KR20220023026A - 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법 - Google Patents

Abstract

스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 이용한 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료방법에 관한 것이다

Description

인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법{Diagnosis and treatment of synovitis and osteolysis caused by artificial joint wear}

본 발명은 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 이용한 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 및 치료방법에 관한 것이다.

인공 관절 치환술은 골관절염 (osteoarthritis, OA)과 같은 퇴행성 질환 및 류마티스 관절염 (rheumatoid arthritis, RA)을 포함한 염증성 관절병 환자를 치료하는 매우 효과적이고 안전한 방법이다 [Arch Orthop Trauma Surg. 2008;128:249-54., What Has Been Achieved? Hip & pelvis. 2019;31:179-89.]. 매년 전 세계적으로 수백만 명 (> 130 만 명)이 관절 전 치환술 (total joint arthroplasty, TJA)을 받고 있다 [Int J Mol Sci. 2017;18.]. 시간이 지남에 따라 보철 임플란트를 착용하는 것이 주요 문제이며 TJA 이후에 수정이 필요하다 [J Knee Surg. 2015;28:139-44.]. 인공 삽입물 주위 골 용해라는 용어는 종종 잘 기능하는 THA와 관련된 진행성 골 흡수라고 한다. 대부분의 경우, 인공 삽입물 주위 골 용해는 일반적으로 초기 고정 불량으로 인한 임플란트의 실패, 시간이 지남에 따라 고정에 대한 기계적 손상 또는 파편 입자를 착용하는 면역 반응에 의해 유발된 고정의 생물학적 손실로 설명될 수 있는 무균성 풀림이 뒤따른다

생물학적 요인과 기계적 요인 모두 임플란트 풀림의 병인에 기여할 수 있다[the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 2003;18:1995-2001., official publication of the Orthopaedic Research Society. 2005;23:520-5.]. 염증 및 뼈 전환 신호 경로 사이의 유전적 변이조차도 환자의 골 용해에 대한 감수성을 평가하는데 중요한 요소이다 [Genes Genomics. 2019;41:1113-25.]. 골 용해 (비스포스포네이트와 같은 항골 재 흡수제) 치료를 위해 약리학적 개입이 고려되고 있지만, 대부분은 골 용해가 유도된 후에만 효과적이다. 일반적으로 수술 2 ~ 3 개월 후 섬유막이 불규칙적으로 조직되어 있고 (섬유아세포, 대식세포, 연골 세포, 림프구, 내피 세포, 중간엽 줄기세포 (MSC) 및 보철물 유래 마모 입자에 풍부함) 더 닮은 것이 관찰된다. 활액 조직이 뼈 / 보철물 경계면 주위에 형성 될 수 있으므로 그 이하이다 [Gene Ther. 2010;17:1262-9.]. 이러한 세포 유형의 대부분은 마모 입자를 식세포로 만들어 활성화 할 수 있습니다. 단핵구 / 대 식세포 계통의 활성화는 신체의 파편 생성을 위한 생물학적 반응의 초기 단계로 간주됩니다. 인터루킨 (IL) -6, -8, -11, IL-1β, 종양 괴사 인자 (TNF) -α, 형질 전환 성장 인자 (TGF) -α 및 β와 같은 다양한 종류의 전 염증성 사이토 카인 및 매개체의 분비 상승 , 프로스타글란딘 (PG) E2, 단핵구 화학 유인 단백질 (MCP-1)과 같은 케모카인, 기질 금속 단백 분해 효소 (MMP), Rankl과 같은 파골 세포 촉진 인자 등이 관찰되었다 [. Innate Immun. 2013;19:213-24., HSS J. 2006;2:102-13., . Nat Rev Immunol. 2011;11:723-37.]. 마모 찌꺼기 생성 후 파골 세포 활성을 향상시키는 데 있어 다양한 면역 세포에 의한 파골 세포 형성 인자와 함께 방출된 염증 매개체의 역할은 잘 연구되었지만, 그 동안 관찰된 바와 같이 뼈 형성 및 뼈 손실 억제에 기여할 수 있는 요인은 삽입물 주위 골 용해는 여전히 파악하기 어렵다. 최근 Ti 입자에 의해 자극된 대식세포의 사이토 카인 유사 TNF-α가 조골 세포의 골 형성 활성을 억제한다는 사실이 입증되었다 [Biomaterials. 2012;33:4251-63.]. 더욱이 마모된 파편에 직접 노출되면 골아 세포의 뼈 형성 능력에 영향을 미치고 골아 세포가 Rankl 및 MCSF와 같은 뼈 흡수제를 방출하도록 자극한다 [J Biomed Mater Res A. 2017;105:912-26.]. 그러나 인공 삽입물 주위 골 용해 동안 골 손실에서 다른 세포 유형의 가능한 역할을 다룬 연구는 아직 거의 없다.

본 발명의 목적은 Ti 입자가 대상체의 FLS에 미치는 영향과 인공 삽입물 주위 골 용해 과정에서 골 손실 과정에 영향을 미치거나 참여할 수 있는 메커니즘을 이해하는 것이다.

상기 목적을 해결하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따라, 스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 이용한 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 방법이 제공된다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따라, 인공관절 삽입물 주변의 골용해에서 골형성을 억제하기 위하여, 대상체에게 스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 투여하는, 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 치료 방법이 제공된다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에 따라, 티타늄 입자를 준비하는 단계; 대상체의 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 준비하는 단계; 및 상기 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 티타늄 입자로 처리하는 단계;를 포함하는 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 방법이 제공된다.

한편, 본 발명의 다른 일 실시예에 따라, 인공관절 삽입 후 발생하는 골용해증의 예방 또는 치료에 사용되는 스클레로스틴의 억제제가 제공된다.

본 발명에 따라, 마모 파편으로 자극된 FLS는 골모세포 발생 뿐만 아니라 파골 세포 발생 과정 모두에 영향을 미쳐 인공 관절 삽입물 주위 골 용해 과정에서 뼈 재 형성 과정에 중요한 역할을 한다.

또한, 마모 잔해에 대한 반응으로 FLS는 골아 세포의 뼈 형성 능력에 영향을 미칠 수 있는 SOST와 같은 특정 인자의 분비 뿐만 아니라 파골 세포 형성에 영향을 미치고 유도할 수 있는 전 염증 매개체를 방출 할 수 있는 이점이 있다.

아울러, 본 발명은 RA 및 인공 삽입물 주위 골 용해와 같은 염증 상태에서 관찰되는 뼈 결함을 설명 할 수 있는 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 손상된 뼈 형성을 치료하는데 적합한 치료 표적이 될 수 있는 SOST와 같은 뼈 억제 분자를 분비하고, 마모 파편에서 골 용해를 유도하는FLS의 역할을 강조할 수 있는 이점이 있다.

도 1은 Ti 입자에서 염증 및 면역 매개체의 발현 증가에 따른 인간 FLS 자극 여부를 나타낸 것이다.
도 2는 Ti CM은 Raw 264.7 세포에서 파골 세포 분화를 유도함을 보여준다.
도 3은 Ti CM은 조골 세포의 골 형성 마커를 억제함을 보여준다.
도 4는 Ti CM은 조골 세포에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 억제함을 보여준다.
도 5는 Ti CM은 외인성 Wnt3a의 조골 세포에 대한 자극 후 골 형성 유도를 억제함을 보여준다.
도 6은 Ti CM은 골아 세포에 대한 외인성 Bmp-2의 자극 후 골 형성 유도를 억제함을 보여준다.
도 7은 Ti CM의 SOST는 억제 된 WNT 및 BMP 신호 및 osteoprogenitors의 ALP 활성을 담당함을 보여준다.
도 8은 인간 활액 조직에서 분리된 FLS의 특성을 보여준다.
도 9는 FLS에 대한 Ti 입자의 영향을 보여준다.
도 10은 Raw 264.7 세포에서 Ti 입자가 세포 생존력 및 세포 독성에 미치는 영향을 보여준다.
도 11은 Ti 입자가 조골 세포의 세포 생존력 및 세포 독성에 미치는 영향을 보여준다.
도 12는 Ti 입자는 FLS에서 WNT 및 BMP 신호 전달 길항제의 발현을 유도함을 보여준다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 용어 또는 단어는 통상적인 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 안되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시예에 기재된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.

공학적 생체 재료는 말기 관절 병리와 관련된 기능적 기형을 개선하기 위해 살아있는 조직을 대체, 확대 또는 상호 작용하도록 계획된다. 하지만, 안타깝게도 임플란트 인터페이스의 마모 파편은 인공 삽입물 주위 골 용해로 이어지는 주요 요인이다. 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)는 활막의 내막 내벽을 채우고 마모 파편과 직접 접촉한다. 이후 연구는 티타늄(Ti) 입자가 인간 FLS에 대한 마모 잔해로서의 영향과 인공 삽입물 주위 골 용해 과정에서 뼈 재형성 과정에 참여할 수 있는 메커니즘을 밝히는 데 목적이 있다. 결과는 Ti 입자가 FLS에서 NFκB 신호 전달 경로의 활성화와 COX-2 및 염증성 사이토 카인의 유도를 유도할 수 있음을 보여주었다. FLS를 자극한 Ti 입자로부터 수집된 조절 배지 (Ti CM)에서 RANKL의 양은 파골 세포 형성을 자극하는 능력을 보여 주었다. Ti CM은 또한 Osterix, Runx-2, 콜라겐 1α 및 뼈 시알로 단백질 (BSP)의 알칼리성 인산염 활성 (ALP), 매트릭스 광물 화, 콜라겐 합성 및 발현 수준과 같은 골 전구 세포에 대한 골 형성 초기 및 말기 분화 마커를 억제했다. Ti CM 처리 후 골 전구체에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 억제가 관찰되었다. Ti CM의 존재하에, WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 외인성 자극은 osteoprogenitors에서 골 형성 활성을 자극하는 데 실패했다. Ti 입자 처리 된 FLS에서 스클레로스틴(sclerostin, SOST : WNT 및 BMP 신호 전달의 길항제)의 유도된 발현 및 Ti CM에서 SOST의 분비가 검출되었다. Ti CM에서 SOST의 중화는 억제된 WNT 및 BMP 신호 전달 활성과 osteoprogenitors의 골 형성 활성을 부분적으로 회복시켰다. 본 발명은 골 손실에 기여하는 FLS의 잠재적인 메커니즘을 강조하여, 골 형성을 자극할 뿐만 아니라 골 전구체의 골 형성 능력을 억제함으로써 삽입물 주위 골 용해 과정에서 관찰되었다.

