KR20210144708A - 신장 손상의 치료 - Google Patents

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KR20210144708A
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세바스찬 섀퍼
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싱가포르 헬스 서비시즈 피티이 엘티디
내셔널 유니버시티 오브 싱가포르
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Abstract

인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화의 저해를 통해 신장 손상(kidney injury)을 치료하고 방지하는 방법, 뿐만 아니라 이러한 방법에 사용하기 위한 제제가 개시된다.

Description

신장 손상의 치료
본 출원은 2019년 2월 22일에 출원된 GB 1902419.9로부터 우선권을 주장하며, 이의 내용 및 요소는 모든 목적을 위해 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본 발명은 신장 손상과 관련된 질환 및 병태의 진단, 치료 및 예방에 관한 것이며, 특히 전적으로 급성 신장 손상(acute kidney injury)에 국한되는 것은 아니다.
급성 신장 손상(AKI)은 신장, 주목할 만하게는 세관 상피 세포(tubular epithelial cell)에의 급속 발병 상해(onset damage)를 지칭한다. 이는 종종 화학적으로 유발되는, 예를 들어, 의약, 화학 물질, 조영제(contrast dye) 또는 약초(herbal) 또는 식이요법(dietary) 보조제에 의해 야기되는 신장 상해 또는 손상이다. 이는 또한, 허혈(ischaemia), 기계적 또는 면역 인자에 의해 야기될 수 있다.
AKI는 흔한 병태(condition)이고, 병원 내 환자 중 10% 이하에 영향을 미친다(문헌[Silver, S. A. & Chertow, G. M. The Economic Consequences of Acute Kidney Injury. Nephron 137, 297-301 (2017)]). AKI와 관련된 주요 사망률이 존재하고, AKI 후 집중 치료를 필요로 하는 환자에서의 사망률은 50% 까지 일 수 있다. AKI로부터 생존한 환자에서 만성 신장 질환(CKD), 말기 신부전(end stage renal failure), 신장 대체 치료법(renal replacement therapy) 또는 이식까지 진행되는 장기간 위험이 존재한다(문헌[Silver, S. A. & Chertow, G. M. The Economic Consequences of Acute Kidney Injury. Nephron 13]; 문헌[Mehta, R. L. 등. Acute Kidney Injury Network: report of an initiative to improve outcomes in acute kidney injury. Crit. Care 11]; 문헌[Zuk, A. 등. Overcoming Translational Barriers in Acute Kidney Injury: A Report from an NIDDK Workshop. Clin. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1113-1123 (2018)]).
화학요법제 시스플라틴(cisplatin)(디클로로디아미노 백금; SP-4-2)-디아민디클로로백금(II))은 두경부, 유방, 폐, 고환, 난소, 뇌, 및 방광 암을 포함하여 광범위한 암을 치료하는 데 널리 사용된다. 시스플라틴 1회 투여 (50 내지 100 mg/m2) 후, 대부분의 환자는 어느 정도 AKI가 발생하고, 최대 30%의 환자에서 혈청 크레아틴의 증가에 의하여 나타나는 신장 기능의 갑작스런 감소로 정의되는(상기 Mehta 등) 신독성(nephrotoxicity)이 발생될 것이다(문헌[Ozkok, A. & Edelstein, C. L. Pathophysiology of cisplatin-induced acute kidney injury. Biomed Res. Int. 2014, 967826 (2014)]). 두경부암을 갖는 노인 환자에서 최대 20% 까지는 AKI로부터 중증 신장 기능장애(dysfunction)로 진행될 것이다(문헌[Yao, X., Panichpisal, K., Kurtzman, N. & Nugent, K. Cisplatin nephrotoxicity: a review. Am. J. Med. Sci. 334, 115-124 (2007)]). 시스플라틴-유도 AKI는 용량 제한적이고, 치료법은 종종 몇 주에 걸친 다수 회의 투여로 분할되지만 이는 여전히 신독성과 관련이 있다. 시스플라틴-유도 AKI의 중증도는 당뇨병, 고혈압, 신독성(nephrotoxic) 약물 및 고령을 포함하여 기존의 병태의 존재 하에 더욱 심하다.
AKI의 병리생리학은 대체로, 독소, 화학 물질, 약물, 면역 및 기계적 인자 또는 허혈에 의한 신장 세관 상피 세포(TEC)의 상해로 정의된다. 또한 AKI에는 혈관 및 면역적 요소가 존재한다. 시스플라틴으로 치료된 환자에서, 약물은 혈장에서보다 신장에서 5배 까지의 수준으로 존재한다. 시스플라틴은 신장에서 TEC에 축적되며, 여기서 활성 산소종(reactive oxygen species)을 유도하고, 글루타티온을 고갈시키며, 미토콘드리아 기능장애를 야기하고, 세포자멸사 또는 괴사를 통해 세포 사멸을 야기한다(상기 Ozkok 등; 문헌[Wang, S., Wei, Q., Dong, G. & Dong, Z. ERK-mediated suppression of cilia in cisplatin-induced tubular cell apoptosis and acute kidney injury. Biochim. Biophys. Acta 1832, 1582-1590 (2013)]; 문헌[Jo, S.-K., Cho, W. Y., Sung, S. A., Kim, H. K. & Won, N. H. MEK inhibitor, U0126, attenuates cisplatin-induced renal injury by decreasing inflammation and apoptosis. Kidney Int. 67]; 문헌[Nowak, G. Protein Kinase C-α and ERK1/2 Mediate Mitochondrial Dysfunction, Decreases in Active Na + Transport, and Cisplatin-induced Apoptosis in Renal Cells. J. Biol. Chem. 277, 43377-43388 (2002)]). 허혈 동안, 매우 높은 산소 요구량(oxygen demand)을 갖는 TEC는 산소 부족(deprived)이 되고, 세포자멸사 또는 괴사로 인해 세포 사멸을 겪는다.
AKI 이후, 신장 기능은 회복될 수 있다. 이는 잔여 TEC의 증식에 의해 구동되는 것으로 널리 인식되며, TEC는 매우 큰 재생 능력을 갖는다(문헌[Yang, H.-C., Liu, S.-J. & Fogo, A. B. Kidney regeneration in mammals. Nephron Exp. Nephrol. 126, 50 (2014)]; 문헌[Coelho, S., Cabral, G., Lopes, J. A. & Jacinto, A. Renal regeneration after acute kidney injury. Nephrology 23, 805-814 (2018)]; 문헌[Chang-Panesso, M. & Humphreys, B. D. Cellular plasticity in kidney injury and repair. Nat. Rev. Nephrol. 13, 39-46 (2017)]). TEC 증식이 불충분할 때, 신독성이 발증하고 시간 경과에 따라 만성 신장 질환이 뒤따를 수 있으며, 섬유증이 2차 현상으로서 발생할 수 있다. 최근의 연구에서, AKI 이후 TEC 기능장애의 중요한 결정요인은 SNAIL 유전자(SNA; SNAH; SNAIL; SLUGH2; SNAIL1로도 알려져 있음)의 재발현(re-expression)인 것으로 나타났다(문헌[Grande, M. T. 등, Snail1-induced partial epithelial-to-mesenchymal transition drives renal fibrosis in mice and can be targeted to reverse established disease. Nat. Med. 21, 989-997 (2015)]; 문헌[Simon-Tillaux, N. & Hertig, A. Snail and kidney fibrosis. Nephrol. Dial. Transplant 32, 224-233 (2017)]; 문헌[Lovisa, S. et al. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat. Med. 21, 998-1009 (2015)]). SNAIL은 배아발생(embryogenesis)에 중요하지만, 상피로부터 중간엽으로의 이행(EMT: epithelial to mesenchymal transition)을 야기하는 암 이외에는 성인에서는 드물게 발현된다. 신장에서, TGFβ1 유전자는 TEC에서 SNAIL을 유도할 수 있으며, 이는 손상된 TEC 기능 및 증식과 관련이 있다(문헌[Lovisa, S. 등. Epithelial-to-mesenchymal transition induces cell cycle arrest and parenchymal damage in renal fibrosis. Nat. Med. 21, 998-1009 (2015)]).
보고에 따르면, 사이토카인 인터루킨 11(IL-11)은 허혈-재관류 손상 후 AKI에 대항하여 강력한 보호 효과를 가지며, AKI에서 세포자멸사, 괴사 및 염증을 저해한다(문헌[Lee, H. T. 등. Interleukin-11 protects against renal ischemia and reperfusion injury. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303, F1216-24 (2012)]). IL-11은 또한, 인간 TEC 및 마우스 신장에서 이소플루란(isoflurane)에 의해 상향조절되는 것으로 나타났으며, 이는 급성 허혈성 신장 손상에 대항하는 IL-11의 중요한 보호 역할과 관련이 있다(문헌[Ham, A. 등. Critical role of interleukin-11 in isoflurane-mediated protection against ischemic acute kidney injury in mice. Anesthesiology 119, 1389-1401 (2013)]).
IL-11 치료는 또한, 래트 및 마우스에서 신장 염증을 감소시키고 신장 상해를 방지함으로써 급성 신독성 신염에 반하여 보호하는 것으로 보고되었다(문헌[Stangou, M. 등. Effect of IL-11 on glomerular expression of TGF-beta and extracellular matrix in nephrotoxic nephritis in Wistar Kyoto rats. J. Nephrol. 24, 106-111 (2011)]; 문헌[Lai, P. C. et al. Interleukin-11 attenuates nephrotoxic nephritis in Wistar Kyoto rats. J. Am. Soc. Nephrol. 12, 2310-2320 (2001)]; 문헌[Lai, P. C. et al. Interleukin-11 reduces renal injury and glomerular NF-kappa B activity in murine experimental glomerulonephritis. Nephron Exp. Nephrol. 101, e146-54 (2005)]).
신장 손상 및 상해에서 IL-11의 보고된 보호 역할과 대조적으로, 본 발명은 IL-11 신호화(signaling)의 저해를 통한 신장 손상 및 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료 및/또는 방지(prevention)에 관한 것이다.
본 발명의 일 양태에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 신장 손상을 역전시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 신장 손 상을 역전시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
또한, 신장 손상을 역전시키는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 신장 손상은 급성 신장 손상이다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 신독성이다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 약물-유도 신장 손상 또는 허혈증-유도 신장 손상이다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 시스플라틴-유도 신장 손상 또는 시스플라틴-유도 신독성이다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 세관 상피 세포(TEC)에의 상해를 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 신기능(renal function)의 열화(impairment)를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 신기능의 열화를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
또한, 신기능의 열화를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직(renal tissue)의 성장(예를 들어, 신장 손상 후), 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직의 성장(예를 들어, 신장 손상 후), 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도를 제공한다.
또한, 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직의 성장(예를 들어, 신장 손상 후), 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, SNAIL 발현(예를 들어, 신장 손상 후)을 저해하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, SNAIL 발현(예를 들어, 신장 손상 후)을 저해하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
또한, SNAIL 발현(예를 들어, 신장 손상 후)을 저해하는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형(예를 들어, 신장 손상 후)으로의 이행을 저해하거나 역전시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 제공한다.
또한, 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형(예를 들어, 신장 손상 후)으로의 이행을 저해하거나 역전시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
또한, 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형(예를 들어, 신장 손상 후)으로의 이행을 저해하거나 역전시키는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 제제는, 인터루킨 11(IL-11)이 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합하는 것을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제이다.
일부 구현예에서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 제제는 유인(decoy) 수용체일 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은
(i) 하기 CDR을 혼입하는(incorporating) 중쇄 가변(VH) 영역:
SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다:
SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은
(i) 하기 CDR을 혼입하는 중쇄 가변(VH) 영역:
SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다:
SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편이다.
일부 구현예에서, 항체 또는 항원-결합 단편은
(i) 하기 CDR을 혼입하는 중쇄 가변(VH) 영역:
SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
(ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역을 포함한다:
SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11에 대한 유인 수용체이다. 일부 구현예에서, IL-11에 대한 유인 수용체는: (i) gp130의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열 및 (ii) IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 뮤테인(mutein)이다. 일부 구현예에서, IL-11 뮤테인은 W147A이다.
일부 구현예에서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다. 제제는 올리고뉴클레오타이드 또는 저분자일 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, IL-11의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:12, 13, 14 또는 15의 서열을 포함하는, IL11로 표적화된 siRNA이다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 일부 구현예에서, IL-11Rα의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:16, 17, 18 또는 19의 서열을 포함하는, IL11RA로 표적화된 siRNA이다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 인터루킨 11 수용체는 IL-11Rα이거나 이를 포함할 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 신장 손상은 급성 신장 손상(AKI), 신독성, 약물-유도 신장 손상(DIKI), 급성 신부전, 급성 신장 질환, 만성 신장 질환, 신장 상해, 요세관 괴사(tubular necrosis), 급성 요세관 괴사, 및 자가면역 신장 손상 중 하나일 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 제제는 신장 손상의 원인, 예를 들어, 신독성 의약의 투여나 소모 또는 신장 손상의 물리적, 기계적, 화학적 또는 환경적 공급원에의 노출, 전에, 이와 함께, 또는 그 후에 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 제제, 용도 및 방법은 약물-유도 신장 손상(DIKI)을 치료하고/거나 방지(treating and/or preventing)하기 위해 제공된다. DIKI는 내재성(intrinsic) 및/또는 특이체질성(idiosyncratic) 신장 손상일 수 있다. 임의의 구현예에서, 본원의 제제, 용도 및 방법은 시스플라틴-유도 신장 손상 및/또는 시스플라틴-유도 신독성을 치료하고/거나 방지하기 위해 제공될 수 있다.
일부 구현예에서, 본원의 제제, 용도 및 방법은 허혈-유도 신장 손상(IIKI) 또는 허혈-유도 급성 신장 손상을 치료하고/거나 방지하기 위해 제공될 수 있다.
본원에 제공된 임의의 구현예에서, 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태는, 신장 손상이 병리학적으로 연관되어 있는 질환, 장애 또는 병태일 수 있다. 병상(pathology)은 세관 상피 세포에의 상해 및/또는 TEC로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행을 포함할 수 있으며, 이는 근위부(proximal) 및/또는 원위부(distal)일 수 있다.
임의의 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절될 수 있는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
임의의 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 것으로 결정된 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절된 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
또한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제로 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료 또는 방지하기 위한 대상체의 적합성을 결정하는 방법이 제공되며, 방법은, 선택적으로 시험관내에서, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R) 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
또한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제로 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료 또는 방지를 위한 대상체를 선택하는 방법이 제공되며, 방법은, 선택적으로 시험관내에서, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R) 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계를 포함한다.
일 양태에서, 대상체에서 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태, 또는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험을 진단하는 방법이 제공되며, 방법은, 선택적으로 시험관내에서, 대상체로부터 수득된 시료에서 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 상향조절을 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 진단하는 방법은 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 진단을 확인하는 방법이다. 일부 구현예에서, 진단하는 방법 및/또는 진단을 확인하는 방법은 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료를 위한 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
또한, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖고 있거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에 대한 예후를 제공하는 방법이 제공되며, 방법은 선택적으로 시험관내에서, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 대상체로부터 수득된 시료에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 결정에 기초하여, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 대상체의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 예후를 제공하는 방법은 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료를 위해 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 상향조절된 발현을 갖는 것으로 결정된 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태 또는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험을 진단하는 방법이 제공되며, 방법은 선택적으로 시험관내에서, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절, 또는 IL-11 매개 신호화의 상향조절을 예측하는 하나 이상의 유전적 인자를 대상체에서 결정하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료를 위해 대상체를 선택하는 단계를 포함한다.
또한, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖고 있거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에 대한 예후를 제공하는 방법이 제공되며, 방법은 선택적으로 시험관내에서, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절, 또는 IL-11 매개 신호화의 상향조절을 예측하는 하나 이상의 유전적 인자를 대상체에서 결정하는 단계를 포함한다.
설명
신장 손상, 특히 급성 신장 손상의 효과적인 방지 및 치료에 대하여 계속 진행중인 요구가 있다.
사이토카인 IL-11은 허혈-재관류 손상 후의 급성 신장 손상에 대항하여 보호 효과를 갖는 것으로 보고되었으며(상기 Lee 등), IL-11은 이소플루란에 의한 화학적 상해 시 인간 세관 상피 세포 및 마우스 신장에서 상향조절되고 보호적인 것으로 보고되었다(상기 Ham 등).
그러나, 대조적으로, 본 발명자들은, IL-11 매개 신호화의 저해가 세관 상피 세포를 보호하는 데 효과적이어서, 세관 상피 세포가 증식하는 것 및 급성 신장 손상의 보편적인 원인 인자인 상해로부터 회복하는 것을 가능하게 함을 밝혀내었다. 발명자들은, IL-11의 저해가 SNAIL의 발현을 방지하거나 감소시킴으로써 세관 상피 세포의 증식을 가능하게 하여 신장 조직 재생 및 회복을 유발한다고 생각하나, 이론에 결부되고자 하는 것은 아니다.
인터루킨 11 및 IL-11에 대한 수용체
지방세포생성(adipogenesis) 저해 인자로도 알려져 있는 인터루킨 11(IL-11)은 다면발현성(pleiotropic) 사이토카인이며, IL-6, IL-11, IL-27, IL-31, 온코스타틴(oncostatin), 백혈병 저해 인자(LIF), 카디오트로핀-1(CT-1: cardiotrophin-1), 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC: cardiotrophin-like cytokine), 섬모 신경친화성 인자(CNTF: ciliary neurotrophic factor) 및 뉴로포에틴(NP-1: neuropoetin-1)을 포함하는 사이토카인의 IL-6 패밀리(family)의 구성원이다.
인터루킨 11(IL-11)은 여러 가지 중간엽 세포 유형에서 발현된다. IL-11 게놈 서열은 염색체 19, 및 염색체 7의 동원체(centromeric) 영역 상으로 맵핑되었고(mapped), 세포로부터의 효율적인 분비를 보장하는 캐너니칼(canonical) 신호 펩타이드와 함께 전사된다. IL-11의 활성자(activator) 단백질 복합체, cJun/AP-1은 이의 프로모터 서열 내에 위치해 있으며, IL-11의 기본적인(basal) 전사 조절에 중요하다(문헌[Du 및 Williams., Blood 1997, Vol 89: 3897-3908]). 미성숙 형태의 인간 IL-11은 199개 아미노산 폴리펩타이드인 반면, 성숙 형태의 IL-11은 178개 아미노산 잔기의 단백질을 인코딩한다(문헌[Garbers 및 Scheller., Biol. Chem. 2013; 394(9):1145-1161]). 인간 IL-11 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P20809(P20809.1 GI:124294; SEQ ID NO:1) 하에 입수 가능하다. 재조합 인간 IL-11 (오프렐베킨(oprelvekin)) 또한 상업적으로 입수 가능하다. 마우스, 래트, 돼지, 소, 몇몇 종의 경골 어류(bony fish) 및 영장류를 포함한 다른 종으로부터의 IL-11 또한 클론되고 시퀀싱되었다.
본 명세서에서, "IL-11"은 임의의 종으로부터의 IL-11을 지칭하며, 임의의 종으로부터의 IL-11의 이소형(isoform), 단편, 변이체 또는 상동체(homologue)를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 종은 인간(호모 사피엔스(Homo sapiens))이다. IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 주어진 종, 예를 들어, 인간으로부터의 미성숙 또는 성숙 IL-11의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성 중 하나를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. IL-11의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, IL-11Rα(바람직하게는 동일한 종으로부터)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)]; 또는 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 바와 같음). IL-11의 단편은 임의의 길이(아미노산 수에 의해)일 수 있지만, 선택적으로 성숙 IL-11의 길이의 적어도 25%일 수 있고 성숙 IL-11의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. IL-11의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 또는 195개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
IL-11은 유비쿼터스적으로(ubiquitously) 발현되는 당단백질 130(gp130; 당단백질 130, IL-6ST, IL-6-베타 또는 CD130으로도 알려져 있음)의 동형이량체(homodimer)를 통해 신호화한다. Gp130은 IL-6 수용체 패밀리와 함께 유형 I 사이토카인 수용체의 하나의 하위단위를 형성하는 막관통 단백질이다. 특이성(specificity)은 개별적인 인터루킨 11 수용체 하위단위 알파(IL-11Rα)를 통해 이 얻어지며, IL-11Rα는 신호 전달에 직접적으로 참여하지 않지만 α-수용체에의 초기 사이토카인 결합 사건이 gp130과 최종적인 복합체 형성을 유발한다.
인간 gp1 30(22개 아미노산 신호 펩타이드 포함)은 918개 아미노산 단백질이고, 성숙 형태는 597개 아미노산 세포외 도메인, 22개 아미노산 막관통 도메인, 및 277개 아미노산 세포내 도메인을 포함하는 866개 아미노산이다. 단백질의 세포외 도메인은 gp130의 사이토카인-결합 모듈(CBM)을 포함한다. gp130의 CBM은 Ig-유사 도메인 D1, gp130의 피브로넥틴-유형 III 도메인 D2 및 D3을 포함한다. 인간 gp130의 아미노산 서열은 UniProt 수탁 번호 P40189-1(SEQ ID NO:2) 하에 입수 가능하다.
인간 IL-11Rα는 422개 아미노산 폴리펩타이드(UniProt Q14626; SEQ ID NO:3)이고, 뮤린 IL-11Rα와 약 85% 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 동일성을 공유한다. IL-11Rα의 2개의 이소형이 보고되었으며, 이는 세포질 도메인에서 상이하다(상기 Du 및 Williams). IL-11 수용체 α-사슬(IL-11Rα)은 IL-6 수용체 α-사슬(IL-6Rα)과 많은 구조적 및 기능적 유사성을 공유한다. 세포외 도메인은 특징적인 보존된 Trp-Ser-X-Trp-Ser(WSXWS) 모티프를 포함하여 24% 아미노산 동일성을 나타낸다. 짧은 세포질 도메인(34개 아미노산)은, JAK/STAT 신호화 경로의 활성화에 필요한 박스(Box) 1 및 2 영역이 결여되어 있다.
뮤린 IL-11 상의 수용체 결합 부위가 맵핑되었고, 3개 부위 - 부위 I, II 및 III - 가 식별되었다. gp130에의 결합은 부위 II 영역에서의 치환에 의해, 그리고 부위 III 영역에서의 치환에 의해 감소된다. 부위 III 돌연변이체는 검출 가능한 작용제(agonist) 활성을 나타내지 않고, IL-11Rα 길항제 활성을 갖는다(문헌[Cytokine Inhibitors Chapter 8; edited by Gennaro Ciliberto and Rocco Savino, Marcel Dekker, Inc. 2001]).
본 명세서에서, IL-11에 대한 수용체(IL-11R)는 IL-11에 결합할 수 있는 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 복합체를 지칭한다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11에 결합하고 수용체를 발현하는 세포에서 신호 전달을 유도할 수 있다.
IL-11 수용체는 임의의 종으로부터의 것일 수 있고, 임의의 종으로부터의 IL-11 수용체의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 종은 인간(호모 사피엔스)이다.
일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11Rα일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11에 대한 수용체는 IL-11Rα를 포함하는 폴리펩타이드 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 폴리펩타이드 복합체일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11 수용체는 gp130, 또는 IL-11이 결합하는 gp130을 포함하는 복합체일 수 있다.
IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, 주어진 종, 예를 들어, 인간으로부터의 IL-11Rα의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 아미노산 서열 동일성 중 하나를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. IL-11Rα의 이소형, 단편, 변이체 또는 상동체는 선택적으로, IL-11(바람직하게는 동일한 종으로부터)에 결합하고 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 신호 전달을 자극하는 능력을 특징으로 할 수 있다(예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)] 또는 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 바와 같음). IL-11 수용체의 단편은 임의의 길이(아미노산 수에 의해)일 수 있지만, 선택적으로 성숙 IL-11Rα의 길이의 적어도 25%일 수 있고 성숙 IL-11Rα의 길이의 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. IL-11 수용체 단편의 단편은 10개 아미노산의 최소 길이, 및 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 400, 또는 415개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다.
IL-11 신호화
IL-11은 IL-11Rα에 낮은 친화도(Kd ~10 nmol/L)로 결합하고, 이들 결합 파트너 사이의 상호작용 단독으로는 생물학적 신호를 전달하기에 불충분하다. 신호 전달을 할 수 있는 고 친화도 수용체(Kd ~400 내지 800 pmol/L)의 발생은 IL-11Rα 및 gp130의 공동-발현을 필요로 한다(문헌[Curtis 등 Blood 1997; 90 (11):4403-12]; 문헌[Hilton 등, EMBO J 13:4765, 1994]; 문헌[Nandurkar 등, Oncogene 12:585, 1996]). 세포-표면 IL-11Rα에의 IL-11의 결합은 주로 미토겐-활성화된 단백질 키나제(MAPK)-캐스케이드 및 Janus 키나제/신호 전달자 및 전사 활성자(Jak/STAT) 경로를 통해 헤테로이량체화, 티로신 인산화, gp130의 활성화 및 다운스트림 신호화를 유도한다(상기 Garbers 및 Scheller).
원칙적으로, 가용성 IL-11Rα는 또한, IL-11과 함께 생물학적으로 활성인 가용성 복합체를 형성하여(문헌[Pflanz 등, 1999 FEBS Lett, 450, 117-122]), IL-6과 유사하게, IL-11이 일부 경우에 세포-표면 gp130에 결합하기 전에 가용성 IL-11Rα에 결합할 수 있는 가능성을 상승시킬 수 있다(상기 Garbers 및 Scheller). Curtis 등(문헌[Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12])은 가용성 뮤린 IL-11 수용체 알파 사슬(sIL-11R)의 발현을 기재하며, gp130을 발현하는 세포에서 신호화를 조사하였다. 막관통 IL-11R이 없고 gp130의 존재 하에, sIL-11R은 막관통 IL-11R을 통한 신호화와 유사하게 M1 백혈병 세포의 IL-11 의존적 분화 및 Ba/F3 세포에서의 증식 및 gp130, STAT3 및 SHP2의 인산화를 포함하여 초기(early) 세포내 사건을 매개하였다. 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11에 의한 세포-막 결합된 gp130을 통한 신호화의 활성화가 최근 실증되었다(문헌[Lokau 등, 2016 Cell Reports 14, 1761-1773]). 이러한 소위 IL-11 trans 신호화가 질환 발병에 중요할 수 있지만, 인간 질환에서 이의 역할은 아직 연구된 적이 없었다. 바람직한 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화를 방해(disrupt)함으로써 달성된다.
본원에 사용된 바와 같이, 'IL-11 trans 신호화'는, IL-11Rα에 결합된 IL-11이 gp130에 결합함으로써 유도되는 신호화를 지칭하는 데 사용된다. IL-11은 IL-11Rα에 비-공유 복합체로서 결합될 수 있다. gp130은 막-결합되고 세포에 의해 발현되어, 신호화는 IL-11:IL-11Rα 복합체가 gp130에 결합한 후 발생한다. 일부 구현예에서, IL-11Rα는 가용성 IL-11Rα일 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 IL-11Rα의 가용성(분비된) 이소형(예를 들어, 막관통 도메인이 결여됨)이다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 세포막 결합된 IL-11Rα의 세포외 도메인의 단백질분해성 절단의 유리된(liberated) 생성물이다. 일부 구현예에서, IL-11Rα는 세포막-결합된 것일 수 있고, gp130을 통한 신호화는 "IL-11 cis 신호화"라고 하는 세포-막-결합된 IL-11Rα에 결합된 IL-11의 결합에 의해 유도될 수 있다.
IL-11-매개 신호화는 조혈작용(hematopoiesis) 및 혈소판발생(thrombopoiesis)을 자극하며, 용골세포(osteoclast) 활성을 자극하고, 신경발생(neurogenesis)을 자극하며, 지방세포생성을 저해하고, 전염증성(pro inflammatory) 사이토카인 발현을 감소시키며, 세포외 기질(ECM) 대사를 조절하고, 위장관 상피 세포의 정상적인 성장 제어를 매개하는 것으로 나타났다(상기 Du 및 Williams).
인터루킨 11(IL-11)의 생리학적 역할은 불분명하게 남아 있다. IL-11은 조혈 세포의 활성화 및 혈소판 생성과 가장 강하게 연관되어 왔다. IL-11은 또한, 이식편대숙주-질환, 염증성 관절염 및 염증성 장 질환에 반하여 보호를 부여하여, 항-염증성 사이토카인인 것으로 여겨지는 IL-11을 유발하는 것으로 나타났다(문헌[Putoczki 및 Ernst, J Leukoc Biol 2010, 88(6):1109-1117]). 그러나, IL-11은 전염증성일 뿐만 아니라 항염증성, 전혈관신생(pro-angiogenic)이고 신장 조직 형성(neoplasia)에 중요한 것으로 시사된다. 최근의 연구는, IL-11이 마우스 관절염 모델 및 암에서 바이러스-유도 염증 동안 쉽게 검출 가능함을 나타내었고, 이는 IL-11의 발현이 병리학적 자극에 의해 유도될 수 있음을 시사한다. IL-11은 또한, 신생물성(neoplastic) 위장관 상피에서 종양-촉진 표적 유전자의 Stat3-의존적 활성화와 연관이 있다(상기 Putoczki 및 Ernst).
본원에 사용된 바와 같이, "IL-11 신호화" 및 "IL-11-매개 신호화"는 IL-11, 또는 성숙 IL-11 분자의 기능을 갖는 이의 단편이 IL-11에 대한 수용체에 결합함으로써 매개되는 신호화를 지칭한다. "IL-11 신호화" 및 "IL-11 매개 신호화"는 예를 들어, IL-11에 대한 수용체에의 결합을 통해 IL-11/이의 기능적 단편에 의해 개시되는 신호화를 지칭하는 것으로 이해될 것이다. 다시 말해, "신호화"는 세포적 활성을 지배하는 신호 전달 및 다른 세포적 과정을 지칭한다.
신장 손상
본 발명의 양태는 신장 손상, 특히 급성 신장 손상(AKI; 급성 신부전으로도 알려져 있음) 및/또는 신장 손상, 예를 들어, AKI의 진단, 치료 및 예방을 지칭한다.
