KR20220022237A - 식물 세포에서 감수분열의 염색체 교차 재조합을 증가시키는 Protein phosphatase 4 복합체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 단계를 포함하는 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수를 증가시키는 방법, PP4 복합체의 기능을 저해시켜 야생형에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체의 제조방법 및 PP4 복합체의 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 식물 세포의 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 교차 재조합 수 증가 방법을 이용하면 작물 육종의 가속화 및 양적형질 지도 작성의 가속화를 극대화할 수 있다.

Description

식물 세포에서 감수분열의 염색체 교차 재조합을 증가시키는 Protein phosphatase 4 복합체 및 이의 용도{Protein phosphatase 4 complex for increasing chromosomal crossover recombination in meiosis of plant cell and uses thereof}

본 발명은 식물 세포에서 감수분열의 염색체 교차 재조합을 증가시키는 Protein phosphatase 4 (PP4) 복합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 애기장대 유래 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하여 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수를 증가시키는 방법, 야생형에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 야생형에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자, 및 PP4 복합체의 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는 식물 세포의 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가용 조성물에 관한 것이다.

감수분열(meiosis)은 진핵생물에서 특수화된 세포분열이다. 한 번의 DNA 복제 후 두 번의 연이은 염색체 분리(감수분열I, 감수분열Ⅱ)가 일어나며 반수체 세포를 생성한다(Villeneuve et al., 2001 Cell 106: 647-50; Mercier et al., 2015 Annu Rev Plant Biol 66: 297-327). 특히 감수분열I 전기 동안, 상동 염색체들은 물리적으로 서로 짝을 이루고 프로그램된 재조합을 수행하여 상동 염색체가 교차(crossover)를 형성한다. 따라서 반수체 세포들은 감수분열의 염색체 재조합과 독립적인 염색체 분리를 통하여 유전적으로 모자이크이고 독특한 유전정보를 갖는다. 결국, 감수분열을 통한 유성생식은 집단 내 유전변이, 생물의 환경 적응과 작물의 육종에 큰 영향을 미친다(Mercier et al., 2015).

감수분열 중 상동 염색체 재조합은 진화적으로 보존된 국소이성화효소(topoisomerase) 관련 단백질인 SPO11에 의한 DNA 이중가닥 절단(DNA double strand breaks, DSBs)의 형성으로부터 시작한다(Lam and Keeney, 2014 Cold Spring Harb Perspect Biol 7: a016634; Robert et al., 2016 Science 351: 943-949). 식물에서는 SPO11-1과 SPO11-2이 MTOPVIB 단백질과 이형사합체(heterotetramer)를 형성하여 DSB를 생성한다. DSB는 5'-3' 말단 절제(resection) 과정을 거쳐 3'-OH의 단일가닥 DNA(single strand DNA, ssDNA)를 형성하여 재조합 단백질 RAD51, DMC1과 결합한다. RAD51/DMC1 복합체는 상동 염색체의 DNA를 침투하여 대치고리(displacement loop, D-loop)를 형성한다. 야생형 애기장대에서 DMC1, RAD51, RPA1, yH2A.X의 면역염색을 통해 ~150-250개의 DSB 연관 foci가 형성됨을 확인할 수 있었다(Osman et al., 2009 EMBO J 28: 394-404; Fernandes et al., 2018 PLoS Genet 14: e1007317). 야생형에서는 단지 약 10개의 DSB만 교차(crossover)를 형성하다. 나머지 D-loop들은 FIGL1, RECQ4A, RECQ4B, FANCM이 관여하는 non-crossover(NCO) 경로에 의해 풀린다. DSB은 자매 염색분체(sister chromatid)에 의해 수선되기도 한다(Mercier et al., 2015).

식물에서 교차를 유도하는 주 경로는 ZMM 경로로도 알려진 Class I 경로이다. Class I 경로의 교차들은 교차 간섭의 영향을 받는다(Mercier et al., 2015). 즉, 교차들은 우연한 기대 이상으로 넓게 분포한다. 식물에서 80-85% 정도의 교차 형성은 Class I 경로에 의존하며 MSH4, MSH5, ZIP4, SHOC1, PTD, HEI10, HEIP1, MER3, MLH1, MLH3 유전자들이 관여한다(Mercier et al., 2005 Curr Biol 15: 692-701; Mercier et al., 2015; Higgins et al., 2004 Genes Dev 18: 2557-70; Copenhaver et al., 2002 Genetics 160: 1631-9). ZMM 경로는 D-loop를 안정화하고, double-Holliday junction에 작동하고 교차 형성을 촉진한다. 식물, 동물, 균계에서 연구를 통해 ZMM 단백질들의 기능을 밝혔다. MSH4와 MSH5는 복합체를 이루며 스라이딩 클램프 형태로 중간물(intermediate)을 안정화시킨다. SHOC1과 PTD 역시 복합체를 이루며 joint molecule에 강력히 결합한다. HEI10은 ubiqutin/SUMO E3 ligase로 발현양에 비례하여 교차를 촉진한다. MER3는 헬리카제(helicase)이며, MLH1과 MLH3은 복합체를 이루며 엔도뉴클레아제(endonuclease) 활성으로 double-Holliday junction을 분해(resolution)하며 교차를 형성한다. 식물에서 나머지 15-20%의 교차는 Class Ⅱ 경로에 의존적이며 이들은 교차 간섭에 민감하지 않다. Class Ⅱ 경로는 non-crossover를 촉진하며 교차를 억제한다(Mercier et al., 2015). fancm, recq4a recq4b, figl1과 같은 non-crossover 돌연변이체들에서는 Class Ⅱ 경로의 교차가 MUS81 엔도뉴클레아제에 의해 형성된다. 이들 non-crossover 돌연변이체에서 교차 증가는 모델 식물 애기장대 뿐만 아니라 벼, 토마토, 콩에서도 확인되었다.

한편, 한국공개특허 제2014-0056294호에는 '웅성 감수분열 모세포의 세포내 프로세스에 체계적으로 영향을 가하는 방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2002-0055539호에는 '수용체 유전자를 이용한 세포분열 조절물질 및 항암제 탐색방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '식물 세포에서 감수분열의 염색체 교차 재조합을 증가시키는 Protein phosphatase 4 복합체 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

감수분열 동안 염색체당 교차의 수는 1-3개로 제한되고, 이는 육종에서 linkage drag 문제 및 유용 형질들 조합에 큰 걸림돌이 되고 있다. 본 발명자는 애기장대 형광 종자 교차 측정 시스템을 활용하여, 알려진 Class Ⅱ 경로의 교차 억제 인자들 이외에 Class I 경로에서 작동하는 새로운 교차 억제 인자를 유전학적 스크링을 통해 찾고자 하였다.

