KR20220003993A - A kit and method for identifying the species of Eospalax - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식별 기술분야에 속하고, 구체적으로 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트 및 방법에 관한 것이다.The present invention belongs to the field of identification, and specifically relates to kits and methods for identifying species of the genus Zoco.
조코(zokor)는 조코아과(Myospalacinae) 동물의 총칭으로, 지하 생활에 적응하는 설치류 동물이다. Zokor is a generic name for animals in the family Myospalacinae, and is a rodent that adapts to underground life.
조코는 체형이 튼실하고, 원통형이며, 머리는 넓고 납작하며, 머리에 촉수가 있고, 코끝은 평평하고 뭉툭하며, 콧등이 드러나 있고, 꼬리 및 팔다리가 짧고, 눈이 매우 작고, 시력이 좋지 않고, 거의 털로 덮이고, 귀 윤곽이 퇴화되고, 털 아래에 숨겨져 있다. 조코는 평생 지하에서 생활하며, 가끔 밤에 지면에서 활동한다. 조코는 구멍을 매우 빨리 파는데, 앞다리로 흙을 파고, 머리로 흙을 밀며, 개체마다 독립된 동혈(
중국은 거의 모든 화석종 및 현존하는 종을 포함하는 조코의 주요 분포 지역이고, 현존하는 조코는 두개골 후두부의 형태에 따라 조코속(Myospalax) 및 중국조코속(Eospalax)으로 구분되고, 중국조코속은 중국에만 분포한다. 조코속 내에는 종이 비교적 적고, 현재 일반적으로 조코속은 가짜조코(M. aspalax), 시베리아조코(M. myospalax) 및 자바이칼조코(M. psilurus) 등 3종이 있는 것으로 여겨지고, 중국조코속은 중국조코(E. fontanieri), 간쑤조코(E. cansus), 친링조코(E. rufescens), 로트실트조코(E. rothschildi), 스미스조코(E. smithi) 및 고원조코(E. baileyi) 등 6종이 있다. China is the main distribution area of Joco, including almost all fossil and extant species, and the extant Joco is divided into Myospalax and Eospalax according to the shape of the occipital region of the skull. distributed only in There are relatively few species within the genus Joco, and it is currently generally considered that there are three species of the genus Joco: M. aspalax, M. myospalax, and M. psilurus. E. fontanieri), Gansujoko (E. cansus), Qinlingzoko (E. rufescens), E. rothschildi, E. smithzoko (E. smithi) and highland zoko (E. baileyi) are six species.
조코는 거의 평생을 밀폐된 지하 터널 시스템에서 생활하며, 독특한 지하 생활 방식은 먹이 찾기, 교미, 번식 등 많은 측면에서 특수성을 가지므로 과학자들의 광범위한 관심을 불러 일으켰다. 또한, 고원조코의 건조한 전체 골격은 국가 1급 동물 약재 사이룽 뼈(Sailong bone)의 유일한 효과적인 자원이고, 중국 한약 재에서 호랑이 뼈, 표범 뼈에 대한 이상적인 대체품이다. 그러나 제약공장에서 사이룽 뼈를 구매하는 과정에서 다른 동물뼈와 섞이는 현상이 발견되었다. 생물종을 식별하는 것은 생물의 다양성을 이해하고 보호하는 기초가 되며, 각 생물을 정확하게 식별할 수 있어야만 더 많은 분야의 연구 및 자원 활용을 진행할 수 있다. 그러나 서로 다른 조코는 비슷한 생활환경으로 인해 형태가 유사하므로, 특히 중국조코속 종의 형태학적 식별이 매우 어렵고, 유년 및 준성체(sub-adult) 두개골의 식별 특징이 명확하지 않으며, 전문적인 분류 훈련 없이 형태를 통해 종을 정확하게 식별하는 것은 매우 어렵다. Zocoes spend most of their lives in enclosed underground tunnel systems, and their unique underground lifestyle has aroused widespread interest among scientists because it is unique in many ways, including foraging, mating, and breeding. In addition, the dried whole skeleton of Kowonzoko is the only effective resource of the national first-class animal medicine Sailong bone, and is an ideal substitute for tiger bones and leopard bones in Chinese herbal medicines. However, in the process of purchasing Sailong bone from a pharmaceutical factory, it was discovered that it was mixed with other animal bones. Identification of biological species is the basis for understanding and protecting biological diversity, and only when each organism can be accurately identified can more fields of research and resource utilization proceed. However, since the different zokos have similar morphologies due to similar living environments, it is particularly difficult to identify the morphological identification of the Chinese zoco species, the identification characteristics of juvenile and sub-adult skulls are not clear, and professional classification training Without it, it is very difficult to accurately identify a species by morphology.
따라서, 중국조코속의 종을 빠르고, 정확하게 식별하는 방법과 시약을 연구하는 것은 매우 중요한 의미가 있다. Therefore, it is very important to study methods and reagents for the rapid and accurate identification of species of the genus Zozodiac.
본 발명의 목적은 중국조코속의 종을 간단하고 정확하게 식별할 수 있는 키트 및 방법을 제공하는 것으로, 형태를 통해 조코 종을 식별하는 어려운 문제를 해결한다.An object of the present invention is to provide a kit and method for simple and accurate identification of a species of the genus Zoocco, and solves the difficult problem of identifying a species of Zoocco through its shape.
본 발명은 검출 대상 종의 다음 14개 SNP부위를 동시에 검출하는 시약을 포함하는 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트를 제공하고, The present invention provides a kit for identifying a species of the genus Chinese progenitor, comprising a reagent for simultaneously detecting the following 14 SNP sites of a species to be detected,
상기 14개 SNP부위는, The 14 SNP sites are
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치; In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO:
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치;이다. In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16;
추가적으로, 상기 SNP부위의 염기는, Additionally, the base of the SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치는 A이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치는 T이거나, 또는,In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5 is A, and in the 16S rRNA gene, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6 is T, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이고, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치는 T이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이거나, 또는In the 12S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7 is T,
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치는 A이거나, 또는,In the 16S rRNA gene, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10 is A, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치는 G이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치는 C이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11 is G, and in the 16S rRNA gene, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12 is C, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치는 T이고, 2번 위치는 G이거나, 또는, In the 12S rRNA gene,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치는 C이고, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치는 C이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치는 G이고, 31번 위치는 C이다. In the 12S rRNA gene, the 4th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 14 is C, the 25th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15 is C, and in the 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 16 Position 22 of the shown conserved motif sequence is G and position 31 is C.
더 추가적으로, 상기 시약은 시퀀싱용 시약, KASP방법용 시약 또는 제한 단편 길이 다형성 방법용 시약이다. Still further, the reagent is a reagent for sequencing, a reagent for a KASP method, or a reagent for a restriction fragment length polymorphism method.
더 추가적으로, 상기 키트는 증폭12S rRNA유전자 및 16S rRNA유전자 보존 모티프 서열의 시약을 더 포함하고, 상기 보존 모티프 서열은 SEQ ID NO: 5~16으로 나타낸 서열이다. Further additionally, the kit further comprises reagents for the amplified 12S rRNA gene and 16S rRNA gene conservation motif sequence, wherein the conservation motif sequence is a sequence shown in SEQ ID NOs: 5-16.
