KR20210143801A - 분자 이벤트의 감지 및 정량화를 위한 표면 고정된 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 장치 - Google Patents

분자 이벤트의 감지 및 정량화를 위한 표면 고정된 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 장치 Download PDF

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애쉬윈 고피나스
폴 더블유.케이. 로테문트
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캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

표적 분자의 결합 또는 입체형태적 변화와 같은 분자 이벤트를 감지하기 위한 폴리뉴클레오티드 플랫폼을 사용하여 쌍 안정 장치가 작제된다. 용도에는 표적 농도 측정, 표적에 대한 환경 조건(예를 들어, 열, 빛 또는 pH)의 영향 측정, 또는 표적에 결합하거나 이의 생물학적 기능을 조절하는 분자에 대한 라이브러리 스크리닝이 포함된다. 장치는 상부 뚜껑, 하부 뚜껑, 및 이들 사이의 가요성 링커 또는 힌지의 3개의 영역을 포함한다. 장치는 상부 및 하부 뚜껑이 분리된 개방 입체형태, 및 이들이 서로 밀접하게 결합된 폐쇄 입체형태를 갖는다. 표적 분자의 결합 도메인 또는 변형은 장치에 고정되어 분자 이벤트가 발생하는 경우 장치가 개방에서 폐쇄로 또는 그 반대로 전환되어 신호를 생성한다. 최적 장치 설계는 표면 고정 장치의 폐쇄를 측정하는 데 사용되는 신호 양식(광학적 또는 전자적)에 의해 결정된다.

Description

분자 이벤트의 감지 및 정량화를 위한 표면 고정된 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 장치
관련 출원(들)에 대한 교차 참조
본 출원은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 "Bistable Polynucleotide Devices for the Sensing and Quantification of Molecular Events"를 제목으로 하는 2018년 9월 25일에 출원된 미국 출원 일련 번호 16/350,115호의 일부 계속 출원이다.
미 연방 후원 연구 또는 개발에 관한 설명
본 발명은 미국 국립과학재단(National Science Foundation)에 의해 수여되는 부여 번호 CMMI1636364 및 해군연구청(Office of Naval Research)에 의해 수여되는 부여 번호 N00014-14-1-0702에 따라 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 특정 권리를 갖는다.
분야
본 발명은, 예를 들어, 분자 이벤트의 정량화가 단일 분석물의 농도 측정, 또는 한 세트의 분석물의 다중화된 검출 및 정량화를 가능하게 할 수 있는 경우 관심 분자에 발생할 수 있는 결합 이벤트, 입체형태적 변화, 화학적 변형 또는 효소적 변형과 같은 상기 분자 이벤트의 감지 및 정량화를 위한 구조체에 관한 것으로, 여기서 분석물은 유체 샘플 내의 분자 또는 입자 유형이다.
다양한 분자 존재물은 서로에 대한 선택적 친화성을 나타내며, 이는 수용체-리간드, 항체-항원, 나노바디-항원, 또는 앱타머-표적 복합체와 같은 다중분자 복합체의 형성을 발생시킨다. 한 분자의 또 다른 분자에 대한 상기 선택적 친화성은 상기 친화성으로부터 발생하는 결합 이벤트가 제공된 샘플 용액에서 분석물의 존재를 결정하는 데 사용될 수 있고, 특정 환경에서 또한 분석물의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있기 때문에 특별히 중요하다.
지난 수십 년 동안, 신호가 광학성(분광, 비색 또는 형광)이거나 전기적(임피던스, 커패시턴스, 인덕턴스 또는 전류)일 수 있는 1차 또는 2차 결합 이벤트와 관련된 신호를 검출하고/하거나 증폭시키는 직접 또는 간접 전략을 포함하여 특정 복합체 형성의 확인에 기초한 다양한 검출 방법이 개발되었다. 이들 방법(및 관련 시스템)의 특이성, 속도 및 민감도로 인해, 이들은 현대 분석 측정의 초석이 되었으며, 학술뿐만 아니라 산업 연구에서 유용성을 발견하였다. 상기 플랫폼의 몇몇 특정 적용 분야는 환경 평가, 식품 안전, 의학적 진단, 및 화학적, 생물학적 및/또는 방사선전 제제의 검출을 포함한다.
그러나, 기존의 고 민감도 검정은 다수의 분석물에 대한 다중화가 매우 어렵게 만드는 기술적 세부사항을 갖는다. 또한, 정량화를 위해 상기 검정을 사용하기 위한 접근법은 종종 많은 양의 샘플로 이어지는 일련의 희석 단계를 포함한다. 따라서, 적은 샘플 부피에서 분석물의 존재를 정량적으로 측정하기 위해 동시 고 민감도 모듈식 다중화 방법에 대한 요구가 크다.
보다 일반적으로, 입체형태적 변화 및 효소적 변형과 같은 분자 이벤트의 검출은 생물학적 활성에 대한 강력한 검정을 생성하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 막횡단 단백질 수용체는 이들의 자연 기능 과정에서 내인성 리간드에 결합하지만, 상기 수용체에 대한 인공 리간드는 가장 중요한 약제 부류 중 하나를 구성한다. 세포외 측의 리간드에 의한 막횡단 수용체의 활성화는 종종 입체형태적 변화 또는 이의 세포질 측의 수용체의 인산화를 수반하여 수용체 활성화 및 가능한 생물학적 활성의 직접 표시를 제공한다. 현재, 잠재적인 약물에 대한 분자의 큰 라이브러리를 스크리닝하는 것이 세포에서 가장 잘 수행된다. 따라서, 인산화 또는 입체형태적 변화와 같은 일부 기능적 분자 이벤트에 대한 검정을 제공하기 위해 분석물의 단순한 결합을 넘어설 수 있는 임의의 분자 이벤트의 시험관 내 센서가 필요하다. 유사하게, 열, 빛, pH 또는 기타 환경 자극에 기초하여 변화하는 활성과 같은 모든 종류의 기능적 특성에 대한 분자를 스크리닝하는 것은 임의의 분자 이벤트에 대해 민감하고 모듈식이며 다중화 가능한 플랫폼으로부터 이익을 얻을 수 있다.
본 발명의 구현예의 양태는 관심 분자에 대해 발생할 수 있는 결합 이벤트, 입체형태적 변화, 화학적 변형 또는 효소적 변형과 같은 분자 이벤트를 검출하기 위한 일반적인 플랫폼에 관한 것이다. 일부 구현예에서, 결합과 같은 분자 이벤트의 검출은 유체 샘플에서 분자 또는 입자의 농도를 결정하는 데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 입체형태적 변화 또는 효소적 변형과 같은 분자 이벤트의 검출은 의학적 관심의 막 수용체에 대한 활성에 대해 약물 후보의 라이브러리를 스크리닝하는 데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 구조체는 표면에 대한 외부 자극의 광학적 또는 전자적 검출을 위한 쌍 안정 분자 센서(상기 쌍 안정 분자 센서는 사이에 가요성 힌지 또는 가요성 링커를 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상을 포함하는 폴리뉴클레오티드 플랫폼을 갖고, 제1 폴리뉴클레오티드 형상 또는 제2 폴리뉴클레오티드 형상 중 하나는 표면 상에 고정되어 고정된 폴리뉴클레오티드 형상 및 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상이 되도록 함), 및 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상 중 적어도 하나에 결합된 하나 이상의 기능성 분자를 포함하며, 상기 쌍 안정 분자 센서는 2개의 상태 중 하나를 갖고, 상기 2개의 상태는 폐쇄 상태 및 개방 상태이고, 개방 상태에서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상은 가요성 힌지 또는 가요성 링커에 의해 구속되는 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 대해 자유롭게 이동하며, 폐쇄 상태에서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상은 고정된 폴리뉴클레오티드 형상에 근접하게 위치된다. 일부 구현예에서, 폴리뉴클레오티드 플랫폼은 스캐폴딩된 데옥시리보핵산(DNA) 오리가미(origami), 스캐폴딩된 리보핵산(RNA) 오리가미, 스캐폴딩된 하이브리드 DNA:RNA 오리가미, 단일 가닥 DNA 타일(tile), 다중 가닥 DNA 타일, 단일 가닥 RNA 오리가미, 다중 가닥 RNA 타일, 또는 다중 스캐폴드가 있는 계층적으로 구성된 DNA 또는 RNA 오리가미로부터 선택된다.
본 발명의 일부 구현예에서, 표면이 금 또는 그래핀이고, 테더링된 형상이 유기 형광단, 양자점, 형광 비드 또는 발광 란타나이드 화합물로부터 선택되는 발광체를 포함하고, 개방 상태가 폐쇄 상태보다 더 많은 빛을 생성하는 광학 검출을 위한 구조체는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 일부 구현예에서, 표면이 금, 백금, 그래핀, 인듐 옥사이드 또는 인듐 주석 옥사이드를 포함하는 작업 전극이고, 테더링된 형상이 하나 이상의 산화환원 활성 분자로 표지되고, 상태의 변화가 하나 이상의 산화환원 활성 분자와 작업 전극 사이의 전자 이동을 발생시키는 전기 검출을 위한 구조체는 상기 기재된 바와 같다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 구조체는 표면 위의 용액 및 작업 용액 전극을 추가로 포함하며, 여기서 표면은 트랜지스터로 기능하고, 표면은 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어, 그래핀, 몰리브덴 디설파이드 또는 인듐 옥사이드로부터 선택되는 게이트 물질이고, 고정된 형상은 표면에 직접 부착되고, 표면 위의 용액은 트랜지스터를 위한 게이트 전극으로 기능한다.
본 발명의 일부 구현예에서, 상기 기재된 바와 같은 구조체는 전계 효과 감지에 사용되며, 구조체는 표면 위의 용액 및 작업 용액 전극을 추가로 포함하며, 여기서 표면은 트랜지스터로 기능하고, 표면은 실리콘 디옥사이드, 알루미늄 옥사이드 또는 실리콘 니트라이드로부터 선택되는 캡핑 층(capping layer) 아래에 반도체 게이트를 포함하고, 고정된 형상은 캡핑 층에 부착되고, 표면 위의 용액은 트랜지스터를 위한 게이트 전극으로 기능한다.
특허 또는 출원 파일은 색으로 제작된 적어도 하나의 도면을 함유한다. 색 도면(들)을 갖는 이러한 특허 또는 특허 출원의 카피는 요청시 필요한 요금의 지불과 함께 관청에 의해 제공될 것이다.
본 명세서와 함께 첨부된 도며은 본 발명의 예시적 구현예를 예시하고, 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하는 역할을 한다.
도 1a는 친화성 태그 및 DNA 바코드 둘 모두를 포함하는 용액에서 작동하도록 설계된 쌍 안정 분자 센서의 개략도이다.
도 1b는 2개의 폴리뉴클레오티드 형상으로 구성된 쌍 안정 분자 센서의 개략도이며, 이 중 하나는 광학적 또는 전자적 검출에 적합한 가요성 링커에 의해 테더링된 표면에 고정된다.
도 2a는 분석물의 결합시 친화성 태그의 숨김을 나타내는 샌드위치 작동 메커니즘을 통해 작동하는 용액 내 쌍 안정 센서의 작동의 개략도이다.
도 2b는 친화성 비드를 사용하여 개방 센서를 제거함으로써 폐쇄된 쌍 안정 센서로부터 DNA 바코드의 추출을 설명하는 개략도이다.
도 3a-c는 표면 상의 광학적 또는 전자적 검출을 위해 적합화된 샌드위치 작동을 사용하여 단일 가닥 핵산을 감지하기에 적합한 쌍 안정 센서를 도시한다.
도 3d는 2개의 CRISPR/dCas9 복합체를 사용한 샌드위치 작동을 사용하여 이중 가닥 DNA를 감지하기에 적합한 쌍 안정 센서를 도시한다.
도 3e는 이중 가닥 분석물에 결합시 숨겨진 서열을 나타내는 단일 알로스테리 CRISPR/dCas9 복합체를 사용한 샌드위치 작동을 사용하여 이중 가닥 DNA를 감지하기에 적합한 쌍 안정 센서를 도시한다.
도 4a-f는 샌드위치, 경쟁적 및 기능성의 3개의 주요 작동 메커니즘을 도시하고, 이는 협동성을 사용하는 이들 메커니즘의 예를 포함하며, 이는 MAPK의 인산화, 또는 막횡단 G 단백질 결합 수용체에 대한 리간드의 결합을 검출한다.
도 5a-d는 리보스위치, 절단 반응 및 라이게이션 반응에 기초한 쌍 안정 센서의 기능적 작동을 도시한다.
도 6a-c는 표면에 고정된 쌍 안정 센서의 작동의 전자적 검출에 대한 3개의 상이한 접근법을 도시한다.
도 7a-e는 신호 켜짐 및 신호 꺼짐 구현예 둘 모두에 대한 신호 트레이스의 카툰 스케치를 포함하여 표면 상에 고정된 쌍 안정 센서의 작동의 광학 검출에 대한 3개의 상이한 접근법을 도시한다.
도 8a-d는 쌍 안정 센서가 이의 폐쇄 상태에 있는 경우 각각 상이한 입체형태의 신호 분자 또는 폴리뉴클레오티드 물질을 하부 검출기 표면에 제시하는 쌍 안정 센서에 대한 4개의 상이한 기하학을 도시한다.
도 9a-f는 광학적 또는 전자적 표면 상에 쌍 안정 센서의 표면 배치에 대한 문제 및 해법을 도시한다.
도 10은 쌍 안정 센서의 다중 어레이의 사용을 통한 다중 분석물의 다중화된 검출을 도시하며, 여기서 각각의 서브-어레이는 별개의 관심 분석물에 민감하다.
하기의 상세한 설명에서, 본 발명의 특정한 예시적인 구현예만이 예시로서 제시되고 설명된다. 당업자가 인식할 수 있는 바와 같이, 본 발명은 많은 상이한 형태로 구체화될 수 있으며, 본원에 설명된 구현예로 제한되는 것으로 해석되어선 안 된다.
본 발명의 구현예의 양태는 폴리뉴클레오티드 플랫폼(예를 들어, 폴리뉴클레오티드로부터 잘 정의된 2차원 또는 3차원 형상의 생성을 위한 일반적인 구조)을 사용하여 기판 상에 생성된 쌍 안정 분자 센서에 관한 것이다. 폴리뉴클레오티드 플랫폼은 스캐폴딩된 데옥시리보핵산(DNA) 오리가미(Rothemund, Paul WK. "Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns", Nature 440.7082 (2006): 297), 스캐폴딩된 리보핵산(RNA) 오리가미(Torelli, Emanuela et al, "Isothermal folding of a light-up bio-orthogonal RNA origami nanoribbon", Scientific Reports 8 (2018): 6989), 스캐폴딩된 하이브리드 DNA:RNA 오리가미(Wang, Pengfei, et al. "RNA-DNA hybrid origami: folding of a long RNA single strand into complex nanostructures using short DNA helper strands", Chemical Communications 49 (2013) 5462-5464), 스캐폴드 비함유 DNA 단일 가닥 타일(DNA 브릭) 시스템(Wei, Bryan, et al., "Complex shapes self-assembled from single-stranded DNA tiles", Nature 485 (2012):623-626 및 Ke, Yonggang, et al., "Three-Dimensional Structures Self-Assembled from DNA Bricks", Science 338 (2012):1177-1183), 스캐폴드 비함유 다중 가닥 DNA 타일 시스템(Winfree, Erik, et al., "Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals", Nature 394 (1998) 539-44) 또는 RNA 타일 시스템(Chworos, Arkadiusz, et al., "Building programmable jigsaw puzzles with RNA." Science 306 (2004):2068-72), 분자 내 폴딩된 단일 가닥 RNA(Geary, Cody, et al., "A single-stranded architecture for cotranscriptional folding of RNA nanostructures", Science 345 (2014) 799-804) 또는 단일 가닥 DNA 오리가미(Han, Dongran, et al., "Single-stranded DNA and RNA origami", Science 358 (2017): eaao2648)를 포함하나 이에 제한되지는 않으며, 이들 모두는 그 전체가 참조로서 포함된다. 명확성을 위해, 본 발명의 구현예의 양태는 주로 "분자 형상"의 특정 예로서 스캐폴딩된 DNA 오리가미와 관련하여 본원에 기재될 것이다. 그러나, 본 발명의 구현예는 스캐폴딩된 DNA 오리가미에 제한되지 않는다. 대신에, 본 발명의 구현예는 상기 열거된 플랫폼과 같은 다른 폴리뉴클레오티드 플랫폼을 사용하여 제조된 분자 형상을 포함하며, 여기서 다른 폴리뉴클레오티드 플랫폼에 대한 본 발명의 구현예의 적용의 일부 예는 하기에 더 상세히 기재된다.
본 발명의 일부 구현예는 2개의 부분을 갖는다: 첫째로, 분석물 분자의 용액과 같은 외부 자극의 적용시 그 상태를 변화하도록 설계된 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서, 및 둘째로, 장치의 상태 변화가 DNA 서열, 광학 신호 또는 전자 신호로 기록되는 것을 가능하게 하는 일련의 프로토콜 및 방법.
용액(도 1a) 또는 표면(도 1b)에서 기능할 수 있는 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서가 본원에 기재된다. 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서를 도입하기 위해, 용액 및 표면 버전 둘 모두에 공통된 특징이 먼저 기재된다. 일 구현예에서, 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서는 하나 이상의 가요성 링커에 의해 함께 테더링된 2개의 폴리뉴클레오티드 형상으로 구성된다. 명확성을 위해, 도 1에는 단일 링커만 도시되어 있다.
쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서는 분자 이벤트를 검출하기 위한 일반적인 플랫폼을 나타낸다. 명확성을 위해, 센서는 도 1a-1b에 도시된 바와 같고, 여기서 이들 센서는 분석물 분자의 농도를 측정하는 데 일반적으로 사용되는 능력인 결합 이벤트의 검출에 적합화된 것이다. 또한, 도 1a-1b는 ELISA와 같은 샌드위치 면역검정에서 일반적으로 사용되는 능력인 단백질의 검출을 위한 "샌드위치 작동 모드"에서 항체 쌍과 함께 사용하도록 특별히 적합화된 상기 센서를 도시한다. 나중에, 도 3은 핵산의 검출을 위한 샌드위치 작동 모드를 도시한다. 또한 나중에, 도 4 및 5는 플랫폼을 사용하여 검출 및 정량화될 수 있는 다른 분자 이벤트 중 일부를 강조하는 다수의 구현예를 도시하며, 관련된 다양한 분자 존재물에 관한 세부사항을 도시한다.