본원에서, '신장 손상'은 신장, 신장 조직, 및/또는 하나 이상의 신장 세포(renal cell)에의 상해를 지칭한다. 세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관에의 공격(insult), 예를 들어, 화학적 또는 물리적 치료/경험으로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 예를 들어, 약물-유도 신장 손상, 예를 들어, 시스플라틴-유도 신장 손상의 경우에서 화학적 공격의 결과일 수 있다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 예를 들어, 충돌(crush)의 결과로서 발생하는 신장 손상 또는 예를 들어 질환을 치료하기 위한 및/또는 신장 이식을 위한 수술 동안 발생할 수 있는 신장 조직에의 수술적 상해의 결과로서의 신장 손상의 경우에서 물리적 공격으로 인한 것일 수 있다(예를 들어, 신장 손상은 의료원성(iatrogenic) 원인을 가질 수 있음). 일부 구현예에서, 신장 손상은 예를 들어, 허혈(ischenia)의 결과로서 저산소증의 결과일 수 있거나, 재관류로 인한 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 감염, 감염에 대한 면역 반응, 암 및/또는 자가면역력으로 인해 발생할 수 있다. 상해는 가역적이거나 비가역적일 수 있다.
일부 구현예에서, 신장 손상은 신장 중 하나 또는 둘 다에의 상해를 포함한다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 신피막(renal capsule), 신피질(renal cortex), 신수질(renal medulla), 신유두(renal papilla), 신추체(renal pyramid), 신주(renal column), 신배(renal calyx), 소신배(minor calyx), 대신배(major calyx), 문(hilum), 신우(renal pelvis), 수뇨관(ureter), 신동맥(renal artery) 및 신정맥(renal vein) 중 하나 이상에의 상해를 포함한다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 신장 상피 세포(renal epithelial cell), 세관 상피 세포, 근위 세관 상피 세포, 원위 세관 상피 세포, 신장 벽세포(renal parietal cell), 족세포(podocyte), 헨레 고리의 가는 분절 세포(loop of Henle thin segment cell), 굵은 상행각 세포(thick ascending limb cell), 집합관 주세포(collecting duct principal cell), 집합관 개재 세포(collecting duct intercalated cell), 및 간질성 신장 세포(interstitial kidney cell) 중 하나 이상에의 상해를 포함한다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 신장 상피 세포, 예를 들어, 세관 상피 세포, 예를 들어, 근위 세관 상피 세포에의 상해를 포함한다.
세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관의 구조 및/또는 기능에의 변화를 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 세포/조직/기관에의 상해는 세포/조직/기관의 정상적인 기능의 상관관계 수준의 감소, 및/또는 세포/조직/기관의 약화된 기능의 상관관계의 증가를 특징으로 할 수 있다. 예시로서, 신장/신장 조직/신장 세포에의 상해는 신장 상해를 겪고 있는 대상체에 의한 요배설량(urine output)의 감소, 및/또는 신장 상해를 겪고 있는 대상체에서 혈청 크레아틴 수준의 증가를 특징으로 할 수 있다. 세포/조직/기관에의 상해는 세포 사멸, 예를 들어, 상해를 입은 기관/조직의 세포 사멸을 특징으로 할 수 있다. 세포 사멸은 세포자멸사(즉, 프로그래밍된 세포 사멸) 또는 괴사(상해의 결과로서 조기(premature) 세포 사멸)로 인한 것일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, '급성 신장 손상'은 일반적으로, 신장 기능에서 갑작스런 악화(deterioration)를 지칭한다. 급성 신장 손상은 혈청 크레아틴의 신속한 증가 및/또는 요배설량의 신속한 감소를 특징으로 할 수 있다.
급성 신장 손상은 문헌[Summary of Recommendation Statements of the Kidney Disease Improving Global Outcomes (KDIGO) group, Kidney International Supplements (2012) 2, 8-12](그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 따라 정의되고 병기화(staged)될 수 있다.
일부 구현예에서, 급성 신장 손상은 (i) 48시간 내에 ≥ 0.3 mg/dl(≥ 26.5 μmol/l)의 혈청 크레아틴 증가; (ii) 이전의 7일 내에 발생하였던 것으로 알려져 있거나 추정되는 기준선에 대하여 ≥ 1.5배까지의 혈청 크레아틴 증가; 또는 (iii) 6시간 동안 < 0.5 ml/kg/h의 소변량(urine volume)으로서 정의된다.
일부 구현예에서, 급성 신장 손상은 1, 2 또는 3기(stage) 급성 신장 손상일 수 있다. 1기 급성 신장 손상은 (i) 1.5 내지 1.9배 기준선까지의 혈청 크레아틴 증가, (ii) ≥ 0.3 mg/dl(≥ 26.5 μmol/l)까지의 혈청 크레아틴 증가, 또는 (iii) 6 내지 12시간 동안 < 0.5 ml/kg/h의 소변량으로서 정의될 수 있다. 2기 급성 신장 손상은 (i) 2.0 내지 2.9배 기준선까지의 혈청 크레아틴 증가, 또는 (ii) ≥ 12시간 동안 < 0.5 ml/kg/h의 소변량으로서 정의될 수 있다. 3기 급성 신장 손상은 (i) ≥ 3.0배 기준선까지의 혈청 크레아틴 증가, (ii) ≥ 4.0 mg/dl(≥ 353.6 μmol/l)까지의 혈청 크레아틴 증가, (iii) 신장 대체 치료법의 개시, (iv) < 18세의 환자에서, 1.73 m2당 < 35 ml/분까지의 eGFR 저하; (v) ≥ 24시간 동안 < 0.3 ml/kg/h의 소변량, 또는 (vi) ≥ 12시간 동안의 무뇨(anuria)로서 정의될 수 있다.
신장 손상은 세관 상피 세포(TEC)에의 상해 및/또는 TEC로부터 상피-투(to)-중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행(즉, EMT)을 특징으로 할 수 있다. TEC로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행은 예를 들어, E-카드헤린(cadherin)의 감소된 발현, SNAIL의 증가된 발현 및/또는 ACTA2의 증가된 발현을 특징으로 할 수 있다.
신장 손상은 임의의 원인을 가질 수 있으며, 예는 기계적(즉, 물리적) 상해 또는 손상, 화학적 상해 또는 손상, 허혈 또는 유전적 소인(genetic predisposition)으로 인한 신장 손상을 포함한다. 원인 또는 상해는 통상적으로, 약화된 신장 기능을 초래할 것이며, 이는 신부전을 유발할 수 있다.
기계적 상해 또는 손상은 대상체에게의, 신장에의, TEC에의 또는 족세포(podosytes)에의 물리적 손상을 포함할 수 있다. 이는 또한, 예를 들어, 요로(urinary tract)의 세관 폐색(obstruction)/막힘을 포함할 수 있다.
화학적 상해 또는 손상은 대상체에게 투여되거나, 이에 의해 흡수되거나 섭취되는 약물, 의약, 독소, 약초 또는 식이요법 보충제 또는 다른 화학적 제제에 의해 야기될 수 있다. 일부 구현예에서, 화학적 상해는 신장에서 발생하지 않거나, 신장과 하나 이상의 다른 조직 둘 다에서 발생하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 이러한 제제의 투여의 부작용이다. 일부 구현예에서, 화학적 상해는 암을 방지하거나 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 화학치료제의 투여의 부작용이다. 일부 구현예에서, 신장 손상은 약물-유도 신장 손상 또는 약물-유도 급성 신장 손상이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 요로의 세관 폐색/막힘은 소정의 화학적 제제, 예를 들어, 설폰아미드, 메토트렉세이트(methotrexate), 아사이클로비르(acyclovir), 디에틸렌 글리콜, 트리암테렌(triamterene)의 투여의 결과로서 생길 수 있다.
허혈성 상해는, 예를 들어, 패혈증(sepsis), 혈액 소실 또는 수술, 또는 또 다른 질환, 장애 또는 병태를 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 화학적 제제, 예를 들어, 의약 또는 약물의 효과로 인한 저혈압과 같이 많은 인자에 의해 야기될 수 있는, 신장으로의 혈류 저하로부터 생길 수 있다. 허혈증에 의해 야기되는 신장 손상은 허혈-유도 신장 손상, 또는 허혈-유도 급성 신장 손상일 수 있다. 충돌(crush) 손상에 의해 야기되는 신장 손상은 혈관 수축(vasoconstriction)을 동반하는 허혈-유도 신장 손상일 수 있거나, 세관 캐스트(tubular cast) 기계적 인자 또는 순환성 인자, 예를 들어, 미오글로빈(myoglobin)의 독성 효과에 의해 야기될 수 있다.
일부 구현예에서, AKI일 수 있는 신장 손상은 일부 경우 신장의 세관 상피 세포(TEC), 즉, 신세관 상피 세포의 사멸을 포함하거나 유발할 수 있는 상해를 특징으로 한다. TEC는 근위 또는 원위일 수 있으며, 둘 다 AKI에서 상해를 입을 수 있고, 신장 사구체 내 족세포도 마찬가지일 수 있다. TEC에의 상해는 또한, 임의의 유형의 상해, 손상 또는 공격일 수 있으며, 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 이는 기계적, 화학적 또는 허혈성 상해일 수 있다. TEC에의 상해는 신장 손상, 특히 AKI의 보편적인 원인 인자이다. TEC의 증식은 신장 기능의 회복 및 복구를 위한 기전을 제공하는 반면, TEC의 증식 실패는 질환 발증 및 진행, 예를 들어, 만성 신장 질환 및 신부전을 유발할 수 있다. 사구체 기능을 복구시키기 위한 족세포 전구체의 증식 또한 발생할 수 있으나, TEC 증식처럼 잘 설명되어 있지 않다.
일부 구현예에서, 신장 손상은 신독성이거나 이를 특징으로 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 신독성은 신장에의 독성을 지칭한다. 독성은 다시 말해, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 상해를 지칭한다. 신독성은 신기능에 미치는 소정의 성분의 독성 효과의 결과로서 생길 수 있으며, 따라서, 화학적 상해 또는 손상의 결과로서 볼 수 있다. 화학적 상해 또는 손상과 같이, 신독성은 신장에서 발생하지 않거나, 신장과 하나 이상의 다른 조직 둘 다에서 발생하는 질환 또는 병태를 치료하기 위한 제제의 투여의 부작용일 수 있다. 일부 구현예에서, 신독성은 암을 방지하거나 치료하기 위해 대상체에게 투여되는 화학치료제의 투여의 부작용일 수 있다. 이와 같이, 신독성은 약물-유도 신장 손상 또는 약물-유도 급성 신장 손상의 형태일 수 있다.
상기 기재된 바와 같이, 약물-유도 신장 손상, 약물-유도 급성 신장 손상 또는 약물-유도 신독성은 신장 외부의 조직, 신장 내의 조직 또는 둘 다에서 발생하는 질환, 장애 또는 병태를 치료하고자 하는 약물 또는 의약의 투여의 부작용으로서 생길 수 있다. 많은 약물이 이러한 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있으며, 이러한 부작용은 치료를 받는 병태, 치료를 받는 대상체, 투약량, 투약 요법 또는 투여 방식, 및 대상체가 치료 전 부분(partial) 신부전을 나타내는 규모(extent)에 의존할 수 있다. 예를 들어, 하기 제제는 모두 신장 손상을 유도하는 데 있어서 잠재력을 갖는 것으로 보고되었다: 이뇨제(diuretic), β-차단제(blocker), 혈관확장제(vasodilator), ACE 저해제, 아미노글리코시드(aminoglycoside) 항생제(예를 들어, 겐타마이신(gentamicin)), 암포테르시신(amphotercicin) B, 시스플라틴, NSAID(예를 들어, 아스피린, 이부프로펜(ibuprofen), 디클로페낙(diclofenac)), 시클로스포린(ciclosporin), 리튬 염, 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 설폰아미드, 메토트렉세이트(methotrexate), 아사이클로비르(acyclovir), 디에틸렌 글리콜, 트리암테렌(triamterene), β-락탐 항생제, 반코마이신(vancomycin), 리팜피신(rifampicin), 시프로플록사신(ciprofloxacin), 라니티딘(ranitidine), 시메티딘(cimetidine), 퓨로세미드(furosemide), 티아지드(thiazide), 페니토인(phenytoin). 선택적으로 약물-유도 신장 손상은 폴레이트(folate)-유도 신장 손상이 아니다.
일부 구현예에서, 약물-유도 신장 손상, 약물-유도 급성 신장 손상 또는 약물-유도 신독성은 대상체에서 암을 치료하거나 방지하는 의도의 화학치료제의 투여의 부작용으로서 발생할 수 있다. 화학치료제의 예는 알킬화제, 예컨대 시스플라틴, 카르보플라틴(carboplatin), 메클로레타민(mechlorethamine), 사이클로포스파미드(cyclophosphamide), 클로람부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide); 퓨린 또는 피리미딘 항-대사물, 예컨대 아자티오퓨린(azathiopurine) 또는 머캅토퓨린(mercaptopurine); 알칼로이드(alkaloid) 및 테르페노이드(terpenoid), 예컨대 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid)(예를 들어, 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 비노렐빈(vinorelbine), 빈데신(vindesine)), 포도필로톡신(podophyllotoxin), 에토포사이드(etoposide), 테니포사이드(teniposide), 탁산(taxane), 예컨대 파클리탁셀(paclitaxel)(TaxolTM), 도세탁셀(docetaxel); 토포이소머라제(topoisomerase) 저해제, 예컨대 유형 I 토포이소머라제 저해제 캄토테신(camptothecin) 이리노테칸(irinotecan) 및 토포테칸(topotecan), 또는 유형 II 토포이소머라제 저해제, 암사크린(amsacrine), 에토포사이드(etoposide), 에토포사이드 포스페이트, 테니포사이드(teniposide); 항종양 항체(예를 들어, 안트라사이클린(anthracyline) 항생제), 예컨대 닥티노마이신(dactinomycin), 독소루비신(doxorubicin)(AdriamycinTM), 에피루비신(epirubicin), 블레오마이신(bleomycin), 라파마이신(rapamycin); 항체 기초 제제, 예컨대 항-VEGF, 항-TNFα, 항-IL-2, 항GpIIb/IIIa, 항-CD-52, 항-CD20, 항-RSV, 항-HER2/neu(erbB2), 항-TNF 수용체, 항-EGFR 항체, 단일클론 항체 또는 항체 단편을 포함하며, 예는, 세툭시맙(cetuximab), 파니투무맙(panitumumab), 인플릭시맙(infliximab), 바실릭시맙(basiliximab), 베바시주맙(bevacizumab)(Avastin®), 아브식시맙(abciximab), 다클리주맙(daclizumab), 겜투주맙(gemtuzumab), 알렘투주맙(alemtuzumab), 리툭시맙(rituximab)(Mabthera®), 팔리비주맙(palivizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 에타네르셉트(etanercept), 아달리무맙(adalimumab), 니모투주맙(nimotuzumab); 및 EGFR 저해제, 예컨대 에를로티닙(erlotinib), 세툭시맙(cetuximab), 게피티닙(gefitinib)을 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 본 발명은 시스플라틴-유도 신장 손상의 진단, 치료 및/또는 예방에 관한 것이다. 이는 시스플라틴-유도 급성 신장 손상 또는 시스플라틴-유도 신독성을 포함할 수 있다. 시스플라틴(디클로로디아미노 백금; SP-4-2)-디아민디클로로백금(II))은 두경부, 유방, 폐, 고환, 난소, 뇌 및 방광 암을 포함한 광범위한 암을 치료하는 데 널리 사용되는 화학치료제이고, 관 상해 및 괴사를 수반하는 신장 손상 및 기능장애를 유 발하는 것으로 널리 인식된다(예를 들어, 문헌[Oh 등, Electrolyte Blood Press 2014 Dec; 12(2): 55-65]; 문헌[PA Arunkumar 등, Asian Pac J Trop Biomed 2012 Aug 2(8): 640-644]). 다른 백금-기초 화학치료제가 또한 신장 상해를 야기한다.
신장 손상을 갖는 대상체가 또한, 별개의 병인(etiology)을 갖는 질환 병태로서 또는 신장 손상의 2차 효과로서 신장의 섬유증과 함께 존재할 수 있는 것으로 인식되긴 하지만, 일부 구현예에서, 진단되거나, 치료를 받거나 방지되는 신장 손상은 신장의 섬유증, 예를 들어 신장 섬유증이 아니다. 일부 구현예에서, 대상체는 섬유증을 갖지 않는다. 일부 구현예에서, TEC 상해는 섬유증의 부재 하에 발생한다. 일부 구현예에서, 섬유증은 예를 들어, TEC의 불완전한 재생으로 인해 AKI를 별개로(예를 들어, 이차적으로) 생기게 한다. 일부 구현예에서, 대상체에서 상해를 입은 TEC는 전섬유증성(pro-fibrotic) TEC가 아니다. 일부 구현예에서, 섬유증은 생기지 않는다.
IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제
본 발명은 IL-11-매개 신호화의 저해를 수반한다.
본원에서, '저해'는 대조군 조건에 비교한 감소, 저하 또는 약화를 지칭한다. 예를 들어, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 IL-11의 작용의 저해는 제제의 부재 하에서의, 및/또는 적절한 제어 제제의 존재 하에서의 IL-11-매개 신호화의 규모/정도의 감소, 저하 또는 약화를 지칭한다.
본원에서 저해는 또한, 중화 또는 길항작용(antagonism)으로서 지칭될 수 있다. 대시 말해, IL-11-매개 신호화(예를 들어, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 의해 매개되는 상호작용, 신호화 또는 다른 활성)를 저해할 수 있는 제제는 관련 기능 또는 과정에 관하여 '중화' 또는 '길항' 제제라고 할 수 있다. 예를 들어, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11-매개 신호화를 중화시킬 수 있는 제제로서 지칭될 수 있거나, IL-11-매개 신호화의 길항제로서 지칭될 수 있다.
IL-11 신호화 경로는 IL-11 신호화의 저해를 위해 다수의 경로를 제공한다. IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 예를 들어, IL-11에 대한 수용체를 통한 신호화에 관여하거나 이에 필요한 하나 이상의 인자의 작용을 저해하는 것을 통해 그렇게 할 수 있다.
예를 들어, IL-11 신호화의 저해는 IL-11(또는 IL-11 함유 복합체, 예를 들어, IL-11과 IL-11Rα의 복합체)과 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, IL-11Rα를 포함하는 수용체 복합체, gp130 또는 IL-11Rα 및 gp130을 포함하는 수용체 복합체) 사이의 상호작용을 방해함으로써 달성될 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 및 gp130 중 하나 이상의 유전자 또는 단백질 발현을 저해함으로써 달성된다.
구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 trans 신호화를 방해하는 것이 아니라 IL-11-매개 cis 신호화를 방해함으로써 달성되며, 즉, IL-11-매개 신호화의 저해는 막 결합된 IL-11Rα를 수반하는 gp130-매개 cis 복합체를 저해함으로써 달성된다. 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화를 방해하는 것이 아니라 IL-11-매개 trans 신호화를 방해함으로써 달성되며, 즉, IL-11-매개 신호화의 저해는 gp130-매개 trans 신호화 복합체, 예컨대 가용성 IL-11Rα에 결합된 IL-11 또는 가용성 IL-6R에 결합된 IL-6을 저해함으로써 달성된다. 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해는 IL-11-매개 cis 신호화 및 IL-11-매개 trans 신호화를 방해함으로써 달성된다. 본원에 기재된 바와 같은 임의의 제제는 IL-11-매개 cis 및/또는 trans 신호화를 저해하는 데 사용될 수 있다.
다른 예에서, IL-11 신호화의 저해는 IL-11/IL-11Rα/gp130의 다운스트림 신호화 경로를 방해함으로써 달성될 수 있다. 다시 말해, 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은 IL-11/IL-11 수용체 복합체를 통한 신호화의 다운스트림 신호화 경로/과정/인자의 저해를 포함한다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은, IL-11/IL-11 수용체 복합체에 의해 활성화되는 세포내 신호화 경로를 통한 신호화의 저해를 포함한다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화의 저해/길항작용은, 인자의 발현/활성이 IL-11/IL-11 수용체 복합체를 통한 신호화의 결과로서 상향조절되는 하나 이상의 인자의 저해를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 JAK/STAT 신호화를 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, JAK/STAT 신호화를 저해할 수 있는 제제는 JAK1, JAK2, JAK3, TYK2, STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5A, STAT5B 및/또는 STAT6의 작용을 저해할 수 있다. 예를 들어, 제제는 JAK/STAT 단백질의 활성화를 저해하고/거나, JAK 또는 STAT 단백질과 세포 표면 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 또는 gp130의 상호작용을 저해하고/거나, JAK 단백질의 인산화를 저해하고/거나, JAK 단백질과 STAT 단백질 사이의 상호작용을 저해하고/거나, STAT 단백질의 인산화를 저해하고/거나, STAT 단백질의 이량체화를 저해하고/거나, 세포핵으로의 STAT 단백질의 전좌(translocation)를 저해하고/거나, DNA에의 STAT 단백질의 결합을 저해하고/거나 JAK 및/또는 STAT 단백질의 분해를 촉진할 수 있다. 일부 구현예에서, JAK/STAT 저해제는 룩솔리티닙(Ruxolitinib)(Jakafi/Jakavi; Incyte), 토파시티닙(Tofacitinib)(Xeljanz/Jakvinus; NIH/Pfizer), 오클라시티닙(Oclacitinib)(Apoquel), 바리시티닙(Baricitinib)(Olumiant; Incyte/Eli Lilly), 필고티닙(Filgotinib)(G-146034/GLPG-0634; Galapagos NV), 간도티닙(Gandotinib)(LY-2784544; Eli Lilly), 레스타우르티닙(Lestaurtinib)(CEP-701; Teva), 모멜로티닙(Momelotinib)(GS-0387/CYT-387; Gilead Sciences), 파크리티닙(Pacritinib)(SB1518; CTI), PF-04965842(Pfizer), 우파다시티닙(Upadacitinib)(ABT-494; AbbVie), 페피시티닙(Peficitinib)(ASP015K/JNJ-54781532; Astellas), 페드라티닙(Fedratinib)(SAR302503; Celgene), 쿠쿠르비타신 I(Cucurbitacin I)(JSI-124) 및 CHZ868로부터 선택된다.
일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 MAPK/ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, MAPK/ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제는 GRB2의 작용을 저해하고/거나, RAF 키나제의 작용을 저해하고/거나, MEK 단백질의 작용을 저해하고/거나, MAP3K/MAP2K/MAPK 및/또는 Myc의 활성화를 저해하고/거나, STAT 단백질의 인산화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, ERK 신호화를 저해할 수 있는 제제는 ERK p42/44를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, ERK 저해제는 SCH772984, SC1, VX-11e, DEL-22379, 소라페닙(Sorafenib)(Nexavar; Bayer/Onyx), SB590885, PLX4720, XL281, RAF265(Novartis), 엔코라페닙(encorafenib)(LGX818/Braftovi; Array BioPharma), 다브라페닙(dabrafenib)(Tafinlar; GSK), 베무라페닙(vemurafenib)(Zelboraf; Roche), 코비메티닙(cobimetinib)(Cotellic; Roche), CI-1040, PD0325901, 비니메티닙(Binimetinib)(MEK162/MEKTOVI; Array BioPharma), 셀루메티닙(selumetinib)(AZD6244; Array/AstraZeneca) 및 트라메티닙(Trametinib)(GSK1120212/Mekinist; Novartis)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 c-Jun N-말단 키나제(JNK) 신호화/활성을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, JNK 신호화/활성을 저해할 수 있는 제제는 JNK(예를 들어, JNK1, JNK2)의 작용 및/또는 인산화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, JNK 저해제는 SP600125, CEP 1347, TCS JNK 6o, c-JUN 펩타이드, SU3327, AEG 3482, TCS JNK 5a, BI78D3, IQ3, SR3576, IQ1S, JIP-1(153-163) 및 CC401 디하이드로클로라이드로부터 선택된다.
문헌[Widjaja 등, bioRxiv (2019) 830018]은, NOX4 발현 및 활성이 IL-11/IL-11Rα/gp130을 통한 신호화에 의해 상향조절됨을 실증한다. NOX4는 NADPH 옥시다제, 및 반응성 산소종(ROS)의 공급원이다. Nox4의 발현은 간세포-특이적 Il11 발현을 갖는 유전자이식 마우스에서 상향조절되고, IL11로 자극된 1차 인간 간세포(primary human hepatocytes)는 NOX4 발현을 상향조절한다.
일 부 구현예에서, 본 발명은 NOX4 발현(유전자 또는 단백질 발현) 또는 기능을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 NOX4 발현/기능의 IL-11-매개 상향조절을 저해할 수 있는 제제를 이용한다. NOX4 발현 또는 기능을 저해할 수 있는 제제는 본원에서 NOX4 저해제로 지칭될 수 있다. 예를 들어, NOX4 저해제는 NOX4의 발현(예를 들어, 유전자 및/또는 단백질 발현)을 감소시키고/거나, NOX4를 인코딩하는 RNA의 수준을 감소시키고/거나, NOX4 단백질의 수준을 감소시키고/거나, NOX4 활성의 수준을 감소(예를 들어, NOX4-매개 NADPH 옥시다제 활성 및/또는 NOX4-매개 ROS 생성을 감소)시킬 수 있다.
NOX4 저해제는 NOX4-결합 분자 및 NOX4 발현을 감소시킬 수 있는 분자를 포함한다. NOX4-결합 저해제는 NOX4에 대한 상호작용 파트너의 펩타이드/핵산 앱타머, 항체(및 항체 단편) 및 단편을 포함하며, 이는 NOX4 기능의 길항제, 및 NOX4의 저분자 저해제로서 거동한다. NOX4 발현을 감소시킬 수 있는 분자는 NOX4에 대한 안티센스 RNA(예를 들어, siRNA, shRNA)를 포함한다. 일부 구현예에서, NOX4 저해제는 문헌[Altenhofer 등, Antioxid Redox Signal. (2015) 23(5): 406-427] 또는 문헌[Augsburder 등, Redox Biol. (2019) 26: 101272]에 기재된 NOX4 저해제, 예컨대 GKT137831로부터 선택된다.
결합제
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 이러한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있다. 이러한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 및/또는 gp130에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11 매개 cis 및/또는 trans-신호화를 저해할 수 있다. 제제는 trans-신호화 복합체, 예컨대 IL-11 및 가용성 IL-11Rα에 결합하고 gp130-매개 신호화를 저해할 수 있다.
IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 임의의 종류일 수 있으나, 일부 구현예에서, 제제는 항체, 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자일 수 있다. 제제는 단리된 또는 정제된 형태로 제공될 수 있거나, 약학적 조성물 또는 약제로서 제형화될 수 있다.
항체 및 항원-결합 단편
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. 일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 폴리펩타이드, 예를 들어, 유인 수용체 분자이다. 일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 앱타머일 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 항체, 또는 이의 항원-결합 단편이다. "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고, 단일클론 항체, 다중클론 항체, 단일특이적 및 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체), 및 항체 단편이 관련된 표적 분자에의 결합을 나타내는 한 이들을 포괄한다.
단일클론 항체 기술과 관련된 오늘날의 기법의 측면에서, 항체는 대부분의 항원에 대해 제조될 수 있다. 항원-결합 부분은 항체의 파트(part)(예를 들어, Fab 단편) 또는 합성 항체 단편(예를 들어, 단일 사슬 Fv 단편[ScFv])일 수 있다. 선택된 항원에 대한 단일클론 항체는 기지의 기법, 예를 들어, 문헌["Monoclonal Antibodies: A manual of techniques ", H Zola (CRC Press, 1988)] 및 문헌["Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications ", J G R Hurrell (CRC Press, 1982)]에 개시된 것에 의해 제조될 수 있다. 키메라 항체는 문헌[Neuberger 등 (1988, 8th International Biotechnology Symposium Part 2, 792-799)]에 의해 논의되어 있다. 단일클론 항체(mAb)는 특히 본 발명의 방법에 유용하고, 항원 상의 단일 에피토프를 특이적으로 표적화하는 항체의 균질한 집단이다.
다중클론 항체 또한 본 발명의 방법에 유용하다. 단일특이적 다중클론 항체가 바람직하다. 적합한 다중클론 항체는 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
항체의 항원-결합 단편, 예컨대 Fab 및 Fab2 단편이 또한, 사용/제공될 수 있으며, 유전적으로 조작된 항체 및 항체 단편도 그럴 수 있다. 항체의 가변 중쇄(VH) 및 가변 경쇄(VL) 도메인은, 초기(early) 프로테아제 분해 실험에 의해 최초로 인식된 사실인 항원 인식에 관여한다. 추가의 확인은 설치류 항체의 "인간화"에 의해 밝혀졌다. 설치류 기원의 가변 도메인은, 생성된 항체가 설치류 모(parented) 항체의 항원 특이성을 보유하도록 인간 기원의 불변 도메인에 융합될 수 있다(문헌[Morrison 등 (1984) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 81, 6851-6855]).
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은, 관련 표적 분자(즉, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체)에 결합할 수 있는 항체의 상보성-결정 영역(CDR; complementarity-determining region)을 포함한다.
IL-11에 결합할 수 있는 항체는 예를 들어, 문헌[Bockhorn 등. Nat. Commun. (2013) 4(0):1393]에서 사용된 것과 같은 단일클론 마우스 항-인간 IL-11 항체 클론 #22626; 카탈로그 번호 MAB218(R&D Systems, MN, USA), 클론 6D9A(Abbiotec), 클론 KT8(Abbiotec), 클론 M3103F11(BioLegend), 클론 1F1(Abnova Corporation), 클론 3C6(Abnova Corporation), 클론 GF1(LifeSpan Biosciences), 클론 13455(Source BioScience), 11h3/19.6.1(문헌[Hermann 등, Arthritis Rheum. (1998) 41(8):1388-97]), AB-218-NA(R&D Systems), X203(문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237], 문헌[Ng, 등, "IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis." bioRxiv 336537]로서도 공개되어 있음; doi: https://doi.org/10.1101/336537) 및 US 2009/0202533 A1, WO 99/59608 A2, WO 2018/109174 A2 및 WO 2019/238882 A1에서 공개된 항-IL-11 항체를 포함한다.
