KR20220001859A - 선택적 결합능력 및 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 표면의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 선택적 결합이 가능하며 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 표면의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하고, 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체 및 클릭 반응 등이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액을 사용하여 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자 필름으로 표면을 개질하고, 개질된 표면에 탐침 분자를 도입하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 제조 방법으로 제조된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면은, 높은 특이적 결합능력과 상대적으로 적은 비특이적 단백질 흡착을 나타낸다. 한편, 본 공중합체 시스템의 다목적성과 실용성에 기초하여, 본 발명의 제조 방법은 분석물질 검출, 바이오센싱, 세포요법 및 약물전달에 사용될 수 있다.

Description

선택적 결합능력 및 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 표면의 제조방법 {Method for preparing surface with selective binding capability and preventing non-specific absorption}
본 발명은 선택적 결합이 가능하며 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 표면의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하고, 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체 및 클릭 반응 등이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액을 사용하여 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자 필름으로 표면을 개질하고, 개질된 표면에 탐침 분자를 도입하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조방법에 관한 것이다.
고분자 박막은 세포-세포 상호 작용과 같은 생물학적 현상을 규명하는데 있어 점점 더 중요한 역할을 수행하고 있으며, 코팅, 리소그래피, 접착제, 분석적 탐지, 약물 전달, 센서, 에너지 변환 및 저장 장치와 같은 다양한 기술분야에 있어서도 중요한 구성이 된다. 예를 들어, 고분자 박막을 이용한 세포표면공학 기술로 셀-인-쉘(cell-in-shell) 구조를 형성하는 것은 생촉매, 세포기반 치료 및 조직공학 분야에서 최근 유망한 전략으로 떠오르고 있다. 이러한 세포 캡슐화는 이식용 세포의 취급을 용이하게 하고, 세포의 생존력 및 대사활성을 향상시킨다. 고분자 필름이 생물학적 용도로 사용되기 위해서는 몇 가지 요건이 충족되어야 한다. 특히, 상기 필름은 생체 적합성과 낮은 독성을 나타내야 한다. 또한, 방오성 특성에 더해, 단백질, 세포 및 박테리아와 같은 바람직하지 않은 생물학적 개체의 비특이적 흡착을 최소화하기 위해, 특정 표적에 대한 결합 능력을 가져야 한다.
폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 및 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)를 비롯한 몇몇 친수성 중합체, 양쪽성 중합체, 다당류, 폴리 비닐피롤리돈 및 폴리(2-알킬-2-옥사졸린) 등은 높은 생체 적합성 및 낮은 독성과 더불어 우수한 방오성 특성을 나타낸다. 따라서, 이들 중합체는 의공학적 용도에 일반적으로 사용된다. 특히 PEG 박막은 가장 널리 사용되고 있다. 두께가 10 nm 미만인 PEG 박막은 용액에서 비특이적 단백질 흡착을 1.0 ng/cm 미만으로 저감시킬 수 있다. 단백질 흡착에 의한 PEG-물 복합체의 붕괴는 동력학적 및 에너지적으로 불리하지만, 온화한 반응 조건 하에 PEG를 생물학적 활성 리간드(예를 들어, 비오틴 및 니트릴로트리아세트산) 또는 항체에 직접 커플링하는 것은 어렵다. 이는 PEG에 활성 작용기가 없기 때문이다.
비특허문헌 1 은 활성 에스테르기를 실온에서 하룻밤 동안 디숙신이미딜 카보네이트(DSC)와 반응시킴으로써 PEG-코팅된 표면에 성공적으로 도입하였다. 단량체가 숙신이미딜 에스테르기를 갖는 경우, 표면-개시 제어 라디칼 중합 (surface-initiated, controlled radical polymerization, SI-CRP) 동안 에스테르 결합이 카르복실레이트기로 가수분해되기 때문에, 중합 이후에 활성화를 위해 PEG 필름을 변형할 필요가 있다. 그러나, 이러한 중합 후 변형 접근법은 몇 가지 단점이 있다. 방오성 필름의 경우, 비특이적 흡착을 최소화하기 위해 백필링(backfilling) 분자에 의한 부동화(passivation)가 필요하다(도 1(a)). 또한, 숙신이미딜 에스테르 결합은 수용액에서의 가수분해에 취약하며, 가수분해 후 비특이적 흡착은 표적 생물학적 개체의 결합을 방해할 수 있다. 더욱이, 에스테르화는 무수 환경 및 비교적 긴 반응 시간을 필요로 하기 때문에 번거롭다.
이에, 본 발명자들은, SI-CRP 이후, 활성화를 위한 에스테르화, 비오티닐화를 위한 아미드 결합 및 백필링(backfilling) 시약에 의한 부동화가 필요 없는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조방법을 완성하였다.
Jeong et al., Asian J. Org. Chem. 2013, 2, 568 Kim et al., Anal. Chem. 2008, 80, 5094
본 발명은 활성화 및 부동화 단계를 수행하지 않고 활성 기능성 및 방오성을 갖는 공중합 필름으로 개질된 표면을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법을 제공한다:
(i) 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하는 단계;
(ii) 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체 및 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액을 사용한 표면 개시 중합 단계;
(iii) 상기 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 표면에, 분석 대상 분자의 선택적 고정화가 가능한 탐침 분자를 공유 결합 또는 비공유 결합 방식을 통해 도입하는 단계.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면을 제공한다.