본 발명자는 애기장대 형광 종자 리포터 라인에 EMS(Ethyl-methane-sulfonate)를 처리하여 염색체당 교차 수가 야생형에 비해 증가된 hcr1 (high crossover rate 1) 돌연변이체를 확보하였고, SHOREmap 분석을 통해 상기 HCR1이 식물을 포함한 모든 진핵생물에서 보존된 PP4 (Protein phosphatase 4)의 촉매소단위체(catalytic subunit)인 PPX1 (Protein phosphatase X-1)임을 확인하였다. 또한, hcr1 돌연변이체와 다른 종류의 형광 종자 리포터 라인 또는 형광 꽃가루 리포터 라인과 교배한 후 잡종 세대를 대상으로 GBS(genotyping by sequencing) 분석을 수행한 결과, 유전체 전체에서 교차 수가 증가되었음을 확인하였으며, hcr1 돌연변이와 Class Ⅱ 경로의 교차 억제 인자인 fancm가 함께 이중 돌연변이체가 되면 교차가 추가적으로 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명의 PPX1이 Class I 경로에서 작동하는 새로운 교차 억제 인자로서, 발현 억제 또는 기능상실 돌연변이를 통해 교차 수를 효과적으로 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 단계를 포함하는, 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수를 증가시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 식물 세포에서 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 야생형에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 PP4 복합체의 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 식물 세포의 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 애기장대 PPX1 (Protein phosphatase 4 catalytic subunit) 유전자는 감수분열 교차 형성(crossover formation) Class I 경로에서 교차 억제 유전자로 작동하므로, 기능상실(loss of function) 돌연변이를 유도하거나 발현을 억제하면 염색체당 교차 수가 증가될 수 있다. 또한 Class Ⅱ 경로의 교차 억제 유전자와 함께 이중 돌연변이체가 되면 교차 수가 추가적으로 증가하여 작물 육종의 가속화 및 양적형질 지도 작성의 가속화를 극대화할 수 있다. 더욱이, PPX1 유전자는 진핵생물에서 잘 보존되어 있기 때문에 본 발명에서 활용한 녹다운(knockdown) 방식으로도 대부분의 작물에서 교차 수를 효과적으로 증가시킬 수 있을 것이다.

도 1은 형광 종자 리포터 라인(420 GR/GR)을 활용하여 유전학적 스크리닝을 통해 교차가 증가한 애기장대 hcr1 (high crossover rate 1) 돌연변이체를 확보하는 과정을 보여준다. 도 1a는 420 GR/++ 식물체에 EMS(Ethyl-methane-sulfonate)를 처리하여 스크리닝 집단을 제작한 과정을 보여준다. 도 1b는 교차 증가 돌연변이 스크리닝에 활용한 형광 종자 라인(420 GR/++)과 이미지 분석 프로그램 CellProfiler로 분석한 대표 그림이다. 도 1c는 스크리닝을 통해 확보한 교차 증가 돌연변이체(hcr)들의 교차 빈도 측정 결과이다. 빨간점은 평균값을 의미한다. 420 (GR/GR)은 3번 염색체의 sub-telomeric 부위에 녹색(eGFP)과 빨간색(dsRed) 마커가 5.1 Mbp 간격으로 위치한 FTL(Fluorescent tagged line)로, 유전적 배경은 Col이다.
도 2는 hcr1 돌연변이가 PPX1 (PP4 catalytic subunit, At4g26720) 유전자의 스플라이싱 자리(splicing site)에 발생하여 기능상실 대립유전자(loss of function allele)임을 보여준다. 도 2a는 hcr1 돌연변이체 이형접합체와 BC₁F₂에서 420의 교차율을 보여준다. 도 2b는 BC₁F₂ 60개체의 유전체를 시퀀싱하여 hcr1의 돌연변이 위치를 확인한 것으로, 염색체 4번에 위치함을 보여준다. 도 2c는 hcr1 돌연변이가 포스파타제(phosphatase)를 코딩하는 PPX1(At4g26720) 유전자의 3번째 인트론의 donor site(5' splice site)에 발생한 것(hcr1-1, G→A)을 보여준다. 도 2d는 애기장대에서 PP4 포스파타제 복합체를 구성하는 소단위체들 및 이들의 유전자 정보를 나타낸다. 도 2e는 진화적으로 잘 보존된 PPX1의 계통도를 보여준다. 도 2f는 PPX1 게노믹 DNA를 hcr1 돌연변이체에 도입하여 증가되었던 교차율이 다시 야생형 수준으로 회복되는 것을 확인한 상보성 검증 결과이다. 도 2g는 hcr1의 또다른 돌연변이체 (At4g26720 유전자의 5' UTR에 T-DNA 삽입)인 hcr1-2에서도 교차가 증가하고, hcr1-1/hcr1-2 F₁에서도 교차가 증가하였음을 보여준다. 도 2h는 PPX1의 이원체(paralog)인 PPX2의 돌연변이체(ppx2), PPX1과 PPX2의 돌연변이체(hcr1-2 ppx2), 및 PP4 포스파타제 복합체 구성원인 PP4R2 소단위체의 돌연변이체(pp4r2)에서도 야생형과 비교하여 교차가 증가하였음을 보여준다.
도 3은 PPX1 및/또는 PPX2 유전자를 녹다운한 형질전환체에서 진정염색질(euchromatin, 염색체 상에서 발현해야 할 유전자들이 많이 분포되어 있는 지역) 부위에서 교차가 증가하는 것을 보여준다. 도 3a는 miR173을 활용한 감수분열 특이적 miRNA-induced gene silencing을 위해 사용한 벡터의 도식이다(meiMIGS-PPX1, -PPX2, -PPX1-PPX2). PPX1 및 PPX2 박스 상단에 표시된 숫자는 각각 At4g26720 및 At5g55260의 염기서열에서 염기 위치를 나타낸다. 도 3b는 RT-qPCR를 통해 meiMGIS-PPX1, meiMGIS-PPX2, meiMIGS-PPX1-PPX2에서 PPX1 및 PPX2의 전사체 발현량이 감소했음을 보여준다. 도 3c는 meiMGIS-PPX1, meiMGIS-PPX2, meiMGIS-PPX1-PPX2 형질전환체 모두가 hcr1 처럼 교차가 증가했음을 보여준다. 도 3d는 형광 종자 교차 리포터 라인(CTL: Columbia traffic lines) 및 형광 꽃가루 교차 리포터 라인들의 유전체 상 위치이다. 도 3e는 hcr1과 다양한 형광 종자 교차 리포터 라인의 교배 결과에서 야생형과의 교배 결과에 비해 교차 수가 증가함을 보여준다. 도 3f는 meiMIGS-PPX1-PPX2와 다양한 형광 종자 교차 리포터 라인의 교배 결과에서 야생형과의 교배 결과에 비해 교차 수가 증가함을 보여준다. 도 3g는 meiMIGS-PPX1-PPX2와 다양한 형광 꽃가루 교차 리포터 라인의 교배 결과에서 야생형과의 교배 결과에 비해 교차 수가 증가함을 보여준다. 도 3h는 meiMIGS-PPX1-PPX2와 형광 꽃가루 교차 리포터 라인들의 교배 결과에서 교차 간섭률(interference ratio, IFR)이 약해진 것을 보여준다(IFR이 1에 가까우면 교차 간섭이 없어진다). 도 3i는 교차 증가가 염색체의 텔로미어(telomere) 부근에서 주로 발생하였고 동원체(centromere) 부근에서는 많지 않음을 보여준다.
도 4는 meiMIGS-PPX1-PPX2에서 유전체 수준의 교차 증가를 보여준다. 도 4a는 meiMIGS-PPX1-PPX2에서 교차 지도 작성을 위한 GBS(genotyping-by-sequencing) 분석용 F₂ 식물체의 준비 과정이다. 도 4b는 meiMIGS-PPX1-PPX2 Col/Ler 잡종 F₁의 감수분열에서 교차가 증가했음을 보여준다. 도 4c는 meiMIGS-PPX1-PPX2 Col/Ler 잡종 F₂ 개체당 교차 평균이 야생형 7.5에 비해 9.7개로 증가했음을 보여준다. 도 4d는 meiMIGS-PPX1-PPX2의 각 염색체에서 교차가 증가했음을 보여준다. 도 4e는 meiMIGS-PPX1-PPX2의 교차 증가가 대부분 텔로미어(telomere) 부근에서 주로 발생하였고 동원체(centromere) 부근에서는 변화가 없음을 보여주는 것으로, 빨간색 실선과 파란색 실선은 각각 meiMIGS-PPX1-PPX2와 야생형의 교차를 나타내고, 점선은 평균값을 나타낸다. 또한, 녹색 및 분홍색의 바는 각각 SNP 및 DNA 메틸화를 의미한다. 도 4f는 유전체 수준에서 meiMIGS-PPX1-PPX2의 교차 증가 부위를 보여준다.
도 5a는 hcr1에서 감수분열 동안 염색체 행동에 큰 변화가 없음을 보여주고, 도 5b는 축 요소(axis element)와 시냅토네마 복합체(synaptonemal complex, SC)를 ASY1과 ZYP1의 면역염색을 통해 hcr1에서 변화 없음을 보여준다. 도 5c 및 5d는 DSB 위치에 겹치는 RAD51 foci 수가 변화 없음을 보여준다. 도 5e 및 5f는 교차 위치에 겹치는 MLH1 foci 수가 hcr1 돌연변이체에서 증가함을 보여준다. 모든 scale bar는 10 μm를 나타낸다.
도 6은 PPX1은 Class I 교차를 억제함을 보여준다. 도 6a는 hcr1 돌연변이체가 zip4, Class I 돌연변이체의 불임을 회복하지 못함을 보여준다. 도 6b는 Class Ⅱ 돌연변이체인 fancm과 이중 돌연변이가 됐을 때 각각의 단일 돌연변이체보다 교차가 추가로 증가함을 보여준다. 도 6c 및 6d는 애기장대 원형질체에서 PPX1이 Class I 경로에 관여하는 HEI10, PTD 및 MSH5와 결합함을 면역 염색과 co-IP(immunoprecipitation)를 통해 보여준다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 단계를 포함하는, 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수를 증가시키는 방법을 제공한다.