특히, 항-IL-11 항체 클론 22626(MAB218로도 알려져 있음)은 예를 들어, 문헌[Schaefer 등, Nature (2017) 552(7683):110-115]에서 IL-11 매개 신호화의 길항제인 것으로 나타났다. 단일클론 항체 11h3/19.6.1은 문헌[Hermann 등, Arthritis Rheum. (1998) 41(8):1388-97]에서 중화성(neutralising) 항-IL-11 IgG1인 것으로 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[McCoy 등, BMC Cancer (2013) 13:16]에서 사용된 R&D Systems으로부터의 AB-218-NA는 중화성 항-IL-11 항체의 또 다른 예이다. WO 2018/109174 A2 및 WO 2019/238882 A1은 IL-11 매개 신호화의 더욱 추가의 예시적인 항-IL-11 항체 길항제를 개시한다. 문헌[Ng, 등, "IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis." bioRxiv 336537]; doi: https://doi.org/10.1101/336537 및 WO 2019/238882 A1에서 개시된 X203(Enx203으로도 지칭됨)은 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제이고, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:92(본 개시내용의 SEQ ID NO:22)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:94(본 개시내용의 SEQ ID NO:23)에 따른 VL 영역을 포함한다. WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:117(본 개시내용의 SEQ ID NO:30)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:122(본 개시내용의 SEQ ID NO:31)에 따른 VL 영역을 포함하는 hEnx203을 포함하여 X203의 인간화 버전은 WO 2019/238882 A1에 기재되어 있다. Enx108A는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제의 추가 예이고, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:8(본 개시내용의 SEQ ID NO:26)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:20(본 개시내용의 SEQ ID NO:27)에 따른 VL 영역을 포함한다.
IL-11Rα에 결합할 수 있는 항체는 예를 들어, 단일클론 항체 클론 025(Sino Biological), 클론 EPR5446(Abcam), 클론 473143(R & D Systems), US 2014/0219919 A1에 기재된 클론 8E2, 8D10 및 8E4 및 8E2의 친화도-성숙 변이체, Blanc 등(문헌[J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59])에 기재된 단일클론 항체, X209(문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792], 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062로서 공개되기도 함), WO 2014121325 A1 및 US 2013/0302277 A1에 개시된 항체, 및 US 2009/0202533 A1, WO 99/59608 A2, WO 2018/109170 A2 및 WO 2019/238884 A1에 개시된 항-IL-11Rα 항체를 포함한다.
특히, 항-IL-11Rα 항체 클론 473143(MAB1977로도 알려져 있음)은 예를 들어, 문헌[Schaefer 등, Nature (2017) 552(7683):110-115]에서 IL-11 매개 신호화의 길항제인 것으로 나타났다. US 2014/0219919 A1은 항-인간 IL-11Rα 항체 클론 8E2, 8D10 및 8E4에 대한 서열을 제공하며, IL-11 매개 신호화를 길항시키는 이의 능력을 개시한다 - 예를 들어, US 2014/0219919 A1의 [0489] 내지 [0490]을 참조한다. 더욱이, US 2014/0219919 A1은 클론 8E2의 추가 62개 친화도-성숙 변이체에 대한 서열 정보를 제공하며, 이 중에서 61개는 IL-11 매개 신호화를 길항시키는 것으로 개시된다 - US 2014/0219919 A1의 표 3을 참조한다. WO 2018/109170 A2 및 WO 2019/238884 A1은 IL-11 매개 신호화의 더욱 추가의 예시적인 항-IL-11Rα 항체 길항제를 개시한다. 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062 및 WO 2019/238884 A1에 개시된 X209(Enx209로도 지칭됨)는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제이며, WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:7(본 개시내용의 SEQ ID NO:24)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:14(본 개시내용의 SEQ ID NO:25)에 따른 VL 영역을 포함한다. WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:11(본 개시내용의 SEQ ID NO:32)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:17(본 개시내용의 SEQ ID NO:33)에 따른 VL 영역을 포함하는 hEnx209를 포함하여 X209의 인간화 버전은 WO 2019/238884 A1에 기재되어 있다.
당업자는 주어진 종/대상체에서의 치료적 용도에 적합한 항체를 생성하기 위한 기법을 잘 알고 있다. 예를 들어, 인간에서의 치료적 용도에 적합한 항체를 생성하는 절차는 문헌[Park and Smolen Advances in Protein Chemistry (2001) 56: 369-421(그 전체가 참조로서 본원에 포함됨)에 기재되어 있다.
주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체는 모델 종(예를 들어, 설치류, 토끼목(lagomorph))에서 생성되고, 후속적으로 주어진 종/대상체에서의 치료적 용도를 위한 이의 적합성을 향상시키기 위해 조작될 수 있다. 예를 들어, 모델 종의 면역화에 의해 생성된 단일클론 항체의 하나 이상의 아미노산은 인간 생식계열 면역글로불린 서열과 더욱 유사한 항체 서열에 도달하기 위해 치환될 수 있다(따라서 항체로 치료되는 인간 대상체에서 항-이종발생성(xenogenic) 항체 면역 반응에 대한 잠재력을 감소시킴). 항체 가변 도메인에서의 변형은 항체 파라토프(paratope)를 보존하기 위해 프레임워크(framework) 영역에 초점을 맞출 수 있다. 항체 인간화는 항체 기술 분야에서 일상적인 관례의 문제이고, 예를 들어, 문헌[Almagro and Fransson, Frontiers in Bioscience (2008) 13:1619-1633], 문헌[Safdari 등, Biotechnology and Genetic Engineering Reviews (2013) 29(2): 175-186] 및 문헌[Lo 등, Microbiology Spectrum (2014) 2(1)]에 검토되어 있으며, 이는 모두 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 인간화에 대한 요건은, 인간 면역글로불린 유전자를 발현하는 유전자이식 모델 종에서 주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체를 생성함으로써 피해질 수 있으며, 따라서, 이러한 동물에서 생성된 항체는 완전(fully)-인간이다(예를 들어, 문헌[Bruggemann 등, Arch Immunol Ther Exp (Warsz) (2015) 63(2):101-108]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함됨).
파지 디스플레이 기법이 또한, 주어진 표적 단백질(예를 들어, IL-11 또는 IL-11Rα)에 대한 항체의 식별에 이용될 수 있으며, 당업자에게 잘 알려져 있다. 인간 표적 단백질에 대한 완전 인간 항체의 식별을 위한 파지 디스플레이의 사용은 예를 들어, 문헌[Hoogenboom, Nat. Biotechnol. (2005) 23, 1105-1116] 및 문헌[Chan 등, International Immunology (2014) 26(12): 649-657]에 검토되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
항체/단편은 IL-11의 생물학적 활성을 저해하거나 감소시키는 길항제 항체/단편일 수 있다. 항체/단편은 IL-11의 생물학적 효과, 예를 들어, IL-11 수용체를 통해 생산성 신호화를 자극시키는 이의 능력을 중화시키는 중화성 항체일 수 있다. 중화 활성은 T11 마우스 형질세포종(plasmacytoma) 세포주에서 IL-11 유도 증식을 중화시키는 능력에 의해 측정될 수 있다(문헌[Nordan, R. P. 등. (1987) J. Immunol. 139:813]).
IL-11-결합 또는 IL-11Rα-결합 항체는 IL-11-매개 신호화를 길항시키는 능력에 대해 예를 들어, US 2014/0219919 A1 또는 Blanc 등(문헌[J. Immunol Methods. 2000 Jul 31;241(1-2);43-59])에 기재된 검정을 사용하여 평가될 수 있다. 간략하게는, IL-11-결합 및 IL-11Rα-결합 항체는, 적절한 종으로부터의 IL-11에 의한 자극에 반응하여, 적절한 종으로부터의 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 저해하는 능력에 대해 시험관내에서 평가될 수 있다. 대안적으로, IL-11-결합 및 IL-11Rα-결합 항체는 TGFβ1에 의한 섬유아세포의 자극 후 섬유아세포로부터-근섬유아세포(myofibroblast)로의 이행을 저해하는 능력에 대해 αSMA 발현의 평가에 의해 시험관내에서 분석될 수 있다(예를 들어, WO 2018/109174 A2(실시예 6) 및 WO 2018/109170 A2(실시예 6), 문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237] 및 문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792]에 기재된 바와 같음).
항체는 일반적으로 6개의 CDR; 경쇄 가변 영역(VL) 내의 3개: LC-CDR1, LC-CDR2, LC-CDR3, 및 중쇄 가변 영역(VH) 내의 3개: HC-CDR1, HC-CDR2 및 HC-CDR3을 포함한다. 6개의 CDR은 함께, 항체의 파라토프를 정의하며, 이러한 파라토프는 표적 분자에 결합하는 항체의 파트이다. VH 영역 및 VL 영역은 각각의 CDR의 양편 에 프레임워크 영역(FR)을 포함하며, 이는 CDR에 대한 스캐폴드(scaffold)를 제공한다. N-말단으로부터 C-말단까지, VH 영역은 하기 구조를 포함하고: N 말단-[HC-FR1]-[HC-CDR1]-[HC-FR2]-[HC-CDR2]-[HC-FR3]-[HC-CDR3]-[HC-FR4]-C 말단; VL 영역은 하기 구조를 포함한다: N 말단-[LC-FR1]-[LC-CDR1]-[LC-FR2]-[LC-CDR2]-[LC-FR3]-[LC-CDR3]-[LC-FR4]-C 말단.
항체 CDR 및 FR을 정의하기 위한 몇몇 상이한 관례, 예컨대 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)], 문헌[Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)]에 기재된 것, 및 문헌[Retter 등, Nucl. Acids Res. (2005) 33 (suppl 1): D671-D674]에 기재된 바와 같은 VBASE2가 존재한다. 본원에 기재된 항체의 VH 영역 및 VL 영역의 CDR 및 FR은 카바트(Kabat) 시스템에 따라 정의된다.
일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-11에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 항체, 또는 이의 항원-결합 단편은 IL-11Rα에 특이적으로 결합하는 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)로부터 유래된다.
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은 바람직하게는 IL-11-매개 신호화를 저해한다. 이러한 항체/항원-결합 단편은 IL-11-매개 신호화의 길항제인 것으로 기재될 수 있고/거나 IL-11-매개 신호화를 중화시키는 능력을 갖고 있는 것으로 기재될 수 있다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11에 결합하는 항체의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11-결합 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)의 CDR의 CDR, 또는 이로부터 유래된 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(1)
SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(2)
SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(3)
SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(4)
SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (1)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (2)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (3)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (4)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11에 결합하는 항체의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11-결합 항체(예를 들어, Enx108A, Enx203 또는 hEnx203)의 VH 영역 및 VL 영역의 VH 영역 및 VL 영역, 또는 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:26의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:27의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:22의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:23의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:30의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VH 영역 및 SEQ ID NO:31의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11Rα에 결합하는 항체의 CDR을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11Rα-결합 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)의 CDR의 CDR, 또는 이로부터 유래된 CDR을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VH 영역:
(5)
SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3,
또는 HC-CDR1, HC-CDR2, 또는 HC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 하기 CDR을 혼입하는 VL 영역:
(6)
SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
또는 LC-CDR1, LC-CDR2, 또는 LC-CDR3 중 하나 이상에서 1, 2 또는 3개의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환된 이의 변이체를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (5)에 따른 CDR을 혼입하는 VH 영역, 및 (6)에 따른 CDR을 혼입하는 VL 영역을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 IL-11Rα에 결합하는 항체의 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 본원에 기재된 IL-11Rα-결합 항체(예를 들어, Enx209 또는 hEnx209)의 VH 영역 및 VL 영역의 VH 영역 및 VL 영역, 또는 이로부터 유래된 VH 영역 및 VL 영역을 포함한다.
기준 아미노산 서열(예를 들어, 본원에 기재된 CDR 서열, VH 영역 서열 또는 VL 영역 서열)의 하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산으로 치환되는 본 발명에 따른 구현예에서, 치환은 예를 들어, 하기 표에 따른 보존적 치환일 수 있다. 일부 구현예에서, 중간 열(column)의 동일한 블록(block) 내의 아미노산이 치환된다. 일부 구현예에서, 최우측 열의 동일한 선(line)의 아미노산이 치환된다:
Figure pct00001
일부 구현예에서, 치환(들)은 기능적으로 보존적일 수 있다. 다시 말해, 일부 구현예에서, 치환은 동등한 비치환된 분자에 비해 치환을 포함하는 항체/단편의 하나 이상의 기능적 특성(예를 들어, 표적 결합)에 영향을 미치지 않을 수 있다(또는 실질적으로 영향을 미치지 않을 수 있음).
일부 구현예에서, 기준 VH 영역 또는 VL 영역 서열에 비해 치환(들)은 VH 영역 또는 VL 영역 서열의 특정 영역 또는 영역들에 집중(focus)될 수 있다. 예를 들어, 기준 VH 영역 또는 VL 영역 서열로부터의 변동은 하나 이상의 프레임워크 영역(FR1, FR2, FR3 및/또는 FR4)에 집중될 수 있다.
본 개시내용에 따른 항체 및 항원-결합 단편은 관련 표적 분자에 결합할 수 있는 단일클론 항체(mAb)의 서열을 사용하여 설계되고 제조될 수 있다. 항체의 항원-결합 영역, 예컨대 단일 사슬 가변 단편(scFv), Fab 및 Fab2 단편이 또한 사용/제공될 수 있다. '항원-결합 영역' 또는 '항원 결합 단편'은, 주어진 항체가 특이적인 표적에 결합할 수 있는 항체의 임의의 단편이다.
일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 VL 및 VH 영역을 포함한다. 항체의 항원-결합 영역의 VL 및 VH 영역은 함께 Fv 영역을 이룬다. 일부 구현예에서, 항체/단편은, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 Fv 영역을 포함하거나 이로 구성된다. Fv 영역은 단일 사슬로서 표현될 수 있으며, 여기서, VH 및 VL 영역은 예를 들어, 가요성(flexible) 올리고펩타이드에 의해 공유 연결된다. 이에, 항체/단편은, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 VL 및 VH 영역을 포함하는 scFv를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
항체의 항원-결합 영역의 VL과 경쇄 불변(CL) 영역, 및 VH 영역과 중쇄 불변 1(CH1) 영역은 함께 Fab 영역을 이룬다. 일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항체의 Fab 영역을 포함하거나 이로 구성된다.
일부 구현예에서, 항체/단편은 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 전항체(whole antibody)를 포함하거나 이로 구성된다. "전항체"는 면역글로불린(Ig)의 구조와 실질적으로 유사한 구조를 갖는 항체를 지칭한다. 상이한 종류의 면역글로불린 및 이의 구조는 예를 들어, 문헌[Schroeder 및 Cavacini J Allergy Clin Immunol. (2010) 125(202): S41-S52]에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 유형 G의 면역글로불린(즉, IgG)은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 약 150 kDa 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 중쇄는 VH, 뒤이어 3개의 불변 도메인(CH1, CH2, 및 CH3)을 포함하는 중쇄 불변 영역을 포함하고, 유사하게 경쇄는 VL, 뒤이어 CL을 포함한다. 중쇄에 따라, 면역글로불린은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, IgE, 또는 IgM으로서 분류될 수 있다. 경쇄는 카파(κ) 또는 람다(λ)일 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 중쇄 불변 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 IgG(예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgA(예를 들어, IgA1, IgA2), IgD, IgE 또는 IgM, 예를 들어, 인간 IgG(예를 들어, hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4), hIgA(예를 들어, hIgA1, hIgA2), hIgD, hIgE 또는 hIgM의 중쇄 불변 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 면역글로불린에서, 중쇄 불변 서열은 인간 IgG1 알로타입(allotype)(예를 들어, G1m1, G1m2, G1m3 또는 G1m17)의 중쇄 불변 서열이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 치환 K214R, D356E 및 L358M(즉, G1m3 알로타입)을 포함하는 인간 면역글로불린 G 1 불변(IGHG1; UniProt: P01857-1, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:52의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 G 4 불변(IGHG4; UniProt: P01861, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 서열은 치환 S241P 및/또는 L248E를 포함하는 인간 면역글로불린 G 4 불변(IGHG4; UniProt: P01861, v1)의 불변 영역 서열이거나 이로부터 유래된다. S241P 돌연변이는 힌지 안정화(hinge stabilising)인 한편, L248E 돌연변이는 IgG4의 이미 낮은 ADCC 이펙터(effector) 기능을 추가로 감소시킨다(문헌[Davies 및 Sutton, Immunol Rev. 2015 Nov; 268(1):139-159]; 문헌[Angal 등 Mol Immunol. 1993 Jan;30(1):105-8]). 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:53의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 본 개시내용의 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 경쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 경쇄 불변 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 카파(κ) 또는 람다(λ) 경쇄, 예를 들어, 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2), 또는 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예를 들어, IGLC1(UniProt: P0CG04-1, v1), IGLC2(UniProt: P0DOY2-1, v1), IGLC3(UniProt: P0DOY3-1, v1), IGLC6(UniProt: P0CF74-1, v1) 또는 IGLC7(UniProt: A0M8Q6-1, v3)이거나 이로부터 유래된다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 면역글로불린 경쇄 불변 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 카파 불변(IGKC; Cκ; UniProt: P01834-1, v2; SEQ ID NO:90)이거나 이로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 면역글로불린 경쇄 불변 서열은 인간 면역글로불린 람다 불변(IGLC; Cλ), 예를 들어, IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 또는 IGLC7이다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:54의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 SEQ ID NO:55의 아미노산 서열과 적어도 70% 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 중 하나의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은, (i) SEQ ID NO:28의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:29의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (i) SEQ ID NO:56의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:57의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
일부 구현예에서, 항체/항원-결합 단편은 (i) SEQ ID NO:58의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드, 및 (ii) SEQ ID NO:59의 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 중 하나의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성된 폴리펩타이드를 포함한다.
Fab, Fv, ScFv 및 dAb 항체 단편은 모두 이. 콜라이(E. coli)에서 발현되고 이로부터 분비될 수 있어서, 다량의 상기 단편의 손쉬운 생성을 가능하게 한다.
전항체, 및 F(ab')2 단편은 "2가(bivalent)"이다. "2가"란, 본 발명자들은, 상기 항체 및 F(ab')2 단편이 2개의 항원 조합 부위를 가짐을 의미한다. 대조적으로, Fab, Fv, ScFv 및 dAb 단편은 단지 1개의 항원 조합 부위를 갖는 1가(monovalent)이다. IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 합성 항체 또한, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 파지 디스플레이 기술을 사용하여 제조될 수 있다.
항체는 친화도 성숙 과정에 의해 생성될 수 있으며, 이 과정에서, 비변형된 모(parent) 항체와 비교하여 항원에 대한 항체의 친화도의 향상을 갖는 변형된 항체가 발생된다. 친화도-성숙 항체는 당업계에 알려진 절차, 예를 들어, 문헌[Marks 등, Rio/Technology 10:779-783 (1992)]; 문헌[Barbas 등, Proc Nat. Acad. Sci. USA 91:3809-3813 (1994)]; 문헌[Schier 등, Gene 169:147-155 (1995)]; 문헌[Yelton 등, J. Immunol. 155:1994-2004 (1995)]; 문헌[Jackson 등, J. Immunol. 154(7):331 0-15 9 (1995)]; 및 문헌[Hawkins 등, J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992)]에 의해 생성될 수 있다.
항체/단편은 예를 들어, 2개의 상이한 항체의 2개의 상이한 단편으로 이루어진 이중-특이적 항체를 포함하여, 이중-특이적 항체는 2개 유형의 항원에 결합한다. 이중특이적 항체는 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 본원에 기재된 바와 같은 항체/단편을 포함한다. 항체는 임의의 요망되는 항원일 수 있는 제2 항원에 대해 친화도를 갖는 상이한 단편을 함유할 수 있다. 이중-특이적 항체의 제조 기법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Mueller, D 등, (2010 Biodrugs 24 (2): 89-98)], 문헌[Wozniak-Knopp G 등, (2010 Protein Eng Des 23 (4): 289-297)], 및 문헌[Baeuerle, PA 등, (2009 Cancer Res 69 (12): 4941-4944)]를 참조한다. 이중특이적 항체 및 이중특이적 항원-결합 단편은 임의의 적합한 포맷, 예컨대 문헌[Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-197]에 기재된 포맷으로 제공될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 예를 들어, 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항원-결합 단편은 이중특이적 항체 접합체(conjugate)(예를 들어, IgG2, F(ab')2 또는 CovX-Body), 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분자(예를 들어, IgG, scFv4-Ig, IgG-scFv, scFv-IgG, DVD-Ig, IgG-sVD, sVD-IgG, 2 인(in) 1-IgG, mAb2, 또는 탠덤ab 공통 LC), 비대칭 이중특이적 IgG 또는 IgG-유사 분자(예를 들어, kih IgG, kih IgG 공통 LC, CrossMab, kih IgG-scFab, mAb-Fv, 전하쌍(charge pair) 또는 SEED-바디), 작은 이중특이적 항체 분자(예를 들어, 디아바디(Db: Diabody), dsDb, DART, scDb, tandAbs, 탠덤 scFv(taFv), 탠덤 dAb/VHH, 트리플 바디(triple body), 트리플 헤드(triple head), Fab-scFv, 또는 F(ab')2-scFv2), 이중특이적 Fc 및 CH3 융합 단백질(예를 들어, taFv-Fc, Di-디아바디, scDb-CH3, scFv-Fc-scFv, HCAb-VHH, scFv-kih-Fc, 또는 scFv-kih-CH3), 또는 이중특이적 융합 단백질(예를 들어, scFv2-알부민, scDb-알부민, taFv-독소, DNL-Fab3, DNL-Fab4-IgG, DNL-Fab4-IgG-사이토카인2)일 수 있다. 특히, 문헌[Kontermann MAbs 2012, 4(2): 182-19]의 도 2를 참조한다.
이중특이적 항체를 생성하는 방법은 항체 또는 항체 단편을 예를 들어, 문헌[Segal 및 Bast, 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같이 화학적으로, 예를 들어, 환원적 디설파이드 또는 비-환원적 티오에테르 결합으로 가교시키는 단계를 포함하며, 이 문헌은 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(-2-피리딜디티오)-프로피오네이트(SPDP)는 예를 들어, 힌지 영역 SH- 기를 통해 Fab 단편을 화학적으로 가교시켜, 디설파이드-연결 이중특이적 F(ab)2 헤테로이량체를 생성하는 데 사용될 수 있다.
이중특이적 항체를 생성하는 다른 방법은 항체-생성 하이브리도마를 예를 들어, 문헌[D. M. 및 Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜과 융합시켜, 이중특이적 항체를 분비할 수 있는 쿼드로마(quadroma) 세포를 생성하는 단계를 포함한다.
이중특이적 항체 및 이중특이적 항원-결합 단편은 또한, 예를 들어, 문헌[Antibody Engineering: Methods and Protocols, Second Edition (Humana Press, 2012), at Chapter 40: Production of Bispecific Antibodies: Diabodies and Tandem scFv (Hornig and Farber-Schwarz)], 또는 문헌[French, How to make bispecific antibodies, Methods Mol. Med. 2000; 40:333-339]에 기재된 바와 같이 예를 들어, 항원 결합 분자에 대한 폴리펩타이드를 인코딩하는 핵산 작제물로부터의 발현에 의해 재조합적으로 생성될 수 있다.
예를 들어, 2개의 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인(즉, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인, 및 또 다른 표적 단백질에 결합할 수 있는 항원 결합 도메인에 대한 경쇄 및 중쇄 가변 도메인)을 인코딩하고, 항원 결합 도메인 사이의 적합한 링커 또는 이량체화 도메인을 인코딩하는 서열을 포함하는 DNA 작제물은 분자 클로닝 기법에 의해 제조될 수 있다. 이후, 재조합 이중특이적 항체는 적합한 숙주 세포(예를 들어, 포유류 숙주 세포)에서 작제물의 발현(예를 들어, 시험관내에서)에 의해 생성될 수 있으며, 그 후에 발현된 재조합 이중특이적 항체는 선택적으로 정제될 수 있다.
유인 수용체
IL-11 또는 IL-11 함유 복합체에 결합할 수 있는 펩타이드 또는 폴리펩타이드 기초 제제는 IL-11 수용체, 예를 들어, IL-11 수용체의 IL-11 결합 단편에 기초할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11Rα 사슬의 IL-11-결합 단편을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 가용성이고/거나 막관통 도메인(들) 중 하나 이상, 또는 모두를 배제할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 gp130의 IL-11-결합 단편을 포함할 수 있으며, 바람직하게는 가용성이고/거나 막관통 도메인(들) 중 하나 이상, 또는 모두를 배제할 수 있다. 이러한 분자는 유인 수용체로서 기재될 수 있다. 이러 한 제제의 결합은, IL-11에 대한 수용체, 예를 들어, IL-11Rα 또는 gp130에 결합하는 IL-11의 능력을 감소/방지하여 다운스트림 신호화를 저해함으로써 IL-11 매개 cis 및/또는 trans-신호화를 저해할 수 있다.
Curtis 등(문헌[Blood 1997 Dec 1;90 (11):4403-12])은, 가용성 뮤린 IL-11 수용체 알파 사슬(sIL-11R)이 막관통 IL-11R 및 gp130을 발현하는 세포 상에서 시험되었을 때 IL-11의 활성을 길항시킬 수 있었음을 보고한다. 이들은, sIL-11R에 의한 관찰된 IL-11 길항작용이 막관통 IL-11R을 이미 발현하고 있는 세포 상에서 제한된 수의 gp130 분자에 의존함을 제안하였다.
신호 전달 및 치료적 개입의 저해에 대한 기초(basis)로서 가용성 유인 수용체의 용도 또한, 다른 신호화 분자:수용체 쌍, 예를 들어, VEGF 및 VEGF 수용체에 대해 보고되었다(문헌[De-Chao Yu 등, Molecular Therapy (2012); 20 5, 938-947]; 문헌[Konner and Dupont Clin Colorectal Cancer 2004 Oct;4 Suppl 2:S81-5]).
이와 같이, 일부 구현예에서, 결합제는 유인 수용체, 예를 들어, 가용성 IL-11에 대한 수용체 및/또는 IL-11 함유 복합체일 수 있다. 유인 수용체에 의해 제공되는 IL-11 및/또는 IL-11 함유 복합체에 대한 경쟁은 IL-11 길항제 작용을 유발하는 것으로 보고되었다(상기 Curtis 등). 유인 IL-11 수용체는 또한, WO 2017/103108 A1 및 WO 2018/109168 A1에 기재되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
유인 IL-11 수용체는 바람직하게는 IL-11 및/또는 IL-11 함유 복합체에 결합하여, 이러한 종(species)이 gp130, IL-11Rα 및/또는 gp130:IL-11Rα 수용체에의 결합에 이용 불가능하게 만든다. 이와 같이, 이는 에타네르셉트(etanercept)가 TNFα에 대한 유인 수용체로서 작용하는 것과 동일한 방식으로 많이, IL-11 및 IL-11 함유 복합체에 대한 '유인' 수용체로서 작용한다. IL-11-매개 신호화는 유인 수용체의 부재 하에서의 신호화 수준과 비교하여 감소된다.
유인 IL-11 수용체는 바람직하게는 하나 이상의 사이토카인 결합 모듈(CBM)을 통해 IL-11에 결합한다. CBM은 IL-11에 대한 천연 발생 수용체 분자의 CBM이거나, 이로부터 유래되거나 이와 상동성이다. 예를 들어, 유인 IL-11 수용체는, gp130 및/또는 IL-11Rα의 CBM으로부터의 것이거나, 이로부터 유래되거나 이와 상동성인 하나 이상의 CBM을 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
일부 구현예에서, 유인 IL-11 수용체는 gp130의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함하거나 이로 구성될 수 있다. 일부 구현예에서, 유인 IL-11 수용체는 IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 본원에서, 주어진 펩타이드/폴리펩타이드의 기준 영역 또는 서열에 '상응하는' 아미노산 서열은 기준 영역/서열의 아미노산 서열의 적어도 60%, 예를 들어, 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 중 하나의 서열 동일성을 갖는다.
일부 구현예에서, 유인 수용체는 IL-11에 예를 들어, 적어도 100 μM 이하, 선택적으로 10 μM 이하, 1 μM 이하, 100 nM 이하, 또는 약 1 내지 100 nM 중 하나의 결합 친화도로 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 유인 수용체는 IL-11 결합 도메인의 모두 또는 파트를 포함할 수 있으며, 선택적으로 막관통 도메인의 모두 또는 파트가 결여될 수 있다. 유인 수용체는 선택적으로, 면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, IgG Fc 영역에 융합될 수 있다.
저해제
본 발명은 IL-11, IL-11 함유 복합체, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체 중 하나 이상에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 저해제 분자의 용도를 고려한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11을 기반으로 한 펩타이드-기반 또는 폴리펩타이드-기반 결합제, 예를 들어, IL-11의 돌연변이체, 변이체 또는 결합 단편이다. 적합한 펩타이드 또는 폴리펩타이드 기초 제제는, 신호 전달의 개시를 유발하지 않거나 차선의 신호화를 생성하는 방식으로 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 이러한 종류의 IL-11 돌연변이체는 내인성 IL-11의 경쟁적 저해제로서 작용할 수 있다.
예를 들어, W147A는, 아미노산 147이 트립토판으로부터 알라닌으로 돌연변이화된 IL-11 길항제이며, IL-11의 소위 '부위 III'을 파괴한다. 이러한 돌연변이체는 IL-11Rα에 결합할 수 있으나, gp130 호모이량체의 연계(engagement)는 실패하여, IL-11 신호화의 효율적인 차단을 초래한다(문헌[Underhill-Day 등, 2003; Endocrinology 2003 Aug;144(8):3406-14]). Lee 등(문헌[Am J respire Cell Mol Biol. 2008 Dec; 39(6):739-746])은 또한, IL-11Rα에의 IL-11의 결합을 특이적으로 저해할 수 있는 IL-11 길항제 돌연변이체("뮤테인")의 생성을 보고한다. IL-11 뮤테인은 또한 WO 2009/052588 A1에 기재되어 있다.