본 발명의 제조 방법으로 제조된, 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면은, 높은 특이적 결합능력과 상대적으로 적은 비특이적 단백질 흡착을 나타낸다. 한편, 본 공중합체 시스템의 다목적성과 실용성에 기초하여, 본 발명의 제조 방법은 분석물질 검출, 바이오센싱, 세포요법 및 약물전달에 사용될 수 있다.
도 1은 종래의 관능화 과정과 본 발명의 공정을 나타낸다. 도 1(a)는 부동화를 포함하는 금 표면상의 방오성 폴리(에틸렌글리콜) 필름의 화학적 관능화, 도 1(b)는 부동화를 포함하지 않는 금 표면상의 공중합체 필름의 이중-관능화의 도식화를 나타낸다(SAMs: 자기조립단분자막(self-assembled monolayers); SI-CRP: 표면-개시 제어 라디칼 중합(surface-initiated, controlled radical polymerization); OEGMA: 올리고(에틸렌 글리콜)메타크릴레이트; DSC: N,N-디숙시니미딜 카보네이트; DMF: 디메틸포름아미드; 및 MAEP: 2-(메타크릴로일옥시)에틸-4-펜티노에이트).
도 2는 개시제, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름 및 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 각각 코팅된 금 표면의 PIERS 스펙트럼을 나타낸다. 도 2(a)는 개시제로 코팅된 금 표면의 PIERS 스펙트럼, 도 2(b)는 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 코팅된 금 표면의 PIERS 스펙트럼, 도 2(c)는 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA)필름으로 코팅 금 표면의 PIERS 스펙트럼을 나타낸다.
도 3은 SI-CRP 및 비오티닐화 전후로 표면의 조사 및 고해상도 XPS 스펙트럼을 기록한 것을 나타낸다. 도 3(a)는 개시제로 코팅된 금 표면의 wide scan XPS 스펙트럼, 도 3(b)는 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 코팅된 금 표면의 wide scan XPS 스펙트럼, 도 3(c)는 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 코팅된 금 표면의 wide scan XPS 스펙트럼을 나타내고, 도 3(d)는 개시제로 코팅된 금 표면의 고해상도 C 1s XPS 스펙트럼, 도 3(e)는 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 코팅된 금 표면의 고해상도 C 1s XPS 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 다양한 몰비로 MAEP 및 OEGMA의 SI-CRP를 통해 합성된 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름에 흡착된 각 단백질의 양을 나타낸다.
도 5 는 개질되지 않은 금, 개시제-코팅된 금 표면, 폴리(MAEP-co-OEGMA)필름으로 코팅된 금 표면 및 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 코팅된 금 표면의 두께(검은 선) 및 물 정적 접촉각(파란색 선) 그래프를 나타낸다. 공중합체 필름((MAEP)의 몰분율 = 0.2)을 대표 샘플로 사용 하였다.
도 6 은 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름((MAEP)의 몰분율 = 0.2)의 분리된 C 1s 피크를 나타낸다: C-C/C-H (284.6 eV), C-N (285.6 eV) , C-O (286.5 eV), O=C-NH (287.5 eV) 및 O=C-O (288.3 eV); 이에 상응하는 원자 백분율은 각각 53.5, 24.2, 11.3, 4.4 및 6.6%임.
도 7 은 폴리(MAEP)의 분리된 C 1s 피크를 나타낸다: C-C/C-H (284.6 eV), C-O (286.4 eV) 및 O=C-O (288.7 eV); 이에 상응하는 원자 백분율은 각각 63.6, 20.1 및 16.3%임.
이하, 본 발명에 대하여 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은, 하기의 단계를 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법에 관한 것이다:
(i) 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하는 단계;
(ii) 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체 및 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액을 사용한 표면 개시 중합 단계;
(iii) 상기 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 표면에 분석 대상 분자의 선택적 고정화가 가능한 탐침 분자를 공유 결합 또는 비공유 결합 방식을 통해 도입하는 단계.
본 발명에서, 공중합체 고분자 필름으로 개질되는 유무기 표면으로 금, 백금, 티타늄, 스테인리스 스틸, 나이티놀 등의 금속 표면 또는 유리, 실리콘 고분자 등의 비금속 표면을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 유무기 표면으로 금 표면을 사용할 수 있다.
본 발명에서, 자기조립단분자막(SAMs, self-assembled monolayers)은, 흡착에 의해 표면에 자발적으로 형성되는 유기 분자의 분자 조립체로서, 개시제를 포함한다. 일반적으로, 개시제란 단량체가 포함되어 있는 매질에서 활성라디칼을 형성하면서 중합반응을 일으키는 물질을 일컫는다. 본 발명에서, 자기조립단분자막을 유무기 표면 위에 고정하는 단계는, 다이설파이드 그룹 또는 실록산 그룹을 포함하고 개시제 역할을 하는 화합물을 포함하는 용액을 사용하여 수행할 수 있다. 바람직하게는, 하기 화학식 1 로 나타내는 화합물, 또는 비특허문헌 2 에서 사용된 바와 같은 하기 화학식 2 로 나타내는 화합물을 포함하는 용액을 사용하여 수행할 수 있다.
