KR20220006286A

KR20220006286A - 전립선암 진단 및 치료를 위한 전립선특이 막 항원 표적 화합물 및 이를 포함하는 전립선암 진단 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20220006286A
Application number: KR1020200084056A
Authority: KR
Inventors: 임일한; 우상근; 이철희; 송강현; 임상무; 최창운
Original assignee: 한국원자력의학원
Priority date: 2020-07-08
Filing date: 2020-07-08
Publication date: 2022-01-17

Abstract

본 발명은 전립선특이 막 항원에 특이적으로 결합하여 저해 활성을 가지고 방사성 표지자로서 이용시 해상도가 뛰어난 영상을 제공할 수 있는 전립선특이 막 항원 표적 화합물 및 이를 포함하는 방사성 추적자용 조성물, 전립선암의 진단용 조성물 또는 전립선암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

Description

전립선암 진단 및 치료를 위한 전립선특이 막 항원 표적 화합물 및 이를 포함하는 전립선암 진단 및 치료용 조성물{Prostate-specific Membrane Antigen Targeted Compound And Composition Comprising The Same For Diagnosis And Treatment Of Prostate Cancer}

본 발명은 전립선암 진단 및 치료를 위한 전립선특이 막 항원 표적 화합물 및 이를 포함하는 전립선암 진단용 조성물 또는 전립선암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 미국에서는 폐암 다음으로 높은 사망률을 보이고, 국내에서도 고령화와 식생활의 서구화 등에 의하여 급격히 증가하는 양상을 보이고 있어 전립선암의 조기 진단, 예방 및 치료는 국내뿐만 아니라 전 세계적으로 큰 이슈가 되고 있다.

전립선특이 막 항원(Prostate-specific membrane antigen, PSMA)은 전립선암에서 특이적으로 발현되는 것으로서, 다른 조직보다 약 100배 이상 전립선에서 많이 발현되는 아연-의존성 금속 단백질 분해 효소이다. PSMA는 이러한 높은 발현과 세포 외부에 활성 부위가 존재함으로 인하여 전이성 전립선암의 치료 및 영상화를 위한 잠재적인 바이오마커로 여겨져 왔으며, PSMA에 결합하는 리간드로서 Glu-urea-Lys (GUL) 또는 Glu-urea-Cys (GUC)와 같은 펩타이드 유도체가 오래 전부터 알려져 있고, 이러한 펩타이드 리간드에 방사성 동위원소를 표지한 방사성 의약품은 PET 등으로 PSMA를 발현하는 전립선암을 특이적으로 영상화하거나 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다(특허문헌 1).

이에, 전립선암 진단 및 치료를 위한 전립선특이 막 항원 표적 화합물에 대한 연구가 지속적으로 이루어졌으며, 전립선특이 막 항원에 특이적으로 결합하여 저해활성을 가지면서 양전자 방출 단층촬영(PET) 등의 분자 영상 기법에 방사성 표지자로서 이용시 뛰어난 해상도의 영상을 제공하므로 작은 크기의 종양도 발견할 수 있는 전립선특이 막 항원 표적 화합물을 개발할 필요성이 존재하였다.

한국 공개특허공보 제2019-0114908호 (2019.10.10.)

본 발명은 전립선특이 막 항원에 특이적으로 결합하여 저해 활성을 가지고 양전자 방출 단층촬영(PET) 등의 분자 영상 기법에 적용시 영상의 해상도가 뛰어난 전립선특이 막 항원 표적 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 일 양태는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다:

[화학식 1]

R₁및 R₂는 각각 독립적으로 CH₂, NH 또는 O이고,

B₁및 B₂는 각각 독립적으로 아마이드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 에스테르 결합 및 티오에스테르 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,

m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고,

R₃은 수소, 수산화기, 카르복실기, 아릴기 및 아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고,

R₄는 수산화기, 카르복실기 및 할로겐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 치환 또는 비치환된 아릴기이고,

