KR20220008396A

KR20220008396A - 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20220008396A
Application number: KR1020227000587A
Authority: KR
Inventors: 마틴 로베단; 스테판 클루츠; 사파 쿠투프 쿠르트
Original assignee: 바이엘 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2014-03-11
Filing date: 2015-03-06
Publication date: 2022-01-20
Also published as: RU2016139642A3; EP2918294A1; SG11201607033WA; IL247358A0; AR100572A1; CA2941901C; AU2015230168A1; KR102650937B1; IL247358B; CN106163576A; NZ723484A; RU2016139642A; BR112016020759A2; SA516371786B1; WO2015135844A1; KR102350094B1; AU2015230168B2; BR112016020759B1; JP2017509338A; US20160375159A1

Abstract

본 발명은 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 생성물 유동에서 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치는 각각 생성물 유동을 전달하기 위한 생성물 유동 라인(8)에 연결된 유입구(4) 및 배출구(5)를 갖는 파이프 또는 호스(1)를 포함하고, 여기서, 파이프 또는 호스(1)은 곡선형이고/이거나 권취축 (h) 주위에 개수 n의 권선 (winding)으로 나선형으로 감기고, 원심력의 법선의 작용 방향을 변경하기 위해 45도 내지 180도의 각 (α)을 갖는 권취축 (h) 내의 하나 이상의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖고, 장치는 딘수 > 0 및 비틀림 파라미터 > 0인 것을 특징으로 한다.

Description

연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 및 방법{DEVICE AND METHOD FOR CONTINUOUS VIRUS INACTIVATION}

본 발명은 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 낮은 pH에서의 체류 루프 (residence loop)에서 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

생물의약품 생산 방법은 바이러스 감소를 위해 다양한 독립적인 단계를 필요로 한다. (외피보유) 바이러스의 불활성화를 위해 빈번하게 사용되는 방법은 산성 배지와의 접촉이다.

배치 (batch) 방식에서 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화는 알려져 있고, 활성 물질, 예를 들어 항체의 생물의약품 생산에서 빈번하게 사용된다 (Sofer 2003, Virus Inactivation in the 1990s - and into the 21st Century. Part 4. BioPharm International). 여기서, 불활성화되는 물질, 즉 활성 바이러스를 잠재적으로 함유하는 액체를 적합한 용기 내에 도입하고, 산성 용액에 의해 pH를 ≤ 4로 만들고, 필요한 경우 균질화하고, 필요한 시간 동안 정치시킨다. 바이러스의 불활성화는 특정 생성물 및 방법-의존성인 시간 동안 바이러스를 산성 용액과 접촉시킴으로써 수행된다. 따라서, 백 (bag) 내의 전체 내용물은 실질적으로 동일한 체류 시간에서 불활성화를 경험하고, 그에 따라 용기의 각각의 유체 요소에서 달성되는 바이러스 감소 역시 실질적으로 동일하다.

생물의약품 및 생물학적 제품, 특히 제약 항체의 생산 방법이 연속적인 방식으로 작동되어야 할 경우, 바이러스 불활성화를 위해 요구되는 유지 시간이 달성되어야 할 것이다. 본 특허 출원의 목적을 위해, 연속식 바이러스 불활성화는 공급 스트림의 바이러스 불활성화 모듈 내로의 도입 및 생성물 스트림의 바이러스 불활성화 모듈로부터의 배출이 중단없이 이루어짐을 의미한다. 적어도 하나의 생물반응기를 포함하는 생산 플랜트의 연속적인 작동은 본 특허 출원의 목적을 위해, 공급 스트림의 생물반응기 내로의 도입 및 생성물 스트림의 생산 플랜트로부터의 배출이 중단없이 이루어짐을 의미하고, 일부의 공정 단계는 반연속적으로 작동할 수 있다.

