KR20210143277A - 다중-호흡기 바이러스 항원-특이적 t 세포 및 상기 세포를 제조하고 치료학적으로 사용하는 방법 - Google Patents

다중-호흡기 바이러스 항원-특이적 t 세포 및 상기 세포를 제조하고 치료학적으로 사용하는 방법 Download PDF

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KR20210143277A
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KR1020217034430A
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앤 마리 린
발데스 후안 페르난도 베라
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베이롤 칼리지 오브 메드신
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Abstract

본원 개시내용의 구현예는 다중-호흡기 바이러스 특이적 T 세포주 및 이를 사용하여 바이러스 감염을 치료하고 예방하는 방법에 관한 것이다.

Description

다중-호흡기 바이러스 항원-특이적 T 세포 및 상기 세포를 제조하고 치료학적으로 사용하는 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
[0001] 본 출원은 2019년 3월 25일자로 출원된 미국 가출원 번호 제62/823,446호에 대한 우선권을 주장하며, 이는 그 내용 전체가 본원에 참조로 포함된다.
[0002] 본원 개시내용의 구현예는 적어도 세포 생물학, 분자 생물학, 면역학 및 의학 분야에 간한 것이다.
[0003] 바이러스 감염은 다양한 장애에 대한 선택적 치료법인, 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 (allo-HSCT) 후 이환율 및 사망률의 심각한 원인이다. 그러나, 이식 후, 이식편 대 숙주 질환 (GVHD), 1차 질환 재발 및 바이러스 감염은 이환률 및 사망률의 주요 원인으로 남아있다. 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 파라인플루엔자 바이러스 및 사람 메타뉴모바이러스를 포함하는 커뮤니티-획득 호흡기 바이러스로 인한 호흡기 감염은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식 수용자의 최대 40%에서 검출되고, 이들은 폐렴 및 세기관지염을 포함하는 심각한 증상을 유발하고 치명적일 수 있다. 아데노바이러스(AdV), 리노바이러스 및 SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV를 포함한 코로나바이러스 스트레인을 비롯한 기타 호흡기 바이러스 및 일반적으로 면역저하된 환자에게 발병하는 풍토병 CoV는 특히 면역저하된 개체에서 심각한 증상을 유발할 수 있고, 최근의 SARS-CoV2 대유행은 본원 발명자들이 상기 감염을 치료하고 예방할 준비가 얼마나 부실한지를 분명하게 드러냈다. 효과적인 항바이러스제의 부재와 생체 외 확장된 바이러스-특이적 T 세포를 입양 전달하는 것이 2개 잠복성(엡스타인-바르 바이러스, 사이토메갈로 바이러스, BK 바이러스, 사람 헤르페스 바이러스 6) 및 용해성 (아데바이러스) 바이러스의 치료를 위해 임상적으로 유익할 수 있음을 입증하는 본원 발명의 그룹의 데이터를 감안하여, 본원 발명자들은 상기 면역치료학적 접근법을 호흡기 바이러스로 확장할 가능성을 조사하였다. 일부 바이러스에 대한 것이 가용하지만, 항바이러스 약물은 항상 효과적인 것은 아니고, 이는 신규 치료요법이 필요함을 강조한다. 이러한 바이러스 감염을 치료하는 한 가지 전략은 입양 T 세포 전달을 사용하는 것이고, 예를 들어, 바이러스 특이적 T 세포(VST)가 생체외 건강한 공여자의 말초 혈액에서 확장된 다음 바이러스 감염된 개체, 줄기 세포 이식 수용자에게 주입된다.
[0004] Adv, EBV, CMV, BK, HHV6을 표적화하는 시험관 내 확장된 공여자 유래 및 제3자 바이러스 특이적 T 세포는 바이러스 감염된 줄기 세포 이식 환자에게 입양 전달되는 경우 안전한 것으로 나타났다. 바이러스 특이적 T 세포는 Adv, EBV, CMV, BK 및 HHV6에 대한 항바이러스 면역을 재구성하고 질환을 제거하는데 효과적이었고 생체 내에서 상당한 확장을 나타냈다. 입양 전달된 시험관내 확장된 바이러스 특이적 T 세포는 안전하고, 환자에게 입양 전달되는 경우 임상적 이득과 관련이 있는 것으로 나타났다.
[0005] 본원 개시내용의 구현예는 바이러스 감염을 억제하고 하나 이상의 질환 증상을 개선하고/제거하기 위해 생체외 확장된, 비-유전학적으로 변형된, 바이러스 특이적 T 세포를 투여함에 의해 특정 바이러스에 대한 치료요법을 제공하여 당업계에서 오랜 염원의 필요성을 충족시킨다.
발명의 요약
[0006] 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 바이러스 특이적 T-림프구(VST)의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 제2 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 펩믹스(pepmix) 라이브러리와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 함유하며, 여기서 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, VST는 T 세포를 다수의 펩믹스 라이브러리로 프라이밍된 수지상 세포(DC)와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 함유하며, 여기서 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, VST는 PIV-3 항원을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 플라스미드 및 각각의 제2 항원을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 플라스미드로 핵감염된 수지상 세포(DC)와 T 세포를 접촉시킴으로써 생성된다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 적어도 하나의 PIV-3 항원 및 적어도 하나의 제2 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, VST는 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구를 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 αβT 세포 수용체를 발현한다. 일부 구현예에서, VST는 MHC-제한된 T 림프구를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스(hMPV) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스 및 이의 조합으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 또는 4개의 제1 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 4개의 제1 항원은 다음과 같다: PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, 및 PIV-3 항원 F. 일부 구현예에서, 조성물은 2개 또는 3개의 제2 바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 3개의 제2 바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 3개의 제2 바이러스는 인플루엔자, RSV, 및 hMPV이다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 각각의 제2 바이러스 당 적어도 2개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1 또는 둘다를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 N, RSV 항원 F, 또는 둘다를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N, 및 이의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 이루어지거나 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, VST는 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 생체외 배양한다. 일부 구현예에서, 다중바이러스 VST는 배양 9 내지 18일 이내에 충분히 확장하여 이들은 대상체에게 투여할 준비가 되어 있다. 일부 구현예에서, VST는 (a) 무시할만한 동종이식편반응; (b) 동일한 대상체로부터 수거되지만 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 배양되지 않은 상응하는 항원-특이적 T 세포 보다, 대상체로부터 수거한 항원-특이적 T 세포의 적은 활성화 유도된 세포사; 및 (c) 70% 초과의 생존능으로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중에 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 펩믹스는 화학적으로 합성되고 임의로 >90% 순수하다. 일부 구현예에서, VST는 Th1 극성화되어 있다. 일부 구현예에서, VST는 바이러스 항원-발현 표적 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 구현예에서, VST는 비-감염된 자가 또는 동종이계 표적 세포를 유의적으로 용해시키지 않는다.
[0007] 본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 조성물 중 어느 하나를 포함하고, 정맥내 전달용으로 제형화된 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 음성이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 바이러스 특이적 T-림프구(VST)의 폴리클로날 집단을 포함하는 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 제2 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자 및 사람 메타뉴모바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 펩믹스 라이브러리와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 함유하며, 여기서 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있고, 상기 약제학적 조성물은 정맥내 전달용으로 제형화되고, 상기 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5 EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성이다.
[0008] 본원의 개시내용은 또한 표적 세포를 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물 중 어느 하나 이상으로 용해시키는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 바이러스 특이적 T-림프구(VST)의 폴리클로날 집단과 표적 세포를 접촉시키는 단계를 포함하여 표적 세포를 용해시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 제2 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자 및 사람 메타뉴모바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 펩믹스(pepmix) 라이브러리와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 함유하며, 여기서 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 상기 접촉 단계는 대상체에서 생체내 수행한다. 일부 구현예에서, 상기 접촉 단계는 VST의 대상체로의 투여를 통해 생체내 수행한다.
[0009] 본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물 중 어느 하나 이상을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 바이러스 특이적 T-림프구(VST)의 폴리클로날 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 제2 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 바이러스는 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자 및 사람 메타뉴모바이러스를 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 펩믹스(pepmix) 라이브러리와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 함유하며, 여기서, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 5x106 내지 5x107 VST / m²이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체에는 다중 용량으로 VTS가 투여된다. 하나의 구현예에서, 대상체에는 VST가 투여되고 이어서 상기 대상체의 바이러스 부하량을 모니터링하고, 상기 바이러스 부하량이 증가하는 경우, 상기 대상체에는 제2 용량의 VST를 투여한다. 일부 구현예에서, 대상체는 면역저하되어 있다. 일부 구현예에서, 대상체는 급성 골수 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 육아종 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 VST를 투여받기 전에 다음을 투여받는다: (a) 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 이식체; (b) 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련없는 공여자 이식체; (c) 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 반수체-동일한(haplo-identical) 이식체; 또는 (d) 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련된 공여자 이식체. 일부 구현예에서, 대상체는 (a) 고체 기관 이식을 받고; (b) 화학치료요법을 받고; (c) HIV 감염을 갖고; (d) 유전학적 면역결핍증을 갖고/갖거나 (e) 동종이계 줄기 세포 이식체를 받는다. 일부 구현예에서, 조성물은 수회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 조성물의 투여는 대상체에서 바이러스 감염을 효과적으로 치료하거나 예방하고, 여기서, 상기 바이러스 감염은 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다.
[0010] 본원의 개시내용은 또한 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 3형 (PIV-3), 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스, 및 이의 조합으로부터 선택되는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 다수의 바이러스 항원을 인지하고, 상기 다수의 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자 및 사람 메타뉴모니아바이러스 각각으로부터 기원하는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, VST는 다수의 바이러스 항원을 인지하고, 상기 다수의 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자 및 사람 메타뉴모니아바이러스 각각으로부터 기원하는 적어도 2개의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함하거나, 이들로 이루어지거나 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 조성물은 정맥내 전달을 위해 제형화된 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중에 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성이다.
[0011] 본원의 개시내용은 또한 표적 세포를 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는 표적 세포를 용해시키는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 3형 (PIV-3), 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로부터 선택되는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 상기 접촉 단계는 대상체에서 생체내 수행한다. 일부 구현예에서, 상기 접촉 단계는 VST의 대상체로의 투여를 통해 생체내 수행한다.
[0012] 본원의 개시내용은 또한 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하고, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 파라인플루엔자 바이러스 3형 (PIV-3), 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로부터 선택되는 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 약제학적 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 수회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 상기 조성물의 투여는 대상체에서 바이러스 감염을 효과적으로 치료하거나 예방하고, 여기서, 상기 바이러스 감염은 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다.
[0013] 도 1: 건강한 공여자로부터 폴리클로날 다중-호흡기 바이러스-특이적 T 세포 (다중-R-VST)의 생성. 도 1a는 다중-R-VST 생성 프로토콜의 도식을 보여준다. 도 1b는 트립판 블루 배제를 사용한 세포 계수를 기준으로 10일 기간 동안 성취된 배수 확장을 보여준다(n=12). 제조는 약 10 내지 18일로부터 어느 곳에서 수행할 수 있다. 도 1c 및 도 1d는 확장된 세포(평균±SEM, n=12)의 표현형을 보여준다. 도 1e는 확장된 CD4+ T 세포 집단(평균±SEM, n=8) 내에 Treg(CD4+CD25+FoxP3+)의 최소 검출을 보여준다 .
