KR20220008078A - Cordyceps cultivation by spent coffee grounds biomass - Google Patents

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KR20220008078A
KR20220008078A KR1020200086198A KR20200086198A KR20220008078A KR 20220008078 A KR20220008078 A KR 20220008078A KR 1020200086198 A KR1020200086198 A KR 1020200086198A KR 20200086198 A KR20200086198 A KR 20200086198A KR 20220008078 A KR20220008078 A KR 20220008078A
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caffeine
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coffee grounds
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김승욱
이수권
이주훈
전영상
김형렬
유하영
이자현
박철환
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고려대학교 산학협력단
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Abstract

The present invention relates to a method for using coffee ground biomass (SCG), waste produced in a huge amount every year, as a medium for growth of Cordyceps strains and production of cordycepin. How the content of caffeine contained in coffee ground biomass (SCG) has an inhibitory effect on the Cordyceps strains is confirmed. Accordingly, coffee biomass (SCG), mass waste, is utilized as a medium for producing cordycepin, a high value-added substance.

Description

커피 찌꺼기 바이오매스를 이용한 동충하초 배양 방법{Cordyceps cultivation by spent coffee grounds biomass}Cordyceps cultivation method using coffee grounds biomass {Cordyceps cultivation by spent coffee grounds biomass}

본 발명은 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (spent coffee ground; SCG)를 동충하초 (Cordyceps)의 배양 배지로 활용하기 위한 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a method for utilizing waste coffee grounds biomass (spent coffee ground; SCG) as a culture medium of Cordyceps.

글로벌 커피 시장은 지속적인 성장세를 보이고 있으며, 국내 커피산업 시장 규모 역시 증가하고 있다. 국내 커피 산업 시장규모는 2018년 기준 약 7조원으로 추정이 되고 있고, 2023년에는 약 9조원 수준까지 도달할 것으로 전망하고 있다. 이러한 국내 커피 산업의 증가 이유는 국내 커피 소비자가 늘어남에 있다. 2018년 기준 국내 20세 이상 인구의 연간 1인당 커피 소비량이 약 355잔으로 세계인구 연간 1인당 소비량 132잔의 약 3배에 달하는 것으로 그 원인을 확인할 수 있다. The global coffee market is showing continuous growth, and the size of the domestic coffee industry market is also increasing. The size of the domestic coffee industry market is estimated to be about 7 trillion won as of 2018, and is expected to reach 9 trillion won by 2023. The reason for this increase in the domestic coffee industry is the increase in domestic coffee consumers. As of 2018, the per capita consumption of coffee per capita of 20 years and older in Korea was about 355 cups, which is about three times the annual per capita consumption of 132 cups of the world population.

하지만, 국내외 커피 산업 시장이 증가함에 따라 문제점도 생겨났다. 커피 한잔을 만드는데 사용되는 원두는 부피로만 따지면 약 0.2%의 양만 사용이 되고 나머지 99.8%는 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)로 폐기물로 버려진다. 그러므로 매년 세계적으로 1000만톤이상의 커피 부산물이 발생되고 있으며, 국내 또한 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)가 2014년 기준 약 10만 700여 톤이 발생하였다. 이는 매년 증가하고 있는 실정이다. 국내에서 생산되는 엄청난 양의 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)는 다양한 분야에서 연구 및 재활용하고 있다.However, problems arose as the domestic and international coffee industry market increased. Only about 0.2% of the beans used to make a cup of coffee are used in terms of volume, and the remaining 99.8% is discarded as waste as coffee grounds biomass (SCG). Therefore, more than 10 million tons of coffee by-products are generated worldwide every year, and about 10,700 tons of coffee grounds biomass (SCG) was generated in Korea as of 2014. This is a situation that is increasing every year. Coffee grounds biomass (SCG), a huge amount of waste produced in Korea, is being researched and recycled in various fields.

본 발명은 상술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 일 측면은 폐자원인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 동충하초 (Cordyceps)의 발효 배지로 활용하기 위한 올바른 방법을 제공하는 데 있다. 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 효율적인 발효 배지로 활용하기 위해 그 안에 함유되어 있는 카페인 (caffeine)의 농도가 동충하초 (Cordyceps)의 성장 및 고부가가치 물질인 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 저해 영향에 대한 평가를 하고, 이를 통해 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 효율적인 동충하초 (Cordyceps)의 발효 배지로 활용하기 위한 기초 기술을 확보하고자 한다. The present invention is to solve the problems of the prior art described above, and one aspect of the present invention is to provide a correct method for using coffee grounds biomass (SCG), a waste resource, as a fermentation medium of Cordyceps. . In order to utilize coffee grounds biomass (SCG) as an efficient fermentation medium , the inhibitory effect of the concentration of caffeine contained therein on the growth of Cordyceps and the production of cordycepin, a high value-added substance. The purpose of this evaluation is to secure a basic technology for using coffee grounds biomass (SCG), a waste, as an efficient fermentation medium for Cordyceps.