바이러스 불활성화를 위해 요구되는 유지 시간 (= 체류 시간)은 체류 루프에서 달성될 수 있다. 여기서, 체류 루프 내의 층류가 문제가 될 수 있다. 튜브를 통한 층류에서, 포물선 속도 프로파일이 확립되며, 이것은 넓은 체류 시간 분포를 유도한다 (도 1). 튜브를 통한 유동의 중심부에서의 최대 속도는 평균 속도의 2배이지만 튜브 벽에서의 속도는 0 (부착 조건)이기 때문에, 이 경우에 매우 넓은 체류 시간 분포가 발생한다. 상기 방식에서 얻어지는 체류 시간은 평균 체류 시간의 1/2 (튜브 중앙부의 빨리 유동하는 유체 요소에 의한) 내지 무한히 긴 체류 시간 (벽 근처의 부착하는 유체 요소에 의한)이다. 먼저 바이러스의 효과적인 불활성화에 최소 체류 시간이 필요하고, 두 번째로 낮은 pH에서 긴 체류 시간은 생성물 (예를 들어 단백질)을 손상시킬 수 있기 때문에, 연속적인 작동에서 좁은 체류 시간 분포의 달성은 필수적이다. 이 경우에, 층류 상황으로부터 균일한 체류 시간을 갖는 난류 플러그 유동 (turbulent plug flow)으로의 변화는 수용가능한 대안이 아니다. 난류 유동은 높은 유속을 필요로 한다. 낮은 pH에서 바이러스 불활성화를 위해 일반적인 긴 체류 시간 (예를 들어 60-120분)이 달성되어야 한다면, 바람직하지 않게 큰 플랜트가 필요하다. 연속식 바이러스 불활성화를 수행하는 한 방법은 UV-C 광 조사이고; WO2002038191, EP1339643B1, EP1464342B1, EP1914202A1 및 EP1916224A1은 불활성화되는 물질이 UV-C 광으로 조사되고 존재하는 바이러스가 결과적으로 불활성화되는 나선 체류 루프의 사용을 설명하고 있다. 유체가 나선형으로 감긴 튜브를 통해 유동할 때, 원심력이 유체에 작용한다. 원심력은 2차 유동 (딘 에디스 (Dean eddies)로 알려짐)을 유도하고, 이에 의해 불활성화되는 물질의 개선된 방사상 혼합 및 따라서 보다 균질한 조사가 가능하다. 언급된 공급원에서 사용되는 나선 구조는 나선의 축 방향에서의 변화가 없는 연속적인 나선 코일이다. 낮은 pH에서의 연속식 바이러스 불활성화에 사용하기 위해, UV-C 조사에서 사용되는 바와 같은 연속적인 나선 구조의 사용은 체류 시간 분포가, 튜브를 통해 층류가 발생하는 연속적인 튜브의 경우보다 더 잘 좁을 수 있지만, 여전히 너무 넓기 때문에 실행가능하지 않다. 여전히 비교적 넓은 체류 시간 분포 때문에, 상기 기하학적 구조는 pH 바이러스 불활성화를 위해 큰 플랜트를 계속 필요로 할 것이다.

먼저 요구되는 최소 체류 시간은 각각의 유체 요소에 대해 달성되어야 하고, 두 번째로 생성물, 특히 단백질 생성물은 낮은 pH에서 손상될 수 있기 때문에, pH-기반 바이러스 불활성화를 위해 매우 좁은 체류 시간 분포를 달성하는 것이 필요하다.

니감 (Nigam) 등 (US7337835B2, [AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289])은 나선 코일을 통한 유동의 경우에, 나선 코일의 축의 굴곡 (bending)이 유체에 대한 원심력의 법선의 작용 방향의 변화를 야기한다고 개시하고 있다. 니감 등에 따르면, 가장 좁은 체류 시간 분포는 Dn ≥ 3의 딘수 (Dean number)에 대한 값에서 얻을 수 있는 한편, Dn < 3에서는 체류 시간 분포의 확장이 관찰된다. 상기 기술은 저자들에 의해 "코일형 유동 인버터 (coiled flow inverter)" (CFI)로 언급되었다. CFI의 원리를 도 2에 제시한다. 나선 튜브 기하학적 구조에 의해 야기되는 원심력은 2차 유동을 생성하고, 그 결과로서 좁은 체류 시간 분포가, 열 교환기에서 심지어 층류의 경우에 실현될 수 있다. 니감 등은 90° 굴곡부 (bend)의 구현이, 튜브를 통해 층류가 발생하는 연속적인 나선 또는 연속적인 튜브보다 상당히 더 좁은 체류 시간 분포를 생성함을 개시하고 있다. 니감 등은 또한 보다 많은 굴곡부가 사용될수록 체류 시간 분포가 좁음을 개시하고 있다. 굴곡부의 수가 증가하면서, 그를 통해 난류 유동이 발생하고 플러그 유동 프로파일을 갖는 유동 튜브의 체류 시간 분포에 대한 근사치가 얻어진다.

상기 튜브 기하학적 구조를 긴 체류 시간 및 좁은 체류 시간 분포를 동시에 필요로 하는 방법, 예를 들어 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화에 대한 적용가능성은 조사되거나 언급되지 않았다. 긴 체류 시간은 열 교환기의 제공과 무관하다.

발명의 개요

따라서, 본 발명의 목적은 좁은 체류 시간 분포를 보이면서, 낮은 pH에서 연속식 바이러스 불활성화를 위해, 연속적인 유동이 그를 통해 발생하는 체류 루프에서 요구되는 체류 시간의 달성을 가능하게 하는, 신규하고, 간단하며 저렴한 해결책을 제공하는 것이다.