X₁, X₂및 X₃은 각각 독립적으로 O 또는 S이고,

q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고,

R₅는

또는

이다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 수화물을 포함하는 방사성 추적자용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 수화물을 포함하는 전립선암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 전립선암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 전립선특이 막 항원 표적 화합물은 구리의 방사성 동위원소, 특히 ⁶⁴Cu와 안정적으로 착물을 형성함으로써, 방사성 표지자로서 사용되는 경우 뛰어난 해상도의 영상을 제공할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 전립선특이 막 항원 표적 화합물은 전립선특이 막 항원에 특이적으로 결합하여 저해활성을 나타내므로 이를 전립선암의 치료 또는 예방의 용도로 활용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 구현예로서, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 표지 결과(도 1의 패널 A), 안정성 시험 결과(도 1의 패널 B) 및 체외 흡수 분석 결과(도 1의 패널 C)를 나타낸다.
도 2는 PC-3 및 22RV1 종양 이종 이식 모델에서 ¹⁸F-FDG의 PET/CT 영상 결과이다. 정맥 주사(5.6 MBq) 후, 1시간 후의 ¹⁸F-FDG PET/CT 영상이다. 패널 A의 종양 이종이식 동물 모델에서 왼쪽은 PC-3의 대표 MIP 영상이고, 오른쪽은 22RV1의 대표 MIP 영상이다. 패널 B는 종양 이종이식 모델에서 횡단면 영상이고, 패널 C는 종양 이종이식 모델에서 관상 영상이다. ¹⁸F-FDG는 양쪽 종양 모두에서 축적됨을 확인하였다.
도 3은 PC-3 및 22RV1 이종 이식 모델의 2-PMPA의 부재하의 PET/CT 영상 결과를 나타낸다. ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물(~7.4 MBq)의 정맥 주사 후 24시간에서 이미징이다. 패널 A의 종양 이종이식 모델에서 왼쪽은 PC-3의 대표 MIP (maximum intensity projection) 영상이고, 오른쪽은 22RV1의 대표 MIP 영상이다. 패널 B는 종양 이종이식 모델에서 횡단면 영상이고, 패널 C는 종양 이종이식 모델에서 관상 영상이다.
도 4는 PC-3 및 22RV1 이종 이식 모델의 2-PMPA의 존재하의 PET/CT 영상 결과를 나타낸다. ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물(~7.4 MBq)을 800 μM의 2-PMPA와 함께 정맥 주사 후 24시간에서 PET/CT 영상을 얻었다. 종양 이종이식 모델에서 왼쪽은 PC-3의 대표 MIP 영상이고, 오른쪽은 22RV1의 대표 MIP 영상이다. 22RV1 종양의 경우 2-PMPA에 의해 특이적으로 블로킹되었다.
도 5는 22RV1 이종 이식 모델에서 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 인 비보 PET/CT 영상 결과(패널 A) 및 생체분포 분석 결과(패널 B-D)를 나타낸다. 패널 A에서는 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 정맥내 주사 후(8.2 내지 8.9 MBq), PET/CT 영상을 2, 24, 및 48시간 시점에서 측정한 결과이고, 패널 B는 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 생체분포 분석 결과이며, 패널 C 및 패널 D는 각각 간에 대한 종양 비율 결과이며, 신장에 대한 종양의 비율 결과이다(*; p <0.05).

이하, 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 명세서 및 청구범위에서 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.

본 발명에서 용어 "진단"은 질환의 징후 및 증상으로부터 질병을 확인하는 작용 및/또는 이러한 경우에서 질병을 나타내는 생물학적 마커(유전자 또는 단백질과 같은 것)의 분석을 의미한다.

본 발명에서 용어 "예방"은 본 발명의 화합물 또는 조성물의 투여로 질병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말하며, "치료" 또는 "개선"은 본 발명의 화합물 또는 조성물에 의해 질병이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어 "알킬"은 1-30개 탄소 원자, 바람직하게 1-20, 1-15, 1-10, 1-8, 1-6, 1-4, 1-3 또는 1-2개 탄소 원자를 갖는 선형, 분지 및 원형 사슬 라디칼을 포함한다.