Menkhorst 등(문헌[Biology of Reproduction May 1, 2009 vol.80 no.5 920-927])은 PEG화된(PEGylated) IL-11 길항제, PEGIL11A(CSL Limited, Parkvill, Victoria, Australia)를 기재하며, 이는 암컷 마우스에서 IL-11 작용을 저해하는 데 효과적이다.
문헌[Pasqualini 등. Cancer (2015) 121(14):2411-2421]은 IL-11Rα에 결합할 수 있는 리간드-지향성(directed), 펩티도미메틱(peptidomimetic) 약물, 골 전이-표적화 펩티도미메틱-11(BMTP-11)을 기재한다.
일부 구현예에서, IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 결합제는 IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체 중 하나의 저분자 저해제의 형태로 제공될 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체의 저분자 저해제, 예를 들어, 문헌[Lay 등, Int. J. Oncol. (2012); 41(2): 759-764]에 기재된 IL-11 저해제의 형태로 제공될 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
앱타머
일부 구현예에서, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있는 제제는 앱타머이다. 핵산/펩타이드 리간드라고도 하는 앱타머는, 표적 분자에 높은 특이성 및 높은 친화도로 결합하는 능력을 특징으로 하는 핵산 또는 펩타이드 분자이다. 현재까지 식별된 대부분의 모든 앱타머는 비-천연 발생 분자이다.
주어진 표적(예를 들어, IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체)에 대한 앱타머는 지수 농화에 의한 리간드의 체계적 진화(SELEXTM)의 방법에 의해, 또는 SOMAmer(느린 오프-레이트 변형된 앱타머(slow off-rate modified aptamer))를 개발함으로써 식별 및/또는 생성될 수 있다(문헌[Gold L 등. (2010) PLoS ONE 5(12):e15004]). 앱타머 및 SELEX는 문헌[Tuerk and Gold, Science (1990) 249(4968):505-10] 및 WO 91/19813호에 기재되어 있다. SELEX 및 SOMAmer 기술을 적용하는 것은 예를 들어, 앱타머의 화학적 다양성을 확장(expand)시키기 위해 아미노산 측쇄를 모방하는 작용기를 첨가하는 단계를 포함한다. 그 결과, 표적에 대한 고 친화도 앱터머가 농화(enriched) 및 식별될 수 있다.
앱타머는 DNA 또는 RNA 분자일 수 있으며, 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다. 앱타머는, 예를 들어, 당(sugar) 및/또는 포스페이트 및/또는 염기가 화학적으로 변형된, 화학적으로 변형된 핵산을 포함할 수 있다. 이러한 변형은 앱타머의 안정성을 향상시키거나 앱타머를 분해에 대해 더욱 강하게 만들 수 있고, 리보스의 2' 위치에서 변형을 포함할 수 있다.
앱타머는 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 합성될 수 있다. 예를 들어, 앱타머는 예를 들어, 고체 지지체 상에서 화학적으로 합성될 수 있다. 고체상 합성은 포스포라미다이트(phosphoramidite) 화학을 사용할 수 있다. 간략하게는, 고체 지지된(supported) 뉴클레오타이드는 탈트리틸화(detritylated)된 다음, 적합하게 활성화된 뉴클레오사이드 포스포라미다이트와 커플링되어, 포스파이트 트리에스테르 연결을 형성한다. 그 후에, 캡핑(capping)이 발생하며, 뒤이어 산화제, 전형적으로 요오드에 의한 포스파이트 트리에스테르의 산화가 발생할 수 있다. 그 후에, 주기(cycle)가 반복되어, 앱타머를 조립할 수 있다(예를 들어, 문헌[Sinha, N. D.; Biernat, J.; McManus, J.; Koster, H. Nucleic Acids Res. 1984, 12, 4539]; 및 문헌[Beaucage, S. L.; Lyer, R. P. (1992). Tetrahedron 48 (12): 2223] 참조).
적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 또는 40개 뉴클레오타이드 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다. 적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오타이드 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 적합한 핵산 앱타머는 선택적으로, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 또는 80개 뉴클레오타이드 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
앱타머는 특이적인 표적 분자에 결합하도록 선택되거나 조작된 펩타이드일 수 있다. 펩타이드 앱타머 및 이의 생성 방법과 식별 방법은 문헌[Reverdatto 등, Curr Top Med Chem. (2015) 15(12):1082-101]에 검토되어 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다. 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 아미노산 중 하나의 최소 길이를 가질 수 있다. 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 또는 50개 아미노산 중 하나의 최대 길이를 가질 수 있다. 적합한 펩타이드 앱타머는 선택적으로, 2-30, 2-25, 2-20, 5-30, 5-25 또는 5-20개 아미노산 중 하나의 길이를 가질 수 있다.
앱타머는 nM 또는 pM 범위, 예를 들어, 500 nM, 100 nM, 50 nM, 10 nM, 1 nM, 500 pM, 100 pM 중 하나의 미만의 KD를 가질 수 있다.
IL-11 결합제의 특성
본 발명에 따른 IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제는 하기 특성 중 하나 이상을 나타낼 수 있다:
· IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에의 특이적인 결합;
· 10 μM 이하, 바람직하게는 ≤ 5 μM ≤ 1 μM, ≤500 nM, ≤ 100 nM, ≤10 nM, ≤1 nM 또는 ≤100 pM의 KD로, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에의 결합;
· IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11과 IL-11Rα:gp130 수용체 복합체 사이의 상호작용의 저해;
· IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 저해.
이들 특성은 적합한 검정에서 관련 제제의 분석에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 검정은 제제와 적합한 대조군 제제의 성능 비교를 수반할 수 있다. 당업자는 주어진 검정에 대한 적절한 제어 조건을 식별할 수 있다.
예를 들어, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체에 결합하는 시험 항체/항원-결합 단편의 능력의 분석에 적합한 음성 대조군은 비-표적 단백질에 대한 항체/항원-결합 단편(즉, IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11에 대한 수용체에 특이적이지 않은 항체/항원-결합 단편)일 수 있다. 적합한 양성 대조군은 기지의 입증된(예를 들어, 상업적으로 입수 가능한) IL-11-결합 또는 IL-11 수용체-결합 항체일 수 있다. 대조군은 분석중인 추정상(putative) IL-11/IL-11 함유 복합체/IL-11 수용체-결합 항체/항원-결합 단편과 동일한 이소타입(isotype)일 수 있고, 예를 들어, 동일한 불변 영역을 가질 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 특이적으로 결합할 수 있다. 주어진 표적 분자에 특이적으로 결합하는 제제는 바람직하게는, 이것이 다른 비-표적 분자에 결합하는 것보다 더 큰 친화도로, 및/또는 더 큰 기간으로 표적에 결합한다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-6 사이토카인 패밀리의 하나 이상의 다른 구성원(예를 들어, IL-6, 백혈병 저해 인자(LIF), 온코스타틴 M(OSM), 카디오트로핀-1(CT-1), 섬모 신경친화성 인자(CNTF) 및 카디오트로핀-유사 사이토카인(CLC))에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-6 수용체 패밀리의 하나 이상의 다른 구성원에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)에 결합할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-6Rα, 백혈병 저해 인자 수용체(LIFR), 온코스타틴 M 수용체(OSMR), 섬모 신경친화성 인자 수용체 알파(CNTFRα) 및 사이토카인 수용체-유사 인자 1(CRLF1) 중 하나 이상에의 결합 친화도보다 더 큰 친화도로 IL-11Rα에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 비-표적에의 결합제의 결합 규모는 예를 들어, ELISA, SPR, 생물층 간섭계(BLI: Bio-Layer Interferometry), 마이크로스케일 열영동(MST: MicroScale Thermophoresis)에 의해, 또는 방사성면역검정(RIA: radioimmunoassay)에 의해 측정된 바와 같이 표적에의 제제의 결합의 약 10% 미만이다. 대안적으로, 결합 특이성은 결합 친화도의 측면에서 반영될 수 있으며, 여기서, 결합제는 또 다른 비-표적 분자에 대한 KD보다 적어도 0.1 자릿수(order of magnitude)(즉, 0.1 x 10n, 여기서, n은 자릿수를 나타내는 정수임) 더 큰 KD로 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합한다. 이는 선택적으로 적어도 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 또는 2.0 중 하나일 수 있다.
주어진 결합제의 표적에 대한 이러한 결합제의 결합 친화도는 종종 이의 해리 상수(KD; dissociation constant)의 측면에서 기재된다. 결합 친화도는 당업계에 알려진 방법에 의해, 예컨대 ELISA, 표면 플라즈몬 공명(SPR; 예를 들어, 문헌[Hearty 등, Methods Mol Biol (2012) 907:411-442]; 또는 문헌[Rich 등, Anal Biochem. 2008 Feb 1; 373(1):112-20] 참조), 생물층 간섭계(예를 들어, 문헌[Lad 등, (2015) J Biomol Screen 20(4): 498-507]; 또는 문헌[Concepcion 등, Comb Chem High Throughput Screen. 2009 Sep; 12(8):791-800] 참조), 마이크로스케일 열영동(MST) 분석(예를 들어, 문헌[Jerabek-Willemsen 등, Assay Drug Dev Technol. 2011 Aug; 9(4): 342-353] 참조)에 의해, 또는 방사성표지된 항원 결합 검정(RIA)에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 50 μM 이하, 바람직하게는 ≤ 10 μM, ≤5 μM, ≤4 μM, ≤3 μM, ≤2 μM, ≤1 μM, ≤500 nM, ≤100 nM, ≤75 nM, ≤50 nM, ≤40 nM, ≤30 nM, ≤20 nM, ≤15 nM, ≤12.5 nM, ≤10 nM, ≤9 nM, ≤8 nM, ≤7 nM, ≤6 nM, ≤5 nM, ≤4 nM, ≤3 nM, ≤2 nM, ≤1 nM, ≤500 pM, ≤400 pM, ≤300 pM, ≤200 pM, 또는 ≤100 pM 중 하나의 KD로 IL-11 또는 IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 EC50 = 10,000 ng/ml 이하, 바람직하게는 ≤5,000 ng/ml, ≤1000 ng/ml, ≤900 ng/ml, ≤800 ng/ml, ≤700 ng/ml, ≤600 ng/ml, ≤500 ng/ml, ≤400 ng/ml, ≤300 ng/ml, ≤200 ng/ml, ≤100 ng/ml, ≤90 ng/ml, ≤80 ng/ml, ≤70 ng/ml, ≤60 ng/ml, ≤50 ng/ml, ≤40 ng/ml, ≤30 ng/ml, ≤20 ng/ml, ≤15 ng/ml, ≤10 ng/ml, ≤7.5 ng/ml, ≤5 ng/ml, ≤2.5 ng/ml, 또는 ≤1 ng/ml 중 하나의 결합 친화도(예를 들어, ELISA에 의해 결정된 바와 같음)로 IL-11, IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합한다. 이러한 ELISA는 예를 들어, 문헌[항체 Engineering, vol. 1 (2nd Edn), Springer Protocols, Springer (2010), Part V, pp657-665]에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 대한 수용체, 예를 들어, gp130 또는 IL-11Rα에의 결합에 중요한 영역 내의 IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에 결합하여, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용, 및/또는 수용체를 통한 신호화를 저해한다. 일부 구현예에서, 제제는, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체에의 결합에 중요한 영역 내의 IL-11에 대한 수용체에 결합하여, IL-11 또는 IL-11-함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용, 및/또는 수용체를 통한 신호화를 저해한다.
2개 단백질 사이의 상호작용을 저해하는, 주어진 결합제(예를 들어, IL-11/IL-11 함유 복합체, 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제)의 능력은 예를 들어, 결합제의 존재 하에, 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 결합제의 인큐베이션 후에 상호작용의 분석에 의해 결정될 수 있다. 주어진 결합제가 2개 상호작용 파트너 사이의 상호작용을 저해할 수 있는지의 여부를 결정하기에 적합한 검정의 일례는 경쟁 ELISA이다.
주어진 상호작용(예를 들어, IL-11과 IL-11Rα 사이, 또는 IL-11과 gp130 사이, 또는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이, 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이)을 저해할 수 있는 결합제는, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) 상호작용의 수준과 비교하여, 결합제의 존재 하에 - 또는 상호작용 파트너 중 하나 또는 둘 다와 결합제의 인큐베이션 후에 - 상호작용 파트너 사이의 상호작용의 수준의 감소/저하를 관찰함으로써 식별된다. 적합한 분석은 시험관내에서, 예를 들어, 재조합 상호작용 파트너를 사용하거나 상호작용 파트너를 발현하는 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 상호작용 파트너를 발현하는 세포는 내인성적으로 그렇게 수행할 수 있거나, 세포 내로 도입된 핵산으로부터 그렇게 수행할 수 있다. 이러한 검정의 목적을 위해, 상호작용 파트너 및/또는 결합제 중 하나 또는 둘 다는 상호작용의 수준을 검출하고/거나 측정하는 목적을 위해 검출 가능한 엔터티(entity)로 표지되거나 이와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 제제는 방사성 원자 또는 착색된 분자 또는 형광 분자 또는 임의의 다른 방식으로 쉽게 검출될 수 있는 분자로 표지될 수 있다. 적합한 검출 가능한 분자는 형광 단백질, 루시퍼라제, 효소 기질, 및 방사성표지를 포함한다. 결합제는 검출 가능한 표지로 직접 표지될 수 있거나 결합제는 간접적으로 표지될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 비표지되고, 그 자체가 표지되는 또 다른 결합제에 의해 검출될 수 있다. 대안적으로, 제2 결합제는 여기에 비오틴이 결합되어 있을 수 있고, 표지된 스트렙타비딘이 비오틴에 결합하는 것은 제2 결합제를 간접적으로 표지하는 데 사용될 수 있다.
2개 결합 파트너 사이의 상호작용을 저해하는 결합제의 능력은 또한, 이러한 상호작용의 다운스트림 기능적 결과, 예를 들어, IL-11-매개 신호화의 분석에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이 또는 IL-11:IL-11Rα와 gp130 사이의 상호작용의 다운스트림 기능적 결과는 예를 들어, IL-11에 의해 매개되는 과정, 또는 예를 들어, 콜라겐 또는 IL-11의 유전자/단백질 발현을 포함할 수 있다.
IL-11 또는 IL-11 함유 복합체와 IL-11에 대한 수용체 사이의 상호작용의 저해는 3H-티미딘 혼입 및/또는 Ba/F3 세포 증식 검정, 예컨대 예를 들어, 문헌[Curtis 등. Blood, 1997, 90(11)] 및 문헌[Karpovich 등. Mol. Hum. Reprod. 2003 9(2): 75-80]에 기재된 것을 사용하여 분석될 수 있다. Ba/F3 세포는 IL-11Rα 및 gp130을 공동-발현한다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11과 IL-11Rα:gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 결합제는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 결합제의 존재 하에서의) IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 결합제는 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용을, 결합제의 부재 하에서의 IL-11:IL-11Rα 복합체와 gp130 사이의 상호작용의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
IL-11 또는 IL-11 수용체의 발현을 감소시킬 수 있는 제제
본 발명의 양태에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있다.
발현은 유전자 또는 단백질 발현일 수 있고, 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 잘 알려질 당업계의 방법에 의해 결정될 수 있다. 발현은 대상체의 세포/조직/기관/기관계에 의한 것일 수 있다.
적합한 제제는 임의의 종류일 수 있으나, 일부 구현예에서, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 저분자 또는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다.
IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 유전자의 전사를 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 전사-후 가공을 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 안정성을 감소시키는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 인코딩하는 RNA의 분해를 촉진하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 번역-후 가공을 저해하는 것, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 안정성을 감소시키는 것 또는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 폴리펩타이드의 분해를 촉진하는 것을 통해 그렇게 수행할 수 있다.
문헌[Taki 등. Clin Exp Immunol (1998) Apr; 112(1): 133-138]은 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone) 또는 인터페론-감마(IFNγ; interferon-gamma)에 의한 치료 시 류마티스성 활막(rheumatoid synovial) 세포 내 IL-11의 발현의 감소를 보고하였다.
본 발명은 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 방지/감소시키기 위한 안티센스 핵산의 용도를 고려한다. 일부 구현예에서, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제는 RNA 간섭(RNAi)에 의해 감소된 발현을 야기할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 저해성(inhibitory) 핵산, 예컨대 shRNA 또는 siRNA를 포함하지만 이로 제한되지 않는 안티센스 또는 작은 간섭 RNA일 수 있다.
일부 구현예에서, 저해성 핵산은 벡터에서 제공된다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제제는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 중 하나 이상에 대한 shRNA를 인코딩하는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
올리고뉴클레오타이드 분자, 특히 RNA는 유전자 발현을 조절하기 위해 이용될 수 있다. 이는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(siRNA)에 의한 mRNA의 표적화된 분해, 전사 후 유전자 침묵(PTG), 마이크로-RNA(miRNA)에 의한 mRNA의 발달적으로 조절된 서열-특이적 번역 억제, 및 표적화된 전사적 유전자 침묵을 포함한다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 상보적 서열 결합에 의해 표적 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, mRNA를 표적화하고 이에 결합하는, 바람직하게는 단일-가닥의, 올리고뉴클레오타이드이다. 표적 올리고뉴클레오타이드가 mRNA인 경우, mRNA에의 안티센스의 결합은 mRNA의 번역 및 유전자 생성물의 발현을 차단한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는, 센스 게놈 핵산에 결합하고 표적 뉴클레오타이드 서열의 전사를 저해하도록 설계될 수 있다.
IL-11, IL-11Rα 및 gp130에 대한 기지의 핵산 서열(예를 들어, 수탁 번호: BC012506.1 GI:15341754(인간 IL-11), BC134354.1 GI:126632002(마우스 IL-11), AF347935.1 GI:13549072(래트 IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(인간 IL-11Rα), NM_001163401.1 GI:254281268(마우스 IL-11Rα), NM_139116.1 GI:20806172(래트 IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(인간 gp130), NM_010560.3 GI:225007624(마우스 gp130), NM_001008725.3 GI:300244570(래트 gp130) 하에 GenBank로부터 입수 가능한 기지의 mRNA 서열)의 측면에서, 올리고뉴클레오타이드는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 억제시키거나 침묵화시키도록 설계될 수 있다.
이러한 올리고뉴클레오타이드는 임의의 길이일 수 있으나, 바람직하게는 짧으며, 예를 들어, 100개 미만의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 10-40개 뉴클레오타이드, 또는 20-50개 뉴클레오타이드일 수 있고, 표적 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 mRNA 내 상응하는 길이의 뉴클레오타이드 서열과 완전-상보성 또는 근(near)-상보성(예를 들어, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 상보성)을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오타이드 서열의 상보적 영역은 임의의 길이일 수 있으나, 바람직하게는 적어도 5개, 선택적으로 50개 이하 뉴클레오타이드, 예를 들어, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 또는 50개 뉴클레오타이드 중 하나의 길이이다.
IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현의 억제는 바람직하게는, 세포/조직/기관/기관계/대상체에 의해 발현되는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 양의 저하를 초래할 것이다. 예를 들어, 주어진 세포에서, 적합한 핵산의 투여에 의한 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 억제는, 비처리된 세포에 비해 해당 세포에 의해 발현되는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 양의 저하를 초래할 것이다. 바람직한 억제 정도(degree)는 적어도 50%, 더욱 바람직하게는 적어도 60%, 70%, 80%, 85% 또는 90% 중 하나이다. 90% 내지 100%의 억제 수준이 발현 또는 기능의 '침묵화'인 것으로 여겨진다.
특정 염색체 좌위에서 이질염색질 복합체의 표적화 및 후성 유전자(epigenetic gene) 침묵화에 있어서 RNAi 머시너리 및 작은 RNA의 역할이 실증되었다. RNA 간섭(RNAi)으로도 알려져 있는 이중-가닥 RNA(dsRNA)-의존적 전사 후 침묵은, dsRNA 복합체가 단기간 내에 침묵화를 위한 상동성의 특정 유전자를 표적화할 수 있는 현상이다. 이는 서열 동일성을 갖는 mRNA의 분해를 촉진하기 위한 신호로서 작용한다. 20-nt siRNA는 일반적으로, 유전자-특이적 침묵화를 유도하기에 충분히 길지만, 숙주 반응을 피하기에는 충분히 짧다. 표적화된 유전자 생성물의 발현의 저하는 siRNA의 몇몇 분자에 의해 유도되는 90% 침묵화로 광범위할 수 있다. RNAi 기반 치료제는 많은 적응증(indication)을 위한 I, II 및 III상 임상 시험으로 진행되었다(문헌[Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433]).
당업계에서, 이러한 RNA 서열은 이의 기원에 따라 "짧은 또는 작은 간섭 RNA"(siRNA) 또는 "microRNA"(miRNA)라고 한다. 두 유형의 서열 모두, 상보적 RNA에 결합하고 mRNA 제거(RNAi)를 유도하거나 단백질로의 mRNA 번역을 저지함으로써 유전자 발현을 하향조절하는 데 사용될 수 있다. siRNA는 길이가 긴 이중 가닥 RNA의 가공에 의해 유래되고, 자연 상에서 발견될 때 전형적으로 외인성 기원이다. 마이크로-간섭 RNA(miRNA)는 짧은 헤어핀의 가공에 의해 유래되는 내인성적으로 인코딩된 작은 비-코딩 RNA이다. siRNA와 miRNA 둘 다, RNA 절단 없이 부분적으로 상보적인(complimentary) 표적 서열을 보유하는 mRNA의 번역을 저해하고, 완전히 상보적인 서열을 보유하는 mRNA를 분해할 수 있다.
siRNA 리간드는 전형적으로 이중 가닥이고, 표적 유전자의 기능의 RNA 매개 하향조절의 효과성을 최적화하기 위해, siRNA의 길이는, siRNA에 의한 mRNA 표적의 인식을 매개하는 RISC 복합체에 의한 siRNA의 올바른 인식을 보장하도록 선택되고, 따라서 siRNA는 숙주 반응을 감소시키기에 충분히 짧은 것이 바람직하다.
miRNA 리간드는 전형적으로 단일 가닥이고, 부분적으로 상보적이어서 리간드가 헤어핀을 형성하는 것을 가능하게 하는 영역을 갖는다. miRNA는 DNA로부터 전사되지만 단백질로 번역되지 않는 RNA 유전자이다. miRNA 유전자를 코딩하는 DNA 서열은 miRNA보다 더 길다. 이러한 DNA 서열은 miRNA 서열 및 근사 역보체(approximate reverse complement)를 포함한다. 이러한 DNA 서열이 단일 가닥 DNA 분자로 전사될 때, miRNA 서열 및 이의 역보체는 염기쌍을 이루어, 부분적으로 이중 가닥인 RNA 분절(segment)을 형성한다. 마이크로RNA 서열의 설계는 문헌[John 등, PLoS Biology, 11(2), 1862-1879, 2004]에 논의되어 있다.
전형적으로, siRNA 또는 miRNA의 효과를 모방하고자 하는 RNA 리간드는 10 내지 40개 리보뉴클레오타이드(또는 이의 합성 유사체), 더욱 바람직하게는 17 내지 30개 리보뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 19 내지 25개 리보뉴클레오타이드, 가장 바람직하게는 21 내지 23개 리보뉴클레오타이드를 갖는다. 이중 가닥 siRNA를 이용하는 본 발명의 일부 구현예에서, 분자는 예를 들어, 1 또는 2개의 (리보)뉴클레오타이드의 대칭적인 3' 오버행, 전형적으로 dTdT 3' 오버행의 UU를 가질 수 있다. 본원에 제공된 개시내용에 기초하여, 당업자는 예를 들어, Ambion siRNA 파인더(finder)와 같은 자원(resource)을 사용하여 적합한 siRNA 및 miRNA 서열을 쉽게 설계할 수 있다. siRNA 및 miRNA 서열은 합성적으로 생성되고 외인성적으로 첨가되어 유전자 하향조절을 야기하거나, 발현 시스템(예를 들어, 벡터)을 사용하여 생성될 수 있다. 바람직한 구현예에서, siRNA는 합성적으로 합성된다.
더 긴 이중 가닥 RNA는 세포에서 가공되어 siRNA를 생성할 수 있다(예를 들어, 문헌[Myers (2003) Nature Biotechnology 21:324-328] 참조). 더 긴 dsRNA 분자는 예를 들어, 1 또는 2개의 (리보)뉴클레오타이드의 대칭적인 3' 또는 5' 오버행을 가질 수 있거나, 평활 단부(blunt end)를 가질 수 있다. 더 긴 dsRNA 분자는 25개 뉴클레오타이드 이상일 수 있다. 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 25 내지 30개 뉴클레오타이드 길이이다. 더욱 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 25 내지 27개 뉴클레오타이드 길이이다. 가장 바람직하게는, 더 긴 dsRNA 분자는 27개 뉴클레오타이드 길이이다. 30개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 dsRNA는 벡터 pDECAP를 사용하여 발현될 수 있다(문헌[Shinagawa 등, Genes and Dev., 17, 1340-5, 2003]).
또 다른 대안은 세포에서 짧은 헤어핀 RNA 분자(shRNA)의 발현이다. shRNA는 합성 siRNA보다 더 안정하다. shRNA는 작은 루프 서열에 의해 분리된 짧은 인버트 반복부(inverted repeat)로 구성된다. 하나의 인버트 반복부는 유전자 표적에 상보적이다. 세포에서, shRNA는 다이서(DICER)에 의해 siRNA로 가공되며, 이는 표적 유전자 mRNA를 분해하고 발현을 억제시킨다. 바람직한 구현예에서, shRNA는 벡터로부터 전사에 의해 내인성적으로(세포 내에서) 생성된다. shRNA는 세포 내에서, RNA 폴리머라제 III 프로모터, 예컨대 인간 H1 또는 7SK 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 II 프로모터의 제어 하에 shRNA 서열을 인코딩하는 벡터로 세포를 형질주입함으로써 생성될 수 있다. 대안적으로, shRNA는 벡터로부터 전사에 의해 외인성적으로(시험관내에서) 합성될 수 있다. 그 후에, shRNA는 세포 내로 직접 도입될 수 있다. 바람직하게는, shRNA 분자는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 부분 서열을 포함한다. 바람직하게는, shRNA 서열은 40 내지 100개 염기 길이, 더욱 바람직하게는 40 내지 70개 염기 길이이다. 헤어핀의 스템(stem)은 바람직하게는 19 내지 30개 염기쌍 길이이다. 스템은 G-U 쌍형성(pairing)을 함유하여, 헤어핀 구조를 안정화시킬 수 있다.
siRNA 분자, 더 긴 dsRNA 분자(longer dsRNA molecule) 또는 miRNA 분자는 바람직하게는 벡터 내에 함유된 핵산 서열의 전사에 의해 재조합적으로 만들어질 수 있다. 바람직하게는, siRNA 분자, 더 긴 dsRNA 분자 또는 miRNA 분자는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 부분 서열을 포함한다.
일 구현예에서, siRNA, 더 긴 dsRNA 또는 miRNA는 벡터로부터 전사에 의해 내인성적으로(세포 내에서) 생성된다. 벡터는 당업계에 알려진 임의의 방식으로 세포 내로 도입될 수 있다. 선택적으로, RNA 서열의 발현은 조직 특이적(예를 들어, 심장, 간, 또는 신장 특이적) 프로모터를 사용하여 조절될 수 있다. 추가 구현예에서, siRNA, 더 긴 dsRNA 또는 miRNA는 벡터로부터 전사에 의해 외인성적으로(시험관내에서) 생성된다.
적합한 벡터는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 억제를 할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 제제를 발현하도록 배치된 올리고뉴클레오타이드 벡터일 수 있다. 이러한 벡터는 바이러스 벡터 또는 플라스미드 벡터일 수 있다. 치료적 올리고뉴클레오타이드는 바이러스 벡터의 게놈에 혼입되고, 이의 발현을 구동하는 조절 서열, 예를 들어, 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된"은, 선택된 뉴클레오타이드 서열 및 조절 뉴클레오타이드 서열이 공유적으로 연결되어 조절 서열의 영향 또는 제어 하에 뉴클레오타이드 서열의 발현을 일어나게 하는 상황을 포함할 수 있다. 그러므로, 조절 서열은, 선택된 뉴클레오타이드 서열 중 파트 또는 모두를 형성하는 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절 서열이 수행할 수 있다면, 선택된 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된다.
프로모터-발현된 siRNA 서열을 인코딩하는 바이러스 벡터는 당업계에 알려져 있고, 치료적 올리고뉴클레오타이드의 장기간 발현의 이익을 갖는다. 예는 렌티바이러스(문헌[Nature 2009 Jan 22; 457(7228):426-433]), 아데노바이러스(문헌[Shen 등, FEBS Lett 2003 Mar 27;539(1-3)111-4]) 및 레트로바이러스(문헌[Barton and Medzhitov PNAS November 12, 2002 vol.99, no.23 14943-14945])를 포함한다.
다른 구현예에서, 벡터는, IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 발현의 억제가 필요한 부위로의 치료적 올리고뉴클레오타이드의 전달을 돕도록 배치될 수 있다. 이러한 벡터는 전형적으로, 올리고뉴클레오타이드를 양으로 하전된 벡터(예를 들어, 양이온성 세포 투과성(penetrating) 펩타이드, 양이온성 중합체 및 덴드리머, 및 양이온성 지질)와 복합체화시키는 것; 올리고뉴클레오타이드를 저분자(예를 들어, 콜레스테롤, 담즙산, 및 지질), 중합체, 항체, 및 RNA와 접합시키는 것; 또는 올리고뉴클레오타이드를 나노미립자 제형에서 캡슐화하는 것(문헌[Wang 등, AAPS J. 2010 Dec; 12(4): 492-503)을 수반한다.
일 구현예에서, 벡터는 핵산 서열을 센스 배향과 안티센스 배향 둘 다에서 포함할 수 있어서, RNA로서 발현될 때, 센스 구획 및 안티센스 구획은 회합되어 이중 가닥 RNA를 형성할 것이다.