[0014] 도 2: 다중-R-VST의 특이성 및 농축. 도 2a는 표적 바이러스 각각으로부터의 개별 자극 항원에 노출 시킨 후 확장된 T 세포주 내 바이러스-반응성 T 세포의 특이성을 보여준다. 데이터는 평균±SEM SFC/2×105 (n=12)으로서 제공된다. 도 2b는 특이성의 배수 농축을 보여준다(PBMC 대 다중-R-VST; n=12). 도 2c는 1개 대표적인 공여자에서 바이러스 자극 후 CD4 헬퍼 (상부) 및 CD8 세포독성 T 세포 (하부)로부터의 ICS에 의해 평가된 바와 같이 IFNγ 생성을 보여주고(도트 플롯은 CD3+ 세포 상에 게이팅하였다), 도 2d는 스크리닝된 9개 공여자에 대한 요약 결과를 보여준다(평균±SEM). 도 2e는 개별 자극 항원에 응답하는 공여자-유래된 VST 세포주의 수를 보여준다. 도 2f는 표적 바이러스 각각으로부터 풀링된 자극 항원의 적정된 농도로의 노출 후 확장된 T 세포주 내 바이러스-반응성 T 세포의 특이성을 보여준다. 데이터는 평균 ±SEM SFC/2×105 (n=7)으로서 제공된다. 도 2g는 표적 바이러스 각각으로부터 개별 자극 항원에 노출시킨 후 건강한 공여자의 말초 혈액에서 CARV-특이적 T 세포의 빈도를 보여준다. 데이터는 평균 ±SEM SFC/5×105 (n=12)으로서 제공된다.
[0015] 도 3: 다중-R-VST는 폴리클로날 및 다가기능성이다. 도 3a는 1개 대표적인 공여자에서 ICS에 의해 평가된 바와 같이 CD3+ T 세포 기원의 이중 IFNγ 및 TNFα 생성을 보여주고, 도 3b는 스크리닝된 9개 공여자로부터의 요약 결과(평균±SEM)를 보여준다. 도 3c는 멀티플렉스 비드 어레이에 의해 측정된 바와 같이 다중-R-VST의 사이토킨 프로필을 보여주고, 도 3d는 ELIspot 검정에 의해 그랜자임 B의 생성을 평가한다. 결과는 SFC/2x105 인풋 VST (평균±SEM, n=9)으로서 보고된다.
[0016] 도 4: 다중-R-VST는 바이러스-감염된 표적에 대해 반응성이다. 도 4a는 대조군으로서 부하되지 않은 PHA 아세포와 함께 표적(E:T 40:1; n=8)으로서 자가 펩믹스-펄싱된 PHA 아세포를 사용하여 표준 4-시간 Cr51 방출 검정에 의해 평가된 다중-R-VST의 세포용해 잠재력을 보여준다. 결과는 특이적 용해의 퍼센트(평균±SEM)로서 제공된다. 도 4b는 다중-R-VST가 Cr51 방출 검정에 의한 평가시 비-감염된 자가 또는 동종이계 PHA 아세포에 대해 무시할만한 활성을 보여줌을 입증한다. 도 4c는 대조군으로서 부하되지 않은 PHA 아세포와 함께 표적(E:T 40:1, 20:1, 10:1, 5:1)으로서 자가 펩믹스-펄싱된 PHA 아세포를 사용하여 표준 4-시간 Cr51 방출 검정에 의해 평가된 다중-R-VST의 세포독성 활성을 보여준다. 결과는 특이적 용해의 퍼센트(평균±SEM, n=8)로서 제공된다.
[0017] 도 5: HSCT 수용자의 말초 혈액에서 호흡기 신시티알 바이러스(RSV)- 및 사람 메타뉴모바이러스 (hMPV)-특이적 T 세포의 검출. 3개의 감염을 갖는 2명의 HSCT 수용자로부터 단리된 PBMC는 판독값으로서 IFNγ ELIspot을 사용하는 감염 바이러스에 대한 특이성에 대해 시험하였다. 도 5a 및 도 5b는 제어된 RSV-연관된 URTI을 갖는 2명의 환자로부터의 결과를 보여주고, 이는 내인성 RSV-특이적 T 세포에서 검출가능한 상승과 일치하고, 도 5c는 내인성 hMPV-특이적 T 세포의 확장과 함께 hMPV-LRTI의 제거를 보여준다. ALC: 절대 림프구수.
[0018] 도 6: HSCT 수용자의 말초 혈액에서 RSV- 및 파라인플루엔자 (PIV-3)-특이적 T 세포의 검출. 3개의 감염을 갖는 3명의 HSCT 수용자로부터 단리된 PBMC는 판독값으로서 IFNγ ELIspot을 사용하는 감염 바이러스에 대한 특이성에 대해 시험하였다. 도 6a 및 도 6b는 제어된 RSV- 및 PIV-연관된 URTI 및 LRTI를 갖는 2명의 환자로부터의 결과를 보여주고 이는 내인성 바이러스-특이적 T 세포에서 검출가능한 증가와 일치한다. 도 6c는 바이러스에 대한 T 세포 반응을 상승시키는데 실패한 계속되는 PIV-관련된 중증의 URTI를 갖는 환자로부터의 결과를 보여준다. ALC: 절대 림프구수.
[0019] 도 7. RSV 게놈 및 형태의 구조.
[0020] 도 8. RSV-VST 생성 프로토콜의 도식.
[0021] 도 9. RSV-VST의 특징 분석. 도 9a는 트립판 블루 배제를 사용한 세포 계수를 기준으로 10일 기간 동안 성취된 배수 확장을 보여준다. 도 9b 및 도 9c는 확장된 세포의 표현형을 보여준다.
[0022] 도 10. RSV-VST는 다기능성이다. 도 10a는 EliSpot 검정에 의해 평가된 바와 같은 CD3+ T 세포로부터 IFNγ 생성을 보여준다. 도 10b는 ELIspot 검정에 의한 그랜자임 B의 생성을 보여준다. 결과는 SFC/2x105 인풋 VST (평균±SEM, n=9)으로서 보고된다.
[0023] 도 11. 멀티플렉스 비드 어레이에 의한 측정시 RSV-VST의 사이토킨 프로필.
정의
[0024] 본원에 사용된 바와 같은, 청구항 및/또는 명세서에서 용어 “포함하는”과 연계하여 사용되는 경우 용어 “a” 또는 “an”의 사용은 “하나”를 의미할 수 있으나 이것은 또한 “하나 이상”, “적어도 하나” 및 “하나 초과”의 의미와 일치한다. 본 발명의 일부 구현예는 본 발명의 하나 이상의 구성성분, 방법 단계 및/또는 방법으로 이루어지거나 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 명세서에 기재된 임의의 방법 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 다른 방법 또는 조성물에 대해 실시될 수 있는 것으로 고려된다.
[0025] 수치 값의 바로 앞에 위치하는 경우의 용어 “약”은 수치값의 ± 0% 내지 10%, ± 0% 내지 10%, ± 0% 내지 9%, ± 0% 내지 8%, ± 0% 내지 7%, ± 0% 내지 6%, ± 0% 내지 5%, ± 0% 내지 4%, ± 0% 내지 3%, ± 0% 내지 2%, ± 0% 내지 1%, ± 0% 내지 1% 미만, 또는 본원의 임의의 다른 값 또는 값의 범위를 의미한다. 예를 들어, “약 40”은 40의 ± 0% 내지 10%(즉, 36 내지 44)를 의미한다.
[0026] 청구항에서 "또는" 이라는 용어의 사용은, 그것이 명시적으로 대안만을 언급하지 않는 한 또는 명세서가 대안 및 "및/또는"만을 언급하는 정의를 뒷받침하고 있더라도 그 대안이 상호 배타적이지 않는 한 "및/또는"을 의미하는 것으로 사용된다.
[0027] 용어 본원에 사용된 바와 같은 “바이러스 항원”은 천연적으로 단백질성인 항원을 언급한다. 특이적 구현예에서, 바이러스 항원은 코트 단백질이다. 바이러스 항원의 특정 예는 EBV, CMV, AdV, BK, JC 바이러스, HHV6, RSV, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 보카바이러스, 코로나바이러스, 리노바이러스, LCMV, 볼거리, 홍역, hMPV, 파르보바이러스 B, 로타바이러스, 메르켈 세포 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, HPV, HIV, HTLV1, HHV8, C형 간염, B형 간염, HTLV1, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 에볼라로부터 선택된 적어도 바이러스 기원의 항원을 포함한다.
[0028] 용어 “항원-특이적 T 세포주” 또는 “바이러스-특이적 T 세포” 또는 “바이러스-특이적 T 세포주”는 본원에 상호교환적으로 사용되어 바이러스 또는 관심 대상의 바이러스에 대한 특이성 및 효능을 갖는 폴리클로날 T 세포주를 언급한다. 본원에 기재된 바와 같은, 바이러스 항원 또는 수개의 바이러스 항원은 말초 혈액 단핵 세포에서 고유 T 세포에 제공되고 고유 CD4+ 및 CD8+ T 세포 집단은 상기 바이러스 항원(들)에 응답하여 확장한다. 예를 들어, EBV에 대한 항원-특이적 T 세포주 또는 바이러스-특이적 T 세포는 EBV를 인지할 수 있어 EBV에 특이적인 T 세포를 확장시킨다. 또 다른 예에서, 아데노바이러스 및 BK에 대한 항원-특이적 T 세포주 또는 바이러스-특이적 T 세포는 AdV 및 BK 둘다를 인지할 수 있어, 아데노바이러스 및 BK에 특이적인 T 세포를 확장시킨다.
[0029] 본원에 사용된 바와 같이, 본원에 상호교환적으로 사용된 바와 같은 용어 “환자” 또는 “대상체” 또는 “개체”는 사람, 가정용 동물 및 농장 동물, 및 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이 및 소, 양, 돼지 및 염소를 포함하는 농업용 동물을 포함하는 임의의 포유동물에 언급한다. 하나의 특정 포유류는 성인, 어린이 및 노인을 포함하는 사람이다. 대상체는 또한 개, 고양이 및 말을 포함하는 애완 동물일 수 있다. 농업용 동물의 예는 돼지, 소, 양 및 염소를 포함한다.
[0030] 본원에 사용된 바와 같이 달리 지적되지 않는 경우, 용어 “치료한다”, "치료하는", "치료" 등은 상기 용어가 적용되는 질환, 장애 또는 병태를 역전시키거나, 완화시키거나, 이의 진행을 억제하거나 질환, 장애 또는 병태, 또는 상기 질환, 장애 또는 병태의 하나 이상의 증상을 예방하는 것을 언급하고, 증상 또는 합병증의 발병을 예방하거나, 증상 또는 합병증을 개선시키거나, 상기 질환, 병태 또는 장애를 제거하기 위한 본원에 기재된 임의의 조성물, 약제학적 조성물 또는 투여 형태의 투여를 포함한다. 일부 경우에, 치료는 치유 또는 개선이다.
[0031] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “투여하는”, “투여한다”, “투여” 등은 상기 제제를 사용하여 치료를 필요로 하는 대상체에게 치료학적 제제를 이전하거나, 전달하거나, 도입하거나 수송하는 임의의 방식을 언급한다. 상기 방식은 안내, 경구, 국소, 정맥내, 복막내, 근육내, 피내, 비강내 및 피하 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
[0032] 본원에 사용된 바와 같은, 용어 “포함한다(comprise)”, “포함하는(comprising)”, “포함한다(includes)”, “포함하는(including)”, “갖는다”, “갖는”, “함유한다(contains)”, “함유하는(containing)”, “를 특징으로 하는”, 또는 이의 임의의 다른 변형어구는 비-배타적 내용물을 포괄하는 것으로 의도되고, 인용된 성분들의 달리 명백하게 지적된 임의의 제한에 적용한다. 예를 들어, 요소들(예를 들어, 성분들 또는 특성들 또는 단계들)의 목록을 “포함하는 조성물 및/또는 방법은 필연적으로 단지 상기 요소들 (또는 성분들 또는 특성들 또는 단계들)로 필수적으로 제한되지 않지만, 상기 조성물 및/또는 방법에 명백하게 목록되지 않거나 고유한 다른 성분들 (또는 성분들 또는 특성들 또는 단계들)을 포함할 수 있다.