본 발명에서 용어 "아릴"은 단환식 또는 다환식 또는 융합된 다환식 방향족 고리계를 지칭한다. 상기 용어 "알릴"은 고리계의 하나 이상의 탄소 원자가 헤테로 원자로 치환된 단환식 또는 다환식 또는 융합 다환식 방향족 "헤테로아릴" 고리 시스템을 포함한다. 전형적으로, "아릴" 및 "헤테로아릴"이라는 용어는 3-30개의 탄소 원자, 예컨대 3-10개, 특히 2-6개의 탄소 원자를 갖는 기를 지칭한다.

본 발명에서 용어 "아릴알킬" 또는 "아랄킬"은 하나 이상의 알킬기 및 하나 이상의 아릴기를 포함하는 기를 지칭하기 위해 사용된다.

본 발명에서 용어 "할로겐" 또는 "할로"는 불소(F), 염소(Cl), 브롬(Br), 요오드(I)를 포함한다.

[화학식 1]

R₁및 R₂는 각각 독립적으로 CH₂, NH 또는 O이고,

m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고,

X₁, X₂및 X₃은 각각 독립적으로 O 또는 S이고,

q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고,

R₅는

또는

이다.

상기 화학식 1에서, R₁및 R₂는 NH이고,

B₁및 B₂는 아마이드 결합이고,

m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고,

R₃은 카르복실기이고,

R₄는

이고, 여기서 R₆및 R₇은 각각 독립적으로 수소, 수산화기 및 할로겐기로 이루어지는 군으로부터 선택되고,

X₁, X₂및 X₃은 O이고,

q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고,

R₅는

일 수 있다.

구체적으로, 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

화학식 1 또는 화학식 2에서, m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고, q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고, R₆및 R₇은 각각 독립적으로 수소, 수산화기 및 할로겐기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.

구체적으로, 화학식 1 또는 화학식 2에서, m은 2 또는 3이고, n, o, p는 각각 독립적으로 4 내지 6의 정수이고, q, r, s는 각각 독립적으로 1 또는 2일 수 있다.

구체적인 예로서, 상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 3]

또한, 본 발명의 화합물은 금속 방사성 동위원소와 안정적으로 착물을 형성하고, 이를 방사성 추적자로 활용하면 뛰어난 해상도의 영상을 구현할 수 있으므로 작은 크기의 종양까지도 발견이 가능할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화합물에서 상기 금속의 방사성 동위원소는 구리의 방사성 동위원소일 수 있고, 보다 구체적으로 ⁶²Cu, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁷Cu로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있고, ⁶⁴Cu일 수 있다. ⁶⁴Cu는 반감기가 대략 12.7시간으로 긴 편이기 때문에 ⁶⁴Cu를 이용한 금속 착물은 방사성 의약품으로서 다양한 활용도를 가질 수 있다. 또한, ⁶⁴Cu는 사이클로트론을 이용하여 생산할 수 있기 때문에 생산 및 품질관리가 용이한 이점이 있다.

본 발명의 화합물 또는 금속의 방사성 동위원소와 착물을 이루는 화합물은 전립선암 세포에 과다 발현하는 전립선특이 막 항원(Prostate-Specific Membrane Antigen, PSMA)에 선택적으로 결합할 수 있고, 이의 활성을 저해할 수 있다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용할 수 있으며, 염으로는 약학적으로 허용가능한 유리산(free acid)에 의해 형성된 산 부가염이 유용하다. 산 부가염은 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요드화수소산, 아질산, 아인산 등과 같은 무기산류, 지방족 모노 및 디카르복실레이트, 페닐-치환된 알카노에이트, 하이드록시 알카노에이트 및 알칸디오에이트, 방향족 산류, 지방족 및 방향족 설폰산류 등과 같은 무독성 유기산, 트리플루오로아세트산, 아세테이트, 안식향산, 구연산, 젖산, 말레인산, 글루콘산, 메탄설폰산, 4-톨루엔설폰산, 주석산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 얻는다. 이러한 약학적으로 무독한 염의 종류로는 설페이트, 피로설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 바이설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노하이드로겐 포스페이트, 디하이드로겐 포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 프로피오네이트, 데카노에이트, 카프릴레이트, 아크릴레이트, 포메이트, 이소부티레이트, 카프레이트, 헵타노에이트, 프로피올레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말리에이트, 부틴-1,4-디오에이트, 헥산-1,6-디오에이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로 벤조에이트, 하이드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 프탈레이트, 테레프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 클로로벤젠설포네이트, 크실렌설포네이트, 페닐아세테이트, 페닐프로피오네이트, 페닐부티레이트, 시트레이트, 락테이트, β-하이드록시부티레이트, 글리콜레이트, 말레이트, 타트레이트, 메탄설포네이트, 프로판설포네이트, 나프탈렌-1-설포네이트, 나프탈렌-2-설포네이트, 만델레이트 등을 포함한다.