화학식 1 화학식 2
Figure pat00001
Figure pat00002
본 발명에서, 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하는 단계는, 유무기 표면과 자기조립 분자 사이의 특정한 화학적 상호 작용에 기초하여 표면의 개질 및 기능화를 위한 것으로, 예를 들어, 유기 용매에 자기조립단분자막을 형성시킬 수 있는 개시제를 포함하는 화학 물질, 즉 다이설파이드 그룹 또는 실록산 그룹을 포함하는 화합물을 녹인 후 조제된 용액에 금 혹은 실리콘/유리 기판을 하루 정도 상온에서 담근 후, 동일한 유기 용매로 세척한 뒤 질소 가스 등으로 표면을 건조하여 개시제가 포함된 자기조립단분자막으로 코팅된 표면을 얻을 수 있다.
본 발명에서, 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링(Antifouling) 단량체는, 안티파울링(Anitfouling) 또는 넌파울링(Non-fouling), 즉 비특이적 흡착(fouling, 오염, 오물, 원치 않는 흡착 등)을 방지하는 성질, 즉 방오성을 가진 단량체로서, 원치 않는 흡착물에는 금속, 이온, 생체 물질 등이 다양하게 포함될 수 있다. 특히 생체 물질의 비특이적 흡착의 경우 안티바이오파울링(Anti-biofouling) 혹은 넌바이오파울링(Non-biofouling)으로도 지칭된다. 이러한 성질은 주로 바이오칩센서 장치의 표면, 생체 삽입 의료기기의 표면 및 선박 표면 등에 적용되며, 이러한 표면에 원치 않는 생체 물질의 흡착을 방지할 수 있는 성질을 보유한 표면을 안티바이오파울링 표면(Anti-biofouling surface)이라고 한다. 본 발명에서는 이러한 비특이적 흡착 방지 성질, 즉 안티파울링 성질을 가진 단량체를 이용하여 표면 개시 중합을 통한 표면 개질을 수행한다. 본 발명에서 안티파울링 단량체의 예로, 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 및 폴리(2-히드록시에틸 메타크릴레이트)를 비롯한 몇몇 친수성 중합체, 양쪽성(zwitterion) 중합체, 다당류, 폴리 비닐피롤리돈 및 폴리(2-알킬-2-옥사졸린) 등을 들 수 있다. 바람직하게는, 안티파울링 단량체는 폴리(에틸렌글리콜) 또는 양쪽성 이온(Zwitter ion)일 수 있다. 보다 바람직하게는, 안티파울링 단량체는 하기 화학식 3 으로 나타내는 화합물일 수 있다.
화학식 3
Figure pat00003
(식 중, n 은 2 이상의 자연수이고, R 은 H 또는 CH3임.)
본 발명에서, 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체를 포함하는 용액으로 표면 개시 중합한 공중합체 고분자 필름은 높은 생체 적합성, 낮은 독성 및 우수한 방오성 특성을 나타낸다. 특히, 안티파울링 단량체 사슬의 입체 반발, 입체 배제 및 입체적 유연성으로 인해 고분자 필름이 우수한 방오성 특성을 지닌다.
본 발명에서 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체는, 공유 결합 또는 비공유 결합을 통해 생물학적 활성 리간드 또는 항체, 즉 탐침 분자와 결합할 수 있는 단량체를 의미한다. 상기 공유 결합 또는 비공유 결합은, 예를 들어, 클릭 반응, -NH2 와 NHS 그룹의 결합, -NH2와 알데히드 그룹의 결합, -NH2 와 에폭시 그룹의 결합, -NH2와 COOH의 결합, 비오틴과 아비딘의 수소 결합 등일 수 있다. 바람직하게는, 상기 공유 결합은 클릭 반응일 수 있다. 클릭 반응(Click Chemistry)(이는, '클릭 화학' 또는 '클릭 화학 반응' 이라고도 한다)은 어떤 특정한 관능기끼리 매우 높은 반응성을 가지고 선택적으로 반응하여 생성물이 빠르게 합성되는 방법으로, 클릭 반응을 이용하면 매우 높은 수득률로 원하는 물질을 합성할 수 있다. 또한 클릭 반응은 합성 조건도 간단하기 때문에 비교적 합성이 까다로운 고분자에도 응용이 가능한 장점이 있다. 대표적인 클릭 반응에는 티올-알카인, 아지드-알카인 반응, 딜스-알더(Diels-Alder), 티올엔(Thiol-Ene) 반응 등이 있다. 본 발명에서 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체는, 아민기(-NH2), 하이드록실기(-OH), 하이드록시 숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)기, 알데히드기(-CHO) 및 아세틸렌기로부터 선택되는 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 탐침 단량체는 하기 화학식 4 으로 나타내는 화합물일 수 있다.