도 1은 튜브를 통해 층류가 발생하는 튜브의 포물선 유동 프로파일을 보여준다 (상부: 튜브의 종단면). 튜브를 통해 층류가 발생하는 튜브 내의 유동 방향의 동일한 속도의 선 (하부: 튜브의 단면).
a = 튜브 벽
b = 유동 방향의 튜브의 축방향 축
c = 방사상 축
d = 유동 방향의 동일한 유동 속도의 선.
도 2는 유동 프로파일을 제시하면서 CFI의 원리 및 설계 파라미터를 보여준다. 유동 방향의 동일한 속도의 선이 제시된다. 유동 프로파일은 문헌 [Ind. Eng. Chem. Res. (2008), 47, 10, pp. 3630-3638]에 제시된 것이었다.
- 호스 내경 (d_i),
- 호스 외경 (d_o),
- 피치 거리 (p),
- 코일 튜브 직경 (d_ct),
- 코일 직경 (d_c),
- 굴곡부의 각 α,
e = 원심력의 작용 방향
f = 나선 코일을 통한 유동 방향
g = 나선 코일 내의 유체의 유동 방향
h = 코일축/나선의 축
도 3은 튜브를 통해 층류가 발생하는 연속적인 튜브 및 이상적인 유동 튜브와 비교하여 3 ml/min의 부피 유량에서 다양한 개수의 굴곡부를 갖는 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 장치의 체류 시간 거동에 대한 조사 결과를 보여준다 (굴곡부 = 유동에 대한 원심력의 작용 방향의 법선을 변경하기 위한 방향의 90° 변화부. 1의 무차원 농도는 0.25 g/l의 비타민 B12의 농도에 대응한다).
도 4는 3 ml/min의 부피 유량에서 CFI를 설계하기 위한 그래프를 보여준다.
도 5는 체류 시간 측정을 위한 실험에 사용되는 장치 (4개 프레임)의 사진을 보여준다.
도 6은 바이러스 불활성화를 위한 장치 내로의 주입시에 실시예 1에서 도입되는 추적자 (tracer) 용액의 계단 함수를 보여준다.
i = 시간축
j = UV 신호의 축
k = CFI의 유입구에서 추적자 물질의 도입 시점.
도 7은 CFI의 예에 따른 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치의 그림을 보여준다. 좌측: 프레임이 장착된 유지 스탠드. 우측: 프레임이 장착되지 않은 유지 프레임.
도 8은 바이러스 불활성화 및 pH의 후속 조정에 대한 흐름도로서, 나선형으로 감긴 튜브(1) 및 그의 방향의 변화부 및/또는 굴곡부(2)는 단순히 도식적으로 제시된다.
도 9는 실험 연구로부터의 프레임의 제작도이다.

본 발명은 생성물 스트림 내의 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 장치를 제공함으로써 상기 목적을 달성하고, 상기 장치는 각각의 경우 생성물 스트림을 전달하기 위한 생성물 유동 라인(8)에 연결된 유입구(4) 및 배출구(5)를 갖는 튜브 또는 호스(1)를 포함하고,

- 여기서, 튜브 또는 호스(1)는 곡선형이고/이거나 코일 축(h) 주위에 개수 n의 권선 (winding)으로 나선형으로 감기며, 원심력의 법선의 작용 방향을 변경하기 위해 45° 내지 180°의 각(α)을 갖는 코일축 내의 하나 이상의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖고,

- 장치는 딘수 ≥ 0 및 비틀림 (torsion) 파라미터 ≥ 0을 특징으로 한다.

장치는 딘수 ≥ 0 이외에, 또한 ≥ 1, 바람직하게는 ≥ 2, 바람직하게는 ≥ 3, 보다 바람직하게는 ≥ 4의 딘수를 가질 수 있다.

장치는 ≥ 0의 비틀림 파라미터 이외에, 또한 ≥ 100, ≥ 200, ≥ 300, ≥ 400, 특히 바람직하게는 ≥ 500의 비틀림 파라미터를 가질 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 장치는 딘수 ≥ 3 및 비틀림 파라미터 ≥ 500을 갖는다.

튜브 또는 호스(1)는 바람직하게는 코일축 (h) 주위에 나선형으로 감긴다. 코일축의 단면은 대체로 원형이다.

곡선형 입체형태의 예는 EP094443181B1, 특히 도 5 내지 11로부터 알려져 있고, 이들은 그 설명과 함께 본원에 참고로 포함된다.

본 발명의 장치는 하나 이상의 프레임 (frame)(3)을 보유하는 유지 스탠드 (holding stand)(6)을 포함할 수 있다. 대안으로서, 유지 스탠드는 코일축을 형성한다. 프레임 및/또는 유지 스탠드는 중공형이거나 충전형일 수 있다. 호스 또는 튜브(1)가 높은 강도 및 강성을 갖는 경우, 자가 지지 구조가 또한 가능하다.

플랜트의 치수에 대해, 니감 등의 개시내용이 참고로 포함된다: US7337835B2, [AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368, Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289]. 특히, 니감 등은 체류 시간 분포의 협소화를 야기하는 방사상 방향으로의 혼합 증가가 심지어 45° 내지 180°의 각 α, 바람직하게는 40° 내지 120°, 특히 90°에서 발생함을 개시하고 있다. 도 2는 니감 등에 따른 CFI의 원리 및 α = 90°의 특정 경우의 그의 설계 파라미터를 보여준다. 유동 프로파일이 나선 코일의 방향의 함수로서 어떻게 변하는지 알 수 있다.

설계 파라미터로서, 다음을 언급할 수 있다:

- 호스 내경 (d_i),

- 피치 (pitch) 거리 (p),

- 코일 튜브 직경 (d_ct),

- 코일 직경 (d_c),

- 아암 (arm) 당 권선의 수 (n) (아암은 2개의 연속적인 굴곡부 사이의 연속적인 나선 코일의 영역이다),

- 굴곡부의 각 α,

- 굴곡부의 수 (프레임에서 프레임당 4개 굴곡부가 제시됨).

시스템을 설명하는 무차원 파라미터는 레이놀즈 수 (Reynolds number) (Re), 딘수 (Dn) 및 비틀림 파라미터 (T)이다.