본 발명은 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 함유되어 있는 카페인 (caffeine)의 농도 범위 (0.05% ~ 2%)에 따라 동충하초 (Cordyceps) 및 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 영향을 살펴 보기 위하여, Cordyceps militaris (KCTC6064, KCTC6862, KYL05) 균주가 제공된다. The present invention is Cordyceps according to the concentration range (0.05% ~ 2%) of caffeine contained in coffee grounds biomass (SCG) (Cordyceps) and cordycepin (cordycepin) To examine the effect on production, Cordyceps militaris (KCTC6064, KCTC6862, KYL05) strains are provided.

본 발명에 따른 커피 찌꺼기 바이오매스를 이용한 동충하초 배양 방법은 (a) 커피 바이오매스 유래 카페인 (caffeine)을 Cordyceps 균주 생장 억제 인자로 설정하는 단계; (b) 억제 및 저해 인자로 확인된 카페인 (caffeine)의 농도에 따른 Cordyceps 균주 생장의 변화를 제시하는 단계; (c) Cordyceps 균주에 생장 및 최종 물질의 생산량에 가장 많은 억제 및 저해 영향을 주는 카페인 (caffeine)의 농도를 제시하는 단계; (d) 카페인 (caffeine)이 제거가 된 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 고부가가치 물질 생산 Cordyceps 균주의 배지로 활용하는 단계;를 포함한다.Cordyceps culture method using coffee grounds biomass according to the present invention comprises the steps of (a) setting coffee biomass-derived caffeine (caffeine) as a Cordyceps strain growth inhibitory factor; (b) presenting a change in the growth of Cordyceps strains according to the concentration of caffeine (caffeine) identified as an inhibitory and inhibitory factor; (c) presenting the concentration of caffeine (caffeine) having the greatest inhibitory and inhibitory effect on the growth and production of the final substance in the Cordyceps strain; (d) using the coffee grounds biomass (SCG) from which caffeine has been removed as a medium for high value-added material production Cordyceps strain; includes.

본 발명의 특징 및 이점들은 첨부도면에 의거한 다음의 상세한 설명으로 더욱 명백해질 것이다.The features and advantages of the present invention will become more apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings.

이에 앞서 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이고 사전적인 의미로 해석되어서는 아니 되며, 발명자가 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.Prior to this, the terms or words used in the present specification and claims should not be construed in the ordinary and dictionary meaning, and the inventor may properly define the concept of the term to describe his invention in the best way. Based on the principle that there is, it should be interpreted as meaning and concept consistent with the technical idea of the present invention.

본 발명에 따르면, 매년 엄청난 양으로 생산되는 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 함유되어 있는 카페인의 함량이 Cordyceps 균주에 어떻게 억제 영향을 주는지를 확인할 수 있다. 이러한 중요 기초 기술을 확보하여 대량 폐기물인 커피 바이오매스를 고부가가치 물질인 코디세핀 (cordycepin)을 생산하는 배지로 활용할 수 있다. 이를 바탕으로 코디세핀의 대량생산 생물공정 시스템, 건강기능식품, 의약품 그리고 화장품 원료 분야에 중요한 기초 기술로 제시할 수 있다. According to the present invention, it can be confirmed how the content of caffeine contained in coffee grounds biomass (SCG), a waste produced in a huge amount every year, has an inhibitory effect on the Cordyceps strain. By securing this important basic technology, coffee biomass, a mass waste, can be used as a medium for producing high value-added material, cordycepin. Based on this, it can be presented as an important basic technology in the field of mass production bioprocessing system of cordycepin, health functional food, pharmaceutical and cosmetic raw materials.