한편, 조직 상주 섬유 아세포 유사 활막 세포 (FLS)는 인공 삽입물 주변 세포막에서 세포 집단의 약 70 %를 구성하고 보철물에서 나온 마모 파편과 직접 접촉한다. 관절염과 같은 염증 상태에서 FLS는 염증 매개체와 기질 분해 프로테아제를 분비하는 것으로 나타났다. 최근에, FLS의 중요성은 TJA에 따른 무균성 풀림의 발병 기전에서 인정되고 있다. 활액과 세포 외 기질의 구성을 제어함으로써 FLS는 관절의 동적 무결성을 유지한다. TJA가 실패한 환자의 경계 막에 존재하는 FLS는 골 흡수 MMP, 스트로 멜리 신 및 콜라게나 아제의 발현이 증가하여 마모 파편에 반응하여 뼈의 세포 외 기질을 파괴하는 것으로 나타났다. 또한, 마모 파편으로 자극을 받으면 FLS는 TNF-α, IL-6, IL-1β, IL-8, MCP-1 및 Rankl과 같은 전 염증성 사이토 카인을 방출하는 행동에 기인하여 향상에 기여했다. 최근 임플란트의 관절 표면에서 나온 Ti 입자는 염증 방향으로 FLS를 활성화하여 자가 분비 및 파라 크린 방식으로 기여하여 인공 삽입물 주위 공간 내에 복잡한 환경을 만들 수 있음이 밝혀졌다. 현재까지 삽입물 주위 골 용해 과정에서 뼈 손실에 영향을 미치는 FLS의 역할이나 기여는 여전히 의문이다. 따라서 현재 발명의 목적은 Ti 입자가 인간 FLS에 미치는 영향과 인공 삽입물 주위 골 용해 과정에서 골 손실 과정에 영향을 미치거나 참여할 수 있는 메커니즘을 이해하는 것이다.

이하, 본원을 실시예 및 실험예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본원의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

1. Ti 입자의 준비

입자는 Johnson Matthey Company (매사추세츠 주 와드 힐)에서 상업적으로 조달되었다. 조직 학적 분석에 따르면 Ti 입자의 약 86 %는 직경이 10μm 미만이었다. 멸균하기 위해 Ti 입자를 180 ° C에서 6 시간 동안 과열시킨 다음 70 % 에탄올에 48 시간 동안 담근다. 인산 완충 식염수 (PBS)에서 멸균된 Ti 입자를 분산시켜 추가 실험에 활용했다. 현재 연구에서는 Limulus 분석 (E-TOXATE; Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 수행하여 추정된 내 독소가 없는 입자만을 사용했다. 처리 전 매번 Ti 입자를 초음파 처리하고 와류 시켰다.

2. 세포 배양

1 차 FLS는 한림 대학교 병원에서 슬관절 전 치환술시 얻은 사람의 활막 조직에서 채취했다. 한림 대학교 성심 병원 윤리위원회는 실험 프로토콜을 승인하고 허용했다. 모든 기여자들은 서면 동의서에 서명했다 (번호 : 2009-42). 기관 심의위원회는 또한 동의 양식과 실험 절차를 확인했다. 새로 얻은 생검 조직을 멸균 조건 하에서 5 μm의 작은 부분으로 자르고 순차적 소화 전과 그 사이에 PBS로 두 번 철저히 세척했다. 조직은 1mg / mL 콜라게나 제 IV 형 (Sigma Aldrich) 및 10 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)을 갖는 무 혈청 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM : Invitrogen, Carlsbad, CA)와 함께 수조에서 37 ° C에서 2 회 배양되었다. ) (Lonza, Walkersville, USA) 100 IU / mL (P) 및 100 μg / mL (S) 농도에서 60 분 동안. 활막 조직의 두 번째 효소 분산 후, 조직 샘플을 약 1-2 분 동안 와동시켜 세포를 방출하였다. 이어서, 스트레이너를 사용하여 조직을 변형시켜 세포를 함유하는 세포 현탁액으로부터 조직을 분리하였다. 세포 현탁 배지를 수집하고 원심 분리하여 세포 펠릿을 얻었다. 세포 펠렛을 신선한 배지에 현탁하고 37 ℃ 온도 및 5 % CO2 가습 대기에서 조직 배양 접시의 표면에 부착되도록 두었다. 2 일째에 비 부착성 세포를 제거한 후 활액 내막에서 2 개의 주요 세포 집단만 남았다. 그 중 하나의 세포 유형은 단핵구/대식세포 마커인 CD6을 발현하는 대식세포 유사 세포이며 대식세포 유사 활막 세포로 인식된다. 다른 유형은 일반적으로 대식세포 마커의 부재와 항원의 존재 (예 : 프 롤릴 4 하이드 록 실라 제, 비 멘틴, CD248)로 인식되는 섬유 아세포 유사 활막 세포이다. 대식세포와 유사한 활막 세포는 불충분한 수명으로 말기 분화되며 체외 배양에서 며칠 이상 지속되는 경우는 드물다. 추가 계대 또는 트립 신화 과정은 우성 세포 유형 인 FLS의 비교적 균질 한 집단을 초래했다. FL는 10 %의 소 태아 혈청 (FBS) 및 1 %의 페니실린/스트렙토 마이신 (P/S)을 포함하는 DMEM에서 배양되고 성장되었다. 세포를 5% CO2 가습 대기를 유지하는 인큐베이터에 보관하고 매 3-4 일 사이에 통과시켰다. 활막 조직에서 채취한 세포를 현미경으로 시각화하고 4 ~ 8 이상의 계대를 실험 목적으로 활용했다. FL는 전형적인 방추 모양의 섬유 모세포 표현형을 보 였는데, 이는 합류에 평행 한 클러스터를 형성하고 (도 S1A), 골아 세포 및 단핵구 / 대 식세포와 같이 FLS와 함께 종종 발견되는 다른 세포 유형의 오염을 특징으로 한다. 특성화를 위해 FLS, 조골 세포 및 단핵구/대식세포 관련 마커의 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR로 평가했다. FLS의 균질성을 확인하기 위해 Prolyl hydroxylase (P4HB; 콜라겐 합성에 관여함), vimentin 및 CD248 (표면 마커)의 mRNA 발현 수준을 분석했다. 이 세 가지 마커는 모두 FLS에만 특이적인 반면, 1 차 HOB 및 단핵구 세포주 THP-1은 이들을 발현하지 않는 것으로 관찰되었다 (대조군으로 간주) (도 8 B-D). osteocalcin (OCN), bone sialoprotein (BSP) 및 osteoprotegerin (OPG) (도 8E-G) 및 단핵구 (CD68) (도 1H)와 같은 골아 세포에 특이적인 마커는 각각 HOB 및 THP-1에 의해서만 발현되었지만 FLS가 아니다.

건강한 환자의 고관절 교체 수술 중에 근위 대퇴골 표본에서 1 차 인간 골아 세포 (HOB)를 채취했다. 한림 대학교 성심 병원 (번호; 2009-41) 윤리위원회는 다음 실험 프로토콜에 대한 승인 및 허가를 받았다. 해면골 조각은 우리의 잘 확립된 실험실 프로토콜에 따라 배양되었다. 간단히 말해서, 뼈 조각을 작은 조각으로 잘게 썰고 1mg / mL의 I 형 콜라게나 아제 (Sigma Aldrich)를 포함하는 무 혈청 MEM 배지에서 1 시간 동안 37 ℃에서 순차적으로 분해하기 전에 PBS로 두 번 철저히 세척했다. 그 후 소화 된 뼈 칩을 조직 배양 접시에 균일하게 펴고 FBS (10 %), 페니실린 (100 U/mL), 스트렙토 마이신 (100 U/mL)이 있는 MEM 배지에서 배양했다. 분리된 HOB는 ALP 활성에 대한 염색 및 골 형성 유전자의 발현 분석을 특징으로 하였다.

THP-1 인간 단핵구 세포주 (ATCC, USA)를 10 % FBS, L- 글루타민 (2mM) 및 1 % P/S를 갖는 RPMI-1640 성장 배지에서 가습 된 5 % CO2 대기 인큐베이터에서 배양하고 유지했다. 37 ° C. 실험 전에 세포를 6-well plate에서 성장시키고 20nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)를 48 시간 동안 첨가하여 대식세포 유사 세포로의 분화를 유도했다.

인간 골 전구 세포주 (SaOS-2 : ATCC, HTB-85) 및 뮤린 대식세포 / 단핵구 세포주, RAW 264.7 세포 (ATCC, TIB-71)를 10 % FBS, 100 U / mL 페니실린이 포함된 완전한 DMEM 배지에서 배양했다(5 % CO 2 및 37º C 온도의 가습 인큐베이터에서 100 U/mL 스트렙토 마이신 보충제).

3. 전골모세포의 분화

SaOS-2 세포를 접종하고 6 웰 플레이트의 각 웰의 1mL 배지에서 약 1x105 세포의 합류점에서 준비했다. 세포는 37 ° C 온도, 95 %의 가습 대기 및 5 % CO2를 갖는 인큐베이터에서 유지되었다. 조골 세포 분화를 유도하기 위해 분화 유도제 인 아스코르브 산 (50μg / mL)과 β- 글리세로 포스페이트 (10mM) (Sigma Aldrich)가 포함된 특정 골 형성 배지에서 조골 세포 세포를 7 일 동안 성장시켰다.

4. MTT 분석

MTT, 3- (4, 5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) -2, 5- 디 페닐-테트라 졸륨 브로마이드 (MTT; Sigma Aldrich) 환원 분석을 수행하여 우리 실험실 프로토콜에 따라 세포의 생존력을 평가했습니다. 배양 배지를 제거한 후, 5 mg / mL의 MTT 시약을 96 웰 플레이트의 세포에 첨가하고 37 ° C에서 3 ~ 4 시간 동안 배양 하였다. 우물에 활성 대사가 있는 생존 세포는 MTT 기질을 포르 마잔 (짙은 보라색)으로 바꿉니다. 색 형성은 생존할 수 없는 세포가 MTT를 포르 마잔으로 바꾸는 능력을 상실하기 때문에 귀중하고 편리한 마커 역할을 한다. 상층액을 버리고 각 웰에 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 200μl를 첨가하여 보라색의 가시적인 불용성 포르 마잔 결정을 용해시키고 마지막으로 플레이트 판독 분광 광도계를 사용하여 570nm 파장에서 광학 밀도를 측정했다.