바람직하게는, 상기 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함한다. Preferably, the reagent comprises a primer pair represented by SEQ ID NO: 1-2 and a primer pair represented by SEQ ID NO: 3-4.
본 발명은 12S rRNA유전자 및 16S rRNA유전자 보존 모티프 서열을 증폭하기 위한 시약의 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트에서의 용도를 더 제공하고, 상기 보존 모티프 서열은 SEQ ID NO: 5~16으로 나타낸 서열이다. The present invention further provides the use of a reagent for amplifying a 12S rRNA gene and a 16S rRNA gene conserved motif sequence in a kit for identifying a species of the genus Zoco, wherein the conserved motif sequence is shown in SEQ ID NOs: 5-16 is a sequence
추가적으로, 상기 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함한다. Additionally, the reagent comprises a primer pair represented by SEQ ID NO: 1-2 and a primer pair represented by SEQ ID NO: 3-4.
본 발명은 중국조코속의 종을 식별하기 위한 방법을 더 제공하고, 상기 방법은, The present invention further provides a method for identifying a species of the genus Chrysanthemum, the method comprising:
(1)검출 대상 조코 샘플의 게놈 총 DNA를 추출하는 단계; (1) extracting the total genomic DNA of the zoco sample to be detected;
(2)다음 14개의 종 특이적 SNP부위를 검출하고, 분석하는 단계;를 포함하고, (2) detecting and analyzing the following 14 species-specific SNP sites;
상기 14개의 종 특이적 SNP부위는, The 14 species-specific SNP sites are,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치; In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO:
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치;이고, In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16;
바람직하게는, 단계(1)에서 설명한 샘플은 조직 샘플 또는 혈액 샘플이다. Preferably, the sample described in step (1) is a tissue sample or a blood sample.
추가적으로, 상기 단계(2)에서 설명한 검출 단계는,Additionally, the detection step described in step (2) above is,
1)단계(1)에서 추출된 DNA를 주형으로 하여, 증폭 시약을 이용하여 PCR증폭을 진행하여 증폭산물을 얻는 단계; 1) using the DNA extracted in step (1) as a template, PCR amplification using an amplification reagent to obtain an amplification product;
2)단계1)에서 얻은 PCR증폭산물에 대해 아가로스 겔 전기 영동 검출을 진행하는 단계; 2) performing agarose gel electrophoresis detection for the PCR amplification product obtained in step 1);
3)단계2)의 검출 결과에서, 490bp에서 밝은 밴드를 갖는 12S rRNA 유전자 PCR증폭산물 및 1450bp에서 밝은 밴드를 갖는 16S rRNA 유전자 PCR증폭산물을 시퀀싱하여 12S rRNA 및 16S rRNA유전자 서열을 얻는 단계; 3) From the detection result of step 2), sequencing the 12S rRNA gene PCR amplification product having a bright band at 490bp and the 16S rRNA gene PCR amplification product having a bright band at 1450bp to obtain 12S rRNA and 16S rRNA gene sequences;
4)단계3)에서 얻은 12S rRNA유전자 서열 및 16S rRNA유전자 서열에서 다음 14개의 종 특이적 SNP부위를 분석하는 단계;를 포함하고,4) analyzing the following 14 species-specific SNP sites in the 12S rRNA gene sequence and the 16S rRNA gene sequence obtained in step 3);
상기 14개의 종 특이적 SNP부위는, The 14 species-specific SNP sites are,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치; In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO:
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치;이고, In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16;
바람직하게는, 단계1)에서 설명한 증폭 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함하고, 상기 PCR증폭의 소둔 온도는 52~56℃이고, 단계3)에서 설명한 시퀀싱은 양방향 생어(Sanger) 시퀀싱이다. Preferably, the amplification reagent described in step 1) includes a primer pair shown in SEQ ID NO: 1-2 and a primer pair shown in SEQ ID NO: 3-4, and the annealing temperature of the PCR amplification is 52 to 56 ° C. , and the sequencing described in step 3) is bidirectional Sanger sequencing.
더 추가적으로, 상기 종 특이적 SNP부위의 염기는,Further, the base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치는 A이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치는 T이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5 is A, and in the 16S rRNA gene, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6 is T, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이고, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치는 T이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7 is T,
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치는 A이거나, 또는,In the 16S rRNA gene, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10 is A, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치는 G이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치는 C이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11 is G, and in the 16S rRNA gene, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12 is C, or
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치는 T이고, 2번 위치는 G이거나, 또는, In the 12S rRNA gene,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치는 C이고, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치는 C이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치는 G이고, 31번 위치는 C인 경우, 검출 대상 조코는 중국조코속이고, In the 12S rRNA gene, the 4th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 14 is C, the 25th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15 is C, and in the 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 16 If position 22 of the conserved motif sequence shown is G and position 31 is C, then the protozoon to be detected is of the genus Chrysanthemum;
바람직하게는, 상기 종 특이적 SNP부위의 염기는, Preferably, the base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치는 A이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치는 T이면, 중국조코이거나, 또는 If the position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the 12S rRNA gene is A, and the position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the 16S rRNA gene is T, it is a Chinese zoco, or
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는,The base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이고, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치는 T이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이면, 스미스조코이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7 is T,
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는, The base of the species-specific SNP site is,
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치는 A이면, 로트실트조코이거나, 또는, If position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the 16S rRNA gene is A, then it is a rotsiltzoco, or,
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는,The base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치는 G이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치는 C이면, 친링조코이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11 is G, and in the 16S rRNA gene, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the 16S rRNA gene is C, or
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는, The base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치는 T이고, 2번 위치는 G이면, 고원조코이거나, 또는, In the 12S rRNA gene, if the 1st position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13 is T and the 2nd position is G, then it is a plateau, or,
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는, The base of the species-specific SNP site is,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치는 C이고, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치는 C이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치는 G이고, 31번 위치는 C이면, 간쑤조코이다.In the 12S rRNA gene, the 4th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 14 is C, the 25th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15 is C, and in the 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 16 If position 22 of the conserved motif sequence shown is G and position 31 is C, then it is Gansujoco.
본 발명의 유익한 효과는 다음과 같다: 본 발명의 프라이머 쌍은 특이성이 좋으며, 이를 이용하여 PCR을 진행하면, 표적 이외의 DNA단편과 비특이적 증폭을 일으키지 않고, 증폭된 타겟 유전자는 미토콘드리아 단일 카피 유전자로, 클로닝이 필요하지 않고, 직접 시퀀싱에 사용될 수 있으며 방법이 간단하다. 본 발명에 의해 제공되는 중국조코속의 종 보존 모티프 서열은, 중국조코속의 종 특이적 SNP부위의 12S rRNA 및/또는 16S rRNA유전자 단편(DNA바코드)에서의 위치를 결정하는데 도움이 될 수 있어, 상기 SNP부위 유전자형의 결정을 용이하게 한다. The beneficial effects of the present invention are as follows: The primer pair of the present invention has good specificity, and when PCR is performed using it, non-specific amplification with a DNA fragment other than the target does not occur, and the amplified target gene is a mitochondrial single copy gene. , no cloning is required, can be used for direct sequencing, and the method is simple. The species-conserved motif sequence of the genus Zozodiac provided by the present invention may be helpful in determining the position in the 12S rRNA and/or 16S rRNA gene fragment (DNA barcode) of the species-specific SNP site of the genus Zozodiac, Facilitates the determination of the SNP site genotype.