따라서, 샌드위치 작동 메커니즘의 2개의 예시적인 예(도 1a, "용액 버전", 및 도 1b "표면 버전")가 있으며, 폴리뉴클레오티드 형상 각각은 분석물 분자 또는 입자의 고유한 중복되지 않는 영역에 결합하는 "결합 분자"(예를 들어, 앱타머, 항체 또는 나노바디)를 갖는다. 표적 분석물의 부재하에서, 2개의 오리가미는 가요성 링커를 통해 서로에 대해 이동하며, 이는 "개방"으로 언급되는 상태이다. 그러나, 분석물 포획시, 2개의 오리가미는 결합하여 "폐쇄"로 언급되는 상태인 단일한 반강성 유닛을 형성한다. 일부 구현예에서, 오리가미 중 적어도 하나는 개방에서 폐쇄로의 상태 변화를 검출하는 데 사용될 수 있는 독특한 DNA 바코드 또는 발광 또는 전자 활성 신호전달 분자를 갖는다. 명확성을 위해, 도 1a의 용액 버전의 일 구현예의 설명에서, 폴리뉴클레오티드 형상 중 하나 또는 둘 모두가 발광 분자를 가질 가능성이 생략되었으나; 일부 구현예에서, 용액 버전은 신호 검출의 목적을 위해 발광 분자를 갖는 것은 하기 기재되는 바와 같다.
다음 용어는 본 발명의 개시 전체에 걸쳐 상호교환적으로 사용된다: 쌍 안정 분자 센서, 쌍 안정 센서, 쌍 안정 검출기, 쌍 안정 장치, 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 나노구조, 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 장치, 쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서, 플라이트랩(flytrap) 센서, 플라이트랩 검출기, 또는 플라이트랩.
본 발명의 개시에서, 쌍 안정 센서의 적어도 2개의 반강성 폴리뉴클레오티드 형상은 "뚜껑(lid)"으로 언급되며, 도표 내에서 이들 뚜껑의 배향과 관련하여 또는 표면 상의 쌍 안정 센서의 배향과 관련하여 "상부 뚜껑" 및 "하부 뚜껑"으로 지칭될 수 있다. 이들 뚜껑은 상기 기재된 바와 같은 임의의 폴리뉴클레오티드 플랫폼을 사용하여 구현될 수 있는 경우 "DNA 오리가미"이다.
본 발명의 개시에서, "링커" 또는 "힌지"로서 뚜껑 사이의 가요성 연결. 일부 구현예에서, 뚜껑 사이에 하나 초과의 링커가 존재할 수 있고, 일부 구현예에서, 단일 링커는 단일 가닥 DNA, 이중 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 이중 가닥 RNA, 이중 가닥 DNA 나선의 다발, 이중 가닥 RNA 나선의 다발, 폴리뉴클레오티드 유사체, 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 비-폴리뉴클레오티드 중합체를 포함할 수 있다. 구현예에 따라, 링커는 단일 공유 결합(약 2 옹스트롬)에서 최대 10,000개의 뉴클레오티드 이중 결합 링커(약 3.5 마이크론)의 길이로 다양할 수 있다. 용액 기반 검출(예를 들어, LRET 또는 PCR-증폭 가능 DNA 신호이나 이에 제한되지는 않음)을 사용하는 구현예는 전형적으로 더 짧은 링커(1 nm 내지 10 nm)를 사용하는 반면, 표면 기반 광학 검출 또는 전자 검출을 사용하는 구현예는 전형적으로 더 긴 링커(10 nm 내지 4 마이크론)를 사용할 것이다.
쌍 안정 폴리뉴클레오티드 센서의 일부 구현예는 독립적으로 합성된 링커로 자가 조립된 2개의 독립적으로 폴딩된 DNA 오리가미 형상을 포함하는 반면, 다른 구현예는 폴리뉴클레오티드 형상 및 링커 둘 모두가 단일한 긴 DNA 스캐폴드 가닥으로부터 모두 폴딩된 단일 DNA 오리가미를 포함한다. 쌍 안정 센서의 또 다른 구현예는 단일 가닥 DNA 타일, 다중 가닥 DNA 타일, 단일 가닥 RNA 또는 DNA 오리가미, 또는 임의의 다른 적합한 폴리뉴클레오티드 플랫폼으로부터 생성된다.
구현예에 따라, 분자 이벤트(예를 들어, 분석물 분자의 결합)에 의해 유도된 상태 변화는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 상이한 방법 중 하나에 의해 용액 내에서 또는 표면 상에서 검출될 수 있다: (1) 검정이 용액에서 수행되는 경우, 상태 변화(개방 대 폐쇄)는 정량되는 분석물의 정체를 인코딩하는 독특한 DNA 바코드를 통해 또는 발광 공명 에너지 전달을 통해 검출될 수 있거나, (2) 검정이 표면 상에서 수행되는 경우, 상태 변화는 광학 또는 전기 신호에서의 변화로 기록될 수 있으며, 여기서 표면 상의 쌍 안정 오리가미 장치의 공간적 위치는 기록되는 분자 이벤트의 특성(예를 들어, 정량되는 분석물의 정체)을 인코딩한다.
DNA 바코드 신호의 출력을 통해 검출을 제공하는 일부 "용액 버전" 구현예의 경우, 장치의 쌍 안정성은 우리가 표적 분석물에 결합하지 않는 장치를 우선적으로 제거할 수 있게 한다(도 2). 개방된 장치는 친화성 컬럼(예를 들어, 스트렙타비딘 비드를 포함함)에 결합할 수 있는 이용 가능한 정제 태그(도 2a, 예를 들어, 비오틴)를 갖는다. 결합된 분석물을 갖는 나머지 폐쇄 장치는 숨겨진 친화성 태그를 가지며, 따라서 이들은 친화성 태그에 결합하는 비드를 갖는 친화성 컬럼 상을 통과해야 하며(도 2b), 분석을 위해 수집될 수 있다.
친화성 컬럼으로부터 용리시, 폐쇄된 분석물 결합된 장치는 표준 PCR을 통해 검출되거나, 정량 PCR, 액적 디털 PCR, 또는 부착된 DNA 바코드를 기반으로 하는 차세대 DNA 시퀀싱 또는 딥 DNA 시퀀싱에 대한 다양한 접근법을 통해 정량될 수 있다. DNA 바코드를 검출하고 정량하는 데 사용되는 정확한 접근법에 따라, 장치는 추가 처리 및 정제 없이 사용될 수 있거나, DNA 바코드가 쌍 안정 장치로부터 방출되어 판독되기 전에 정제될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 바코드는 센서로부터 바코드 분자를 절단하는 제한 효소의 사용을 통해 쌍 안정 센서로부터 방출될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 바코드는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Zhang et al, "Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions", Nature Chemistry 3 (2011): 103-113]에 기재된 바와 같이 가닥 치환 반응을 통해 쌍 안정 센서로부터 방출될 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 바코드는 쌍 안정 센서로부터 방출되지 않고, 이는 직접 판독된다.
DNA 바코드 신호를 출력으로 사용하는 일부 용액 기반 구현예의 장점은 다음을 포함한다: (1) 이들은 기존 시약(표준 샌드위치 면역검정을 위한 항체가 쌍 안정 장치에 커플링될 수 있음)과 함께 사용될 수 있고, (2) 이들은 DNA 증폭에 필요한 것(예를 들어, PCR) 이상의 수단 없이 사용될 수 있고, (3) 이들은 형광 기반 qPCR의 경우 적어도 8개의 분석물 및 차세대 시퀀싱의 경우 적어도 1000개의 분석물로 높은 수준의 다중화를 가능하게 하고, (4) 이들은 쌍 안정 센서의 DNA 바코드 출력을 가져오고 이를 액적 디지털 PCR(ddPCR)에 대한 입력으로 사용하여 매우 정량적이 될 수 있다. 따라서, 핵산 계수를 위한 표준 기술(ddPCR)은 쌍 안정 센서의 사용을 통해 단백질 분자를 계수하는 데 사용될 수 있다.
임의의 특정 용액 기반 구현예의 민감도, 위 음성 및 위 양성 비율은 (1) 장치 내의 결합 분자에 대한 분석물의 결합 친화성, 및 결합된 분석물이 장치를 완전히 폐쇄하는 정도, (2) 정제 태그가 결합된 상태에서 '숨겨진' 정도, 및 (3) '숨겨지지 않은' 정제 태그가 용액으로부터 분석물이 결합되지 않은 장치의 완전한 제거를 허용하는 정도에 의해 설정될 것이다. 예를 들어, 폐쇄된 장치가 여전히 비오틴과 같은 소분자 정제 태그가 오리가미 표면의 구멍으로부터 약간 돌출되도록 허용하는 경우, 일부 분석물 분자가 친화성 컬럼에서 손실되어 단백질 농도의 위 음성 또는 과소평가를 발생시킬 수 있다. 유사하게, 쌍 안정 장치에 대한 분석물의 결합이 상대적으로 약하고, 장치가 지속적으로 폐쇄되지 않고, 여전히 동적으로 개방되고 폐쇄되는 경우, 이는 컬럼에서 손실될 수 있다.
따라서, 일부 구현예에서, 분석물이 결합하는 경우 활성화되는 한 쌍의 짧은 상보적 단일 가닥 DNA를 포함하는 추가적인 '약한 잠금'은 위 음성을 감소시킬 수 있다. 약한 잠금은 분석물이 없는 장치의 평형을 폐쇄 입체형태로 이동시키는 경향이 있을 것이다. 상기 장치가 폐쇄 입체형태에서 충분한 시간, 특히 장치가 컬럼을 통과하는 데 걸리는 평균 시간을 소비하는 경우, 이는 컬럼 결합을 피할 수 있고, 위 양성을 생성할 수 있다.
따라서, 약한 잠금을 갖는 구현예에서, 약한 잠금의 강도는 분석물이 결합되지 않은 쌍 안정 장치의 변동(개방과 거의 폐쇄 사이)이 친화성 컬럼에 결합하기에 충분한 기회, 즉, 높은 확률로 그렇게 할 기회를 생성하도록 조정되어야 한다.
분석물이 결합되지 않은 장치가 컬럼에 결합할 가능성이 높을수록, 통과하여 위 양성을 발생시킬 가능성이 낮아진다. 따라서, 일부 구현예에서, 다수의 순차적 친화성 컬럼 분리를 사용하여 위 양성을 감소시킬 수 있다.
도 1a의 약한 잠금 및 친화성 태그의 외관과 관련하여, 친화성 태그는 명확성을 위해 단일 가닥의 약한 잠금의 말단에 위치하는 것으로 그려졌다. 일부 구현예는 약한 잠금 및 친화성 태그의 이러한 입체형태를 갖는다. 다른 구현예에서, 약한 잠금 및 친화성 태그는 쌍 안정 센서의 내부 표면 상의 별도의 링커에 있다. 다른 구현예에서, 약한 잠금은 없고, 친화성 태그는 쌍 안정 센서의 내부 표면 상의 링커에 있다.
결합된 분석물을 갖는 쌍 안정 장치가 종종 개방 입체형태로 변동하는 약한 분석물 결합의 경우(분석물이 여전히 2개의 뚜껑 중 하나에 결합된 경우), 분석물의 추가 카피의 결합은 추가 결합 부위가 이용 가능한 경우 개방 입체형태의 빈도를 감소시키는 역할을 할 수 있다. 따라서, 용액 기반 쌍 안정 센서의 일부 구현예에서, 도 4b에서 표면 상의 DNA 검출에 대해 제시된 것("협동 샌드위치 메커니즘"으로 표지됨)과 유사한 방식으로 센서의 상부 및 하부 뚜껑 상의 각각의 결합 파트너의 다중 카피의 포함을 통한 협동성의 이용은 또한 위 음성을 감소시킬 수 있다.
용액 기반 쌍 안정 센서의 일부 구현예에서, 시간 분해 광학 출력의 사용은 긴 수명의 방출기의 시간 분해 발광을 측정할 수 있는 널리 설치된 상업용 플레이트 판독기의 베이스에서 쌍 안정 센서의 사용을 가능하게 한다. 상기 구현예에서, 용액 기반 센서는 DNA 바코드, 또는 친화성 태그 또는 약한 잠금을 필요로 하지 않는다. 판독값은 짧은 수명(나노초에서 마이크로초)의 방출기(예를 들어, 유기 형광단 또는 양자점)와 긴 수명의 방출기(밀리초) 발광 화합물, 예를 들어, 유로퓸 및 테르븀 킬레이트 사이의 발광 공명 에너지 전달을 기반으로 한다. 상기 구현예에서, 쌍 안정 센서의 하나의 뚜껑은 유기 형광단으로 표지된다. 일부 구현예에서, 하나의 뚜껑 상의 유기 형광단은 유기 켄처로 대체될 수 있다. 상기 구현예에서, 쌍 안정 센서의 제2 뚜겅은 유로퓸 및 테르븀 킬레이트와 같은 긴 수명의 방출기로 표지된다.
짧은 수명 및 긴 수명의 방출기에 사용되는 특정 파장에 따라, 에너지 전달(공여체에서 수용체로)은 짧은 수명의 방출기에서 긴 수명의 방출기로이거나 그 반대일 수 있다. 두 경우 모두, 펄스화된 여기 광이 사용되며, 짧은 수명의 방출기의 감쇠 수명이 지난 후에 시간 분해 측정이 이루어진다. 이러한 방식으로, 모든 산란된 여기 광이 소산되고, 측정된 유일한 신호는 짧은 수명과 긴 수명의 방출기 사이에 전달되어 신호 대 노이즈 및 결과적으로 검정의 감도를 크게 증가시키는 것이다. 상기 측정의 일반적인 원리인 발광 공명 에너지 전달(LRET)은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Selvin et al, "Luminescence Resonance Energy Transfer" Journal of the American Chemical Society, 116(1994):6029-6030]에 이전에 기재되었다.
반면에, 쌍 안정 센서가 표면에 고정된 경우(도 1b), 분석물의 결합은 전자적으로(도 6) 또는 광학적으로(도 7) 측정된 상태 변화로 인식될 수 있다. 쌍 안정 장치의 상태 변화를 검출하기 위한 표면 기반 접근법의 각각의 구현예는 용액 접근법과는 상이한 세트의 위 양성 및 위 음성 오차에 대한 메커니즘을 가질 것이고, 따라서 일부 구현예에서 검출은 다른 것보다 더 정량적일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에 대해 나중에 논의되는 바와 같이, 위 양성은 분석물의 부재하에서 상부 오리가미 형상이 표면에 비특이적으로 결합하는 경우(도 9a)에 발생할 수 있다.
일부 용액 구현예와 마찬가지로, 일부 표면 기반 구현예는 고 민감도 측정을 달성한다. 일부 표면 기반 구현예는 모두의 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 TIRF 현미경검사(문헌[Gietl et al "DNA origami as biocompatible surface to match single-molecule and ensemble experiments" Nucleic Acids Res. 40 (2012): e110 및 Tsukanov et al, "Detailed study of DNA hairpin dynamics using single-molecule fluorescence assisted by DNA origami", Phys. Chem. B 117 (2013):11932-11942]에서 단일 오리가미에 대해 기재된 바와 같음) 또는 전기화학 검출(문헌[Lai, "Chapter Eight: Folding- and Dynamics-Based Electrochemical DNA Sensors", Methods in Enzymology, 589 (2017):221-252; Immoos et al, "DNA-PEG-DNA triblock macromolecules for reagentless DNA detection", Journal of the American Chemical Society 126 (2004):10814-10815; Wu et al, "Development of a "signal-on" electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for point mutation detection", Chemical Communications, 49 (2013): 3422-3424; 및 Wu, et al, "Effects of DNA probe and target flexibility on the performance of a "signal-on" electrochemical DNA sensor" Analytical Chemistry 86 (2014) 8888-8895]에서 작은 핵산의 재구성에 대해 기재된 바와 같음)의 사용을 통해 고 민감도를 달성하며, 여기서 표면 상의 핵산에 대한 분석물 핵산의 결합은 전기화학적으로 활성인 작용기(페로센 또는 메틸렌 블루)를 표면에 근접하게 만들며, 여기서 이는 전자적으로 검출될 수 있다.
일부 구현예에서, 표면 기반 광학 및 전자 측정은 DNA 오리가미 위치결정 기술의 사용을 통해 아날로그 측정에서 디지털 측정으로 전환될 수 있다. 디지털 측정은 DNA 오리가미를 사용하여 달성될 수 있는데, 이는 모든 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kershner et al, "Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces", Nature Nanotechnology 4 (2009):557-561; Hung et al, "Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami", Nature Nanotechnology 5 (2010): 121-126; Gopinath et al, "Optimized Assembly and Covalent Coupling of Single-Molecule DNA Origami Nanoarrays", ACS Nano 8 (2014):12030-12040; 및 Gopinath et al, "Engineering and mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami", Nature 535 (2016): 401-405]에 기재된 바와 같이 개별 DNA 오리가미가 이들을 위치결정하기 위한 리소그래피 기술을 사용하여 표면 상의 격자로 거의 결정적으로(부위의 95% 초과가 단일 오리가미를 가짐) 이격될 수 있기 때문이다. 상기 이전에 기재된 "DNA 오리가미 배치" 기술은 95% 초과의 확률로 개별 쌍 안전 센서를 개별 광학 또는 전자 장치에 배치할 수 있게 하여, 센서의 95% 초과가 표적 분자를 감지하는 데 이용 가능할 것이다. 이는 점적의 37% 이하로 단일 핵산을 달성하기 위해 개별 분석물 핵산으로 점적을 채우기 위해 포아송 통계에 의존하는 액적 디지털 PCR과 대조적이다. 따라서, 쌍 안정 센서를 판독하는 표면 기반 접근법의 일부 구현예는 판독을 위해 액적 디지털 PCR에 의존하는 일부 용액 기반 방법보다 많은 정량적 결과를 제공할 수 있다.
일부 표면 기반 구현예는 널리 이용 가능한 기술을 사용하여 상이한 분석물에 대한 특이성을 갖는 표면 고정된 장치의 스폿을 인쇄함으로써 높은 정도의 다중화를 달성한다. 도 10은 각각의 스폿이 동일한 쌍의 결합 분자를 갖는 수천 개의 장치를 가질 것이지만, 상이한 스폿은 상이한 쌍의 결합 분자를 가질 것임을 제시한다. 일부 구현예는 잉크젯 인쇄로 이러한 공간 다중화를 달성하고, 다른 구현예는 마이크로어레이 스폿팅으로 다중화를 달성한다.
일부 용액 기반 구현예와 유사하게, 일부 표면 기반 구현예는 표적 분자를 결합시키기 위해 기존 샌드위치 ELISA 시약을 사용할 수 있으나, 상기 구현예는 추가 물질(전자 또는 광학 칩) 및 기기(전자 판독기 또는 TIRF/다른 광학 판독기 또는 현미경)를 필요로 할 수 있다.