[0033] 본원에 사용된 바와 같은 용어 “로 이루어진다” 및 “로 이루어진”은 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 예를 들어, 청구항에 사용된 “로 이루어진다” 또는 “로 이루어진”은 청구사항을 통상적으로 이와 연관된 불순물 (즉, 소정의 성분 내 불순물)을 제외한 청구항에 구체적으로 인용된 성분들, 물질 또는 단계들로 제한한다. 용어 “로 이루어진다” 또는 “로 이루어진”이 서두에 바로 이어지는 것 보단 차라리 청구항의 실체의 조항에서 나타나는 경우, 용어 “로 이루어진다” 또는 “로 이루어진”은 상기 조항에 제시된 요소들 (또는 성분들 또는 단계들)만으로 제한하고; 다른 요소들 (또는 성분들)은 전체적으로 청구항으로부터 배제되지 않는다.
[0034] 본 발명의 다른 목적, 특성 및 이점들은 하기의 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다. 그러나, 상세한 설명 및 본 발명의 구체적인 구현예를 제시하는 구체적인 실시예는, 상기 상세한 설명으로부터 본 발명의 개념과 범위 내에서 다양한 변화 및 변형을 줄 수 있음이 당업계의 숙련자에게는 명백하기 때문에, 단지 예시로서만 제공되는 것임을 알아야 한다.
[0035] 하기의 논의는 본 발명의 다양한 구현예에 관한 것이다. 용어 “발명”은 임의의 특정 구현예를 언급하거나 본원 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 이들 구현예의 하나 이상이 사용될 수 있지만, 기재된 구현예는 해석되지 않거나, 청구항을 포함하는 본원 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 사용되지 말아야 한다. 추가로, 당업자는 하기의 설명이 광범위하게 적용되며, 임의의 구현예에 대한 논의는 단지 그 구현예를 예시하는 것임을 의미하며 청구항을 포함하는 개시내용의 범위가 상기 구현예로 제한됨을 시사하는 것으로 의도되지 않는다.
개요
[0036] 다양한 구현예에서, 본원의 개시내용은 바이러스 감염 (예를 들어, 호흡기 바이러스 감염) 및 연관된 질환을 치료하거나 예방하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본원의 개시내용은 생체외 확장된, 비-유전학적으로 변형된, 바이러스-특이적 T 세포 (VST)의 투여에 의해 바이러스 감염을 억제하고 증상을 제거하는 상기 감염의 예방 또는 치료에 관한 것이다. 임의의 이론에 의해 국한시키고자 하는 것 없이, VST는 바이러스-유래된 펩타이드를 제공하는 표적 세포 상에서 발현되는 주요 조직적합성 복합체 (MHC) 분자에 결합하는 이들의 고유 T 세포 수용체 (TCR)를 통해 바이러스 감염된 세포를 인지하고 사멸시킨다.
[0037] 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 파라인플루엔자 바이러스 및 사람 메타뉴모바이러스를 포함하는 커뮤니티-획득 호흡기 바이러스로 인한 호흡기 바이러스 감염은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식체 (allo-HSCT) 수용자의 최대 40%에서 검출되고, 이들은 세기관지염 및 폐렴과 같은 중증 질환을 유발할 수 있고 치명적일 수 있다. RSV 유도된 세기관지염은 1세 미만의 유아에서 병원 입원에 대한 가장 통상적인 이유이고, 질환 억제 센터 (CDC)는 연간 인플루엔자가 전세계적으로 최대 3천5백60만명의 장애에 관여하고, 140,000 내지 710,000명이 입원하고 연간 비용은 미국에서만 질환 관리에 대략 $871억이고, 12,000 내지 56,000명이 사망한다.
[0038] 따라서, CARV는 전세계적으로 이환률 및 사망률의 주요 원인이고, 이의 면역계가 나이브이거나 (예를 들어, 유아) 저하된 개체들은 가장 취약하다. 예를 들어, 동종이계 조혈 줄기 세포 이식체 (HSCT) 수용자에서, CARV-관련된 호흡기 바이러스 질환의 발생률은 40%로 높다(5). 대부분의 환자들은 초기에 비루, 기침 및 열을 나타내지만, 대략 50%의 경우에, 감염은 보다 하부 호흡기로 진행하고 폐렴 및 세기관지염을 포함하는 중증 증상을 특징으로하고 사망률은 23-50%이다(6-9). hMPV(10) 및 PIV(11)에 대해 승인된 예방 백신이나 항바이러스 약물이 없으며 인플루엔자에 대한 예방 백신은 환자가 HSCT 후 최소 6개월이 아닌 경우 나타나지 않는다(12). 에어로졸화된 리바비린(RBV)은 RSV 치료용으로 FDA 승인을 받았지만 비용이 매우 비싸고(5일 코스 = $149,756) 관리가 어렵기 때문에 환자를 둘러싸고 있는 에어로졸 텐트에 연결하는 특수 분무 장치가 필요하다(13-16). 따라서, 많은 임상적으로 문제가 있는 CARV에 대해 승인된 항바이러스제의 부재와 에어로졸화된 RBV 투여의 높은 비용 및 복잡성은 대안적 치료 전략의 필요성을 강조한다.
[0039] 아데노바이러스(AdV), 리노바이러스 및 코로나바이러스 스트레인 SARS-CoV, SARS-CoV-2, MERS-CoV을 포함한 기타 호흡기 바이러스 및 풍토병 CoV는 면역적격 환자와 면역저하된 환자 둘다를 감염시킨다. 이들은 특히 면역저하된 개체에서 중증의 증상을 유발할 수 있으며, 2020년의 SARS-CoV2 대유행은 사람이 상기 감염 및 관련 질환을 치료하고 예방할 준비가 제대로 되어 있지 않음을 분명하게 드러냈다. 이러한 끔찍한 대유행은 이미 전세계적으로 수천 명의 사망, 의료 시스템의 붕괴, 수십년 동안 볼 수 없었던 세계 경제 붕괴를 초래하였다. 따라서 이러한 바이러스를 치료하기 위한 새로운 치료법이 시급히 필요하다는 것은 분명하다. 본원의 개시내용은 상기 치료요법을 제공한다.
[0040] 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 부분적으로 HLA-매칭된 "기성품(off-the-shelf)" 제품으로 이용가능한 건강한 사전 스크리닝된 혈청 양성 공여자로부터 조달된 말초혈 단핵 세포(PBMC)로부터 생성된 VST를 제공한다. 따라서, 본원 개시내용은 하나 이상의 바이러스에 대한 특이성을 갖는 VST를 포함하는 VST 제품 및 바이러스 감염을 치료 또는 예방하기 위해 이러한 VST를 사용하는 방법을 제공한다.
[0041] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 VST는 하나 이상의 바이러스 (예를 들어, 하나 이상의 호흡기 바이러스) 또는 보다 구체적으로 바이러스에 의해 발현되는 항원에 응답한다(또는 “이에 특이적이다”). 일부 구현예에서, 본원에 기재된 VST는 단지 하나의 바이러스에 응답한다. 예를 들어, 하나의 구현예에서, 본원 개시내용은 하나 이상의 RSV 항원에 대한 특이성을 갖는 VST의 폴리클로날 집단을 제공한다. 일부 경우에, 상기 RSV-특이적 VST는 다수의 RSV 항원에 대해 특이성을 갖는 T 세포를 포함한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 RSV-특이적 VST를 투여함에 의해 대상체에서 RSV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 RSV-특이적 VST를 투여함에 의해 대상체에서 RSV 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 이러한 관행은 RSV 이외의 임의의 단일 바이러스에 적용될 수 있다.
[0042] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 VST는 하나 초과의 바이러스 (예를 들어, 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 바이러스)에 응답한다. 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 하나 초과의 호흡기 바이러스(예를 들어, 본원에 기재된 호흡기 바이러스 중 임의의 하나 이상)에 반응하는 다중-호흡기 바이러스 특이적 T 세포(다중-R-VST)를 제공한다. 특정 양상에서, 다중-R-VST는 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV, 및 이들의 조합으로부터 선택된 바이러스에 의해 발현되는 하나 이상의 호흡기 바이러스 항원에 특이성을 갖는다. 특정 구현예에서, 다중-R-VST는 인플루엔자, RSV, hMPV, 및 PIV 각각에 의해 발현되는 항원에 특이성을 갖는다. 특정 양상에서, 다중-R-VST는 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 바이러스에 의해 발현되는 하나 이상의 호흡기 바이러스 항원에 특이성을 갖는다. 특정 구현예에서, 다중-R-VST는 인플루엔자, RSV, hMPV, 및 PIV3 각각에 의해 발현되는 항원에 특이성을 갖는다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 항원은 인플루엔자 A 항원 NP1이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 항원은 인플루엔자 A 항원 MP1이다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 항원의 NP1 및 MP1의 조합이다. 일부 구현예에서, RSV 항원은 RSV N이다. 일부 구현예에서, RSV 항원은 RSV F이다. 일부 구현예에서, RSV 항원은 RSV N 및 F의 조합이다. 일부 구현예에서, hMPV 항원은 F이다. 일부 구현예에서, hMPV 항원은 N이다. 일부 구현예에서, hMPV 항원은 M2-1이다. 일부 구현예에서, hMPV 항원은 M이다. 일부 구현예에서, hMPV 항원은 F, N, M2-1 및 M의 조합이다. 일부 구현예에서, PIV 항원은 M이다. 일부 구현예에서, PIV 항원은 HN이다. 일부 구현예에서, PIV 항원은 N이다. 일부 구현예에서, PIV 항원은 F이다. 일부 구현예에서, PIV 항원은 M, HN, N 및 F의 조합이다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 다중-R-VST를 대상체에게 투여함에 의해 대상체에서 PIV, 인플루엔자, RSV 및/또는 hMPV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 다중-R-VST를 대상체에게 투여함에 의해 대상체에서 PIV, 인플루엔자, RSV 및/또는 hMPV 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, PIV3 항원은 M이다. 일부 구현예에서, PIV3 항원은 HN이다. 일부 구현예에서, PIV3 항원은 N이다. 일부 구현예에서, PIV3 항원은 F이다. 일부 구현예에서, PIV3 항원은 M, HN, N 및 F의 조합이다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 다중-R-VST를 대상체에게 투여함에 의해 대상체에서 PIV3, 인플루엔자, RSV 및/또는 hMPV 감염을 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 또한 상기 다중-R-VST를 대상체에게 투여함에 의해 대상체에서 PIV3, 인플루엔자, RSV 및/또는 hMPV 감염을 예방하는 방법을 제공한다. 상기 관행은 임의의 다중 바이러스에 적용될 수 있다.