본 발명의 상기 내용에 의하여, 해당 분야의 통상적인 기술지식 및 통상적인 수단에 따라, 본 발명의 상기 기본 기술 사상을 벗어나지 않고 다양한 다른 형식의 수정, 대체 또는 변경을 진행할 수 있음이 자명하다. According to the above content of the present invention, it is evident that various other types of modifications, substitutions, or changes can be made without departing from the basic technical spirit of the present invention according to common technical knowledge and common means in the field.
이하, 실시예 형식의 구체적인 실시방안을 통해, 본 발명의 상기 내용을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나 본 발명의 상기 주제 범위는 이하 실시예로만 한정되는 것으로 이해되어서는 안된다. 본 발명의 상기 내용에 기초하여 실현되는 기술은 모두 본 발명의 범위에 속한다.Hereinafter, the above contents of the present invention will be described in more detail through specific implementation methods in the form of examples. However, it should not be understood that the scope of the subject matter of the present invention is limited only to the following examples. All techniques realized based on the above contents of the present invention fall within the scope of the present invention.
도 1은 중국조코속의 종의 식별에 사용되는 12S rRNA유전자의 SNP부위이다.
도 2는 중국조코속의 종의 식별에 사용되는 16S rRNA유전자의 SNP부위이다.
도 3은 실시예 3에서 코드 번호가 ZYX-4인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(중국조코 보존 모티프(conserved motif) 1, 서열 SEQ ID NO: 5).
도 4는 실시예 3에서 코드 번호가 ZYX-4인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(중국조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 6인 역 상보적 서열).
도 5는 실시예 3에서 코드 번호가 MX-16인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 7).
도 6은 실시예 3에서 코드 번호가 MX-16인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 8).
도 7은 실시예 3에서 코드 번호가 MX-16인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 3, 서열 SEQ ID NO: 9인 역 상보적 서열).
도 8은 실시예 3에서 코드 번호가 ZBX-4인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(로트실트조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 10).
도 9은 실시예 3에서 코드 번호가 TCX-7인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(친링조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 11).
도 10은 실시예 3에서 코드 번호가 TCX-7인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(친링조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 12).
도 11은 실시예 3에서 코드 번호가 CD-8인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(고원조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 13).
도 12는 실시예 3에서 코드 번호가 FFX-5인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 14).
도 13은 실시예 3에서 코드 번호가 FFX-5인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 15).
도 14는 실시예 3에서 코드 번호가 FFX-5인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 3, 서열 SEQ ID NO: 16인 역 상보적 서열).
도 15는 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(중국조코 보존 모티프1, 서열 SEQ ID NO: 5의 위치).
도 16은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(중국조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 6인 역 상보적 서열의 위치).
도 17은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 7의 위치).
도 18은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 8의 위치).
도 19은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(스미스조코 보존 모티프 3, 서열 SEQ ID NO: 9인 역 상보적 서열의 위치).
도 20은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(로트실트조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 10의 위치).
도 21은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(친링조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 11의 위치).
도 22는 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(친링조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 12의 위치).
도 23은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(고원조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 13의 위치).
도 24는 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 1, 서열 SEQ ID NO: 14의 위치).
도 25는 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 12S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 2, 서열 SEQ ID NO: 15의 위치).
도 26은 실시예 3에서 코드 번호가 WCX-3인 조코 16S rRNA유전자PCR산물 시퀀싱 피크 맵이다(간쑤조코 보존 모티프 3, 서열 SEQ ID NO: 16인 역 상보적 서열의 위치). 1 is a SNP region of a 12S rRNA gene used for identification of species of the genus Zoco.
Figure 2 is a SNP region of the 16S rRNA gene used for identification of the species of the genus Zoco in China.
Fig. 3 is a sequencing peak map of the
FIG. 4 is a
Fig. 5 is a
6 is a
Fig. 7 is a
Fig. 8 is a
Fig. 9 is a sequencing peak map of the
10 is a sequencing peak map of the
11 is a sequencing peak map of the
12 is a sequencing peak map of the
13 is a
Fig. 14 is a
Fig. 15 is a sequencing peak map of the
Fig. 16 is a sequencing peak map of the
Fig. 17 is a
Fig. 18 is a
19 is a
20 is a sequencing peak map of the
Fig. 21 is a sequencing peak map of the
22 is a sequencing peak map of the
23 is a
Fig. 24 is a sequencing peak map of the
Fig. 25 is a sequencing peak map of the
26 is a sequencing peak map of the
본 발명을 보다 명확하게 이해하기 위하여, 이하 실시예 및 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 실시예는 단지 설명을 위한 것일 뿐 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하지 않는다. In order to more clearly understand the present invention, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples and drawings. The examples are for illustrative purposes only and do not limit the present invention in any way.
실시예에서 특정 조건을 제시하지 않은 실험 방법은 해당 분야에서 잘 알려진 통상적인 방법 및 통상적인 조건 또는 제조사가 권장하는 조건에 따른 것으로, 실시예에 사용된 다양한 화학 시약은 모두 시판되고 있으며, 사용된 프라이머는 위탁합성하였다.Experimental methods that do not suggest specific conditions in the Examples are in accordance with conventional methods and conventional conditions well known in the field or conditions recommended by manufacturers, and various chemical reagents used in Examples are all commercially available and used Primers were contract synthesized.
실시예 1, 본 발명의 중국조코속을 식별하기 위한 키트Example 1, kit for identifying the genus Chrysanthemum of the present invention
본 발명의 키트의 성분은, The components of the kit of the present invention are:
(1)PCR증폭 시약: SEQ NO: 1~2 및 SEQ NO: 3~4을 포함하는 프라이머 쌍; (1) PCR amplification reagent: a pair of primers comprising SEQ NO: 1-2 and SEQ NO: 3-4;
(2)시퀀싱용 시약;을 포함한다. (2) reagents for sequencing;
실시예 2, PCR프라이머 설계와 SNP부위의 검증Example 2, PCR primer design and SNP site verification
발명자는 8개의 조코 종121개의 조코 개체의 미토콘드리아 게놈 서열을 정렬하였고, 12S rRNA유전자는 8개의 중국조코속의 종 특이적 SNP가 존재하고, 16S rRNA유전자는 6개의 중국조코속의 종 특이적 SNP가 존재하는 것을 발견하였다. The inventor aligned the mitochondrial genome sequences of 8 Joco species and 121 Joco individuals, the 12S rRNA gene has 8 species-specific SNPs of Joco genus, and the 16S rRNA gene has 6 species-specific SNPs of the genus C. Joco. found that
8개의 조코 종121개의 조코 개체는, 가짜조코12개, 자바이칼조코10개, 중국조코15개, 스미스조코18개, 로트실트조코16개, 고원조코14개, 간쑤조코24개, 친링조코12개가 있다. There are 8 zoco species, 121 zoko individuals: 12 fake zoco, 10 Java zoko, 15 Chinese zoco, 18 Smith zoko, 16 rotsilt zoco, 14 highland zoco, 24 Gansu zoco, 12 Qinling zoco. there is a dog
12S rRNA와 16S rRNA및 주변 유전자 서열에 대하여 보존 영역에서 다음과 같이 프라이머를 설계한다: Design primers in the conserved regions for 12S rRNA and 16S rRNA and surrounding gene sequences as follows:
ME12S-1L: AGCACTGAAAATGCTTAGATGG(SEQ ID NO: 1); ME12S-1L: AGCACTGAAAATGCTTAGATGG (SEQ ID NO: 1);
ME12S-1R: CGGCTAAGCATAGTGGGGTA(SEQ ID NO: 2). ME12S-1R: CGGCTAAGCATAGTGGGGTA (SEQ ID NO: 2).