화학식 4
Figure pat00004
(식 중, R 은 아민기(-NH2), 하이드록실기(-OH), 하이드록시 숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)기, 알데히드기(-CHO) 또는 아세틸렌기임.)
본 발명에서, 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액으로 표면 개시 중합한 공중합체 고분자 필름은 클릭 반응을 통해 생물학적 활성 리간드 또는 항체와 결합할 수 있다. 바람직하게는, 공중합체 고분자는 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸-4-펜티노에이트-코-올리고(에틸렌글리콜)메타크릴레이트](폴리(MAEP-co-OEGMA))일 수 있다.
표면 개시 중합은 중합 개시제가 고정된 표면으로부터 단량체(monomer)의 성장을 통해 고분자층을 형성하는 방법으로서, 본 발명에서는, 유무기 표면에 고정된 자기조립단분자막(개시제)에 안티파울링 단량체 및 탐침 단량체를 포함하는 용액을 첨가함으로써 공중합체 필름을 생성하는 공정으로, 표면-개시 제어 라디칼 중합(surface-initiated, controlled radical polymerization, SI-CRP)이라고도 한다. 바람직하게는, 실온에서 대기압하에 ppm 단위의 구리 촉매로 반응이 일어날 수 있는, 표면개시 전자이동 재생 활성체 응용 원자이동 라디칼 중합(surface-initiated, activators regenerated by electron transfer atom transfer radical polymerization, SI-ARGET ATRP)을 사용할 수 있다. SI-ARGET ATRP 는 SI-CRP 중 ATRP 방식을 따르는 중합법 중에 하나이다. SI-ATRP 방식은 Br과 같은 할로겐 화합물을 표면에 고정시킨 후 할로겐 원자와 단량체의 바이닐 그룹과의 원자 이동을 통해 라디칼 중합을 진행하여 표면에 기능성 고분자 층을 만드는 중합법으로서, SI-ATRP 와 SI-ARGET ATRP 와의 차이는 단량체가 포함된 반응용액내에 있는 산소 제거 방법의 차이에 기인하는데, 산소를 제거하는 방식이 비타민 C와 같은 환원제를 사용하는 경우 후자의 방식을 따른다고 볼 수 있고, 전자는 반응용액 내의 산소를 제거하는 물리적 공정이 요구되는데 비싼 장치와 긴 제거 시간이 필요하다.
본 발명에서, 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 표면은, 공중합체 고분자 필름으로 코팅된 표면으로서, 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 부분 및 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 부분을 포함한다.
본 발명에서 표면 개시 중합시, 안티파울링 단량체와 탐침 단량체를 포함하는 용액에 있어서, 안티파울링 단량체의 몰비율이 20% 내지 90% 일 수 있다. 바람직하게는, 안티파울링 단량체의 몰비율이 50% 내지 90% 일 수 있다. 보다 바람직하게는, 안티파울링 단량체의 몰비율이 70% 내지 90%일 수 있다. 안티파울링 단량체의 몰비율이 100% 인 경우, 방오 성질은 뛰어나지만, 분석 대상 물질의 결합을 위해 다른 방식이 필요하다. 특히 바람직하게는, 안티파울링 단량체의 몰비율이 80% 일 수 있다. 본 발명에 있어서, 안티파울링 단량체와 탐침 단량체의 몰비율을 조정함으로써, 공중합체 고분자 필름의 특이적 결합 능력을 향상시키고 비특이적 단백질 흡착을 감소시키는 효과가 있다.
본 발명에서 분석 대상 분자의 선택적 고정화가 가능한 탐침 분자는 비오틴 및 니트릴로트리아세트산을 비롯한 생물학적 활성 리간드 또는 항체로서, 공유 결합 또는 비공유 결합 방식을 통해 공중합체 고분자 필름에 도입될 수 있다. 바람직하게는, 탐침 분자는 비오틴일 수 있다. 바람직하게는, 탐침 분자는 공유 결합을 통해 공중합체 고분자 필름과 결합할 수 있다. 보다 바람직하게는, 탐침 분자는 클릭 반응을 통해 공중합체 고분자 필름과 결합할 수 있다. 본 발명에서 탐침 분자는 스트렙타비딘을 비롯한 분석 대상 분자에 대해 높은 선택성을 나타낸다.
본 발명에서 분석 대상 분자는, 개질된 유무기 표면을 사용하여 선택적으로 흡착하고자 하는 분자로서, 스트렙타비딘, 콘카나발린 A(Concanavalin A), 또는 마노스 등일 수 있다. 바람직하게는, 분석 대상 분자는 스트렙타빈일 수 있다. 또한, 선택적 고정화는, 탐침 분자에 대한 분석 대상 분자의 흡착이 우수함을 의미하며, 이는 피브리노겐, 소혈청 알부민(BSA), 리보핵산가수분해효소 A(RNase A), 및 라이소자임을 비롯한 비특이적 흡착 단백질보다 흡착되는 양이 많음을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 제조 방법에 의해 제조된, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면에 관한 것이다.