본 발명에 따른 화합물의 산 부가염은 통상의 방법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 본 발명의 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 메틸렌클로라이드, 아세토니트릴 등과 같은 유기용매에 녹이고 유기산 또는 무기산을 가하여 생성된 침전물을 여과, 건조시켜 제조하거나, 용매와 과량의 산을 감압 증류한 후 건조시켜 유기용매 하에서 결정화시켜서 제조할 수 있다.

또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염은 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리 토금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물 염을 여과하고, 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로는 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하다. 또한, 이에 대응하는 염은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 방사성 추적자용 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 전립선암 진단용 조성물을 제공한다.

본 발명의 방사성 추적자용 조성물 또는 전립선암 진단용 조성물은 분자 영상 기법에 사용될 수 있으며, 그 예로는 생물발광(bioluminescence), SPECT(single photon emission computed tomography), 컴퓨터단층촬영(computed tomography, CT), 자기공명단층촬영(magnetic resonance imaging, MRI), 양전자방출 단층촬영(positron emission tomography, PET), 또는 초음파 등이 있으나 이에 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 다른 양태는 상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 수화물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 전립선암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약학적 조성물은 임상 투여시에 경구 및 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테로 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사를 주입하는 방법에 의한다.

이때, 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위하여 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 안정제 또는 완충제와 함께 물에 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고, 이를 앰플 또는 바이알 단위 투여형으로 제조할 수 있다. 상기 조성물은 멸균되고/되거나 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 보조제, 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 함유할 수 있으며, 통상적인 방법인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 따라 제제화할 수 있다.

경구 투여용 제형으로는 예를 들면 정제, 환제, 경/연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 과립제, 엘릭시르제, 트로키제 등이 있는데, 이들 제형은 유효성분 이외에 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로즈 및/또는 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및/또는 폴리에틸렌 글리콜)를 함유하고 있다. 정제는 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분 페이스트, 젤라틴, 메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 및/또는 폴리비닐피롤리딘 등과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염 등과 같은 붕해제 또는 비등 혼합물 및/또는 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제를 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험예 1: 실험 계획 및 방법

세포 배양

인간 전립선암 세포주(22RV1; PSMA 양성 및 PC-3; PSMA 음성)를 사용하였다. 두 세포는 모두 American Type Culture Collection(ATCC)으로부터 입수하여 1% 항생제(페니실린 G, 100 units/ml 및 스트렙토마이신 10 ug/ml; Gibco)를 함유하는 10% 우태아 혈청(Gibco)과 함께 RPMI 1640에서 유지하였다. 세포를 5% CO₂분위기하 37℃에서 배양하였다.

PSMA 표적 화합물의 ⁶⁴ Cu 방사성 표지

본 발명의 전립선-특이 막항원(Prostate-specific membrane antigen)에 대한 표적 화합물(이하, "PSMA 표적 화합물" 또는 "⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물"이라 함)은 문헌 Weineisen et al. EJNMMI Research 2014, 4:63 (Synthesis and preclinical evaluation of DOTAGA conjugated PSMA ligands for functional imaging and endoradiotherapy of prostate cancer)에 기술된 방법 또는 이 방법을 변형하여 합성한 후, 이 화합물의 방사성 원소의 표지를 위해, ⁶⁴Cu 용출액 (481 kBq)을 1 mM의 아세트산 나트륨(pH 5.5) 및 1 nmol의 화합물을 함유하는 표지 바이알에 첨가하였다. 반응 혼합물을 42℃에서 5분 동안 가열하였다. 혼입 수율(incorporation yield)은 0.1M 시트르산(pH 5.5)을 이용하여 순간 박막 크로마토그래피(iTLC, Agilent Technologies)에 의해 결정하였다. 혼입 수율은 95%를 항상 초과하여 나타났다.