ME16S-1L: AGAGGAGATAAGTCGTAACAAGGT(SEQ ID NO: 3)ME16S-1L: AGAGGAGATAAGTCGTAACAAGGT (SEQ ID NO: 3)
ME16S-1R: TCCTGATCCAACATCGAGGT(SEQ ID NO: 4)ME16S-1R: TCCTGATCCAACATCGAGGT (SEQ ID NO: 4)
상기 프라이머를 이용하여 서로 다른 조코 종의 DNA샘플을 증폭하여, 중국조코속의 종의 식별에 사용되는 12S rRNA유전자 및 16S rRNA 유전자의 14개 SNP부위를 확인하고, 부위 명칭 중 12S는 상기 부위가 12S rRNA유전자에 위치함을 의미하고, 16S는 상기 부위가 16S rRNA유전자에 위치함을 의미하고, 그 뒤의 숫자는 서열 정렬 후, 서열에서 상기 부위의 위치를 의미하고, 중간은 “-” 로 연결한다. 구체적으로 다음과 같다: By amplifying DNA samples of different Joco species using the primers, 14 SNP sites of the 12S rRNA gene and 16S rRNA gene used for identification of the Chinese Joco species were identified, and 12S among the site names indicates that the site is 12S means located in the rRNA gene, 16S means that the site is located in the 16S rRNA gene, the number after that means the position of the site in the sequence after sequence alignment, and the middle is connected with “-” do. Specifically:
1)중국조코 종 특이적 SNP부위: 12S-310, 유전자형은 A; 16S-1313, 유전자형은 T이고, 1) Chinese Joco species-specific SNP site: 12S-310, genotype A; 16S-1313, genotype T;
2)스미스조코 종 특이적 SNP부위: 12S-133, 유전자형은 T; 12S-455, 유전자형은 T; 16S-1328, 유전자형은 T이고, 2) Smithzoco species-specific SNP site: 12S-133, genotype is T; 12S-455, genotype T; 16S-1328, genotype T;
3)로트실트조코 종 특이적 SNP부위: 16S-392, 유전자형은 A이고, 3) Lotsiltzoco species-specific SNP site: 16S-392, genotype A,
4)친링조코 종 특이적 SNP부위: 12S-323, 유전자형은 G; 16S-393, 유전자형은 C이고, 4) Chinlingjoco species-specific SNP site: 12S-323, genotype G; 16S-393, genotype C;
5)고원조코 종 특이적 SNP부위: 12S-141, 유전자형은 T; 12S-142, 유전자형은 G이고, 5) Archaea protozoan species-specific SNP site: 12S-141, genotype T; 12S-142, genotype G,
6)간쑤조코 종 특이적 SNP부위: 12S-330, 유전자형은 C; 12S-433, 유전자형은 C; 16S-1317, 유전자형은 G; 16S-1326, 유전자형은 C이다. 6) Gansuzoco species-specific SNP site: 12S-330, genotype C; 12S-433, genotype C; 16S-1317, genotype G; 16S-1326, genotype C.
각각의 종 특이적 SNP부위 주변에는 종 보존 모티프 서열이 존재하고, 구체적으로 다음과 같다: Species conservation motif sequences exist around each species-specific SNP site, and are specifically as follows:
1)중국조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 5로 표시된 바와 같고, 서열 37번 위치는 SNP부위12S-310이고, 1) Chinese
2)중국조코 보존 모티프 2는 서열표에서 SEQ ID NO: 6으로 표시된 바와 같고, 서열 18번 위치는 SNP부위16S-1313이고, 2) Chinese
3)스미스조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 7로 표시된 바와 같고, 서열 33번 위치는 SNP부위12S-133이고, 3)
4)스미스조코 보존 모티프 2는 서열표에서 SEQ ID NO: 8로 표시된 바와 같고, 서열 7번 위치는 SNP부위12S-455이고, 4)
5)스미스조코 보존 모티프 3은 서열표에서 SEQ ID NO: 9로 표시된 바와 같고, 서열 33번 위치는 SNP부위16S-1328이고, 5)
6)로트실트조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 10으로 표시된 바와 같고, 서열 34번 위치는 SNP부위16S-392이고, 6)
7)친링조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 11로 표시된 바와 같고, 서열 47번 위치는 SNP부위12S-323이고, 7) Chin
8)친링조코 보존 모티프 2는 서열표에서 SEQ ID NO: 12로 표시된 바와 같고, 서열 위치 3는 SNP부위16S-393이고, 8) Chin
9)고원조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 13으로 표시된 바와 같고, 서열 1번 위치는 SNP부위12S-141, 2번 위치는 SNP부위12S-142이고, 9) Archaeological conserved
10)간쑤조코 보존 모티프 1은 서열표에서 SEQ ID NO: 14로 표시된 바와 같고, 서열 4번 위치는 SNP부위12S-330이고, 10)
11)간쑤조코 보존 모티프 2는 서열표에서 SEQ ID NO: 15로 표시된 바와 같고, 서열 25번 위치는 SNP부위12S-433이고, 11)
12)간쑤조코 보존 모티프 3은 서열표에서 SEQ ID NO: 16으로 표시된 바와 같고, 서열 22번 위치는 SNP부위16S-1317이고, 31번 위치는 SNP부위16S-1326이다. 12)
실시예 3, 중국조코속의 종의 식별Example 3 Identification of species of the genus Zoco
먼저 12S rRNA유전자 단편 프라이머 쌍(SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 2) 및 16S rRNA유전자 단편 프라이머 쌍(SEQ ID NO: 3 및 SEQ ID NO: 4)을 합성한다. First, a pair of 12S rRNA gene fragment primers (SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2) and a 16S rRNA gene fragment primer pair (SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4) are synthesized.