[0043] 하나의 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 각각에 대한 특이성을 갖는 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 폴리클로날 집단은 CD4+ 및 CD8+ VST 둘다를 포함할 수 있다. 폴리클로날 집단은 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 PIV, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 가질 수 있다. 대상체에서 PIV, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 치료하는 방법은 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체에서 PIV, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 예방하는 방법은 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[0044] 하나의 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 각각에 대한 특이성을 갖는 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 폴리클로날 집단은 CD4+ 및 CD8+ VST 둘다를 포함할 수 있다. 폴리클로날 집단은 대상체에게 투여될 수 있다. 대상체는 PIV3, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 가질 수 있다. 대상체에서 PIV3, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 치료하는 방법은 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 대상체에서 PIV3, 인플루엔자, RSV, 및/또는 hMPV 감염을 예방하는 방법은 다중-R-VST의 폴리클로날 집단을 대상체에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
[0045] 일부 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 추가의 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 일부 특정 구현예에서, 본원 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서, 상기 다수의 바이러스 항원은 PIV3으로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 추가의 항원으로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함한다. 추가의 바이러스는 인플루엔자, RSV, hMPV, AdV, 코로나바이러스 또는 이의 조합을 포함할 수 있다. VST는 하나 이상의 추가의 바이러스에 의해 발현되는 추가의 항원을 인지할 수 있고, 여기서, 상기 추가의 항원은 PIV 항원 M (예를 들어, PIV3 항원 M), PIV 항원 HN (예를 들어, PIV3 항원 HN), PIV 항원 N (예를 들어, PIV3 항원 N), PIV 항원 F (예를 들어, PIV3 항원 F), 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N, 및 AdV 항원 헥손(Hexon), AdV 항원 펜톤(Penton) 및 이의 조합으로부터 이루어진 하나 이상 또는 전부를 포함할 수 있다. 추가의 항원은 일부 구현예에서 하나 이상의 코로나바이러스 항원을 포함할 수 있다. 예를 들어, 추가의 항원은 하나 이상의 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2) 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 항원은 nsp1; nsp3; nsp4; nsp5; nsp6; nsp10; nsp12; nsp13; nsp14; nsp15; nsp16; 스파이크 (S); 외피 단백질 (E); 매트릭스 단백질 (M); 뉴클레오캡시드 단백질 (N)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 SARS-CoV2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, SARS-CoV2 항원은 SARS-CoV-2 (AP3A); SARS-CoV-2 (NS7); SARS-CoV-2 (NS8); SARS-CoV-2 (ORF10); SARS-CoV-2 (ORF9B); 및 SARS-CoV-2 (Y14)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 항원을 추가로 포함한다.
[0046] 일부 구현예에서 추가의 항원은 추가로 또는 대안적으로 EBV, CMV, AdV, BK, JC 바이러스, HHV6, RSV, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 보카바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, LCMV, 볼거리, 홍역, 사람 메타뉴모바이러스, 파르보바이러스 B, 로타바이러스, 메르켈 세포 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, HPV, HIV, HTLV1, HHV8, C형 간염, B형 간염, HTLV1, 및 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 에볼라로부터 선택된 바이러스로부터 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, EBV 항원은 LMP2, EBNA1, BZLF1, 및 이의 조합으로부터 기원한다. 일부 구현예에서, CMV 항원은 IE1, pp65, 및 이의 조합으로부터 기원한다. 일부 구현예에서, 아데노바이러스 항원은 헥손, 펜톤 및 이의 조합으로부터 기원한다. 일부 구현예에서, BK 바이러스 항원은 VP1, 대형 T. 및 이의 조합으로부터 기원한다. 일부 구현예에서, HHV6 항원은 U90, U11, U14, 및 이의 조합으로부터 기원한다.
[0047] 일부 구현예에서, 적어도 하나의 펩믹스는 RSV, 인플루엔자, PIV, 또는 hMPV로부터의 항원(또는 항원의 일부)를 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 펩믹스는 RSV, 인플루엔자, PIV, hMPV, 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2), 또는 이의 조합으로부터의 항원 (항원의 일부에 대해)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 펩믹스는 RSV, 인플루엔자, PIV3, hMPV, 또는 이의 조합으로부터의 항원 (항원의 일부에 대해)을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 펩믹스는 RSV, 인플루엔자, PIV3, hMPV, 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2), 또는 이의 조합으로부터의 항원 (또는 항원의 일부에 대해)을 포함한다.
[0048] 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원 M일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원 HN일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원 N일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원 F일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, 및 PIV 항원 F의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 1개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 2개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 3개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 4개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 4개의 제1 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, 및 PIV 항원 F를 포함할 수 있다.
[0049] 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원이다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원 M일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원 HN일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원 N일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원 F일 수 있다. 일부 구현예에서, 제1 항원은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, 및 PIV3 항원 F의 임의의 조합일 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 1개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 2개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 3개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 4개의 제1 항원을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 4개의 제1 항원은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, 및 PIV3 항원 F를 포함할 수 있다.
[0050] 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 RSV일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 인플루엔자일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 hMPV일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 RSV, 인플루엔자 및 hMPV를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 RSV, 인플루엔자 및 hMPV로 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 제2 바이러스는 본원에 기재된 바와 같이 임의의 적합한 바이러스로부터 선택될 수 있다.
[0051] 일부 구현예에서, 조성물은 2개 또는 3개의 제2 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물은 3개의 제2 바이러스를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 3개의 제2 바이러스는 인플루엔자, RSV, 및 hMPV를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 각각의 제2 바이러스 당 적어도 2개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 1개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 2개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 3개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 4개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 5개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 6개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 7개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 8개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 9개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 10개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 11개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 12개의 제2 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 조성물은 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 위해 적합한 임의의 수의 제2 항원을 포함한다.
[0052] 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 MP1일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 N일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 F일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M2-1일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 F일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 N일 수 있다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N의 임의의 조합일 수 있다.
[0053] 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 MP1을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1 및 인플루엔자 항원 MP1 둘다를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 F를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 RSV 항원 N 및 RSV 항원 F 둘다를 포함한다.
[0054] 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M2-1을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 F를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함한다.
[0055] 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 대한 임의의 적합한 항원을 포함할 수 있다.
[0056] 일부 구현예에서, 제2 항원은 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 각각을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, PIV3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, PIV3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV3 항원 M, PIV3 항원 HN, PIV3 항원 N, PIV3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 필수적으로 이루어진다. 일부 구현예에서, 제2 항원은 본원에 기재된 바와 같은 조성물에 대한 임의의 적합한 항원을 포함할 수 있다.
[0057] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물 중에 VST는 PBMC를 다수의 펩믹스 라이브러리와 접촉시킴에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, 각각의 펩믹스 라이브러리는 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸친 다수의 중복 펩타이드를 함유한다. 일부 구현예에서, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV 기원의 제1 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나는 PIV3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있다. 일부 구현예에서, 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가의 펩믹스 라이브러리는 각각의 제2 항원에 걸쳐 있다.
[0058] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 VST는 T 세포를 적어도 하나의 DNA 플라스미드로 핵감염된 수지상 세포 (DC)와 같은 항원 제공 세포 (APC)와 접촉시킴에 의해 생성된다. 일부 구현예에서, DNA 플라스미드는 하나의 항원의 적어도 일부를 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, DNA 플라스미드는 PIV 항원(예를 들어, PIV3 항원)을 암호화할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 DNA 플라스미드는 각각 제2 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 플라스미드는 적어도 하나의 PIV 항원 및 적어도 하나의 제2 항원을 암호화한다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 조성물은 CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 αβT 세포 수용체를 발현하는 VST를 포함한다. 일부 구현예에서, 조성물은 MHC-제한된 VST를 포함한다.
[0059] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV, 및 하나 이상의 추가의 바이러스로부터 선택되는 하나 이상의 호흡기 바이러스에 특이성을 갖는 다중-호흡기 바이러스 특이적 T 세포 (다중-R-VST)를 제공한다. PIV 항원은 PIV3으로부터 기원할 수 있다. 예를 들어, 일부 경우에, 추가의 바이러스는 코로나바이러스를 포함한다. 코로나바이러스는 알파 코로나바이러스일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 알파 코로나바이러스는 HCoV-E229, HCoV-NL63, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 알파 코로나바이러스는 HCoV-E229 및 HCoV-NL63 각각을 포함한다. 코로나바이러스는 베타 코로나바이러스일 수 있다. 예를 들어, 특정 구현예에서, 베타 코로나바이러스는 SARS-CoV, SARS-CoV2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, 및 이의 조합으로부터 선택된다. 특정 구현예에서, 베타 코로나바이러스는 SARS-CoV, SARS-CoV2, MERS-CoV, HCoV-HKU1, HCoV-OC43, 및 이의 조합 각각을 포함한다. 일부 경우에, 추가의 바이러스는 아데노바이러스를 포함한다. 일부 경우에, 추가의 항원은 EBV, CMV, AdV, BK, JC 바이러스, HHV6, RSV, 보카바이러스, 리노바이러스, 코로나바이러스, LCMV, 볼거리, 홍역, 파르보바이러스 B, 로타바이러스, 메르켈 세포 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, HPV, HIV, HTLV1, HHV8, C형 간염, B형 간염, HTLV1, 및 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 에볼라 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
[0060] 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV, 및 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV2)에 대해 특이성을 갖는 다중-R-VST를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV, 하나 이상의 AdV 및 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)에 대해 특이성을 갖는 다중-R-VST를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV3, 및 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV2)에 대해 특이성을 갖는 다중-R-VST를 제공한다. 하나의 구현예에서, 본원의 개시내용은 인플루엔자, RSV, hMPV, PIV3, 하나 이상의 AdV, 및 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)에 대해 특이성을 갖는 다중-R-VST를 제공한다.
[0061] 일부 구현예에서, VST는 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 생체외 배양할 수 있다. 일부 구현예에서 다중바이러스 VST는 배양의 모든 범위 및 이들 간의 서브범위를 포함하여, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일, 14일, 15일, 16일, 17일, 18일, 19일, 20일 이내 충분히 확장하여 이들은 환자에게 투여할 준비가 되어있다. 전형적인 제조 수행 (상기 조건에서 배양/확장)은 10 내지 18일 동안, 보다 전형적으로 14-16일 동안이다. 일부 구현예에서, 다중바이러스 VST는 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 위해 적합한 임의의 일수 이내에 충분히 확장하였다.
[0062] 본원의 개시내용은 무시할만한 동종이식편반응을 나타내는 VST를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 적은 활성화를 나타내는 VST를 포함하는 조성물은 동일한 환자로부터 수거된 상응하는 항원-특이적 T 세포 보다, 환자로부터 수거된 항원-특이적 T 세포의 세포사를 유도하였다. 일부 구현예에서, 조성물은 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 배양하지 않는다. 일부 구현예에서, VST를 포함하는 조성물은 70% 초과의 생존능을 나타낸다.
[0063] 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 조성물은 1 EU/ml 미만, 2 EU/ml 미만, 3 EU/ml 미만, 4 EU/ml 미만, 5 EU/ml 미만, 6 EU/ml 미만, 7 EU/ml 미만, 8 EU/ml 미만, 9 EU/ml,미만, 10 EU/ml 미만의 내독소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물은 5 EU/ml 미만의 내독소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 조성물은 마이코플라스마에 음성이다.
[0064] 일부 구현예에서, VST의 폴리클로날을 작제하기 위해 사용되는 펩믹스는 화학적으로 합성된다. 일부 구현예에서, 펩믹스는 임의로 모든 범위 및 이들 사이의 서브범위를 포함하는 >10%, >20%, >30%, >40%, >50%, >60%, >70%, >80%, 또는 >90% 순수하다. 일부 구현예에서, 펩믹스는 임의로 >90% 순수하다.
[0065] 일부 구현예에서, VST는 Th1 극성화되어 있다. 일부 구현예에서, VST는 바이러스 항원-발현 표적 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 구현예에서, VST는 다른 적합한 유형의 항원-발현 표적 세포를 용해시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 조성물 중에 VST는 비-감염된 자가 표적 세포를 유의적으로 용해시키지 않는다. 일부 구현예에서, 조성물 중에 VST는 비-감염된 자가 동종이계 표적 세포를 유의적으로 용해시키지 않는다.
[0066] 본원의 개시내용은 정맥내 전달을 위해 제형화된 임의의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일 동안 세균에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 세균에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일 동안 진균류에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 진균류에 대해 음성이다.