5. 젖산 탈수소 효소 (LDH) 활성 분석

세포 독성 검출 키트 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)를 사용하여 제조업체의 프로토콜 지침에 따라 LDH 활성을 분석했다. LDH는 모든 종류의 세포에 존재하는 세포질 효소이며 LDH 세포 독성 검출 키트는 손상된 세포에서 세포 배양 배지로의 LDH 방출을 측정하는데 사용할 수 있다. 세포 독성을 평가하기 위해 PBS (40μl)를 함유하기 전에 실험 샘플에서 얻은 세포 배양 배지 10μl를 새로운 96 웰 플레이트에 첨가했습니다. 이후, 키트에 제공된 촉매와 함께 준비된 LDH 시약 50μl를 각 웰에 첨가하고 배양 플레이트를 실온에서 배양하기 위해 약 45 분 동안 어둡게 유지하였다. 마지막으로 공급된 정지 용액 (50 μl)을 웰에 추가하여 진행중인 효소 반응을 종료했다. 테트라 졸륨 염의 포르 마잔으로의 환원은 490 nm 파장에서 관찰되었다. 세포 사멸의 긍정적인 제어를 위해 완전한 세포 용 해물이 사용되었다.

6. Ti 입자 자극 FLS (Ti CM)에서 조절된 배지 수집

FLS는 10 % FBS 및 1 % P / S를 갖는 완전한 DMEM 배지에서 하룻밤 동안 4.0x105 세포 / 60 mm 조직 배양 접시의 합류점에 접종되었다. 그 후, 세포는 48 시간 동안 1 % P / S를 함유하는 무 혈청 DMEM에서 Ti 입자로 처리되었다. 무균 조건에서 배양 48 시간 후에 컨디셔닝 된 배지 (CM)를 수집하였다. 세포 찌꺼기를 제거하기 위해 수집된 CM을 원심 분리하고 SaOS-2 및 RAW264.7 세포를 사용한 추가 실험에 사용했다.

7. RNA 분리 및 실시간 RT-PCR

RNA는 Trizol 시약 (Invitrogen)에 의해 세포로부터 수집되었다. RNA의 품질과 무결성은 각각 흡광도 비율 (260/280)을 평가하고 RNA를 아가 로스 겔에서 분리하여 결정했다. 첫 번째 가닥 cDNA는 SuperScript ²² (Invitrogen)를 사용하여 총 RNA (2μg)에서 합성되었다. 각 PCR 혼합물에 대해 EXPRESS SYBR green qPCR Supermix와 함께 cDNA의 10 분의 1을 사용했다 (BioPrince, Seoul, Korea). 이후, Rotor-Gene Q real-time PCR (Qiagen, Hilden, Germany)을 수행했다. 열 순환 반응은 초기 단계로 95 ° C에서 10 분 동안 샘플을 예열하고 95 ° C에서 20 초 동안, 60 ° C에서 20 초 동안, 72 ° C에서 25 초 동안 50주기의 증폭을 포함했다. 원하는 유전자의 상대적 mRNA 발현을 GAPDH의 발현 수준으로 정규화하고 이중 델타 CT (ΔΔCT) 방법으로 정량화했습니다. PCR 프라이머의 서열은 표 1에 기록되어 있다.

Target	Forward primer (5' ->3')	Reverse primer (3' ->5' )
Human
DKK1	TCAGACTGTGCCTCAGGATTGTGT	TCTGTATCCGGCAAGACAGACCTT
DKK2	TGATGCGGGCCTCCTGATCAATTA	ACTGGAAGCAATCAAATGCGAGGC
DKK3	TTGGGAGAGTCAGGCAGGGTTAAA	TGTCTGCCAACTGGTAGAGGCAAA
DKK4	TGGGACACTCTGTGTGAACGATGT	TCTTGTCCCTTCCTGCCTTGTGAT
sFRP1	AGAGCTGCACTATCACGAGCCTTT	AGACCAATGACCAGGCCAATCAGT
sFRP2	TAGGTGCAACTGTGACTTGGGTCT	CCACAAGTTTGGGCCACAGAGAAA
sFRP3	CCTGCAAACTGGCCTGCACTTTAT	AGCATCATTTGTTCACCACAGCCC
sFRP4	AGGTCACAACGGTGGTGGATGTAA	ATCATCCTTGAGCGCCACTCGTAA
sFRP5	TGAGGCGGAGGTTTCAGAGTAGAA	AGGCACTGAGACCCTAACTCCTTT
SOST	TTCAGTGCCAAGGTCACTTCCAGA	TTCTTCCAGGAGTTTGTCAGCCGT
Noggin	CAAGAAGCAGCGCCTAAG	GTACTGGATGGGAATCCAG
Folistatin	AGAGCCTGCTTCCTCTGAG	AGCTGTAGTCCTGGTCTTC
Chordin	CGCATCAGTGGACACATTG	TTCTGCAGCAGCATATGAGC
Gremline	ATGTGACGGAGCGCAAATAC	TGGATATGCAACGACACTGC
Rankl	CGTTGGATCACAGCACATCAG	GCTCCTCTTGGCCAGATCTAAC
Osteocalcin	GCCTTTGTGTCCAAGC	GGACCCCACATCCATAG
Runx2	ACTGGGCCCTTTTTCAGA	GCGGAAGCATTCTGGAA
Osterix	CAAAGCAGGCACAAAGAAGCCGTA	AGGTGAAAGGAGCCCATTAGTGCT
BSP	AGTACCAACAGCACAGAGGCAGAA	CTGCATTGGCTCCAGTGACACTTT
Prolyl 4 hydroxylase	TCAAGGTGCTTGTTGGGAAG	AATGGGAGCCAACTGTTTGC
Vimentin	TCTCAGCATCACGATGACCTTG	TTGCGCTCCTGAAAAACTGC
CD68	AAGAGCCACAAAACCACCAC	AACTGTGACGTTTCCATGGC
Osteoprotegrin	GCAGCGGCACATTGGAC	CCCGGTAAGCTTTCCATCAA
CD248	TTTTTGGTGGTCCTGCTTGC	AGTCAGTGATGCGCTTGTTG
COX-2	CCAAATCCTTGCTGTTCCCACCCAT	GTGCACTGTGTTTGGAGTGGGTTT
TNF-α	AAGGACGAACATCCAACCTTCCCAA	TTTGAGCCAGAAGAGGTTGAGGGT
IL-1	AACCAGGCTGCTCTGGGATTCTCTT	ATTTCACTGGCGAGCTCAGGTACT
IL-8	AAGAAACCACCGGAAGGAACCATCT	AGAGCTGCAGAAATCAGGAAGGCT
IL-11	AGATATCCTGACATTGGCCAGGCA	ACTTCAGTGATCCACTCGCTTCGT
IL-6	CCAGCTATGAACTCCTTCTC	GCTTGTTCCTCACATCTCTC
iNOS	GGTCAGAGTCACCATCCTCTTTG	GCAGCTCAGCCTGTACTTATC
GAPDH	TCGACAGTCAGCCGCATCTTCTTT	ACCAAATCCGTTGACTCCGACCTT
Mouse
Trap	ACATGACCACAACCTGCAG	CCTCAGATCCATAGTGAAACCG
MMP-9	GATCCCCAGAGCGTCATTC	CCACCTTGTTCACCTCATTTTG
CSTK	TGACCACTGCCTTCCAATAC	CTCTGTACCCTCTGCATTTAGC
Rankl	CGTGCAGAAGGAACTGCAACACAT	TTGATGGTGAGGTGTGCAAATGGC
GAPDH	TCAACAGCAACTCCCACTCTTCCA	ACCCTGTTGCTGTAGCCGTATTCA

8. Luciferase assay

SaOS-2 세포는 제조업체의 지침에 따라 24 웰 플레이트에서 Genefectine 형질 감염 시약 (Genetrone Biotech, 대한민국 서울)을 사용하여 형질 감염되었다. Axin-2 또는 BRE (Addgene, Cambridge, MA, USA)의 50ng 구축물과 동일한 양의 Renilla luciferase thymidine kinase 구축물 (Invitrogen)을 사용하여 루시퍼 라제 활성을 추정했다. 제조업체의 지침에 따라 이중 루시퍼 라제 분석 키트 (Promega, Madison, WI, USA)를 사용하여 루시퍼 라제 활성을 평가했다. 리포터 활성은 각 샘플에서 발광계 (Glomax, Promega, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하고 Renilla luciferase 활성으로 정규화되었다.

제조업체의 프로토콜에 따라 리포펙타민 시약 (Invitrogen)을 사용하여 활성화된 T 세포의 핵 인자 (NFATc) 1 구축물 (Addgene)로 원시세포를 형질 감염했다.

9. 단백질 분리 및 웨스턴 블로팅

세포로부터의 단백질을 RIPA 완충액 (20mM Tris-HCl, pH 7.5, 200mM NaCl, 1 % Triton X-100, 1mM 디티오트레이톨)을 함유하는 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일에서 수확했다 (Roche Diagnostics). 단백질 분석 키트 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 각 샘플의 단백질 농도를 추정한 후 수집된 총 단백질을 전기 영동을 위해 SDS- 폴리 아크릴 아미드 겔에로드 한 후 PVDF 멤브레인으로 옮겼다. 막은 COX-2 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), β-Catenin (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA)에 대한 항체로 조사되었다. β- 액틴 항체 (Santa Cruz Biotechnology)는 로딩 대조군으로 간주되었다. 이어서, 블롯은 1X TBST (10mM Tris-HCl, 50mM NaCl, 0.25 % Tween 20)로 여러 번 세척되었다. 표적 단백질은 양 고추 냉이 과산화 효소 결합 2차 항체로 확인되었다. 표적 단백질 밴드를 시각화하기 위해 화학 발광 시약 (Bionote, Inc., 경기도)을 사용했다.