상동 염색체(homologous chromosome)는 감수분열(meiosis) 과정에서 세포 내에서 서로 짝을 이루는 부모로부터 각각 하나씩 물려 받은 크기와 모양이 거의 같은 염색체를 의미한다. 이러한 상동 염색체는 감수분열 제I분열의 전기 단계에서 상동 염색체의 분체끼리 일부가 교환되는(재조합되는) 교차(crossover)가 발생하고, 이러한 상동 염색체의 교차는 유전적 다양성 형성에 기여하게 된다.

본 발명에 따른 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가 방법에 있어서, 상기 PP4 복합체의 기능 저해는 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하여 이루어지는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가 방법에 있어서, 상기 PP4 촉매소단위체 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 PP4 조절소단위체 단백질은 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 PP4 촉매소단위체 및 PP4 조절소단위체 단백질의 범위는 각각 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1, 서열번호 3, 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 또는 서열번호 11로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 PP4 촉매소단위체 및/또는 PP4 조절소단위체 단백질의 돌연변이 또는 발현 저해를 통해 야생형 즉, 비형질전환체에 비해 상동 염색체의 교차 재조합 수를 증가시키는 활성을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 PP4 catalytic (PP4C) subunit 1 (PP4-1, PPX-1)이고, 상기 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 PP4 catalytic (PP4C) subunit 2 (PP4-2, PPX-2)이며, 상기 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 PP4 regulatory (PP4R) subunit 2 (PP4R2)이고, 서열번호 7 및 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 PP4 regulatory (PP4R) subunit 3A (PP4R3A)이고, 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 PP4 regulatory (PP4R) subunit 3A (PP4R3B)를 나타낸다.

또한, 본 발명은 상기 PP4 촉매소단위체 및 PP4 조절소단위체 단백질을 암호화하는 유전자를 제공한다. 본 발명의 PP4 촉매소단위체 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 2 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열을 포함하며, PP4 조절소단위체 단백질을 암호화하는 유전자는 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2, 서열번호 4, 서열번호 6, 서열번호 8, 서열번호 10 또는 서열번호 12의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명에서 있어서, 상기 서열번호 2의 염기서열은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 4의 염기서열은 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 6의 염기서열은 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 8의 염기서열은 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 10의 염기서열은 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 단백질; 서열번호 12의 염기서열은 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 단백질;을 코딩하는 서열이다.

본 발명의 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 또는 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 상기 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 또는 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자를 발현 저해 벡터인 VIGS (virus-induced gene silencing) 벡터나 RNAi 벡터에 삽입하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 본 발명은 감수분열 단계에서 특이적으로 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 또는 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하기 위해, 감수분열 특이적 유전자인 DMC1의 프로모터를 사용한 감수분열 특이적 microRNA 매개 유전자 침묵(meiosis-specific microRNA mediated gene silencing) 방법을 사용하였다.