[0067] 일부 구현예에서, 본원의 약제학적 조성물은 1 EU/ml 미만, 2 EU/ml 미만, 3 EU/ml 미만, 4 EU/ml 미만, 5 EU/ml 미만, 6 EU/ml 미만, 7 EU/ml 미만, 8 EU/ml 미만, 9 EU/ml,미만, 10 EU/ml 미만의 내독소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 본원의 약제학적 조성물은 마이코플라스마에 대해 음성이다.
[0068] 본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 하나 이상의 유효량의 VST (예를 들어, PIV, 인플루엔자, RSV 및 hMPV에 대해 특이성을 갖는 본원에 기재된 다중-R-VST)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 본원의 개시내용은 또한 본원에 기재된 임의의 VST (예를 들어, PIV, 인플루엔자, RSV, 및 hMPV에 대해 특이성을 갖는 본원에 기재된 다중-R-VST)를 포함하는 조성물 및 본원에 기재된 VST를 포함하는, 하나 이상의 유효량의 상기 약제학적 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다.
펩믹스 라이브러리의 생성
[0069] 본원 개시내용의 일부 구현예에서, 펩타이드 라이브러리는 PBMC에 제공되어 궁극적으로 VST를 생성한다. 특정한 경우, 라이브러리는 동일한 항원의 일부 또는 전체에 걸쳐 있는 펩타이드의 혼합물 ("펩믹스")을 포함한다. 본원의 개시내용에 사용된 펩믹스는 15개 아미노산 길이인 펩타이드를 포함하고 특정 양상에서 11개 아미노산까지 서로 중복되는 시판되는 펩타이드 라이브러리로부터 기원할 수 있다. 일부 경우에, 이들은 합성적으로 생성될 수 있다. 이의 예는 제조원(JPT Technologies (Springfield, VA) 또는 Miltenyi Biotec (Auburn, Ca))으로부터의 것들을 포함한다. 특정 구현예에서, 펩타이드는 적어도 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 또는 35개 이상의 아미노산 길이이고, 예를 들어, 특정 구현예에서, 예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34개 아미노산 길이가 중복된다.
[0070] 일부 구현예에서, 펩믹스에 사용된 바와 같은 아미노산은 모든 범위 및 이들 사이의 서브범위를 포함하여 적어도 85%, 적어도 86%, 적어도 87%, 적어도 88%, 적어도 89%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99, 적어도 99.9%의 순도를 갖는다. 일부 구현예에서, 펩믹스에서 본원에 사용된 바와 같은 아미노산은 적어도 70% 순도를 갖는다.
[0071] 상이한 펩타이드의 혼합물은 임의의 비율의 상이한 펩타이드를 포함할 수 있지만, 일부 구현예에서, 각각의 특정 펩타이드가 또 다른 특정 펩타이드와 실질적으로 동일한 양으로 혼합물 중에 존재한다. 광범위 특이성을 갖는 다중바이러스 세포독성 T 세포에 대해 펩믹스를 제조하고 생성하는 방법은 이의 전문이 본원에 참조로 인용된 US2018/0187152에 기재되어 있다.
VST의 생성
[0072] 일부 구현예에서, VST를 생성하는 방법은 공여자로부터 수득된 혈액으로부터 단핵 세포 (MNC)를 단리하는 단계 또는 MNC가 단리되도록 하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, MNC는 PBMC이다. MNC 및 PBMC는 당업자에 의해 공지된 방법을 사용함에 의해 단리된다. 예를 들어, 밀도 원심분리(구배) (피콜-플라크(Ficoll-Paque))는 PBMC를 단리시키기 위해 사용될 수 있다. 다른 예에서, 세포 제조 튜브(CPT) 및 새롭게 수거된 혈액을 갖는 SepMate 튜브는 PBMC를 단리하기 위해 사용될 수 있다.
[0073] 일부 구현예에서, MNC는 PBMC이다. 예를 들어, PBMC는 림프구, 단핵구 및 수지상 세포를 포함할 수 있다. 예를 들어, 림프구는 T 세포, B 세포 및 NK 세포를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 사용된 바와 같은 MNC는 배양되거나 냉동보존된다. 일부 구현예에서, 세포를 배양하거나 냉동보존하는 공정은 배양 중의 세포를 하나 (또는 하나의 일부) 이상의 항원과 항원-특이적 T 세포를 자극하고 확장시키는데 적합한 배양 조건하에서 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 하나 이상의 바이러스 항원을 포함할 수 있다.
[0074] 일부 구현예에서, 세포를 배양하거나 냉동보존하는 공정은 적합한 배양 조건하에서 세포를 하나 이상의 항원 기원의 하나 이상의 에피토프와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, MNC 또는 PBMC를 하나 이상의 항원, 또는 하나 이상의 항원 기원의 하나 이상의 에피토프와 접촉시키는 단계는 각각의 공여자의 MNC 또는 PMBC 각각으로부터 항원-특이적 T 세포의 폴리클로날 집단을 자극하고 확장시킨다. 일부 구현예에서, 항원-특이적 T 세포주는 냉동보존될 수 있다.
[0075] 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 전체 단백질 형태로 있을 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 각각의 항원의 일부 또는 전체 서열에 걸친 일련의 중복 펩타이드를 포함하는 펩믹스일 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 항원은 전체 단백질, 및 각각의 항원의 일부 또는 전체 서열에 걸친 일련의 중복 펩타이드를 포함하는 펩믹스의 조합일 수 있다.
[0076] 일부 구현예에서, PBMC 또는 MNC의 배양은 가스 투과성 배양 표면을 포함하는 용기에서 수행한다. 일부 구현예에서, 상기 용기는 가스 투과성 부분 또는 강성 용기를 갖는 주입 백이다. 하나의 구현예에서, 용기는 G-Rex® 생물반응기이다. 하나의 구현예에서, 용기는 임의의 컨테이너, 생물반응기 등일 수 있고 이들은 본원에 기재된 바와 같은 PBMC 또는 MNC를 배양하기 위해 적합하다.
[0077] 일부 구현예에서, PBMC 또는 MNC는 하나 이상의 사이토킨의 존재하에 배양된다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL4이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL7이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL4 또는 IL7이다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 IL4 및 Ll7을 포함하지만 IL2는 포함하지 않는다. 일부 구현예에서, 사이토킨은 본원에 기재된 바와 같이 PBMC 또는 MNC를 배양하기 위해 적합한 사이토킨의 임의의 조합일 수 있다.
[0078] 일부 구현예에서, MNC 또는 PBMC의 배양은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 상이한 펩믹스의 존재하에 수행할 수 있다. 다수의 펩타이드인 펩믹스는 항원의 일부 또는 전체 서열에 걸쳐있는 일련의 중복 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, MNC 또는 PBMC는 다수의 펩믹스의 존재하에 배양될 수 있다. 상기 경우에, 각각의 펩믹스는 다수의 펩믹스에서 다른 펩믹스 각각이 포함하는 항원과는 상이한 적어도 하나의 항원을 포함한다. 일부 구현예에서, 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20개 이상의 상이한 항원은 다수의 펩믹스에 의해 포함된다. 일부 구현예에서, 적어도 2개의 상이한 바이러스 기원의 적어도 하나의 항원은 다수의 펩믹스에 의해 포함된다.
[0079] 일부 구현예에서, 펩믹스는 15량체 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 펩믹스는 본원에 기재된 방법을 위해 적합한 펩타이드를 포함한다. 일부 구현예에서, 항원에 걸친 펩믹스 내 펩타이드는 서열에서 8개 아미노산, 9개 아미노산, 10개 아미노산, 11개 아미노산, 12개 아미노산, 13개 아미노산, 14개 아미노산, 15개 아미노산이 중복된다. 일부 구현예에서, 항원에 걸친 펩믹스 내 펩타이드는 서열에서 11개 아미노산이 중복된다.
[0080] 일부 구현예에서, PBMC 또는 MNC는 인플루엔자 A 항원 NP1 및 인플루엔자 A 항원 MP1, RSV 항원 N 및 F, hMPV 항원 F, N, M2-1, 및 M, 및 PIV 항원 M, HN, N, 및 F에 걸친 펩믹스의 존재하에 배양한다. 일부 구현예에서, PBMC 또는 MNC는 인플루엔자 A 항원 NP1 및 인플루엔자 A 항원 MP1, RSV 항원 N 및 F, hMPV 항원 F, N, M2-1, 및 M, 및 PIV 항원 M, HN, N, 및 F 및 본원에 기재된 하나 이상의 코로나바이러스 (예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2) 항원에 걸친 펩믹스의 존재하에 배양한다. 일부 구현예에서, PBMC 또는 MNC는 EBV 항원 LMP2, EBNA1, 및 BZLF1, CMV 항원 IE1 및 pp65, 아데노바이러스 항원 헥손 및 펜톤, BK 바이러스 항원 VP1 및 대형 T, 및 HHV6 항원 U90, U11, 및 U14에 걸친 펩믹스의 존재하에 배양한다. 일부 구현예에서, 항원 특이적 T 세포는 항원-특이성 세포독성에 대해 시험된다.
[0081] 본원의 개시내용은 표적 세포를 본원에 기재된 바와 같은 조성물 또는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포를 용해시키는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, 표적 세포와 조성물 또는 약제학적 조성물 간의 접촉은 대상체에서 생체내에서 일어난다. 일부 구현예에서, 표적 세포와 조성물 또는 약제학적 조성물 간의 접촉은 VST의 대상체로의 투여를 통해 생체내에서 일어난다. 일부 구현예에서, 대상체는 사람이다.
[0082] 본원의 개시내용은 본원에 기재된 조성물 또는 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구현예에서, VST는 모든 범위 및 이들 사이의 서브범위를 포함하여, 5x103 내지 5x109 VST/m², 5x104 내지 5x108 VST/m², 5x105 내지 5x107 VST/m², 5x104 내지 5x108 VST/m², 5x106 내지 5x109 VST/m²이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, VST는 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 대상체는 면역저하되어 있다. 일부 구현예에서, PIV 감염을 갖는 대상체에는 PIV, RSV, hMPV, 및 인플루엔자에 특이적인 본원에 기재된 다중-R-VST가 투여된다. 일부 구현예에서, 다중-R-VST는 교차 특이성을 가져, 이들은 이들이 생성된 바이러스와는 상이한 바이러스 감염에 대해 효과적이다. 예를 들어, 예시된 바에 제한되지 않지만, 다중-R-VST에서 PIV 특이적 VST는 PIV3 항원에 대해 생성된다. 일부 구현예에서, 치료되는 PIV 감염은 PIV3이다. 일부 구현예에서, 치료되는 PIV 감염은 PIV3와는 다른 혈청형이다. 일부 구현예에서, RSV 감염을 갖는 대상체에는 PIV, RSV, hMPV, 및 인플루엔자에 특이적인 본원에 기재된 다중-R-VST가 투여된다. 일부 구현예에서, hMPV 감염을 갖는 대상체에는 PIV, RSV, hMPV, 및 인플루엔자에 특이적인 본원에 기재된 다중-R-VST가 투여된다. 일부 구현예에서, 인플루엔자 감염을 갖는 대상체에는 PIV, RSV, hMPV, 및 인플루엔자에 특이적인 본원에 기재된 다중-R-VST가 투여된다. 일부 구현예에서, 코로나바이러스 (예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2) 감염을 갖는 대상체에는 PIV, RSV, hMPV, 인플루엔자, 및 코로나바이러스 (예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)에 특이적인 본원에 기재된 다중-R-VST가 투여된다.