본 발명의 일부 구현예는 다음 특성 중 하나 이상을 갖는 검정의 첫 번째 예를 나타낸다: (1) 정제 태그를 숨기는 원리에 기초하여 분석물 결합 신호를 독특하고 증폭 가능한 DNA 신호로 전환(장치의 상태를 개방에서 폐쇄로 변화)시키는 쌍 안정 DNA 나노구조 장치. (2) 단일 분석물 분자의 결합시 크고 가요성인 쌍 안정 DNA 장치의 작고 컴팩트한 강성 장치로의 전환을 민감하게 측정하기 위한 다중 표면 기반 방법을 사용한 검정. (3) PCR/시퀀싱을 통한 용액 내 또는 광학 또는 전자 신호의 공간적 위치를 통한 표면 상에서의 기재된 쌍 안정 DNA 나노구조 장치에 기초한 다중 분석물의 정량적 측정을 다중화하는 능력을 갖는 검정. (4) 디지털 액적 PCR과 동일한 규모로 단백질 분자의 디지털 정량화를 제공할 수 있는 검정.
본 발명의 일부 구현예는 기존의 전기화학적 검정에 비해 유의한 개선을 제공한다. 문헌[Lai, "Chapter Eight: Folding- and Dynamics-Based Electrochemical DNA Sensors", Methods in Enzymology, 589 (2017):221-252; Immoos et al, "DNA-PEG-DNA triblock macromolecules for reagentless DNA detection", Journal of the American Chemical Society 126 (2004):10814-10815; Wu et al, "Development of a "signal-on" electrochemical DNA sensor with an oligo-thymine spacer for point mutation detection", Chemical Communications, 49 (2013): 3422-3424; 및 Wu, et al, "Effects of DNA probe and target flexibility on the performance of a "signal-on" electrochemical DNA sensor" Analytical Chemistry 86 (2014) 8888-8895]에 기재된 바와 같은 폴딩 기반 검정은 전기화학 감지(페로센 또는 메틸렌 블루 신호전달 분자를 사용함)를 통해 표면 상의 검출기에 대한 핵산의 결합으로 인한 입체형태 변화를 검출하는 데 사용되었다. 이러한 설정에서, 단일 핵산은 신호전달 분자가 표면에 가깝도록 분석물 핵산이 전체 구조체에 결합하고 폴딩할 때 단일 신호 분자를 표면에 가까워지도록 한다.
본 발명의 개시의 구현예는 중요한 방식에서 상이하다: (i) 개시된 작업은 이전 작업이 DNA 또는 RNA로 제한되는 경우 단백질 또는 임의의 분석물이 검사될 수 있게 한다. (ii) 이전 작업은 결합 이벤트 당 단일 신호 분자를 사용한다. 본원에 개시된 DNA 오리가미 또는 또 다른 큰 DNA 나노구조의 사용은 본원에 개시된 신호가 훨씬 강할 수 있음을 의미하며; 적어도 200개의 신호 분자가 오리가미 중 하나에 혼입되어 본 발명의 검정이 원칙적으로 200배 더 민감하도록 증폭을 제공할 수 있다. (iii) 이전 작업은 검출 분자를 단지 몇 나노미터로 폴딩한다. 이는 신호 분자가 비활성(분석물 없음)에서 활성(분석물 결합) 상태로 매우 멀리 이동하지 않음을 의미한다. 차례로, 이는 비활성 및 활성 상태가 가능한 만큼 강하게 분화되지 않고, 검정이 가능한 한 잠재적으로 민감하지 않음을 의미한다. 본원에 개시된 작업에서, 테더는 최대 수 마이크론 길이일 수 있다(모든 방법 아래로 수 나노미터까지 조정 가능). 이는 신호전달 분자를 갖는 오리가미가 비활성 상태의 신호를 최소화하기 위해 표면 위의 최적의 높이에 위치하게 하여 분석물 결합 상태에 대한 민감도를 최대화할 것이다. 이전 작업에서, 짧은 링커는 검출 방법을 전기화학적 감지로 제한하였다. 본원에 개시된 작업에서, 링커는 비활성 상태에서 신호전달 분자를 TIRF 기판의 감쇠장으로부터 유의하게 이동시키기에 충분히 길 수 있으므로(예를 들어, 200 나노미터), TIRF 현미경검사는 훨씬 더 높은 민감도를 달성할 수 있을 것이다.
본 발명의 구현예는 기존의 TIRF-기반 검정에 비해 유의한 개선을 제공한다. TIRF는 이전에 분자 결합 또는 입체형태 변화의 검출을 위해 표면 결합 오리가미에 사용되어 왔다(Gietl et al "DNA origami as biocompatible surface to match single-molecule and ensemble experiments" Nucleic Acids Res. 40 (2012): e110 및 Tsukanov et al, "Detailed study of DNA hairpin dynamics using single-molecule fluorescence assisted by DNA origami", Phys. Chem. B 117 (2013):11932-11942.). 이들 연구는 본원에 개시된 방법이 낮은 부피/낮은 농도/단일 분자 체제에서 단백질의 정량화에 사용될 수 있음을 뒷받침한다. 그러나, 이들 이전 연구는 (i) 단백질보다는 핵산을 연구하였고, (샌드위치 검정에서와 같이) 분석물을 동시에 결합시키기 위해 2개의 결합 분자를 사용하기 위한 시설을 제공하지 않는다. (i) 단일 신호전달 분자를 사용하여 매우 간단한 헤어핀 또는 홀리데이 정션(Holliday junction)의 입체형태적 변화를 연구하였다. 본원에 개시된 훨씬 더 큰 장치는 분자 이벤트의 더 큰 증폭 및 민감도를 위해 200개 초과의 신호전달 분자를 가질 것이다. (ii) 짧은 링커/작은 입체형태적 변화를 사용하였다. 다시, 본원에 개시된 작업은 동일한 수의 신호전달 분자에 대해 더 높은 민감도를 가능하게 할 매우 큰 입체형태 변화를 사용한다.
쌍 안정 오리가미 검출기는 다른 잠재적인 방법에 비해 몇 가지 장점을 갖는다. 면역검정(DNA 및 RNA 검출에도 적용되지만, 일반적으로 핵산 검출에 사용되지 않음)의 언어에서, 검출 시스템의 구성요소가 함께 혼합될 임의의 필요 없이 그리고 중요하게는 추가 샘플이 세척되거나 2차 검출 시스템이 첨가될 필요 없이 분석될 샘플이 검출기에 간단히 추가될 수 있는 "균질성 검정"의 기초로 작용할 수 있다. 이는 검출 실험이 직접적이고 신속하게 진행될 수 있음을 의미한다. 둘째로, 오리가미 도메인은 전형적으로 매우 크기 때문에(수 메가달톤), 이들은 전형적으로 검출되는 분자보다 100-1000배 더 크다(킬로달톤 내지 수십 킬로달톤). 이는 오리가미가 2차 증폭 시스템의 사용 없이 200배 증폭을 제공할 수 있는 다수의 신호전달 분자를 가질 수 있음을 의미한다.
도 1 및 도 2에서, 단백질의 검출을 위해 항체를 사용하는 샌드위치 작동 메커니즘을 사용하는 구현예가 도시되어 있다. 도 3은 핵산의 검출을 위해 샌드위치 작동을 사용하는 상이한 구현예를 도시한다. 도 3a는 표면 상의 플라이트랩 장치의 기본 기하학을 제시한다. 이는 2개의 100 나노미터 직경의 DNA 오리가미 디스크 또는 "뚜껑"을 포함하고, 이들 사이에 10 나노미터 내지 4,000 나노미터 이중 가닥 DNA 링커를 포함한다. 단일 가닥 표적 핵산 서열 XY의 검출은 각각 표적 서열의 절반에 상보적이고, 상부 및 하부 뚜껑의 내부에 각각 결합된 한 쌍의 프로프 X' 및 Y'에 의해 매개된다.
XY의 부재하에서, 플라이트랩의 뚜껑은 독립적으로 확산될 것이며, 이는 테더에 의해 제한되고, 이는 본 발명의 개시에서 "개방" 상태로 언급된다. 도메인 X 및 Y 둘 모두가 본 발명의 개시에서 "폐쇄" 상태로 언급되는 플라이트랩 상의 이들의 상보적 프로브에 결합하는 경우, 장치의 2개의 뚜껑은 선택된 특정 프로브-표적/장치 기하학에 의해 설정된 거리로 공동 국소화될 것이다. 예를 들어, 프로브가 프로브-표적 듀플렉스의 끝에 있는 위치에서 뚜껑에 테더링되도록 선택되는 경우, 뚜껑은 단일 프로브-표적 듀플렉스의 길이의 대략 2배의 거리에 고정될 것이다(10-mer 프로브 쌍의 경우 약 7 nm, 20-mer 프로브 쌍의 경우 약 14 nm). 반면에, 링커를 프로브-표적 듀플렉스의 중간에 인접하게 하는 기하학으로 뚜껑에 테더링되도록 프로브를 선택하는 경우, 뚜껑은 표적 서열의 길이와 무관하게 대략 2-4 나노미터(최대 2개의 DNA 나선의 폭)의 거리에 고정될 수 있다.
도 3c에 기재된 플라이트랩은 단일 가닥 DNA, 단일 가닥 RNA, 또는 다른 단일 가닥 폴리뉴클레오티드 유사체를 검출하는 데 가장 효율적일 것이다. 특별한 DNA 듀플렉스 서열, 즉, DNA 삼중 나선을 형성할 수 있는 것들의 경우, DNA 삼중 나선 형성의 동역학이 느리고, 표적 분석물이 폴리퓨린:폴리피리미딘 삼중체 형성 서열로 제한되더라도, 도 3c의 플라이트랩은 이중 가닥 DNA를 검출하는 데 사용될 수 있다.
반면에, dCas9/CRISPR 복합체의 사용을 통해, 2개의 상이한 방법을 통해 이중 가닥 DNA를 효율적으로 검출할 수 있는 플라이트랩을 생성하는 것이 가능하다. CRISPR 시스템에서, dCas9 단백질은 gRNA와 복합체를 이루며, 이들 각각은 20-뉴클레오티드 RNA "가이드" 서열을 갖는다. dCas9의 도움으로, 가이드 서열은 적절한 이중 가닥 DNA로 가닥 치환될 수 있고, 본질적으로 상보적 표적에 비가역적으로 결합할 수 있다.
따라서, 일부 구현예(도 3d)에서, 각각의 뚜껑은 관심 DNA 서열에서 인접한 20-뉴클레오티드 표적 쌍에 결합하도록 선택된 2개의 상이한 가이드 서열 중 하나를 갖는 부착된 gRNA를 갖는다. 분석물 DNA의 도입 전에, dCas9 단백질이 도입되며, gRNA에 조립된다. 결과적으로, 단일한 이중 가닥 분석물 DNA에 대한 2개의 CRISPR/dCas9 복합체의 동시 결합은 플라이트랩을 폐쇄할 것이다.
상기 구현예에서, 주의할 점은 표적 서열이 특정 컨센서스 서열, 예를 들어, NGG를 갖는 소위 PAM-부위에 인접해야 한다는 것이다. 따라서, 천연 DNA의 경우, 통상적인 dCas9를 사용한 검출은 우연히 2개의 적절한 간격의 PAM-부위(약 50개의 뉴클레오티드 이내)를 갖는 DNA 서열로 제한될 것이다. 최근 분석된 GFP 구조는 CRISPR-기반 유전자 조절 실험에서 대조군으로 사용되었으며, DNA의 여러 스트레치가 도 3d에 도시된 이중-표적 검출 계획에 적절한 거리에서 PAM 부위의 이중 발생을 갖는 것으로 밝혀졌다. 또한, 일부 구현예에서, S. 피오게네스(S. Pyogenes) 이외의 유기체로부터의 Cas 단백질(또는 임의의 적합한 엔도뉴클레아제), 및 이들의 PAM 부위에 대한 상이한 서열 특이성을 갖는 조작된 엔도뉴클레아제 단백질(예를 들어, Cas9)은 더 큰 범위의 서열이 검출될 수 있게 할 것이다. 표적 분석물이 바-코딩 방식 또는 DNA 저장에 사용되는 인공 DNA인 경우, 필요할 때마다 PAM 부위 쌍을 추가하는 것은 어렵지 않다.
상기 이중 표적 체계를 갖는 구현예의 장점은 이들이 표준 gRNA 서열과 함께 작동할 것이라는 점이다. 또한, 원자간력 현미경(AFM) 데이터(도 3f)는 인공 가이드 서열을 갖는 dCas9이 오리가미의 가장자리를 따라 짧은 인공 표적에 용이하게 결합한다는 것을 제시한다. 따라서, CRISPR/dCas9 복합체는 원하는 위치에서 DNA 오리가미와 잘 통합된다. 이중 표적 체계는 CRISPR/dCas9의 DNA-결합 부분이 도 3f에서와 같이 오리가미에 결합하기보다는 자유로울 것을 요구한다. 따라서, 일부 구현예에서, gRNA의 3' 연장은 플라이트랩에 CRISPR/dCas9 복합체를 고정시키는 데 사용될 것이다.
상기 이중 표적 체계의 제한적이 서열 구속은 이들이 2개의 표적/PAM 부위 및 적어도 46개의 뉴클레오티드의 길이를 갖는 DNA 분석물을 필요로 한다는 것이다. 다른 구현예는 더 적은 서열 제약으로 이중 가닥 DNA의 검출을 가능하게 한다. 동적 DNA 및 RNA 나노기술은 비평형 DNA 반응을 사용하여 정렬된 이벤트의 캐스케이드를 생성하도록 한다(문헌[Zhang et al, "Dynamic DNA nanotechnology using strand-displacement reactions", Nature Chemistry 3 (2011): 103-113]에 기재된 바와 같음). 고전적인 예는 소위 헤어핀-사슬 반응이다. 이러한 유형의 반응은 트리거 서열이 결합할 때까지 헤어핀을 형성하는 또 다른 보호 서열을 통해 서열이 "숨겨진" 상태를 유지할 수 있게 한다.
따라서, 소위 "알로스테리" CRISPR/Cas9 복합체를 생성하기 위해 서열을 숨기는 원리는 이중 가닥 DNA 센서를 달성하기 위해 사용될 수 있다(도 3e). 플라이트랩의 바닥 뚜껑에 위치된 알로스테리 CRISPR/Cas9은 표적 이중 가닥 서열 X에 결합시 플라이트랩의 뚜껑 상의 서열 hY'에 상보적인 새로운 서열 hY를 나타내어 플라이트랩을 폐쇄시킨다. 이를 위해, gRNA의 5' 말단은 가이드 서열과 헤어핀을 형성할 새로운 서열로 연장될 수 있다. 따라서, 가이드 서열은 관심 이중 가닥 DNA(X)가 알로스테리 CRISPR/Cas9에 결합할 때까지 hY'으로부터 서열 hY를 숨기고 보호하는 역할을 한다.
여기서, 용어 알로스테리의 사용은 문헌에서 알로스테리의 표준 사용과 일치하지만 다소 드문 경우이다. 정의에 의해 알로스테리는 단순히 제3 분자 C에 대한 제2 분자 B(전형적으로, 단백질)의 결합 또는 활성을 변화시키는 하나의 분자 효과기 A의 능력을 포함한다. 여기에 제공된 알로스테리 체계에서, 관심 이중 가닥 DNA는 효과기 A의 역할을 하고, CRISPR/dCas9 복합체는 B의 역할을 하고, 플라이트랩의 뚜껑 상의 서열은 C의 역할을 한다. 도 3e의 체계는 알로스테리가 일반적으로 단백질의 "정상적인" 활성에 대해 정의된다는 점에서 특이하다. 여기서, 단백질의 "정상적인" 활성은 단백질에 대한 새로운 기능, 즉, 플라이트랩 뚜껑을 결합하는 기능을 켜거나 끄는 알로스테리 트리거로 사용된다. 소분자 (4-하이드록시타목시펜)가 CRISPR/cas9의 활성을 전환하는 표준 알로스테리가 기재되어 있지만(Oakes et al "Profiling of engineering hotspots identifies an allosteric CRISPR-Cas9 switch", Nature Biotechnology 34 (2016):646-651), 상기 종류의 체계는 CRISPR/cas9의 문헌에 보고된 것으로 생각되지 않는다.
이중 가닥 DNA를 검출하기 위한 도 3e의 알로스테리 체계의 장점은 단일 20-뉴클레오티드 표적 및 이의 3-뉴클레오티드 PAM 부위만 필요로 한다는 것이다. XRN-1 5'에서 3'으로의 엑소뉴클레아제 또는 다른 활성은 효모 및 포유동물 세포에서 생체 내 gRNA의 5' 말단에 기능성 서열의 유용한 첨가를 억제하는 것으로 나타났음에 주목한다(상기 첨가는 Cas9의 단백질 외피에 의해 보호되지 않음). 여기서, 시험관 내 DNA 검출이 수행되기 때문에, 상기 연장은 분해되지 않을 것이다. 일부 구현예에서, 작은(< 10 nt 스템) 헤어핀은 가이드의 중요한 처음 10개 뉴클레오티드(PAM 부위에 가까움)에서 CRISPR/Cas9 DNA 복합체의 개시를 방해하는 것을 피하고, 센서의 민감도를 최대화하기 위해 사용될 수 있다.
일부 관심 천연 서열은 필연적으로 NGG가 누락될 것이지만, 이들 경우에, 상이한 PAM 부위 박테리아로부터의 Cas-단백질 Cpf1)를 갖는 상이한 천연 또는 돌연변이체 CRISPR 시스템(예를 들어, TTTN PAM 부위를 갖는 프레보텔라(Prevotella) 및 프란시셀라(Francisella)의 사용은 일부 구현예에서 사용 가능한 표적 서열을 찾을 가능성을 크게 증가시킬 것이다. 또한, Cpf1은 dCas9과는 완전히 상이한 gRNA 구조 및 3'-말단 가이드 서열을 가지며, 이는 일부 표적 서열에 대해 더 양립가능함을 입증할 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, CRISPR/Cpf1은 CRISPR/dCas9 대신 사용될 것이다.