도 1 은 본 발명에서 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 활용한 Cordyceps 균주에 의한 코디세핀 (cordycepin) 생산 실험의 순서에 따른 그림이다.
도 2 는 본 발명에서 저해 물질로 확인이 된 카페인 (caffeine 2%)의 첨가 유무에 따른 균의 활성을 한천 배지 배양을 통해 확인한 것이다.
도 3 은 본 발명에서 카페인 (caffeine)이 농도 (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%)에 따라 균 성장에 미치는 영향을 3일 째에 확인한 것이다.
도 4 는 본 발명에서 카페인 (caffeine)이 농도 (0.05 ~ 2%)에 따라 균 성장에 미치는 영향을 6일 째에 확인한 것이다.
도 5 는 본 발명에서 카페인 (caffeine 2%)이 첨가 유무에 따른 액침 배양에서의 Cordyceps 균주의 주사전자현미경 사진이다.
도 6 은 본 발명에서 카페인 (caffeine) 농도 (0.05 ~ 2%)에 따라 Cordyceps 균주의 건조 무게를 각각 6일 동안 확인한 결과다.
도 7 은 본 발명에서 카페인 (caffeine) 농도 (0.05 ~ 2%)에 따라 코디세핀 (cordycepin) 생산량을 각각 6일 동안 확인한 결과이다.
도 8 은 본 발명에서 카페인 (caffeine) 이 추출됨에 따라 Cordyceps 균주의 활성을 contorl과 비교하여 각각 6일 동안 확인한 결과이다.1 is a diagram according to the sequence of a cordycepin production experiment by a Cordyceps strain utilizing coffee grounds biomass (SCG), which is a waste in the present invention.
2 is a view showing the activity of bacteria according to the presence or absence of addition of caffeine (caffeine 2%), which was confirmed as an inhibitor in the present invention, through agar medium culture.
3 shows the effect of caffeine on bacterial growth according to the concentration (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%) in the present invention on the 3rd day it has been confirmed
Figure 4 confirms the effect of caffeine (caffeine) on the growth of bacteria according to the concentration (0.05 ~ 2%) in the present invention on the 6th day.
5 is a scanning electron micrograph of a Cordyceps strain in immersion culture with or without caffeine (caffeine 2%) added in the present invention.
Figure 6 is the result of confirming the dry weight of the Cordyceps strain according to the caffeine (caffeine) concentration (0.05 ~ 2%) in the present invention, respectively for 6 days.
7 is a result of confirming the production of cordycepin for 6 days according to the caffeine (caffeine) concentration (0.05 to 2%) in the present invention, respectively.
8 is a result of confirming the activity of the Cordyceps strain compared to contorl for 6 days, respectively, as caffeine is extracted in the present invention.

본 발명의 목적, 특정한 장점들 및 신규 특징들은 첨부된 도면들과 연관되어지는 이하의 상세한 설명과 바람직한 실시예들로부터 더욱 명백해질 것이다. 본 명세서에서 각 도면의 구성요소들에 참조번호를 부가함에 있어서, 동일한 구성 요소들에 한해서는 비록 다른 도면상에 표시되더라도 가능한 한 동일한 번호를 가지도록 하고 있음에 유의하여야 한다. 또한, "제1", "제2" 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위해 사용되는 것으로, 구성요소가 상기 용어들에 의해 제한되는 것은 아니다. 이하, 본 발명을 설명함에 있어서, 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 관련된 공지 기술에 대한 상세한 설명은 생략한다.The objects, specific advantages and novel features of the present invention will become more apparent from the following detailed description taken in conjunction with the accompanying drawings and preferred embodiments. In the present specification, in adding reference numbers to the components of each drawing, it should be noted that only the same components are given the same number as possible even though they are indicated on different drawings. In addition, terms such as “first” and “second” are used to distinguish one component from another, and the component is not limited by the terms. Hereinafter, in describing the present invention, detailed descriptions of related known technologies that may unnecessarily obscure the gist of the present invention will be omitted.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시형태를 상세히 설명하기로 한다.Hereinafter, preferred embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명은 폐기물은 커피 찌꺼기 바이오매스 (SGG)의 활용방안으로서 안출되었다.The present invention was devised as a method for utilizing coffee grounds biomass (SGG) as waste.

커피 찌꺼기 바이오매스 (SGG)는 식물 성장에 좋은 영양분을 제공할 수 있어 퇴비 혹은 버섯 발효 배지로도 활용될 수 있다. 그러나 퇴비 혹은 버섯 발효 배지로 활용하는 데에 있어 치명적인 문제점이 있다. 바로 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 함유되어 있는 카페인 (caffeine)의 영향이다. 커피 원두에서 아라비카 (Arabica) 품종에서는 약 1.2%, 로부스타 (Robusta) 품종에서는 약 2.2%의 카페인 (caffeine)이 함유되어 있다. 이 성분은 재배 시 외부로부터의 병해충을 막아주는 역할을 하나 쓴맛을 내는 성분 중의 하나이기도 하다. 그런데 앞에서 언급했던 것처럼 커피 한잔 만드는데 필요한 원두의 양은 고작 약 0.2%이고 나머지 약 99.8%의 폐기되는 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 있는 카페인 (caffeine)의 양은 0.05% 에서 2%이내로 상당하다. 이러한 양의 차이가 나는 이유는 커피 원두를 로스팅 (Roasting)과 열수 처리 하는 방법 차이에서 나오는 것으로 예상이 된다. 카페인 (caffeine)이 함유되어 있는 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 바로 퇴비로 활용했을 시에는 재배 작물이 영양분을 흡수하는 것을 방해해 말라 죽게 된다. 또한, 토양을 산성화하기 때문에 산성화 토양이 맞지 않는 식물에는 10% ~ 15% 함량 이상 퇴비로 활용하지 않는 것이 좋다. Coffee grounds biomass (SGG) can provide good nutrients for plant growth and can be used as compost or mushroom fermentation medium. However, there is a fatal problem in using it as compost or mushroom fermentation medium. It is the effect of caffeine contained in coffee grounds biomass (SCG). In coffee beans, about 1.2% of the Arabica variety and about 2.2% of the Robusta variety contain caffeine. This ingredient prevents pests and diseases from outside during cultivation, but it is also one of the ingredients that produces a bitter taste. However, as mentioned above, the amount of coffee beans required to make a cup of coffee is only about 0.2%, and the amount of caffeine in the remaining 99.8% of discarded coffee grounds biomass (SCG) is significant within 0.05% to 2%. The reason for the difference in this amount is expected to come from the difference in the method of roasting and hydrothermal treatment of coffee beans. When coffee grounds biomass (SCG), which contains caffeine, is directly used as compost, it prevents the cultivated crops from absorbing nutrients and causes them to wither and die. In addition, it is recommended not to use more than 10% to 15% of compost for plants that are not suitable for acidified soil because it acidifies the soil.