대안적으로, siRNA 분자는 당업계에 알려진 표준 고체상 또는 용액상 합성 기법을 사용하여 합성될 수 있다. 뉴클레오타이드 사이의 연결은 포스포디에스테르 결합일 수 있거나, 대안적으로, 예를 들어, 화학식 P(O)S, (티오에이트); P(S)S, (디티오에이트); P(O)NR'2; P(O)R'; P(O)OR6; CO; 또는 CONR'2의 연결기(linking group)는 -O- 또는 -S-를 통해 인접 뉴클레오타이드에 접합되며, 여기서, R은 H(또는 염) 또는 알킬(1-12C)이고 R6은 알킬(1-9C)이다.
천연 발생 염기 이외의 변형된 뉴클레오타이드 염기가 사용될 수 있으며, 이를 함유하는 siRNA 분자에 유리한 특성을 부여할 수 있다.
예를 들어, 변형된 염기는 siRNA 분자의 안정성을 증가시켜, 침묵화에 필요한 양을 감소시킬 수 있다. 변형된 염기의 제공 또한, 비변형된 siRNA보다 더욱 안정하거나 덜 안정한 siRNA 분자를 제공할 수 있다.
용어 '변형된 뉴클레오타이드 염기'는 공유적으로 변형된 염기 및/또는 당을 갖는 뉴클레오타이드를 포괄한다. 예를 들어, 변형된 뉴클레오타이드는, 3' 위치에서 하이드록실기 이외의 그리고 5' 위치에서 포스페이트기 이외의 저분자량 유기 기에 공유적으로 부착된 당을 갖는 뉴클레오타이드를 포함한다. 그러므로, 변형된 뉴클레오타이드는 또한, 2' 치환된 당, 예컨대 2'-O-메틸-; 2'-O-알킬; 2'-O-알릴; 2'-S-알킬; 2'-S-알릴; 2'-플루오로-; 2'-할로 또는 아지도-리보스, 카르복실릭 당 유사체, a-아노머(anomeric) 당; 에피머(epimeric) 당, 예컨대 아라비노스, 자일로스 또는 릭소스(lyxose), 피라노스 당, 푸라노스 당, 및 세도헵툴로스를 포함할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드는 당업계에 알려져 있으며, 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 및 피리미딘, 및 다른 헤테로사이클을 포함한다. 이들 부류의 피리미딘 및 퓨린은 당업계에 알려져 있으며, 슈도이소시토신, N4,N4-에타노시토신, 8-하이드록시-N6-메틸아데닌, 4-아세틸시토신, 5-(카르복시하이드록실메틸) 우라실, 5 플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸-2-티오우라실, 5-카르복시메틸아미노메틸 우라실, 디하이드로우라실, 이노신, N6-이소펜틸-아데닌, 1-메틸아데닌, 1-메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 2,2-디메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-메틸아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸 우라실, 5-메톡시 아미노 메틸-2-티오우라실, -D-만노실쿼오신(queosine), 5-메톡시카르보닐메틸우라실, 5메톡시우라실, 2 메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산 메틸 에스테르, 슈도우라실, 2-티오시토신, 5-메틸-2 티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5메틸우라실, N-우라실-5-옥시아세트산 메틸에스테르, 우라실 5-옥시아세트산, 쿼오신, 2-티오시토신, 5-프로필우라실, 5-프로필시토신, 5-에틸우라실, 5-에틸시토신, 5-부틸우라실, 5-펜틸우라실, 5-펜틸시토신, 및 2,6,디아미노퓨린, 메틸슈도우라실, 1-메틸구아닌, 1-메틸시토신을 포함한다.
씨. 엘레간스(C. elegans), 초파리, 식물 및 포유류에서의 유전자를 침묵화시키기 위한 RNAi의 용도에 관한 방법은 당업계에 알려져 있다(문헌[Fire A, 등, 1998 Nature 391:806-811]; 문헌[Fire, A. Trends Genet. 15, 358-363 (1999)]; 문헌[Sharp, P. A. RNA interference 2001. Genes Dev. 15, 485-490 (2001)]; 문헌[Hammond, S. M., 등, Nature Rev. Genet. 2, 110-1119 (2001)]; 문헌[Tuschl, T. Chem. Biochem. 2, 239-245 (2001)]; 문헌[Hamilton, A. 등, Science 286, 950-952 (1999)]; 문헌[Hammond, S. M., 등, Nature 404, 293-296 (2000)]; 문헌[Zamore, P. D., 등, Cell 101, 25-33 (2000)]; 문헌[Bernstein, E., 등, Nature 409, 363-366 (2001)]; 문헌[Elbashir, S. M., 등, Genes Dev. 15, 188-200 (2001)]; WO0129058; WO9932619, 및 문헌[Elbashir S M, 등, 2001 Nature 411:494-498]).
이에, 본 발명은 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130을 발현하는 포유류, 예를 들어, 인간 세포 내로 적합하게 도입되거나 그 내에서 발현될 때, RNAi에 의해 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 제공한다.
IL-11, IL-11Rα 및 gp130에 대한 핵산 서열(예를 들어, 수탁 번호: BC012506.1 GI:15341754(인간 IL-11), BC134354.1 GI:126632002(마우스 IL-11), AF347935.1 GI:13549072(래트 IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(인간 IL-11Rα), NM_001163401.1 GI:254281268(마우스 IL-11Rα), NM_139116.1 GI:20806172(래트 IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(인간 gp130), NM_010560.3 GI:225007624(마우스 gp130), NM_001008725.3 GI:300244570(래트 gp130) 하에 GenBank로부터 입수 가능한 기지의 mRNA 서열) 올리고뉴클레오타이드는 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130의 발현을 억제시키거나 침묵화시키도록 설계될 수 있다.
핵산은 예를 들어, GenBank 수탁 번호 NM_000641.3 GI:391353405(IL-11), NM_001142784.2 GI:391353394(IL-11Rα), NM_001190981.1 GI:300244534(gp130) 하에 정의된 바와 같은 IL-11, IL-11Rα 또는 gp130 mRNA, 또는 상기 mRNA에 대한 상보적 서열의 일부와 실질적인 서열 동일성을 가질 수 있다.
핵산은 이중 가닥 siRNA일 수 있다(당업자가 이해할 바와 같이 그리고 하기에서 추가로 설명되는 바와 같이, siRNA 분자는 짧은 3' DNA 서열을 또한 포함할 수 있음).
대안적으로, 핵산은 DNA(통상 이중 가닥 DNA)일 수 있으며, 이는 포유류 세포에서 전사될 때, 스페이서(spacer)를 통해 결합된 2개의 상보적 부분을 갖는 RNA를 산출하여, RNA는 상보적 부분이 서로 혼성화될 때 헤어핀의 형태를 취한다. 포유류 세포에서, 헤어핀 구조는 효소 다이서에 의해 분자로부터 절단되어, 2개의 별개의 그러나 혼성화된 RNA 분자를 산출할 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 핵산은 일반적으로, SEQ ID NO 4 내지 7(IL-11) 중 하나의 서열 또는 SEQ ID NO 8 내지 11(IL-11Rα) 중 하나로 표적화된다.
mRNA 전사물(transcript)의 단지 단일 가닥(즉, 비(non) 자가-혼성화된) 영역은 RNAi에 적합한 표적인 것으로 예상된다. 따라서, SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나로 표시된 서열에 대해 IL-11 또는 IL-11Rα mRNA 전사물에서 매우 근접한 다른 서열 또한, RNAi에 대한 적합한 표적일 수 있는 것으로 제안된다. 이러한 표적 서열은 바람직하게는 17-23개 뉴클레오타이드 길이이고, 바람직하게는 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나와 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 또는 모든 19개 뉴클레오타이드만큼(SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나의 어느 단부에서) 중첩된다.
이에, 본 발명은, IL-11 또는 IL-11Rα를 발현하는 포유류 세포 내로 적합하게 도입되거나 그 내에서 발현될 때, RNAi에 의해 IL-11 또는 IL-11Rα 발현을 억제시킬 수 있는 핵산을 제공하며, 여기서 핵산은 일반적으로 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나의 서열로 표적화된다.
"일반적으로 표적화된"이란, 핵산이 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11과 중첩되는 서열을 표적화할 수 있다. 특히, 핵산은, SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나보다 약간 더 길거나 더 짧은(바람직하게는 17 내지 23개 뉴클레오타이드 길이), 그렇지 않으면 SEQ ID NO 4 내지 7 또는 8 내지 11 중 하나와 동일한 인간 IL-11 또는 IL-11Rα의 mRNA 내의 서열을 표적화할 수 있다.
본 발명의 핵산과 표적 서열 사이의 완벽한 동일성/상보성은 바람직하긴 하지만, 필수적이지는 않은 것으로 예상된다. 이에, 본 발명의 핵산은 IL-11 또는 IL-11Rα의 mRNA와 비교하여 단일 미스매치를 포함할 수 있다. 그러나, 심지어 단일 미스매치의 존재는 감소된 효율을 유발하는 경향이 있어서, 미스매치의 부재가 바람직한 것으로 예상된다. 존재할 때, 3' 오버행은 미스매치의 수를 고려할 때 배제될 수 있다.
용어 "상보성"은 천연 발생 리보- 및/또는 데옥시리보뉴클레오타이드로 구성된 핵산 사이의 종래의 염기쌍 형성으로 제한되지 않을 뿐만 아니라 비-천연 뉴클레오타이드를 포함하는 본 발명의 mRNA와 핵산 사이의 염기쌍 형성을 포함한다.
일 구현예에서, 핵산(본원에서 이중 가닥 siRNA로 지칭됨)은 SEQ ID NO 12 내지 15로 표시된 이중 가닥 RNA 서열을 포함한다. 또 다른 구현예에서, 핵산(본원에서 이중 가닥 siRNA로 지칭됨)은 SEQ ID NO 16 내지 19로 표시된 이중 가닥 RNA 서열을 포함한다.
그러나, 또한, IL-11 또는 IL-11Rα mRNA의 동일한 영역에 관하여 약간 더 짧거나 더 긴 서열이 또한 효과적일 것으로 예상된다. 특히, 17 내지 23 bp 길이의 이중 가닥 서열이 또한 효과적일 것으로 예상된다.
이중 가닥 RNA를 형성하는 가닥은 짧은 3' 디뉴클레오타이드 오버행을 가질 수 있으며, 이는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 3' DNA 오버행의 사용은 3' RNA 오버행과 비교하여 siRNA 활성에 어떠한 효과도 갖지 않지만, 핵산 가닥의 화학적 합성의 비용을 감소시킨다(Elbashir 등, 2001c). 이러한 이유에서, DNA 디뉴클레오타이드가 바람직할 수 있다.
존재할 때, 디뉴클레오타이드 오버행은 서로 대칭적일 수 있지만, 필수적이지는 않다. 사실상, 센스(상단) 가닥의 3' 오버행은 이것이 mRNA 인식 및 분해에 참여하지 않기 때문에 RNAi 활성과 무관하다(문헌[Elbashir 등, 2001a, 2001b, 2001c]).
초파리에서의 RNAi 실험이, 안티센스 3' 오버행이 mRNA 인식 및 표적화에 참여할 수 있음을 나타내긴 하지만(Elbashir 등. 2001c), 3' 오버행은 포유류 세포에서 siRNA의 RNAi 활성에 필요한 것으로 보이지 않는다. 따라서, 3' 오버행의 올바르지 않은 어닐링(annealing)은 포유류 세포에서 거의 효과를 갖지 않는 것으로 생각된다(문헌[Elbashir 등. 2001c; Czauderna 등. 2003]).
따라서, 임의의 디뉴클레오타이드 오버행은 siRNA의 안티센스 가닥에 사용될 수 있다. 그렇지만, 디뉴클레오타이드는 바람직하게는 -UU 또는 -UG(또는 오버행이 DNA라면 -TT 또는 -TG), 더욱 바람직하게는 -UU(또는 -TT)이다. -UU(또는 -TT) 디뉴클레오타이드 오버행이 가장 효과적이고, 전사 신호(종결자 신호는 TTTTT임)의 RNA 폴리머라제 III 단부와 일관된다(즉, 이의 파트를 형성할 수 있음). 이에, 이러한 디뉴클레오타이드가 가장 바람직하다. 디뉴클레오타이드 AA, CC 및 GG가 또한 사용될 수 있지만, 덜 효과적이고 결과적으로 덜 바람직하다.
더욱이, 3' 오버행은 siRNA로부터 전적으로 생략될 수 있다.
본 발명은 또한, 바람직하게는 3'-오버행을 갖지만 선택적으로 갖지 않는, 각각 상기 언급된 이중 가닥 핵산 중 하나의 성분 가닥으로 구성된 단일 가닥 핵산(본원에서 단일 가닥 siRNA로 지칭됨)을 제공한다. 본 발명은 또한, 시험관내에서 서로 혼성화하여 상기 언급된 이중 가닥 siRNA를 형성할 수 있는 이러한 단일 가닥 핵산의 쌍을 함유하는 키트를 제공하며, 이는 그 후에 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 또한, 예를 들어, SEQ ID NO: 12 내지 15 또는 16 내지 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 서열 또는 상기 언급된 서열 중 임의의 하나로부터 단일 염기쌍 치환에 의해 상이한 서열을 포함하여 포유류 세포에서 전사될 때, 자가-혼성화하여 이중 가닥 모티프를 생성할 수 있는 2개의 상보적 부분을 갖는 RNA(본원에서 또한 shRNA로 지칭됨)를 산출하는 DNA를 제공한다.
상보적 부분은 일반적으로 스페이서에 의해 결합될 것이며, 이러한 스페이서는 2개의 상보적 부분이 서로 혼성화하도록 적합한 길이 및 서열을 갖는다. 2개의 상보적(즉, 센스 및 안티센스) 부분은 어느 순서로 5'-3' 결합될 수 있다. 스페이서는 전형적으로, 대략 4-12개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 4-9개 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 6-9개 뉴클레오타이드의 짧은 서열일 것이다.
바람직하게는 스페이서의 5' 단부(업스트림 상보적 부분의 바로 3')는 뉴클레오타이드 -UU- 또는 -UG-, 또한 바람직하게는 -UU-로 구성된다(또한 이들 특정 디뉴클레오타이드의 사용이 필수적이지는 않긴 함). OligoEngine(Seattle, Washington, USA)의 pSuper 시스템에 사용하도록 권고된 적합한 스페이서는 UUCAAGAGA이다. 이러한 경우 및 다른 경우에, 스페이서의 단부는 서로 혼성화되어, 예를 들어, SEQ ID NO 12 내지 15 또는 16 내지 19의 정확한 서열을 적은 수(예를 들어, 1 또는 2개)의 염기쌍만큼 지나 이중 가닥 모티프를 신장시킬 수 있다.
유사하게는, 전사된 RNA는 바람직하게는 다운스트림 상보적 부분으로부터의 3' 오버행을 포함한다. 다시, 이는 바람직하게는 -UU 또는 -UG, 더욱 바람직하게는 -UU이다.
그 후에, 이러한 shRNA 분자는 포유류 세포에서 효소 다이서에 의해 절단되어, 상기 기재된 바와 같이 이중 가닥 siRNA를 산출할 수 있으며, 여기서 혼성화된 dsRNA 중 하나 또는 각각의 가닥은 3' 오버행을 포함한다.
본 발명의 핵산의 합성을 위한 기법은 당연하게도, 당업계에 잘 알려져 있다.
당업자는, 잘 알려진 기법 및 상업적으로 입수 가능한 물질을 사용하여 본 발명의 DNA에 적합한 전사 벡터를 잘 작제할 수 있다. 특히, DNA는 프로모터 및 전사 종결 신호를 포함한 제어 서열과 회합될 것이다.
특히 적합성은 OligoEngine(Seattle, Washington, USA)의 상업적으로 입수 가능한 pSuper 및 pSuperior 시스템이다. 이들은 폴리머라제-III 프로모터(H1), 및 전사물의 3' 단부에서 2개의 U 잔기를 기여하는 T5 전사 종결자 서열을 사용한다(이는 다이서 가공 후, siRNA의 하나의 가닥의 3' UU 오버행을 제공함).
또 다른 적합한 시스템은 문헌[Shin 등. (RNA, 2009 May; 15(5): 898-910)]에 기재되어 있으며, 또 다른 폴리머라제-III 프로모터(U6)를 사용한다.
본 발명의 이중 가닥 siRNA는 하기 기재된 바와 같이 기지의 기법을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 포유류 세포 내로 도입되어, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시킬 수 있다.
유사하게는, 본 발명의 DNA를 함유하는 전사 벡터는 RNA의 일시적인 또는 안정한 발현을 위해 하기 기재된 바와 같이 기지의 기법을 사용하여 시험관내에서 또는 생체내에서 종양 세포 내로 도입되어, 또한 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시킬 수 있다.
이에, 본 발명은 또한, 포유류, 예를 들어, 인간, 세포에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 억제시키는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 세포에 투여하는 단계를 포함한다.
유사하게는, 나아가 본 발명은 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
나아가, 본 발명은 치료 방법, 바람직하게는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하는 방법에 사용하기 위한, 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 제공한다.
나아가, 본 발명은 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료를 위한 약제의 제조에 있어서, 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터의 용도를 제공한다.
나아가, 본 발명은 본 발명의 이중 가닥 siRNA 또는 본 발명의 전사 벡터를 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 포함하는 조성물을 제공한다. 적합한 담체는 친유성 담체 또는 비히클을 포함하며, 이는 세포막의 투과를 도울 수 있다.
본 발명의 siRNA 듀플렉스 및 DNA 벡터의 투여에 적합한 물질 및 방법은 당업계에 잘 알려져 있고, 향상된 방법이 RNAi 기술의 잠재력을 고려하여 개발 하에 있다.
일반적으로, 핵산을 포유류 세포 내로 도입하기 위해 많은 기법이 이용 가능하다. 기법의 선택 은, 핵산이 시험관내에서 배양된 세포 내로 또는 생체내에서 환자의 세포에 이전되는지의 여부에 의존할 것이다. 시험관내에서 핵산을 포유류 세포 내로 이전시키기에 적합한 기법은 리포솜, 전기천공, 현미주사(microinjection), 세포 융합, DEAE, 덱스트란 및 칼슘 포스페이트 침전의 사용을 포함한다. 생체내 유전자 이전 기법은 바이러스(전형적으로 레트로바이러스) 벡터에 의한 형질주입 및 바이러스 외피 단백질-리포솜 매개 형질주입(문헌[Dzau 등. (2003) Trends in Biotechnology 11, 205-210])을 포함한다.
특히, 본 발명의 핵산을 시험관내와 생체내 둘 다에서 세포내 투여하기에 적합한 기법은 하기 논문에 개시되어 있다:
일반적인 검토: 문헌[Borkhardt, A. 2002. Blocking oncogenes in malignant cells by RNA interference--new hope for a highly specific cancer treatment? Cancer Cell. 2:167-8]. 문헌[Hannon, G.J. 2002. RNA interference. Nature. 418:244-51]. 문헌[McManus, M.T., and P.A. Sharp. 2002. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nat Rev Genet. 3:737-47]. 문헌[Scherr, M., M.A. Morgan, and M. Eder. 2003b. Gene silencing mediated by small interfering RNAs in mammalian cells. Curr Med Chem. 10:245-56]. 문헌[Shuey, D.J., D.E. McCallus, and T. Giordano. 2002. RNAi: gene-silencing in therapeutic intervention. Drug Discov Today. 7:1040-6].
리포솜을 사용한 전신 전달: 문헌[Lewis, D.L., J.E. Hagstrom, A.G. Loomis, J.A. Wolff, and H. Herweijer. 2002. Efficient delivery of siRNA for inhibition of gene expression in postnatal mice. Nat Genet. 32:107-8]. 문헌[Paul, C.P., P.D. Good, I. Winer, and D.R. Engelke. 2002. Effective expression of small interfering RNA in human cells. Nat Biotechnol. 20:505-8]. 문헌[Song, E., S.K. Lee, J. Wang, N. Ince, N. Ouyang, J. Min, J. Chen, P. Shankar, and J. Lieberman. 2003. RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis. Nat Med. 9:347-51]. 문헌[Sorensen, D.R., M. Leirdal, and M. Sioud. 2003. Gene silencing by systemic delivery of synthetic siRNAs in adult mice. J Mol Biol. 327:761-6].
바이러스 매개 이전(virus mediated transfer): 문헌[Abbas-Terki, T., W. Blanco-Bose, N. Deglon, W. Pralong, and P. Aebischer. 2002. Lentiviral-mediated RNA interference. Hum Gene Ther. 13:2197-201]. 문헌[Barton, G.M., and R. Medzhitov. 2002. Retroviral delivery of small interfering RNA into primary cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99:14943-5]. 문헌[Devroe, E., and P.A. Silver. 2002. Retrovirus-delivered siRNA. BMC Biotechnol. 2:15]. 문헌[Lori, F., P. Guallini, L. Galluzzi, and J. Lisziewicz. 2002. Gene therapy approaches to HIV infection. Am J Pharmacogenomics. 2:245-52]. 문헌[Matta, H., B. Hozayev, R. Tomar, P. Chugh, and P.M. Chaudhary. 2003. Use of lentiviral vectors for delivery of small interfering RNA. Cancer Biol Ther. 2:206-10]. 문헌[Qin, X.F., D.S. An, I.S. Chen, and D. Baltimore. 2003. Inhibiting HIV-1 infection in human T cells by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA against CCR5. Proc Natl Acad Sci U S A. 100:183-8]. 문헌[Scherr, M., K. Battmer, A. Ganser, and M. Eder. 2003a. Modulation of gene expression by lentiviral-mediated delivery of small interfering RNA. Cell Cycle. 2:251-7]. 문헌[Shen, C., A.K. Buck, X. Liu, M. Winkler, and S.N. Reske. 2003. Gene silencing by adenovirus-delivered siRNA. FEBS Lett. 539:111-4].
펩타이드 전달: 문헌[Morris, M.C., L. Chaloin, F. Heitz, and G. Divita. 2000. Translocating peptides and proteins and their use for gene delivery. Curr Opin Biotechnol. 11:461-6]. 문헌[Simeoni, F., M.C. Morris, F. Heitz, and G. Divita. 2003. Insight into the mechanism of the peptide-based gene delivery system MPG: implications for delivery of siRNA into mammalian cells. Nucleic Acids Res. 31:2717-24]. siRNA를 표적 세포에 전달하기에 적합할 수 있는 다른 기술은 나노입자 또는 나노캡슐, 예컨대 미국 특허 번호 6,649,192B호 및 5,843,509B호에 기재된 것에 기초한다.
IL-11-매개 신호화의 저해
본 발명의 구현예에서, IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제는 하기 기능적 특성 중 하나 이상을 소유할 수 있다:
· IL-11에 의해 매개되는 신호화의 저해;
· IL-11Rα:gp130 수용체 복합체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화의 저해;
· gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화(즉, IL-11 trans 신호화)의 저해;
· IL-11에 의해 매개되는 과정의 저해;
· IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현의 저해.
이들 특성은 적합한 검정에서 관련 제제의 분석에 의해 결정될 수 있으며, 이러한 검정은 제제와 적합한 대조군 제제의 성능 비교를 수반할 수 있다. 당업자는 주어진 검정에 대한 적절한 제어 조건을 식별할 수 있다.
IL-11-매개 신호화 및/또는 IL-11에 의해 매개되는 과정은 IL-11의 단편 및 IL-11 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩타이드 복합체에 의해 매개되는 신호화를 포함한다. IL-11-매개 신호화는 인간 IL-11 및/또는 마우스 IL-11에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. IL-11에 의해 매개되는 신호화는, IL-11 또는 IL-11 함유 복합체가 결합하는 수용체에 IL-11 또는 상기 복합체가 결합한 후 발생할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 또는 IL-11-함유 복합체의 생물학적 활성을 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들어, IL-11Rα:gp130을 포함하는 수용체를 통한 신호화에 의해 활성화되는 하나 이상의 신호화 경로의 길항제이다. 일부 구현예에서, 제제는, IL-11Rα 및/또는 gp130, 예를 들어, IL-11Rα:gp130을 포함하는 하나 이상의 면역 수용체 복합체를 통한 신호화를 저해할 수 있다. 본 발명의 다양한 양태에서, 본원에 제공된 제제는 IL-11-매개 cis 및/또는 trans 신호화를 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 다양한 양태에 따르면, 본원에 제공된 제제는 IL-11-매개 cis 신호화를 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화를, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 신호화의 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11-매개 신호화를, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 신호화의 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 감소시킬 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화는 IL-11Rα:gp130 수용체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. 이러한 신호화는 예를 들어, IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포를 IL-11로 처리함으로써, 또는 IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 세포에서 IL-11 생성을 자극함으로써 분석될 수 있다.
IL-11-매개 신호화의 저해에 대한 제제의 IC50은, IL-11Rα 및 gp130을 발현하는 Ba/F3 세포를 인간 IL-11 및 제제의 존재 하에 배양하고, DNA 내로의 3H-티미딘 혼입을 측정함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 이러한 검정에서 10 μg/ml 이하, 바람직하게는 ≤ 5 μg/ml, ≤ 4 μg/ml, ≤ 3.5 μg/ml, ≤ 3 μg/ml, ≤ 2 μg/ml, ≤ 1 μg/ml, ≤ 0.9 μg/ml, ≤ 0.8 μg/ml, ≤ 0.7 μg/ml, ≤ 0.6 μg/ml, 또는 ≤ 0.5 μg/ml 중 하나의 IC50을 나타낼 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11-매개 신호화는 gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화일 수 있다. 일부 구현예에서, IL-11:IL-11Rα 복합체, 예를 들어, IL-11Rα의 세포외 도메인과 IL-11의 복합체, 또는 가용성 IL-11Rα 이소형/단편과 IL-11의 복합체는 가용성일 수 있다. 일부 구현예에서, 가용성 IL-11Rα는 IL-11Rα의 가용성(분비된) 이소형이거나, 세포막 결합된 IL-11Rα의 세포외 도메인의 단백질분해성 절단의 유리된 생성물이다.
일부 구현예에서, IL-11:IL-11Rα 복합체는 세포-결합된 것, 예를 들어, 세포-막 결합된 IL-11Rα와 IL-11의 복합체일 수 있다. gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화는, gp130을 발현하는 세포를 IL-11:IL-11Rα 복합체, 예를 들어, 펩타이드 링커에 의해 IL-11Rα의 세포외 도메인, 예를 들어, 하이퍼(hyper) IL-11에 결합된 IL-11을 포함하는 재조합 융합 단백질로 처리함으로써 분석될 수 있다. 하이퍼 IL-11은 IL-11Rα의 단편(도메인 1 내지 3으로 구성된 아미노산 잔기 1 내지 317; UniProtKB: Q14626) 및 IL-11(UniProtKB: P20809의 아미노산 잔기 22 내지 199)을 20개 아미노산 길이 링커(SEQ ID NO:20)와 함께 사용하여 작제되었다. 하이퍼 IL-11에 대한 아미노산 서열은 SEQ ID NO:21로 표시되어 있다.
일부 구현예에서, 제제는 gp130에의 IL-11:IL-11Rα 복합체의 결합에 의해 매개되는 신호화를 저해할 수 있고, 또한 IL-11Rα:gp130 수용체에의 IL-11의 결합에 의해 매개되는 신호화를 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11에 의해 매개되는 과정을 저해할 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을 저해할 수 있다. 유전자 및/또는 단백질 발현은 본원에 기재된 바와 같이 또는 당업자에게 잘 알려질 당업계의 방법에 의해 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 발현 수준의 100% 미만, 예를 들어, 99% 이하, 95% 이하, 90% 이하, 85% 이하, 80% 이하, 75% 이하, 70% 이하, 65% 이하, 60% 이하, 55% 이하, 50% 이하, 45% 이하, 40% 이하, 35% 이하, 30% 이하, 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 또는 1% 이하 중 하나까지 저해할 수 있다. 일부 구현예에서, 제제는 IL-11 및/또는 IL-11Rα의 유전자/단백질 발현을, 제제의 부재 하에서의(또는 적절한 대조군 제제의 존재 하에서의) 발현 수준의 1배 미만, 예를 들어, ≤0.99배, ≤0.95배, ≤0.9배, ≤0.85배, ≤0.8배, ≤0.75배, ≤0.7배, ≤0.65배, ≤0.6배, ≤0.55배, ≤0.5배, ≤0.45배, ≤0.4배, ≤0.35배, ≤0.3배, ≤0.25배, ≤0.2배, ≤0.15배, ≤0.1배 중 하나까지 저해할 수 있다.
신장 손상의 치료/방지
본 발명은 예를 들어, 신장 손상 및 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료/방지를 위한 방법 및 물품(제제 및 조성물)을 제공한다.
치료는 IL-11-매개 신호화의 저해(즉, IL-11-매개 신호화의 길항작용)에 의해 달성된다. 다시 말해, 본 발명은 예를 들어, 세포, 조직/기관/기관계/대상체에서 IL-11 매개 신호화의 저해를 통한, 신장 손상 및 장애, 신장 손상과 관련된 질환 및 병태의 치료/방지를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 개시내용에 따른 IL-11-매개 신호화의 저해는 신장의 세포(예를 들어, 세관 상피 세포)에서 IL-11-매개 신호화의 저해를 포함한다.
신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제가 제공된다.
또한, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도가 제공된다.
나아가, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 치료하거나 방지하는 방법이 제공되며, 방법은 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료적 유효량의, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 본 발명은 질환/병태에서 신장 손상-관련 병상의 치료/방지를 제공한다. 다시 말해, 본 발명은, 신장 손상이 병리학적으로 연관된 질환/병태의 치료/방지를 제공한다. 신장 손상-관련 병상은 본원에 기재되어 있다. 특히, 관련 병상은 근위, 원위 또는 둘 다에서 세관 상피 세포에의 상해를 포함한다.
더욱이, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 본원에서, 신장 손상을 역전시킬 수 있는 것으로 실증된다. 다시 말해, IL-11 매개 신호화의 저해는 신장 손상 후 신기능을 향상시킬 수 있는 것으로 나타나 있다.
이에, 본 발명은 예를 들어, 신장 손상의 결과 약화된 신기능을 갖는 대상체에서 신기능을 증강/향상시키기 위해 IL-11 매개 신호화의 길항제의 이용을 고려한다.
인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 기능적 신장 조직의 생성을 위해 증식 TEC를 촉진하는 데 유용하다. 그러므로, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 본원에서 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능 및/또는 신장 조직의 성장, 유지 및/또는 기능을 촉진하기 위해 제공된다.