도 1 내지 3에서, 단백질 및 핵산과 같은 분석물의 정량화를 향해 분자 결합 이벤트를 검출하고 정량화하기 위해 샌드위치 작동 메커니즘을 사용하는 것이 기재된 구현예가 도시되어 있다. 도 4 및 도 5는 추가 문맥에서 쌍 안정 분자 센서를 설명한다. 기본적인 쌍 안정 센서 설계는 센서의 상부 뚜껑 및 하부 뚜껑의 역할이 분자 이벤트의 검출과 관련하여 상이한 역할을 갖고, 이들 역할이 분자 이벤트가 결합 이벤트이거나, 입체형태적 변화이거나, 다른 분자 이벤트인지의 여부에 기초하여 상이한 여러 "작동 메커니즘"을 갖는다. 도 4a, 4c 및 4d에 제시된 바와 같이, 감지 메커니즘이 "샌드위치 메커니즘"(결합 이벤트에 대해 도 4a), "경쟁 메커니즘"(결합 이벤트에 대해 도 4c) 또는 "기능적 메커니즘"(분자 또는 물리적 환경, 효소적 또는 화학적 절단, 또는 효소적 또는 화학적 변형에 의해 유도되는지 아닌지 간에 입체형태적 변화에 대해 도 4d)인지의 여부가 구별된다. 추가로, 샌드위치, 경쟁적 또는 기능적 메커니즘에서 작동하는 것으로 설명된 센서는 비-협력적 또는 협력적 메커니즘으로 작동하는 것으로 추가로 설명될 수 있다(예를 들어, 도 4b).
샌드위치 작동 메커니즘(도 4a)은 표적 분석물에 대한 한 쌍의 결합 파트너(항체, RNA 또는 DNA 앱타머, 천연 결합 단백질 등)가 각각 센서의 상부 및 하부 뚜껑에 위치된 "샌드위치" 설계에 대해 설명되었다. 샌드위치 메커니즘은 분석물의 존재 또는 부재를 검출하거나 농도를 측정하는 데 우수하다. 항체가 결합 파트너로 사용되는 경우, 샌드위치 검정은 샌드위치 면역검정, 예를 들어, 샌드위치 ELISA와 유사하다.
관심 특정 분자 분석물의 경우, 적절한 결합 파트너 쌍을 찾을 수 있는 경우 샌드위치 메커니즘(도 4a)이 이의 검출에 적절하다. 이는 전형적으로 단백질과 같은 더 큰 표적 분석물에 대한 경우이며, 이에 대해 2개의 상이한 에피토프가 발견될 수 있으며, 하나의 결합 파트너는 각각의 에피토프에 대한 친화성을 갖는다. 표적 분석물이 단일 가닥 DNA 또는 단일 가닥 RNA인 경우, 2개의 결합 파트너는 단일 가닥일 수 있으며, 여기서 각각의 결합 파트너는 그 자체가 표적 분석물의 상이한 영역 또는 하위서열에 상보적인 단일 가닥의 DNA 또는 RNA이다. 표적 분석물이 DNA, RNA:DNA 하이브리드 또는 이중 가닥 RNA의 이중 가닥인 경우, 결합 파트너는 (1) 표적 분석물의 2개의 상이한 영역 또는 하위서열에서의 단일 가닥 DNA 또는 RNA(이 경우 센서는 삼중체의 형성시 폐쇄됨)일 수 있거나, (2) 결합 파트너는 2개의 위치에서 표적에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 핵산/단백질 복합체(예를 들어, CRISPR/dCas9)일 수 있거나(도 3d에 도시된 바와 같음), (3) 결합 파트너는 알로스테리 CRISPR/dCas9 복합체일 수 있거나(도 3e에서와 같음), (3) 결합 파트너는 징크-핑거 단백질, 또는 2개의 영역 또는 하위서열에서 표적에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 펩티드 분자일 수 있거나, (4) 2개의 상이한 영역에서 표적에 서열 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 분자 쌍일 수 있다.
경쟁적 작동 메커니즘(도 4c)은 센서의 하부 뚜껑이 표적 분석물에 대한 단일 결합 파트너(항체, RNA 또는 DNA 앱타머, 천연 결합 단백질 등)를 보유하고, 센서의 상부 뚜껑이 표적 분석물과 유사한 방식으로 하부 뚜껑 상의 결합 파트너에 결합할 수 있는 경쟁자 분자를 보유하는 상황에 대해 설명된다. 경쟁적 메커니즘은 분석물의 존재 또는 부재를 검출하거나 농도를 측정하는 데 우수하다. 결합 파트너가 항체인 경우, 경쟁적 메커니즘은 경쟁적 면역검정과 유사하다. 경쟁적 메커니즘은 표적 분석물이 너무 작거나, 너무 비대칭인 표면을 갖거나, 표적이 발견되기에 2개의 상이한 결합 파트너에 대해 너무 화학적으로 차별화되지 않은 예에서 유용하다. 이는 종종 전형적인 약물 또는 많은 호르몬과 같은 소분자의 경우일 것이다. 경쟁적 작동 메커니즘이 특정 표적 분석물에 대해 단일 항체 또는 단일 앱타머만을 필요로 한다는 사실은 경쟁적 작동 메커니즘에 이용 가능한 잠재적인 분석물의 수를 관심 표적에 대한 2개의 항체 또는 2개의 앱타머가 발견되는 것을 필요로 하는 샌드위치 작동 메커니즘에 이용 가능한 잠재적 분석물의 수보다 매우 크게 만든다.
경쟁적 작동 메커니즘에서, 상부 및 하부 뚜껑의 역할은 결합 및 경쟁자가 센서에 인접한 기판 표면에 비특이적으로 결합하는 잠재성(전형적으로, 위 음성 신호를 유발함)에 따라 상호교환될 수 있고; 배경 표면에 대해 더 낮은 비특이적 친화성을 갖는 분자는 전형적으로 뚜껑 상에 위치하도록 선택된다.
경쟁자 분자는 표적 분자, 결합 파트너에 결합할 수 있는 표적 분자에 대한 관련 분자, 또는 표적이 정상적으로 결합할 부위에서 결합 파트너에 결합할 수 있는 임의의 다른 분자가 예일 수 있다. 이는 경쟁자가 결합 파트너의 결합시 표적의 정상적인 결합을 차단하거나 달리 억제하기 때문이다. 유사하게, 표적 분석물은 결합 파트너에 결합하고 경쟁자의 결합을 억제하는 능력을 갖는다. 표적의 부재하에서, 경쟁자는 결합 파트너에 종종 결합하고, 센서의 상부 뚜껑은 하부 뚜껑 및 표면에 가깝게 더 많은 시간을 소비하여 신호를 생성한다. 표적의 존재하에서, 표적 분자는 일부 센서의 하부 뚜껑 상의 결합 파트너에 결합하고, 경쟁자가 결합 파트너에 결합하는 시간의 양을 감소시켜 신호를 변경한다. 표적 농도가 증가함에 따라, 표적은 결합 파트너에서 더 높은 점유율을 가지며, 센서는 더 자주 개방되고, 상부 뚜껑은 표면에서 떨어져 더 많은 시간을 소비하여 신호 변화를 향상시킨다.
분석물의 존재가 개방 상태의 확률을 증가시킨다는 사실은 경쟁적 작동 메커니즘의 모든 구현예가 "신호-꺼짐(signal-off)" 검출기이어야 한다는 것을 의미하지는 않는다. 따라서, 경쟁적 작동 메커니즘에서의 신호 변화는 신호를 생성하고 측정하는 데 사용되는 특정 감지 방식에 따라 양성 또는 음성일 수 있다. 경쟁적 검정은, 예를 들어, 뚜껑이 제1 형광단으로 표지되는 광학 감지 방식과 함께 사용될 수 있다. 하부 뚜껑이 제2 형광 수용체로 표지된 상황에서, 표적의 추가는 제1 형광단과 제2 형광단 사이의 FRET의 감소를 발생시켜, 제2 형광단으로부터의 신호를 감소시켜, "신호-꺼짐" 검출기를 구현할 것이다. 하부 뚜껑이 형광 켄처로 표지된 상황에서, 표적의 추가는 제1 형광단과 켄처 사이의 켄칭을 감소시켜 "신호-켜짐" 검출기를 구현할 것이다. 따라서, 다른 작동 메커니즘에 대해, 경쟁적 메커니즘은 원하는 대로 신호 켜짐 및 신호 꺼짐 센서 둘 모두를 발생시킬 수 있다.
기능적 작동 메커니즘(도 4d)은 단일 표적 분석물보다는 분자 클래스의 결합, 절단 또는 라이게이션을 포함하는 효소적 또는 화학적 활성, 또는 효소적 또는 화학적 변형, 예를 들어, 인산화, 메틸화 또는 아세틸화를 포함하는 분자 이벤트의 보다 일반적인 검출을 가능하게 한다. 기능적 메커니즘에서, 상부 뚜껑 및 하부 뚜껑은 소분자 또는 단백질 효소일 수 있으나, 온도, 빛, pH 또는 이온 강도에서의 변화와 같은 물리적 조건일 수 있는 외부 자극의 존재하에서 서로 결합하거나 방출하는 기능적 파트너(기능적 파트너 1 및 기능적 파트너 2 각각)를 각각 갖는다.
일반적으로, 상부 및 하부 뚜껑의 역할은 상호교환될 수 있으며, 즉, 가능적 파트너 1은 상부 뚜껑에 있을 수 있고, 기능적 파트너 2는 하부 뚜껑에 있을 수 있고, 그 반대일 수 있다. 따라서, 어떤 기능적 파트너가 상부 뚜껑에 적용되는지의 선택은 전형적으로 어떤 기능적 파트너가 배경 기판에 대해 가장 낮은 비특이적 결합을 갖는지의 여부에 좌우된다. 그러나, 기능적 파트너 중 하나가 막횡단 단백질인 경우와 같은 일부 구현예에서, 센서의 성능은 막횡단 단백질이 상부 뚜껑에 부착되고, 다른 기능적 파트너가 하부 뚜껑에 부착되는 경우에 증가될 수 있다. 많은 구현예에서, 외부 자극은 기능적 파트너 2에 대한 친화성을 변화시킬 기능적 파트너 1의 입체형태적 변화를 유발할 것이다. 상기 구현예에서, 기능적 파트너 2는 또 다른 입체형태적 상태가 아니라 특정 입체형태적 상태로 기능적 파트너 1에 결합하도록 기능적 파트너 1에 대해 발생되는 항체이다. 많은 구현예에서, 외부 자극은 기능적 파트너 1의 화학적 변형(예를 들어, 인산화)을 유발할 것이며, 이는 기능적 파트너 2에 대한 이의 친화성을 변화시킬 것이다. 상기 구현예에서, 기능적 파트너 2는 또 다른 입체형태적 상태(예를 들어, 인산화되지 않음)가 아니라 특정 변형 상태(예를 들어, 인산화)에서 기능적 파트너 1에 결합하도록 기능적 파트너 1에 대해 발생되는 항체이다.
따라서, 기능적 작동 메커니즘의 일 구현예(도 4e)에서 미토겐 활성화된 단백질 키나제 키나제(MAPKK) 또는 MAPK를 인산화하는 임의의 다른 제제에 의한 미토겐 활성화된 단백질 키나제(MAPK, 예를 들어, P42 또는 P44)의 인산화의 검출을 가능하게 한다. 이러한 구현예에서, 기능적 파트너 1은 MAPK(하부 뚜껑 상)이고, 기능적 파트너 2는 MAPK의 인산화된 형태에만 결합하는 항체(항-포스포-MAPK)이다. MAPK가 인산화되지 않는 경우, 센서는 개방되고, 인산화되는 경우, 센서는 폐쇄된다. 유사한 구현예는 기능적 파트너 1을 변형될 수 있는 임의의 단백질로 대체(메틸화, 인산화 또는 아세틸화를 통함)하고, 기능적 파트너 2를 파트너 1의 변형된 버전에만 결합하는 결합 파트너로 대체함으로써 작제될 수 있다.
따라서, 기능적 작동 메커니즘의 일 구현예에서 임의의 G-단백질 결합 수용체(GPCR)와 같은 단백질 수용체에 대한 리간드, 효능제 또는 길항제의 검출을 가능하게 한다. 이러한 구현예(도 4f)에서, 기능적 파트너 1은 단백질 기반 지질 나노디스크(문헌[Bayburt et al, "Membrane Protein Assembly into Nanodiscs" FEBS Letters 584 (2010):1721-1727]에 기재된 바와 같음), 또는 나노디스크의 지질 부분에 로딩된 뮤-오피오드 수용체(원형 GPCR)와 같은 막횡단 수용체 단백질을 갖는 문헌[Zhao et al, "DNA-Corralled Nanodiscs for the Structural and Functional Characterization of Membrane Proteins and Viral Entry, Journal of the American Chemical Society, 140 (2018): 10639-10643 및 Iric et al "DNA-Encircled Lipid Bilayers" Nanoscale (2018) DOI:10.1039/C8NR06505E]에 기재된 바와 같은 DNA 기반 지질 나노디스크이며, 상기 문헌 모두의 전체내용은 참조로서 본원에 포함된다. 막 단백질을 가용화하기 위한 단백질 기반 지질 나노디스크는 잘 연구되어 있으며, 이들은 상기 문헌[Zhao et al]에 교시된 바와 같이 DNA 가닥에 연결될 수 있으며, 따라서 기능적 파트너 1을 상부 뚜껑에 부착하는 방법을 제공한다. 유사하게, 상기 문헌[Zhao et al. 및 Iric et al.]에 개시된 바와 같은 DNA-기반 지질 나노디스크는 막 단백질로 로딩될 수 있고, 센서의 상부 뚜껑에 부착될 수 있거나, 센서의 상부 뚜껑으로 직접 작용할 수 있다. 기능적 파트너 2는 수용체 단백질이 리간드에 결합하는 경우에 막횡단 단백질에 대한 친화성이 변하는 B-어레스틴과 같은 단백질이다. 기능적 파트너 2로서 베타-어레스틴을 사용하는 특정 경우에, 상부 뚜껑에서 GPCR의 리간드 결합 및 활성화는 용액에 존재하는 G 단백질 결합 수용체 키나제(GRK)가 GPCR을 인산화시키도록 하여 베타-어레스틴이 GPCR에 결합하고 센서를 폐쇄시키도록 할 것이다. 이러한 구현예는 시험관 내 무세포 환경에서 GPCR에 대한 약물의 스크리닝을 위한 일반적인 방법을 제공한다. 이러한 설정에서, 센서는 단순히 특정 표적 분석물에 결합하고 감지하는 것이 아니라, 연구 중인 수용체의 정상적인 생물학적 기능에 영향을 미치는 임의의 분자에 반응한다. 이러한 경우, 기능적 센서는 "클래스 검출기"인 것으로 언급된다.
상기 기재된 검출기는 GPCR의 리간드 결합을 검출하기 위한 천연 베타-어레스틴 경로의 가장 충실한 모방체일 것이다. 베타 어레스틴 1(일명 "어레스틴-2")에서 베타 어레스틴 2(일명 "어레스틴 3")로 베타 어레스틴의 정체를 변경함으로써, GPCR에 대한 상이한 리간드가 미묘하게 상이한 효과를 갖고 상이한 다운스트림 경로를 모방하는 소위 편향된 효능작용의 상이한 양태를 검출하고 연구하고, 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Oakley et al, "Differential Affinities of Visual Arrestin, Arrestin1, and Arrestin2 for G Protein-coupled Receptors Delineate Two Major Classes of Receptors" The Journal of Biological Chemistry 275 (2000) 17201-17210]에 교시된 바와 같이 베타 어레스틴 1 및 베타 어레스틴 2에 대한 상이한 친화성을 갖는 소위 클래스 A와 클래스 B GPCR 사이의 차이를 연구하는 것이 가능할 것이다.
유사하게, 상이한 GRK(GRK2 내지 GRK6)는 상이한 GPCR과 상이한 상호작용을 가지며, 즉, 이들은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Yang et al, "Phosphorylation of G Protein-Coupled Receptors: From the Barcode Hypothesis to the Flute Model" Molecular Pharmacology 92 (2017) 201-210]에 교시된 바와 같이 GPCR 유형 및 특정 리간드의 기능으로서 상이한 잔기에서 GPCR을 인산화한다. 따라서, 일부 구현예에서, 2개의 유형의 베타 어레스틴 및 5개의 상이한 GRK의 상이한 조합이 조합될 것이다.
일부 구현예에서, 용액에서 GRK의 사용을 필요로 하지 않는 센서를 생성시키기 위해, 원하는 GRK 유형은 DNA에 컨쥬게이션되고, 베타 어레스틴과 함께 플라이트랩의 하부 뚜껑에 놓는다. 이러한 방식으로, 신호전달 경로의 모든 필요한 성분은 단일 쌍 안정 검출기로 조합되며, 감지를 위해, 리간드만 추가될 필요가 있다. 상기 구현예에서, 리간드가 결합되고, GPCR이 활성화되는 경우, 플라이트랩의 상부 뚜껑은 먼저 하부 뚜껑 상의 GRK와 일시적으로 상호작용하고, GPCR은 인산화되고 방출된다. 이후, 상부 뚜껑의 인산화된 GPCR은 베타 어레스틴에 대한 결합을 통해 두 번째로 하부 뚜껑과 상호작용하고, 지속적인 신호가 검출된다.
본 발명의 다른 구현예는 베타 어레스틴에 대한 요구 없이 GPCR의 리간드 결합을 검출하는 항체를 사용한다. 일 구현예에서, 상부 뚜껑은 부착된 GPCR(예를 들어, 상기와 같이 뮤-오피오드)을 갖지만, 하부 뚜껑은 베타 어레스틴을 갖지 않는다. 대신, 이는 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Mouledous et al, "GRK2 Protein-mediated Transphosphorylation Contributes to Loss of Function of mu-Opioid Receptors Induced by Neuropeptide FF (NPFF2) Receptors" The Journal of Biological Chemistry, 287 (2012) 12736-12749, 및 Just et al, "Differentiation of Opioid Drug Effects by Hierarchical Multi-Site Phosphorylation" Molecular Pharmacology 83 (2013) 633-639]에 교시된 바와 같이 GPCR의 인산화 상태에 대해 발생된 항체를 갖는다. 따라서, 리간드가 결합하고, GRK가 수용체를 인산화하는 경우, 항-포스포-항체는 GPCR에 결합하고, 플라이트랩을 폐쇄하고, 신호를 유도한다. 상기 구현예는 리간드 결합이 GPCR과의 베타-어레스틴 상호작용의 특정 특징 없이 연구되도록 하고, 상이한 인산화 패턴에 대한 항체의 사용은 GPCR의 인산화 코드가 연구될 수 있도록 할 것이다(Yang et al supra vida).