다음과 같은 방법으로 식별한다: Identify in the following way:
a)QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit를 이용하여, 번호가 ZYX-4, MX-16, ZBX-4, TCX-7, CD-8, FFX-5, WCX-3인 조코의 조직 샘플의 게놈 총 DNA를 각각 추출하는 단계; a) Genomic total DNA from a tissue sample of Zocco numbered ZYX-4, MX-16, ZBX-4, TCX-7, CD-8, FFX-5, WCX-3, using the QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit. extracting each;
b)단계 a)에서 설명한 게놈 총 DNA를 주형으로 하여, 상기 12S rRNA프라이머 쌍 및 16S rRNA프라이머 쌍을 이용하여 PCR반응을 각각 진행하고, ZYX-4의 소둔 온도는 52℃이고, MX-16의 소둔 온도는 56℃이고, ZBX-4의 소둔 온도는 52℃이고, TCX-7의 소둔 온도는 56℃이고, CD-8의 소둔 온도는 56℃이고, FFX-5의 소둔 온도는 56℃이고, WCX-3의 소둔 온도는 55℃인 단계; b) Using the genomic total DNA described in step a) as a template, each PCR reaction is carried out using the 12S rRNA primer pair and the 16S rRNA primer pair, and the annealing temperature of ZYX-4 is 52° C., and that of MX-16 The annealing temperature is 56°C, the annealing temperature of ZBX-4 is 52°C, the annealing temperature of TCX-7 is 56°C, the annealing temperature of CD-8 is 56°C, and the annealing temperature of FFX-5 is 56°C. , the annealing temperature of WCX-3 is 55 ℃;
c)단계 b)에서 얻은 PCR산물에 대해 1% 아가로스 겔 전기 영동 검출을 진행하여, 약 490bp 및 약 1450bp의 밝은 밴드가 관찰되는 단계; c) performing 1% agarose gel electrophoresis detection on the PCR product obtained in step b), in which bright bands of about 490bp and about 1450bp are observed;
d)단계 c)의 PCR산물에 대해 양방향 생어 시퀀싱(bi-directional Sanger sequencing)을 각각 진행하여, 12S rRNA유전자 및 16S rRNA유전자 시퀀싱 피크 맵을 얻는 단계; d) performing bi-directional Sanger sequencing on the PCR product of step c) to obtain a 12S rRNA gene and 16S rRNA gene sequencing peak map;
e)에서 얻은 시퀀싱 피크 맵에서 SEQ ID NO: 5~16의 보존 모티프 서열을 찾아, SNP부위 염기를 분석하는 단계. e) finding the conserved motif sequence of SEQ ID NO: 5 to 16 in the sequencing peak map obtained in e), and analyzing the base of the SNP site.
결과는 다음과 같다: Here is the result:
(1)ZYX-4조코: SEQ ID NO: 5의 서열 중 37번 위치 염기는 A(도 3)이고, SEQ ID NO: 6에 나타낸 서열 중 18번 위치 염기는 T(도 4)이다. (1) ZYX-4 Zoco: In the sequence of SEQ ID NO: 5, the nucleotide at position 37 is A (FIG. 3), and in the sequence shown in SEQ ID NO: 6, the nucleotide at position 18 is T (FIG. 4).
즉 번호가 ZYX-4인 샘플은 중국조코속의 중국조코인 것으로 판단한다. That is, the sample with the number ZYX-4 is judged to be a Chinese Zoco in the genus Chinese Zoco.
(2)MX-16조코: SEQ ID NO: 7의 서열 중 33번 위치 염기는 T(도 5)이고, SEQ ID NO: 8에 나타낸 서열 중 7번 위치 염기는 T(도 6)이고, SEQ ID NO: 9에 나타낸 서열 중 33번 위치 염기는 T(도 7)이다. (2) MX-16 zoco: in the sequence of SEQ ID NO: 7, the base at position 33 is T (FIG. 5), in the sequence shown in SEQ ID NO: 8, the base at
즉 번호가 MX-16인 샘플은 중국조코속의 스미스조코인 것으로 판단한다. That is, the sample numbered MX-16 is judged to be a Smithzocoin of the Chinese Zoco genus.
(3)ZBX-4조코: SEQ ID NO: 10의 서열 중 34번 위치 염기는 A(도 8). (3) ZBX-4 zoco: in the sequence of SEQ ID NO: 10, the base at position 34 is A ( FIG. 8 ).
즉 번호가 ZBX-4인 샘플은 중국조코속의 로트실트조코인 것으로 판단한다. That is, the sample with the number ZBX-4 is judged to be a Lotsilt Zocoin of the Zoko genus of China.
(4)TCX-7조코: SEQ ID NO: 11의 서열 중 47번 위치 염기는 G(도 9)이고, SEQ ID NO: 12에 나타낸 서열 중 35번 위치 염기는 C(도 10)이다. (4) TCX-7 zoco: In the sequence of SEQ ID NO: 11, the nucleotide at position 47 is G (Fig. 9), and in the sequence shown in SEQ ID NO: 12, the nucleotide at position 35 is C (Fig. 10).
즉 번호가 TCX-7인 샘플은 중국조코속의 친링조코인 것으로 판단한다. That is, the sample numbered TCX-7 is judged to be a Qinling Zocoin of the Chinese Zoco genus.
(5)CD-8조코: SEQ ID NO: 13의 서열 중 1번 위치 염기는 T이고, 2번 위치 염기는 G(도 11)이다. (5) CD-8 zoco: In the sequence of SEQ ID NO: 13, the nucleotide at
즉 번호가 CD-8인 샘플은 중국조코속의 고원조코인 것으로 판단한다. In other words, the sample numbered CD-8 is judged to be a High Zoco in the genus Chinese Zoco.
(6)FFX-5조코: SEQ ID NO: 14의 서열 중 4번 위치 염기는 C(도 12); SEQ ID NO: 15에 나타낸 서열 중 25번 위치 염기는 C(도 13); SEQ ID NO: 16에 나타낸 서열 중 22번 위치 염기는 G, 31번 위치 염기는 C(도 14). (6) FFX-5 zoco: in the sequence of SEQ ID NO: 14, the base at
즉 번호가 FFX-5인 샘플은 중국조코속의 간쑤조코인 것으로 판단한다. In other words, the sample numbered FFX-5 is judged to be a Gansuzo coin of the Chinese Zoko genus.
(7)WCX-3조코: SEQ ID NO: 5의 서열 중 37번 위치 염기는 A가 아니고(도 15), SEQ ID NO: 6에 나타낸 서열 중 18번 위치 염기는 T가 아니고(도 16), SEQ ID NO: 7의 서열 중 33번 위치 염기는 T가 아니고(도 17), SEQ ID NO: 8에 나타낸 서열 중 7번 위치 염기는 T가 아니고(도 18), SEQ ID NO: 9에 나타낸 서열 중 33번 위치 염기는 T가 아니고(도 19), SEQ ID NO: 10의 서열 중 34번 위치 염기는 A가 아니고(도 20), SEQ ID NO: 11의 서열 중 47번 위치 염기는 G가 아니고(도 21), SEQ ID NO: 12에 나타낸 서열 중 35번 위치 염기는 C가 아니고(도 22), SEQ ID NO: 13의 서열 중 1번 위치 염기는 T가 아니고, 2번 위치 염기는 G가 아니고(도 23), SEQ ID NO: 14의 서열 중 4번 위치 염기는 C가 아니고(도 24), SEQ ID NO: 15에 나타낸 서열 중 25번 위치 염기는 C가 아니고(도 25), SEQ ID NO: 16에 나타낸 서열 중 22번 위치 염기는 G가 아니고, 31번 위치 염기는 C가 아니다(도 26). (7) WCX-3 zoco: in the sequence of SEQ ID NO: 5, the nucleotide at position 37 is not A (Fig. 15), and in the sequence shown in SEQ ID NO: 6, the nucleotide at position 18 is not T (Fig. 16) , the base at position 33 in the sequence of SEQ ID NO: 7 is not T (FIG. 17), the base at position 7 in the sequence shown in SEQ ID NO: 8 is not T (FIG. 18), and in SEQ ID NO: 9 In the sequence shown, the base at position 33 is not T (FIG. 19), the base at position 34 in the sequence of SEQ ID NO: 10 is not A (FIG. 20), and the base at position 47 in the sequence of SEQ ID NO: 11 is Not G (FIG. 21), the base at position 35 in the sequence shown in SEQ ID NO: 12 is not C (FIG. 22), the base at position 1 in the sequence of SEQ ID NO: 13 is not T, and the base at position 2 The base is not G (Fig. 23), the base at position 4 in the sequence of SEQ ID NO: 14 is not C (Fig. 24), and the base at position 25 in the sequence shown in SEQ ID NO: 15 is not C (Fig. 25), in the sequence shown in SEQ ID NO: 16, the nucleotide at position 22 is not G, and the nucleotide at position 31 is not C ( FIG. 26 ).