이는 버섯 발효 배지에서도 해당되는 내용이다. 매년 발생되는 엄청난 양의 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에는 카페인 (caffeine) 뿐만 아니고 풍부한 질소원과 탄소원이 있다. 이를 버섯 균주인 동충하초 (Cordyceps)의 발효 배지로 활용하여, 고부가가치 물질인 코디세핀 (cordycepin)을 생산하는 데에 보완이 필요하다. 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG) 안에 함유되어 있는 카페인 (caffeine)의 함량이 동충하초 (Cordyceps)의 생장 및 고부가가치 물질인 코디세핀 (cordycepin)의 생산에 어떻게 저해 영향을 미치는가에 대한 기초 평가 기술이 필요하다. This is also true of the mushroom fermentation medium. Coffee grounds biomass (SCG), a huge amount of waste generated every year, contains not only caffeine, but also a rich source of nitrogen and carbon. By using this as a fermentation medium for the mushroom strain Cordyceps , it is necessary to supplement it to produce a high value-added material, cordycepin. A basic evaluation technology is needed for how the content of caffeine contained in coffee grounds biomass (SCG) has an inhibitory effect on the growth of Cordyceps and the production of high value-added material, cordycepin. .

본 발명은 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (spent coffee ground; SCG)를 동충하초 (Cordyceps)의 배양 배지로 활용하기 위한 방법을 제공한다. 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)는 glucan (10.35%), galactan (7.98%), mannan (21.46%) 그리고 arabinan (3.08%)과 같은 6탄당 (hexose), 5탄당 (pentose) 성분들을 함유하고 있어 동충하초 배양 배지로 적합하다. 그러나 카페인 (caffeine)과 페놀 성분 (phenolic compound)들도 함유하고 있어, 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG) 자체를 배지로 활용하는 데에 문제점을 발견 하였다. 카페인과 페놀 성분들이 동충하초의 배양을 저해 했으며 특히 카페인의 함량이 균주의 생장을 억제하며, 생산 목표인 코디세핀 (cordycepin)의 생산 수율을 저하시켰다. 이를 개선하기 위해서 카페인이 균주 생장과 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 영향을 조사하였다. 저해 인자인 카페인이 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에서 제거되어야 하는데 공정상 완전한 제거는 비용이 많이 요구 되므로, 최소한의 저해 농도를 제시하였다. The present invention provides a method for utilizing waste coffee grounds biomass (spent coffee ground; SCG) as a culture medium of Cordyceps. Coffee grounds biomass (SCG) contains hexose and pentose components such as glucan (10.35%), galactan (7.98%), mannan (21.46%) and arabinan (3.08%). It is suitable as a culture medium. However, since it also contains caffeine and phenolic compounds, we found a problem in using coffee grounds biomass (SCG) itself as a medium. Caffeine and phenol components inhibited the culture of Cordyceps, and the caffeine content inhibited the growth of the strain and lowered the production yield of cordycepin, the production target. To improve this, the effect of caffeine on strain growth and cordycepin production was investigated. Caffeine, an inhibitory factor, has to be removed from coffee grounds biomass (SCG), but complete removal is costly in the process, so a minimum inhibitory concentration is suggested.

이를 통해 폐기물인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG) 그 자체를 발효 배지로 활용하여 코디세핀 (cordycepin)과 같은 고부가가치 물질을 생산하는 데에 그 목적이 있다. 카페인이 균주와 고부가가치 물질인 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 영향에 대한 결과는 생물 발효 공정 시스템과 건강기능 식품 및 의약품 그리고 화장품 원료 생산 분야에서 기초 기술로 유용하게 활용될 수 있다.Through this, the purpose is to use the coffee grounds biomass (SCG) itself, a waste, as a fermentation medium to produce high value-added substances such as cordycepin. The results on the effects of caffeine on the production of strains and high value-added substance, cordycepin, can be usefully utilized as a basic technology in the biological fermentation process system and in the production of health functional foods, pharmaceuticals, and cosmetics raw materials.