본 발명의 또 다른 구현예는 베타 어레스틴 또는 GRK에 대한 요구 없이 GPCR의 리간드 결합을 검출하는 나노바디를 사용한다. 일 구현예에서, 상부 뚜껑은 부착된 GPCR(예를 들어, 상기와 같이 뮤-오피오드)을 갖지만, 하부 뚜껑은 베타 어레스틴을 갖지 않으며, GRK는 용액에 존재하지 않거나 하부 뚜껑에 부착되지 않는다. 대신, GPCR의 활성 리간드 결합 상태에 대해 발생된 나노바디가 하부 뚜껑에 부착된다. 상기 나노바디의 생성은 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Huang et al, "Structural insights into mu-opioid receptor activation" Nature 524 (2015) 315-321]에 교시되어 있다. 리간드의 존재하에서, GPCR이 활성화되고, 나노바디는 GPCR에 결합하고, 플라이트랩을 폐쇄하고, GPCR이 인산화되거나 인산화되지 않는지의 여부에 관계 없이 신호를 유도한다. 상기 기재된 베타 어레스틴 경로의 모방체보다 훨씬 간단한 상기 구현예에서, 검출기는 장기간 저장 및 선적을 위해 훨씬 더 안정적일 수 있고, 생산하는 데 더 저렴할 수 있으며, 따라서 진단 환경에서 더 유용할 수 있다. 특히, 뮤-오피오드 수용체를 갖는 구현예의 경우, 플라이트랩 검출기는 오피오드-클래스 약물이 공지되지 않은 샘플에 존재하거나, 오염된 건물에 존재하는지의 여부를 검출하기 위해 법 집행기관에서 사용될 수 있다.
따라서, 기능적 작동 메커니즘의 일 구현예에서 '리보스위치'의 입체형태의 변화를 통해 소분자 표적의 검출 및 농도 측정을 가능하게 할 수 있다. RNA 및 DNA 앱타머는 관심 소분자 표적에 결합하기 위한 인공 분자 진화(SELEX)에 의해 선택될 수 있다. 그러나, (A) 상기 표적은 전형적으로 샌드위치 작동 메커니즘에 의해 검출되기에는 너무 작으며, (B) 표적 및 앱타머의 결합 특징에 따라, 민감한 경쟁적 작동 메커니즘을 작제하기 어려울 수 있다. 상기 경우에, 리보스위치와 함께 기능적 작동 메커니즘의 사용은 경쟁 없이 소분자의 직접 검출을 가능하게 할 수 있다. 상기 구현예에서, 앱타머는 리보스위치가 되도록 변형되어, 소분자 표적의 결합시, DNA 또는 RNA 서열(도 5a) 또는 RNA-단백질(도 5b) 또는 DNA-단백질 결합 도메인에 노출되도록 입체형태적 변화를 겪는다. 따라서, 리보스위치는 하나의 기능적 파트너로 사용될 수 있고, 단백질, DNA 또는 RNA 분자는 두 번째 기능적 파트너로 사용될 수 있다. 특히, 일부 구현예는 표적 소분자에 결합시 일반적으로 사용되는 MS2 앱타머를 노출시키는 RNA 리보스위치를 사용할 수 있으며, 여기서 MS2 앱타머는 후속적으로 다른 뚜껑에 부착된 MS2-바이러스 주요-코트-단백질(MCP)에 결합한다(도 5b).
따라서, 기능적 작동 메커니즘의 일 구현예에서, 2개의 단백질, 2개의 핵산 또는 이들의 하이브리드의 화학적 또는 효소적 라이게이션(결합 또는 커플링)이 검출된다(도 5c). 상기 구현예에서, 기능적 파트너 1 및 기능적 파트너 2는 라이게이션이 측정될 2개의 분자이다. 화학적 또는 효소적 라이게이션 제제의 도입은 기능적 파트너 1 및 2가 함께 공유적으로 결합되도록 하고, 결과적으로 센서가 폐쇄되고 신호를 생성하게 할 것이다. 상기 구현예에서, 라이게이션 제제의 존재 또는 부재, 활성의 강도, 또는 농도가 측정된다.
기능적 작동 메커니즘의 관련 구현예에서, 단백질 또는 DNA의 화학적 또는 효소적 절단(절단(cutting))이 검출된다(도 5d). 상기 구현예는 라이게이션을 포함하는 구현예의 상황과 반대의 상황을 나타낸다. 상기 구현예에서, 기능적 파트너 1 및 기능적 파트너 2는 이들이 단일한 공동 결합된 존재물로 존재하거나, 측정 전에 미리 라이게이션되는 상태로 제조된다. 화학적 또는 효소적 절단 제제의 도입은 기능적 파트너 1 및 기능적 파트너 2를 서로 분리하여 센서를 개방시켜 신호를 생성하게 한다. 상기 구현예에서, 절단제의 존재 또는 부재, 활성의 강도, 또는 농도가 측정된다.
본 발명의 일부 구현예는 사용 협력성에 의해 향상될 수 있다. 센서의 상부 및 하부 뚜껑에 존재하는 결합 파트너, 경쟁자 또는 기능적 파트너의 수를 증가시킴으로써 샌드위치(도 4d), 경쟁적 또는 기능적 작동 센서에 협력성이 추가될 수 있다.
쌍 안정 분자 센서가 표면에 고정된 구현예는 여러 널리 공지된 검출 양식 중 하나를 사용하여 전자적으로 또는 광학적으로 판독될 수 있다. 도 6은 쌍 안정 분자 센서를 전자적으로 판독하는 표면 상의 구현예에 사용될 수 있는 3개의 상이한 장치 아키텍쳐를 예시한다.
도 6a에서, 쌍 안정 분자 센서는 표준 평면 반도체 트랜지스터의 게이트 영역 위에 고정된다. 여기서, "개방" 또는 "폐쇄" 상태에 있는 센서는 트랜지스터 특성으로부터 정량화될 수 있는 방식으로 트랜지스터의 게이트 주변의 국소 이온 환경에 영향을 미친다. 예를 들어, 트랜지스터는 "개방" 또는 "폐쇄" 상태에 있는 센서가 트랜지스터가 "켜짐" 또는 "꺼짐"으로 직접 전환되도록 편향될 수 있다.
고전적인 반도체 재료로 구성된 바이오센싱 FET는 이전에 기재되었다(Veigas et al, "Field Effect Sensors for Nucleic Acid Detection: Recent Advances and Future Perspectives" Sensors 15 (2015):10380-10398).
도 6b에서, 쌍 안정 분자 센서는 1차원(1D) 물질(탄소 나노튜브 또는 실리콘 나노와이어) 또는 2차원(2D) 물질(그래핀, 몰리브덴 디설파이드[MoS2], 또는 인듐 옥사이드의 박층)과 같은 저차원 물질로부터 구성된 전계 효과 트랜지스터(FET)의 채널 영역에 고정된다. 여기서, FET는 채널의 전자적 반응을 변조하기 위해 (용액에서) 게이트 접촉을 갖는 2개의 전극 사이에 1D 또는 2D 물질로 제조된 채널로 구성된다. "개방" 또는 "폐쇄" 상태에 있는 센서는 트랜지스터의 게이트 주변의 국소 이온 환경에 영향을 미치며, 이는 트랜지스터 특성으로부터 정량화될 수 있다. 예를 들어, 트랜지스터는 "개방" 또는 "폐쇄" 상태에 있는 센서가 트랜지스터가 "켜짐" 또는 "꺼짐"으로 직접 전환되도록 편향될 수 있다.
저차원 물질로 구성된 바이오센싱 FET는 탄소 나노튜브(Allen et al, "Carbon Nanotube Field-Effect-Transistor-Based Biosensors" Advanced Materials 19 (2007) 1439-1451); 실리콘 나노와이어(Chen et al, "Silicon nanowire field-effect transistor-based biosensors for biomedical diagnosis and cellular recording investigation" Nanotoday 6 (2011) 131-154); 그래핀(Afsahi et al, "Towards Novel Graphene-Enabled Diagnostic Assays with Improved Signal-to-Noise Ratio" MRS Advances 60 (2017) 3733-3739); 몰리브덴 디설파이드(Sarkar et al, "MoS2 Field-Effect Transistor for Next-Generation Label-Free Biosensors", ACS Nano 8 (2014) 3992-4003) 및 인듐 옥사이드(Nakatsuka, et al, "Aptamer-field-effect transistors overcome Debye length limitations for small-molecule sensing", Science 6 (2018) eaao6750)에 대해 이전에 기재되었다.
도 6c에서, 쌍 안정 분자 센서는 금속(예를 들어, 금 또는 백금), 그래핀, 인듐 주석 옥사이드 또는 인듐 옥사이드와 같은 적절한 전도도의 물질로 구성된 평면 전극 상부에 고정된다. 여기서, 쌍 안정 분자 센서의 뚜껑은 "개방" 또는 "폐쇄" 상태에서 전극에 대한 근접성이 금속 전극 내에서 전류 흐름으로서 검출 가능한 전자의 이동을 유도하는 산화환원 활성 분자를 갖는다. 쌍 안정 센서 작동의 전기화학적 검출은 구형파 전압전류법(square wave voltammetry), 순환 전압전류법(cyclic voltammetry), 전기화학 임피던스 분광법, 또는 시간대전류법(chronoamperometry)을 포함하나 이에 제한되지는 않는 여러 널리 공지된 방법 중 하나를 사용하여 수행된다.
일 구현예에서, 전기화학적 검출은 금 전극에 대해 수행되며, 여기서 금 표면은 전자 빔 증착, 또는 운모 또는 실리콘 웨이퍼와 같은 초평면 주형으로부터의 주형-스트리핑에 의해 제조되었고, 쌍 안정 센서의 상부 뚜껑 상의 산화환원 활성 분자는 메틸렌 블루 리포터 분자이고, 쌍 안정 센서의 하부 뚜껑은 티올 변형, 폴리뉴클레오티드 백본에 대한 포스포로티오에이트 변형, 또는 폴리아데노신 연장을 통해 금 표면에 고정되고, 그렇지 않으면 금 전극은 머캅토헥산올(또는 유사한 알칸티올)의 자기 조립 단층에 의해 전환되며, 이는 원하지 않는 전기화학적 반응이 메틸렌 블루 분자로부터의 원하는 신호를 불명료하게 하는 것을 방지한다. 상기 구현예에서, 쌍 안정 센서의 폐쇄는 메틸렌 블루에서 표면으로의 전자 전달 속도를 증가시켜 시스템에 대한 "신호-켜짐" 거동을 생성할 것이다. 일부 구현예에서, 전자 전달 속도의 변화는 구형파 전압전류법에 의해 측정될 것이다.
구형파 전압전류법에 의해 판독되는 금 전극, 메틸렌 블루 산화환원 리포터 및 알칸티올 패시베이션 층의 조합은 이전에 기재(Ricci et al, "Linear, redox modified DNA probes as electrochemical DNA sensors" Chemical Communications 36(2007): 3768-3770)된 바와 같이 문헌에서 일반적이다.
도 7은 쌍 안정 분자 센서를 광학적으로 판독하는 표면 상의 구현예에 사용될 수 있는 3개의 상이한 장치 아키텍쳐를 예시한다.
도 7a에서, 쌍 안정 분자 센서는 투명한 광학 기판(유리, 석영, 실리콘 디옥사이드) 상에 고정되고, 내부 전반사 조명(TIRF 조명, 여기서 임계각 미만의 빛은 기판 내에서 전파되도록 제한됨)이 표면에서 감쇠장을 생성하기 위해 사용된다. 상기 구현예에서, 발광체(예를 들어, 유기 형광단 또는 양자점) 또는 광 산란체(예를 들어, 25-50 나노미터 플라즈몬 입자, 또는 500 nm 내지 1 마이크론 유전체 입자)과 같은 광학 리포터가 상부 뚜껑에 부착된다. 개방 상태에서, 광학 리포터는 작은 형광 또는 산란 신호가 관찰될 정도로 표면에서 충분히 멀리 떨어져 있을 것이다. 일부 구현예에서, 플라즈몬 나노입자는 금 또는 은 나노입자이다. 일부 구현예에서, 유전체 입자는 실리카 또는 폴리스티렌 나노구이다. 폐쇄된 상태에서, 광학 리포터는 큰 형광 또는 산란 신호가 관찰되도록 감쇠장의 강한 부분에 있을 것이다. 감쇠장의 거리 의존적 감쇠는 방출체에 의해 생성되거나 입자에 의해 산란되는 빛의 파장 람다와 관련이 있으며, 강한 신호에 대한 임계 거리는 전형적으로 람다/10이다. TIRF 광학 측정을 위한 단일 오리가미의 사용은 이전에 기재되었다(Gietl et al "DNA origami as biocompatible surface to match single-molecule and ensemble experiments" Nucleic Acids Res. 40 (2012): e110 및 Tsukanov et al, "Detailed study of DNA hairpin dynamics using single-molecule fluorescence assisted by DNA origami", Phys. Chem. B 117 (2013):11932-11942).
도 7c에서, 쌍 안정 센서는 금(Dulkeith et al, "Gold Nanoparticles Quench Fluorescence by Phase Induced Radiative Rate Suppression" Nano Letters 5 (2005):585-589) 및 그래핀(Kasry et al, "Highly Efficient Fluorescence Quenching with Graphene" J. Phys. Chem. C 116 (2012):2858-2862)에 대해 기재된 바와 같이 발광체의 형광을 강하게 켄칭시키는 기판(금 또는 그래핀) 상에 고정된다. 따라서, 개방 상태에서, 쌍 안정 센서의 쌍부 뚜껑으로부터의 광학 신호는 크고, 폐쇄 상태에서, 쌍 안정 센서의 상부 뚜껑으로부터의 광학 신호는 훨씬 더 작다. 상기 구현예에서, 가장 강한 켄칭 효과는 방출체가 표면의 수 나노미터 내에 있는 경우에 관찰되며, 따라서, 상기 구현예는 상부 뚜껑 상의 신호 분자가 표면으로부터 단단하고 밀접하게 접촉(수 나노미터 미만)하여 위치되는 경우에 쌍 안정 장치 기하학을 사용할 수 있다. 하나의 상기 잠재적인 기하학은 도 7c, 특히 하부 뚜껑의 영역을 넘어 연장되는 단단한 아암을 갖는 상부 뚜껑에 다이어그램으로 표시된다.
도 7d에서, 쌍 안정 센서는 널리 공지된 DNA 오리가미 배치 기술을 사용하여 미세제작된 링 공진기(문헌[Sarkaleh et al, "Optical Ring Resonators: A Platform for Biological Sensing Applications" J. Med. Signals. Sens. 7 (2017):185-191]에 기재된 바와 같음)에 고정되며, 여기서 미세제작된 링 공진기는 광학 도파관에 강하게 커플링된다. 상기 구현예에서, 발광체 또는 광 산란체는 둘 모두 쌍 안정 센서의 상태 변화에 대한 상용성 광학 리포터이다. 도파관의 한쪽 말단에 입력된 여기 광은 링 공진기로 진입하고, 쌍 안정 장치의 뚜껑 상의 리포터에 의해 형광으로 방출되거나 산란될 수 있거나, 형광으로 방출되거나 산란되지 않을 수 있다. 쌍 안정 장치가 개방된 경우, 링에서 순환하는 빛은 단순히 도파관으로 되돌아가고, 출력에서 전송된 신호로 관찰된다. 반면에, 쌍 안정 장치가 폐쇄되는 경우, 링 공진기에서 순환하는 빛은 더 긴 파장의 방출 광으로 전환되거나(리포터가 발광체인 경우), 산란된다(리포터가 광 산란체인 경우). 따라서, 장치가 폐쇄되는 경우, 감소된 양의 광이 링으로부터 도파관으로 되돌아가고, 감소된 신호 전송이 도파관 출력에서 측정된다. 상기 구현예에서, 폐쇄 상태의 뚜껑의 위치는 링 공진기의 표면으로부터 최대 50 나노미터 떨어져 있을 수 있다.
도 7a에 다이어그램으로 표시된 것과 같은 구현예의 경우, 측정된 광 신호는 쌍 안정 센서의 폐쇄시 증가하여 소위 "신호 켜짐" 검출 양식을 생성한다(도 7b). 도 7c 및 7d에 다이어그램으로 표시된 것과 같은 구현예의 경우, 측정된 광 신호는 쌍 안정 센서의 폐쇄시 감소하여 소위 "신호 꺼짐" 검출을 생성한다(도 7e).
광학 표면 판독의 다른 구현예에서, 쌍 안정 센서는 널리 공지된 DNA 오리가미 배치 기술을 사용하여 다른 유형의 미세제작된 광학 장치에 고정된다. 일부 구현예에서, 발광체를 갖는 쌍 안정 센서는 금속(예를 들어, 금) 광학 보타이 안테나의 중심에 위치된다. 상기 보타이 안테나의 중심에 있는 강한 전기장은 발광체의 형광을 향상시키는 것으로 공지되어 있다(문헌[Kinkhabwala, et al. "Large single-molecule fluorescence enhancements produced by a bowtie nanoantenna", Nature Photonics 3 (2009):654-657]에 기재된 바와 같음). 따라서, 상기 구현예에서, 쌍 안정 센서의 폐쇄 상태는 "신호 켜짐" 거동을 갖는 시스템을 생성하는 향상된 광 방출을 나타낼 것이다. 상기 구현예에서, 폐쇄 상태의 뚜껑의 위치는 최대 광학 신호를 위해 보타이의 중심의 수 나노미터 내에 있어야 할 것이다.
광학 표면 판독의 다른 구현예에서, 쌍 안정 센서는 널리 공지된 DNA 오리가미 배치 기술을 사용하여 광 결정 공동(PCC) 내에 고정된다. 이전에 기재되어 입증된 바와 같이(Gopinath et al, "Engineering and mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami", Nature 535 (2016): 401-405), DNA 오리가미 상의 방출체와 PCC의 상호작용은 PCC의 공진 모드 내에서 노드와 관련된 나노미터 규모의 위치결정에 강하게 의존한다. 유한 차분 시간 영역(FDTD) 분석에 의해 정확하게 예측될 수 있는 일부 위치에서, 방출체와 공동 사이의 커플링이 약할 수 있고, 다른 위치에서는 강할 수 있다. PCC의 광학 공진 모드 내의 피크에 적절하게 배치된 쌍 안정 장치의 경우, 쌍 안정 장치가 폐쇄되는 경우 광학 신호가 향상되어 "신호 켜짐" 거동을 갖는 시스템을 생성할 것이다.