즉 번호가 WCX-3인 샘플은 중국조코속의 종에 속하지 않는 것으로 판단한다. That is, it is determined that the sample numbered WCX-3 does not belong to the species of the genus Chinese progenitor.
또한, 번호가 ZYX-4, MX-16, ZBX-4, TCX-7, CD-8, FFX-5, WCX-3인 조코에 대해 종래의 형태학적 식별 방법으로 식별하였다. In addition, zoco numbers ZYX-4, MX-16, ZBX-4, TCX-7, CD-8, FFX-5, WCX-3 were identified by conventional morphological identification methods.
ZYX-4개체는 체형이 크고, 이마에 흰 반점이 있고, 콧등은 타원이고, 꼬리가 비교적 길고 드러나 있고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 콧등은 타원형이고, 광대뼈 아치의 확장 정도가 낮고, 광대뼈 아치의 가장 넓은 부분은 뒤쪽에 위치하고, 상단 융기(top ridge)는 평행하고, 안와상 융기(supraorbital ridge), 중후두 융기(mid-occipital ridge)가 발달되지 않았고, 앞니구멍(incisive forame)은 상악전구골과 상악골에 의해 둘러싸여 있고, 상악 제3 대구치(M3)는 후엽이 있고, 이러한 특징은 중국조코와 일치하고, 중국조코임을 보여준다. The ZYX-4 individual has a large body shape, a white spot on the forehead, an oval nose bridge, a relatively long and exposed tail, a raised skull and occipital region, an oval nose bridge, a low degree of extension of the cheekbone arch, and a cheekbone arch The widest part is located posteriorly, the top ridge is parallel, the supraorbital ridge and mid-occipital ridge are undeveloped, and the incisive forame is the maxillary bulb. Surrounded by bone and maxilla, the maxillary third molar (M 3 ) has a posterior lobe, and this feature is consistent with the Chinese zoco, showing that it is a Chinese zoco.
MX-16개체는 콧등은 승포판 모양이고, 꼬리에 털이 빽빽하고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 광대뼈 아치가 매우 확장되어 있고, 앞부분은 뒷부분보다 현저히 넓으며, 이마 상단 융기는 입천장솔기(palatine raphe) 부분에서 상당히 가깝고, 앞니구멍은 상악전구골에 의해 둘러싸이고, 이러한 특징은 스미스조코와 일치하고, 스미스조코임을 보여준다. In the case of MX-16, the bridge of the nose is in the shape of a vesicle plate, the tail is dense with hairs, the occipital part of the skull is raised, the cheekbone arch is very extended, the front part is significantly wider than the back part, and the bump on the top of the forehead is called the palatine raphe. ), the foramen of the front teeth is surrounded by the maxillary anterior bone, and these features are consistent with the smithzocco and show that it is a smithzoco.
ZBX-4개체는 체형이 작고, 앞발이 현저하게 약하고, 콧등은 승모(승려 모자) 모양이고, 꼬리에 털이 빽빽하고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 광대뼈 아치가 확장되고, 상단 융기는 평행하고, 입천장솔기 부분에서 가깝지 않고, 이마부위에서 내측으로 접혀 가깝고, 전면은 발달된 안와상 융기와 연결되고, 앞니구멍은 상악전구골과 상악골에 의해 둘러싸여 있어, ZBX-4는 로트실트조코로 확인된다. The ZBX-4 individual has a small body shape, remarkably weak forelimbs, a mitral (monk's hat) shape on the bridge of the nose, dense hairs on the tail, a raised skull and occipital area, an extended cheekbone arch, and a parallel upper elevation. It is not close to the palatal seam, it is folded inward from the forehead, and the front surface is connected to the developed orbital ridge, and the incisor hole is surrounded by the maxillary anterior and maxilla.
TCX-7개체는 콧등이 승모 모양이고, 꼬리에 털이 빽빽하고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 광대뼈 아치가 확장되고, 이마, 상단 융기는 현저하게 서로 가깝고, 상단 융기 사이의 거리는 이마 융기보다 크며, 앞니구멍은 상악전구골과 상악골에 의해 둘러싸여 있고, 이러한 특징은 친링조코와 일치하고, 친링조코임을 보여준다. TCX-7 individual has a mitral shape on the bridge of the nose, dense hairs on the tail, and the occipital region of the skull is raised, the zygomatic arch is extended, the forehead and upper elevations are remarkably close to each other, and the distance between the top elevations is greater than that of the forehead. The foramen of the incisors is surrounded by the maxillary anterior and maxilla, and these features are consistent with the chin lingo, showing that it is a chin lingo.
CD-8조코는 콧등은 승모 모양이고, 꼬리에 털이 빽빽하고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 광대뼈 아치가 비교적 확장되고, 상단 융기는 입천장솔기에서 만나지 않고, 앞니구멍은 상악전구골에 의해 둘러싸이고, 이러한 특징은 고원조코와 일치하고, 고원조코로 확인된다. In the CD-8 jaw nose, the bridge of the nose is mitral-shaped, the tail is densely haired, the cranial occipital region is raised, the cheekbone arch is relatively expanded, the upper elevation does not meet at the palatal seam, and the incisor hole is surrounded by the premaxillary fossa. , these features are consistent with the highland zodiac, and are identified as highlandozoic.
FFX-5개체 콧등은 타원형이고, 꼬리가 길고 드러나 있거나 가느다란 흰색 털이 있고, 두개골 뇌 후두부가 융기되고, 광대뼈 아치가 확장되고, 상단 융기는 평행하고, 이마부위에서 내측으로 접혀 가깝고, 발달된 안와상 융기와 연결되고, 중후두 융기가 발달되고, 앞니구멍은 상악전구골과 상악골에 의해 둘러싸여 있고, 상악 제3 대구치(M3)는 후엽이 없고, 이러한 특징은 모두 간쑤조코의 형태학적 식별 특징과 일치하고, 간쑤조코임을 보여준다. FFX-5 subject's nose bridge is elliptical, with long tail exposed or thin white hairs, cranial occipital ridge is raised, cheekbone arch is extended, upper ridge is parallel, and close inward from the forehead, close to the developed orbit It is connected to the upper ridge, the mid-occipital ridge is developed, the foramen is surrounded by the maxillary anterior and maxilla, and the maxillary third molar (M 3 ) does not have a posterior lobe. , and shows that it is Gansujoko.
WCX-3는 두개골 뇌 후두부가 융기되지 않고, 상단-후두릉(crista occipitalis)은 수평으로 잘린 모양으로, WCX-3은 중국조코속의 종이 아니라 조코속종인 것으로 확인되었고, 조코속의 앞니구멍은 상악전구골과 상악골에 의해 둘러싸여 있고, M1내측에는 하나의 내측 오목각이 있고, M3은 짧고, 코뼈의 후연(後緣)은 결각이 없고, 이러한 특징은 모두 가짜조코의 형태학적 식별 특징과 일치하고, WCX-3는 조코속의 가짜조코임을 보여준다. In WCX-3, the cranial brain occipital region is not raised, and the crista occipitalis is cut horizontally. Surrounded by bone and maxilla, there is one medial concave angle on the medial side of M 1 , M 3 is short, and the trailing edge of the nasal bone has no indentation. and WCX-3 shows that it is a fake Joco of the genus Joco.