10. 알칼리성 포스파타제 활성 (ALP) 분석

조골세포의 ALP 활성은 앞서 설명한대로 분석되었다. 요컨대, SaOS-2 세포는 48- 웰 플레이트에서 9 x 104 세포 / 웰의 합류로 성장했다. 24 시간 후 세포를 Ti CM으로 처리 하였다. 48 시간 동안 처리 한 후 세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 세포 용해를 위해 100 μl / well의 차가운 RIPA 버퍼를 사용했습니다. 그 후, 수집된 전체 세포 용 해물 중 20μl의 세포 용 해물을 100μl의 CSPD 기질 (Roche Diagnostics)과 혼합하고 30 분 동안 실온에서 어두운 곳에서 보관했다. 발광 강도를 검출하기 위해 발광 계 (Glomax)를 사용했다. 단백질 분석 키트 (Bio-Rad Laboratories)로 총 세포 용 해물을 평가하여 단백질 농도를 표준화했다.

11. 알리자린 레드 S 및 시리우스 레드 염색

Ti CM의 존재 하에서 SaOS-2 세포의 콜라겐 합성 및 무기질화 매트릭스 침착 능력은 각각 Sirius Red 및 Alizarin Red S 염색에 의해 평가되었다. 골 형성 배지 (10mM β- 글리세롤 포스페이트 및 50mg / mL 아스코르브 산이있는 DMEM 배지)에서 SaOS-2 세포를 자극하여 24 웰 플레이트에서 14 일 동안 분화했다. 2 일마다 새로운 Cont CM 또는 Ti CM 배지가 교체되었다. 세포를 실험실 프로토콜에 따라 1 시간 동안 파라 포름 알데히드 용액의 4 %에 고정하고 실온에서 Alizarin Red S 용액 (40mM) (Sigma Aldrich)으로 30 분 동안 염색했다. 현미경은 염색 된 세포를 그리는 데 사용되었다. 광물 화의 정량화를 위해 처음에 염색된 세포를 10 % 염화 세틸 피리 디늄 (Sigma Aldrich)에 1 시간 동안 용해시킨 후 분광 광도계 (SoftMaxPro 5)로 570 nm에서 흡광도를 판독하기 위해 96 웰 플레이트로 옮겼다. 콜라겐 염색의 경우 Bouin의 유체 (Sigma Aldrich)로 2 시간 동안 세포 고정을 수행했다. 그 후, 포화 수성 picric acid에 용해 된 Sirius Red 염료 (1 mg/mL) (Sigma Aldrich)로 최소 1 시간 동안 세포 염색을 수행했다. 염료를 측정하기 위해 염색된 세포를 쉐이커를 사용하여 30 분 동안 0.1N 수산화 나트륨에 녹였다. 550n에서 분광 광도계를 사용하여 용해된 Sirius Red 염료의 광학 밀도를 추정했다. 0.1 N 수산화 나트륨은 블랭크로 간주되었다. 삼중 배양을 분석했다.

12. RAW264.7 세포를 24 웰 배양 접시에서 성장시켰다. 이틀마다 매체가 교체되었다. 배양 9 일 후 세포 단층을 PBS 1mL로 2 회 부드럽게 세척하고 4 % 포름 알데히드 용액에 15 분 동안 고정시켰다. 이후 세포를 증류수로 세척하여 고정액을 제거하고 제조사의 권장 사항에 따라 Acid Phosphatase Leukocyte kit (Sigma Aldrich)를 사용하여 TRAP 염색 하였다. 간단히 말해서, 세포를 6.76 mm 타르트 레이트 및 0.14 mg / mL 패스트 가닛 GBC의 존재 하에 어둠 속에서 1 시간 동안 37 ° C에서 나프톨 AS-BI 0.12 mg / mL에 담갔다. 그 후 세포를 세척하고 30 초 동안 헤 마톡 실린으로 염색하였다. TRA에 양성인 다핵 세포 (MNC, 2 개 또는 3 개 이상의 핵 포함)를 광학 현미경을 사용하여 계수했다.

13. 트랩 활동

TRAP 활성은 파라-니트로 페닐 포스페이트 (pNPP) 가수 분해 분석으로 측정되었다. PBS로 두 번 세척한 후 세포를 0.1 % (V / V) Triton X-100의 200 μl 용액으로 용해시켰다. 0.04M 타르타르산 및 0.09M 시트 레이트 (pH 5.8)에서 12.5mM pNPP로 37 ° C에서 1 시간 동안 배양한 후. 5mM NaOH를 첨가하여 반응을 중단했다. 405 nm에서 흡광도는 ELISA 플레이트 리더 (Synergy HT, BioTek Instruments, Winooski, VT)에서 측정되었다. 결과는 배양의 총 단백질 농도로 정규화 되었다.

14. 항체 어레이

FLS 또는 Ti 입자로부터 수집 된 CM은 48 시간 동안 FLS를 자극하여 항체 어레이 준비 및 분석을 위해 Ebiogen Company (경희대학교 경희 비즈니스 센터)에 제공되었다. 312 개의 항체를 포함하는 탐색기 항체 마이크로 어레이 슬라이드 (Fullmoon biosystems, Sunnyvale, CA, USA)를 차단 용액 (30 mL)으로 처리하고 37 ° C에서 45 분 동안 쉐이커에 보관했다. 블로킹 후 슬라이드를 45 mL의 이중 증류수로 약 10 회 헹구었다. 표지된 샘플을 5.3 mL의 커플 링 용액에 용해시켰다. 차단된 어레이 슬라이드를 커플링 혼합물이 들어있는 커플링 접시에서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션 했다. 커플링 후, 어레이 슬라이드를 30 mL의 1x 세척 용액으로 2 회 목욕시켰다. 다음으로, 30 μL의 0.5 mg/mL Cy3-streptavidin (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK)을 30 mL의 검출 버퍼에 첨가하고 수동 흔들어서 함께 혼합했다. 어레이 슬라이드 스캐닝은 Revolution TM 4200 마이크로 어레이 스캐너 (Vidar Systems, Herndon, VA, USA) 및 ArraySifter Express 1.3 (Vidar Systems)을 사용하여 수행되었다. 어레이 슬라이드는 10μm/픽셀 해상도, 최적의 레이저 출력 및 광전자 증 배관에서 분석되었다. 스캔 한 이미지를 얻은 후, 그리드를 만들고 ArraySifter Express 1.3으로 평가했다. 수치 데이터는 Genowiz 4.0 TM (Ocimum Biosolutions, India)을 사용하여 평가되었다.

15. 엘리사

FLS 세포를 Ti 입자 (1 : 400)와 함께 24 시간 및 48 시간 동안 배양하고 Ti CM을 수집하여 스클레로스틴 (SOST)의 농도를 확인했다. 휴먼 SOST ELISA 키트 (미국 미네소타 주 미니애폴리스 소재의 R & D Systems)는 제조업체의 프로토콜에 따라 정량적 측정에 사용되었다.

16. Ti CM에서 SOST 무효화

Ti CM에서 SOST를 중화하기 위해 Ti CM을 항 -SOST (10 mg / mL) 중화 항체 (R & D Systems)와 함께 37ºC에서 2 시간 동안 사전 인큐베이션하고 ALP를 분석하기 전에 48 시간 동안 SaOS-2 세포에 처리했다 (활동 및 Axin-2 또는 BRE 리포터 활동). 이 실험을 위해, 비 면역 이소 타입 랫트 IgG를 Ti CM (10 mg / mL)에 사전 인큐베이션하고 대조군으로 사용했다.

17. 통계 분석

모든 통계 데이터는 Graphpad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc, San Diego, CA, USA)에 의해 평가되었으며 양측 Student t 테스트로 계산되었다. P <0.05, P <0.01 및, P <0.001의 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주되었다.

평가예

1. Ti 입자는 인간 FLS를 자극하여 염증 및 면역 매개체 생성

처음에는 세포 생존력과 세포 독성에 대한 영향을 분석하기 위해 다양한 비율의 세포 대 Ti 입자 (1 : 100, 1 : 200, 1 : 300 및 1 : 400)를 FLS로 처리하고 MTT 및 LDH 분석을 수행했다. 1 : 400의 비율까지, MTT 및 LDH 분석은 인간 FLS의 세포 생존력 및 세포 독성에 대한 Ti 입자의 유의 한 영향을 나타내지 않았다 (도 9 A-B). FLS가 Ti 입자 처리에 어떻게 반응하는지 확인하기 위해 배양 배지에서 방출된 가용성 단백질을 312 개의 항체 코팅 된 항체 어레이 칩으로 분석했다. 분비 단백질 수준 측정의 양은 총 조절 단백질의 백분율로 클러스터링 되었다. 가용성 단백질의 신호 강도를 고려하여 10.79 % 세포 외 기질, 11.80 % 세포 이동, 11.23 % 세포 분화, 5.18 % 세포주기, 11.45 % 세포 사멸 과정, 11.30 % 혈관 신생, 12.06 % 염증 반응, 11.77 % 면역 반응 및 4.42 % 분비 CM을 제어하기 위해 Ti CM에서 릴리스 되었다 (도 9C). 더욱이, 이들 총 조절 단백질 중에서, 상당히 상향 조절된 분비 단백질의 양은 다음과 같이 추가로 클러스터링 되었다. 9.84 % 세포 외 기질, 13.91 % 세포 이동, 11.63 % 세포 분화, 4.95 % 세포주기, 14.88 % 세포 사멸 과정, 12.18 % 혈관 신생, 15.09 % 염증 반응, 8.74 면역 반응 및 8.74 % 분비. 결과는 CM을 제어하기 위해 Ti CM에서 방출된 가용성 단백질의 신호 강도를 고려하여 표시된다 (도 1A). 누적 적으로 염증 및 면역 반응이 Ti 입자에 대한 반응으로 FLS에 의해 분비되는 단백질의 약 25 %를 구성하는 것으로 나타났으며, 이는 염증 유도를 나타낸다. 예상대로 시간에 따라 Ti 입자를 FLS로 처리하면 COX-2의 발현 수준이 증가했다 (도 9D). 또한 Ti 입자를 FLS에 24 시간 동안 처리하면 IκBα의 안정성이 억제되어 NFkB 신호 전달 경로가 활성화되었다 (도 1B). FLS에서 NFkB 신호 전달 경로의 활성화는 다양한 염증 및 면역 반응 매개체의 유도 및 발현과 관련이 있는 것으로 밝혀졌다 [21]. Ti 입자로 자극된 FLS에서 24 시간 동안 실시간 RT-PCR로 mRNA 발현을 분석한 결과, COX-2 및 IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8과 같은 전 염증성 사이토 카인의 발현, IL-11 및 IL-17이 증가했다 (도 1D-J). 흥미롭게도, Ti- 자극된 FLS에서 Rankl (~ 50 배)의 mRNA 발현 수준에서 상당한 유도가 검출되었다(도 1I).