본 발명의 상동 염색체의 교차 재조합 수 증가 방법은, 본 발명에 따른 PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능 저해와 동시에, FIGL1 (AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE 1), RECQ4A (ATP-dependent DNA helicase Q-like 4A), RECQ4B 및 FANCM (Fanconi anemia group M protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 기능을 추가로 저해하여 식물 세포에서 상동 염색체의 교차 재조합 수를 보다 증가시킬 수 있다.

본 발명은 또한, 식물 세포에서 PP4 (Protein phosphatase 4) 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조방법에 있어서, 상기 식물 세포에서 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현 저해는 감수분열 단계에서 특이적으로 표적 유전자 침묵을 매개하는 재조합 벡터를 식물세포에 형질전환하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 VIGS 벡터 또는 RNAi 벡터이다. VIGS (Virus-induced gene silencing)는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence specific) 이라는 특징들을 가진다. 상기 VIGS 벡터는 외래 유전자를 도입한 식물체 내에서 일시적으로 발현시킬 수 있는 일시적(transient) 발현 벡터 및 외래 유전자가 도입된 식물체에서 영구적으로 발현시킬 수 있는 식물 발현 벡터로 사용할 수 있다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터 (EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리 (binary) 벡터이다.

발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 프로모터는 T7 프로모터, SP6 프로모터, CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터 등 당업계에 공지된 식물 프로모터를 선택적으로 사용할 수 있으며, 표적 유전자를 세포의 감수분열 단계에서 특이적으로 발현 저해할 수 있는 감수분열 특이적 프로모터 예컨대, DMC1 (DNA meiotic recombinase 1) 프로모터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseolin) 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로, 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및 (또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 투머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 제조방법은 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계를 포함하는데, 상기 형질전환은 예를 들면, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefiaciens)에 의해 매개될 수 있다. 또한, 본 발명의 방법은 상기 형질전환된 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 단계를 포함한다. 형질전환 식물 세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법으로 제조된 야생형에 비해 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 식물 세포의 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 조성물에 있어서, 상기 PP4 복합체의 기능 저해 물질은 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적인 항체; 또는 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하는 miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA) 또는 antisense RNA;일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 조성물은, FIGL1 (AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE 1), RECQ4A (ATP-dependent DNA helicase Q-like 4A), RECQ4B 또는 FANCM (Fanconi anemia group M protein) 단백질의 발현 또는 기능 저해 물질을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료

애기장대 식물체는 22℃, 50-60% 습도 및 16/8시간 명/암 주기의 조건으로 조절된 조건에서 생장시켰다. 종자는 발아를 위해 암 조건의 4℃에서 3-4일 배양하였다. 종자에서 표현되는 FTL(Fluorescent tagged line)과 꽃가루에서 표현되는 FTL 라인들을 사용하였다(Wu, G., et al., (2015) Genetics 200:35-45; Melamed-Bessudo, C., et al., (2005) Plant J. 43:458-66). T-DNA 삽입 계통인 ppx1 (GK_651B07), ppx2 (GK_488H09), pp4r2 (SALK_093051) 및 zip4-2 (SALK_068052)와 EMS 돌연변이체인 fancm-1는 NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Centre)로부터 제공받았다. hcr2-1의 유전형분석은 PCR 증폭을 통해 수행되었으며, 야생형의 대립유전자는 ppx1-F 및 ppx1-R의 프라이머 세트를 사용하였고, T-DNA 대립유전자를 위해서는 ppx1-F 및 GABI_LB 프라이머 세트를 사용하였다. ppx2-1의 유전형분석은 야생형의 대립유전자는 ppx2-F 및 ppx2-R의 프라이머 세트, T-DNA 대립유전자는 ppx2-R 및 GABI_LB 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭을 통해 수행되었다. pp4r2의 유전형분석은 야생형의 대립유전자는 pp4r2-F 및 pp4r2-R의 프라이머 세트, T-DNA 대립유전자는 pp4r2-R 및 LBb1.3 프라이머 세트를 사용하여 PCR 증폭을 통해 수행되었다. hcr1-1의 유전형분석은 hcr1-F 및 hcr1-R dCAPs 마커를 사용한 PCR 증폭 후, FokI 제한효소 처리를 통해 분석하였다. zip4-2 및 fancm-1의 유전형분석은 이전의 방법으로 수행되었다(Yelina, N. E. et al., (2015) Genes Dev. 29:2183-202 ).

2. EMS(Ethyl-methyl sulfonate) 처리를 통한 돌연변이 유도

420 (GR/GR) 동형접합체와 야생형 애기장대(Col-0)의 교배로부터 획득된 420 GR/++ 반접합체(hemizygote) 식물체의 약 10,000개 종자를 100 mM의 인산 완충액(pH 7.5) 40㎖에 1시간 동안 담궈둔 후 신선한 인산 완충액으로 세척하고, 0.3%(v/v) EMS를 처리하고 상온에서 12시간동안 반응시켰다(도 1a). EMS 처리한 종자는 증류수로 10회 세척하고 즉시 토양에 심었다. 이들 종자로부터 약 7,000개의 M₁ 식물체가 발아되고 성장하였다. 12개의 독립적인 M₁ 식물체로부터 종자를 결합하여 약 600개의 M₂ 집단을 생성하였다. 각 M₂ 집단으로부터 약 150개 종자를 빨간색과 녹색의 형광에 근거하여 420 GR/++ 반접합체로 지정하고 생장시켜 자가 수정하였다. 이로부터 유래된 종자를 420 교차 빈도(crossover frequency) 분석에 사용하였다.