[0083] 일부 구현예에서, 대상체는 하나 이상의 의학적 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 VST를 수용하기 전에 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 이식체를 수용한다. 일부 구현예에서, 대상체는 VST를 수용하기 전에 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련없는 공여자 이식체를 수용한다. 일부 구현예에서, 대상체는 VST를 수용하기 전에 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 반수체-동일한 이식체를 수용한다. 일부 구현예에서, 대상체는 VST를 수용하기 전에 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 이식체를 수용한다. 일부 구현예에서, 대상체는 고체 기관 이식을 수용하였다. 일부 구현예에서, 대상체는 화학치료요법을 받았다. 일부 구현예에서, 대상체는 HIV 감염을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 유전학적 면역결핍증을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 동종이계 줄기 세포 이식을 수용하였다. 일부 구현예에서, 대상체는 바이러스 감염을 수득하고/하거나 바이러스 감염 후 유의적인 부작용을 갖는 것에 이들이 보다 민감해질 수 있게 하는 기존의 병태를 갖는다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 대상체는 심혈관 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 당뇨병을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 만성 호흡기 질환을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 고혈압을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 암을 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 비만이다. 일부 구현예에서, 대상체는 노인이다. 일부 구현예에서, 대상체는 본 문단에 기재된 바와 같이 하나 초과의 의학적 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 대상체는 본 문단에 기재된 바와 같이 모든 의학적 병태를 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)로 감염시킨다. 일부 구현예에서, 환자는 COVID-19로 진단되었다. 일부 구현예에서, 대상체는 면역저하되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 면역저하된은 약화된 면역계를 가짐을 의미한다. 예를 들어, 면역저하된 환자는 감염 및 다른 질환과 싸우는 감소된 능력을 갖는다. 일부 구현예에서, 환자는 환자가 질환 또는 병태 또는 또 다른 질환 또는 병태를 치료하기 위해 받은 치료로 인해 면역저하된다. 일부 구현예에서, 면역저하된 원인은 나이 때문이다. 하나의 구현예에서, 면역저하된 원인은 어린 나이 때문이다. 하나의 구현예에서, 면역저하된 원인은 노령 때문이다. 일부 구현예에서, 환자는 이식 치료요법을 필요로 한다. 일부 구현예에서, 대상체는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)에 의한 감염 이외의 다른 의학적 병태를 갖지 않는다. 일부 구현예에서, 대상체는 급성 골수 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 육아종 질환을 갖는다.
[0084] 일부 구현예에서, 치료 효능은 VST 세포주의 투여 후 측정된다. 다른 구현예에서, 치료 효능은 감염의 바이러스혈증 해명에 기초하여 측정된다. 다른 구현예에서, 치료 효능은 감염의 비루릭(viruric) 해명에 기초하여 측정된다. 다른 구현예에서, 치료 효능은 환자 기원의 샘플 중에 바이러스 부하량의 해명을 기준으로 측정된다. 다른 구현예에서, 치료 효능은 폐에서 질환을 밝힌 후 흉부 이미지화를 통해 측정된다. 일부 구현예에서, 샘플은 비강 면봉으로부터 유래한다. 다른 구현예에서, 치료 효능은 환자 기원의 샘플 중에서 감염의 바이러스혈증 해명, 감염의 비루릭 해명 및 바이러스 부하량의 해명에 기초하여 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 환자의 말초 혈액 중에서 검출가능한 바이러스 부하량을 모니터링함에 의해 측정된다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 거시적 혈뇨의 해명을 포함한다. 일부 구현예에서, 치료 효능은 CTCAE-PRO 또는 환자 및/또는 임상의가 보고한 결과를 조사하는 유사한 평가 도구에 의해 측정된 출혈성 방광염 증상의 감소를 포함한다.
[0085] 일부 구현예에서, 샘플은 환자 기원의 조직 샘플로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 환자 기원의 유체 샘플로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 환자 기원의 뇌척수액 (CSF)으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 환자 기원의 BAL로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 샘플은 환자 기원의 대변으로부터 선택된다.
[0086] 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 수회 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 1회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 2회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 3회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 4회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 5회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 6회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 7회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 8회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 9회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 10회 초과로 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 대상체에 대해 적합한 횟수로 대상체에게 투여된다. 조성물의 다중 투여가 개체에 제공되는 경우, 투여 간 지속 기간은 임의의 적합한 길이일 수 있고, 1-24 시간, 1-7일, 1-4주, 1-12개월 이상을 포함하고, 모든 범위 및 이들 사이의 서브범위를 포함한다.
[0087] 일부 구현예에서, VST(예를 들어, 다중-R-VST)의 폴리클로날 집단을 포함하는, 본원에 기재된 2개 이상의 조성물은 조합으로 대상체에게 투여된다. 2개 이상의 조성물은 순차적으로 또는 동시에 대상체에게 투여될 수 있다. 2개 이상의 조성물은 풀링될 수 있고 단일 조성물로서 투여될 수 있다. 2개 이상의 조성물은 별도의 조성물로 별도의 시간에 투여될 수 있다. 하나의 구현예에서, 대상체에는 PIV, 인플루엔자, RSV, 및 hMPV에 대한 특이성을 갖는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 제1 다중-R-VST 조성물이 투여되고, 상기 대상체에는 또한 또 다른 바이러스에 대한 특이성을 갖는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 제2의 분리된 VST 조성물이 투여된다. 특정 구현예에서, 다른 바이러스는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV2)이다. 일부 구현예에서, 대상체에는 PIV, 인플루엔자, RSV, 및 hMPV에 대한 특이성을 갖는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 제1 다중-R-VST 조성물 및 또 다른 바이러스에 대한 특이성을 갖는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 제2의 VST 조성물의 풀을 포함하는 단일 조성물이 투여된다. 특정 구현예에서, 다른 바이러스는 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV2)이다. 일부 구현예에서, 다른 바이러스는 BV, CMV, AdV, BK, JC 바이러스, HHV6, RSV, 인플루엔자, 파라인플루엔자, 보카바이러스, 코로나바이러스, 리노바이러스, LCMV, 볼거리, 홍역, hMPV, 파르보바이러스 B, 로타바이러스, 메르켈 세포 바이러스, 헤르페스 심플렉스 바이러스, HPV, HIV, HTLV1, HHV8, C형 간염, B형 간염, HTLV1, 헤르페스 심플렉스 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 및 에볼라로부터 선택된다.
[0088] 일부 구현예에서, 조성물의 투여는 대상체에서 바이러스 감염을 효과적으로 치료하거나 예방한다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 PIV이다. 일부 구현예에서, 바아러스 감염은 PIV3이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 RSV이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 인플루엔자이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 hMPV이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 SARS-CoV이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 MERS-CoV이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 HCoV-HKU1이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 HCoV-OC43이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 HCoV-E229이다. 일부 구현예에서, 바이러스 감염은 HCoV-NL63이다.
[0089] 본원의 개시내용은 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물을 제공한다. 본원의 개시내용은 다수의 바이러스 항원이 적어도 하나의 항원을 포함함을 제공한다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 코로나바이러스(예를 들어, SARS-CoV 또는 SARS-CoV2)일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 PIV로부터 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 RSV 항원일 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 인플루엔자로부터 기원할 수 있다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 항원은 hMPV로부터 기원할 수 있다.
[0090] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 PIV, RSV, 인플루엔자 및 hMPV 각각으로부터 기원하는 적어도 하나의 항원을 포함하는 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 PIV, RSV, 인플루엔자 및 hMPV 각각으로부터의 적어도 2개의 항원을 포함하는 다수의 바이러스 항원을 포함하는 다수의 바이러스 항원을 인지하는 VST의 폴리클로날 집단을 제공한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함한다. 일부 구현예에서, 다수의 항원은 PIV 항원 M, PIV 항원 HN, PIV 항원 N, PIV 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 중 어느 하나로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, VST의 폴리클로날 집단은 인플루엔자, RSV, PIV, 및/또는 hMPV로 감염된 환자에게 투여된다.
[0091] 본원 개시내용의 적어도 일부 방법에서, 생성된 VST는 개체, 예를 들어, 면역저하된 개체에게 투여된다. 일부 경우에, 개체는 동종이계 줄기 세포 이식을 갖거나 가질 것이다. 구체적인 실시형태에서, 세포는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 피내, 피하, 복강내 주사 등과 같은 주사에 의해 투여된다. 일부 구현예에서, 개체는 림프종 또는 백혈병을 갖는다. 일부 구현예에서, VST는 추가로 폴리클로날 CD4+ 및 CD8+ VST로서 정의된다. PBMC는 개체에 대해 동종이계일 수 있거나 개체에 자가일 수 있다. 일부 구현예에서, 본 발명의 방법은 추가로 VST를 세포 분열을 자극하는 하나 이상의 조성물, 예를 들어, 피토헤마글루티닌에 노출시키는 단계를 포함하고; 일부 양상에서, 상기 화합물은 미토겐이다.
[0092] 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 정맥내 전달을 위해 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 구현예에서, 본원의 개시내용은 본원에 기재된 VST 집단 및 하나 이상의 담체, 부형제, 희석제, 완충제 및/또는 전달 비히클을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 특정 구현예에서, 본원의 개시내용은 정맥내 전달을 위해 제형화된, 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의 VST 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 구현예에서, 정맥내 전달용으로 제형화된 조성물은 배양 배지 중에 현탁되거나 재현탁된, 본원에 기재된 확장된 VST 하나 이상을 포함할 수 있다. 정맥내 전달용으로 제형화된 조성물은 추가로 또는 대안으로, 적합한 담체, 부형제, 희석제, 완충제 및/또는 전달 비히클 중에 재현탁된 하나 또는 확장된 VST를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 정맥내 전달용으로 제형화된 조성물은 식염수 중에 재현탁된, 본원에 기재된 확장된 VST 하나 이상을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 세균에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 진균류에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 배양 중에 적어도 1일, 적어도 2일, 적어도 3일, 적어도 4일, 적어도 5일, 적어도 6일, 적어도 7일, 적어도 8일, 적어도 9일, 적어도 10일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이다. 일부 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 조성물은 배양 중 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이다.
[0093] 일부 구현예에서, 정맥내 전달용으로 제형화된 조성물은 1 EU/ml 미만, 2 EU/ml 미만, 3 EU/ml 미만, 4 EU/ml 미만, 5 EU/ml 미만, 6 EU/ml 미만, 7 EU/ml 미만, 8 EU/ml 미만, 9 EU/ml,미만, 10 EU/ml 미만의 내독소를 나타낸다. 일부 구현예에서, 정맥내 전달용으로 제형화된 약제학적 조성물은 마이코플라스마에 대해 음성이다.
실시예
실시예 1
방법
[0094] 달리 지적되지 않는 경우, 하기에 제공된 실시예는 하기의 재료 및 방법을 사용하였다.
유동 세포측정
면역표현형 분류
[0095] 다중-R-VST는 하기에 대한 모노클로날 항체로 표면 염색시켰다: CD3, CD25, CD28, CD45RO, CD279 (PD-1) [Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ], CD4, CD8, CD16, CD62L, CD69 (Beckman Coulter, Brea, CA) 및 CD366 (TIM-3) (BioLegend, San Diego, CA). 세포는 포스페이트 완충 식염수(PBS) (Sigma-Aldrich) 중에 펠렛화하고 이어서 항체는 포화량(5μl)으로 첨가하고 이어서 4°C에서 15분동안 항온처리하였다. 후속적으로, 세포를 세척하고, 300μl의 PBS에 재현탁시키고, 적어도 20,000 생존 세포를 Gallios™ 유동 세포측정기 상에서 획득하고, Kaluza® 유동 분석 소프트웨어(Beckman Coulter)를 사용하여 분석하였다.