2. Ti CM 유도 파골 세포 형성

Ti 입자에 의해 자극 된 FLS에서 IL-6, Il-1β와 같은 사이토 카인과 Rankl과 같은 파골 세포 형성 인자의 발현 증가가 관찰됨에 따라 파골 세포 형성을 자극할 가능성이 예상되었다. IL-6과 IL-1β는 파골 세포 형성을 증가 시키는데 관여하는 것으로 알려져 있으며 Rankl은 파골 세포 전구체를 파골 세포로 분화시키는 주요 요인으로 간주된다. 따라서 처음에는 Ti CM의 유사 분열 또는 세포 독성 효과가 뮤린 대식세포 세포주 RAW 264.7에 대해 조사되었다. Ti CM *?*(25 %, 50 %, 75 % 및 100 %)을 RAW 264.7 세포에 24, 48 및 72 시간 동안 처리하고 MTT 및 LDH 분석을 수행했다. 72 시간 동안 100 % CM의 투여 량은 RAW 264.7 세포에 대해 유의한 유사 분열 및 세포 독성 효과를 나타내지 않았기 때문에 추가 실험에 100 % CM을 사용했다 (도 10 A-B). 파골 세포 형성에 대한 Ti CM의 효과를 설명하기 위해 RAW 264.7 세포를 Ti CM으로 9 일 동안 교대로 처리하고 TRAP 양성 세포를 재료 및 방법에 설명된대로 TRAP 염색에 의해 검출했다. Ti CM은 세포 생존력에 영향을 주지 않고 다핵 세포 형성을 유도함으로써 파골 세포 형성의 증가를 보여주었다 (도 2A-C). 또한, 알려진 파골 세포 마커 유전자의 mRNA 발현을 실시간 RT-PCR을 통해 조사하였다. Ti CM을 9 일 동안 처리 한 후 TRAP, Rankl, Cathepsin K (CSTK) 및 matrix metallopeptidase (MMP) -9의 mRNA 발현 증가는 RAW264.7 세포에서 Ti CM이 파골 세포 형성을 유도하는 효과를 확인했습니다 (도 2D (ad)). ). 또한 Ti CM은 전사 프로그램을 자극하기에 충분한 RAW264.7 세포에서 NFATc1 리포터 활성을 유의하게 유도하여 성숙한 파골 세포 표현형을 얻었다. (도 2E)

3. Ti CM은 osteoprogenitors의 골 형성 매개 변수 억제

다음으로 Ti CM이 osteoprogenitors의 골 형성 활성에 미치는 영향을 조사했다. 처음에 MTT 및 LDH 분석은 인간 골 전구 세포주인 SaOS-2에 대한 Ti CM의 유사 분열 또는 세포 독성 효과의 가능성을 배제하기 위해 수행되었다. 이를 위해 Ti CM의 다른 비율 (25 %, 50 %, 75 % 및 100 %)이 72 시간까지 SaOS-2로 처리되었다. 결과는 72 시간 동안 Ti CM 처리의 모든 비율에서 SaOS-2 세포에 대한 Ti CM의 유의한 세포 독성 및 유사 분열 효과가 없음을 보여주었다 (도 11 A, B). 그 후, 조골 세포의 초기 및 후기 골 형성 매개 변수에 대한 Ti CM의 효과를 평가하였다. ALP 활성은 조골 세포에 대한 초기 분화 골 형성 마커로 간주된다. 따라서 Ti CM을 48 시간 동안 처리하고 ALP 활성을 분석했다. 결과는 대조군과 비교하여 100 % Ti CM으로 처리했을 때 SaOS-2 세포의 ALP 활성의 감소 (50 % 이상)를 나타냈다 (도 3A). 100 % Ti CM은 SaOS-2 세포에 대한 생존력이나 세포 독성 효과를 나타내지 않았고 ALP 활성에 대한 최대 억제 효과를 보였으므로 모든 추가 실험은 100 % Ti CM으로 수행되었다. 다른 골 형성 마커의 발현에 대한 Ti CM의 반응을 추가로 분석하기 위해 SaOS-2 세포를 β-glycerophosphate (10mM)와 ascorbic acid (50μg / mL)를 처리하여 7 일 동안 분화시킨 후 Ti CM으로 24 시간 동안 처리했다. mRNA를 수집하고 실시간 RT-PCR 분석을 수행했다. 결과는 Osterix 및 Runx2와 같은 골 형성 전사 인자의 감소된 mRNA 발현을 보여 주었다 (도 3 B, C). 또한 Runx2와 Osterix의 단백질 발현 수준은 조골 세포에서 Ti CM에 의해 감소되었다 (도 3D). 콜라겐 1α 및 BSP와 같은 말단 골 형성 분화 마커의 mRNA 발현 수준도 감소하는 것으로 나타났다 (도 3 E & F). 또한 콜라겐 합성 (Sirius red S 염색) 및 광물화 과정 (Alizarin Red S 염색)과 같은 골아 세포에 대한 말단 분화 마커에 대한 Ti CM의 효과를 재료 및 방법에 설명 된대로 수행했다. 결과는 Ti CM 처리된 SaOS-2 세포에서 억제된 Sirius Red S 및 Alizarin Red S 염색을 보여주었다 (도 3G (a)). Ti CM 처리된 배양 물에서 Sirius Red S 및 Alizarin Red S 염색의 정량화는 SaOS-2 세포의 콜라겐 합성 및 광물 화 과정에서 상당한 감소를 보여주었습니다 (도 3G (b, c)).

4. Ti CM은 WNT 및 BMP 신호 전달 경로 억제

조골 세포에 대한 Ti CM 처리는 골 형성 마커를 감소 시켰기 때문에 Ti CM은 조골 세포 분화에 필요한 WNT 및 BMP와 같은 중요한 골 형성 신호 전달 경로에 대한 억제 효과를 가질 수 있다고 가정했다. 따라서 Ti CM이 WNT 및 BMP 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있는지 여부를 조사하기 위해 루시퍼 라제 리포터 분석이 사용되었다. SaOS-2 세포는 각각 WNT 및 BMP 경로에 대해 Axin-2-luc 또는 BRE-luc의 리포터 구축물로 형질 감염되었다. Ti CM 처리 24 시간 후, Axin-2-luc 및 BRE-luc luciferase 활성 모두의 기저 수준의 현저한 감소는 WNT 및 BMP 신호 전달 경로에 대한 Ti CM의 억제 역할을 예시한다 (도 4A & C). 조골 세포 분화 과정에서 표준 WNT 신호 전달은 β-Catenin의 안정화를 통해 활성화되는 반면 Smad 1/5/8의 인산화는 BMP 신호 전달 활성의 활성화에 책임이 있다. 따라서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로에 대한 Ti CM의 억제 결과를 정확하게 조사하기 위해 β-Catenin의 단백질 발현과 Smad 1/5/8의 인산화를 western blotting을 수행하여 분석했다. 얻은 결과는 Ti CM 처리가 대조군과 비교하여 12 시간 및 24 시간 후에 β- 카테닌의 안정성을 억제했음을 나타냈다 (도 4B). 같은 방식으로 Smad 1/5/8의 인산화 수준의 감소는 대조군과 비교하여 30 분 및 60 분 후에 나타났다 (도 4D).

5. Wnt3a 및 Bmp-2 단백질을 사용한 외인성 자극은 억제 된 골 형성을 회복하지 못함.

Ti CM 유도 골 형성 장애에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 관여를 확인하기 위해, 우리는 재조합 Wnt3a (25 ng / mL) 및 Bmp로 자극하여 SaOS-2 세포에서 Ti CM 억제 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 회복하려고 추가로 시도했다. -2 (50ng / mL), 외인성. 기대는 억제 된 골 형성 (WNT 및 BMP) 신호를 복원하고 Ti CM 처리된 조골 세포에서 방해 된 골 형성 활성을 회복시키는 것이었다. 이를 위해 Axin-2 또는 BRE 루시 페라 제 플라스미드로 일시적으로 형질 감염된 SaOS-2 세포를 Ti CM 및 Wnt3a 또는 Bmp-2와 함께 24 시간 동안 공동 처리하고 루시퍼 라제 리포터 활성을 분석했다. 외인성 자극은 Ti CM 처리 세포에서 Axin-2 또는 BRE 루시퍼 라제 활성을 유도하는데 실패한 반면, 예상대로 대조군 CM 처리 세포에서 증가 된 루시 페라 제 활성이 검출되었다 (도 5A 및 6A). 골 형성 신호 전달 경로에 대한 Ti CM의 억제 역할을 확인하기 위해, Wnt3a 또는 Bmp-2와 함께 Ti CM을 SaOS-2 세포에 공동 처리하고 ALP 활성을 분석하였다. Wnt3a 및 Bmp-2의 외인성 자극은 Ti CM의 존재 하에서 ALP 활성의 회복을 입증하지 못했다 (도 5B & 6B). 또한, SaOS-2 세포는 앞서 설명한 바와 같이 분화하도록 유도되었으며 Ti CM의 존재하에 Runx2, Osterix, Collagen 1α 및 BSP와 같은 골 형성 마커의 mRNA 발현 수준에 대한 Wnt3a 및 Bmp-2 단백질의 모든 자극 효과는 다음과 같았다. 분석 결과는 Ti CM의 존재하에 이들 골 형성 마커의 mRNA 발현 수준에서 유도가 없음을 보여 주었다 (도 6C-F & 7C-F). 또한, Ti CM과 함께 처리된 Wnt3a의 경우 Runx2 및 Osterix 단백질 수준의 유도가 관찰되지 않았다 (도 6G). 마지막으로 Wnt3a 및 Bmp-2의 외인성 자극 효과는 콜라겐 합성 및 무기화와 같은 후기 골 형성 마커에 대해 분석되었다. CM과 함께 Wnt3a의 공동 처리는 대조군 CM의 SaOS-2 세포에서 콜라겐 합성 (Sirius red S 염색) 및 광물화 (Alizarin Red S)를 유도했지만 Ti CM의 경우 실패했다 (도 5H (a & b) & Ti CM과 함께 Bmp-2를 병용했을 때 콜라겐 합성과 무기질화의 유사한 억제가 관찰되었다 (도 6G (a & b) & 6H (a & b)).