3. 형광 종자 및 형광 꽃가루를 이용한 교차 빈도 및 간섭의 측정

교차 빈도는 CellProfiler 이미지 분석 프로그램을 사용하여 FTL/++ 반접합체 식물체의 형광 및 비형광 종자를 계수하여 분석하였다. CellProfiler는 녹색 단독 형광 종자(N_Green), 빨간색 단독 형광 종자(N_Red), 및 총 종자수(N_Total)를 정량화할 수 있고, 교차 빈도(cM)는 하기의 공식을 통해 계산되었다. 유전자형간의 교차 빈도 유의성 검증은 Welch's t-test를 사용하였다.

cM = 100 x (1-[1[2(N_Green+N_Red)/N_Total]^1/2)

꽃가루 FTLs은 qrt-1 돌연변이 배경에서 제조되었으며, 웅성 감수분열의 4개 꽃가루 생성물이 서로 붙어있다. FTLs은 post-meiotic LAT52 프로모터의 조절하에 eYFP (Y), dsRed (R) 또는 eCFP (C)를 발현한다. 꽃가루사분자(pollen tetrad) FTL-기반 교차 빈도 및 간섭의 측정은 DeepTetrad를 사용하여 수행하였다(Berchowitz, L. E. & Copenhaver, G. P. (2008) Nat. Protoc. 3:41-50; Lim, E. C. et al., (2020) Plant J. 101:473-483). DeepTetrad는 딥러닝(deep-learning) 기반 이미지 분석 시스템으로, 둘 또는 세가지 컬러 FTL intervals의 꽃가루 사분자 종류를 인식할 수 있다. 두가지 컬러 FTL interval CEN3은 parental ditype(PD), tetra type(T) 및 non-parental ditype(NPD) 사분자를 생산하고, 교차 빈도는 Perkin's 방정식을 사용하여 계산하였다.

cM = 0.5T + 3NPD / (PD + T + NPD) * 100

세가지 컬러 FTL interval (I1bc, I1fg, I2fg, I3bc 및 I5ab)은 12개의 사분자 종류를 생산한다: no recombination (A), single crossover interval 1 (B; SCO-i1), single crossover interval 2 (C; SCO-i2), two-strand double crossover (D; 2st DCO), three-strand double crossover a (E; 3st DCOa), three-strand double crossover b (F; 3st DCOb), four-strand double crossover (G; 4st DCO), non-parental ditype interval 1, non-crossover interval 2 (H; NPD-i1 NCO-i2), non-crossover interval 1, non-parental ditype interval 2 (I; NCO-i1 NPD-i2), non-parental ditype interval 1, single crossover interval 2 (J; NPD-i1 SCO-i2), single crossover interval 1, non-parental ditype interval 2 (K; SCO-i1 NPD-i2) 및 non-parental ditype interval 1, non-parental ditype interval 2 (L; NPD-i1 NPD-i2). 형광 종자 상태는 DeepTetrad를 사용하여 확인하였고, 교차 빈도 및 간섭은 Perkin's 방정식을 사용하여 계산하였다.

두 개의 연결된 interval에서 교차 간섭률(IFR=σ)은 인접한 교차 X_γ를 가진 유전자 지도 거리 대 인접한 교차 X_δ를 포함하지 않는 유전자 지도 거리의 비율로, 다음의 공식을 사용하여 DeepTetrad로 계산하였다.

4. DNA 시퀀싱과 SHOREmap을 이용한 hcr1-1 돌연변이의 확인

높은 (>27 cM) 420 교차 빈도를 가지는 50개의 hcr1 BC₁F₂ 개체를 확인하였고, 각 BC₁F₂ 개체로부터 획득한 종자 5 ㎎을 모았다. 멸균된 종자를 1/2 MS 고체 배지에서 발아시키고 7일령의 유묘를 수집하였다. 모은 유묘의 약 3 g을 액체 질소를 이용하여 분말화하였다. 상기 분말을 40㎖의 nuclear isolation 버퍼(25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.44 M sucrose, 10 mM MgCl₂, 0.5% Triton X-100, 10 mM β-mercaptoethanol, 2 mM spermine, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail)를 사용하여 균질화하였다. 용해물은 교반하여 ice에서 30분간 반응시킨 후 4℃, 3,000g에서 25분간 원심분리하고 펠렛 부분을 CTAB(Cetyl trimethylammonium bromide)를 이용한 DNA 추출에 사용하였다. 추출 및 정제한 DNA는 Bioruptor sonicator를 사용하여 200-500 bp 크기로 잘랐다. 정제된 DNA를 Illumina Truseq Nano DNA LT library prep kit를 사용하여 라이브러리 구축에 사용하였고 hcr1 BC₁F₂ 라이브러리는 Illumina Genome Analyser (100 bp paired) Hiseq 2000 장비를 사용하여 시퀀싱하였다.

Paired-end reads를 GenomeMapper 툴을 사용한 TAIR10 참조 게놈에 정렬하기 위해 SHOREmap (v.3.0)을 사용하였다. 원시 reads는 SHORE import 기능을 사용하여 +33 또는 +64의 Phred 점수 컷 오프를 가진 quality value에 따라 다듬고, SHORE consensus 기능을 사용하여 hcr1 BC₁F₂와 TAIR10 참조 어셈블리간 서열 변이를 검출하였다. 높은 마커 점수(>40)를 가진 SNP (Single nucleotide polymorphism)를 SHOREmap backcross 기능을 사용한 대립유전자 빈도 분석에 사용하였다. 돌연변이는 (i) 80% 이상의 대립유전자 빈도. 및 (ⅱ) 예측된 유전자 내에서 비동의(non-synonymous) 변이, splice site 또는 조기종결코돈 변화를 가진 것들을 스크리닝하였다. 또한 후보 돌연변이는 감수분열, 핵 내 단백질 위치 및 TAIR 데이터베이스에 제공된 알려진 분자 기능과 관련하여 예측되거나 알려진 기능을 가진 유전자 내의 위치를 기반으로 검사되었다.

5. PPX1 에 의한 hcr1-1 의 유전적 상보성

HCR1/PPX1를 포함하는 4.5 kb 크기의 게노믹 DNA 단편을 PPX1-F 및 PPX1-R 프라이머 세트를 이용하여 증폭하였다. PCR 산물은 PstI와 SmaI 제한효소로 절단한 후 pGREEN0029 벡터로 클로닝하였다. pGREEN0029-PPX1와 empty 벡터를 전기천공법(electroporation)으로 아그로박테리움 GV3101-pSOUP 균주로 도입하고, 상기 아그로박테리움 균주를 꽃대 침지법(floral dipping)으로 식물체에 형질전환하였다. T₁ 식물체는 카나마이신 저항성과 HCR1/PPX1 전이유전자의 LB와 RB에 특이적인 프라이머 세트를 사용한 유전형분석을 통해 선별하였다.

6. PPX/PP4 계통도

PPX/PP4 계통도를 구축하기 위해 neighbour-joining 방법을 사용하였다. 다중 서열 정렬에 사용된 아미노산 정보는 다음과 같다: AtPPX1 (NP_194402.1), AtPPX2 (NP_200337.1), OsPPX (XP_015612628), DmPp4-19C (NP_001285489), HsPPP4C (NP_001290432), Cepph-4.1 (NP_499603), Cepph-4.2 (NP_001022898) 및 ScPPH3 (AJV04101).