이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예로서 상세히 설명하나, 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<제조 및 측정 방법>
재료
2- 하이드록시에틸 메타크릴레이트 (97 %, Aldrich사 제조), 올리고(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 (OEGMA, M n : ~360, Aldrich사 제조), 4-펜티노산 (95 %, Aldrich사 제조), 2-아지도아세트산 (97 %, Aldrich사 제조), N-(2-{2-[2-(2-아지도에톡시)에톡시]에톡시}에틸)헥사하이드로-2-옥소-(3aS,4S,6aR)-1H-티에노[3,4-d]이미다졸-4-펜탄아미드 (아지드-비오틴, Aldrich사 제조), 구리(II) 브로마이드 (CuBr2, 99%, Aldrich사 제조), 2,2'-비피리딜 (bpy, ≥99 %, Aldrich사 제조), 구리(II) 황산염 5수화물 (CuSO4·5H2O, 98+ %, Aldrich사 제조), (+)-나트륨 L-아스코르베이트 (≥98 %, Aldrich사 제조), 비스[2-(2-브로모이소부티릴 옥시)운데실] 디설파이드 (개시제, 97 %, Aldrich사 제조), 이소프로필 알코올 (≥99.7 %, Aldrich사 제조) 및 N,N-디메틸포름아미드 (DMF, 99.8 %, Aldrich사 제조)를 추가 정제 없이 사용하였다. 2-(메타크릴로일옥시)에틸-4-펜티노에이트 (MAEP)는 종래 알려진 방법에 의해 합성되었다(Mishra et al., Macromol. Rapid. Commun. 2014, 35, 442 참조). Human Ultra Pure System (대한민국 Human Corp.사 제조)의 탈이온수 (18.3 MΩcm)가 사용되었다.
(1) 개시제-코팅된 금 표면의 제조
먼저, 실리콘 웨이퍼 상에 5 nm의 티타늄 및 100 nm의 금을 열 증발시킴으로써 개질 되지 않은 금 표면을 제조하였다. 개시제-코팅된 금 표면은 개질 되지 않은 금 표면을 실온에서 하기 화학식 1 화합물(개시제)의 1 mM 에탄올 용액에 침지시키는 방법으로 자기조립단분자막(SAM)을 형성하여 제조되었다. 18 시간 후, 제조된 표면을 에탄올로 수 차례 철저히 헹구고, 이어서 아르곤 스트림(g)에서 건조시켰다.
화학식 1
Figure pat00005
(2) 금 표면에 폴리(MAEP- co- OEGMA) 필름 합성
개시제-코팅된 금 표면에, 안티파울링 단량체인 올리고(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 (OEGMA) 및 탐침 단량체인 2-(메타크릴로일옥시)에틸-4-펜티노에이트 (MAEP) 를 포함하는 용액을 사용하여, 표면 개시 중합을 실시하였다. 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름의 성능을 최적화시키기 위해, 두 단량체의 공급 몰비를 다양하게 실험하였다([MAEP]:[OEGMA] = 100:0, 50:50, 20:80, 10:90 및 0:100)(총 농도 125 mM). 대표적인 합성 경로는 다음과 같다. 우선 (i) 탈이온수에서 2 mM CuBr2 및 4 mM bpy 로 구성된 복합 용액 및 (ii) 탈이온수에서 20 mM 아스코르베이트 나트륨 (환원 용액)으로 구성된 두 가지 다른 저장 용액을 준비하였다. MAEP (5.25 mg, 0.025 mmol), OEGMA (32.6 μL, 0.1 mmol), 탈이온수 (367.4 μL) 및 DMF (500 μL)를 함유하는 원추형 튜브에 50 μL의 복합 용액 및 50 μL의 환원 용액을 첨가 하였다. 각 시약의 최종 농도는 MAEP (25 mM), OEGMA (100 mM), CuBr2 (0.1 mM), bpy (0.2 mM) 및 아스코르베이트 나트륨 (1 mM)이며 물과 DMF의 부피 비율은 (v/v = 1:1) 이었다. 생성된 담갈색 용액을 실온에서 10 분 동안 교반하였다. SI-ATRP는 혼합물을 개시제-코팅된 표면을 갖는 튜브에 첨가함으로써 개시되었고, 실온에서 일정 시간 (10-240 분) 동안 진행되었다. 중합은 혼합물로부터 표면을 제거함으로써 종결시켰다. 생성된 표면을 탈이온수 및 DMF로 철저히 세척하여 물리흡착된 중합체를 제거한 다음, 아르곤 스트림(g)에서 건조시켰다.
(3) 금 표면의 폴리(MAEP- co -OEGMA) 필름의 비오티닐화
표면 개시 중합에 의해 생성된 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 개질된 금 표면에, 탐침 분자 비오틴을 도입하였다. 3 mL의 이소프로필 알코올/탈이온수 (v/v = 1/2)에서 CuSO4·5H2O (2.6 mM), (+)-나트륨 L-아스코르베이트 (13 mM) 및 아지드-비오틴 (9 mM)으로 구성된 용액을 준비하여, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면을 실온에서 6 시간 동안 용액에 침지시켰다. 생성된 표면을 이소프로필 알코올 및 탈이온수로 철저히 세척하여 물리흡착된 시약을 제거하였다.