6. SOST는 골 형성 장애를 설명함.

위의 결과 대신, 다음 의도는 Ti- 자극된 FLS로부터 분비된 분자를 확인하는 것이 었는데, 이는 골 형성 신호에 대한 Ti CM의 억제 역할과 골아 세포의 골 형성 활성을 설명 할 수 있다. WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 조절 메커니즘에 대한 여러 메커니즘이 존재하며 그 중 하나는 분비된 세포 외 길항제를 통하는 것이다 [24-26]. WNT (SOST, Dickkopf (DKK), 분비 된 frizzled-related protein (sFRP), Wnt 억제 인자 (WIF) 및 Wise) 및 BMP (noggin, chordin, follistatin 및 SOST)에 대한 많은 세포 외 길항제, 신호 경로는 다음과 같다. Ti 입자 자극 FLS에서 24 시간 동안 WNT 신호 전달 경로에 대한 다양한 길항제의 mRNA 발현을 분석한 결과, DKK 및 sFRP 계열 및 SOST와 같은 길항제의 발현 증가가 관찰되었다. 다양한 스크리닝 된 길항제 중에서 DKK2, SFRP3, SFRP5의 유도는 상당히 높았다 (> 20 배) (보조 도 S5A-C). 또한, 알려진 BMP 신호 전달 길항제 (noggin, chordin, follistatin)의 발현 수준도 증가하는 것으로 나타났다 (도 12 D-F). 이러한 과발현 된 길항제 중에서 SOST는 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 음성 조절 자이므로 Ti CM에서 방출 정도를 평가해야 한다. 이를 위해 SOST의 mRNA 발현 수준은 Ti 입자 자극 24 시간 후 실시간 RT-PCR로 측정하였으며, 24 시간 및 48 시간 Ti 입자 자극 후 Ti CM의 SOST 농도를 ELISA로 측정하였다. FLS에서 Ti 입자 자극 후 SOST에 대해 약 40 배의 mRNA 발현이 관찰되었다 (도 7A). 더욱이, ELISA 결과는 24 시간에 대조군에 비해 Ti CM (~ 6 ng / mL)에서 분비 된 SOST의 증가를 보여 주었다 (도 7B).

Ti CM에서 SOST의 상당한 방출과 조골 세포에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 억제하는 능력은 조골 세포의 골 형성 활성을 억제하는 데 관여하는 정도를 연구하는 데 이상적인 후보이다. 따라서 SOST의 관여를 설명하기 위해 항 -SOST 항체를 사용하여 Ti CM에서 SOST를 중화시켰으며 WNT 및 BMP 신호 전달 경로에서 회복 정도와 ALP 활성이 조골 세포에서 관찰되었다. Ti CM에서 SaOS-2 세포로 처리하기 전에 30 분 동안 SOST 중화 항체와 함께 배양되었고, 효과는 루시퍼 라제 리포터 분석 (WNT 및 BMP 신호 전달 활성에 대한) 및 ALP 활성에 의해 분석되었다. 결과는 Ti CM에서 SOS를 차단한 후 억제된 Axin-2 및 BRE 리포터 활동의 부분적인 회복을 보여주었으며, Ti CM에서 SOST의 중화 후 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 회복을 분명히 시사한다 (도 7C-D). SOST 중화 후 WNT 및 BMP 신호 전달 활성의 회복에 대한 확인은 웨스턴 블로팅에 의한 β-catenin의 안정화 및 Smad 1/5/8 분자의 인산화에 의해 더욱 확증되었다 (도 7 E & F). Ti CM에서 SOST의 중화는 β-catenin 단백질의 안정성 회복 뿐만 아니라 Smad 1/5/8 분자의 인산화 회복을 가져왔다. 더욱이, Ti CM에서 SOST의 중화는 또한 SaOS-2 세포의 ALP 활성의 부분적인 회복을 가져왔다 (도 7G). Ti CM 효과가 다른 체외 골아 세포 모델에서 재현 가능한지 여부를 확인하기 위해 1 차 인간 골아 세포의 배양이 확립되었다. Ti CM 처리는 SaOS-2 세포와 유사한 1 차 인간 조골 세포에서도 ALP 활성 (약 70 %)을 억제했다. 더욱이, 항 -SOST 항체에 의해 중화된 SOST를 갖는 Ti CM의 처리는 일차 인간 조골 세포에서 ALP 활성의 부분적인 회복을 보여 주어 SaOS-2 세포로부터의 결과를 입증했다 (도 7H).

TJA 이후, 임플란트의 정기적인 사용은 종종 임상 환경에서의 실패와 관련이 있다. 임플란트 표면의 기계적 마모를 형성하는 상당한 양의 마모 파편이 방출되면 일반적으로 FLS, 대식세포, 조골 세포, 파골 세포 및 수지상 세포와 같은 활막의 골 이식 층에 존재하는 다양한 종류의 세포에서 염증 반응을 유발한다. 우리의 이전 연구는 인공 삽입물과 같은 조건 동안 조골 세포의 낮은 뼈 형성 능력에 영향을 미치는 다양한 세포 유형 간의 세포 상호 작용의 중요성을 강조했다. Ti 입자 자극 대식세포에서 TNF-α의 분비는 골격자로부터 WNT 및 BMP 신호 경로 길항제인 SOST의 자동분비 분비를 유도하여 골생제제의 골유발 능력을 억제하는 것으로 관찰되었다. 삽입물 주위 막에 존재하는 다양한 세포 유형 중에서 FLS가 대다수를 구성하며 관절 보철 표면의 마모 파편에 의해 영향을 받는 것으로 나타났다. 따라서, 본 연구는 마모 파편으로 유도된 골 용해 중에 종종 관찰되는 바와 같이 강화된 파골 세포 형성 또는 방해된 골 형성에서 Ti 입자-자극 FLS의 역할을 관찰하는 것을 목표로 하였다. 이를 위해 인간 활막 조직 샘플에서 분리된 FLS를 특성화하고 (보조 도 S1) 마모 잔해 (Ti 입자)의 효과를 연구하는 데 활용했다. 마모 잔해는 IL-6, TNF-α, IL1β 및 COX-2 및 프로스타글란딘 E2 (PGE2)와 같은 전 염증 매개체의 유출을 유발하여 FLS에서 염증 반응을 유발하는 것으로 알려져 있다. 이러한 연구에 따르면 Ti 입자에 의한 인간 FLS의 자극은 COX-2의 발현을 유도하고 NFκB 신호 전달 경로를 활성화시켰다 (도 1). 더욱이, IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-8, IL-11, IL-17, Rankl과 같은 염증 및 파골 세포 형성 매개체의 증가 된 mRNA 발현이 Ti 입자로 자극 된 FLS에서 관찰되었다 (도 1).

마모 파편으로 자극된 FLS는 뼈 흡수 인자를 분비하고 파골 세포 형성을 지원하는 것으로 알려져 있습니다. Ti 입자로 자극된 FLS는 전 염증 매개체의 발현 증가를 보여주었기 때문에 이러한 분비물의 효과를 정의 할 필요가 있었습니다. Ti CM은 대식 세포주 인 RAW 264.7 세포에서 TRAP, Rankl, CSTK, MMP-9와 같은 파골 세포 인자의 mRNA 발현을 증가시켰다. 더욱이 Ti CM에 의한 자극은 파골 세포 형성 마커, TRAP 활성 (TRAP 염색)을 증가 시켰을 뿐만 아니라 RAW 264.7 세포에서 다핵 성숙 파골 세포 형성을 유도했다 (도 2). 이러한 결과는 Ti CM에서 Ti 자극 -FLS로부터 분비 된 파골 세포 형성 매개체의 존재를 입증하고 마모 파편으로 유도 된 골 용해 동안 증가 된 파골 세포 생성 활성에 FLS의 관여를 확인했다.

인공 삽입물 주위 골 용해 동안, 강화 된 파골 세포 형성과는 별개로, 골 형성 활동의 방해는 TJA 이후 골 침식의 또 다른 주요 원인이다. 최근 임플란트 교체에 실패한 환자의 계면 막에서 유래된 섬유 아세포는 골아 세포에서 콜라겐 합성을 억제 할 수있는 골 흡수 MMP 및 매개체를 분비하는 것으로 보고되었다. 그러나 조골 세포의 골 형성 활동을 방해하는 FLS의 역할에 대한 통찰력을 제공할 수 있는 다른 보고서는 없다. 따라서 조골 세포의 골 형성 능력에 대한 Ti CM에서 FLS에 의한 분비 분자의 역할을 관찰하기 위해 Ti CM *?* 후 SaOS-2 세포의 골 형성 매개 변수를 관찰하였다. Ti CM에 존재하는 분비 인자가 조골 세포에 대한 초기 (ALP 활성, 전사 인자 : Runx2 및 Osterix)뿐만 아니라 후기 (BSP, 무기질화 및 콜라겐 합성) 분화 마커를 억제했다는 점에 주목하는 것이 흥미로웠습니다 (도 3). 골격이 발달하는 동안 골 형성 계통의 세포 증식, 분화 및 생존은 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 엄격한 규제 하에 있다. Ti CM이 조골 세포의 골 형성 활성을 억제함에 따라 Ti CM에 존재하는 분비 인자가 WNT 및 BMP와 같은 골 신호 전달 경로에 억제 역할을 할 수 있다고 가정했다. Ti CM의 처리는 골아 세포에서 기저 WNT 및 BMP 신호 전달 활성을 억제하여 골 형성 신호 전달 경로에 대한 CM의 분비 인자의 억제 역할을 암시한다 (도 4). 더욱이, 재조합 Wnt3a 및 Bmp-2 단백질에 의한 외인성 처리는 WNT 및 BMP 신호 전달 경로와 골 형성 마커 모두에 대한 Ti CM의 억제 효과를 구제하지 못하여 CM에서 분비 인자의 WNT 및 BMP 신호 억제 능력을 검증하는 데 실패했다. 조골 세포의 경로와 골 형성 활동 (도 5 & 6).