안정성 테스트

⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 안정성은 37℃에서 1, 2, 4, 24, 48 및 60 시간 동안 인간 및 마우스 혈청, 및 인산 완충 식염수(PBS)에서 배양 후 iTLC를 통해 분석하였다.

⁶⁴ Cu-PSMA 표적 화합물의 인 비트로(in vitro) 흡수 분석

블로킹 연구를 위해 100 μM의 2-PMPA(Sigma-Aldrich)의 존재 또는 부재하에 분석 배지(무혈청 배지)에서 3.75 nM의 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 사용하여 흡수(uptake)를 조사하였다. 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션을 수행하였다. 이후 분석 프로토콜에 따라 인 비트로 흡수분석(uptake assay)를 수행하였다(Lee CH, Kim MJ, Lee HH, et al. Adenine nucleotide translocase 2 as an enzyme related to [18F] FDG accumulation in various cancers. Mol Imaging Biol. 2019;21:722-30). 간략히 설명하면, 세포를 1% 소혈청 알부민을 함유하는 차가운 PBS로 2회 세척하고 1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)로 용해시켰다. 세포 내 축적된 방사능을 γ-감마 카운터를 사용하여 측정하였다. 분석 시 세포 용해물의 총 단백질의 양으로 방사능 축적정도를 표준화 하였다. 모든 실험은 적어도 3회 수행하였다.

동물 실험

6주령 수컷 BALB/C 누드 마우스를 NARA Bio, Inc.로부터 입수하였다. 모든 동물 실험은 KIRAMS의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(2019-0032)에 의해 승인되었다. 22RV1 세포(5×10⁶/100㎕)의 매트리겔과 혼합 배양 배지(Corning Inc.)를 마우스의 오른쪽 허벅지에 피하 이식하여, 전립선암 이종 이식 마우스 모델을 제작 확립하였다. ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 표적화에 기반하여 PSMA 음성 종양 및 PSMA 양성 종양을 비교하기 위해, PC-3 세포 및 22RV1 세포을 각각 마우스의 왼쪽 및 오른쪽 허벅지에 이식하였다. 종양 크기가 직경이 0.5 cm를 초과할 때 PET 영상화를 수행하였다.

생체분포 연구(Biodistribution Study)

종양 보유 마우스에서 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 흡수를 평가하기 위해 각 시점에 따른 생체분포 연구를 수행하였다(각 시점에서 n=3). 모든 마우스에 2.0 MBq의 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 정맥 주사하였다. 정맥 주사(i.v.) 후 2시간, 24시간 및 48시간에 각 그룹을 희생시켰다. 종양 및 혈액 샘플을 포함한 다양한 기관에 가중치를 부여하고 방사능을 측정하였다. γ-카운터의 데이터는 조직의 그램당 주사된 용량의 % (%ID/g)로 나타냈다.

동물 PET/CT 영상화

종양 보유 마우스의 PET/CT 이미지를 PET/CT(INVEON 스캐너, Siemens Healthcare)를 이용하여 획득하였다. 22RV1 이종 이식 모델 단독 그룹(n=4)에 헤드 당 8.1 - 8.9 MBq의 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 정맥주사한 후, 2, 24 및 48시간에서, 흡입 마취(이소플루란, 1.5%) 하에서 20분 동안 이미지를 수득하였다. 또한, PSMA에 대한 특이적 결합을 평가하기 위해, PC-3 및 22RV1 모두의 이종 이식 동물 모델(n=2)은 800 μM 2-PMPA의 존재 또는 부존재 하에, ¹⁸F-FDG(5.55MBq) 및 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물(7.2-7.4 MBq)을 정맥주사한 후 24시간 및 48시간에 PET/CT 이미지를 수득하였다. 이미지는 INVEON 소프트웨어 및 AMIDE 알고리즘(의료 이미지 데이터 검사기)에 의해 재구성하고 분석하였다.