7. meiMIGS-PPX1, meiMIGS-PPX2 및 meiMIGS-PPX1-PPX2 형질전환 식물체 제조

감수분열 특이적 microRNA 매개 유전자 침묵(meiosis-specific microRNA mediated gene silencing, meiMIGS) 형질전환 식물체를 제조하기 위해서, DMC1 프로모터, 5'-UTR, 2개의 인트론 및 엑손 서열을 포함하는 1.5 kb 크기의 게노믹 DNA를 야생형(Col) 게노믹 DNA로부터 DMC1-1p_1.5kb-Lv0-GGAG-F와 DMC1-1p_1.5kb-Lv0-CATT-R 프라이머를 사용하여 증폭하였다. PCR 산물은 골든 게이트 클로닝 시스템을 이용하여 universal Level 0 (Lv0) 벡터(pICH41331)로 클로닝하였다. PPX1과 PPX2 cDNA 부위는 miR173 표적 서열을 포함하는 정방향 및 역방향 프라이머로 증폭한 후 Lv0 벡터(pICH41331)로 클로닝하였다. PPX1-PPX2 융합 cDNA는 오버랩 PCR을 통해 제조하였으며 Lv0 벡터(pICH41331)로 클로닝하였다. DMC1 프로모터 및 MIGS-PPX1/2/1-2 Lv0 벡터를 Nos 터미네이터를 가진 Lv1 position 2 vector pICH47742로 조립하였다. meiMIGS 카세트를 포함한 각 Lv1 벡터는 Lv 벡터(pICSL11017)와 링커(pICH41744)를 포함하는 항생제 내성 유전자 BAR와 함께 Lv2인 바이너리 벡터 pAGM4723로 조립되었다. Lv2 바이너리 벡터는 아그로박테리움 균주 GV3101-pSUP로 도입되었고, 꽃대 침지법을 통해 애기장대를 형질전환시켰다.

8. F ₂ 식물체의 GBS 및 교차 확인

시퀀싱 라이브러리를 준비를 위해 meiMIGS-PPX1-PPX2 Col/Ler F₂ 96 개체로부터 CTAB를 사용하여 게노믹 DNA를 추출하였다. DNA 150 ng을 0.3 unit의 dsDNA Shearase (Zymo Research)를 사용하여 단편화시키고(최종 부피 15 ㎕), 잘린 DNA는 20℃에서 30분 동안 30 ㎕의 반응 용액(3 units of T4 DNA polymerase (New England Biolabs), 10 units of T4 polynucleotide kinase (Thermo Fisher Scientific), 1.25 units of Klenow fragment (New England Biolabs) 및 0.4 mM dNTPs)에서 말단-수선시켰다. DNA 단편은 AMPure XP magnetic SPRI 비드 (Beckman-Coulter, A63881)를 이용하여 정리하였다. DNA는 A-tail이고, 이전의 방법(Rowan, B. A., et al., (2015) G3 (Bethesda). 5:385-98)에 따라 20 ㎕의 반응 부피로 바코드된 Illumina 어댑터와 결합시켰다. 8개의 DNA 라이브러리를 30 ㎕ 용출 버퍼(10 mM Tris-HCl, pH 8.0)에 풀링, 세척 및 용출하였다. 16 ㎕의 AMPure XP magnetic SPRI 비드를 포함하고 있는 튜브에 30 ㎕의 혼합물을 넣고, 상온에서 5분간 반응시킨 후, 시료를 magnetic rack에 2분간 놓아둔 후 상층액(42 ㎕)를 새로운 튜브로 옮기고 0.23배의 SPRI 비드와 섞어주었다. 상온에서 5분간 반응시킨 후, magnetic rack에 2분간 놓아둔 후 상층액을 제거하고 비드를 80% 에탄올로 30초간 세척하는 과정을 2회 반복하였다. 그 후 비드를 10분간 공기로 말리고 20 ㎕의 10 mM Tris (pH 8.0)를 이용하여 DNA를 용출시켰다. 용출물 12 ㎕를 KAPA HiFi Hot-Start ReadyMix PCR kit (Kapabiosystems)와 알려진 DNA 올리고뉴클레오티드(Rowan, B. A., et al., (2015))를 사용하여 PCR 증폭시켰다. PCR 산물은 SPRI 비드를 사용하여 정제하였고 Bioanalyzer를 통해 정량화하였다. 6개의 바코드 라이브러리는 Illumina HiSeqX 기기를 사용하여 페어링 엔드 150bp 시퀀싱에 따라 수행되었다.

9. 야생형 및 hcr1 의 감수분열모세포(meiocyte)의 면역세포학적 분석

애기장대 꽃가루 모세포의 염색체 확산은 이전의 보고(Chelysheva, L. et al. (2010) Cytogenet. Genome Res. 129:143-53)에서와 같이 고정된 싹과 DAPI 염색을 통해 준비되었다. 후사기(pachytene) 세포는 ASY1과 ZYP1에 대해 면역염색되었고, 이동기(diakinesis) 세포는 MLH1에 대해 면역염색되었다. 세사기(leptotene) 단계 감수분열모세포는 신선한 싹을 이용하여 ASY1과 RAD51에 대해 면역염색되었다. α-ASY1(rat, 1:200 또는 1:500 희석), α-ZYP1(rabbit, 1:200 희석), α-MLH1(rabbit, 1:200 희석), α-RAD51(rabbit, 1:300 희석) 등의 항체가 사용되었다. 현미경 검사는 CDD Coolsnap HQ2 카메라가 장착된 DeltaVision personal DV 현미경(Applied precision/GE Healthcare)을 사용해 수행되었다. 이미지 캡처는 SoftWoRx 소프트웨어 버전 5.5를 사용하여 수행되었다. 세사기 단계 핵의 ASY1과 RAD51 공동-면역염색에는 각각 0.2 μM의 광학구간 10개의 Z-stack으로 개별 세포 이미지를 획득하였고, ImageJ를 이용하여 각 셀에 대한 최대 강도 투영을 결정하였다. 감수분열 세포당 MLH1 foci 수, 세포당 RAD51 foci 수는 축 단백질 ASY1과 관련된 값을 수동으로 점수화하였다. Welch's test는 야생형과 hcr1-1 MLH1 및 RAD51 foci의 유의미한 차이를 평가하기 위해 사용되었다.

10. Co-localization 및 co-immunoprecipitation 분석을 위한 원형질체에서 융합 단백질의 일시적 발현

원형질체 일시적 발현 벡터는 골든 게이트 클로닝을 사용하여 구축되었다. cDNA로부터 PCR로 증폭된 PPX1/HCR1와 감수분열 유전자의 전장은 Lv0 유니버설 벡터(pICH41331)로 복제되었다. 에피토프 및 형광 단백질 태깅을 위해, 정지 코돈이 결여된 코딩 지역을 가지는 Lv0 벡터를 35S 프로모터 벡터(pICH51266), C-말단 벡터(YFP, CFP, Myc tag/pICSL50010 및 HA tag/pICSL50009) 및 NOS 터미네이터 벡터(pICH41421)를 사용하여 Lv1 transient 벡터(pICH4742)에 조립하였다.