WNT와 BMP 신호 전달 경로를 모두 관리하는 조절 메커니즘 중 하나는 분비 된 길항제를 통하는 것이다. 류마티스 관절염 (RA)과 같은 염증 상태에서 FLS는 DKK1 및 SOST와 같은 WNT 길항제를 분비하는 능력을 가지고있는 것으로 나타났다. Ti 입자는 FLS에서 염증 반응을 유도하기 때문에 Ti CM에서 WNT 및 BMP 신호 전달 길항제의 분비 가능성을 높힌다. Ti 입자를 FLS로 처리 한 후 WNT 및 BMP 신호 전달 길항제의 모든 상향 조절된 발현에 대한 스크리닝은 WNT 길항제, DKK2, sFRP3, sFRP5 및 SOST의 mRNA 발현이 증가했음을 나타냈다. BMP 신호 전달 경로의 경우 noggin, follistatin, SOST 및 chordin과 같은 길항제의 mRNA 발현이 상승한 것으로 나타났다 (보조 도 S5 및 도 7). 이러한 모든 길항제 중에서 SOST만이 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 모두 억제하는 것으로 알려있다. SOST는 지단백질 수용체 관련 단백질 5 또는 6 공동 수용체 (LRP5 / 6)에 결합하여 WNT 리간드가 WNT 신호 전달 경로를 활성화하기 위해 주름진 LRP 복합체 수용체에 결합하는 것을 방지한다. BMP 신호 전달의 경우, SOST는 BMP 분자에 결합하는 능력을 가지고 있으며 격리 및 세포 내 프로테아좀 분해를 유도하여 BMP 신호 전달 경로를 억제한다. 이러한 사실을 고려하고 SOST의 관련성을 확인하기 위해 SOST는 SOST 특이 적 항체에 의해 중화되었으며 골 형성 회복에 대한 일부 효과가 관찰되었다. 결과는 Ti CM에서 SOST의 중화 후 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 부분적인 회복을 보여 주었다. 더욱이, Ti CM에서 SOST의 중화는 조골 세포의 ALP 활성을 부분적으로 회복시켰다. 이러한 결과는 조골 세포에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 폐지함으로써 조골 세포의 골 형성 활성을 방해하는 Ti CM에서 Ti 입자 자극 FLS에 의해 분비되는 SOST의 억제 역할을 확인하고 검증한다 (도 7).

그러나 Ti CM에서 SOST를 중화시킨 후 ALP 활동뿐만 아니라 WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 완전한 회복을 얻지 못하면 추가 검증이 필요한 다른 요인 또는 메커니즘의 존재 가능성이 높아진다. 다른 WNT 및 BMP 길항제의 발현 증가는 Ti 입자가 FLS로 자극된 후 관찰되었다 (도 7). SOST는 WNT와 BMP 신호 전달 경로를 모두 억제하는 능력이 있기 때문에 억제된 골 형성 활성에서 그 역할을 연구했다. 그러나, WNT 및 BMP 신호 전달 경로의 다른 길항제는 골 형성 신호 전달 경로와 최종적으로 골아 세포의 골 형성 활성 모두의 억제에 기여할 수 있다. 따라서 SOST의 중화 후 골 형성 활동의 부분적인 회복을 설명 할 수 있는 이러한 길항제의 역할을 설명하기 위해 추가 연구가 필요할 것이다. FLS로부터 Ti CM에 의한 억제된 골 형성 활성의 완전한 회복에 기여할 수 있는 또 다른 가능성은 염증 조건 하에서 사이토 카인 유사 TNF-α의 강화된 분비가 조골 세포로부터 SOST의 분비를 유도하는 원인이 될 수 있다는 것이다. 자신의 골 형성 활동에 영향을 미치는 자가 분비 방식이다. 더욱이, TNF-α 자체는 뼈 형성에 대한 자극 또는 억제 효과를 가지고 있는 것으로 나타났으며 따라서 조사가 필요한 또 다른 요인이 될 수 있다. 다양한 세포 유형에서 TNF-α와 같은 염증 인자와 조골 세포의 뼈 형성 능력에 직접적으로 영향을 미칠 수 있는 SOST와 같은 분자에 대한보다 자세한 연구가 필요하다. 보철물 주변의 활막에서 다양한 세포 유형 간의 분자 상호 작용에 대한 명확한 통찰력이 매우 필요하며 이 현상에 대한 우리의 이해는 현재 매우 제한적이다. 이 연구는 Ti 자극 FLS in vitro 모델에서 항 골 형성 인자의 분비를 확인할 수 있었지만, 결과를 확인하려면 더 관련성이 높은 in vivo 모델을 기반으로 한 추가 연구가 필요하다. 그러나 마모 파편으로 인한 염증 동안 골아 세포와 FLS에 의한 SOST의 방출은 활액 공간에서 SOST의 중요성을 강조하고 삽입물 주위 골 용해 동안 뼈 형성 이벤트에 영향을 미칠 수 있는 정도는 추가 조사가 필요하다. 최근에 인간 SOST 단일 클론 항체 (Romosozumab)는 골절 위험이 높은 폐경기 여성의 골다공증 치료 용으로 승인되었다. 이 인간화 단일 클론 항체는 스클레로스틴 (SOST)의 활성을 억제하여 동시에 골 형성을 증가시키고 골 흡수를 감소시킴으로써 작동하도록 설계되었다. SOST를 억제하는 유사한 접근법은 삽입물 주위 골 용해 동안 골 형성 장애를 치료하는 데 도움이 될 수 있다. 그러나 임상 환경에 적용하기 위해서는 조직 임플란트 인터페이스에서 다양한 세포 유형 간의 누화를 이해하기 위해 보다 엄격한 접근 방식이 필요하므로 식별된 요인을 대상으로 하는 약물을 활용 한 결과를 평가할 수 있다. 또한 활막의 윤활 능력으로 인해 전체 고관절 교체시 보철물의 여러 부분 사이의 마찰을 줄이기 위해 활막을 회수하는 것이 제안되었다. 그러나 염증 상태에서 활막의 골아 세포 및 섬유 아세포와 같은 다양한 세포 유형으로부터 신호를 형성하는 뼈 형성 신호의 길항제 (예 : SOST)의 방출을 고려할 때 윤활 목적을 위한 활막의 회수는 논쟁의 여지가 있다. 따라서 임상의는 교체 수술 후 뼈 형성과 관련하여 활막의 회수 결과를 고려할 때 신중해야 한다.

종합 해보면, 마모 파편으로 자극된 FLS는 골 모세포 발생 뿐만 아니라 파골 세포 발생 과정 모두에 영향을 미쳐 삽입물 주위 골 용해 과정에서 뼈 재 형성 과정에 중요한 역할을 한다는 결론을 내릴 수 있다. 마모 잔해에 대한 반응으로 FLS는 골아 세포의 뼈 형성 능력에 영향을 미칠 수 있는 SOST와 같은 특정 인자의 분비 뿐만 아니라 파골 세포 형성에 영향을 미치고 유도할 수 있는 전 염증 매개체를 방출 할 수 있다. 이 연구는 RA 및 인공 삽입물 주위 골 용해와 같은 염증 상태에서 관찰되는 뼈 결함을 설명 할 수 있는 조절 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 손상된 뼈 형성을 치료하는데 적합한 치료 표적이 될 수 있는 SOST와 같은 뼈 억제 분자를 분비하고, 마모 파편에서 골 용해를 유도하는FLS의 역할을 강조한다.

이하, 도면을 상세하게 설명한다.

도 1은 Ti 입자에서 염증 및 면역 매개체의 발현 증가에 따른 인간 FLS 자극 여부를 나타낸 것으로, (A)는Ti CM의 분비 단백질 어레이 분석이이고, 전체 분비 단백질 중에서 상당히 상향 조절 된 분비 단백질이 분류되고 Cont CM에 대한 비율의 백분율로 표시된다. (B)는 Ti 입자 처리 12 시간에서 FLS는 COX-2의 유도 된 발현을 보였고 IκBα의 단백질 발현을 억제하였다. TNF-α는 양성 대조군으로 사용되었다. (C-I) 염증 매개체의 FLS 유도 mRNA 발현에 대한 Ti 입자의 처리; COX-2, 전 염증성 사이토 카인; IL-1β, IL-6, IL-8, IL-11, IL-17, TNF-α 및 파골 세포 형성 인자, Rankl. 데이터는 평균 ± SD로 표시되며, 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. (* P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 대 대조군)

도 2는 Ti CM은 Raw 264.7 세포에서 파골 세포 분화를 유도함을 보여주는 것으로,

(A)는 파골 세포 (100x)의 TRAP 염색, 파골 세포 형성 및 형태는 광학 현미경으로 관찰되었다. (B)는 2 개 이상의 핵을 갖는 TRAP 양성 세포의 수는 Raw 264.7 세포에 대한 Ti CM 또는 Rankl (50 ng / mL) 처리 9 일 후에 계수되었다. Rankl의 치료는 양성 대조군으로 간주되었다. (C)는 트랩 활동의 정량화. D (a-d) Ti CM은 Raw 264.7 세포에 대한 Ti CM 또는 Rankl 처리 9 일 후 파골 세포 마커 (TRAP, Rankl, MMP-9 및 CTSK)의 상대적 mRNA 발현을 유도했다. (H) NFATc1 리포터 플라스미드를 Raw 264.7 세포에 일시적으로 형질 감염시켰다. Ti CM을 24 시간 동안 처리하고 리포터 활성을 세포 용 해물에서 분석했다. Rankl 치료는 양성 대조군으로 간주된다. 데이터는 평균 ± S.D로 표현된다. (n = 3. * P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 대 대조군)