통계 분석

모든 통계 분석은 GraphPad 프리즘 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 모든 데이터는 평균±표준 편차(SD)로 평가되며, 3회 이상 수행된 2개 이상의 개별적인 생물학적 실험을 나타낸다. 그룹 간 통계적 유의성을 일원 분산 분석과 짝을 이루지 않은 Student's t 테스트를 사용하여 비교하였다. P<0.05는 통계적으로 유의 한 것으로 간주하였다.

실험예 2: ⁶⁴ Cu-PSMA 표적 화합물의 제조 및 인 비트로 흡수 분석

⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 표지화 효율을 평가하기 위해 화합물에 대해 순간 박막 크로마토그래피(iTLC, Agilent Technologies)를 측정하였다. 그 결과, 도 1의 패널 A에서 보여지는 바와 같이, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물은 유리 ⁶⁴Cu 피크와 비교하여 성공적으로 표지(95% 이상 표지)된 것을 확인할 수 있었다.

화합물의 안정성에 대하여, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 혈청 안정성을 PBS (pH 7.4), 인간 혈청 및 마우스 혈청에서 평가하였다. 그 결과, 도 1의 패널 B에 나타난 바와 같이, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 안정성은 60시간까지 90% 이상 유지되는 것을 확인할 수 있었다.

PSMA 발현에 따른 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 결합(binding)능을 확인하기 위해 인 비트로 흡수 분석을 수행하였다. 즉, 100 μM의 2-PMPA의 존재 또는 부존재하에서 PC-3 세포 및 22RV1 세포에 3.75 nM의 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 처리하였다. 그 결과, 도 1의 패널 C에 나타난 바와 같이, 22RV1 세포는 PC-3 세포 보다 7.5배 흡수가 증가하였다(p<0.001).

블로킹 연구를 수행한 결과, 2-PMPA 존재하의 22RV1 세포는 2-PMPA 부재하의 세포에 비해 10.6배 흡수가 감소하였다(p<0.01). 반면, PC-3 세포의 경우 PMPA의 존재 또는 부재 사이에 큰 차이가 없었다. 이와 같은 결과로부터, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물이 안정적으로 표지되었고 PSMA 발현에 비례하여 표적화되었음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: PC-3 및 22RV1 이종 이식 동물 모델을 이용한 인 비보 이미징 분석

PSMA 발현에 따른 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 사용한 표적화 이미징을 평가하기 위해, PC-3 및 22RV1 세포 모두를 이종 이식한 종양 동물 모델(n=2)을 제작하고, ¹⁸F-FDG PET/CT 이미징을 통해 양쪽 모두 종양이 존재하는지 확인하였다. 그 결과, 이종 이식 동물 모델의 양쪽 종양 모두에서 ¹⁸F-FDG 흡수를 확인하였다(도 2). 다음으로, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 사용하여 종양간의 표적화 이미지를 평가하였다. 스태틱 이미지(static image) 뿐만 아니라, MIP (maximum intensity projection) 이미지를 통해, ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 흡수가 PC-3 종양 보다도 22RV1 종양 부위에서 눈에 띄게 두드러지게 나타났다(도 3). 반면에, 800 μM의 2-PMPA를 함께 주입한 경우에는 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 흡수가 22RV1 종양 부위에서 현저히 감소하였다(도 4). 이러한 결과들은 PSMA 고 수준 발현을 갖는 종양은 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 사용한 PET/CT 방법에 의해 명확하게 시각화될 수 있음을 보여주었다.

실험예 4: 22RV1 이종 이식 모델을 이용한 인 비보 생체분포 분석

다양한 시점에서 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 인 비보 생체분포 패턴을 확인하기 위해 22RV1 세포만을 사용한 이종이식 종양모델을 제작하였다. PET/CT 이미지에서, PSMA 표적화된 종양 이미지 뿐만 아니라 간을 제외하고는 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 흡수의 감소되는 패턴을 관찰할 수 있었다.

상기 PET/CT 영상 분석 결과에 기초하여, 종양 보유 마우스에서 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 생체분포 패턴(%ID/g)을 평가하였다. 하기 표 1은 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 정맥 주사한 후에 22RV1 종양 보유 마우스의 생체분포(%ID/g) 분석 결과를 보여준다.