플라스미드 DNA와 엽육(mesophyll) 원형질체는 이전의 방법(Hwang, I. & Sheen, J. (2001) Nature 413:383-389)에 따라 준비되었다. 20x10³개의 원형질체는 20 ㎍의 총 플라스미드 DNA로 형질주입(transfection)시키고, 상온에서 6-12시간 동안 배양되었다. PPX1-CFP와 감수분열 단백질-YFP의 co-localization을 검출하기 위해, 20 ㎍의 총 플라스미드 DNA (PPX1-CFP와 YFP 융합 컨스트럭트 HEI10-YFP, PTD-YFP 또는 MSH5-YFP의 혼합물)를 20x10³개의 원형질체에 공동-형질주입하고 상온에서 12시간 동안 배양시켰다. 음성 대조군으로서 PPX1-CFP 단독 또는 YFP-융합 플라스미드 단독만이 형질주입되었다. 형질주입된 엽육세포 원형질체의 형광은 공초점현미경(LSM 800, Zeiss)을 사용하여 관찰하였다.

Western blot 분석을 위해, PPX1-Myc 태그 및 감수분열 유전자-HA 태그 DNA 플라스미드의 40 ㎍을 원형질체에 공동-형질주입하거나, 음성 대조군으로서 상기 플라스미드를 각각 형질주입하였다. 총 단백질은 추출 버퍼((50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, protease inhibitor cocktail (Roche) 및 1% Triton X-100)를 사용하여 추출하였고, 추출된 버퍼는 8% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 SDS-PAGE로 전개시켰으며, 니트로셀룰로스 멤브레인으로 트랜스퍼 후 anti-HA (1:2,000 Roche 12013819001) 또는 anti-Myc (1:2,000 Santa Cruz sc-9E10) 항체를 사용하여 확인하였다. Co-immunoprecipitation 분석을 위해 형질주입된 원형질체 세포를 IP 버퍼(50 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Triton X-100, 10% glycerol 및 protease inhibitor cocktail)로 용해시키고, 용해물을 1 ㎍의 anti-Myc 항체로 12시간 동안 4℃에서 회전시키며 반응시켰다. 그 후, 원형질체 용해물과 항체의 혼합물을 50% protein G가 코팅된 아가로스 비드 (Millipore 16-201)와 2시간 동안 반응시켰다. 그 후 아가로스 비드를 IP 버퍼로 3회 세척하고 추출 버퍼로 단백질을 추출한 뒤 anti-HA 항체를 이용한 웨스턴 블랏에 사용하였다.

실시예 1. HCR1/PPX1 돌연변이를 통한 교차 증가

이전의 연구들을 통해 식물에서 교차 증가는 교차 억제 유전자들 FANCM, RECQ4A, RECQ4B, FIGL1의 돌연변이를 통해 이룰 수 있음이 알려졌다. 이들 돌연변이를 통한 교차는 Class Ⅱ 교차 경로를 따르고 MUS81 엔도뉴클레아제에 의존적이다. 본 발명에서는 새로운 교차 억제 유전자를 확보하기 위해 형광 종자 교차 측정 라인에 EMS를 처리하고 교차가 증가된 돌연변이를 스크리닝하였다(도 1). 교차가 증가한 hcr1 돌연변이체를 확보하였고, NGS (next-generation sequencing)를 통해 돌연변이체의 교차 증가 원인이 PP4 복합체의 catalytic subunit인 PP4C 단백질을 부호화하는 PPX1(AT4G26720) 유전자에 돌연변이 발생에 기인한 것임을 확인하였다(도 2). 또한, PPX1 뿐아니라 PP4 복합체를 구성하는 regulatory subunit인 PP4R2 단백질을 부호화하는 유전자의 돌연변이체에서도 교차가 증가함을 확인하였다(도 2H). PPX1은 진화적으로 잘 보존된 포스파타제(phosphatase)로 다른 동식물에서도 발견할 수 있다(도 2F). 효모와 선충에서 PPX1 유사체들이 DNA 수선과 재조합에 관련되었음이 이전의 연구들을 통해 보고되었었다. 하지만 감수분열 동안 상동 염색체의 교차 증가 표현형은 본 발명에서 최초로 보고되는 내용이다.

실시예 2. 감수분열 특이적 HCR1/PPX1 유전자 발현 감소를 통한 교차 증가

PPX1 단일 돌연변이는 애기장대에서 교차를 증가시키지만, 발달과정의 표현형은 야생형과 같다. 하지만 이원체(paralog)인 PPX2와 이중 돌연변이가 되면 발달 초기에 식물이 치사된다. 따라서, PPX1와 PPX2의 발현을 감수분열 단계에서 특이적으로 감소시키기 위해 MIGS (miRNA-induced gene silencing) 기술과 감수분열 특이적인 프로모터를 이용하여 meiMIGS (meiosis-specific microRNA mediated gene silencing) 기술을 확립하였다(도 3). 감수분열 특이적 유전자 DMC1 (DNA meiotic recombinase 1)의 프로모터를 사용하고, miRNA173 타겟 시퀀스와 PPX1 cDNA를 결합하여 발현시키면 감수분열 동안 PPX1 부위에서 22-nt의 miRNA가 발생하여 내재적인 PPX1의 발현을 녹다운하게 된다(도 3A-3B). 또한, meiMIGS-PPX1, meiMIGS-PPX2 및 meiMIGS-PPX1-PPX2 형질전환체에서 hcr1 돌연변이체와 같이 교차율이 증가했음을 확인할 수 있었다(도 3C). 교차 증가는 420 interval 뿐만아니라 염색체 전반적으로 증가하였고, 다만 동원체(centromere) 주위에서는 변화가 없거나 오히려 다소 감소했음을 확인할 수 있었다(도 3D-3G). 세 개 interval의 형광 종자 라인에서는 옆 interval에서 교차가 있느냐, 없느냐에 따라 교차 간섭율(옆 interval에서 교차가 있는 교차률/옆 interval에서 교차가 없는 교차률)을 계산할 수 있는데, meiMIGS-PPX1-PPX2 형질전환 식물체에서는 교차 간섭율이 증가하여 간섭 정도가 약해졌음을 알 수 있었다. 이는, 같은 물리적 거리의 염색체 상에서 교차가 증가함을 의미한다.