인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 본원에서 세관 상피 세포(TEC), 및/또는 신장 조직을 재생시키기 위해 제공된다.
세관 상피 세포에 의한 상피 및/또는 액타(acta)로부터 중간엽 세포 표현형으로의 이행(본원에서 'EMT'로도 지칭됨)은 감소된 신장 기능과 관련이 있다. TEC에 의한 EMT는 조직 손상 후 생성되는 가용성 인자, 예컨대 TGFB1에 의해 유도된다. IL-11 매개 신호화의 길항작용은 본원에서 EMT를 TEC에 의해 저해하여 신기능을 보존/향상시키는 것으로 나타나 있다.
SNAIL의 발현은, TEC의 증식 능력 소실, 및 EMT와 연관이 있다. IL-11-매개 신호화는 본원에서 SNAIL 발현을 상향조절하는 데 있어서 중추적인 역할을 갖는 것으로 실증된다. 이에, 본 발명은 예를 들어, TEC에서 SNAIL 발현을 저해하기 위해 IL-11 매개 신호화의 길항제를 이용하는 것을 고려한다. IL-11 매개 신호화의 길항작용은 TEC 증식의 SNAIL-매개 저해로부터 TEC를 방출한다.
이에, 본 발명은 TEC 표현형을 갖는 신장에서 세포를 보존하며/수를 증가시키고/비율을 증가시키기 위해 IL-11 매개 신호화의 길항제를 이용하는 것을 고려한다. TEC 표현형은 예를 들어, E-카드헤린 발현을 특징으로 할 수 있다. 본 발명은 신장에서 중간엽 세포-유사 표현형을 갖는 세포의 수/비율을 감소시키기 위해 IL-11 매개 신호화의 길항제를 이용하는 것을 고려한다. 중간엽 세포-유사 표현형은 예를 들어, 선택적으로 E-카드헤린 발현의 결여와 함께 SNAIL 및/또는 ACTA2 발현을 특징으로 할 수 있다.
IL-11 매개 신호화의 길항제는 TEC 또는 신장 조직의 기능의 수준을 보존/증가시키기 위해 방법에서 사용될 수 있다. TEC/신장 조직 기능은 예를 들어, 이러한 활성의 상관관계의 평가에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, TEC/신장 조직 기능은 혈청/혈액 내 우레아 및/또는 크레아틴(예를 들어, 혈액 우레아 질소)의 수준을 분석함으로써, 또는 크레아틴에 대한 알부민의 비(ACR)를 모니터링함으로써 평가될 수 있다. IL-11 매개 신호화의 길항제는 혈청/혈액 내 크레아틴 및/또는 우레아의 수준을 감소시키기 위해, 또는 ACR을 감소시키기 위해 방법에서 사용될 수 있다.
본 발명의 치료적 및 예방적 이용성이, 신장 손상 및/또는 신장 손상-관련 병상의 감소로부터 이익을 얻을 임의의 질환/병태까지 본질적으로 확대된다는 것이 당업자에게 분명해질 것이다. 본 발명의 치료적 및 예방적 이용성은 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 겪고 있는 임의의 대상체까지 확대된다. 본 발명의 치료적 및 예방적 이용성은 또한, 신장 손상-관련 병상이 존재하는 질환을 겪고 있는 임의의 대상체까지 확대된다.
일부 구현예에서, 본 발명은 신장 손상에 의해 야기/악화되는 질환/병태의 치료/방지를 위해 제공된다. 일부 구현예에서, 신장 손상이 불량한 예후를 제공하는 대상체에서 질환/병태의 치료/방지가 제공된다.
급성 신장 손상의 진단 및 관리는 문헌[Rahman M 등, Acute Kidney injury: a guide to diagnosis and management. Am Fam Physician 2012 Oct 1:86(7): 631-9]에 기재되어 있다. 본원에 기재된 바와 같이, 급성 신장 손상은, 감소된 요배설량과 함께 또는 없이, 혈청 크레아틴 수준의 증가에 의해 명시되는 신장 기능의 갑작스런 악화를 특징으로 한다.
일부 구현예에서, 치료/방지될 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태는 예를 들어, 정상적인 기관/조직/대상체(즉, 신장 손상 또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태가 없음)와 비교하여 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태에 의해 영향을 받는 기관/조직/대상체에서 하기 중 하나 이상의 증가를 특징으로 할 수 있다: IL-11, 및 IL-11Rα 중 하나 이상의 발현.
일부 구현예에서, 본 발명은 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 신장 손상과 관련된 질환/장애/병태의 맥락에서 신장 손상의 치료/방지를 제공한다. 일부 구현예에서, 본 발명은 신장 손상 및 신장 손상과 관련된 기저(underlying) 질환/장애/병태의 치료/방지를 제공한다. 예를 들어, IL-11-매개 신호화의 저해는 화학치료법-관련 신장 손상에서 IL-11의 역할을 길항시키는 데 있어서, 뿐만 아니라 암 자체에서 IL-11의 역할을 길항시키는 데 있어서 이용성을 갖는다.
본 발명에 따른 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 치료/방지는, IL-11의 상향조절, 예를 들어, 질환/장애/병태의 증상이 명시되거나 발생할 수 있는 세포 또는 조직에서 IL-11의 상향조절, 또는 세포외 IL-11 또는 IL-11Rα의 상향조절과 관련된 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태일 수 있다.
신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태는 임의의 조직 또는 기관 또는 기관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 질환/장애/병태는 몇몇 조직/기관/기관계에 영향을 미칠 수 있다. 일부 구현예에서, 질환/장애/병태는 신장에 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태는, 심혈관계, 소화계, 배설계, 호흡계, 신장계(renal system), 생식계, 순환계, 근육계, 내분비계, 외분비계, 림프계, 면역계, 신경계, 및/또는 골격계 중 하나 이상에 영향을 미친다.
일부 구현예에서, 본 발명은 급성 신장 손상, 신독성, 약물-유도 신장 손상, 약물-유도 급성 신장 손상, 약물-유도 신독성, 시스플라틴-유도 신장 손상, 시스플라틴-유도 급성 신장 손상, 시스플라틴-유도 신독성에서 신장 손상-관련 병상의 치료/방지를 제공한다.
치료는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 진행을 방지하기에, 예를 들어, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 악화를 감소/지연/방지하기에, 또는 이의 발증을 감소/지연/방지하기에 효과적일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 증상의 향상, 예를 들어, 이의 중증도의 감소, 및/또는 이의 역전을 유발할 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 생존율을 증가시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 치료는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 효과 및/또는 증상을 역전시키기에 효과적이다.
방지(prevention)는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 발증(development)의 방지, 및/또는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 악화의 방지, 예를 들어, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태가 이후의 또는 만성 병기로 진행되는 것의 방지를 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 본 발명은 급성 신장 손상(AKI), 급성 신부전, 급성 신장 질환, 만성 신장 질환, 신장 상해, 약물-유도 신장 손상, 요세관 괴사, 급성 요세관 괴사, 자가면역 신장 손상 및 암의 치료/방지를 제공한다.
급성 요세관 괴사는 병원 내 환자에서 내재성 급성 신장 손상의 가장 보편적인 유형이다(상기 Rahman M 등). 그 원인은 종종 허혈성(연장된 저혈압으로부터) 또는 신독성(세관 세포에 독성인 제제로부터)이다. 급성 요세관 괴사에 의해 야기되는 급성 신장 손상은 종종 혈관내 부피 및 신장으로의 혈류의 적절한 충만(repletion)으로 향상되지 않는다. 허혈성 급성 요세관 괴사와 신독성 급성 요세관 괴사 둘 다 시간 경과에 따라 해소(resolve)될 수 있긴 하지만, 신손상의 정도 및 기존의 만성 신장 질환의 존재에 따라 일시적인 신장 대체 치료법이 필요할 수 있다.
본원에 지칭된 바와 같은 "암"은 임의의 원치 않는 세포 증식(또는 그 자체가 원치 않는 세포 증식에 의해 명시되는 임의의 질환), 신생물 또는 종양, 또는 원치 않는 세포 증식, 신생물 또는 종양의 증가된 위험 또는 소인일 수 있다. 암은 양성 또는 악성일 수 있고, 원발성 또는 속발성(전이성)일 수 있다. 신생물 또는 종양은 세포의 임의의 비정상적인 성장 또는 증식일 수 있고, 임의의 조직에 위치할 수 있다. 조직의 예는 부신(adrenal gland), 부신 수질(adrenal medulla), 항문, 충수(appendix), 방광, 혈액, 뼈, 골수, 뇌, 유방, 맹장(cecum), 중추신경계(뇌를 포함하거나 배제함) 소뇌(cerebellum), 자궁경부(cervix), 결장(colon), 십이지장, 자궁내막(endometrium), 상피 세포(예를 들어, 신상피), 담낭, 식도, 교질 세포(glial cell), 심장, 회장(ileum), 공장(jejunum), 신장, 눈물샘(lacrimal glad), 후두(larynx), 간, 폐, 림프, 림프절(복부 림프절, 겨드랑이 림프절(axillary lymph node), 경부 림프절(cervical lymph node), 서혜부 림프절(inguinal lymph node), 종격 림프절(mediastinal lymph node), 골반 림프절(pelvic lymph node), 대동맥주위 림프절(periaortic lymph node) 포함), 림프아구(lymphoblast), 턱(maxilla), 종격(mediastinum), 장간막(mesentery), 자궁근층(myometrium), 비인두(nasopharynx), 장막(omentume), 구강(oral cavity), 난소, 췌장, 이하선(parotid gland), 말초신경계 복막, 흉막(pleura), 전립선, 침샘, S상 결장(sigmoid colon), 피부, 소장, 연조직(soft tissue), 비장, 위, 고환, 흉선(thymus), 갑상선, 혀, 편도선(tonsil), 기관(trachea), 자궁, 음문(vulva), 백혈구를 포함한다.
암은 특정 유형일 수 있다. 암의 유형의 예는 성상세포종(astrocytoma), 암종(예를 들어, 선암종(adenocarcinoma), 간세포 암종, 수질 암종(medullary carcinoma), 유두 암종(papillary carcinoma), 편평 세포 암종), 신경교종(glioma), 림프종, 수아세포종(medulloblastoma), 흑색종(melanoma), 골수종(myeloma), 수막종(meningioma), 신경아세포종(neuroblastoma), 육종(sarcoma)(예를 들어, 혈관육종(angiosarcoma), 연골육종(chrondrosarcoma), 골육종(osteosarcoma))을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이 "암"은 하기 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다: 급성 림프성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 부신피질암, 항문암, 방광암, 혈액암, 뇌암, 뇌종양, 유방암, 여성 생식계의 암, 남성 생식계의 암, 중추신경계 림프종, 자궁경부암, 소아 횡문근육종(childhood rhabdomyosarcoma), 소아 육종, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 골수성 백혈병(CML), 결장 및 직장 암, 결장암, 자궁내막암, 자궁내막 육종, 식도암, 안암(eye cancer), 담낭암, 위암, 위장관암, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포암, 호지킨 질환(Hodgkin's disease), 하인두암(hypopharyngeal cancer), 카포시 육종(Kaposi's sarcoma), 신장암, 후두암, 백혈병, 백혈병, 간암, 폐암, 악성 섬유성 조직구종(malignant fibrous histiocytoma), 악성 흉선종(malignant thymoma), 흑색종, 중피종(mesothelioma), 다발성 골수종, 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두암, 신경계암, 신경아세포종, 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma), 구강암, 구강인두암(oropharyngeal cancer), 골육종(osteosarcoma), 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암(penile cancer), 인두암(pharyngeal cancer), 뇌하수체 종양, 혈장 세포 신생물, 원발성 CNS 림프종, 전립선암, 직장암, 호흡계, 망막아종(retinoblastom), 침샘암, 피부암, 소장암, 연조직 육종, 위암, 위암, 고환암, 갑상선암, 비뇨기계암, 자궁 육종, 질암(vaginal cancer), 혈관계, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증(Waldenstrom's macroglobulinemia) 및 윌름 종양(Wilms' tumor).
본 발명의 다양한 양태에 따르면, 방법은 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다(예를 들어, 신장 손상의 맥락에서):
신장 조직 및/또는 신장 세포의 괴사의 감소;
신장 및/또는 신장 조직의 섬유증의 감소;
신장 및/또는 신장 조직의 콜라겐 함량의 감소, 및/또는 콜라겐 침착의 저해;
신기능의 증가/유지;
요배설량의 증가/유지;
소변 알부민/크레아틴 비의 감소;
혈청 크레아틴 수준의 감소;
혈청 우레아 수준의 감소;
혈청 TGFβ1 수준의 감소;
신장 중량의 증가/유지;
신피질(renal cortical) 부피의 증가/유지;
체중의 증가/유지;
세관 상피 세포의 상피로부터-중간엽 세포로의 이행의 저해;
신장에서 ACTA2+ve 세포의 수/비율의 감소;
신장 세포에 의한 및/또는 신장/신장 조직에서 SNAIL 발현의 감소; 및
신장 세포에 의한 및/또는 신장/신장 조직에서 E-카드헤린 발현의 증가/유지.
투여
IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 투여는 바람직하게는 "치료적 유효" 또는 "예방적 유효" 양(amount)으로 존재하며, 이는 대상체에게 이익을 나타내기에 충분하다.
일부 구현예에서, 제제는 신장 손상의 원인, 예를 들어, 신독성 의약의 투여 또는 소모 또는 신장 손상의 환경적 공급원에의 노출 전에, 이와 함께 또는 그 후에 투여될 수 있다.
투여되는 실제량, 및 투여의 속도와 시간-경과는 신장 손상의 성질과 중증도 및 제제의 성질에 의존할 것이다. 치료의 처방, 예를 들어, 투약에 대한 결정 등은 일반 의사 및 다른 의학 박사의 책임 내에 있고, 전형적으로 치료될 질환/병태, 개별 대상체의 조건, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 인자를 고려한다. 상기 언급된 기법 및 프로토콜의 예는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition, 2000, pub. Lippincott, Williams & Wilkins]에서 찾을 수 있다.
다수의 용량의 제제가 제공될 수 있다. 용량 중 하나 이상 또는 각각은 또 다른 치료제의 동시적인 또는 순차적인 투여에 의해 동반될 수 있다.
다수의 용량은 예정된 시간 간격에 의해 분리될 수 있으며, 이러한 시간 간격은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 또는 31일, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6개월 중 하나인 것으로 선택될 수 있다. 예로서, 용량은 7, 14, 21 또는 28일(+(플러스) 또는 -(마이너스) 3, 2 또는 1일)마다 1회 주어질 수 있다.
치료적 적용에서, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제는 바람직하게는, 약학적으로 허용 가능한 담체, 아쥬반트, 부형제, 희석제, 충전제, 완충제, 보존제, 항산화제, 윤활제, 안정화제, 가용화제, 계면활성제(예를 들어, 습윤제), 마스킹제(masking agent), 착색제, 풍미제, 및 감미제(sweetening agent)를 포함하지만 이로 제한되지 않는 당업자에게 잘 알려진 하나 이상의 다른 약학적으로 허용 가능한 성분과 함께 약제 또는 약학적 제제로서 제형화될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "약학적으로 허용 가능한"은, 합리적인 의학적 판단의 범위 내에서, 타당한 이익/위험 비(benefit/risk ratio)에 비례하여(commensurate), 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제점이나 합병증 없이 해당 대상체(예를 들어, 인간)에서 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 성분, 물질, 조성물, 투약 형태 등에 관한 것이다. 각각의 담체, 아쥬반트, 부형제 등은 또한, 제형의 다른 성분과 융화성(compatible)인 의미에서 "허용 가능"해야 한다.
적합한 담체, 아쥬반트, 부형제 등은 표준 약학적 문헌, 예를 들어, 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Company, Easton, Pa., 1990]; 및 문헌[Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994]에서 찾을 수 있다.
제형은 약학 분야에 잘 알려진 임의의 방법에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을, 하나 이상의 부속(accessory) 성분을 이루는 담체와 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제형은 활성 화합물을 담체(예를 들어, 액체 담체, 미분된 고체 담체 등)와 균일하게 그리고 긴밀하게 회합시킨 다음, 필요하다면 생성물을 형상화(shaping)시킴으로써 제조된다.
제형은 주사를 포함할 수 있는 투여의 국소, 비경구, 전신, 정맥내, 동맥내, 근육내, 경막내(intrathecal), 안내(intraocular), 결막내(intraconjunctival), 피하, 경구 또는 경피 경로용으로 제조될 수 있다. 주사 제형은 선택된 제제를 멸균 또는 등장성 매질에 포함할 수 있다. 제형 및 투여 방식은 제제 및 치료될 질환/장애/병태에 따라 선택될 수 있다.
일부 경우, 본원에 기재된 바와 같은 물품(예를 들어, 제제/조성물)은 신장 손상과 관련된 질환/장애/병태에 대한 치료와 함께 본원에 기재된 바와 같은 치료를 위해 투여된다. 신장 손상과 관련된 질환/장애/병태에 대한 적합한 치료는 당업계에 알려져 있다. 조성물은 치료될 질환/장애/병태에 따라, 단독으로 또는 다른 치료와 조합되어, 동시적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 물품은 치료 전에, 이와 동시에, 또는 그 후에 투여될 수 있다. 물품 및 치료는 예를 들어, 상기 기재된 제형에서 함께 제형화되거나, 별도로 제형화될 수 있다.
IL-11 및 IL-11에 대한 수용체의 검출
본 발명의 일부 양태 및 구현예는 대상체로부터 수득된 시료에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 검출에 관한 것이다.
일부 양태 및 구현예에서, 본 발명은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(각각의 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 인코딩하는 단백질 또는 올리고뉴클레오타이드로서)의 발현의 상향조절(과발현), 및 IL-11의 작용을 저해할 수 있는 제제에 의한 또는 IL-1 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 방지하거나 감소시킬 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 적합성의 지표(indicator)로서 이러한 상향조절의 검출에 관한 것이다.
상향조절된 발현은, 주어진 유형의 세포 또는 조직에 대해 통상 예상될 것보다 더 큰 수준에서의 발현을 포함한다. 상향조절은 세포 또는 조직에서 관련 인자의 발현 수준을 측정함으로써 결정될 수 있다. 비교는, 관련 인자에 대한 대상체로부터의 세포 또는 조직 시료에서의 발현 수준과 기준 발현 수준, 예를 들어, 동일한 또는 상응하는 세포 또는 조직 유형에 대한 관련 인자의 정상적인 발현 수준을 나타내는 값 또는 값의 범위 사이에서 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 대조군 시료에서, 예를 들어, 건강한 대상체로부터의 또는 동일한 대상체의 건강한 조직으로부터의 상응하는 세포 또는 조직에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현을 검출함으로써 결정될 수 있다. 일부 구현예에서, 기준 수준은 표준 곡선 또는 데이터 세트로부터 수득될 수 있다.
발현 수준은 절대 비교를 위해 정량화될 수 있거나, 상대 비교가 이루어질 수 있다.
일부 구현예에서, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 상향조절은, 시험 시료에서의 발현 수준이 기준 수준의 적어도 1.1배일 때 존재하는 것으로 여겨질 수 있다. 더욱 바람직하게는, 발현 수준은 기준 수준의 적어도 1.2, 적어도 1.3, 적어도 1.4, 적어도 1.5, 적어도 1.6, 적어도 1.7, 적어도 1.8, 적어도 1.9, 적어도 2.0, 적어도 2.1, 적어도 2.2, 적어도 2.3, 적어도 2.4 적어도 2.5, 적어도 2.6, 적어도 2.7, 적어도 2.8, 적어도 2.9, 적어도 3.0, 적어도 3.5, 적어도 4.0, 적어도 5.0, 적어도 6.0, 적어도 7.0, 적어도 8.0, 적어도 9.0, 또는 적어도 10.0배 중 하나로부터 선택될 수 있다.
발현 수준은 많은 기지의 시험관내 검정 기법, 예컨대 PCR 기반 검정, 인 시추 혼성화 검정(in situ hybridisation assay), 유세포분석 검정, 면역학적 또는 면역조직화학적 검정 중 하나에 의해 결정될 수 있다.
예로서, 적합한 기법은, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체에 결합할 수 있는 제제를 시료와 접촉시키고 제제와 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 복합체의 형성을 검출함으로써 시료 내 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 수준을 검출하는 방법을 수반한다. 제제는 임의의 적합한 결합 분자, 예를 들어, 항체, 폴리펩타이드, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자일 수 있으며, 선택적으로 표지되어, 형성된 복합체의 검출, 예를 들어, 시각화를 허용할 수 있다. 적합한 표지 및 이의 검출 수단은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 형광 표지(예를 들어, 플루오레세인(fluorescein), 로다민, 에오신 및 NDB, 녹색 형광 단백질(GFP), 희토류의 킬레이트(chelate), 예컨대 유로퓸(Eu; europium), 테르븀(Tb; terbium) 및 사마륨(Sm; samarium), 테트라메틸 로다민, 텍사스 레드(Texas Red), 4-메틸 엄벨리페론(umbelliferone), 7-아미노-4-메틸 쿠마린, Cy3, Cy5), 동위원소 마커, 방사성 동위원소(예를 들어, 32P, 33P, 35S), 화학발광 표지(예를 들어, 아크리디늄 에스테르, 루미놀, 이소루미놀), 효소(예를 들어, 퍼옥시다제, 알칼리 포스파타제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 루시퍼라제), 항체, 리간드 및 수용체를 포함한다. 검출 기법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 표지제(labelling agent)에 상응하도록 선택될 수 있다. 적합한 기법은 올리고뉴클레오타이드 태그의 PCR 증폭, 질량 분광법, 예를 들어, 리포터 단백질에 의한 기질의 효소적 전환 시 형광 또는 색상의 검출, 또는 방사성의 검출을 포함한다.
검정은 시료에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 양을 정량화하도록 배치될 수 있다. 시험 시료로부터 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 정량화된 양은 기준값과 비교될 수 있으며, 이러한 비교는, 시험 시료가 기준값보다 더 높거나 더 낮은 양의 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 함유하는지의 여부를 통계학적 유의성의 선택된 정도까지 결정하는 데 사용될 수 있다.
검출된 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 정량화는 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체를 인코딩하는 유전자의 상향조절이나 하향조절 또는 증폭을 결정하는 데 사용될 수 있다. 시험 시료가 섬유증성(fibrotic) 세포를 함유하는 경우, 이러한 상향조절, 하향조절 또는 증폭은 기준값과 비교되어, 임의의 통계학적으로 유의한 차이가 존재하는지의 여부를 결정할 수 있다.
대상체로부터 수득된 시료는 임의의 종류일 수 있다. 생물학적 시료는 임의의 조직 또는 체액, 예를 들어, 혈액 시료, 혈액-유래 시료, 혈청 시료, 림프 시료, 정액 시료, 침 시료, 활액 시료로부터 얻어질 수 있다. 혈액-유래 시료는 환자의 혈액 중 선택된 분획, 예를 들어, 선택된 세포-함유 분획 또는 혈장이나 혈청 분획일 수 있다. 시료는 조직 시료 또는 생검; 또는 대상체로부터 단리된 세포를 포함할 수 있다. 시료는 기지의 기법, 예컨대 생검 또는 바늘 흡인술에 의해 수집될 수 있다. 시료는 IL-11 발현 수준의 후속적인 결정을 위해 저장되고/거나 가공될 수 있다.
시료는, 시료가 얻어진 대상체에서 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 상향조절을 결정하기 위해 사용될 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 시료는 신장 조직, 심장 조직, 내장 기관 조직, 호흡계 기관 조직, 또는 비뇨기계/신장계 조직으로부터 얻어진 조직 시료, 예를 들어, 생검일 수 있다. 시료는 세포를 함유할 수 있다.
대상체는, 이러한 대상체가 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 상향조절된 수준을 갖는다는 결정에 기초하여 본 발명에 따라 치료법/예방을 위해 선택될 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 상향조절된 발현은, IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 마커로서 역할을 할 수 있다.
상향조절은 주어진 조직에 또는 주어진 조직으로부터의 선택된 시료에 있을 수 있다. 바람직한 조직은 신장/신장 조직일 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절은 또한, 순환중인 유체, 예를 들어, 혈액에서, 또는 혈액 유래 시료에서 결정될 수 있다. 상향조절은 세포외 IL-11 또는 IL-11Rα의 것일 수 있다. 일부 구현예에서, 발현은 국소적으로 또는 전신적으로 상향조절될 수 있다.
선택 후, 대상체는 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 투여받을 수 있다.
진단 및 예후
IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체(예를 들어, IL-11Rα, gp130, 또는 IL-11Rα 및/또는 gp130을 함유하는 복합체)의 발현의 상향조절의 검출은 또한, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 진단하며, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법에서, 그리고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법에 사용될 수 있다.
"발증시키는(developing) ", "발증", 및 "발증하다"의 다른 형태는 장애/질환의 발병, 또는 장애/질환의 계속 또는 진행을 지칭할 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 예를 들어, 대상체의 신체에서 또는 대상체의 신체의 선택된 세포/조직에서 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 나타내는 다른 증상의 존재에 기초하여 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖고 있거나 이를 겪고 있는 것으로 의심될 수 있거나, 예를 들어, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태에 대한 위험 인자인 것으로 알려진 유전적 소인 또는 환경적 조건에의 노출때문에 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있는 것으로 여겨질 수 있다. IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 상향조절의 결정은 진단 또는 의심된 진단을 확인할 수 있거나, 대상체가 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있음을 확인할 수 있다. 결정은 또한, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태 또는 소인을, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 것으로 진단할 수 있다.
이와 같이, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖고 있거나 갖는 것으로 의심되는 대상체에 대해 예후를 제공하는 방법이 제공될 수 있으며, 방법은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현이 대상체로부터 수득된 시료에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 결정에 기초하여, IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 대상체의 치료에 대한 예후를 제공하는 단계를 포함한다.
일부 양태에서, 진단 방법 또는 IL-11-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은 IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체의 발현의 결정을 필요로 하지 않을 수 있으나, 발현 또는 활성의 상향조절을 예측하는 유전적 인자를 대상체에서 결정하는 것에 기초할 수 있다. 이러한 유전적 인자는 IL-11, IL-11Rα 및/또는 gp130에서 유전적 돌연변이, 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP) 또는 유전자 증폭의 결정을 포함할 수 있으며, 이는 발현 또는 활성 및/또는 IL-11 매개 신호화의 상향조절과 상관관계가 있고/거나 이를 예측한다. 질환 상태에의 소인 또는 치료 반응을 예측하기 위한 유전적 인자의 사용은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들어, 문헌[Peter Starkel Gut 2008;57:440-442]; 문헌[Wright 등, Mol. Cell. Biol. March 2010 vol. 30 no. 6 1411-1420]을 참조한다.
유전적 인자는 PCR 기초 검정, 예를 들어, 정량적 PCR, 경쟁적 PCR을 포함하여 당업자에게 알려진 방법에 의해 검정될 수 있다. 예를 들어, 대상체로부터 수득된 시료에서 유전적 인자의 존재를 결정함으로써, 진단이 확인될 수 있고/거나 대상체는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있는 것으로 분류될 수 있고/거나 대상체는 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 적합한 것으로 식별될 수 있다.
일부 방법은 IL-11의 분비와 연관된 하나 이상의 SNP의 존재 또는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 발증에 대한 감수성(susceptibility)의 결정을 포함할 수 있다. SNP는 통상 이중-대립유전자(bi-allelic)이며, 따라서, 당업자에게 알려진 많은 종래의 검정 중 하나를 사용하여 쉽게 결정될 수 있다(예를 들어, 문헌[Anthony J. Brookes. The essence of SNPs. Gene Volume 234, Issue 2, 8 July 1999, 177-186]; 문헌[Fan 등, Highly Parallel SNP Genotyping. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 2003. 68: 69-78]; 문헌[Matsuzaki 등, Parallel Genotyping of Over 10,000 SNPs using a one-primer assay on a high-density oligonucleotide array. Genome Res. 2004. 14: 414-425] 참조).
방법은, 대상체로부터 수득된 시료에 SNP 대립유전자가 존재하는지를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 소수 대립유전자(minor allele)의 존재를 결정하는 것은 증가된 IL-11 분비 또는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 발증에 대한 감수성과 관련이 있을 수 있다.
이에, 본 발명의 일 양태에서, 대상체를 스크리닝하는 방법이 제공되며, 방법은
대상체로부터 핵산 시료를 수득하는 단계;
어떤 대립유전자가 시료에서 WO 2017/103108 A1의 도 33, 도 34 또는 도 35에 나열된 하나 이상의 SNP, 또는 나열된 SNP 중 하나와 연관 불균형(linkage disequilibrium)에 있는 SNP의 다형성 뉴클레오타이드 위치에 존재하는지 r2 ≥ 0.8로 결정하는 단계
를 포함한다.
결정 단계는, 소수 대립유전자가 시료 내 선택된 다형성 뉴클레오타이드 위치에 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 이는 0, 1 또는 2개의 소수 대립유전자가 존재하는지의 여부를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
스크리닝 방법은, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 발증에 대한 대상체의 감수성을 결정하는 방법, 또는 본원에 기재된 바와 같은 진단 또는 예후 방법이거나 이의 파트를 형성할 수 있다.
방법은 추가로, 예를 들어, 대상체가 다형성 뉴클레오타이드 위치에 소수 대립유전자를 갖는 것으로 결정된다면, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태에 대한 감수성 또는 이의 증가된 위험을 갖고 있는 것으로 대상체를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 방법은 추가로, 대상체에서 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태에 대한 치료를 제공하기 위해 또는 대상체에서 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 발증 또는 진행을 방지하기 위해, IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료를 위한 대상체를 선택하고/거나 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
일부 구현예에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 진단하고, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법, 및 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은, IL-11 또는 IL-11에 대한 수용체, 또는 유전적 인자의 발현의 상향조절의 검출이 아닌 지표를 이용한다.