비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 개질된 금 표면의 제조에 사용된 개시제, 단량체 및 비오티닐화 여부는 하기 표 1 에 나타낸 것과 같다.
구분 개시제 단량체 공급 몰비 비오티닐화 여부
MAEP OEGMA
비교예 1 화학식 1 화합물 100 0 O
실시예 1 화학식 1 화합물 50 50 O
실시예 2 화학식 1 화합물 20 80 O
실시예 3 화학식 1 화합물 10 90 O
비교예 2 화학식 1 화합물 0 100 O
(4) 측정 및 분석 방법
(a) 편광 적외선 외부 반사 분광법 (PIERS)
PIERS 스펙트럼은 스마트 조리개 등급 각도 (smart aperture grazing angle, SAGA) 액세서리가 장착된 건식 질소 퍼지(N2-purge) Thermo Nicolet Nexus FT-IR 분광 광도계를 사용하여 단일 반사 모드에서 측정하였다. p-편광은 표면의 법선에 대해 80°로 입사되었고, 액체 질소로 냉각된 협대역 수은-카드뮴-텔루라이드 (MCT) 검출기가 반사된 광을 검출하는데 사용되었다. 스펙트럼은 깨끗한 금 표면과 비교하여 흡수 모드에서 관찰되었고, 배경 모드에서 16,000 스캔 및 샘플 모드에서 4,000 스캔으로, 4 cm-1의 해상도에서 수집되었다.
(b) 타원편광 반사법 (Ellipsometry)
각 표면의 두께는 70°의 입사각에서 He-Ne 레이저 (632.8 nm)가 장착 된 Gaertner L116s 엘립소미터 (미국 일리노이 시카고 Gaertner Scientific Corporation사 제조)로 측정되었다. 모든 표면에 대해 1.46 의 굴절률이 사용되었다.
(c) 접촉각 측정법 (Contact angle goniometry)
비디오 카메라가 장착된 Pheonix 300 장치 (대한민국 Surface Electro Optics Co. Ltd.사 제조)를 사용하여 5 ㎕ 부피의 탈이온수 물방울의 정적 접촉각을 측정하였다. 결과값은 적어도 3 차례의 독립적 측정의 평균을 나타낸다.
(d) 표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석
0.8 x 1.0 cm2 금 표면(한국 대전 DI Biotech Ltd. 제조)에 비오티닐화 공중합 필름을 제조하였으며, 굴절률이 1.52 인 No. 2 커버글라스 슬립(미국 코닝사 제조)에 티타늄 (1.5 nm) 및 금 (39 nm)을 순차적으로 증착하여 제조하였다. SPR 분석은 PBS 중에 스트렙타비딘 (0.1 mg/mL) 및 피브리노겐 (1 mg/mL) 용액을 사용하여 Biacore X 굴절계 (스웨덴 Biacore Life Sciences사 제조)에서 수행되었다. 각 단백질 용액 20 μL를 5 μL/min의 고정 유속으로 주입하였다. 단백질 용액을 4분 동안 용리시킨 후, 표면을 5 μL/min의 일정한 유속으로 PBS로 세척하였다. 단백질 결합은 공명 각도를 변동시켰다. 공명 각도는 1 RU = 0.0001° = 1 pg/mm2 인 공명 단위로 나타내었다.
<결과>
(1) 개시제, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름 및 비오티닐화 공중합체로 각각 코팅된 금 표면의 PIERS 스펙트럼
개시제, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름 및 비오티닐화 공중합체로 각각 코팅된 금 표면의 PIERS 스펙트럼을 측정하였다. 도 2 에 도시한 바와 같이, 개시제-코팅된 표면의 스펙트럼은 2983, 2924 및 2849 cm-1에서 (ν(CH2)); 1744 cm-1 에서 ν(C=O); 1463 cm-1에서 ν(CH2); 및 1171 cm-1에서 ν(C-O)의 특징적인 C-H 진동을 나타냈다(도 2(a)). MAEP 및 OEGMA 를 단량체 몰비 20:80 로 포함하는 용액으로 공중합하여 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면에서는, 새로운 피크가 3434 cm-1 (O-H, 넓은 영역) 및 3283 cm-1 (C≡C, 강한 피크)에서 나타났다. 1737 cm-1에서의 새로운 피크 (C=O)는 카르보닐기 수가 증가함에 따라 특히 강했다(도 2(b)). 공중합 필름을 비오티닐화하여 제조된 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면(실시예 2)에서는, 다른 변화가 관찰되었다. 예를 들어, 3277 cm-1에서 아세틸렌 피크가 완전히 사라졌다(도 2(c)). 새로운 피크는 비오틴에서 아미드 I 의 진동모드인 1646 cm-1 및 비오틴에서 트리아졸 C-N 및 아미드 II에 기인한 1563 cm-1에서 나타났다.