meiMIGS-PPX1-PPX2 형질전환체에서 PPX1/PPX2의 발현 감소가 유전체에서 교차 증가된 양상을 확인하기 위해 Col/Ler 잡종을 만든 후 F₂ 식물의 유전체를 GBS (genotyping-by-sequencing)를 통해 분석하였다(도 4). 그 결과, 야생형은 평균 7.5개의 교차가 발생하지만, meiMIGS-PPX1-PPX2 식물에서는 9.7개로 교차가 증가했고, 특히 텔로미어 부근에서 교차가 현격히 증가함을 확인하였다. 이러한 교차 증가는 Class Ⅱ 타입보다는 Class I 타입임을 cytology를 통해 확인했다. 즉, Class I 타입 교차 위치를 탐지하는 MLH1 항체를 활용하여 야생형과 hcr1 돌연변이체에서 MLH1 foci 수를 확인한 결과, hcr1에서 증가된 것이 관찰되었다(도 6F). 반면 DSB를 마킹하는 RAD51 foci수는 야생형과 차이고 없었고, 감수분열 동안 염색체의 패턴을 탐지할 수 있는 ASY1과 ZYP1의 면역염색에서도 야생형과 hcr1 돌연변이 사이에 큰 차이가 없었다. 즉, HCR1/PPX1은 Class I 교차 경로에 작동하여 교차 수을 제한하고 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. fancm 과 hcr1 이중 돌연변이를 통한 교차 발생의 추가적 증가

fancm 돌연변이는 Class Ⅱ 타입 교차가 증가하여 Class I 교차 경로 돌연변이의 불임을 회복하지만 hcr1은 그렇지 못한다(도 6A). fancm 돌연변이체는 420 interval에서 야생형 20 cM에 비해 35 cM으로 교차율이 증가했다(Crismani et al., (2012) Science 336:1588-90). hcr1은 420에서 27 cM을 보여주고 fancm hcr1으로 이중 돌연변이체가 되면 40 cM으로 fancm 또는 hcr1의 단일 돌연변이체보다 추가적으로 교차가 증가하였다(도 6B). 이는 육종 기술적으로 교차를 추가로 증가 시킬 수 있기 때문에 중요하다. 즉, 기존 Class Ⅱ 교차 억제 유전자들(FANCM, RECQ4A/4B, FIGL1)과 HCR1/PPX1을 이중 돌연변이시켜 교차 수를 다양한 작물에서 추가로 증가시킬 수 있다. HCR1이 Class I 교차 경로에서 교차를 억제하고 있는 원인은 Class I 교차 경로에서 교차를 촉진한다고 알려진 HEI10, PTD, MSH5 단백질과 결합하여 탈인산화를 유도하기 때문일 가능성이 높다. 적어도 본 발명에서는 HCR1 단백질이 HEI10, PTD, MSH5에 결합하고 있는 것을 확인하였다(도 6C-6D).

<110> POSTECH Research and Business Development Foundation <120> Protein phosphatase 4 complex for increasing chromosomal crossover recombination in meiosis of plant cell and uses thereof <130> PN20195 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 305 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Ser Asp Leu Asp Arg Gln Ile Gly Gln Leu Lys Arg Cys Glu Pro 1 5 10 15 Leu Ser Glu Ser Glu Val Lys Ala Leu Cys Leu Lys Ala Met Glu Ile 20 25 30 Leu Val Glu Glu Ser Asn Val Gln Arg Val Asp Ala Pro Val Thr Leu 35 40 45 Cys Gly Asp Ile His Gly Gln Phe Tyr Asp Met Met Glu Leu Phe Lys 50 55 60 Val Gly Gly Asp Cys Pro Lys Thr Asn Tyr Leu Phe Met Gly Asp Phe 65 70 75 80 Val Asp Arg Gly Tyr Tyr Ser Val Glu Thr Phe Leu Leu Leu Leu Ala 85 90 95 Leu Lys Val Arg Tyr Pro Asp Arg Ile Thr Leu Ile Arg Gly Asn His 100 105 110 Glu Ser Arg Gln Ile Thr Gln Val Tyr Gly Phe Tyr Asp Glu Cys Leu 115 120 125 Arg Lys Tyr Gly Ser Ser Asn Val Trp Arg Tyr Cys Thr Asp Ile Phe 130 135 140 Asp Tyr Met Ser Leu Ser Ala Val Val 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Claims (10)

1. PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 단계를 포함하는, 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수를 증가시키는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 PP4 복합체의 기능 저해는 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차 재조합 수를 증가시키는 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 PP4 촉매소단위체 단백질은 서열번호 1 또는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 것이며, 상기 PP4 조절소단위체 단백질은 서열번호 5, 서열번호 7, 서열번호 9 및 서열번호 11로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차 재조합 수를 증가시키는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능 저해와 동시에, FIGL1 (AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE 1), RECQ4A (ATP-dependent DNA helicase Q-like 4A), RECQ4B 및 FANCM (Fanconi anemia group M protein)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질의 발현 또는 기능을 추가로 저해하는 것을 특징으로 하는 식물 세포의 감수분열 동안에 상동 염색체의 교차 재조합 수를 증가시키는 방법.
5. 식물 세포에서 PP4 (Protein phosphatase 4) 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하거나, PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자에 T-DNA를 삽입하여 기능상실 돌연변이체를 유도하는 단계를 포함하는, 야생형에 비해 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
6. 제5항의 방법으로 제조된 야생형에 비해 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수가 증가된 형질전환 식물체.
7. 제6항에 따른 식물체의 형질전환 종자.
8. PP4 (Protein phosphatase 4) 복합체의 기능을 저해하는 물질을 유효성분으로 포함하는, 식물 세포의 상동 염색체의 교차(crossover) 재조합 수 증가용 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 PP4 복합체의 기능 저해 물질은 PP4 촉매소단위체(catalytic subunit) 단백질 및 PP4 조절소단위체(regulatory subunit) 단백질 중 하나 이상의 단백질에 특이적인 항체; 또는 PP4 촉매소단위체 단백질 코딩 유전자 및 PP4 조절소단위체 단백질 코딩 유전자 중 하나 이상의 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해하는 miRNA(microRNA), siRNA(small interfering RNA) 또는 antisense RNA;인 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 조성물은 FIGL1 (AAA-ATPase FIDGETIN-LIKE 1), RECQ4A (ATP-dependent DNA helicase Q-like 4A), RECQ4B 또는 FANCM (Fanconi anemia group M protein) 단백질의 발현 저해 물질을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.

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