표면 기반 광학 검출의 일부 구현예에서, 쌍 안정 센서의 판독은 에피형광 현미경에서 편광을 측정함으로써 달성된다. 상기 구현예에서, 비등방성 금 막대는 오리가미의 상부 뚜껑 상에서 광학 리포터로 사용된다. 따라서, 쌍 안정 센서가 폐쇄되고 상부 뚜껑이 결합되는 경우, 금 막대는 자유롭게 회전하는 상태에서 특정 배향으로 고정되는 상태로 전환된다. 금 막대의 회전 확산의 이러한 변화는 2개의 상이한 편광에서 막대로부터 산란된 빛을 검사하고 이들 사이의 비율을 계산함으로써 에피형광 현미경으로 용이하게 검출된다. 1에 가까운 비율은 개방 상태에 있는 쌍 안정 센서를 나타내고, 1과 거리가 먼 비율은 폐쇄 상태에 있는 쌍 안정 센서를 나타낸다. 선형 편광을 사용하는 구현예는 오리가미의 상부 뚜껑에 단일 비등방성 나노막대를 포함한다. 원형 편광을 사용하는 구현예는 한 쌍의 나노막대를 포함하고, 하나는 오리가미의 상부 뚜껑에 있고, 하나는 오리가미의 하부 뚜껑에 있다. 원형으로 편광된 빛을 사용하는 2-나노막대 시스템이 기재되었다(Zhou et al. "A plasmonic nanorod that walks on DNA origami" Nature Communications 6 (2015):8102).
일부 구현예에서, 검출 메커니즘은 표면 플라즈몬 공명(SPR) 또는 반사 간섭계(RI)와 같은 잠재적으로 표지가 없는 광학 기술일 수 있다. SPR에 대한 일반적인 원리는 이전에 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Tiang et al, "Surface Plasmon Resonance: An Introduction to a Surface Spectroscopy Technique" Journal of Chemicalfiled Education 87 (2010) 742-746]에 기재되었다. RI 배후의 일반적인 원리는 이전에 전체내용이 참조로서 본원에 포함되는 문헌[Kussrow et al, "Interferometric Methods for Label-Free Molecular Interaction Studies" Analytical Chemistry 84 (2012): 779-792]에 기재되었다.
검출 방법이 SPR 또는 RI인 일부 구현예에서, 쌍 안정 검출기의 상부 뚜껑은 표지되지 않고, 개방 상태에서 자유롭게 확산되는 것으로부터 폐쇄 상태로 결합된 표면으로의 검출기의 상부 뚜껑의 질량의 이동이 있으며, 이는 표면 근처에서 굴절률 변화를 발생시킬 것이다. 여기서, 쌍 안정 검출기에 의해 가능하게 되는 결합 이벤트 당 증폭은 폴리뉴클레오티드 뚜껑에 대해 측정되는 분석물의 분자량에 좌우될 것이다. 분자량 500 대 5 메가달톤 뚜껑의 소분자 분석물의 경우, 증폭 계수는 최대 10,000일 것이다. 50kD의 단백질 분석물 또는 150kD의 항체의 경우, 결합 이벤트 당 증폭 계수는 30 내지 100배 범위일 것이다.
검출 방법이 SPR 또는 RI인 다른 구현예에서, 금 입자 또는 실리카 입자와 같은 광학 활성 입자가 오리가미의 상부 뚜껑에 부착될 수 있다. 상기 구현예에서, 광학 활성 입자는 전적으로 DNA로 구성되는 상부 뚜껑으로 달성될 수 있는 것보다 더 큰 굴절률 변화 및 더 큰 증폭을 제공한다.
본 발명의 구현예는 이전의 쌍 안정 분자 검출기에 비해 장점을 제공한다. 본원에 개시된 구조체의 한 가지 장점은 본원에 개시된 바와 같이 구조체가 광학적 및 전자적 표면 기반 검출 방법에서 증가된 민감도를 부여하는 널리 정의된 형상을 포함한다는 것이다. 완전히 가요성인 쌍 안정 검출기는 작동 검출 방법이 겔 전기영동이고, 개방 상태와 폐쇄 상태 사이에서 큰 겔 이동이 관찰되는 경우 잘 작동한다. 그러나, 완전히 가요성인 쌍 안정 검출기는 폴리뉴클레오티드 형상의 기하학을 제어하는 능력이 결합 이벤트 당 전형적으로 200배의 높은 신호 증폭을 가능하게 하는 본원에 기재된 광학적 또는 전자적 검출 방법에 적합하지 않다.
전자 검출 방법의 경우, 작동시 용액에서 표면으로 이동하는 테더링된 형상은 표면에 가까운 형상 질량(예를 들어, 최대 5 메가달톤)의 충분한 분획을 가져오거나(무표지 전계 효과 바이오센싱에서), 표면의 단지 수 나노미터 내에 충분한 수(예를 들어, 최대 적어도 200개의 메틸렌 블루 표지)의 전기활성 분자를 가져오는(전기화학적 감지에서) 기하학을 갖는다. 현재 개시된 쌍 안정 검출기는 2 nm 표면 층에 충분한 질량 또는 충분한 수의 전기활성 분자를 한정할 수 없다. 2 nm 표면 층에 도달하는 능력은 폴리뉴클레오티드 형상의 강성, 및 도 8b에서와 같이 고정된 형상으로 형성된 창, 도 8c의 아암, 또는 고정된 형상의 영역을 넘어 연장될 수 있는 도 8d의 돔에 대한 정렬과 같은 특정 기하학을 추정하는 이들의 능력에 의해 가능해진다. 이는 검출에 사용되는 기능성 분자의 조합이 높이가 2 nm를 초과하는 상황에서 필요하며, 예를 들어, 2개의 12 나노미터 항체 및 단백질 항원(예를 들어, 직경 1 내지 6 나노미터)의 조합은 24 내지 30 나노미터 높이의 스택을 생성한다.
유사하게, TIRF, SPR 또는 RI와 같은 광학 검출 방법의 경우, 완전히 가요성인 쌍 안정 검출기의 사용은 높은 신호 증폭을 달성하기 위해 기술의 임계 거리 내에서 형광단의 수 또는 물질의 양을 최대화하지 않는다. 형광단 또는 다른 방출체(예를 들어, TIRF)에 의존하는 기술의 경우, 본원에 기재된 쌍 안정 검출기는 표면으로부터 임계 거리로 적어도 200개의 방출체 표지를 가져올 수 있으며, 여기서 완전히 가요성인 검출기는 최대 몇 개의 방출체를 가져올 수 있다. 굴절률 변화를 생성하기 위해 표지되지 않은 분자의 질량을 표면으로 가져오는 것에 의존하는 광학 기술(SPR 또는 반사 간섭계)의 경우, 본원에 기재된 쌍 안정 검출기는 표면에 적어도 5 메가달톤을 가져올 수 있으며, 여기서 완전히 가요성인 검출기는 표면에 최대 수백 킬로달톤을 가져올 수 있다(예를 들어, 항체의 분자량은 150 킬로달톤임).
쌍 안정 센서의 표면 기반 판독의 구현예는 아날로그 또는 디지털 신호 둘 모두를 생성할 수 있다. 일부 구현예에서, 광학적 또는 전자적 측정은 많은 수의 바이오센서를 포함하는 더 큰 영역에 대해 취해지고, 따라서 상기 측정은 많은 수의 센서에 대한 신호의 합을 제공한다. 상기 구현예에서, 단일 바이오센서 거동은 평균화될 것이고, 판독은 본질적으로 아날로그일 것이다.
그러나, 일부 구현예에서, 쌍 안정 센서의 이산적 특성 및 큰 폴리뉴클레오티드 뚜껑 및 많은 수의 신호전달 분자에 의해 잠재적으로 제공되는 신호 증폭은 이산 단일 분자 이벤트의 측정을 가능하게 한다. 일부 구현예에서, 상기 단일 분자 측정은 DNA 오리가미 배치를 사용하여 개별 쌍 안정 센서를 격자에 위치시키는 능력에 의해 추가로 가능해진다. 상기 구현예에서, 판독은 도 7b, 도 7e 및 도 10의 시간/신호 트레이스에 도시된 바와 같이 사실상 디지털일 것이다. 일부 광학 구현예는, 예를 들어, 단일 분자 생물물리학에서 일반적으로 실시되는 바와 같이 TIRF 현미경검사의 맥락에서 전체 현미경 필드에 걸쳐 수천 개의 쌍 안정 센서의 동시 디지털 측정을 가능하게 한다. 일부 전자적 구현예는, 예를 들어, DNA 오리가미 배치가 단일 분자 산화환원 순환을 이용하기 위해 쌍 안정 센서를 2개의 전극 사이에 위치시키는 데 사용되는 경우 디지털, 단일 분자 전자 측정을 달성할 수 있다(문헌[Lemay et al, "Single-Molecule Electrochemistry: Present Status and Outlook" Acc. Chem. Res. 46 (2013): 369-377]에 기재된 바와 같음).
쌍 안정 센서의 단일 분자 디지털 측정을 달성하는 구현예는 도 7b, 도 7e 및 도 10의 시간/신호 트레이스에서 초기에 도시된 바와 같이 쌍 안정 센서의 상태의 변동을 관찰할 수 있을 것이다. 개방 상태의 쌍 안정 센서는 상부 뚜껑이 표면에서 멀리 떨어져 있는 상황과 상부 뚜껑이 표면 근처에 있는 상황 사이에서 변동할 것이다. 링커의 길이, 및 상부 뚜껑의 확산 상수에 따라, 이러한 변동은 신호 트레이스에서 "켜짐" 상태와 "꺼짐" 상태 사이의 스위칭을 지시하는 특징적인 시간 상수 T1을 가질 것이다. 분자 이벤트의 검출시, 그것이 결합 이벤트이든 또는 변형과 같은 다른 이벤트이든, 쌍 안정 센서의 상부 및 하부 뚜껑은 적어도 서로에 대해 더 큰 친화성을 가질 것이고, 따라서 쌍 안정 센서의 변동은 T2가 T1보다 큰 상이한 특징적인 시간 상수 T2를 갖는다.
T2와 T1 사이의 차이가 클수록, 분자 이벤트가 더 용이하게 검출될 수 있다. 분자 이벤트가 상부 뚜껑이 무시할 수 있는 꺼짐-속도(off-rate)(하부 뚜껑에 대한 이의 친화성이 극도로 높기 때문)를 갖도록 하는 한계에서, 폐쇄 상태는 안정적이고 비가역적일 것이다. 이러한 한계에서, 결합 이벤트 또는 다른 분자는 도 7b, 도 7e 및 도 10에서 나중 시간에 대해 도시된 바와 같이 단일 분자 측정의 시간/신호 트레이스에 지속적인 변화를 유발할 것이다. 쌍 안정 센서에 대한 이러한 강한 결합 및 비가역적 변화의 한계는 명확성을 위해 다이어그램으로 표시되었지만, 많은 구현예에서도 유지될 것이다. 많은 구현예에서, 표적 분자의 결합, 또는 센서 내의 기능성 분자의 변형은 비가역적인 변화를 발생시키지 않을 것이며, 시간/신호 트레이스는 이의 변동률을 변화시킬 것이며, 분자 이벤트의 검출은 상기 비율 변화에서 추론되어야 할 것이다.
쌍 안정 센서의 상이한 구현예는 특정 표면 기반 판독 메커니즘의 성능을 최대화하기 위한 요건, 및 사용된 기능성 분자(예를 들어, 항체, 앱타머)의 특성(예를 들어, 크기, 형상)에 의해 지시된 바와 같이 상이한 형상을 갖는 뚜껑을 사용한다(도 8a-8d). 많은 가능한 기하학 중에서, 4개가 다음에 다이어그램으로 표시된다: 도 8a: 하부 뚜껑 및 상부 뚜껑 모두가 동일하게 형상화된 단순한 버전; (도 8b) 하부 뚜껑이 상부 뚜껑 상의 신호전달 분자가 표면과 접촉하게 되어 안정한 "폐쇄된" 상태의 형성시 최대 신호를 보장하게 하는 창을 갖는 버전(상기 창을 갖는 오리가미는 이전에 기재되었음(Rothemund, Paul WK. "Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns", Nature 440.7082 (2006): 297 및 특허 출원 161284 / CIT-7845)); (도 8c) 상부 뚜껑이 상부 뚜껑 및 기판과 함께 갖는 임의의 신호 분자의 밀접하고 안정적인 접촉을 보장하는 강성 아암을 갖는 비대칭이 되도록 설계된 버전; (도 8d) 상부 뚜껑이 3D 반구 또는 돔이 되도록 설계된 버전으로, 이의 가장자리는 하부 뚜껑의 반경을 넘어 연장되는 반경을 갖고, 이들 둘 모두는 상부 뚜껑 및 신호 분자와 표면의 밀접한 접촉을 보장하고, 또한 쌍 안정 센서가 큰 크기의 결합 분자(예를 들어, 큰 항원을 갖는 2개의 항체의 쌍)를 수용하도록 하는, 버전. 상기 반구 또는 돔 형상을 갖는 DNA는 이전에 기재되었다(Han et al, "DNA origami with complex curvatures in three-dimensional space", Science 332 (2011): 342-346).
쌍 안정 장치 기하학의 함수로서의 성능은 특정 구현예에 좌우된다. 도 8a에 다이어그램으로 표시된 기하학은 발광 또는 산란 신호 분자가 더 큰 신호를 생성하기 위해 표면에 매우 가까워질 필요가 없는 TIRF 현미경검사(도 7a)를 이용하는 구현예에 적합하다. 상기 구현예에서의 강한 신호는 람다가 사용된 광의 파장인 람다/10의 상부 뚜껑-표면 거리에 대해 관찰될 수 있다. 따라서, 532 nm와 동일한 람다를 갖는 녹색광의 경우, 표면의 50 nm 내에서 강한 신호가 달성되며, 여기서 상부 뚜껑은 감쇠장의 강한 부분 내에 있을 것이다. 쌍 안정 장치의 뚜껑 상의 발광체와 미세제작된 광학 공동의 커플링(도 7d)은 또한 람다/10의 상부 뚜껑-표면 거리에 대해 강할 것이다. 따라서, 산란 또는 형광에 의한 광학적 검출을 향상시키기 위해 미세제작된 공동을 사용하는 구현예는 도 8a에 다이어그램으로 표시된 단순한 기하학을 사용하여 높은 성능을 달성할 수 있다.
금속에 대한 최대 켄칭(도 7c), 게이트의 커패시턴스에 대한 최대 방해(도 6a 및 도 6b), 및 전기화학적 설정에서 최대 전자 전송률(도 6c)은 전형적으로 표면의 2 나노미터 이내에서 관찰된다. 따라서, 켄칭에 기초한 광학적 감지를 사용하는 구현예(도 7c) 및 전계 효과 감지를 사용하는 구현예(도 6a 및 도 6b) 및 전기화학적 감지를 사용하는 구현예(도 6c)는 모두 상부 뚜껑 및 표면과 함께 가질 수 있는 신호 분자의 보다 밀접한 접촉을 가능하게 하는 장치 기하학, 예를 들어, 도 8b, 도 8c 및 도 8d에 다이어그램으로 표시된 쌍 안정 장치 기하학의 이점을 누릴 수 있다.
표면 상의 플라이트랩의 성능은 용액에 존재하지 않는 다수의 잠재적인 문제에 종속되며, 이는, 상이한 구현예에서, 도 9에 제시된 바와 같이 기판의 표면 화학 및 쌍 안정 센서의 상이한 성분을 조정함으로써 해결된다.
예를 들어, 플라이트랩의 하나의 뚜껑(하부 뚜껑)은 표면에 고정되어야 하고, 다른 뚜껑(상부 뚜껑)은 용액에 자유롭게 부유해야 한다. 상부 뚜껑이 표면에 대해 너무 높은 친화성을 갖는 경우, 이는 하부 뚜껑 옆에 접착될 것이며, 플라이트랩이 표적 분자에 결합하여 이를 검출한 것으로 보일 수 있다(위 양성). 상기 문제는 패턴화되지 않은 표면뿐만 아니라 DNA 오리가미 결합 부위로 패턴화된 표면에서도 발생한다(도 9a). 빈 부위, 이중 결합, 및 센서가 폐쇄 상태로 고정됨은 모두 표면에 대한 쌍 안정 센서의 부적절한 접착에 의해 유발될 수 있는 문제이다.
표면에 대한 오리가미의 접착을 제어하는 능력은 실리콘 니트라이드 및 실리콘 디옥사이드 기판에서 가장 잘 발달되어 있다(전체내용이 본원에 포함되는 문헌[Kershner et al, "Placement and orientation of individual DNA shapes on lithographically patterned surfaces", Nature Nanotechnology 4 (2009):557-561; Hung et al, "Large-area spatially ordered arrays of gold nanoparticles directed by lithographically confined DNA origami", Nature Nanotechnology 5 (2010): 121-126; Gopinath et al, "Optimized Assembly and Covalent Coupling of Single-Molecule DNA Origami Nanoarrays", ACS Nano 8 (2014):12030-12040; 및 Gopinath et al, "Engineering and mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami", Nature 535 (2016): 401-405]에 기재된 바와 같음). 도 9c는 실리콘 디옥사이드, 석영 및 실리콘 니트라이드와 같은 적절한 표면 산화물을 갖는 플라이트랩 기판을 적절하게 결합하기 위한 일 구현예를 도시한다. 측면도에서, 플라이트랩이 적절하게 배향되기 위해서는 표면에 대한 적절한 점착성 또는 비-점착성을 가져야 하는 플라이트랩에 대한 5개의 별개의 영역이 존재하며; 상부 뚜껑의 양쪽 표면은 음으로 하전된 실라놀/카르복시실란 결합 부위 또는 주변 트리메틸 실릴 배경(헥사메틸디실라잔[HMDS] 증착을 통해 생성됨)에 접착되어선 안 되고, 뚜껑 사이의 링커는 결합 부위 또는 배경에 점착되지 않아야 하고, 하부 뚜껑의 한 표면은 점착되지 않아야 하고, 하부 뚜껑의 한 표면은 결합 부위에 점착해야 한다. 일반적으로 사용되는 실험 조건(10 mM Mg2+ 이온을 가짐)에서, Mg2+ 이온 층은 음으로 하전된 표면 부위와 음으로 하전된 오리가미 표면 사이의 브릿지를 제공하기 때문에 평평한 디스크 형상의 오리가미는 결합 부위에 강하게 점착한다. 반면에, 링커의 일부 구현예와 같은 선형 이중 가닥 DNA는 원자력간 현미경검사 하에서 이들의 이동에 의해 실험적으로 제시된 바와 같이 그렇지 않다. 다른 작업(특허 출원 161284 / CIT-7845에 기재된 바와 같음)은 20-mer 폴리-T 단일 가닥 DNA 헤어의 층을 추가함으로써 음으로 하전된 결합 부위에 대해 DNA 오리가미의 한 면을 비점착성으로 만드는 방법을 교시한다. 이러한 변형은 실리콘 디옥사이드에 대해 매우 효과적이며; 하나의 평평한 면 및 하나의 털이 많은 면을 갖는 오리가미가 증착되는 경우, 오리가미의 98% 초과가 표면을 향한 평평한 면과 결합한다. 따라서, 일부 구현예에서, 플라이트랩 디스크의 3개의 면은 적절한 배향을 제공하기 위해 DNA 헤어로 기능화될 수 있다.