본 발명에서는 4세대 바이오매스인 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 Cordyceps 균주의 생장 및 코디세핀 (cordycepin) 생산 배지로 활용하기 위한 방법을 제공한다. 또한, 폐커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG) 성분 중에 카페인 (caffeine)의 농도가 Cordyceps 균주의 생장 및 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 영향을 확인 및 평가한다. 이를 통해 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)가 Cordyceps 균주의 배지로서 활용하지 위한 적절한 방법을 제시하고자 한다.The present invention provides a method for using coffee grounds biomass (SCG), which is a fourth-generation biomass, as a medium for growth and cordycepin production of Cordyceps strains. In addition, the effect of the concentration of caffeine (caffeine) in the waste coffee grounds biomass (SCG) component on the growth of Cordyceps strains and cordycepin production is confirmed and evaluated. Through this, we intend to suggest an appropriate method for using coffee grounds biomass (SCG) as a medium for Cordyceps strains.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.Hereinafter, the present invention will be described in detail.

본 발명은 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 Cordyceps 균주의 발효 배지로 활용하기 위한 방법을 제시하는데, 이를 위해 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG) 성분 중에 카페인 (caffeine)이 주는 균주 생장 억제 영향에 대한 조사 및 발효 배지로 활용하기 위한 최적조건을 설계한다. The present invention provides a method for utilizing coffee grounds biomass (SCG) as a fermentation medium for Cordyceps strains. For this purpose, the effect of caffeine (caffeine) in the coffee grounds biomass (SCG) component to inhibit the growth of strains was investigated and Design optimal conditions for use as fermentation medium.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 본 발명에 따른 동충하초 배양방법은 (a) Cordyceps 균사체를 종균 배양하는 단계; (b) 상기 종균 배양된 Cordyceps 균주에 억제 인자인 카페인 (caffeine)의 농도에 따른 영향 평가를 고체 배지로 준비하는 단계; (c) 상기 액침 본 배지 내 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 Cordyceps 균주에 미치는 영향을 확인하기 위해 준비하는 단계; (d) 본 배지에서 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 Cordyceps 균주의 생장 및 코디세핀 (cordycepin) 생산에 미치는 영향을 확인 및 평가하는 단계; (e) 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에서 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 추출되었을 때와 아닐 때 Cordyceps 균주의 활성을 각각 6일 동안 확인하는 단계;를 포함한다.Hereinafter, the present invention will be specifically described. The method for culturing Cordyceps according to the present invention is (a) culturing a seed culture of Cordyceps mycelium; (b) the seed cultured Cordyceps Preparing a solid medium to evaluate the effect according to the concentration of the inhibitory factor caffeine (caffeine) on the strain; (c) Caffeine, an inhibitory factor in the immersion main medium, is Cordyceps preparing to check the effect on the strain; (d) the caffeine (caffeine) inhibitor in the medium Cordyceps Identifying and evaluating the effect on the growth of the strain and cordycepin (cordycepin) production; (e) checking the activity of the Cordyceps strain for 6 days, respectively, when the inhibitory factor, caffeine, is extracted from the coffee grounds biomass (SCG) and when not.

상기 (a)에 사용되는 균사체는 Cordyceps militaris (KCTC6064, KCTC6862, KYL05) 균주에서 선택되는 1종 이상의 균사체일 수 있다. The mycelium used in (a) above is Cordyceps militaris (KCTC6064, KCTC6862, KYL05) may be one or more mycelium selected from strains.

상기 (a)의 종균 배양에 사용되는 배지 및 방법은 다음과 같다. 균사체를 육안으로 확인하기 위해 PDA (Potato Dextrose Agar) 고체 배지를 이용하였으며, 25℃ 에서 약 1 ~ 2주 동안 배양한다. 균사체 배지를 멸균된 루프를 이용하여 YPD (Yeast extract 2%, Peptone 2%, Glucose 1%, Agar 2%) 사면 배지에 접종한 후 25℃에서 약 1 ~ 2주 동안 배양한다.The medium and method used for the seed culture of (a) are as follows. In order to visually check the mycelium, PDA (Potato Dextrose Agar) solid medium was used, and cultured at 25° C. for about 1 to 2 weeks. After inoculating the mycelium medium in YPD (Yeast extract 2%, Peptone 2%, Glucose 1%, Agar 2%) slope medium using a sterile loop, culture at 25°C for about 1 to 2 weeks.

상기 (b)의 Cordyceps 균사체 배양용 고체 배지 조성은 다음과 같다. Casein hydrolysate 2%, Glucose 2%, Agar 2%로 조성하였으며, 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 농도 (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%)를 각각 첨가하였다. Cordyceps of (b) above The composition of the solid medium for culturing mycelium is as follows. It was formulated with casein hydrolysate 2%, glucose 2%, and agar 2%, and the inhibitory factor, caffeine, had concentrations (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%). ) were added respectively.