	2 h	24 h	48 h
혈액	2.8 ± 0.7	1.7 ± 0.1	1.8 ± 0.3
심장	2.9 ± 0.5	2.8 ± 0.4	3.3 ± 0.1
간	12.0 ± 1.3	10.4 ± 2.1	11.4 ± 1.9
폐	9.1 ± 4.0	5.1 ± 0.3	5.9 ± 0.7
비장	4.2 ± 1.3	3.3 ± 0.4	4.3 ± 0.5
신장	52.6 ± 20.8	15.6 ± 3.9	9.2 ± 2.5
위	2.8 ± 1.9	1.6 ± 0.2	1.5 ± 0.6
소장	4.1 ± 0.7	3.3 ± 0.6	2.8 ± 0.5
대장	4.6 ± 1.0	3.3 ± 0.3	2.3 ± 0.4
근율	1.0 ± 0.1	0.6 ± 0.1	0.6 ± 0.2
대퇴골	1.7 ± 0.5	1.4 ± 0.6	1.3 ± 0.5
뇌	0.3 ± 0.0	0.3 ± 0.1	0.4 ± 0.0
종양	3.5 ± 0.1	4.8 ± 0.5	5.6 ± 0.1

상기 표 1 및 도 5의 패널 B의 결과로부터, 정맥주사 후 2시간에 신장 흡수는 가장 높았지만(52.6±20.8), 24시간(15.6±3.9)과 48시간(9.2±2.5)에서 급격히 감소했으며, 간 흡수는 세가지 시점에서 모두 비슷했다(10~12). 한편, 종양에서의 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물의 흡수는 시간이 지남에 따라 증가하였고, 48시간(5.6±0.1)에서 정점에 도달했다. 또한, 간에 대한 종양의 비율은 24시간 및 48시간에서 유사하였다(도 5의 패널 C). 그러나, 신장에 대한 종양의 비율은 48시간(0.61%±0.05)에서 가장 높았다(p<0.05)(도 5의 패널 D). 상기 결과는 ⁶⁴Cu-PSMA 표적 화합물을 이용한 PET/CT 영상화의 가능성을 보여주었다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물:
[화학식 1]

R₁및 R₂는 각각 독립적으로 CH₂, NH 또는 O이고,
B₁및 B₂는 각각 독립적으로 아마이드 결합, 에테르 결합, 티오에테르 결합, 에스테르 결합 및 티오에스테르 결합으로 이루어진 군으로부터 선택되고,
m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고,
R₃은 수소, 수산화기, 카르복실기, 아릴기 및 아릴알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R₄는 수산화기, 카르복실기 및 할로겐기로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 치환 또는 비치환된 아릴기이고,
X₁, X₂및 X₃은 각각 독립적으로 O 또는 S이고,
q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고,
R₅는
또는
이다.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물.
[화학식 2]

m, n, o, p는 각각 독립적으로 2 내지 6의 정수이고,
q, r, s는 각각 독립적으로 1 내지 4의 정수이고,
R₆및 R₇은 각각 독립적으로 수소, 수산화기 및 할로겐기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
청구항 1에 있어서,
상기 화합물은 ⁶²Cu, ⁶⁴Cu 및 ⁶⁷Cu로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 방사성 금속 원소와 착물을 이루는 것인, 화합물.
청구항 3에 있어서,
상기 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는 화합물.
[화학식 3]
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 화합물, 이의 입체 이성질체 또는 이의 수화물을 포함하는 방사성 추적자용 조성물.
청구항 5에 있어서,
상기 방사성 추적자용 조성물은 양전자방출 단층촬영(PET) 또는 컴퓨터 단층촬영(CT)에 사용되는 것인 조성물.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 수화물을 포함하는 전립선암 진단용 조성물.
청구항 7에 있어서,
상기 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 수화물은 전립선특이 막 항원(Prostate-Specific Membrane Antigen, PSMA)에 선택적으로 결합하는 것인 조성물.
청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 하나의 화합물, 이의 입체 이성질체, 이의 수화물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 전립선암의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.