레이놀즈 수 (Re)는 유체의 밀도 (ρ), 평균 유동 속도 (

) 및 점성 계수 (η)를 사용하여, 다음에 따라 계산된다:

딘수 (Dn)는 다음에 따라 계산된다:

비틀림 파라미터 (T)는 다음에 따라 계산된다:

니감 등은 피치 거리가 최소화되고, 각 α = 90°, 딘수가 적어도 3이고, 비틀림 파라미터가 ≥ 500일 때 최적 결과가 달성될 수 있음을 개시하고 있다. 안정한 2차 유동이 나선에서 형성될 수 있도록, 각각의 아암은 또한 적어도 2개의 완전한 권선을 가져야 한다 [AIChE Journal (1984), Vol. 30, No. 3, p. 363-368] 및 [Chem. Eng. Comm. (1983) 23, 4-6, p. 277-289].

본 발명의 장치의 치수 결정은 대체로 다음과 같이 수행한다:

- 제1 단계에서, 요구되는 부피 유량을 설정한다.

- 이를 기초로 하여, 딘수가 바람직하게는 ≥ 3이고 비틀림 파라미터가 바람직하게는 ≥ 500인 조건에 적용된 상기 식을 사용하여 가능한 치수를 계산한다.

- 생성된 곡선이 도 4에 3 ml/min의 부피 유량에 대해 예시를 위해 제시된다. 니감 등에 따르면 장치의 적합한 치수는 비틀림 파라미터 = 500에 대한 유리한 곡선의 왼쪽에, 및 딘수 = 3에 대한 유리한 곡선의 왼쪽에서 찾을 수 있다. 가장 적절한 튜브 내경 및 코일 튜브 직경은 특히 공간 요건의 면에서 최적화되도록 선택된다. 여기서, 호스 내경은 요구되는 최소 체류 시간이 달성되도록 선택된다. 코일 튜브 직경은 이때 가능한 한 작게 이루어져야 한다. 그 이유는 니감 등에 따르면 보다 많은 굴곡부가 체류 구획에 형성될수록 체류 시간 분포가 좁게 되기 때문이다. 체류 구획의 규정된 호스 길이 및 나선당 권선의 고정된 개수에 대해, 코일 튜브 직경이 작을수록 보다 많은 굴곡부를 형성시킬 수 있다. 근사치로서, 길이(L)를 갖는 체류 구획의 굴곡부의 개수 (n_bend)가 계산될 수 있고, 여기서 n_arm,frame은 프레임당 아암의 개수이고, n_winding,arm은 아암당 권선의 개수이고, π는 숫자 파이이고, d_c는 코일 직경이고, 여기서 d_c = d_ct + d_o이고, d_o는 호스의 외경이다.

본 발명에 따르면, 상기 언급된 파라미터는 예를 들어 약 3 ml/min의 부피 유량에서 연속식 바이러스 불활성화를 위한 시험 플랜트에 대해 선택된 것이었다. 요구되는 호스 길이는 특정 경우에 대해 요구되는 최소 체류 시간 및 선택된 호스 내경을 통해 얻는다. 다음 단계에서, 코일 튜브 직경은 딘수 ≥ 0 및 비틀림 파라미터 ≥ 0 둘 모두, 바람직하게는 딘수 ≥ 2, 바람직하게는 ≥ 3 및 비틀림 파라미터 ≥ 300, 바람직하게는 ≥ 500 둘 모두가 충족되도록 선택된다. 이에 대해서는, 도 4를 참조한다.

튜브 또는 호스(1)의 내경 (d_i)은 대체로 1 내지 30 mm, 바람직하게는 3 내지 6 mm 범위이다. 예를 들어, 내경이 3 mm인 상업적인 튜브/상업적인 호스가 시험 플랜트에 사용되었다. 이 경우, 가능한 최소 코일 튜브 직경은 후속적으로 선택되었다. 보다 작은 코일 튜브 직경이 선택될수록, 주어진 호스 길이에 대해 보다 많은 굴곡부가 구현될 수 있다. 굴곡부의 개수 증가는 체류 시간 분포를 협소화하기 때문에, 상기 개수는 항상 가능한 한 크게 되어야 한다.

튜브/호스(1)의 총 길이(L) 및 내경은 특정 경우에 요구되는 체류 시간이 지켜지도록 총 플랜트의 치수/플랜트의 유속에 대해 조정된다.

상기 언급한 크기를 갖는 플랜트의 경우, 튜브 또는 호스(1)의 총 길이(L)는 대체로 1 내지 200 m, 바람직하게는 50 내지 100 m이다.

2개의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2) 사이의 권선의 개수 n은 대체로 적어도 2-20, 바람직하게는 5 내지 15, 특히 바람직하게는 10이고, 여기서 권선의 개수는 장치가 매우 작은 부피를 점유하도록 선택된다.

유지 스탠드가 코일축을 형성하거나 또는 호스 또는 튜브(1)가 자가 지지하면, 코일축은 대체로 2 내지 n개의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖고, 여기서 n은 임의의 바람직한 수일 수 있다. 개수 n은, 튜브/호스(1)의 총 길이(L)가 장치 주위에 권취되고 매우 작은 부피를 점유하도록 선택된다.