세포내 사이토킨 염색(ICS)
[0096] 다중-R-VST를 수거하고, VST 배지(2x106/ml)에 재현탁시키고, 200μl를 96-웰 플레이트의 웰 당 첨가하였다. 세포는 브레펠딘 A (1μg/ml), 모넨신 (1μg/ml), CD28 및 CD49d (1μg/ml) (BD)과 함께 200ng의 개별 시험 및 대조군 (관련없는 비-바이러스성, 예를 들어, SURVIVIN, WT1) 펩믹스로 밤새 항온처리하였다. 이어서, VST는 PBS로 세척하고, 펠렛화하고, 4°C에서 15분동안 CD8 및 CD3 (5μl/항체/튜브)로 표면 염색시키고, 이어서 세척하고, 펠렛화하고, 암실에서 4°C에서 20분동안 세포고정/세포투과 용액 (BD)으로 고정화하고 투과시켰다. 투과/세척 완충액 (BD)로 세척한 후, 세포는 암실에서 4°C에서 30분동안 10μl의 IFNγ 및 TNFα 항체 (BD)로 항온처리하였다. 이어서, 세포를 투과/세척 완충액으로 2회 세척하고, 적어도 50,000 생존 세포를 Gallios™ 유동 세포측정기 상에서 획득하고, Kaluza® 유동 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
FoxP3 염색
[0097] FoxP3 염색은 제조업자의 지침에 따라 eBioscience FoxP3 키트 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Ma)를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 1x106 세포는 CD3, CD4 및 CD25 항체로 표면 염색시키고, 이어서 세척하고, 1ml의 고정/투과 완충액 중에 재현탁시키고, 암실에서 4°C에서 1시간동안 항온처리하였다. PBS로 세척한 후, 세포는 투과 완충액 중에 재현탁시키고, 5μl의 이소타입 또는 FoxP3 항체(클론 PCH101)으로 4°C에서 30분동안 항온처리하고, 이어서 세척하고 Gallios™ 유동 세포측정기 상에서 획득하고, Kaluza® 유동 분석 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.
기능성 연구
효소-결합된 면역 스팟 (ELIspot)
[0098] ELIspot 분석을 사용하여 IFNγ 및 그랜자임 B-분비 세포의 빈도를 정량하였다. 간략하게, PBMC 및 다중-R-VST는 각각 VST 배지 중에 5x106 및 2x106 세포/ml로 재현탁시키고, 100μl의 세포를 각각의 ELIspot 웰에 첨가하였다. 항원-비활성은 개별 자극[NP1, MP1 (인플루엔자); N, F (RSV); F, N, M2-1, M (hMPV); M, HN, N, F (PIV)], 또는 대조군 펩믹스(Survivin, WT1)를 사용한 직접적인 자극(500ng/펩타이드/ml) 후 측정하였다. 스타필로코커스 (Staphylococcal) 장독소 B (SEB) (1μg/ml) 및 PHA (1μg/ml)는 각각 PBMC 및 VST에 대해 양성 대조군으로서 사용하였다. 항온처리 20시간 후, 플레이트는 이전에 기재된 바와 같이 전개하였고, 실온에서 밤새 건조시키고 이어서 정량을 위해 기관(Zellnet Consulting (New York))으로 전송하였다. 스팟-형성 세포 (SFC) 및 인풋 세포 수를 플롯팅하고, VST에 대한 특이성 역치는 ≥30 SFC/2x105 인풋 세포로서 정의하였다.
멀티플렉스
[0099] 다중-R-VST 사이토킨 프로필은 멀티플렉스 고민감성 사람 사이토킨 패널(MILLIPLEX High Sensitivity Human Cytokine Panel) (Millipore, Billerica, MA)을 사용하여 평가하였다. 2x105 VST는 밤새 펩믹스(NP1, MP1, N, F, F, N, M2-1, M, M, HN, N, 및 F) (1μg/ml)로 자극하였다.
[0100] 후속적으로, 상등액을 수거하고, 이중(dupliacate) 웰에 분주하고, 4°C에서 밤새 항체-고정화된 비드로 항온처리하고, 이어서 세척하고, 실온에서 1시간동안 비오티닐화된 검출 항체로 플레이팅하였다. 최종적으로, 스트렙타비딘-피코에리트린은 실온에서 30분동안 첨가하였다. 샘플을 세척하고, xPONENT 소프트웨어를 사용하여 Luminex 200 (XMAP Technology) 상에서 분석하였다.
크로뮴 방출 검정
[0101] 표준 4-시간 크로뮴 (Cr51) 방출 검정을 사용하여 표적으로서 자가 항원-부하된 PHA 아세포(20ng/펩믹스/1x106 표적 세포)와 함께 다중-R-VST의 특이적 세포용해 활성을 측정하였다. 40:1, 20:1, 10:1, 및 5:1의 이펙터:표적 (E:T) 비율을 사용하여 특이적 용해를 분석하였다. 특이적 용해의 퍼센트를 계산하였다[(실험 방출 - 자발적 방출)/(최대 방출 - 자발적 방출)] x 100. 다중-R-VST 라인의 자가반응성 및 동종이식편반응 잠재력을 측정하기 위해, 자가 및 동종이계 PHA 아세포를 단독으로 표적으로서 사용하였다.
실시예 2
건강한 공여자로부터 폴리클로날 다중-R-VST의 생성
[0102] 본 연구에서, 본원 발명자들은 생체외 확장된 T 세포를 사용한 다수의 임상적으로 문제가되는 호흡기 바이러스를 표적화하는 실행가능성을 탐구하였다. 구체적으로, 본원 발명자들은 인플루엔자, RSV, hMPV, 및 PIV에 대한 특이성을 갖는 VST를 제조하였고, 활성 감염을 성공적으로 억제한 이식 수용자에서 임상적 효능을 입증하였다.
배경
[0103] CARV 연관된 급성 상부 및 하부 RTI는 어린이, 노인 및 면역 체계가 억제되거나 저하된 사람들이 가장 취약한 주요 공중 보건 문제이다(1-3). 이러한 감염은 기침, 호흡곤란, 쌕쌕거림 등을 포함하는 증상과 관련이 있으며 이중/다중 공존의 감염이 흔하며, 빈도는 5세 미만의 아동에서 40%를 초과할 수 있으며 이환율 및 입원 위험 증가와 관련이 있다(22- 26). 면역저하된 동종이계 HSCT 수용자 중 최대 40%가 경증(비루, 기침 및 발열을 포함한 관련 증상)에서 중증(세기관지염 및 폐렴)에 이르는 CARV 감염을 경험하며, 관련 사망률은 LRTI을 갖는 자들에서 50% 정도로 높다(5- 9). 치료학적 선택사항은 제한된다. hMPV 및 PIV에 대해, 현재 승인된 예방 백신이나 치료학적 항바이러스 약물이 없고, 뉴클레오사이드 유사체 RBV의 오프-표지 사용 및 DAS-181 (재조합 시알리다제 융합 단백질)의 연구 사용은 임상적 영향을 제한하였다(10, 11, 27, 28). 예방적 연간 인플루엔자 백신은 이식 후 최소 6개월까지 동종이계 HSCT 수용자에 대해 권장되지 않으며(집중 화학요법 또는 항-B 세포 항체의 수용자는 제외됨), 뉴라미니다제 억제제가 활성 감염의 치료에 항상 효과적인 것은 아니다(12). RSV의 경우, 에어로졸화된 RBV는 영유아의 중증 세기관지염 치료용으로 FDA 승인을 받았고, HSCT 수용자에서 상부 또는 하부 RTI 예방 및 RSV 폐렴 치료에도 오프-표지로 사용된다(13, 15, 16 ). 그러나 약물 전달에 필요한 번거로운 분무 장치 및 환기 시스템과 상당한 관련 비용으로 인해 널리 사용되는데 한계가 있다. 예를 들어, 2015년 에어로졸화 RBV의 비용은 하루에 $29,953이며 일반적인 치료 과정은 5일이다(14). 따라서 높은 비용의 항바이러스제와 결합된 승인된 치료법의 부재로 인해 본원 발명자들은 상기 환자 집단에서 CARV 감염을 예방 및/또는 치료하기 위해 입양 전달된 T 세포를 사용할 잠재력을 탐구하게 하였다.
[0104] CARV의 바이러스 제어를 매개하는 기능적 T 세포 면역의 중추적 역할은 최근에야 주목을 받았다. 예를 들어, RSV URTI를 갖는 181명의 HSCT 환자에 대한 후향적 연구에서는 감염이 LRTI로 진행될 환자를 동정하는 주요 결정인자로 림프구감소증(ALC ≤100/mm3으로 정의됨)을 보고했지만 RSV 중화 항체 수준은 질병 진행과 유의하게 관련되지 않았다(29). 또한, RSV LRTI로 치료받은 HSCT를 갖거나 갖지 않는 혈액 악성 종양을 가진 154명의 성인 환자에 대한 최근의 후향적 분석에서 림프구감소증은 더 높은 사망률과 유의적으로 연관되었다(30). 이들 연구 둘다는 생체 내에서 보호 면역을 매개하는데 있어서 세포 면역의 중요성을 시사한다.
공여자 및 세포주
[0105] 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 대학 (Baylor College of Medicine IRB) 승인 프로토콜(H-7634, H-7666)을 사용하여 정보에 입각한 동의 하에 건강한 지원자 및 HSCT 수용자로부터 수득하였고 식물 혈구응집소(PHA) 아세포 및 다중 R-VST를 생성하는데 사용되었다. PHA 아세포는 이전에 보고된 바와 같이 생성하였고(20), VST 배지 [45% RPMI 1640 (HyClone Laboratories, Logan, Utah), 45% 클릭(Click’s) 배지 (Irvine Scientific, Santa Ana, California), 2 mM GlutaMAX TM-I (Life Technologies, Grand Island, New York), 및 2일 마다 보충되는, 인터류킨 2 (IL2)(100U/mL; NIH, Bethesda, Maryland)가 보충된 10% 사람 AB 혈청(Valley Biomedical, Winchester, Virginia)]에서 배양하였다. VST 생성
다중-호흡기 바이러스 특이적 T 세포의 생성 및 표현형 특징 분석
[0106] 본원 발명자들은 하기의 방법에 의해 인플루엔자, RSV, hMPV 및 PIV에 대해 반응하는 세포의 서브 집단을 포함하는 바이러스 특이적 T 세포(VST) T 세포주를 생성하였다:
[0107] PBMC (2.5x107)는 상기와 같이 수거하였고 이어서 IL7 (20ng/ml), IL4 (800U/ml) (R&D Systems, Minneapolis, MN) 및 펩믹스 (2ng/펩타이드/ml)가 보충된 100ml의 VST 배지를 갖는 G-Rex10 (Wilson Wolf Manufacturing Corporation, St. Paul, MN)으로 전달하였고, 37°C, 5% CO2에서 10 내지 13일 동안 배양하였다(도 1a).
[0108] 펩믹스는 인플루엔자 A 항원(NP1, MP1), RSV 항원(N, F), hMPV 항원 (F, N, M2-1, M) (JPT Peptide Technologies, Berlin, Germany) 및 항원 PIV 항원(M, HN, N, F) (Genemed Synthesis, San Antonio, Tx)에 걸친 펩타이드 라이브러리(11aa가 중복된 15량체)이다. 동결건조된 펩믹스는 디메틸 설폭사이드(DMSO) (Sigma-Aldrich)에서 재구성하였고, 사용때까지 -80°C에서 저장하였다.