도 3은 Ti CM은 조골 세포의 골 형성 마커를 억제하는 것으로, (A) ALP 활성은 50 % 또는 100 % Ti CM으로 처리 한 후 48 시간 후에 수집 된 총 용 해물로 측정되었다. (B-E) SaOS-2 세포를 재료 및 방법에 설명 된대로 7 일 (D) 동안 분화 조건 하에서 성장시킨 다음 100 % Ti CM으로 24 시간 동안 처리했다. Osterix, Runx2, 콜라겐 1α 및 BSP의 전 사체는 추출 된 총 세포 RNA를 사용하여 실시간 RT-PCR로 분석되었습니다. 표시된 결과는 GAPDH 수준으로 정규화되었다. (F) Runx2 및 Osterix의 단백질 발현을 웨스턴 블 롯팅으로 분석했다. β-Actin은 로딩 제어로 사용된다. (G (a)) 콜라겐 합성 및 매트릭스 광물 화는 14 일째에 재료 및 방법 (G (b) 및 (G (b) &)에 설명 된대로 각각 Sirius Red (상단 레인) 및 Alizarin Red S (하단 레인) 염색 (전체 외관))에 의해 평가되었다. (c) Sirius Red S 및 Alizarin Red S 염색의 정량 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. (* P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001)

도 4는 Ti CM은 조골 세포에서 WNT 및 BMP 신호 전달 경로를 억제하는 것으로, SaOS-2 세포를 WNT 신호 전달을위한 Axin-2 리포터 구성 및 BMP 신호 전달을위한 BRE보고 구성으로 일시적으로 형질 감염시키고 상이한 용량의 Ti CM (50 % 및 100 %)으로 처리하였다. (A) Axin-2 리포터 활동 및 (B) BRE 리포터 활동은 수집 된 용 해물로 수행되었다. (C) Ti CM 처리 12 시간 및 24 시간 후 β- 카테닌의 단백질 발현. (D) Ti CM 처리 30 및 60 분 후 p-Smad 1/5/8의 단백질 발현을 웨스턴 블 롯팅으로 평가 하였다. β-Actin은 로딩 제어로 사용된다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. (* P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 대 대조군)

도 5는 Ti CM은 외인성 Wnt3a의 조골 세포에 대한 자극 후 골 형성 유도를 억제하는 것으로, SaOS-2 세포를 30 분 동안 Ti CM과 함께 사전 배양 한 후 Ti CM과 함께 재조합 Wnt3a로 자극 하였다. (A) Ti CM 처리된 SaOS-2 세포 (Axin-2 리포터 구축물 형질 감염 됨)로부터의 세포 용 해물을 24 시간 동안 수집하고 리포터 활성을 분석했다. (B) ALP 분석은 처리 48 시간 후에 수행되었다. (C-F) SaOS-2 세포는 재료 및 방법에 설명 된대로 7 일 (D) 동안 분화 조건 하에서 성장한 다음 24 시간 동안 100 % Ti CM으로 처리되었다. Osterix, Runx2, 콜라겐 1α 및 BSP의 상대적 mRNA 발현은 실시간 RT-PCR로 평가되었다. 표시된 결과는 GAPDH 수준으로 정규화되었다. (G) Runx2 및 Osterix의 단백질 발현은 SDS 겔 전기 영동으로 분석되었다. β-Actin은 로딩 제어로 사용된다. (H) 콜라겐 및 (I), 광물 화 합성은 각각 시리우스 레드 및 알리자린 레드 S 염색에 의해 처리 14 일 후에 평가되었다. (H (a)) 총 외관으로 묘사 된 콜라겐 침착. (H (b)) Sirius Red S 염색의 정량 분석. 광물 화에 대한 Ti CM의 효과는 (I (a)) 총 외관으로 묘사된다. (I (c)) Alizarin Red S 염색의 정량 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001 및 ns (유의 없음) 대 대조군)

도 6은 Ti CM은 골아 세포에 대한 외인성 Bmp-2의 자극 후 골 형성 유도를 억제하는 것으로, SaOS-2 세포를 Ti CM과 함께 30 분 동안 사전 인큐베이션 한 후 Ti CM과 함께 재조합 Bmp-2로 자극 하였다. (A) Ti CM 처리된 SaOS-2 세포 (Axin-2 리포터 구축물 형질 감염 됨)로부터의 세포 용 해물을 24 시간 동안 수집하고 리포터 활성을 분석했다. (B) ALP 분석은 처리 48 시간 후에 수행되었다. (C-F) SaOS-2 세포를 7 일 동안 재료 및 방법 (D)에 설명 된 분화 조건 하에서 성장시킨 다음 Bmp-2와 함께 24 시간 동안 100 % Ti CM으로 처리했다. Osterix, Runx2, 콜라겐 1α 및 BSP의 상대적 mRNA 발현은 실시간 RT-PCR로 평가되었다. 표시된 결과는 GAPDH 수준으로 정규화되었다. (G) 콜라겐 및 (H), 광물 화 합성은 처리 14 일 후 각각 Sirius Red 및 Alizarin Red S 염색에 의해 평가되었다. (G (a)) 콜라겐 침착 심한 외관. (G (b)) Sirius Red S 염색의 정량 분석. 광물화에 대한 Ti CM의 효과는 (H (a)) 총 외관으로 묘사된다. (H (b)) Alizarin Red S 염색의 정량 분석. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. (* P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 및 ns (유의 없음) 대 대조군)

도 7은 Ti CM의 SOST는 억제 된 WNT 및 BMP 신호 및 osteoprogenitors의 ALP 활성을 담당함을 보여주며, A) FLS에 대한 Ti 입자의 처리는 FLS에서 SOST의 mRNA 발현 (~ 40 배)을 유도했다. ELISA는 Ti 입자 처리 24 시간 (~ 6ng / mL) 및 48 시간 (~ 5ng / mL) 후 FLS의 CM에서 유도 된 SOST 방출을 나타냈다. (C) SOST에 대한 항체는 SaOS-2 세포에 대한 처리 전에 Ti CM에서 2 시간 동안 배양되었다. 24 시간 처리 후 Axin-2 리포터 활성 및 (D) BRE 리포터 활성을 분석 하였다. (E) β- 카테닌의 단백질 발현은 SDS 겔 전기 영동으로 분석 하였다. (F) p-smad1 / 5 / 8 단백질 발현의 안정성을 SDS 겔 전기 영동으로 분석 하였다. (G) ALP 활성의 변화 os SaOS-2는 처리 48 시간 후에 분석되었다. (H) SOST에 대한 항체는 일차 인간 조골 세포에 대한 처리 전에 Ti CM에서 2 시간 동안 배양되었다. 48 시간의 처리 후, ALP 활성의 변화를 분석했습니다. 데이터는 평균 ± SD로 표시됩니다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌습니다. (* P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 대 대조군)

도 8은 인간 활액 조직에서 분리 된 FLS의 특성으로, (A) 분리 된 FLS의 합류 단층은 통로 2에서 성장하고 20X 배율에서 관찰되었다. (BD) prolyl 4 hydroxylase (P4HB), vimentin 및 CD248과 같은 섬유 아세포 특이적 마커, (EG) osteocalcin (OCN), bone sialoprotein (BSP) 및 osteoprogrenin (OPG) 및 (H)와 같은 골아 세포 특이적 마커의 mRNA 발현 수준 단핵구 특이 적 마커 CD68은 계대 3, 1 차 골아 세포 (HOB) 및 단핵구 세포주 THP 1에서 FLS에서 실시간 RT-PCR에 의해 결정되었다. 데이터는 평균 ± SD로 표시된다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

도 9는 FLS에 대한 Ti 입자의 영향으로, (A & B) 1 : 100-1 : 400의 비율 (FLS 대 Ti 입자)은 치료 72 시간까지 FLS에 대한 세포 생존력 (MTT 분석) 및 세포 독성 (LDH 분석) 효과를 나타내지 않았다. (B) Ti CM의 분비 단백질 어레이 분석으로 Ti CM에서 총 분비 단백질은 9 개의 범주로 그룹화되고 Cont CM에 대한 비율의 백분율로 표시된다. (C) Ti 입자 처리는 시간 의존적 방식 (3, 6, 12 및 24 시간)으로 COX-2 발현을 유도했다. TNF-α는 양성 대조군으로 사용되었다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

도 10은 Raw 264.7 세포에서 Ti 입자가 세포 생존력 및 세포 독성에 미치는 영향으로, (A & B) 다른 백분율 (25 % -100 %)로 Raw 264.7 세포로 처리 된 Ti CM은 처리 72 시간까지 세포 생존력 (MTT 분석) 및 세포 독성 (LDH 분석) 효과를 나타내지 않았습니다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

도 11은 Ti 입자가 조골 세포의 세포 생존력 및 세포 독성에 미치는 영향으로, (A & B) SaOS-2 세포는 다양한 비율의 Ti CM (25 % -100 %)으로 처리되었습니다. 세포 생존력 (MTT 분석) 또는 세포 독성 활성 (LDH 분석)에 대한 영향은 Ti CM 처리 72 시간까지 관찰되지 않았습니다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다.

도 12는 Ti 입자는 FLS에서 WNT 및 BMP 신호 전달 길항제의 발현을 유도한 것으로, FLS에 대한 Ti 입자의 처리는 WNT 길항제의 mRNA 발현을 유도했다.(A) DKK2, (B) sFRP3, (C) sFRP5 및 BMP 신호 전달 길항제, (D) 노긴, (E) 코딘 및 (F) 폴리 스타틴이다. 세 번의 독립적 인 실험에서 유사한 결과가 얻어졌다. * P <0.05, ** P <0.01, ***, P <0.001 및 ns (유의 없음)는 대조군과 비교했다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.

Claims (5)

1. 스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 이용한 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 방법.
2. 인공관절 삽입물 주변의 골용해에서 골형성을 억제하기 위하여, 대상체에게 스클레로스틴(Sclerostin) 억제제를 투여하는, 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 치료 방법.
3. 티타늄 입자를 준비하는 단계;
   대상체의 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 준비하는 단계; 및
   상기 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 티타늄 입자로 처리하는 단계;를 포함하는 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 진단 방법.
4. 티타늄 입자를 준비하는 단계;
   대상체의 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 준비하는 단계; 및
   상기 섬유 아세포 유사 활막 세포 (Fibroblast-like synoviocytes, FLS)를 티타늄 입자로 처리하는 단계;를 포함하는 인공관절 마모편에 의한 활막염과 골용해의 치료방법.
5. 인공관절 삽입 후 발생하는 골용해증의 예방 또는 치료에 사용되는 스클레로스틴의 억제제.
   

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