일부 구현예에서, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 진단하고, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있는 대상체를 식별하는 방법, 및 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 제제에 의한 치료에 대한 대상체의 반응을 예후화하거나 예측하는 방법은, 하기 지표 중 하나 이상을 검출하고/거나, 측정하고/거나 식별하는 것, 또는 하기 분석 중 하나를 수행하는 것에 기초한다:
· 상승된 혈청 크레아틴, 혈액 우레아 및/또는 질소
· 요(urinary) 나트륨 및 크레아틴 수준
· 감소된 요배설량
· 세관 폐색의 존재/부재를 식별하기 위한 신장 초음파검사
· 신장 생검(renal biopsy)
· 요검사(urinalysis) 수행.
실험실 신장 검사에 대한 기준 수준은 예를 들어, 상기 Rahman 등에서 찾을 수 있으며, 이는 그 전체가 참조로서 본원에 포함된다.
진단 또는 예후 방법은 대상체로부터 수득된 시료 상에서, 또는 대상체로부터 수득된 시료의 가공 후 시험관내에서 수행될 수 있다. 일단 시료가 수집되면, 환자는 수행될 시험관내 진단 또는 예후 방법을 위해 존재할 필요는 없으며, 따라서, 방법은 인간 또는 동물 신체 상에서 수행되지 않는 것일 수 있다. 대상체로부터 수득된 시료는 본원 상기에 기재된 바와 같이 임의의 종류일 수 있다.
다른 진단 또는 예후 시험은 본원에 기재된 것과 함께 사용되어, 진단 또는 예후의 정확성을 증강시키거나 본원에 기재된 시험을 사용함으로써 수득된 결과를 확인시켜 줄 수 있다.
대상체
대상체는 동물 또는 인간일 수 있다. 대상체는 바람직하게는 포유류, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다. 대상체는 비-인간 포유류일 수 있으나, 더욱 바람직하게는 인간이다. 대상체는 수컷 또는 암컷일 수 있다. 대상체는 환자일 수 있다. 환자는 본원에 기재된 바와 같이 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 가질 수 있다. 대상체는 치료를 필요로 하는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태로 진단된 적이 있을 수 있거나, 이러한 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 갖고 있는 것으로 의심될 수 있거나, 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태를 발증시킬 위험에 있을 수 있다.
구현예에서, 본 발명에 따르면, 대상체는 바람직하게는 인간 대상체이다. 구현예에서, 본 발명에 따르면, 대상체는 신장 손상 및/또는 신장 손상과 관련된 장애, 질환 또는 병태의 소정의 마커에 대한 특징화에 기초한 방법에 따라 치료를 위해 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는, 신장 조직에서 명시될 수 있거나 명시될 수 없는 질환, 병태 또는 장애를 치료하기 위해 약물 또는 의약이 투여되는 대상체일 수 있다. 대상체는 이러한 치료의 결과, 예를 들어, 부작용으로서 약물-유도 신장 손상을 발증시켰을 수 있다. 대상체는 이러한 약물-유도 신장 손상을 갖고 있다는 것에 기초하여 본 발명에 따른 치료 또는 방지 치료법에 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 대상체는 화학치료제에 의한 치료를 받았을 수 있거나, 화학치료제에 의한 치료를 받고 있을 수 있다. 대상체는 암을 갖고 있거나, 갖고 있는 것으로 의심되거나, 암으로부터의 회복 또는 관해(remission)에 있을 수 있고, 화학치료제의 투여는 대상체의 치료의 파트를 형성할 수 있다. 이에, 대상체는 화학치료제-유도 신장 손상, 화학치료제-유도 급성 신장 손상 또는 화학치료제-유도 신독성을 갖는 대상체일 수 있다.
일부 바람직한 구현예에서, 대상체는 시스플라틴에 의한 치료를 받았을 수 있거나, 시스플라틴에 의한 치료를 받고 있을 수 있다. 대상체는 암을 갖고 있거나, 갖고 있는 것으로 의심되거나, 암으로부터의 회복 또는 관해에 있을 수 있고, 시스플라틴의 투여는 대상체의 치료의 파트를 형성할 수 있다. 이에, 대상체는 시스플라틴-유도 신장 손상, 시스플라틴-유도 급성 신장 손상 또는 시스플라틴-유도 신독성을 갖는 대상체일 수 있다.
대상체는 선택적으로, 간헐적인 또는 정기적인 투석을 받고 있을 수 있다.
서열 동일성
2개 이상의 아미노산 또는 핵산 서열 사이에서 동일성 백분율을 결정하기 위한 쌍(pairwise) 및 다중 서열 정렬은 당업자에게 알려진 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 입수 가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 ClustalOmega(문헌[Soding, J. 2005, Bioinformatics 21, 951-960]), T-커피(T-coffee)(문헌[Notredame 등. 2000, J. Mol. Biol. (2000) 302, 205-217]), Kalign(문헌[Lassmann 및 Sonnhammer 2005, BMC Bioinformatics, 6(298)]) 및 MAFFT(문헌[Katoh 및 Standley 2013, Molecular Biology and Evolution, 30(4) 772-780]) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 이러한 소프트웨어를 사용할 때, 예를 들어, 갭 페널티(gap penalty) 및 익스텐선 페널티(extension penalty)에 대한 디폴터 매개변수(default parameter)가 바람직하게는 사용된다.
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
본 발명은 기재된 양태 및 바람직한 특질의 조합을, 단, 이러한 조합이 명백하게 허용 불가능하거나 분명하게 피해지는 경우를 제외하고는, 포함한다.
상기 설명에서 또는 하기 청구항에서, 또는 첨부된 도면에서 이의 구체적인 형태로 또는 개시된 기능을 수행하기 위한 수단, 또는 개시된 결과를 수득하기 위한 방법 또는 과정의 측면에서 개시된 특질은 적절하다면, 별개로 또는 이러한 특질의 조합으로, 본 발명을 이의 다양한 형태로 실현하는 데 이용될 수 있다.
임의의 의심을 피하기 위해, 본원에 제공된 임의의 이론적 설명은 독자의 이해를 향상시키기 위해 제공된다. 발명자들은 임의의 이들 이론적 설명에 결부시키고자 하지 않는다.
본원에 사용된 임의의 섹션 머릿말은 단지 구조적인 목적을 위한 것이고, 기재된 주제를 제한하려는 것으로 간주되지 않는다.
후속하는 청구항을 포함하여 본 명세서 전반에 걸쳐, 문맥상 다르게 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다(comprise)" 및 "포함하다(include)" 및 변화형, 예컨대 "포함한다(comprises)", "포함하는(comprising)", 및 "포함하는(including)"은, 임의의 다른 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군(group)의 배제가 아니라 언급된 정수나 단계 또는 정수나 단계의 군의 포함을 내포하는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 단수형("a," "an," 및 "the")은 문맥상 명확하게 다르게 지시하지 않는 한 복수형을 포함함을 주지해야 한다. 범위는 본원에서 "약" 하나의 특정 값으로부터, 및/또는 "약" 또 다른 특정 으로 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현될 때, 또 다른 구현예는 하나의 특정 값으로부터 및/또는 다른 특정 값까지를 포함한다. 유사하게는, 값이 근사치로서 표현될 때, 선행사 "약"의 사용에 의해, 특정 값은 또 다른 구현예를 형성하는 것으로 이해될 것이다. 수치값과 관련하여 용어 "약"은 선택적이고, 예를 들어, +/- 10%를 의미한다.
시험관내에서, 생체외에서 또는 생체내에서, 본원에 개시된 방법이 수행될 수 있거나 생성물이 존재할 수 있다. 용어 "시험관내에서"는 실험실 조건에서 또는 배양물에서의 물질, 생물학적 성분, 세포 및/또는 조직을 이용한 실험을 포괄하고자 하는 반면, 용어 "생체내에서"는 다세포성 유기체를 이용한 실험 및 절차를 포괄하고자 한다. "생체외에서"는 유기체 외부에서, 예를 들어, 인간 또는 동물 신체의 외부에서 존재하거나 발생하는 어떤 것을 지칭하며, 이는 유기체로부터 얻은 조직(예를 들어, 전체(whole) 기관) 또는 세포 상에 있을 수 있다.
핵산 서열이 본원에 개시되는 경우, 이의 역보체가 또한 명백하게 고려된다.
표준 분자생물학 기법에 대해, 문헌[Sambrook, J., Russel, D.W. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 3 ed. 2001, Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press]를 참조한다.
본 발명의 양태 및 구현예는 이제 첨부된 도면을 참조로 논의될 것이다. 추가 양태 및 구현예는 당업자에게 분명할 것이다. 본 문헌에서 언급된 모든 문헌은 참조로서 본원에 포함된다. 본 발명이 하기 기재된 예시적인 구현예와 함께 기재되긴 하였지만, 이러한 개시내용이 주어질 때 많은 동등한 변형 및 변화가 당업자에게 분명할 것이다. 이에, 상기 제시된 본 발명의 예시적인 구현예는 예시적인 것으로 여겨지고 제한하려는 것이 아니다. 기재된 구현예에 대한 다양한 변화는 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다.
인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화의 저해를 통해 신장 손상과 관련된 질환 및 병태의 진단, 치료 및 예방을 할 수 있다.
본 발명의 원리를 예시하는 구현예 및 실험은 이제, 첨부된 도면을 참조로 하여 논의될 것이다.
도 1. 중화성 항-IL-11 항체가 IgG 대조군 항체와 비교하여 AKI로부터 CKD로의 진행을 방지함을 도시하는 현미경 사진이다. 마우스는 폴레이트 유도(folate induced) 신장 손상(급성 요세관 괴사(ATN) 및 2차 섬유증의 모델)을 받았고, IgG 대조군, Enx 203(항-IL-11 항체) 또는 ENx209(항-IL-11RA 항체)를 투여받았다. 신장은 28일 후 수합되었고, 마손 삼색(Masson's Trichrome) 염색에 사용되었다. 항체 둘 다 콜라겐 침착을 방지하는 데 있어서 뚜렷하게 효과적이었다.
도 2a 및 도 2b. 중화성 항-IL-11 항체가 AKI 진행을 방지함을 도시하는 챠트이다. 마우스는 폴레이트 유도 신장 손상을 받았고, IgG 대조군 또는 항-IL-11 항체(Enx203, AB1) 또는 항-IL11RA 항체(ENx209, AB2)를 투여받았다. 28일 후, 신장이 HPA 콜라겐 검정을 위해 수집되었고, 혈청뇨(serum urine)(대사 케이지에서 수집됨)는 요 알부민/크레아틴 비에 대해 평가되었다. 주목 - 제2일에 신장 손상의 마커는 치료군 사이에서 유사하였으며, 이는 동일한 수준의 초기 신장 상해를 나타내지만, 항-IL-11 치료법을 받은 마우스는 기능을 대체로 회복한 반면, IgG를 받은 마우스는 기능을 덜 효과적으로 회복하였다. 상이한 치료를 받은 마우스에 대해 제28일에 (2a) 신장 콜라겐 함량을 도시하고, (2b) 요 알부민/크레아틴 비를 도시한다.
도 3. 신장 손상 반응 및 ERK 활성화에 미치는 ENx203 및 ENx209의 용량-의존적 효과를 도시하는 그래프 및 이미지이다. 동물은 폴레이트로 처리되었고, 항체는 손상 전 1시간으로부터 주사되었다. 신장 콜라겐 함량은 28일 후 평가되었다. 동물은 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 IgG 대조군 항체로 1주 2회(biweekly) 치료되었다. 군 사이에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았으며, 2개 군 모두로부터의 동물은 함께 플롯화된다. 신장 손상의 폴레이트 모델은 매우 중증이다(도 4 참조). 그러나, 심지어 강한 화학적 자극의 맥락에도, 1주 2회 5 mg/kg까지의 용량에서 ENx203은 고도로 효과적이었다(상단 패널). 개별 점(point)은 생물학적 복제물을 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 제시된다. 항체의 1주 2회(biw.) 및 1주 3회(triw.) 주사. 섬유증성 신장에서 IL-11-매개 ERK 활성화를 표적 연계(하단(lower) 패널)의 판독물로서 모니터링하여, 본 발명자들은 1주 2회 1 mg/kg에서 ExN203의 효과를 나타낼 수 있었다.
도 4a 내지 도 4c. (4a) 혈청 크레아틴, (4b) 혈청 우레아 및 (4c) 혈청 TGFB1 수준에 미치는 ENx203 및 ENx209의 용량-의존적 효과를 도시하는 그래프이다. 동물은 폴레이트로 처리되었고, 항체는 손상 전 1시간으로부터 주사되었다. 항체 마커 수준은 28일 후 평가되었다. 동물은 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 IgG 대조군 항체로 1주 2회 치료되었다. 군 사이에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았으며, 2개 군 모두로부터의 동물은 함께 플롯화된다. 개별 점은 생물학적 복제물을 나타낸다. 데이터는 평균±SD로 제시된다. 항체의 1주 2회(biw.) 및 1주 3회(triw.) 주사.
도 5a 내지 도 5c. AKI 진행에 미치는 (5a) ENx108A(IgG1), (5b) ENx203 또는 (5c) ENx209에 의한 치료의 효과를 도시하는 그래프이다. 동물은 폴레이트로 처리되었고, 1일 전부터 항체는 주어진 농도로 치료되었다(1주 2회). 신장 콜라겐 함량은 신장 손상 후 21일째에 결정되었다. 데이터 점은 개별 동물을 나타내고, 모든 데이터는 병행하여 발생되었으며, 따라서 개별 항체는 서로 비교될 수 있다. 동일한 기준선 및 IgG 대조군 동물은 각각의 항체에 대해 플롯화되어, 데이터 해석을 용이하게 한다. 데이터는 평균+-s.d.이며; 점(point)은 군(group)당 동물을 나타낸다. P-값이 교정된 양측 던넷 검정(Two-tailed Dunnett's test).
도 6a 및 도 6b. 마우스에서 Il11ra의 섬유아세포-특이적 넉아웃이 AKI로부터 보호함을 도시하는 그래프이다. 동물은 타목시펜(tamoxifen)으로 처리되어 Il11ra1을 Col1a1+ve 세포로부터 결실시킨 후, 폴레이트에 의해 신장이 손상되었다. 21일 후, (6a) 콜라겐 함량은 HPA 검정을 사용하여 평가되었고, (6b) 신장 기능은 혈청 우레아 수준을 통해 결정되었다. 동물은 항체 치료 동안 유사한 수준까지 보호되었으며, 이는 신장 손상 및 기능장애의 발병에서 섬유아세포에 미치는 IL-11 활성의 중추적인 역할을 시사한다. 시닥(Sidak) 교정된 P-값.
도 7a 내지 도 7f. AKI 후 제3일로부터 항-IL-11 치료법의 효과에 관한 개략도, 그래프 및 이미지이다. (7a) 폴레이트 투여 및 항체 치료의 시점의 개략도이다. (7b) 항-IL-11 치료법을 받는 마우스는 항-IL-11 치료법 직후 체중이 증가한다. (7c) 연구 기간의 종료 시, 항-IL-11 치료법을 받는 마우스는 IgG를 받는 마우스와 비교하여, 더 높은 신장 중량, (7d) 더 적은 신장 콜라겐, (7e) 정상적인 요배설량 및 (7f) 향상된 총 형태를 가졌다.
도 8a 내지 도 8f. ENx203 치료가 신장 손상 및 기능장애를 역전시키고 신장 재생을 유도함을 도시하는 개략도, 그래프 및 이미지이다. (8a) 폴레이트 투여 및 항체 치료의 시점의 개략도이다. 신장 손상의 폴레이트 모델이 확립되었고, 동물은 손상 후 21일까지 치료되지 않았다. 이는 신장 기능의 중증 감소 및 콜라겐 함량의 증가를 유발하였다. 그 후에, 항체 치료가 개시되었고, 혈청 우레아 수준 및 콜라겐 함량의 평가에 의한 신장 기능의 분석이 3, 6, 9 및 12주의 치료 후 수행되었다. 이는 제21일에서의 치료 전 동물과 비교하여 ENx203-치료된 동물에서 (8b) 콜라겐 함량의 유의한 감소, 및 (8c) 신기능의 유의한 향상을 드러내었다. 신장이 더 적은 콜라겐을 함유한 한편, 이러한 동물은 여전히 (8d) 체중이 증가하였고, (8e), (8f) 더 적은 울퉁불퉁한 모습(bumpy)을 보여주었으며 더 건강한 조직학을 가졌다(신장의 단면, 3마리의 동물). P 값은 다수의 시험에 대해 교정되고, FA 21d 군과 이후의 시점 사이에서 차이를 나타낸다(던넷 검정). 데이터는 평균±SD로서 나타난다.
도 9. ENx203 치료가 콜라겐 함량을 감소시켰으며, 정상적인 신실질(renal parenchyma) 및 피질 부피의 복구를 촉진하였음을 도시하는 이미지이다. 엽산(FA) 손상 후 제21일(D21)에 마우스 또는 대조군 마우스로부터, 그 후에 FA 손상 후 D21로부터 IgG 또는 항-IL-11로 3, 6, 9 또는 12주 동안 치료된 마우스에서 신장의 중간-구획의 마손 삼색 염색(Masson's Trichrom stain)이다.
도 10. 도 9에 도시된 이미지로부터 신피질(renal cortex)의 더 높은 배율의 도면을 도시하는 이미지이다. 엽산(FA) 손상 후 제21일(D21)에 마우스 또는 대조군 마우스로부터, 그 후에 FA 손상 후 D21로부터 IgG 또는 항-IL-11로 3, 6, 9 또는 12주 동안 치료된 마우스에서 신장 피질의 마손 삼색 염색이다.
도 11a 및 도 11b. 확립된 신장 손상 후 ENx203 치료가 체중 증가를 유도하고 요(urinary) ACR에서 50% 역전을 유발함을 도시하는 그래프이다. 신장 손상의 폴레이트 모델이 수행되었으며, 동물은 손상 후 21일까지 치료되지 않았다. 그 후에, 항체 치료가 개시되었고, 동물 체중이 계속 평가되었다. (11a) ENx203-치료된 동물은 치료 개시 시 체중이 다시 증가하기 시작하였다. (11b) 요 알부민:크레아틴 비는 손상 후 3-주째의 출발 수준과 비교하여 12주의 치료법에 의해 약 50%만큼 역전되었다.
도 12a 및 도 12b. 세관 상피 세포의 TGFB1-구동 부분 상피-중간엽 형질전환이 IL-11 의존적임을 도시하는 그래프이다. 인간 1차 세관 상피 세포는 TGFB1, IL-11(5 ng/ml, 24h) 또는 TGFB1 및 항체(2 μg/ml, 24h)로 자극되었다. (12a) ACTA2+ve 세포 및 (12b) 콜라겐 발현의 백분율은 오페레타(Operetta) 고-함량 이미지 플랫폼 상에서 모니터링되었다.
도 13. 세관 상피 세포의 TGFB1-구동 부분 상피-중간엽 형질전환에 관한 이미지이다. 상단, 인간 1차 세관 상피 세포가 IL-11(2.5-20 ng/ml, 24h)로 자극되었다. 오페레타 고-함량 이미지화가 사용되어, 로다민-팔로이딘을 사용한 액틴 스트레스 섬유 형성을 시각화하였다. 하단, 세포에서 콜라겐 발현의 시각적인 표현이다.
도 14a 및 도 14b. 세관 상피 세포(TEC)에 의한 근본적으로 중요한 Sanil 인자의 발현이 IL-11 의존적임을 도시하는 이미지 및 그래프이다. 1차 인간 TEC는 IgG 또는 항-IL-11 항체(ENx203)의 존재 하에 IL-11 또는 TGFB로 자극되었으며, Snail 또는 ACTA2 유전자의 발현은 오페레타 이미지화 플랫폼을 사용하여 검출되었다. (14a) IL-11과 TGFB 둘 다, 부분 EMT 및 ACTA2와 Snail 둘 다의 발현을 유도한다. 항-IL-11 항체의 존재 하에, 이러한 효과는 TGFB 자극된 세포에서 강하게 저해되었다. (14b) 도 14a의 현미경 사진으로부터의 ACTA+ve 세포의 정량화이다.
도 15. 항-IL-11 항체 치료가 1차 인간 TEC에서 Snail 유도를 방지함을 도시하는 이미지이다. 항-IL-11 항체(ENx203)의 존재 또는 부재 하에 TGFB로 처리되거나 IL-11로 처리된 1차 인간 신장 세관 상피 세포의 웨스턴 블롯이다. 상단 패널, TGFB(5 ng/ml)에 의한, EMT의 마스터 조절자인 SNAIL의 유도는 IL-11 신호화에 의존하고, IL-11(5 ng/ml) 단독은 SNAIL 발현을 유도할 수 있다. 하단 패널, GAPDH 대조군 단백질에 의해 확인된 동일한 단백질 로딩(loading)이다.
도 16. 신장을 재생시키는 데 있어서 E-카드헤린 발현은 항-IL-11 치료법으로 증가됨을 도시하는 이미지이다. E-카드헤린 발현은 상피 세포 동일성의 캐너니칼 마커이고, E-카드헤린 발현은, 세포가 EMT 또는 부분 EMT를 겪을 때 상실된다. TEC를 부분 EMT(pEMT)로 구동하는 IL-11의 효과를 유지시키면서, 폴레이트 손상 후 D21에서 마우스 및 손상 후 12주 동안 IgG로 치료된 마우스로부터의 신장의 웨스턴 블롯은 대조군과 비교하여 더 낮은 E-카드헤린 수준을 가졌으며, 이러한 효과는 항-IL-11 치료법에 의해 역전되었다.
도 17a 및 도 17b. 신장 손상의 일측 수뇨관 폐색(UUO; Unilateral Ureter Obstruction) 모델에서 항-IL-11 항체 치료의 효과에 관한 그래프 및 막대 챠트이다. UUO는 마우스에서 물리적 신장 손상 반응을 유도하도록 수행되었다. 일부 동물은 제4일, 제7일 및 제9일의 치료(20 mg/kg)에서 ENx203 또는 IgG 대조군 항체로 치료되었다. (17a) ENx203 및 IgG 대조군 치료된 동물의 체중이다. (17b) 신장 내 콜라겐 함량은 시술 후 10일째에 HPA 검정을 사용하여 평가되었다. ENx203 치료적 항체로 치료된 동물은 대조군 항체로 치료된 동물과 비교하여 유의하게 감소된 콜라겐 함량을 가졌다. 데이터는 평균±SD로서 제시된다. 시닥 교정된 P-값이다.
도 18a 내지 도 18h. 신장 손상의 시스플라틴-유도 모델에서 항-IL-11 항체 치료의 효과에 관한 개략도 및 그래프이다. (18a) 마우스는 시스플라틴(7 mg/kg 시스플라틴)을 4주 동안 1주 1회 투여받았다. 대조군은 식염수를 투여받았다. 마우스는 10 mg/kg X203 또는 이소타입-매칭된 IgG 대조군 항체를 IP 주사에 의해 제1주로부터 1주 2회 투여받았다. 마우스는 8주 후 신장 분석을 위해 수합되었다. (18b) HPA 검정에 의해 평가된 바와 같은 신장 내 콜라겐 함량이다. qPCR에 의해 결정된 바와 같은 (18c 내지 18h) (18c) Col3, (18d) 피브로넥틴, (18e) MMP2, (18f) TIMP, (18g) CCL5 및 (18h) CCL2의 RNA 발현이다. 그래프는 식염수-치료 마우스에서의 발현에 비해 발현의 배수 변화(FC; fold change)를 도시한다.
실시예
하기 실시예에서, 발명자들은, 항-IL-11 치료법이 급성 신장 질환 및 만성 신장 질환의 모델에서 신장 열화의 광범위한 재생 및 역전을 통해 신장 손상을 개선할 수 있음을 실증한다.
실시예 1: 재료 및 방법
1.1 1차 인간 신장 근위 세관 상피 세포
배양 및 자극 조건
1차 인간 신장 근위 세관 상피 세포(HRPTEC, PCS-400-010, ATCC)를 완전 신장 상피 세포 성장 배지(PCS-400-030 및 PCS-400-040, ATCC)에서 37℃ 및 5% CO2에서 성장시키고 유지시켰다. HRPTEC 배지를 2-3일마다 새롭게 하고, 세포를 80% 합류율(confluence)에서 표준 트립신처리 기법을 사용하여 계대배양하였다. 모든 실험을 P3에서 수행하였으며, 세포를 각각의 자극(24시간) 전 16시간 동안 혈청-고갈시켰으며, 이러한 고갈은 무혈청 신장 상피 세포 배지에서 수행되었다. 자극된 세포를, 동일한 조건(무혈청 신장 상피 세포 배지) 하에 동일한 기간 동안 성장되었으나 자극이 없는 비자극된 세포와 비교하였다.
오페레타 표현형분석(Operetta phenotyping) 검정
HRPTEC를 96-웰 세포담체 플레이트(600550, PerkinElmer)에 웰당 1 X 104개 세포의 밀도로 시딩(seed)하였다. 세포를, 24시간 동안 2 μg/ml의 항-IL-11(ENx203) 또는 IgG 이소타입 대조군 항체의 존재 하에 그리고 존재 없이, 지시된 농도의 IL-11(Genscript) 또는 TGF-β1(PHC 143B, Bio-Rad)로 자극하였다. 실험 조건 후, 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA, 28908, Thermo Fisher Scientific)에서 고정하며, PBS 중 0.1% Triton X-100(T8787, Sigma)으로 투과시켰다. 비-특이적 결합 부위를 PBS 중 0.5% BSA(A7906, Sigma) 및 0.1% Tween-20(170-6531, Bio-Rad)으로 차단하였다. 세포를 1차 항체(1:500), 즉, ACTA2(ab7817, Abcam), 콜라겐 I(34710, Abcam), SNAIL(ab180714, Abcam)와 함께 밤새(4C) 인큐베이션하고, 뒤이어 적절한 AlexaFluor488-접합 2차 항체(염소 항-마우스 488, ab150113 및 염소 항-Rabbit 488, ab150077, Abcam)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하였다(1:1000, RT, 암실). 세포를 차단 용액 중 로다민-팔로이딘(R415, Thermo Fisher Scientific) 및 DAPI(1 μg/ml, D1306, Thermo Fisher Scientific)로 대조-염색하였다. 플레이트를 스캐닝하고, 이미지를 오페레타 고-함량 이미지화 시스템(1483, PerkinElmer)으로 수집하였다. 각각의 조건을 적어도 2개 웰 및 웰당 최소 7개 필드(field)로부터 검정하였다. Harmony 소프트웨어 버전 3.5.2를 사용하여 ACTA2+ 세포의 정량화를 수행하였다. 면적당 콜라겐 I 형광 강도의 측정을 Columbus 버전 2.7.1로 수행하였다.
1.2 웨스턴 블롯
웨스턴 블롯을 HRPTE 총 단백질 추출물 상에서 수행하였다. HRPTE를, 프로테아제 및 포스파타제 저해제(Thermo Scientifics)를 함유하는 방사성면역침전 검정(RIPA) 완충제에서 용해시키고, 뒤이어 원심분리시켜 용해물을 정제(clear)하였다. 단백질 농도를 브래드포드 검정(Bio-Rad)에 의해 결정하였다. 동일한 양의 단백질 용해물을 SDS-PAGE에 의해 분리하며, PVDF 막으로 이전시키고, SNAIL(3879, CST) 및 GAPDH(2118, CST)에 대한 면역블롯 분석을 받게 하였다. 항-토끼-HRP(7074, CST)와 함께 ECL 검출 시스템(Pierce)을 사용하여 단백질을 시각화하였다.
1.3 동물 모델
모든 동물 시술은 싱헬스 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)에 따라 승인받고 수행되었다. 모든 마우스는 사료 및 물을 마음대로 제공받았다.
화학적 유도-급성 신장 손상의 마우스 모델
10주령 수컷 마우스에게 비히클(0.3 M NaHCO3) 중 엽산(200 mg/kg)의 IP 주사에 의해 신장 손상을 유도하였으며; 대조군 마우스에게는 비히클 단독을 투여하였다. FA-후 28일째에 동물을 희생시켰다. 마우스에게 항-IL-11 항체(ENx203), 항-IL-11Rα 항체(ENx209) 또는 동일한 농도의 IgG 이소타입 대조군을 복강내 주사하였다. 항체 치료법의 치료 기간 및 투약량을 도면에 기재한다.
수술 유도-급성 신장 손상의 마우스 모델
일측 수뇨관 폐색(UUO) 수술을 12주령의 수컷 마우스에서 수행하였다. 간략하게는, 마우스를 케타민(100 mg/kg)/자일라진(10 mg/kg)의 IP 주사에 의해 마취시키고, 마취의 전체 깊이를 발 반사(pedal reflex)로 평가하였다. 그 후에, 마우스의 복부 좌측면을 면도하였다. 메스를 이용하여 피부를 통해 수직 절개를 만들고, 복막을 통해 제2 절개를 만들어서, 신장을 드러내었다. 겸자를 사용하여, 신장을 표면으로 가져오고, 수뇨관을 수술용 실크로 신장 아래에서 2회 묶었다. 결찰된 신장을 이의 올바른 해부학적 위치로 부드럽게 되돌려 놓고, 멸균 식염수를 첨가하여 유체 손실을 보충하였다. 그 후에, 절개를 봉합하였다. 동물을 항생제 엔로플록사신(enrofloxacin)(15 mg/kg, SC) 및 진통제(analgesic) 부프레노핀(buprenorphine)(0.1 mg/kg, SC)으로 3일 연속일 동안 수술-후 치료하였다.
1.4 비색 검정(colorimetric assay) 및 ELISA
마우스 혈청 내 혈액 우레아 질소(BUN)의 수준을 우레아 검정 키트(ab83362, Abcam)를 사용하여 측정하였다. 요 알부민 및 크레아틴 수준을 마우스 알부민 ELISA 키트(ab108792, Abcam) 및 크레아틴 검정 키트(ab204537, Abcam)를 각각 사용하여 측정하였다. 혈청 TGFβ1 수준을 ELISA에 의해 측정하였다. 모든 ELISA 및 비색 검정을 제조업체의 프로토콜에 따라 수행하였다.
1.5 조직학
신장 조직을 10% 중성-완충 포르말린(NBF)에서 RT에서 48시간 동안 고정하고, 탈수시키고, 파라핀 블록에 포매하고, 4 μm로 절편화(section)하였다. 그 후에, 절편을 표준 프로토콜에 따라 마손 삼색으로 염색하고, 광현미경(light microscopy)에 의해 검사하였다.