DNA 오리가미 배치를 사용하는 일부 구현예의 경우, 문헌[Gopinath et al ACS Nano 8 supra vida, 및 Gopinath et al Nature 535, supra vida]에 교시된 바와 같이 플라이트랩의 하부 뚜껑을 표면에 접착시키기 위해 특정 표면 처리 및 특정 용액 조건이 사용된다. 석영, 고유 또는 열 산화물의 캡핑 층을 갖는 실리콘 디옥사이드, 실리콘 니트라이드, 인듐 옥사이드, 또는 산소 플라즈마 처리에 의해 음으로 하전된 기가 표면에 도입될 수 있는 임의의 표면의 경우, 음으로 하전된 표면 기와 플라이트랩 검출기의 음으로 하전된 하부 뚜껑 사이의 접착 브릿지를 형성시키기 위해 양으로 하전된 2가 마그네슘 이온이 사용될 수 있다. 음의 표면 기가 이온화된 실라놀인 구현예에서, 30 내지 40 밀리몰 마그네슘의 마그네슘 농도가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 표면은 음으로 하전된 카르복실산을 도입하는 카르복시실란 처리에 의해 실란화된다. 다시 마그네슘 이온은 음으로 하전된 표면 기와 플라이트랩 검출기의 음으로 하전된 하부 뚜껑 사이에 접착 브릿지를 형성시키는 데 사용될 수 있다. 음의 표면 기가 카르복실산인 상기 구현예에서, 5 밀리몰 미만의 마그네슘 농도가 사용될 수 있다.
일부 구현예에서, 상이한 기판 물질에서, 상부 뚜껑이 배경에 점착하는 것을 방지하는 문제에 대한 다른 해법이 필요할 수 있다. 하부 뚜껑은 링커를 통해 상부 뚜껑이 표면에 영구적으로 인접하도록 제한한다. 이는 상부 뚜껑에 높은 국소 농도를 제공하고, 이는 약한 상호작용에 대한 평형을 이동시키고/시키거나 대안적인 결합 메커니즘이 발생하기에 충분한 시간을 허용할 수 있다. 플라이트랩의 상부 뚜껑이 표면에 점착하는 일부 구현예에서, 상부 뚜껑은, 예를 들어, 도 9b에서와 같이 6-나선 다발로 이들을 구현함으로써 이들의 형상을 변화시키고 이들의 표면적을 감소시킴으로써 덜 점착성이 되도록 할 수 있다. 이러한 접근법은 운모에 명확한 영향을 미치며, 여기서 6-나선 다발 및 다른 3D 오리가미는 더 높은 표면적의 평평한 오리가미보다 표면에 훨씬 덜 접착된다. 전자 감지가 사용되는 일부 구현예에서, 이러한 해법은 오리가미의 질량 및/또는 센서 표면에 가까운 신호전달 분자의 수를 감소시킬 것이기 때문에 민감도를 감소시키는 대가를 치르게 될 것이다.
금 전극을 사용하는 일부 구현예(도 9d)의 경우, 실리콘 디옥사이드 시스템을 밀접하게 모방하는 것이 가능하며, 여기서 접착은 Mg2+ 농도에 의해 조정될 수 있다. 3.6 옹스트롬의 RMS 거칠기를 갖는 초평면 주형-스트리핑된 금(실리콘 디옥사이드 웨이퍼와 유사함)이 기판으로 사용될 수 있다. 실리콘 디옥사이드에서 이용 가능한 것과 유사한 음으로 하전된 결합 부위를 생성하기 위해, 11-머캅토운데칸산과 같은 카르복실화된 티올을 사용하여 자기 조립된 단층을 생성한다. 상기 단층은 이전에 기재된 바와 같이 Mg2+ 이온의 존재하에서 금에 오리가미를 접착하는 데 사용되어 왔다(Gerdon et al, "Controlled Delivery of DNA Origami on Patterned Surfaces", Small 5 (2009): 1942-1946). 비접착성 배경은 실리콘 디옥사드 상에서 HMDS에 의해 생성된 것과 유사한 접촉각을 갖는 자기 조립된 단층을 제공하도록 선택된 알칸티올을 사용하여 구현될 수 있다.
금 전극을 사용하는 다른 구현예는 DNA 오리가미 상의 폴리아데노신(polyA) 가닥 연장, 티올-표지, 또는 포스포로티오에이트 백본을 사용하여 금에 대한 플라이트랩의 하부 뚜껑을 위한 접착을 제공한다. 티올, 포스포로티오에이트 및 폴리아데노신 가닥에 기초한 DNA 접착은 이전에 기재되었다(Zhou et al, "Tandem phosphorothioate modifications for DNA adsorption strength and polarity control on gold nanoparticles." ACS Applied Materials Interfaces 6 (2014):14795-147800). 상부 뚜껑과 배경 표면 사이의 접착 방지는 상부 뚜껑에 대한 폴리에틸렌 글리콜 또는 덱스트란 변형뿐만 아니라 금 기판 상의 배경에 대한 폴리에틸렌-글리콜-티올 변형의 사용에 의해 제공될 수 있다.
그래핀 FET 표면을 사용하는 일부 구현예에서, 실리콘 디옥사이드 시스템은 그래핀에 강하게 결합하는 피렌-카르복실산 분자의 사용을 통해 Mg2+- 유도 접착을 제공하도록 모방될 수 있다(도 9e). 일부 상기 구현예의 경우, 카르복실산 변형된 그래핀은 DNA 오리가미에 비특이적으로 결합할 수 있고, PEG는 비부착성 플라이트랩 표면에 첨가될 수 있다.
그러나, 이중 가닥 DNA는 그래핀 표면에 강하게 점착되지 않고, 단일 가닥 DNA의 노출된 소수성 염기는 그래핀에 강하게 접착되므로, 그래핀에 대한 접착을 관리하기 위한 다른 선택의 여지가 있다. 따라서, 일부 구현예에서, 패턴화되지 않은 변형되지 않은 그래핀이 사용될 수 있다. 상기 구현예에서, 단일 가닥 DNA(예를 들어, 폴리-티민[polyT])는 하부 뚜껑 상의 접착성 플라이트랩 표면에 첨가될 수 있고(도 9f); 상기 구현예에서, 플라이트랩의 다른 표면은 변형되지 않은 그래핀에 대해 매우 낮은 접착을 가질 것이다. 유사한 단일 가닥 링커 전략을 사용하여 DNA 오리가미에 탄소 나노튜브를 부착시켜(Maune et al, "Self-assembly of carbon nanotubes into two-dimensional geometries using DNA origami templates" Nature Nanotechnology (2010) 61-66) 전계 효과 트랜지스터를 형성시켰다.
표면 기반 구현예의 경우, 별개의 쌍 안정 센서의 다중화는 상이한 표적 분자에 대한 특이성, 또는 별개의 시험관에서 상이한 기능성에 대한 민감도를 갖는 센서를 독립적으로 합성하고, 별개의 센서를 광학적 또는 전자적 검출에 적합한 표면 상의 어레이에 공간적으로 배치함으로써 달성될 수 있다. 공간적 위치결정은 잉크젯 인쇄 및 마이크로어레이 인쇄를 포함하는 다양한 기술을 사용하여 미세규모로 달성될 수 있다(문헌[Barbulovic-Nad et al "Bio-microarray fabrication techniques--a review." Critical Reviews in Biotechnology. 26 (2006):237-59.]에 기재된 바와 같음). 따라서, 표면 기반 구현예의 경우, 미세규모 스포팅은 합산된 쌍 안정 장치 거동의 아날로그 측정에 적합한 어레이를 생성하며, 여기서 각각의 스폿은 다수의 무작위로 배열된 쌍 안정 장치를 함유하고; 일부 구현예에서, 각각의 스폿은 적어도 10개의 쌍 안정 장치를 함유한다.
표면 기반 구현예의 경우, 단일 분자 광학적 또는 전자적 검출에 적합한 단일 분자 어레이는 상기 참고문헌에 기재된 바와 같이 DNA 오리가미 배치 기술을 사용하여 리소그래피적으로 구성될 수 있다. 65,536개의 광학 장치의 구성으로서(Gopinath et al, "Engineering and mapping nanocavity emission via precision placement of DNA origami", Nature 535 (2016): 401-405), 여기서 각각의 장치는 광자 결정 공동을 함유하는 5 마이크론 x 5 마이크론 영역이었고, 각각의 장치에는 결정적으로 정의된 수의 개별 DNA 오리가미가 그 안에 위치하였고, 여기서 0에서 7까지 프로그램적으로 배열된 수가 특히 관련이 있다. 따라서, 일부 구현예(도 10)에서, 미세규모 스포팅은 DNA 오리가미 배치와 조합되어 단일 분자 단일 쌍 안정 센서 어레이의 완벽하게 규칙적인 어레이를 달성할 수 있으며, 여기서 N개의 어레이 각각은 특정 분석물에 대해 그리고 N 개의 어레이 각각 내에서 특이적이고, 95% 초과의 확률로 정확히 하나의 쌍 안정 센서로 채워진 단일 쌍 안정 장치에 대한 M개의 결합 부위가 있다. 생성된 개별 결합 부위의 수에 기초하여, 일부 구현예는 최대 100,000에 해당하는 N x M의 전체 스폿의 수를 포함하는 어레이를 갖는다. 일부 구현예는 각각 쌍 안정 장치에 대해 적어도 10개의 결합 부위를 갖는 최대 1000개의 어레이를 갖는다.
4000개 초과의 CMOS 전기화학 센서에 대해 다중화된 전자 검출이 수행되었다(문헌[Sun et al "A scalable high-density electrochemical biosensor array for parallelized point-of-care diagnostics", 2015 IEEE Biomedical Circuits and Systems Conference, IEEE Journal of Solid-State Circuits 53 (2018) 2054-2064]에 기재된 바와 같음). 따라서, 일부 구현예는 마이크로어레이 스폿팅을 전자 장치와 조합하여 최대 4000개의 별개의 유형의 쌍 안정 장치의 다중화된 어레이를 달성하며, 여기서 각각의 스폿은 미세규모 전자 장치에 인쇄되고, 각각의 스폿은 다수의 무작위로 배열된 쌍 안정 센서를 함유하고, 각각의 미세규모 전자 장치로부터의 판독은 다중 쌍 안정 센서의 합산된 반응이고; 일부 구현예에서, 각각의 스폿은 적어도 10개의 쌍 안정 장치를 함유한다.

Claims (74)

  1. 표면 상의 외부 자극의 광학적 또는 전자적 검출을 위한 쌍 안정 분자 센서를 포함하는 구조체로서, 상기 쌍 안정 분자 센서가,
    가요성 힌지 또는 가요성 링커를 사이에 갖는 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상으로서, 제1 폴리뉴클레오티드 형상 또는 제2 폴리뉴클레오티드 형상 중 하나가 표면 상에 고정되어 고정된 폴리뉴클레오티드 형상 및 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상을 제공하는, 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상; 및
    제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상 중 적어도 하나에 결합된 하나 이상의 기능성 분자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 플랫폼을 갖고,
    상기 쌍 안정 분자 센서가 2개의 상태 중 하나를 갖고, 상기 2개의 상태가 폐쇄 상태 및 개방 상태이고, 여기서
    개방 상태에서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상은 가요성 힌지 또는 가요성 링커에 의해 구속되는 바와 같은 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 대해 자유롭게 이동하고;
    폐쇄 상태에서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상은 고정된 폴리뉴클레오티드 형상에 근접하게 위치되며,
    상기 폴리뉴클레오티드 플랫폼이 스캐폴딩된 데옥시리보핵산(DNA) 오리가미(origami), 스캐폴딩된 리보핵산(RNA) 오리가미, 스캐폴딩된 하이브리드 DNA:RNA 오리가미, 단일 가닥 DNA 타일(tile), 다중 가닥 DNA 타일, 단일 가닥 RNA 오리가미, 다중 가닥 RNA 타일, 또는 다중 스캐폴드가 있는 계층적으로 구성된 DNA 또는 RNA 오리가미로부터 선택되는,
    구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 표적 분자를 포함하거나, 외부 자극이 표적 분자와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 포획 분자 및 제2 포획 분자를 포함하고, 제1 포획 분자가 제2 포획 분자와 상이한 표적 분자 영역에 결합할 수 있고, 제1 포획 분자 및 제2 포획 분자가 제1 항체 및 제2 항체, 제1 나노바디 및 제2 나노바디, 또는 제1 앱타머 및 제2 앱타머로부터 선택되고,
    제1 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    표적 분자의 존재하에서, 제1 분자 및 제2 분자가 표적 분자에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  3. 제1항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 형상이 제1 형상 내부 표면 및 제1 형상 외부 표면을 포함하고, 제2 폴리뉴클레오티드 형상이 제2 형상 내부 표면 및 제2 형상 외부 표면을 포함하고, 제1 형상 내부 표면이 제2 형상 내부 표면과 마주할 수 있고, 하나 이상의 기능성 분자가 제1 형상 내부 표면 및/또는 제2 형상 내부 표면에 결합되는, 구조체.
  4. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 표적 단일 가닥 핵산을 포함하거나, 외부 자극이 표적 단일 가닥 핵산과 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 단일 가닥 핵산 및 제2 단일 가닥 핵산을 포함하고, 제1 단일 가닥 핵산 및 제2 단일 가닥 핵산이 서로 상이하고, 표적 단일 가닥 핵산에 상보적이고,
    제1 단일 가닥 핵산의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 단일 가닥 핵산의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    표적 단일 가닥 핵산의 존재하에서, 제1 단일 가닥 핵산 및 제2 단일 가닥 핵산이 표적 단일 가닥 핵산에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  5. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 표적 이중 가닥 핵산을 포함하거나, 외부 자극이 표적 이중 가닥 핵산과 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체 및 제2 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체를 포함하고, 제1 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체 및 제2 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체가 서로 상이하고, 표적 이중 가닥 핵산에 상보적이고,
    제1 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    표적 이중 가닥 핵산의 존재하에서, 제1 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체 및 제2 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA가 표적 이중 가닥 핵산에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  6. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 표적 이중 가닥 핵산을 포함하거나, 외부 자극이 표적 이중 가닥 핵산과 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 알로스테리 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체 및 상보적인 알로스테리 핵산 서열을 포함하고, 알로스테리 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체가 조건부로 숨겨진 알로스테리 핵산 서열을 가지며,
    알로스테리 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체가 표적 이중 가닥 핵산에 결합하여 조건부로 숨겨진 알로스테리 핵산 서열을 노출시킬 수 있고,
    알로스테리 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    상보적 알로스테리 핵산 서열의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    표적 이중 가닥 핵산의 존재하에서, 알로스테리 CRISPR 비활성 효소 가이드 RNA 복합체가 표적 이중 가닥 핵산에 결합되고, 상보적 알로스테리 핵산 서열이 노출된 조건부로 숨겨진 알로스테리 핵산 서열에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  7. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 표적 분자를 포함하거나, 외부 자극이 표적 분자와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 표적 분자에 결합할 수 있는 포획 분자 및 표적 분자의 부재하에서 포획 분자에 결합할 수 있는 경쟁자 분자를 포함하고, 포획 분자가 항체, 나노바디 또는 앱타머로부터 선택되고,
    경쟁자 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    포획 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    표적 분자의 부재하에서, 경쟁자가 포획 분자에 결합하여 쌍 안정 센서를 폐쇄 상태로 만들고,
    표적 분자의 존재하에서, 경쟁자 분자가 표적 분자에 의해 대체되어 쌍 안정 분자 센서를 개방 상태로 만드는,
    구조체.
  8. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제를 포함하거나, 외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 화학적 또는 효소적 제제에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 변형되어 변형된 제1 단백질을 생성시킬 수 있는 제1 단백질 및 변형된 제1 단백질에 결합할 수 있는 제2 단백질을 포함하고,
    제1 단백질의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 단백질의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    화학적 또는 효소적 제제의 존재하에서, 제1 단백질이 변형되고, 제2 단백질이 변형된 제1 단백질에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  9. 제8항에 있어서, 제1 단백질이 인산화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 프레닐화, 아데닐릴화 또는 당화 중 적어도 하나에 의해 변형될 수 있는 구조체.
  10. 제9항에 있어서, 제2 단백질이 변형된 제1 단백질에 결합할 수 있는 천연 발생 단백질인 구조체.
  11. 제9항에 있어서, 제2 단백질이 인산화, 아세틸화, 유비퀴틴화, 프레닐화, 아데닐릴화 또는 당화에 결합할 수 있는 항체인 구조체.
  12. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제를 포함하거나, 외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 포획 핵산 및 포획 분자를 포함하고, 포획 핵산이 화학적 또는 효소적 제제에 의해 화학적으로 또는 효소적으로 변형되어 변형된 포획 핵산을 생성할 수 있으며, 포획 분자가 변형된 포획 핵산과 결합할 수 있고,
    포획 핵산의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    포획 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    화학적 또는 효소적 제제의 존재하에서, 포획 핵산이 변형되어 변형된 포획 핵산을 생성하고, 포획 분자가 변형된 포획 핵산에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  13. 제12항에 있어서, 포획 핵산이 시토신 메틸화, 시토신 하이드록시메틸화, 시토신 포르밀화, 시토신 카르복실화, 아데노신 메틸화, 알킬화 또는 티민 이량체화 중 적어도 하나에 의해 변형될 수 있는 구조체.
  14. 제13항에 있어서, 포획 분자가 포획 핵산에 결합할 수 있는 천연 발생 분자인 구조체.
  15. 제12항에 있어서, 포획 분자가 변형된 포획 핵산에 결합할 수 있는 항체인 구조체.
  16. 제13항에 있어서, 포획 분자가 시토신 메틸화, 시토신 하이드록시메틸화, 시토신 포르밀화, 시토신 카르복실화, 아데노신 메틸화, 알킬화 또는 티민 이량체화에 결합할 수 있는 항체인 구조체.
  17. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 수용체 리간드를 포함하거나, 외부 자극이 수용체 리간드와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 단백질 및 제2 단백질을 포함하고, 제1 단백질이 적어도 하나의 유형의 리간드에 결합할 수 있는 막횡단 수용체 단백질이고, 막횡단 수용체 단백질이 적어도 하나의 유형의 리간드에 의해 결합되는 경우에 제2 단백질이 제1 단백질에 결합할 수 있고,
    제1 단백질의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 단백질의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    적어도 하나의 유형의 리간드의 존재하에서, 제2 단백질이 제1 단백질에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  18. 제17항에 있어서, 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착된 제1 단백질의 하나 이상의 카피가,
    제1 단백질과 제1 폴리뉴클레오티드 형상 사이의 직접 링커 분자,
    제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착될 수 있는 단백질-지질 나노디스크로의 제1 단백질의 삽입,
    제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착될 수 있는 DNA-지질 나노디스크로의 제1 단백질의 삽입, 또는
    제1 폴리뉴클레오티드 형상의 일부로서 형성된 DNA-지질 나노디스크로의 제1 단백질의 삽입에 의해 부착되는,
    구조체.