실험 결과, 본 발명의 중국조코속의 종을 식별하기 위한 방법은 정확하고, 실제로 중국조코속의 종의 식별 및 검출에 사용될 수 있음을 보여준다. The experimental results show that the method for identifying the species of Protozoa of the present invention is accurate and can be used for identification and detection of species of the genus Protozoa.
결론적으로, 본 발명은 형태를 통해 조코 종을 식별하는 어려운 문제를 해결한, 중국조코속의 종을 간단하고 정확하게 식별하기 위한 키트 및 중국조코속을 식별하기 위한 방법을 제공하고, 조코의 종의 식별에 있어 우수한 응용 전망이 있다. In conclusion, the present invention provides a kit for simply and accurately identifying a species of the genus Joco and a method for identifying the genus Zoco, which solves the difficult problem of identifying a Joco species through morphology, and the identification of a species of Joco It has excellent application prospects.
SEQUENCE LISTING <110> 노스웨스트 인스티튜트 오브 플래토 바이오러지 차이니즈 아카데미 오브 사이언스 <120> 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트 및 방법 <130> GY417-2021P0113700CC <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> ME12S-1L <400> 1 agcactgaaa atgcttagat gg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> ME12S-1R <400> 2 cggctaagca tagtggggta 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> ME16S-1L <400> 3 agaggagata agtcgtaaca aggt 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> ME16S-1R <400> 4 tcctgatcca acatcgaggt 20 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> 중국조코motif1 <400> 5 ggtaaatttc gtgccagcca ccgcggtcat acgattaacc caaa 44 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> 중국조코motif2 <400> 6 cctccgaata acaaaactaa gacctacaag tcaaagt 37 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> 스미스조코motif1 <400> 7 cccgcaccag tgaaaaaatc cctaaaaatc ttt 33 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> 스미스조코motif2 <400> 8 gtacgatagc taagatccaa actgggatta gatacc 36 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> 스미스조코motif3 <400> 9 cctccgaata acaaaaccaa gacttacaag tctaagt 37 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> 로트실트조코motif1 <400> 10 cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa tttat 35 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> 친링조코motif1 <400> 11 aaatttcgtg ccagccaccg cggtcatacg attgacccaa actaatgat 49 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> 친링조코motif2 <400> 12 cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa ttttctgaat 40 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> 고원조코motif1 <400> 13 tgaaggagag ggtatcaagc acactta 27 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> 간쑤조코motif1 <400> 14 acaccggcgt aaagcgtaca a 21 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> 간쑤조코motif2 <400> 15 actaaaatca ataacgaaag taatccta 28 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> 간쑤조코motif3 <400> 16 cctccgaata acaaaaccaa ggcttacaag ccaaagt 37 SEQUENCE LISTING <110> Northwest Institute of Plateau Biological Chinese Academy of Sciences <120> Kits and methods for identifying species of the genus Chrysanthemum <130> GY417-2021P0113700CC <160> 16 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> ME12S-1L <400> 1 agcactgaaa atgcttagat gg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> ME12S-1R <400> 2 cggctaagca tagtggggta 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> ME16S-1L <400> 3 agaggagata agtcgtaaca aggt 24 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> ME16S-1R <400> 4 tcctgatcca acatcgaggt 20 <210> 5 <211> 44 <212> DNA <213> Chinese Joko motif1 <400> 5 ggtaaatttc gtgccagcca ccgcggtcat acgattaacc caaa 44 <210> 6 <211> 37 <212> DNA <213> Chinese Joko motif2 <400> 6 cctccgaata acaaaactaa gacctacaag tcaaagt 37 <210> 7 <211> 33 <212> DNA <213> smith joko motif1 <400> 7 cccgcaccag tgaaaaaatc cctaaaaatc ttt 33 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Smith Joko motif2 <400> 8 gtacgatagc taagatccaa actgggatta gatacc 36 <210> 9 <211> 37 <212> DNA <213> Smith Joko motif3 <400> 9 cctccgaata acaaaaccaa gacttacaag tctaagt 37 <210> 10 <211> 35 <212> DNA <213> rotssilt zoko motif1 <400> 10 cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa tttat 35 <210> 11 <211> 49 <212> DNA <213> Qinling Joko motif1 <400> 11 aaatttcgtg ccagccaccg cggtcatacg attgacccaa actaatgat 49 <210> 12 <211> 40 <212> DNA <213> Chinling Joko motif2 <400> 12 cccgaaacca aacgagctac ctaagaacaa ttttctgaat 40 <210> 13 <211> 27 <212> DNA <213> Gowon Joko motif1 <400> 13 tgaaggagag ggtatcaagc acactta 27 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Gansujoko motif1 <400> 14 acaccggcgt aaagcgtaca a 21 <210> 15 <211> 28 <212> DNA <213> Gansu Joko motif2 <400> 15 actaaaatca ataacgaaag taatccta 28 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Gansu Joko motif3 <400> 16 cctccgaata acaaaaccaa ggcttacaag ccaaagt 37
Claims (10)
상기 14개 SNP 부위는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치;
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치인,
중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트.In a kit for identifying a species of the genus Chrysanthemum comprising a reagent for simultaneously detecting the following 14 SNP sites of a species to be detected,
The 14 SNP sites are,
In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO: position 7 of the conserved motif sequence shown in 8, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11, position 1, position 2 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID position 4 of the conserved motif sequence shown in NO: 14, position 25 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15;
In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16,
A kit for identification of species of the genus Zocho.
상기 SNP부위의 염기는
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치는 A이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치는 T이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이고, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치는 T이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이거나, 또는,
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치는 A이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치는 G이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치는 C이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치는 T이고, 2번 위치는 G이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치는 C이고, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치는 C이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치는 G이고, 31번 위치는 C인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트.According to claim 1,
The base of the SNP site is
In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5 is A, and in the 16S rRNA gene, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6 is T, or
In the 12S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7 is T, position 7 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 8 is T, and in the 16S rRNA gene as SEQ ID NO: 9 position 33 of the indicated conserved motif sequence is T, or,
In the 16S rRNA gene, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10 is A, or
In the 12S rRNA gene, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11 is G, and in the 16S rRNA gene, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12 is C, or
In the 12S rRNA gene, the 1st position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13 is T and the 2nd position is G, or
In the 12S rRNA gene, the 4th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 14 is C, the 25th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15 is C, and in the 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 16 A kit for identifying a species of the genus Pseudomonas, wherein position 22 is G and position 31 is C of the shown conserved motif sequence.
상기 시약은 시퀀싱용 시약, KASP방법용 시약 또는 제한 단편 길이 다형성 방법용 시약인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트.3. The method of claim 1 or 2,
The reagent is a reagent for sequencing, a reagent for the KASP method, or a reagent for a restriction fragment length polymorphism method.