상기 (c)의 Cordyceps 균주 액침 배지 조성은 다음과 같다 (Glucose 20 g/L, Casein hydrolysate 20 g/L, MgSO47H2O 1 g/L, KH2PO4 2 g/L). (a)단계에서 준비한 사면 배지의 균사체를 (c)단계에서 준비한 액침 배지에 접종하여 실시한다. (a)단계의 사면 배지 내 균사체는 멸균수 또는 계면활성제 0.1%가 첨가된 멸균수 10 ~ 20 ml를 첨가하여 포자를 액체로 회수한다. 포자 농도를 Haemocytometer로 계수하여 본 배양 배지 내 총 포자 수를 약 0.8 ~ 1.6 × 108로 맞춘다. 배양 온도는 15 ~ 37 ℃, pH는 3 ~ 10, 교반 속도는 0 ~ 250 rpm 에서 배양할 수 있다. Cordyceps of (c) above The composition of the strain immersion medium is as follows (Glucose 20 g/L, Casein hydrolysate 20 g/L, MgSO 4 7H 2 O 1 g/L, KH 2 PO 4 2 g/L). It is carried out by inoculating the mycelium of the slope medium prepared in step (a) into the immersion medium prepared in step (c). The mycelium in the slope medium of step (a) is recovered as a liquid by adding 10 to 20 ml of sterile water or sterile water with 0.1% surfactant added thereto. Count the spore concentration with a Haemocytometer and adjust the total number of spores in the culture medium to about 0.8 ~ 1.6 × 10 8 . The culture temperature can be 15 ~ 37 ℃, the pH is 3 ~ 10, the stirring speed can be cultured at 0 ~ 250 rpm.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예 및 실험예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예 및 실험예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다. 이하 본 발명을 다음의 실험예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through Examples and Experimental Examples. Since these Examples and Experimental Examples are merely for illustrating the present invention, the scope of the present invention is not to be construed as being limited by these Examples and Experimental Examples. Hereinafter, the present invention will be described in more detail by the following experimental examples.

실험예Experimental example 1. One.

카페인 (caffeine) 함량 및 코디세핀 (Caffeine content and cordycepin ( cordycepincordycepin ) 함량 분석) content analysis

카페인 (caffeine) 함량 분석 및 코디세핀 (cordycepin) 함량 분석은 UV Detector (SPD- 20A, Shimadzu, Japan)가 탑재된 high performance liquid chromatography (HPLC)를 이용하였고, 컬럼 (column)은 X-Bridge C18 5 um (250 Х 4.6 mm, Waters)를 사용하였다. 컬럼의 이동상 (mobile phase)은 15% methanol in 20 mM phosphoric acid를 사용하였으며, 유속은 0.6 mL/min 이였다.For analysis of caffeine content and cordycepin content, high performance liquid chromatography (HPLC) equipped with a UV Detector (SPD-20A, Shimadzu, Japan) was used, and the column was X-Bridge C18 5 um (250 Х 4.6 mm, Waters) was used. As the mobile phase of the column, 15% methanol in 20 mM phosphoric acid was used, and the flow rate was 0.6 mL/min.

실험예Experimental example 2. 2.

카페인 (caffeine) 농도에 따른 영향 평가Evaluating the effect of caffeine concentration

카페인 (caffeine) 이 첨가 됨에 따라 균의 활성이 억제가 되는 모습을 도2에 나타내었다. 또한 카페인 (caffeine) 농도에 따른 Cordyceps 균주의 활성 측정을 실시 하였음. 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 농도 (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%)별 고체 배지 (Casein hydrolysate 2%, Glucose 2%, Agar 2%로 조성)에 첨가 되게 준비 하였다. 이 고체 배지에 상기 a)에서 준비한 코디셉스 밀리타리스 (Cordyceps militaris) 균주를 접종 하였다. 인큐베이터에서 접종된 각각의 고체 배지를 25℃에서 6일 동안 암배양 하였으며, 그 결과를 도3 (3일 배양)와 도4 (6일 배양)에 각각 나타내었다. 또한 1 ~ 6일 동안 고체 배지에서의 코디셉스 밀리타리스 (Cordyceps militaris) 균주의 colony diameter (mm)를 각각 측정하여 [표 1]에 나타내었다. Figure 2 shows that the activity of bacteria is inhibited as caffeine (caffeine) is added. Cordyceps according to caffeine concentration The activity of the strain was measured. The inhibitory factor caffeine (caffeine) by concentration (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 2%) in the solid medium (Casein hydrolysate 2%, Glucose 2%, Agar 2 It was prepared to be added to the composition in %). Cordyceps militaris prepared in a) above in this solid medium ( Cordyceps militaris ) strain was inoculated. Each solid medium inoculated in the incubator was cancer-cultured at 25° C. for 6 days, and the results are shown in FIGS. 3 (3-day culture) and 4 (6-day culture), respectively. Also, Cordyceps melitaris (Cordyceps) on solid medium for 1 to 6 days. militaris ) colony diameter (mm) of each strain was measured and shown in [Table 1].