  19. 제17항에 있어서,
    쌍 안정 분자 센서가 G-단백질 수용체 키나제(GRK)를 추가로 포함하고, GRK가 용액 내에 있거나 폴리뉴클레오티드 플랫폼에 부착되고,
    제1 단백질이 G-단백질 결합 수용체(GPCR)를 포함하고, 제2 단백질이 베타-어레스틴 또는 인산화된 GPCR에 결합할 수 있는 항체를 포함하고,
    GPCR에 대한 적어도 하나의 유형의 수용체 리간드의 존재하에서, GPCR이 GRK에 의해 인산화되고, 따라서 베타-어레스틴 또는 항체가 인산화된 GPCR에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  20. 제17항에 있어서,
    제1 단백질이 G-단백질 결합 수용체(GPCR)를 포함하고, 제2 단백질이 항체, 나노바디 또는 앱타머이고,
    GPCR 리간드의 존재하에서, 제2 단백질이 제1 단백질에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  21. 막횡단 수용체에 결합하는 수용체 리간드에 대한 검정 방법으로서, 상기 방법이 후보 수용체 리간드를 표면이 칩인 제17항의 구조체에 제공하는 단계를 포함하는, 방법.
  22. 제21항에 있어서, 막횡단 수용체가 G-단백질 결합 수용체(GPCR)인 방법.
  23. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 리보스위치 리간드를 포함하거나, 외부 자극이 리보스위치 리간드와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 분자 및 제2 분자를 포함하고, 제1 분자가 리보스위치 리간드에 의해 결합될 수 있는 DNA 리보스위치 또는 RNA 리보스위치를 포함하고, 리보스위치 리간드의 결합이 뉴클레오티드 서열 또는 앱타머의 노출을 유도하고, 제2 분자가 DNA 리보스위치 또는 RNA 리보스위치 상의 노출된 뉴클레오티드 서열 또는 앱타머에 결합할 수 있는 DNA 서열, RNA 서열, 또는 단백질을 포함하고,
    제1 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    리보스위치 리간드의 존재하에서, 제2 분자가 제1 분자에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  24. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제를 포함하거나, 외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 화학적 또는 효소적 제제에 의해 변형되어 변형된 포획 분자를 형성할 수 있는 포획 분자를 포함하고, 포획 분자가 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 결합할 수 있고, 변형된 포획 분자가 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 결합할 수 없고, 포획 분자가 단백질 또는 핵산으로부터 선택되고,
    포획 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상 및 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    화학적 또는 효소적 제제의 존재하에서, 포획 분자가 변형되어 쌍 안정 분자 센서를 개방 상태로 만드는,
    구조체.
  25. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제를 포함하거나, 외부 자극이 화학적 또는 효소적 제제와 상호작용하고,
    하나 이상의 기능성 분자가 제1 분자 및 제2 분자를 포함하고, 제1 분자 및 제2 분자 중 적어도 하나가 변형되어 제2 분자에 대한 제1 분자의 결합을 발생시킬 수 있고, 제1 분자 및 제2 분자가 핵산 또는 단백질로부터 선택되고,
    제1 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    제2 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    화학적 또는 효소적 제제의 존재하에서, 제1 분자 및 제2 분자가 함께 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  26. 제1항에 있어서,
    외부 자극이 온도, 빛, pH 또는 이온 조건으로부터 선택되고,
    하나 이상의 기능성 분자가 포획 분자 및 프로브 분자를 포함하고, 포획 분자가 온도, 빛, pH 또는 이온 조건 중 하나에 의해 변형되어 변형된 포획 분자를 생성할 수 있고, 프로브 분자가 변형된 포획 분자에 결합할 수 있고, 포획 분자 및 프로브 분자 각각이 독립적으로 핵산 또는 단백질이고,
    포획 분자의 하나 이상의 카피가 제1 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    프로브 분자의 하나 이상의 카피가 제2 폴리뉴클레오티드 형상에 부착되고,
    외부 자극의 존재하에서, 포획 분자가 변형되고, 프로브 분자가 변형된 포획 분자에 결합하여 쌍 안정 분자 센서를 폐쇄 상태로 만드는,
    구조체.
  27. 제1항에 있어서, 광학 검출을 위한 구조체로서,
    표면이 금 또는 그래핀이고,
    테더링된 형상이 유기 형광단, 양자점, 형광 비드, 또는 발광 란타나이드 화합물로부터 선택되는 발광체를 포함하고,
    개방 상태가 폐쇄 상태보다 더 많은 빛을 생성하는,
    구조체.
  28. 제1항의 구조체를 사용하여 외부 자극을 검정하는 단계를 포함하는 외부 자극의 광학 검출을 위한 방법으로서, 여기서
    표면이 금 또는 그래핀이고,
    테더링된 형상이 유기 형광단, 양자점, 형광 비드, 또는 발광 란타나이드 화합물로부터 선택되는 발광체를 포함하고,
    구조체가 발광체에 의해 생성된 빛을 향상시킬 수 있는 미세제작된 장치에 있는,
    방법.
  29. 제28항에 있어서, 미세제작된 장치가 광자 결정 공동, 링 공진기 또는 광학 보타이로부터 선택되는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 내부 전반사(TIRF) 현미경검사를 사용한 광학 검출을 위한 구조체로서,
    표면이 투명하고,
    테더링된 형상이 형광 표지되거나, 발광 표지되거나, 광산란 입자로 표지되는,
    구조체.
  31. 제1항에 있어서, 표면 플라즈몬 공명(SPR)을 사용한 광학 검출을 위한 구조체로서,
    표면이 금이고,
    테더링된 형상이 표지되지 않거나, 광학 활성 입자로 표지되는,
    구조체.
  32. 제1항에 있어서, 표면 반사 간섭법(RI)을 사용한 광학 검출을 위한 구조체로서,
    표면이 투명하거나 불투명하고,
    테더링된 형상이 표지되지 않거나, 광학 활성 입자로 표지되는,
    구조체.
  33. 제1항에 있어서, 하나 이상의 쌍 안정 분자 센서를 포함하는 기판을 추가로 포함하고, 상기 기판이 하나 이상의 쌍 안정 분자 센서 각각에 대한 표면인, 구조체.
  34. 제33항에 있어서, 하나 이상의 쌍 안정 분자 센서가 유도 자기 조립에 의하거나 리소그래피적으로 기판 상에 위치되는 구조체.
  35. 제34항에 있어서, 하나 이상의 쌍 안정 분자 센서가 리소그래피적으로 기판 상에 위치되는 경우, 상기 기판이 고정된 형상에 대해 접착성이고 테더링된 형상에 대해 접착성이 아닌 리소그래피적으로 패턴화된 결합 부위를 포함하는, 구조체.
  36. 제1항에 있어서, 전기적 검출을 위한 구조체로서,
    표면이 금, 백금, 그래핀, 인듐 옥사이드 또는 인듐 주석 옥사이드를 포함하는 작업 전극이고,
    테더링된 형상이 하나 이상의 산화환원 활성 분자로 표지되고,
    상태의 변화가 하나 이상의 산화환원 활성 분자와 작업 전극 사이의 전자 이동을 발생시키는,
    구조체.
  37. 제36항에 있어서, 하나 이상의 산화환원 활성 분자가 메틸렌 블루, 페로센, 1,3-디아자-2-옥소페노티아진, 또는 트리사이클릭 시토신 유사체로부터 선택되는 구조체.
  38. 제36항에 있어서, 구형파 전압전류법(square wave voltammetry)에 의한 전기적 검출을 위한 구조체로서, 상기 구조체가 은/은 클로라이드 기준 전극, 및 표면 위에 위치된 백금 와이어 카운터 전극을 추가로 포함하고, 여기서
    작업 전극 표면이 금 표면이고, 금이 전자 빔 증착되거나 주형-스트리핑된 금이고,
    하나 이상의 산화환원 활성 분자가 메틸렌 블루이고,
    고정된 폴리뉴클레오티드 형상이 부착되는 표면 상의 위치가 알칸티올 자기 조립 단층으로 코팅되는,
    구조체.
  39. 제38항에 있어서, 고정된 폴리뉴클레오티드 형상이 금 표면에 대한 부착을 위한 티올 변형을 포함하는 구조체.
  40. 제38항에 있어서, 고정된 폴리뉴클레오티드 형상이 금 표면에 대한 부착을 위한 단일 가닥 폴리아데노신 가닥을 포함하는 구조체.
  41. 제38항에 있어서, 고정된 폴리뉴클레오티드 형상이 금 표면에 대한 부착을 위한 포스포로티오에이트 변형을 포함하는 구조체.
  42. 제38항에 있어서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상이 금 표면에 대한 부착을 억제하기 위해 폴리에틸렌 글리콜 변형을 포함하는 구조체.
  43. 제38항에 있어서, 테더링된 폴리뉴클레오티드 형상이 금 표면에 대한 부착을 억제하기 위해 덱스트란 변형을 포함하는 구조체.
  44. 제38항에 있어서, 금 표면이 티올화 폴리에틸렌 글리콜 분자를 포함하는 구조체.
  45. 제36항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 2차원(2D) 플레이트를 형성하고,
    하나 이상의 산화환원 활성 분자가 테더링된 형상 상에 분포되고,
    고정된 형상이 표면과 하나 이상의 산화환원 활성 분자 중 하나 사이에 선택적으로 위치되는,
    구조체.
  46. 제36항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 2D 플레이트를 형성하고,
    고정된 형상이 표면에 대한 직접적인 접근을 제공하는 창 또는 구멍을 갖는 플레이트를 형성하고,
    폐쇄 상태에서, 위에 하나 이상의 산화환원 활성 분자를 갖는 테더링된 형상이 창 또는 구멍 위에 위치되는,
    구조체.
  47. 제36항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 아암(arm)을 갖는 단단한 3차원(3D) 형상을 형성하고, 하나 이상의 산화환원 활성 분자가 단단한 아암의 말단에 부착되는,
    구조체.
  48. 제36항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 반구 또는 단단한 돔을 형성하고, 하나 이상의 산화환원 활성 분자가 단단한 반구 또는 단단한 돔의 주변 가장자리를 따라 부착되며,
    폐쇄 상태에서, 주변 가장자리 상의 산화환원 활성 분자가 고정된 형상에 근접하게 위치되는,
    구조체.
  49. 제1항에 있어서, 표면 상의 용액 및 작업 용액 전극을 추가로 포함하는 전계 효과 감지를 위한 구조체로서,
    표면이 트랜지스터로 기능하고,
    표면이 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어, 그래핀, 몰리브덴 디설파이드, 또는 인듐 옥사이드로부터 선택되는 게이트 물질이고,
    고정된 형상이 표면에 직접 부착되고,
    표면 상의 용액이 트랜지스터에 대한 게이트 전극으로 기능하는,
    구조체.
  50. 제49항에 있어서, 표면이 그래핀이고, 고정 형상이 단일 가닥 DNA 연장에 의해 그래핀에 부착되는 구조체.
  51. 제49항에 있어서, 마그네슘 이온을 추가로 포함하고, 여기서
    표면이 피렌 카르복실산으로 코팅된 그래핀이고,
    고정 형상이 마그네슘 이온과 피렌 카르복실산 사이의 정전기적 상호작용에 의해 코팅된 그래핀 표면에 부착되는,
    구조체.
  52. 제49항에 있어서,
    표면이 폴리리신으로 코팅된 그래핀이고,
    고정 형상이 정전기적 상호작용에 의해 표면에 부착되는,
    구조체.
  53. 제49항에 있어서,
    표면이 금이고,
    테더링된 형상이 폴리에틸렌 글리콜을 포함하는,
    구조체.
  54. 제49항에 있어서,
    표면이 금이고,
    테더링된 형상이 폴리리신-그래프트-폴리에틸렌 글리콜 중합체를 포함하는,
    구조체.
  55. 제49항에 있어서, 마그네슘 이온을 추가로 포함하고, 여기서
    표면이 산소 플라즈마로 처리되거나 카르복시실란으로 코팅된 인듐 옥사이드이고,
    마그네슘 이온이 고정된 형상을 표면에 연결하는,
    구조체.
  56. 제49항에 있어서,
    표면이 인듐 옥사이드이고,
    테더링된 형상이 트리메틸 실릴 기 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 실란을 포함하는,
    구조체.
  57. 제49항에 있어서,
    테더링된 형상이 폐쇄 상태에서 위치를 유지할 수 있는 단단한 2D 플레이트를 형성하는,
    구조체.
  58. 제57항에 있어서,
    고정 형상이 창 또는 구멍을 갖는 플레이트이고,
    폐쇄 상태에서, 고정 형상의 창 또는 구멍이 표면과 테더링된 형상 사이에 임의의 고정 형상이 없도록 공간을 그 사이에 만드는,
    구조체.
  59. 제49항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 아암을 갖는 단단한 3차원(3D) 형상을 형성하고,
    폐쇄 상태에서, 단단한 아암이 그 사이에 임의의 고정 형상 없이 표면 상에 위치되는,
    구조체.
  60. 제49항에 있어서,
    테더링된 형상이 주변 가장자리를 갖는 단단한 반구 또는 단단한 돔을 형성하고,
    폐쇄 상태에서, 주변 가장자리가 주변 가장자리와 표면 사이에 임의의 고정 형상 없이 표면에 근접하고 고정 형상의 주변에 위치되는,
    구조체.
  61. 제1항에 있어서, 표면 상의 용액 및 작업 용액 전극을 추가로 포함하는 전계 효과 감지를 위한 구조체로서,
    표면이 트랜지스터로 기능하고, 표면이 실리콘 디옥사이드, 알루미늄 옥사이드 또는 실리콘 니트라이드로부터 선택되는 캡핑 층 아래에 반도체 게이트를 포함하고,
    고정된 형상이 캡핑 층에 부착되고,
    표면 상의 용액이 트랜지스터에 대한 게이트 전극으로 기능하는,
    구조체.
  62. 제61항에 있어서, 마그네슘 이온을 추가로 포함하고, 여기서
    캡핑 층이 산소 플라즈마에 의해 처리되거나, 카르복실실란으로 코팅되고,
    마그네슘 이온이 고정된 형상을 캡핑 층에 연결하는,
    구조체.
  63. 제61항에 있어서, 테더링된 형상이 트리메틸 실릴 기 및/또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 실란을 포함하는 구조체.
  64. 제61항에 있어서, 테더링된 형상이 폐쇄 상태에서 위치를 유지할 수 있는 단단한 2D 플레이트를 형성하는 구조체.
  65. 제61항에 있어서,
    고정 형상이 창 또는 구멍을 갖는 플레이트이고,
    폐쇄 상태에서, 고정 형상의 창 또는 구멍이 캡핑 층과 테더링된 형상 사이에 임의의 고정 형상이 없도록 공간을 그 사이에 만드는,
    구조체.
  66. 제61항에 있어서,
    테더링된 형상이 단단한 아암을 갖는 단단한 3차원(3D) 형상을 형성하고,
    폐쇄 상태에서, 단단한 아암이 그 사이에 임의의 고정 형상 없이 캡핑 층 상에 위치되는,
    구조체.
  67. 제61항에 있어서,
    테더링된 형상이 주변 가장자리를 갖는 단단한 반구 또는 단단한 돔을 형성하고,
    폐쇄 상태에서, 주변 가장자리가 주변 가장자리와 캡핑 층 사이에 임의의 고정 형상 없이 캡핑 층에 근접하고 고정 형상의 주변에 위치되는,
    구조체.
  68. 광학 검출을 위한 검출 시스템으로서, 상기 검출 시스템이,
    제1항의 복수의 구조체로서, 상기 복수 각각이 상이한 외부 자극 또는 외부 자극과 상호작용하는 분석물을 검출할 수 있는 최대 1,000개의 별개의 쌍 안정 분자 센서를 포함하는, 복수의 구조체,
    잉크젯 인쇄 또는 마이크로어레이 인쇄를 사용하여 기판 표면 상의 최대 1,000개의 상응하는 별개의 영역 중 하나에 위치된 각각의 복수 구조체로서, 별개의 쌍 안정 분자 센서 각각의 다수의 카피가 기판 상의 상응하는 별개의 영역 각각에 위치되는, 각각의 복수 구조체를 포함하는,
    검출 시스템.
  69. 제68항에 있어서, 최대 1,000개의 상응하는 별개의 영역이 핵산 오리가미 배치를 위한 다수의 단일 분자 결합 부위를 갖는 각각의 상응하는 별개의 영역으로 리소그래피적으로 패턴화되는 검출 시스템.
  70. 제69항에 있어서, 다수의 단일 분자 결합 부위 각각이 하나 이하의 쌍 안정 센서를 포함하는 검출 시스템.
  71. 제68항에 있어서,
    투명 기판 상에서의 내부 전반사 분광법,
    금 표면 상의 형광 켄칭,
    그래핀 기판 상의 형광 켄칭, 또는
    광학 보타이를 사용한 형광 향상으로부터 선택되는 것에 의해 외부 자극을 검출할 수 있는,
    검출 시스템.
  72. 전기적 검출을 위한 검출 시스템으로서, 상기 검출 시스템이,
    제1항의 복수의 구조체로서, 상기 복수 각각이 상이한 외부 자극 또는 외부 자극과 상호작용하는 분석물을 검출할 수 있는 최대 4,000개의 별개의 쌍 안정 분자 센서를 포함하는, 복수의 구조체,
    잉크젯 인쇄 또는 마이크로어레이 인쇄를 사용하여 기판 표면 상의 최대 4,000개의 상응하는 별개의 영역 중 하나에 위치된 각각의 복수 구조체로서, 별개의 쌍 안정 분자 센서 각각의 다수의 카피가 기판 상의 상응하는 별개의 영역 각각에 위치되는, 각각의 복수 구조체를 포함하는,
    검출 시스템.
  73. 제72항에 있어서,
    표면이 금, 그래핀, 백금, 그래핀, 인듐 옥사이드, 몰리브덴 디설파이드, 탄소 나노튜브, 실리콘 나노와이어, 또는 실리콘으로부터 선택되는,
    검출 시스템.
  74. 제36항에 있어서,
    DNA 오리가미 배치가 쌍 안정 분자 센서를 100 나노미터 미만의 간격으로 떨어진 전극 사이의 위치에 배치하는 데 사용되고,
    단일 분자 측정이 산화환원 순환에 의해 획득되는,
    구조체.
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