프레임이 코일축으로서 사용될 경우, 각각의 프레임(3)은 대체로 2 내지 6개의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖는다. 도 2에 제시된 바와 같은 정사각형 프레임 (90° 굴곡부)이 바람직하지만, 이로 제한되지 않는다. 하나 이상의 프레임은 대체로 튜브/호스(1)의 총 길이(L)가 장치 주위에 권취되고 매우 작은 부피를 점유할 때까지, 스탠드(6)에서 서로에 대해 고정된다.

상기 방식으로 달성된 좁은 체류 시간 분포는 생성물에 대한 손상을 야기하는, 유사하게 생성물 및 방법-의존성인 최대 체류 시간 (일반적으로 pH-감수성 생성물에 대한 30분 내지 덜 감수성인 생성물에 대한 120분)에 도달하지 않으면서 특정 생성물- 및 방법-의존성 최소 체류 시간에서 바이러스의 요구되는 제거를 달성할 수 있게 한다. 요구되는 체류 시간 및 또한 최대 체류 시간은 생성물-의존성이고, 일반적으로 실험에 의해 결정된다. 최대 체류 시간은 하류 정제 단계의 필요성을 가능한 한 작게 유지하기 위해 생성물이 최소 손상을 겪도록 최적화된다. 체류 시간 분포는 이상적인 유동 (ideal flow) 튜브 반응기의 평균 체류 시간에 접근한다. 상기 방식에서, 연속적으로 작동되는 효과적인 낮은 pH에서의 바이러스 불활성화, 그의 결과 또는 바이러스 제거 및 배치 방법에서의 바이러스 불활성화와 대등한 생성물 품질을 보장하는 것이 가능하다.

특히, 스탠드 상의 프레임을 이용할 때, 장치 (또한 일회용의)의 간단하고 확장가능한 저렴한 제조가 가능하다. 호스/튜브는 호스/튜브가 멸균된 후 또는 멸균 전에 프레임 주위에 요구되는 방식으로 단지 권취된다. 방법에 장치를 사용한 후, 호스/튜브는 프레임에서 탈착되고, 폐기되거나 세정될 수 있다 (다중 사용이 요구될 경우). 굴곡부의 각은 규정된 값을 가져야 한다. 또한 호스/튜브의 위치는 예를 들어 간단하고 재현가능한 코일에 대해 프레임 내로 밀링된 가이드 노치 (guide notch)에 의해 규정되어야 한다. 플랜트에서의 작동을 위해, 상기 방식으로 플랜트가 각각의 생산 실행에서 동일한 효과를 갖는 것이 보장된다.

또한, 장치는 멸균가능, 바람직하게는 고압멸균가능 또는 감마선-조사가능한 것일 수 있다. 상기 특성을 얻기 위해, 관련 품질 요건, 예를 들어 의약 품질 (USP 클래스 VI)에 대응하는 호스를 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명의 장치는 바람직하게는 고압멸균 또는 감마-멸균될 수 있고, 이것은 멸균 작동을 가능하게 만든다.

또한, 본 발명은 다음 단계를 포함하는, 생성물 스트림의 연속식 바이러스 불활성화를 위한 방법을 제공한다:

a) 불활성화되는 생성물 스트림을 제공하는 단계,

b) 유입구(4) 및 배출구(5)를 갖는 튜브 또는 호스(1)의 유입구(4) 내로 생성물 스트림을 도입하는 단계이며, 여기서 튜브 또는 호스(1)는 곡선형이고/이거나 코일 축 (h) 주위에 개수 n의 권선으로 나선형으로 감기고, 원심력의 법선의 작용 방향을 변경하기 위해 45° 내지 180°의 각 (α)을 갖는 코일축 내의 하나 이상의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖고, 여기서 장치는 딘수 ≥ 0 및 비틀림 파라미터 ≥ 0을 특징으로 하는 단계,

c) 바이러스-불활성화 조건 하에 생성물 스트림을 튜브 또는 호스(1)를 통해 유동시키는 단계, 및

d) 배출구(5)를 통해 튜브 또는 호스(1)로부터 배출되는 단계.

생성물 및 잠재적으로 불활성화되는 바이러스 둘 모두를 포함할 수 있는 액체의 생성물 스트림이 단계 a)에서 생산된다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서 장치는 딘수 ≥ 0 이외에, 또한 ≥ 1, 바람직하게는 ≥ 2, 바람직하게는 ≥ 3, 보다 바람직하게는 ≥ 4의 딘수를 가질 수 있다.

본 발명의 방법의 단계 b)에서 장치는 ≥ 0의 비틀림 파라미터 이외에, 또한 ≥ 100, ≥ 200, ≥ 300, ≥ 400, 특히 바람직하게는 ≥ 500의 비틀림 파라미터를 가질 수 있다.

특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 장치는 딘수 ≥ 3 및 비틀림 파라미터 ≥ 500을 가질 수 있다.

단계 c)에 대한 가능한 바이러스-불활성화 조건으로서, pH ≤ 4, UV 처리 또는 열 처리를 언급할 수 있다.