PIERS 분석에 추가하여, 표면의 두께 및 물 정접촉각을 측정하였다. 개시제의 도입은 금 표면의 접촉각을 63±1°(개질 되지 않은 금)에서 69±1°로 약간 증가시켰고, 타원형 두께를 1.2±0.2 nm로 증가시켰다(도 5). MAEP 및 OEGMA 를 단량체 몰비 20:80 로 포함하는 용액으로 공중합하여 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면에서는 접촉각이 60±2°로 감소되고 표면의 두께가 25±1 nm로 상당히 증가하였으며, 이는 공중합 필름이 표면상에 형성되었음을 나타낸다. 공중합 필름을 비오티닐화하여 제조된 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면(실시예 2)에서는 추가적으로 접촉각이 47±3°으로 감소되고 표면 두께가 40±0.2 nm로 증가하였다.
(2) 원소 분석
개시제, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름 및 비오티닐화 공중합체로 각각 코팅된 금 표면의 wide-scan 및 고해상도 XPS 스펙트럼을 측정하였다. 도 3 에 도시한 바와 같이, 개시제-코팅된 표면의 스펙트럼은 83.6 eV (Au 4f7/2), 340 eV (Au 4d5/2) 및 354 eV (Au 4d3/2)에서 특징적인 피크를 나타냈고(도 3(a)), 탄소 부분으로부터 284.6 eV (C-H/C-C), 286.6 eV (C-O-C) 및 288.7 eV (O=C-O)에서 약한 피크가 관찰되었다(도 3(d)). MAEP 및 OEGMA 를 단량체 몰비 20:80 로 포함하는 용액으로 공중합하여 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면에서는, Au 피크의 강도가 상당히 감소하였고(도 3(b)), 532.3 eV에서 탄소 부분과 O 1s 피크에 해당하는 두 피크의 강도는 증가하였다(도 3(b) 및 (e)). 따라서, 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름으로 코팅된 금 표면의 C-O 대 C-H/C-C 비는 개시제-코팅된 표면의 것보다 3 배 높았다(표 2). 공중합 필름을 비오티닐화하여 제조된 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름이 형성된 금 표면(실시예 2)에서는, 399.2 eV (N 1s) 및 162.5 eV (S 2p)에서 특징적인 피크가 나타났으며, 이는 비오틴 제시 화합물의 고정화가 성공적임을 나타낸다(도 3(c)).
비오티닐화의 추가 확인을 위해, 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름(실시예 2)의 고해상도 C 1s 스펙트럼의 피크를 5 개의 개별 피크로 세밀하게 분리(deconvoluted)시켰다. C-C/C-H 피크는 284.6 eV에서 나타났다. 클릭 반응 후 트리아졸로부터의 C-N 피크는 285.6 eV에서 나타났으며, C-O 피크는 286.5 eV에서 관찰되었다. 비오틴의 우레이도기의 O=C-NH 피크는 287.5 eV에서 관찰되었고, O=C-O 피크는 288.3 eV에서 나타났다(도 6). 분리된 C 1s 피크의 원자 백분율은 53.5, 24.2, 11.3, 4.4 및 6.6 % 였다(표 2).
하기 표 2 는, 개시제 코팅된 금 표면(I), 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 코팅된 금 표면(II), 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 코팅된 금 표면(III)(실시예 2), 및 폴리(MAEP)로 코팅된 금 표면(IV)(비교예 1)의 원소별 피크의 상대적 원자 백분율(%) 및 분리된 C 1s 백분율(%)을 나타낸다.
표면 원자 백분율 (%) C1s 백분율 (%)
C 1s O 1s N 1s S 2p C-H/C-C C-N C-O O=CNH O-C=O
I 67.6 25.9 - 6.5 69.6 - 17.5 - 12.9
II 72.0 28.0 - - 49.8 38.8 11.4
III(실시예 2) 65.8 27.3 5.8 1.1 53.5 24.2 11.3 4.4 6.6
IV(비교예 1) 76.2 25.8 - - 63.6 - 20.1 - 16.3
I = 개시제-코팅된 금 표면, II= 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 코팅된 금 표면, III = 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA)로 코팅된 금 표면, 및 IV = 폴리(MAEP)로 코팅된 금 표면.