12S rRNA유전자 및 16S rRNA유전자 보존 모티프 서열을 증폭하기 위한 시약을 더 포함하고, 상기 보존 모티프 서열은 SEQ ID NO: 5~16으로 나타낸 서열인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트.3. The method of claim 1 or 2,
12S rRNA gene and 16S rRNA gene Conservation motif sequence further comprising a reagent for amplifying, wherein the conserved motif sequence is a sequence shown in SEQ ID NOs: 5-16, kit for identifying a species of the genus Zozoco.
상기 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함하는, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트.5. The method of claim 4,
wherein the reagent comprises a pair of primers represented by SEQ ID NO: 1-2 and a pair of primers represented by SEQ ID NO: 3-4.
상기 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함하는, 12S rRNA유전자 및 16S rRNA유전자 보존 모티프 서열을 증폭하기 위한 시약의 중국조코속의 종을 식별하기 위한 키트에서의 용도.7. The method of claim 6,
The reagent comprises a primer pair shown in SEQ ID NO: 1-2 and a primer pair shown in SEQ ID NO: 3-4, a reagent for amplifying a 12S rRNA gene and a 16S rRNA gene conservation motif sequence. Use in kits to identify
(1)검출 대상 조코 샘플의 게놈 총 DNA를 추출하는 단계;
(2)다음 14개의 종 특이적 SNP부위를 검출하고, 분석하는 단계;를 포함하고, 상기 14개의 종 특이적 SNP 부위는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치;
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치;이고,
바람직하게는, 단계(1)에서 설명한 샘플은 조직 샘플 또는 혈액 샘플인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 방법.In a method for identifying a species of the genus Zoco,
(1) extracting the total genomic DNA of the zoco sample to be detected;
(2) detecting and analyzing the following 14 species-specific SNP sites; including, wherein the 14 species-specific SNP sites are:
In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO: position 7 of the conserved motif sequence shown in 8, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11, position 1, position 2 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID position 4 of the conserved motif sequence shown in NO: 14, position 25 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15;
In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16;
Preferably, the sample described in step (1) is a tissue sample or a blood sample.
단계(2)에서 설명한 검출 단계는,
1)단계(1)에서 추출된 DNA를 주형으로 하여, 증폭 시약을 이용하여 PCR증폭을 진행하여 증폭산물을 얻는 단계;
2)단계1)에서 얻은 PCR증폭산물에 대해 아가로스 겔 전기 영동 검출을 진행하는 단계;
3)단계2)의 검출 결과에서, 490bp에서 밝은 밴드를 갖는 12S rRNA 유전자 PCR증폭산물 및 1450bp에서 밝은 밴드를 갖는 16S rRNA 유전자 PCR증폭산물을 시퀀싱하여 12S rRNA 및 16S rRNA유전자 서열을 얻는 단계;
4)단계3)에서 얻은 12S rRNA유전자 서열 및 16S rRNA유전자 서열에서 다음 14개의 종 특이적 SNP부위를 분석하는 단계;를 포함하고,
상기 14개 종 특이적 SNP 부위는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치, SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치, SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치, SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치, SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치, 2번 위치, SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치;
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치, SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치, SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치, SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치, 31번 위치;를 포함하고,
바람직하게는, 단계1)에서 설명한 증폭 시약은 SEQ ID NO: 1~2로 나타낸 프라이머 쌍 및 SEQ ID NO: 3~4로 나타낸 프라이머 쌍을 포함하고, 상기 PCR증폭의 소둔 온도는 52~56℃이고, 단계3)에서 설명한 시퀀싱은 양방향 생어 시퀀싱인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 방법.9. The method of claim 8,
The detection step described in step (2) is,
1) using the DNA extracted in step (1) as a template, PCR amplification using an amplification reagent to obtain an amplification product;
2) performing agarose gel electrophoresis detection for the PCR amplification product obtained in step 1);
3) From the detection result of step 2), sequencing the 12S rRNA gene PCR amplification product having a bright band at 490bp and the 16S rRNA gene PCR amplification product having a bright band at 1450bp to obtain 12S rRNA and 16S rRNA gene sequences;
4) analyzing the following 14 species-specific SNP sites from the 12S rRNA gene sequence and the 16S rRNA gene sequence obtained in step 3);
The 14 species-specific SNP sites are,
In the 12S rRNA gene, position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5, position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ID NO: position 7 of the conserved motif sequence shown in 8, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11, position 1, position 2 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13, SEQ ID position 4 of the conserved motif sequence shown in NO: 14, position 25 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15;
In the 16S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 9, position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: ID NO: position 22, position 31 of the conserved motif sequence indicated by 16;
Preferably, the amplification reagent described in step 1) includes a primer pair shown in SEQ ID NO: 1-2 and a primer pair shown in SEQ ID NO: 3-4, and the annealing temperature of the PCR amplification is 52 to 56 ° C. , and the sequencing described in step 3) is bi-directional Sanger sequencing, a method for identifying species of the genus Zozo.
상기 종 특이적 SNP부위의 염기는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 5로 나타낸 보존 모티프 서열의 37번 위치는 A이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 6으로 나타낸 보존 모티프 서열의 18번 위치는 T이면, 중국조코이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 7로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이고, SEQ ID NO: 8로 나타낸 보존 모티프 서열의 7번 위치는 T이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 9로 나타낸 보존 모티프 서열의 33번 위치는 T이면, 스미스조코이거나, 또는,
16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 10으로 나타낸 보존 모티프 서열의 34번 위치는 A이면, 로트실트조코이거나, 또는,
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 11로 나타낸 보존 모티프 서열의 47번 위치는 G이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 12로 나타낸 보존 모티프 서열의 35번 위치는 C이면, 친링조코이거나, 또는;
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 13으로 나타낸 보존 모티프 서열의 1번 위치는 T이고, 2번 위치는 G이면, 고원조코이거나, 또는;
12S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 14로 나타낸 보존 모티프 서열의 4번 위치는 C이고, SEQ ID NO: 15로 나타낸 보존 모티프 서열의 25번 위치는 C이고, 16S rRNA유전자 중에서 SEQ ID NO: 16으로 나타낸 보존 모티프 서열의 22번 위치는 G이고, 31번 위치는 C이면, 간쑤조코인, 중국조코속의 종을 식별하기 위한 방법. 10. The method according to claim 8 or 9,
The base of the species-specific SNP site is,
If the position 37 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 5 in the 12S rRNA gene is A, and the position 18 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 6 in the 16S rRNA gene is T, it is Chinese Zoco, or,
In the 12S rRNA gene, position 33 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 7 is T, and position 7 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 8 is T, in the 16S rRNA gene as SEQ ID NO: 9 If position 33 of the indicated conserved motif sequence is T, then Smithzoco, or,
If position 34 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 10 in the 16S rRNA gene is A, then it is Rotsiltzocco, or,
In the 12S rRNA gene, position 47 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 11 is G, and in the 16S rRNA gene, position 35 of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 12 in the 16S rRNA gene is C;
In the 12S rRNA gene, if the 1st position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 13 is T and the 2nd is G, then it is a plateau;
In the 12S rRNA gene, the 4th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 14 is C, the 25th position of the conserved motif sequence shown in SEQ ID NO: 15 is C, and in the 16S rRNA gene, SEQ ID NO: 16 If position 22 is G and position 31 is C of the shown conserved motif sequence, then Gansuzocoin, a method for identifying a species of the genus Zozo.
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