단계 a)에서, 생성물 스트림의 pH는 불활성화되는 물질의 pH가 이미 요구되는 값을 갖지 않을 경우, 바람직하게는 ≤ 4의 값으로 설정된다. 이 경우에, pH는 바람직하게는 바이러스 불활성화를 중지시키기 위해 단계 d) 후에 염기에 의해 ≥ 5으로 설정된다.

불활성화되는 용액의 pH를 ≤4로 설정하는 것은 예를 들어 HCl 용액의 첨가에 의해 수행될 수 있다. 첨가는 일반적으로 본 발명의 장치의 상류에서 수행된다.

바이러스 불활성화를 위해 장치 내로 도입하기 전에 생성물 스트림의 pH는 센서 pH0501에 의해 측정된다 (도 8). 상기 pH 센서는 대체로 조절 기능은 갖지 않는다. pH 신호의 기록은 단지 방법을 모니터링하는 기능을 수행한다.

생산 방법이 pH의 하나 이상의 조절을 필요로 할 경우, 바이러스 불활성화를 위한 장치는 pH를 설정하기 위한 장치에 연결된다. pH를 설정하기 위한 2개의 장치, 즉 생성물 스트림의 pH를 ≤ 4로 만들기 위해 불활성화 전의 하나 (단계 b) 및 생성물 스트림을 중화하기 위해 불활성화 후의 추가의 하나 (단계 d)를 사용하는 것이 통상적이다.

단계 c)에서, 산성 용액과 존재하는 임의의 바이러스 사이의 요구되는 접촉 시간 (= 체류 시간)이 달성된다.

단계 d)에서 염기로서, 예를 들어 수산화나트륨 용액 (NaOH)을 사용할 수 있다.

방법은 배치 작동으로서 및 연속적인 생산 방법으로서 수행될 수 있고, 따라서 배치 방법 내에 및 연속적인 방법 내에 통합될 수 있다.

바이러스 불활성화를 위한 장치가 연속적인 생산 방법 내에 포함될 경우, 생성물 스트림이 재순환 루프를 통해 유동하는, pH를 설정하기 위한 하나 이상의 장치가 바람직하다. 도 8은 바이러스 불활성화 및 후속 중화의 예를 보여주며, 이로 제한되지 않는다. M0503은 생성물 스트림을 백 B0502 내에 전달하고, 여기서 바이러스 불활성화를 떠난 후의 pH는 ≥ 5의 값으로 설정된다. 백 B0502의 내용물은 재순환 펌프 M0504에 의해 재순환 루프를 통해, 생성물 스트림의 pH를 측정하는 pH 센서 pH0502 내로 전달된다. 센서의 하류에서, pH를 조절하기 위한 조절제가 공급된다. 조절제에 대한 펌프는 M0505이고, 연관된 센서 pH0502를 통해 조절된다.

본 발명의 방법에서, 불활성화되는 생성물 스트림은 대체로 생물반응기로부터의 용액, 특히 단백질 또는 펩티드 용액, 매우 특히 바람직하게는 항체 용액이다.

선행 기술에서 통상적인 배치 방식에서의 바이러스 불활성화에 비해 본 발명에 따른 연속식 바이러스 불활성화의 기술적 이점은 방법의 작동 방식을 변경할 필요가 없이 "하류 프로세싱"으로도 언급되는 연속적인 마무리 처리 방법 내로 도입되는 능력이다. 여기서, 배치로부터 연속적인 작동, 이어서 배치로의 방법 작동의 변경이 존재하지 않고, 그 대신 전체 "하류 프로세싱" 또는 전체 생산 방법 (상류 및 하류)이 연속적으로 작동될 수 있다.

본원은 생성물 스트림 내의 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 본 발명에 따른 하나 이상의 장치 및 바람직하게는 pH를 설정하기 위한 적어도 하나의 장치를 포함하는 생산 플랜트를 추가로 제공한다.

바람직한 실시양태를 비롯하여 본 발명은 하기 도면 및 실시예를 통해 예시되지만, 이로 제한되지는 않는다. 실시양태는 문맥상 달리 나타내지 않으면, 임의의 요구되는 방식으로 조합될 수 있다.

사용되는 참조 부호는 다음과 같다:

1 = 곡선형 및/또는 나선형으로 감긴 튜브 또는 호스

2 = 45° 내지 180°의 각 (α)에서 코일축 (h)의 방향의 변화부 및/또는 굴곡부(2)

3 = 프레임

4 = 유입구

5 = 배출구

6 = 유지 스탠드

7 = 기부

8 = 생성물 유동 라인

도 1은 튜브를 통해 층류가 발생하는 튜브의 포물선 유동 프로파일을 보여준다 (상부: 튜브의 종단면). 튜브를 통해 층류가 발생하는 튜브 내의 유동 방향의 동일한 속도의 선 (하부: 튜브의 단면).

a = 튜브 벽

b = 유동 방향의 튜브의 축방향 축

c = 방사상 축

d = 유동 방향의 동일한 유동 속도의 선.

도 2는 유동 프로파일을 제시하면서 CFI의 원리 및 설계 파라미터를 보여준다. 유동 방향의 동일한 속도의 선이 제시된다. 유동 프로파일은 문헌 [Ind. Eng. Chem. Res. (2008), 47, 10, pp. 3630-3638]에 제시된 것이었다.