실시예 2: 화학적-유도 신장 손상 모델에서 IL-11 매개 신호화의 저해의 효과 분석
비히클(0.3 M NaHCO3) 중 엽산(180 mg kg-1)의 복강내(i.p.) 주사에 의해 유사한 체중의 10-12주령 한배 새끼 마우스들에서 신장 손상을 화학적으로 유도하였으며; 대조군 마우스에게 비히클 단독을 투여하였다.
Enx203(마우스 IL-11(및 인간 IL-11)에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 항체) 또는 Enx209(마우스 IL-11α(및 인간 IL-11α)에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 항체)를 엽산 치료 후 1일째에 투여한 다음, 20 mg/kg의 용량으로 1주 3회 투여하였다. 주사-후 28일째에 마우스를 안락사시켰다.
Enx203 및 Enx209는 IL-11 매개 신호화의 길항제이다. Enx203은 마우스 항-마우스 IL-11 IgG이고, 예를 들어, 문헌[Ng 등, Sci Transl Med. (2019) 11(511) pii: eaaw1237]에 기재되어 있다(또한 문헌[Ng, 등, "IL-11 is a therapeutic target in idiopathic pulmonary fibrosis." bioRxiv 336537]; doi: https://doi.org/10.1101/336537에 개시되어 있음). Enx203은 또한, "X203"으로 지칭된다. Enx203은 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:92(본 개시내용의 SEQ ID NO:22)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:94(본 개시내용의 SEQ ID NO:23)에 따른 VL 영역을 포함한다. Enx209는 마우스 항-마우스 IL-11Rα IgG이고,예를 들어, 문헌[Widjaja 등, Gastroenterology (2019) 157(3):777-792]에 기재되어 있다(또한 문헌[Widjaja, 등, "IL-11 neutralising therapies target hepatic stellate cell-induced liver inflammation and fibrosis in NASH." bioRxiv 470062]; doi: https://doi.org/10.1101/470062에 개시되어 있음). Enx209는 또한, "X209"로 지칭된다. Enx209는 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:7(본 개시내용의 SEQ ID NO:24)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238884 A1의 SEQ ID NO:14(본 개시내용의 SEQ ID NO:25)에 따른 VL 영역을 포함한다.
우레아 검정 키트(ab83362, Abcam) 및 크레아틴 검정 키트(ab65340, Abcam)를 각각 제조업체의 설명에 따라 사용하여 우레아 및 크레아틴의 마우스 혈장 수준을 정량화하였다. 신장 내 총 콜라겐의 양을, Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 기초하여 정량화하였다. 모든 비색 검정을 제조업체의 설명에 따라 수행하였다.
조직을 파라핀-포매하고, 신장을 3 μm로 절편화하였다. 파라핀 절편을 위해, 조직을 24시간 동안 실온에서 10% 중성-완충 포르말린(Sigma-Aldrich)에서 고정하고, 탈수시키고 파라핀에서 포매하였다. 동결절편을 위해, 신선하게 절제된(dissected) 기관을 조직-Tek 최적 절단 온도 화합물(VWR International)로 포매하였다. 그 후에, 동결몰드(cryomould)를 액체 질소에서 냉각된 이소펜탄을 포함하는 금속 비커에서 냉동시키고, 절편을 -80℃에서 보관하였다. 총 콜라겐을 마손 삼색 염색 키트(HT15, Sigma-Aldrich)로 제조업체의 설명에 따라 염색하였다. 절편의 이미지를 포착하고, 청색-염색된 면적을 ImageJ 소프트웨어(버전 1.49)으로 반-정량적으로 결정하였다. 면역조직화학을 위해, 조직 절편을 항-ACTA2 항체(ab5694, Abcam)와 함께 인큐베이션하였다. 색원체(chromogen)로서 ImmPACT DAB 퍼옥시다제 기질(Vector Laboratories)과 함께 ImmPRESS HRP 항-토끼 IgG 중합체 검출 키트(Vector Laboratories)를 사용하여 1차 항체 염색을 시각화하였다. 그 후에, 절편을 메이어(Mayer) 헤마톡실린(Merck)으로 대조염색하였다.
도 1 및 도 2는, 항-IL11 항체 또는 항-IL-11Rα 항체 길항제로 치료된 마우스가 콜라겐에 대해 유의하게 감소된 염색을 가진 것으로 밝혀졌음을 도시한다.
도 2는 또한, 요 알부민/크레아틴 비가 항-IL-11 항체 또는 항-IL-11Rα 항체에 의한 치료에 의해 유의하게 감소되었음을 도시하며, 이는 신장 상해의 감소된 수준을 나타낸다.
중요하게는, 신장 상해의 화학적 유도 후 제2일에 우레아 및 크레아틴의 혈청 수준은 치료군 사이에서 유사하였으나(데이터는 도시되지 않음), 길항제 IL-11 치료법을 받는 마우스는 기능을 대체로 회복한 반면, IgG를 받는 마우스는 기능을 덜 효과적으로 회복하였다.
별개의 실험에서, 신장 손상의 유사한 폴레이트-유도 모델을 사용하여, 신장 손상을 치료/방지하기 위한 IL-11 매개 신호화의 길항제의 치료적 효능을 평가하였다. 마우스를 상기 기재된 바와 같이 폴레이트로 처리하였으며, 항체를 손상 전 1시간으로부터 투여하였다. 신장 콜라겐 함량을 28일 후 평가하였다. 동물을 1 mg/kg Enx203 1주 2회(biweekly), 5 mg/kg Enx203 1주 2회, 5 mg/kg Enx203 1주 3회, 10 mg/kg Enx203 1주 2회, 10 mg/kg Enx203 1주 3회(triweekly), 20 mg/kg Enx203 1주 3회, 20 mg/kg Enx209 1주 2회, 또는 10mg/kg 또는 20mg/kg IgG 대조군 항체 1주 2회로 치료하였다.
도 3은, IL-11-매개 신호화의 항체 길항제에 의한 치료가 엽산-유도 신장 손상과 관련된 콜라겐 함량의 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시켰음을 도시한다. 콜라겐 수준에 미치는 효과는, 심지어 Enx203이 5 mg/kg, 1주 2회로 투여되었을 때에도 관찰되었다.
섬유증성 신장에서 IL-11-매개 ERK 활성화를 표적 연계의 판독물로서 모니터링하여, 발명자들은 주당 2회 투여되는 1 mg/kg의 용량에서 ExN203에 대한 효과를 실증하였다.
크레아틴, 우레아 및 TGFβ1의 혈청 수준을 또한 이들 실험에서 평가하였으며, 도 4는, IL-11-매개 신호화의 항체 길항제에 의한 치료가 신장 손상의 이들 상관관계의 혈청 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시켰음을 도시한다. 또한, 혈청에서 이러한 인자의 수준의 감소는, 심지어 Enx203이 5 mg/kg, 1주 2회로 투여되었을 때에도 관찰되었다.
추가 실험에서, 신장 손상의 유사한 폴레이트-유도 모델을 사용하여, 신장 손상을 치료/방지하기 위한 IL-11 매개 신호화의 길항제의 치료적 효능을 평가하였다. 마우스를 상기 기재된 바와 같이 폴레이트로 처리하였으며, 항체를 손상 전 1일로부터 투여하였다. 신장 콜라겐 함량을 21일 후 평가하였다. 동물에게 1주 2회(biweekly) 10 mg/kg IgG 대조군 항체, 또는 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 5 mg/kg 또는 10 mg/kg의 Enx203, Enx209 또는 Enx108A를 투여하였다. 결과를 도 5에 도시한다.
Enx108A는, 마우스 IL-11 및 인간 IL-11에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 인간 항-인간 IL-11 IgG이다. Enx108A는 예를 들어, WO 2019/238882 A1에 기재되어 있으며, WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:8(본 개시내용의 SEQ ID NO:26)에 따른 VH 영역 및 WO 2019/238882 A1의 SEQ ID NO:20(본 개시내용의 SEQ ID NO:27)에 따른 VL 영역을 포함한다. 본 실시예에서, Enx108A는 hIgG4(L248E, S241P), 람다 라이트(light) 포맷으로 제공된다(즉, SEQ ID NO:28로 표시된 아미노산 서열을 갖는 중쇄, 및 SEQ ID NO:29로 표시된 아미노산 서열을 갖는 경쇄로 형성됨).
추가 실험에서, 발명자들은 급성, 화학적-유도 신장 손상의 이러한 모델에서 IL11RA1의 넉아웃의 결과를 조사하였다. 타목시펜에 반응하여 IL11RA1의 섬유아세포-특이적 넉아웃을 나타내는 Cre-lox 마우스를 타목시펜으로 처리하여, col1A2-양성 세포로부터 IL-11RA1을 결실시켰으며, 후속적으로 상기 기재된 바와 같이 폴레이트-유도 신장 손상을 받게 하였다(또는 비히클에 의한 처리). 21일 후, HPA 검정을 사용하여 콜라겐 함량을 평가하였으며, 혈청 우레아 수준의 분석에 의해 신장 기능을 결정하였다. 결과를 도 6에 도시한다. 섬유아세포에서의 IL11RA1 넉아웃은 마우스를 폴레이트-유도 신장 손상으로부터 보호하는 것으로 밝혀졌으며, 이는 신장 손상의 병상 및 결과적인 기능장애 및 2차 섬유증에서 섬유아세포에서 IL-11 매개 신호화에서의 중추적인 역할을 나타낸다.
또 다른 실험에서, 마우스를 상기 기재된 바와 같이 폴레이트로 처리하였으며, Enx203을 제3일로부터, 10 mg/kg으로, 1주 2회(biweekly) 투여하였다. 체중, 신장 중량, 신장 콜라겐 함량, 요배설량 및 총 신장 형태를 28일 후에 평가하였다. 결과를 도 7에 도시한다. 연구 종료 시, 항-IL-11 항체 치료법을 받은 마우스는 IgG 대조군을 받은 마우스와 비교하여 증가된 신장 중량, 더 적은 신장 콜라겐, 정상적인 요배설량 및 향상된 총 형태를 가졌다.
발명자들은 만성 신장 손상의 화학적-유도 모델에서 추가 실험을 수행하였다. 간략하게는, 신장 손상을 상기 기재된 바와 같이 마우스에서 폴레이트 처리에 의해 유도하였으며, 21일 동안 치료하지 않았다. 폴레이트 처리에 의한 급성 신장 손상의 유도-후 21일째에, 혈액 우레아 질소의 약 2.5배 증가(도 8b) 및 소변에서 크레아틴에 대한 알부민의 비(ACR)의 약 2.9배 증가(도 11, 하단 패널)에 의해 결정된 바와 같이 만성 신장 질환이 확립되었다. 신장은 이의 초기 질량의 약 33%를 상실하였었고(도 8c), 콜라겐 수준은 약 2.8배 상승되었다(도 8a).
마우스를 제21일로부터 Enx203 또는 IgG 대조군으로 10 mg/kg에서 1주 2회 치료하였다. 실험 중 지시된 일자에 마우스를 안락사시키고, 신장 콜라겐, 혈청 우레아 수준, 신장 중량 및 총 신장 형태를 평가하였다. 결과를 도 8에 도시한다. Enx203에 의한 치료는 신장 콜라겐의 감소된 수준(도 8a) 및 혈청 우레아의 감소된 수준과 관련이 있었으며, 치료법의 제12주까지 BUN에서 전반적인 51% 역전이 존재하였다(P<0.001 vs IgG; 도 8b).
중요하게는, 신장 중량은 시간 경과에 걸쳐 Enx203-치료된 동물에서 증가한 한편, 신장 콜라겐 함량은 저하되었으며(도 8c 및 도 8a), 혈청 우레아 수준은 Enx203-치료 동물에서 시간 경과에 걸쳐 저하되었다(도 8b). 이러한 결과는, 폴레이트-유도 신장 조직 손상 반응을 저해하는 것보다 더 많이, Enx203 치료가 기능적 신장 조직의 재생을 촉진하여, 손상 표현형을 역전시켰음을 나타낸다. 제84일 및 제105일에 수합된 Enx203-치료된 마우스의 신장은 또한, 건강한 신장과 더욱 밀접하게 닮았다(도 8d 및 도 8e).
마우스로부터의 신장 절편의 조직학적 분석은, Enx203 치료가, 폴레이트-유도 신장 손상을 받은 마우스의 신장에서 정상적인 신실질(renal parenchyma)(제12주까지 실질 손실의 54% 역전(P<0.001)), 피질 두께와 부피, 및 피질 형태를 복구시켰음을 드러내었다(도 9 및 도 10).
이 실험에서 마우스의 체중을 또한, 실험 과정 전반에 걸쳐 모니터링하였으며, Enx203 치료는 대조군, 비치료된 수준으로의 폴레이트 처리 마우스의 체중 증가와 관련이 있는 것으로 밝혀졌다(도 11, 상단 패널). 소변에서의 ACR을 또한 실험의 제21일, 제84일 및 제105일에 마우스에서 모니터링하였으며, 결과를 도 11에 도시한다(하단 패널). Enx203에 의한 치료는 폴레이트-처리 마우스에서 소변 ACR의 실질적인 감소(12주 내에 약 50% 감소)를 야기하는 것으로 밝혀졌다.
결과는, IL-11-매개 신호화의 길항작용이 신장 섬유증을 역전시키고 신실질의 광범위한 재생을 생성할 수 있었으며, 이는 신장 열화의 놀라운 역전과 관련이 있음을 실증하였다.
실시예 3: IL-11 매개 신호화의 길항제에 의한 신장 손상의 저해/역전의 분자적 기초의 조사
발명자들은 추가 조사를 수행하여, 신장 조직 기능 및 손상 반응에서 IL-11 매개 신호화의 역할을 평가하였다.
세관 상피 세포로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행은 신장 손상과 관련된 신실질에의 상해 및 기능장애와 연관이 있으며(예를 들어, 문헌[Lovisa 등. Nat. Med. (2015) 21, 998-1009] 참조), 따라서, 발명자들은 IL-11 매개 신호화가 TEC에 대해 상피로부터 중간엽으로의 이행에서 역할을 하는지의 여부를 조사하였다.
인간 1차 세관 상피 세포(TEC)를 시험관내에서 TGFB1, IL-11(5 ng/ml, 24h) 또는 TGFB1 + Enx203(2 μg/ml, 24h)로 자극하였으며, 오페레타 고-함량 이미지화 플랫폼을 사용하여 ACTA2+ve 세포의 백분율 및 콜라겐 발현을 평가하였다.
결과를 도 12에 도시한다. TGFB1과 IL-11 둘 다, ACTA2-발현 TEC의 비율을 증가시키고, 콜라겐 I 발현을 이러한 세포에 의해 증가시키는 것으로 밝혀졌다. Enx203에 의한 치료는 TGFB1/IL-11에 반응하여 TEC에 의한 ACTA2 및 콜라겐 I 발현을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
별개의 실험에서, 인간 1차 TEC를 시험관내에서 24시간 동안 상이한 농도의 IL-11(2.5 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml), TGFB1(5 ng/ml), 또는 TGFB1(5 ng/ml) + Enx203(2 ug/ml)으로 자극하였으며, 오페레타 고-함량 이미지화를 사용하여, 로다민-팔로이딘(도 13, 상단 패널) 및 콜라겐(도 13, 하단 패널)을 사용하여 액틴 스트레스 섬유 형성을 시각화하였다.
본원 상기에서 설명된 바와 같이, SNAIL은 최근에, 급성 신장 손상 후 TEC 기능장애의 중요한 결정요인인 것으로 나타났다. TEC에서 이의 발현은 약화된 TEC 기능 및 증식과 관련이 있다. 시험관내에서 24시간 동안 상이한 농도의 IL-11(5 ng/ml), TGFB1(5 ng/ml), TGFB1(5 ng/ml) + Enx203(2 ug/ml) 또는 TGFB1(5 ng/ml) + IgG 대조군(2 ug/ml)로 자극된 인간 1차 TEC를, ACTA2 또는 SNAIL의 발현에 대해 오페레타 고-함량 이미지화 시스템을 사용하여 분석하였다.
결과를 도 14에 도시한다. IL-11 또는 TGFB1에 의한 치료는 부분 상피 세포-중간엽 세포 이행(EMT), 및 ACTA2와 SNAIL의 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, Enx203의 존재는 ACTA2 및 SNAIL의 유도를 강하게 저해하였다.
세포 용해물을 세포로부터 제조하였으며, SNAIL 발현에 대해 웨스턴 블롯에 의해 분석하였다. GAPDH에 대한 별개의 웨스턴 블롯을 단백질 로딩 대조군으로서 수행하였다. 결과는 도 15에 도시되며, SNAIL 발현이 TGFB1 및 IL-11에 반응하여 상향조절되고 SNAIL의 TGFB-매개 상향조절이 Enx203의 존재에 의해 완전히 방지되었음을 실증한다.
그러므로, SNAIL의 TGFB1-매개 유도는 IL-11-의존적인 것으로 밝혀졌다.
발명자들은, 신장 손상이 상기 기재된 바와 같이 마우스에서 폴레이트 처리에 의해 유도되었으며 후속적으로 마우스를 제21일로부터 Enx203 또는 IgG 대조군으로 10 mg/kg에서 1주 2회(biweekly) 치료한 상기 기재된 실험으로부터 마우스의 신장 조직으로부터의 단백질 용해물의 웨스턴 블롯에 의해 상피 세포 동일성의 캐너니칼 마커인 E-카드헤린의 발현을 조사하였다.
결과를 도 16에 도시한다. 폴레이트-유도 신장 손상은 E-카드헤린 발현을 감소시키는 것으로 밝혀진 한편, Enx203에 의한 치료는 E-카드헤린 발현을 복구시키는 것으로 밝혀졌다.
실시예 4: 물리적-유도 신장 손상의 모델에서 IL-11 매개 신호화의 저해의 효과 분석
일측 수뇨관 폐색(UUO)에 의해 급성 신장 손상의 마우스 모델을 유도하였다. 간략하게는, 마우스를 1개 수뇨관의 샴 시술(sham operation) 또는 수뇨관 폐색에 의해 처리하였다.
마우스를 치료(20 mg/kg)의 제4일, 제7일 및 제9일에 ENx203(도 17b에서 '3C6'으로 지칭됨) 또는 IgG 대조군 항체로 치료하였다. 마우스의 체중을 실험 전반에 걸쳐 모니터링하였으며, 신장 내 콜라겐 함량을 UUO 수술 후 10일째에 HPA 검정을 사용하여 평가하였다.
결과를 도 17에 도시한다. Enx203으로 치료된 마우스는, UUO를 받고 IgG 대조군 항체로 치료받은 마우스와 비교하여 신장 콜라겐을 감소시켰었으며, 체중을 증가시켰다.
실시예 5: 시스플라틴-유도 신장 손상의 모델에서 IL-11 매개 신호화의 저해의 효과 분석
신장 손상을 10주령의 C57Bl/6J 마우스에서 4개 연속주 동안 1주 1회 7 mg/kg 시스플라틴의 투여에 의해 유도하였다. 대조군에게는 시스플라틴이 투여되지 않았다.
마우스에게 X203(마우스 IL-11(및 인간 IL-11)에 결합하고 IL-11 매개 신호화를 저해할 수 있는 항체) 또는 이소타입-매칭된 IgG 대조군 항체를 10 mg/kg의 용량으로 또는 식염수(대조군)로 제1주로부터 1주 2회(biwekly) IP 주사에 의해 투여하였다. 8주 후 분석을 위해 마우스를 수합하였다.
Quickzyme 총 콜라겐 검정 키트(Quickzyme Biosciences)를 사용하여 하이드록시프롤린의 비색 검출에 기초하여 신장 내 총 콜라겐의 양을 정량화하였다. 결과를 도 18b에 도시한다. 시스플라틴 치료는 신장의 증가된 콜라겐 함량과 관련이 있었다. 중화성 항-IL-11 항체가 투여된 시스플라틴-치료된 마우스로부터의 신장은, IgG 대조군 항체가 투여된 시스플라틴-치료된 마우스로부터의 신장보다 더 낮은 콜라겐 함량을 가졌다.
상이한 치료를 받은 마우스의 신장을 또한, Col3, 피브로넥틴, MMP2, TIMP, CCL5 및 CCL2의 RNA 발현에 대해 qPCR에 의해 분석하였다.
간략하게는, 급속-냉동된 신장 조직으로부터 총 RNA를 트리졸(Trizol)(Invitrogen) 및 RNeasy 미니 키트(Qiagen)를 사용하여 추출하였다. iScript cDNA 합성 키트(Biorad)를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 40 주기에 걸쳐 TaqMan(Applied Biosystems)에 의해 또는 StepOnePlus(Applied Biosystem)를 사용하는 SYBR 녹색(Qiagen) 기술에 의해 유전자 발현을 2벌(duplicate)로 분석하였다. 발현 데이터를 GAPDH mRNA 발현으로 정규화하였으며, 배수 변화를 식염수-치료 대조군 대상체에서의 발현에 비해 계산하였다.
결과를 도 18c 내지 도 18h에 도시한다. 시스플라틴 치료는 Col3, 피브로넥틴, MMP2, TIMP, CCL5 및 CCL2의 증가된 발현과 관련이 있었다. 중화성 항-IL-11 항체가 투여된 시스플라틴-치료 마우스로부터의 신장은, IgG 대조군 항체가 투여된 시스플라틴-치료 마우스로부터의 신장과 비교하여 Col3, 피브로넥틴, MMP2, TIMP, CCL5 및 CCL2의 더 낮은 발현을 갖는 경향이 있었다.
SEQUENCE LISTING <110> Singapore Health Services Pte. Ltd. (All states) National University of Singapore (All states) Clegg, Richard Ian (Lesotho only) <120> Treatment of Kidney Injury <130> 007608946 <150> GB 1902419.9 <151> 2019-02-22 <160> 59 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Homo sapiens IL-11 (UniProt P20809) <400> 1 Met Asn Cys Val Cys Arg Leu Val Leu Val Val Leu Ser Leu Trp Pro 1 5 10 15 Asp Thr Ala Val Ala Pro Gly Pro Pro Pro Gly Pro Pro Arg Val Ser 20 25 30 Pro Asp Pro Arg Ala Glu Leu Asp Ser Thr Val Leu Leu Thr Arg Ser 35 40 45 Leu Leu Ala Asp Thr Arg Gln Leu Ala Ala Gln Leu Arg Asp Lys Phe 50 55 60 Pro Ala Asp Gly Asp His Asn Leu Asp Ser Leu Pro Thr Leu Ala Met 65 70 75 80 Ser Ala Gly Ala Leu Gly Ala Leu Gln Leu Pro Gly Val Leu Thr Arg 85 90 95 Leu Arg Ala Asp Leu Leu Ser Tyr Leu Arg His Val Gln Trp Leu Arg 100 105 110 Arg Ala Gly Gly Ser Ser Leu Lys Thr Leu Glu Pro Glu Leu Gly Thr 115 120 125 Leu Gln Ala Arg Leu Asp Arg Leu Leu Arg Arg Leu Gln Leu Leu Met 130 135 140 Ser Arg Leu Ala Leu Pro Gln Pro Pro 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Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg 85 90 95 Asp Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln 115 120 125 Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 130 135 140 Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr 165 170 175 Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 180 185 190 His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro 195 200 205 Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 58 <211> 444 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hEnx209 hIgG4 (L248E, S241P) HC <400> 58 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Leu Arg Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Asn Ile Gly Pro Ser Asp Ser Lys Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Asp Tyr Val Leu Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu 115 120 125 Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys 130 135 140 Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser 145 150 155 160 Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser 165 170 175 Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser 180 185 190 Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn 195 200 205 Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro 210 215 220 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe 225 230 235 240 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 245 250 255 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe 260 265 270 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 275 280 285 Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 290 295 300 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 305 310 315 320 Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 325 330 335 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln 340 345 350 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 355 360 365 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 370 375 380 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 385 390 395 400 Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu 405 410 415 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 420 425 430 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 435 440 <210> 59 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hEnx209 kappa LC <400> 59 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asn Asn 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Trp Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

Claims (44)

  1. 신장 손상을 치료하거나, 방지(preventing)하거나 또는 역전시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제.
  2. 신장 손상을 치료하거나, 방지(preventing)하거나 또는 역전시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  3. 신장 손상을 치료하거나, 방지(preventing)하거나 또는 역전시키는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 (prophylactically) 유효량의 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  4. 제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 신장 손상은 급성 신장 손상인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  5. 제1항 또는 제4항, 제2항 또는 제4항, 또는 제3항 또는 제4항에 있어서, 신장 손상은 신독성(nephrotoxicity)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  6. 제1항, 제4항 또는 제5항, 제2항, 제4항 또는 제5항, 또는 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 손상은 약물-유도 신장 손상 또는 허혈증-유도 신장 손상인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  7. 제1항, 또는 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항, 제2항, 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 손상은 시스플라틴-유도 신장 손상 또는 시스플라틴-유도 신독성인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  8. 제1항, 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항, 제2항, 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 신장 손상은 세관 상피 세포(TEC; tubular epithelial cell)에의 상해를 특징으로 하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  9. 신기능(renal function)에 대한 열화를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제.
  10. 신기능(renal function)에 대한 열화를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  11. 신기능(renal function)에 대한 열화를 겪고 있는 대상체에서 신기능을 향상시키는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 유효량의 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  12. 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직(renal tissue)의 성장, 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제.
  13. 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직의 성장, 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  14. 세관 상피 세포(TEC)의 증식, 생존 및/또는 기능, 및/또는 신장 조직의 성장, 유지 및/또는 기능을 촉진하는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 (prophylactically) 유효량의 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. SNAIL 발현을 저해하는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제.
  16. SNAIL 발현을 저해하는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  17. SNAIL 발현을 저해하는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 (prophylactically) 유효량의 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행(transition)을 저해하거나 역전시키는 방법에 사용하기 위한, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제.
  19. 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행을 저해하거나 또는 역전시키는 방법에 사용하기 위한 약제의 제조에 있어서, 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제의 용도.
  20. 세관 상피 세포(TEC)로부터 중간엽 세포-유사 표현형으로의 이행을 저해하거나 역전시키는 방법으로서, 방법은 치료적 또는 예방적 (prophylactically) 유효량의 인터루킨 11(IL-11)-매개 신호화(signalling)를 저해할 수 있는 제제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제1항, 제4항 내지 제9항, 제12항, 제15항 또는 제18항 중 어느 한 항, 제2항, 제4항 내지 제8항, 제10항, 제13항, 제16항 또는 제19항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제8항, 제11항, 제14항, 제17항 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에의 인터루킨 11(IL-11)의 결합을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 제제인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)에 결합할 수 있는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 폴리펩타이드, 펩타이드, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 앱타머 또는 저분자(small molecule)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
    (i) 하기 CDR을 혼입하는 중쇄 가변(VH) 영역:
    SEQ ID NO:34의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    SEQ ID NO:35의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    SEQ ID NO:36의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역:
    SEQ ID NO:37의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    SEQ ID NO:38의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    SEQ ID NO:39의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
    을 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  27. 제24항 또는 제25항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
    (i) 하기 CDR을 혼입하는 중쇄 가변(VH) 영역:
    SEQ ID NO:40의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    SEQ ID NO:41의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    SEQ ID NO:42의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역:
    SEQ ID NO:43의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    SEQ ID NO:44의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    SEQ ID NO:45의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
    을 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  28. 제24항에 있어서, 제제는 IL-11-매개 신호화의 항-IL-11Rα 항체 길항제, 또는 이의 항원-결합 단편인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  29. 제24항 또는 제28항에 있어서, 항체 또는 항원-결합 단편은
    (i) 하기 CDR을 혼입하는 중쇄 가변(VH) 영역:
    SEQ ID NO:46의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR1
    SEQ ID NO:47의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR2
    SEQ ID NO:48의 아미노산 서열을 갖는 HC-CDR3; 및
    (ii) 하기 CDR을 혼입하는 경쇄 가변(VL) 영역:
    SEQ ID NO:49의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR1
    SEQ ID NO:50의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR2
    SEQ ID NO:51의 아미노산 서열을 갖는 LC-CDR3,
    을 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  30. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제제는 유인 수용체(decoy receptor)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 제제는 IL-11에 대한 유인 수용체인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  32. 제31항에 있어서, IL-11에 대한 유인 수용체는 (i) gp130의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열 및 (ii) IL-11Rα의 사이토카인 결합 모듈에 상응하는 아미노산 서열을 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  33. 제22항 또는 제23항에 있어서, 제제는 IL-11 뮤테인(mutein)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  34. 제33항에 있어서, IL-11 뮤테인은 W147A인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  35. 제1항, 제4항 내지 제9항, 제12항, 제15항 또는 제18항 중 어느 한 항, 제2항, 제4항 내지 제8항, 제10항, 제13항, 제16항 또는 제19항 중 어느 한 항, 또는 제3항 내지 제8항, 제11항, 제14항, 제17항 또는 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 제제는 인터루킨 11(IL-11) 또는 인터루킨 11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  36. 제35항에 있어서, 제제는 올리고뉴클레오타이드 또는 저분자(small molecule)인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  37. 제36항에 있어서, 제제는 IL-11의 발현을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  38. 제37항에 있어서, IL-11의 발현을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:12, 13, 14 또는 15의 서열을 포함하는 IL11로 표적화된 siRNA인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  39. 제36항에 있어서, 제제는 IL-11Rα의 발현을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  40. 제39항에 있어서, IL-11Rα의 발현을 방지(preventing)하거나 감소시킬 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 SEQ ID NO:16, 17, 18 또는 19의 서열을 포함하는 IL11RA로 표적화된 siRNA인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  41. 제21항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 인터루킨 11 수용체는 IL-11Rα이거나 이를 포함하는 것인, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 것으로 결정되었던 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 방법은, 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 대상체에서 상향조절되는지의 여부를 결정하는 단계, 및 인터루킨 11(IL-11) 또는 IL-11에 대한 수용체(IL-11R)의 발현이 상향조절되는 대상체에게 제제를 투여하는 단계를 포함하는, 사용하기 위한 제제, 용도, 또는 방법.
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