[표 1][Table 1]

Figure pat00001
Figure pat00001

본 결과를 바탕으로 카페인 (caffeine) 농도가 0.1% 미만에서는 균주의 활성이 저해는 되나 균주의 생장이 되는 것을 확인하였다. 카페인 (caffeine)의 최소 저해 농도로 0.1% 이하를 제시한다. Based on this result, it was confirmed that the activity of the strain was inhibited when the concentration of caffeine was less than 0.1%, but the growth of the strain was confirmed. 0.1% or less is suggested as the minimum inhibitory concentration of caffeine.

실험예Experimental example 3. 3.

카페인 (caffeine) 첨가에 따른 According to the addition of caffeine (caffeine) 코디셉스Codyceps 밀리타리스Militaris ( ( CordycepsCordyceps militarismilitaris ) 균주 모습) strain appearance

상기 (c)의 Cordyceps 균주 액침 배지 조성 (Glucose 20 g/L, Casein hydrolysate 20 g/L, MgSO47H2O 1 g/L, KH2PO4 2 g/L). 카페인 (caffeine) 이 첨가 됨에 따라 균의 활성이 억제가 되는 모습을 도5에 나타내었다. 균의 활성 측정은 광학 현미경 (Nicon eclipse 80i, Nicon Co., Japan)으로 관측하였으며, Image Pro 3.0 software (Media Cybernetics Inc., USA) 프로그램을 활용하였다. 이미지는 digital camera (Sony, Tokyo, Japan)로 다루었다. 카페인 (caffeine) 농도는 가장 억제를 잘 보여준 2% 농도로 첨가하였다. 카페인 (caffeine) 2%가 첨가됨에 따라 균의 활성은 200, 400, 1000배율로 관측하였으며, 그 결과를 도5에 나타내었다. Cordyceps of (c) above Composition of strain immersion medium (Glucose 20 g/L, Casein hydrolysate 20 g/L, MgSO 4 7H 2 O 1 g/L, KH 2 PO 4 2 g/L). 5 shows that the activity of bacteria is inhibited as caffeine is added. Bacterial activity was measured with an optical microscope (Nicon eclipse 80i, Nicon Co., Japan), and Image Pro 3.0 software (Media Cybernetics Inc., USA) program was used. Images were handled with a digital camera (Sony, Tokyo, Japan). Caffeine was added at a concentration of 2% that showed the most inhibition. As 2% of caffeine was added, the activity of the bacteria was observed at 200, 400, and 1000 times magnification, and the results are shown in FIG. 5 .

실험예Experimental example 4. 4.

카페인 (caffeine) 첨가에 따른 According to the addition of caffeine (caffeine) 코디셉스Codyceps 밀리타리스Militaris ( ( CordycepsCordyceps militarismilitaris ) 균주의 ) of the strain DCWDCW (dry cell weight) 및 코디세핀 ( (dry cell weight) and cordycepin ( cordycepincordycepin ) 생산 변화) production change

상기 (c)의 Cordyceps 균주 액침 배양 조성에 카페인 (caffeine) 2%가 첨가 됨에 Cordyceps 균주의 건조 중량인 DCW는 filter paper (Whatman GF/C, Maidstone, UK) 를 사용하여, 오븐 (vacuum oven, VO-20X, Jeiotech, Daejeon, Korea) 에서 48 h at 50℃로 건조하여 측정하였다. 코디세핀 (cordycepin) 함량은 상기 실험예 1.에서 언급한 방법으로 측정하였다. 이를 바탕으로 Cordyceps 균주의 생장 및 cordycepin 생산 결과를 도6, 7에 나타내었다. Cordyceps of (c) above As 2% of caffeine is added to the strain immersion culture composition, Cordyceps DCW, which is the dry weight of the strain, was measured by drying at 50° C. for 48 h at 50° C. in an oven (vacuum oven, VO-20X, Jeiotech, Daejeon, Korea) using filter paper (Whatman GF/C, Maidstone, UK). The cordycepin content was measured by the method mentioned in Experimental Example 1. Based on this, Cordyceps The growth and cordycepin production results of the strain are shown in FIGS. 6 and 7 .

실험예Experimental example 5. 5.