- 호스 내경 (d_i),

- 호스 외경 (d_o),

- 피치 거리 (p),

- 코일 튜브 직경 (d_ct),

- 코일 직경 (d_c),

- 굴곡부의 각 α,

e = 원심력의 작용 방향

f = 나선 코일을 통한 유동 방향

g = 나선 코일 내의 유체의 유동 방향

h = 코일축/나선의 축

도 3은 튜브를 통해 층류가 발생하는 연속적인 튜브 및 이상적인 유동 튜브와 비교하여 3 ml/min의 부피 유량에서 다양한 개수의 굴곡부를 갖는 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 장치의 체류 시간 거동에 대한 조사 결과를 보여준다 (굴곡부 = 유동에 대한 원심력의 작용 방향의 법선을 변경하기 위한 방향의 90° 변화부. 1의 무차원 농도는 0.25 g/l의 비타민 B12의 농도에 대응한다).

도 4는 3 ml/min의 부피 유량에서 CFI를 설계하기 위한 그래프를 보여준다.

도 5는 체류 시간 측정을 위한 실험에 사용되는 장치 (4개 프레임)의 사진을 보여준다.

도 6은 바이러스 불활성화를 위한 장치 내로의 주입시에 실시예 1에서 도입되는 추적자 (tracer) 용액의 계단 함수를 보여준다.

i = 시간축

j = UV 신호의 축

k = CFI의 유입구에서 추적자 물질의 도입 시점.

도 7은 CFI의 예에 따른 연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치의 그림을 보여준다. 좌측: 프레임이 장착된 유지 스탠드. 우측: 프레임이 장착되지 않은 유지 프레임.

도 8은 바이러스 불활성화 및 pH의 후속 조정에 대한 흐름도로서, 나선형으로 감긴 튜브(1) 및 그의 방향의 변화부 및/또는 굴곡부(2)는 단순히 도식적으로 제시된다.

도 9는 실험 연구로부터의 프레임의 제작도이다.

실시예 1:

프레임의 설계는 도 4에 제시된 바와 같이 수행하였다. 이 그래프는 3 ml/min의 유속에 대해 작성되었고, 설계 파라미터 호스 내경 및 코일 튜브 직경이 프레임의 제작시에 딘수 ≥ 3 및 비틀림 파라미터 ≥ 500의 요구되는 조건을 지키기 위해 변경될 수 있는 범위를 보여준다.

3 mm의 호스 내경이 실험 연구를 위해 선택되었다. 코일 튜브 직경은 이어서 각각의 프레임에 권취되는 호스 길이가 최소화될 수 있도록 63 mm로 선택되었다.

그 결과가 도 3에 제시된, 실험 연구에 사용된 구조의 치수는 다음과 같다: 프레임 직경 (코일 튜브 직경) 63 mm; 프레임의 바깥쪽 가장자리 길이 195 mm. 호스 내경 3 mm; 호스 외경 5 mm. 프레임은 도 9에 제시된 바와 같이 제작되었다.

각각의 아암은 항상 9.5 m의 호스가 프레임에 권취되도록 최소 피치 거리를 갖는 11개의 권선을 갖는다. 최소 피치 거리는 호스가 나선과 접촉함을 의미한다. "3개 굴곡부"의 경우, 하나의 프레임이 사용되었다. 따라서, 9.5 m의 호스가 상기 실험에서 권취되었다. "15개 굴곡부"의 경우, 4개의 프레임이 사용되었다. 총 38 m의 호스가 4개의 프레임에 권취되었다. "27개 굴곡부"의 경우, 7개의 프레임이 사용되었다. 총 66.5 m의 호스가 7개의 프레임에 권취되었다. 프레임당 사용된 호스 길이는 아암당 권선의 수가 일정하다는 가정 하에 코일 튜브 직경에 비례한다. 호스 외경은 사용되는 호스의 경우에 5 mm이었다.

도 5는 체류 시간 측정을 위한 실험에 사용된 프레임 및 호스 코일의 배열을 보여준다. 그러나, 명확성을 위해, 더 큰 호스 직경 (호스 내경 6 mm)이 상기 도면에 사용되었다. 따라서, 실험에 사용된 아암당 11개의 권선은 가능하지 않았다.

실험 구조에서, 도 2 및 도 5에 제시된 각각의 실험에 사용된 호스는 먼저 각각의 프레임에 별개로 권취되었다. 호스가 존재하는 프레임을 이어서 유지 스탠드에 서로 위에 배열하였다. 여기서, 상부 프레임의 배출구는 호스 코일이 상부로부터 하향으로 프레임을 통해 이어지도록, 아래에서 프레임의 유입구에 연결되었다. 대안으로서, 유동은 또한 기저부로부터 상향으로 또는 수평으로 진행될 수 있다.

연속식 바이러스 불활성화를 위한 장치 (CFI)에서 체류 시간의 측정을 위한 실험을 시스템의 배출구에서 UV를 측정하면서 수행하였다. 유속은 항상 3 ml/min이고, 사용되는 실리콘 호스의 내경은 3 mm이고, 호스의 외경은 5 mm이었다. 호스가 그 주위에서 감기는 프레임의 외경은 63 mm (코일 튜브 직경)이었다. 농도가 0.25 g/l인 비타민 B12 용액을 추적자 물질로 사용하였고, 그 이유는 비타민 B12가 280 nm의 파장에서 UV 광을 흡수하고, 따라서 표지자로서 적합하기 때문이다.