SPR 분석
표면 플라즈몬 공명 (SPR) 분석을 사용하여 (MAEP):(OEGMA) 단량체 공급비 100:0, 50:50, 20:80, 10:90 및 0:100 에서 얻은 비오티닐화 공중합 필름, 즉 실시예 1, 2, 3 및 비교예 1 및 2 의 비오티닐화 폴리(MAEP-co-OEGMA) 필름에 흡착된 각 단백질의 양을 측정함으로써, 비오티닐화 공중합 필름의 방오성 및 결합능을 정량적으로 평가하였다. 스트렙타비딘 (MW: 52.8kDa; pI: 5)은 바이오틴에 대한 높은 선택성 및 낮은 해리상수 (Kd
Figure pat00006
10-15M)로 인해 분석 대상 분자로 사용되었다. 피브리노겐 (MW: 340kDa; pI: 5.5)은 높은 비특이적 표면 흡착으로 인해 음성 대조군으로 사용되었다. 도 4는 비오티닐화 공중합 필름에 흡착된 각 단백질의 양을 나타낸다. 흡착된 단백질의 양은 정상 상태 SPR 신호들, ΔRU 간의 차이로부터 얻어졌고, 여기서 ΔRU = [버퍼로 세척한 후 4 분 후 RU] - [단백질 주입 전의 RU 정상 상태 신호] 이다. ΔRU는 흡착된 단백질의 질량에 비례하였고, 1 ΔRU = 1 pg/mm2 였다. 각 필름의 신호 대 잡음(S/N)비는 결합된 스트렙타비딘의 양을 흡착된 피브리노겐의 양으로 나눈 것과 동일하였다. 비오티닐화 폴리(OEGMA) 필름(비교예 2)의 방오성 효과는 우수했으며, 비특이적 단백질 흡착량은 42 pg/mm2 미만이었으나, 스트렙타비딘의 결합이 약했다. 비오티닐화 폴리(MAEP) 필름(비교예 1)은 흡착된 스트렙타비딘 및 피브리노겐의 양은 각각 3074 및 2214 pg/mm2로서, 피브리노겐이 강하게 흡착되기 때문에 스트렙타비딘에 대한 선택성이 거의 없었다(도 4). (MAEP):(OEGMA)의 단량체 공급비가 20:80 인 공중합체 필름(실시예 2)이 스트렙타비딘 (5456 pg/mm2)에 가장 강하게 결합하고 비교적 적은 피브리노겐 (115 pg/mm2)을 흡착시켰는바, 공중합 필름 중에서 가장 높은 S/N 비 (47)를 나타냈다. 흥미롭게도, (MAEP)의 단량체 몰분율을 0.2 로 하여 제조된 필름(실시예 2)의 결합 능력은 폴리(MAEP) 필름(비교예 1)의 것보다 2 배 더 뛰어났다. 이는 유연한 PEG 파트가 스트렙타비딘에 의한 비오틴 결합 부위에 대한 접근을 촉진하기 때문인 것으로 판단된다.

Claims (15)

  1. 하기의 단계를 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법:
    (i) 유무기 표면 위에 자기조립단분자막을 고정하는 단계;
    (ii) 비특이적 흡착 방지 성질을 가진 안티파울링 단량체 및 탐침 분자와 공유 결합 또는 비공유 결합이 가능한 탐침 단량체를 포함하는 용액을 사용한 표면 개시 중합 단계; 및
    (iii) 상기 표면 개시 중합에 의해 생성된 공중합체 고분자로 개질된 표면에, 분석 대상 분자의 선택적 고정화가 가능한 탐침 분자를 공유 결합 또는 비공유 결합 방식을 통해 도입하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 단계 (ii) 의 안티파울링 단량체와 탐침 단량체를 포함하는 용액에 있어서, 안티파울링 단량체의 몰비율이 50% 내지 90% 인,탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 안티파울링 단량체의 몰비율이 80% 인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 안티파울링 단량체는 폴리(에틸렌글리콜)(PEG) 또는 양쪽성(zwitterion) 중합체를 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 안티파울링 단량체는 하기 화학식 3 으로 나타내는 화합물인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
    화학식 3
    Figure pat00007

    (식 중, n 은 2 이상의 자연수이고, R 은 H 또는 CH3임.)
  6. 제 1 항에 있어서, 탐침 단량체는 클릭 반응이 가능한, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 탐침 단량체는 아민기(-NH2), 하이드록실기(-OH), 하이드록시 숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)기, 알데히드기(-CHO) 및 아세틸렌기로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 탐침 단량체는 하기 화학식 4 로 나타내는 화합물인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
    화학식 4
    Figure pat00008

    (식 중, R 은 아민기(-NH2), 하이드록실기(-OH), 하이드록시 숙신이미드(N-hydroxysuccinimide)기, 알데히드기(-CHO) 또는 아세틸렌기임.)
  9. 제 1 항에 있어서, 공중합체 고분자는 폴리[2-(메타크릴로일옥시)에틸-4-펜티노에이트-코-올리고(에틸렌글리콜)메타크릴레이트](폴리(MAEP-co-OEGMA))인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  10. 제 1 항에 있어서, 탐침 분자는 비오틴인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, 유무기 표면은 금, 백금, 티타늄, 스텐인리스 스틸, 및 나이티놀에서 선택되는 금속 표면 또는 유리, 실리콘 및 고분자에서 선택되는 비금속 표면인, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  12. 제 1 항에 있어서, 자기조립단분자막은 다이설파이드 그룹 또는 실록산 그룹을 포함하고 개시제 역할을 하는 화합물을 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  13. 제 12 항에 있어서, 자기조립단분자막은 하기 화학식의 1 또는 화학식 2 로 나타내는 화합물을 포함하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
    화학식 1 화학식 2
    Figure pat00009
    Figure pat00010
  14. 제 1 항에 있어서, 공유 결합 및 비공유 결합 방식을 통해 탐침 분자를 도입하는 단계는 클릭 반응을 이용하는, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면의 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된, 탐침 분자가 포함된 공중합체 고분자 필름으로 개질된 유무기 표면.
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