커피 찌꺼기 coffee grounds 바이오매스biomass ( ( SCGSCG )에서 억제 인자인 카페인 (caffeine)이 추출되었을 때와 아닐 때, ) when the inhibitory factor, caffeine, is extracted and when not, 6일동안for 6 days CordycepsCordyceps 균주의 활성 변화 Changes in strain activity

상기 (e)의 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에서 억제 인자인 카페인 (caffeine)과 플라보노이드 (flavonoid), 페놀 함량 (Total Phenolic Contents)을 효율적으로 추출하기 위해 고액비 (solid-liquid ratio)에 따른 실험을 적용하였다. 고액비 (solid-liquid ratio)는 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 5g기준으로, 추출 용매는 초순수 물 (Ultrapure water)과 여러 유기 용매 (acetone, chloroform, dichloromethane, ethanol, ethyl acetate, methanol, toluene 등등)들로 하였다. 고액비 (solid-liquid ratio)는 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, 1:30으로 하였으며, 이때 1:20과 1:30이 가장 적합하였다. 1:20과 1:30에서 억제 인자인 카페인 (caffeine)과 플라보노이드 (flavonoid), 페놀 함량 (Total Phenolic Contents)이 가장 많이 추출되는 양상을 보였으며, 이렇게 추출 과정을 거친 커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 Cordyceps 균주를 접종하여 관측하였다. 6일 후의 Cordyceps 균주의 활성 결과를 도8에 나타내었다. Experiment according to solid-liquid ratio to efficiently extract caffeine, flavonoid, and phenol content (Total Phenolic Contents), which are inhibitors, from the coffee grounds biomass (SCG) of (e) above was applied. The solid-liquid ratio is based on 5 g of coffee grounds biomass (SCG), and the extraction solvent is ultrapure water and various organic solvents (acetone, chloroform, dichloromethane, ethanol, ethyl acetate, methanol, toluene, etc.) ) were made with The solid-liquid ratio was 1:5, 1:10, 1:15, 1:20, and 1:30, in which case 1:20 and 1:30 were most suitable. At 1:20 and 1:30, caffeine, flavonoid, and phenol content (Total Phenolic Contents), which are inhibitors, were extracted the most, and coffee grounds biomass (SCG) Cordyceps strain was inoculated and observed. The results of the activity of the Cordyceps strain after 6 days are shown in FIG. 8 .

이상 본 발명을 구체적인 실시예를 통하여 상세히 설명하였으나, 이는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명은 이에 한정되지 않으며, 본 발명의 기술적 사상 내에서 당 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의해 그 변형이나 개량이 가능함이 명백하다.Although the present invention has been described in detail through specific examples, it is intended to describe the present invention in detail, and the present invention is not limited thereto. It is clear that the modification or improvement is possible.

본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 모두 본 발명의 영역에 속한 것으로 본 발명의 구체적인 보호 범위는 첨부된 특허청구범위에 의하여 명확해질 것이다.All simple modifications or changes of the present invention are within the scope of the present invention, and the specific protection scope of the present invention will be made clear by the appended claims.

Claims (5)

동충하초 배양방법에 있어서,
커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)를 Cordyceps 균주의 발효 배지로 활용하는 동충하초 배양방법.
In the Cordyceps culturing method,
A method of culturing Cordyceps Cordyceps using coffee grounds biomass (SCG) as a fermentation medium for Cordyceps strains.
청구항 1에 있어서,
커피 찌꺼기 바이오매스 (SCG)에 함유되어 있는 카페인 (caffeine)이 Cordyceps 균주의 생장 및 코디세핀 (cordycepin)의 생산 억제 인자로 제시되는 동총하초 배양방법.
The method according to claim 1,
Caffeine contained in coffee grounds biomass (SCG) is suggested as an inhibitory factor for the growth of Cordyceps strains and the production of cordycepin.
청구항 2에 있어서,
억제 인자인 카페인 (caffeine)의 농도 (0.05 ~ 2%)에 따른 영향 평가 및 Cordyceps 균주의 생장 및 코디세핀 (cordycepin)의 생산 억제 인자로 제시되는 동총하초 배양방법.
3. The method according to claim 2,
Cordyceps culturing method suggested as an inhibitory factor for the evaluation of the concentration (0.05 ~ 2%) of the inhibitory factor caffeine (caffeine) and the growth of Cordyceps strains and production of cordycepin.
 청구항 2에 있어서,
억제 인자 카페인 (caffeine)의 저해 최소 농도는 0.05 ~ 0.1%인 동총하초 배양방법.
3. The method according to claim 2,
The minimum inhibitory concentration of the inhibitory factor caffeine (caffeine) is 0.05 ~ 0.1%.
 청구항 1에 있어서,
카페인 (caffeine), 플라보노이드 (flavonoid), 및 페놀 함량 (Total Phenolic Contents) 중 적어도 어느 하나인 억제 인자를 제거하여 Cordyceps 균주 활성을 증가시키는 동총하초 배양방법.
The method according to claim 1,
Caffeine (caffeine), flavonoid (flavonoid), and phenol content (Total Phenolic Contents) at least any one of the inhibitory factor is removed to increase the activity of Cordyceps strains.
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