먼저, CFI를 증류수로 세척하였다. 시점 (k)에서, 바이러스 불활성화의 유입구에서 추적자 용액을 변경하고, UV 센서의 측정 신호의 기록을 개시하였다 (도 6 참조). 이어서, 추적자 용액의 계단 함수가 시스템에 적용되었다. 시스템의 배출구에서의 UV 신호가 추적자 용액의 UV 신호에 대응할 때, 시스템은 상기 시점으로부터 추적자 용액으로 완전히 채워지고 따라서 계단 함수에 대한 시스템의 반응이 완전히 기록되기 때문에, 실험은 중지될 수 있다.

서로 비교될 수 있도록 기록된 다양한 체류 시간 곡선에 대해, 측정치는 무차원 파라미터로 정규화되었다. 시간은 평균 체류 시간 (τ)으로 정규화되었다;

여기서, V는 체류 구획의 체류 (holdup) 부피이고,

는 부피 유량이다.

무차원 농도는 측정된 UV 신호를 기록된 최대 UV 신호 (0.25 mg/l의 비타민 B12 농도에서)로 정규화함으로써 얻었다. 0.25 mg/l의 비타민 B12 농도는 따라서 1의 무차원 농도를 제시한다. 증류수의 UV 신호는 0의 무차원 농도를 유도한다.

측정 결과는 도 3에 제시된다. 층류가 그를 통해 발생하는 연속적인 튜브의 체류 시간 분포는 다음 식에 따라 분석적으로 결정하였다. F(θ)는 무차원 농도이고, θ는 무차원 시간이다.

튜브를 통해 층류가 발생하는 연속적인 튜브는 그의 포물선 유동 프로파일 때문에, 비교적 넓은 체류 시간 분포를 갖는다. 유체 요소는 벽에 근접한 영역보다 튜브의 중앙부에서 유의하게 더 빠르게 유동한다 (도 1 참조).

다른 한편으로, 호스가 나선형으로 감기면, 원심력은 방사상 방향으로의 시스템의 혼합을 유도한다. 그 결과, 나선의 축에 비교적 근접하는 느리게 유동하는 유체 요소는 밖을 향하여 이동하고, 그에 위치한 요소는 안쪽 방향으로 이동하게 된다. 굴곡부의 실행 결과로서, 원심력에 의해 야기되는 2차 유동이 새로 증가하고, 이것은 방사상 혼합을 개선한다. 도 2는 유동 프로파일이 각각의 90° 굴곡부 후에 어떻게 90° 회전하는지 보여준다. 도 3에서 알 수 있는 바와 같이, 체류 시간 분포의 유의한 협소화는 굴곡부의 사용에 의해 달성될 수 있다.

실험에서 달성되는 최선의 결과는 27개 굴곡부를 갖는 CFI를 사용할 때 얻어졌다 (더 많은 수의 굴곡부는 조사하지 않았다). 이상적인 유동 튜브의 체류 시간 분포에 대한 근사치가 얻어졌다. 추가의 굴곡부가 체류 시간 분포를 추가로 협소화할 것으로 보인다. 따라서, 설명된 기술은 연속식 바이러스 불활성화를 위한 방법으로서 적합하다.

본 특허 출원으로 이어진 연구는 유럽 지역 개발 기금 (European Fund for Regional Development) (EFRE)의 체제 내의 재정 지원 협정 "Bio.NRW: MoBiDiK - Modulare Bioproduktion - Disposable und Kontinuierlich"에 따라 지원되었다.

Claims

생성물 스트림 내 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 장치이며,
각각의 경우 생성물 스트림을 전달하기 위한 생성물 유동 라인(8)에 연결된 유입구(4) 및 배출구(5)를 갖는 튜브 또는 호스(1)를 포함하고,
튜브 또는 호스(1)는 곡선형이고/이거나 코일 축(h) 주위에 개수 n의 권선 (winding)으로 나선형으로 감기며, 원심력의 법선의 작용 방향을 변경하기 위해 45° 내지 180°의 각(α)을 갖는 코일축(h) 내의 하나 이상의 방향 변화부 및/또는 굴곡부(2)를 갖고,
- 장치가 딘수(Dean number) > 0 및 비틀림 파라미터 > 0을 특징으로 하는 것인, 생성물 스트림 내의 바이러스의 연속적인 불활성화를 위한 장치.
제1항에 있어서, 딘수 ≥ 2, 바람직하게는 ≥ 3, 및 비틀림 파라미터 ≥ 300, 바람직하게는 ≥ 500인 것을 특징으로 하는 장치.
제1항 또는 제2항에 있어서, 하나 이상의 프레임(3)에 연결된 유지 스탠드(6)를 포함하는 것을 특징으로 하는 장치.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 멸균가능, 바람직하게는 고압멸균가능, 특히 바람직하게는 감마선-멸균가능한 것을 특징으로 하는 장치.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 곡선형 및/또는 나선형으로 감긴 튜브 또는 호스(1)의 내경 (d_i)이 1 내지 20 mm인 것을 특징으로 하는 장치.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 장치를 포함하는 생산 플랜트.