결과
[0109] 10 내지 13일 동안, 본원 발명자들은 세포에서 평균 8.5배 증가를 성취하였다(도 1b) [0.25x107 PBMCs/cm2로부터 평균 1.9±0.2x107 세포/cm2로의 증가 (메디안: 2.05x107, 범위: 0.6-2.82x107 세포/cm2; n=12)]. 본원 발명자들은 유동 세포측정을 사용하여 상기된 바와 같은 확장된 세포를 면역표현형 분류하였다. 확장된 세포는 거의 전적으로 세포독성 (CD8+; 18.1±1.3%) 및 헬퍼 (CD4+; 74.4±1.7%) T 세포의 혼합물과 함께 CD3+ T 세포 (96.2±0.6%; 평균±SEM)로 구성되었고 [도 1c], CD4/CD25/FoxP3+ 염색에 의한 평가시 조절 T 세포 파생물에 대한 증거가 없다[도 1e]. 추가로, 확장된 세포는 활성화 마커 CD25 (50.2±3.8%), CD69 (52.8±6.3%), CD28 (85.8±2%)의 상향조절 및 최소 PD1 (6.9±1.4%) 또는 Tim3 (13.5±2.3%) 표면 발현과 함께, 센트럴 (CD45RO+/CD62L+: 61.4±3%) 및 이펙터 기억 마커 (CD45RO+/CD62L-:20.3±2.3%)의 발현에 의해 입증된 바와 같이 이페터 기능 및 장기 기억과 일치하는 표현형을 나타냈다[도 1c-1d].
[0110] 따라서, 본원에 개시된 방법은 호흡기 바이러스 항원에 대한 특이성을 갖는 VST의 확장을 시사하는 소진의 징후 없이 활성화된 세포독성 및 헬퍼 T 세포의 폴리클로날 집단의 신속한 확장을 유도한다.
실시예 3
다중-R-VST의 항-바이러스 특이성의 특징분석
[0111] 이어서 확장된 집단이 항원-특이적인지를 결정하기 위해, 본원 발명자들은 면역원으로서 개별 자극 항원 각각을 사용하여, IFNγ 및 그랜자임 B-분비 세포 ELIspot 검정을 수행하였다. ELIspot 분석은 상기 논의된 바와 같이 수행하였다. 생성된 모든 12개 라인은 표적 바이러스 모두에 대해 반응성임을 입증하였다[표 1, 도 2e].
[표 1]
Figure pct00001
[0112] 도 2a는 자극 항원 각각에 대한 활성 정도를 요약하고, 도 2f는 바이러스 항원의 적정 농도에 대한 본원 발명의 확장된 VST의 반응을 보여준다. 참고로, 배양에서 10-13일에 걸쳐 본원 발명자들은 14.6±4.3(PIV-HN) 내지 50.4±9.9배(RSV-N)의 바이러스-특이적 T 세포의 농축을 성취하였다[도 2b; 공여자 PBMC 내 CARV-반응성 T 세포의 전구체 빈도는 도 2g에 요약되어 있다]. 종합해보면 이들 데이터는 호흡기 바이러스 특이적 T 세포가 기억 풀에 상주하고 GMP 준수 제조 방법을 사용하여 생체 외에서 용이하게 증폭될 수 있음을 시사한다.
[0113] 이어서, 바이러스 특이성이 CD4+ 또는 CD8+ 또는 T 세포 서브세트 둘다와 함께 포함되는지를 평가하기 위해, 본원 발명자들은 CD4+ 및 CD8+IFN g-생성 세포상에 게이팅하는 ICS를 수행하였다. 도 2c는 T 세포 격실 둘다에서 검출된 모든 4개의 바이러스 [(CD4+: 인플루엔자 - 5.28%; RSV - 11%; hMPV - 6.57%; PIV - 3.37%), (CD8+:인플루엔자 - 2.26%; RSV - 4.36%; hMPV - 2.69%; PIV - 2.16%)]에 대한 활성을 갖는 1명의 공여자로부터의 대표적인 결과를 보여주고, 도 2d는 스크리닝된 9명의 공여자에 대한 요약 결과를 보여주고, 본원 발명의 다중-R-VST가 폴리클로날이고 폴리-특이적임을 확인시켜 준다.
[0114] 따라서, 이들 데이터는 이들 방법이 폴리클로날이고 CD4+ 및 CD8+ T 세포 둘다를 포함하는 다중-R-VST을 생성함을 확인시켜 준다.
실시예 4
다중-R-VST의 시험관내 효능의 평가
[0115] 다중 염증 촉진성 사이토킨의 생성 및 이펙터 분자의 발현은 증진된 세포용해 기능 및 개선된 생체내 T 세포 활성과 상관관계가 있는 것으로 나타났다. 따라서 본원 발명자들은 이어서 항원 노출 후 본원 발명의 다중 R-VST의 사이토킨 프로필을 조사하였다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 원형적 Th2/억제성 사이토킨 [도 3c-우측 패널]의 기준선 수준과 함께, 대다수의 IFNγ-생성 세포는 또한 루미넥스 어레이에 의한 측정시 (도 3c-좌측 패널], GM-CSF에 추가로 TNFα [도 3a -1명의 공여자로부터의 세부적인 ICS 결과; 9개 공여자에 대한 요약 결과; 도 3b]를 생성하였다. 추가로, 항원 자극시, 본원 발명의 세포는 이펙터 분자 그랜자임 B를 생성하였고, 이는 이들 확장된 세포의 세포용해 잠재력을 시사한다[도 3d, n=9]. 이를 함께 종합해보면, 상기 데이터는 본원 발명의 다중-R-VST의 Th1-극성화된 및 다기능성 특징을 입증한다.
[0116] 이들 확장된 세포의 세포용해 잠재력을 시험관내 조사하기 위해, 본원 발명자들은 다중-R-VST를, 대조군으로 작용하는 부하되지 않은 PHA 아세포와 함께 바이러스 펩믹스가 부하된 자가 Cr51-표지된 PHA 아세포와 다중-R-VST를 동시 배양하였다. 도 4a 및 도 4c에 나타낸 바와 같이, 바이러스 항원-부하된 표적은 본 발명의 확장된 다중-R-VST (40:1 E:T - 인플루엔자: 13±5%, RSV: 36±8%, hMPV: 26±7%, PIV: 22±5%, n=8)에 의해 특이적으로 인지되고 용해된다. 마지막으로, 비록 이들 VST가 단 한번의 자극을 받았음에도 불구하고, HLA-미스매칭된 PHA 아세포를 표적으로 사용하여 감염되지 않은 자가 표적에 대한 활성이나 동종이식편반응(이식편 대 숙주 잠재력)에 대한 활성의 증거는 없었다[도. 4b]. 이것은 이들 세포가 동종이계 HSCT 수용자에게 투여되어야만 하는 경우, 중요한 고려 사항이다.
[0117] 따라서, 다중-R-VST는 시험관내 효능을 소유하고, 안전하다.
실시예 5
다중-R-VST의 생체내 효능의 평가
[0118] 다중-R-VST의 잠재적 임상 관련성을 평가하기 위해, 본원 발명자는 활성/최근 CARV 감염을 갖는 동종이계 HSCT 수용자가 활성 바이러스 에피소드 동안에/후 상승된 수준의 반응성 T 세포를 나타내는지를 조사하였다. 도 5a는 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 (MRD) 이식을 받은 급성 골수 백혈병 (AML)을 갖는 환자 #1, 64세 남성의 결과를 보여준다. 상기 환자는 PCR 분석에 의해 RSV-관련된 것으로 확인된 HSCT 후 9개월째에 중증의 URTI를 발병하였다. 상기 환자는 감염 시에 임의의 면역억제 중에 있지 않았지만 폐 염증을 억제하기 위해, 감염 진단일에 프레드니솔론 복용에 있게 하였다. 4주 이내에, 환자의 증상은 특이적 항바이러스 치료 없이 해소되었다. T 세포 면역이 바이러스 제거에 기여했는지의 여부를 평가하기 위해, 본원 발명자들은 감염 과정에서 RSV 특이적 T 세포의 순환 빈도를 분석하였다. 감염 직전, 상기 환자는 RSV 항원 N 및 F (6.5 SFC/5x105 PBMC)에 대해 매우 약한 반응을 나타냈다. 그러나, 바이러스 노출 1개월 내, RSV-특이적 T 세포는 생체내 확장시키고(527 SFC/5x105 PBMC), 도 5a에 나타낸 바와 같이 반응성 세포에서 81배 증가를 나타내고 이후 이는 감소하였고 바이러스 제거와 일치한다. 참고로, 상기 관찰된 RSV 특이적 반응은 림프구/CD4+ 수의 전반적인 증가를 따르지 않았으므로, T 세포 확장이 일반적인 면역 재구성으로 인한 것이 아니라 바이러스에 의해 구동되었음을 지적한다. 유사하게, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL)을 갖는 환자 #2, 23세 남성은 골수절제 컨디셔닝과 함께 일치된 관련없는 공여자 (MUD) 이식을 받았고, HSCT 후 5개월째, 점진적으로 감소하는 용량의 타크롤리무스 복용 동안에 중증의 RSV 관련된 URTI를 발병하였다. 환자의 감염은 리바비린 투여와 동시에 1주일 이내에 증상적으로 해소되었다. 내인성 면역이 또한 바이러스 제거에 역할을 하는지의 여부를 조사하기 위해, 본원 발명자는 시간 경과에 따라 반응성 T 세포 수를 모니터링하였다. 도 5b에 도시된 바와 같이, 바이러스 제거는 RSV-특이적 T 세포(피크 93 SFC/5x105 PBMC)의 순환 빈도의 증가를 수반하였고 후속적으로 기준선 수준으로 복귀하였다. 동일한 환자는 가래에서 hMPV의 동시 검출(PCR에 의해)과 함께 후속적인 폐렴구균성 폐렴에 대해 이식 후 7개월에 입원하였다. 환자의 폐렴은 4 SFC에서 70 SFC의 피크로 증가하고 후속적으로 기준선 수준으로 감소하는, hMPV 특이적 T 세포(F, N, M2-1 및 M에 대해 반응성)의 현저한 확장과 동시에 질환 및 바이러스 제거의 후속 해결과 함께 항생제로 치료되었다[도 5c]. 다시, 관찰된 RSV-및 hMPV-특이적 반응은 림프구/CD4+ 수에서의 전체적인 증가와는 무관하다. 도 6은 CARV 감염이 발생한 3명의 추가 HSCT 수용자의 결과를 보여준다. 환자 #3은 강도 컨디셔닝이 감소된 반수체-동일 이식을 받았고 이식 후 5주 째에 타크로리무스 복용 중에 있는 동안 RSV 유도 URTI 및 LRTI를 발병한, AML을 갖는 15세 여성이다. 환자는 리바비린을 투여받았고, 감염은 4주 이내에 해소되었다. 본원 발명자들은 시간 경과에 따라 RSV-반응성 T 세포를 모니터링하였고, 도 6a에서 알 수 있는 바와 같이, 바이러스 제거는 RSV-특이적 T 세포의 빈도의 현저한 증가와 일치하였다(0에서 506 SFC/5x105 PBMC로). 유사하게, 골수절제 컨디셔닝과 함께 MUD 이식을 받은 ALL을 갖는 10세 남성인 환자 #4는 타크로리무스를 복용하는 동안 HSCT 후 1개월째에 PIV3 관련 URTI 및 LRTI를 발병하였다. 환자의 감염은 리바비린 투여와 동시에 5주 이내에 증상적으로 해결되었다. 내인성 면역이 또한 바이러스 제거에 역할을 하는지의 여부를 조사하기 위해, 본원 발명자는 시간 경과에 따라 PIV3-반응성 T 세포 수를 모니터링하였다. 도 6b에 도시된 바와 같이, 바이러스 제거는 PIV3 항원 M, HN, N 및 F(피크 38 SFC/5x105 PBMC)에 특이적인 T 세포의 순환 빈도의 증가와 후속적인 감소를 동반하였다. 마지막으로, 본원 발명자는 골수절제 컨디셔닝과 함께 MRD 이식을 받은 만성 육아종성 질환을 앓고 있는 3세 남성인 환자 #5가 사이클로스포린을 복용하는 동안, HSCT 후 4개월째 중증의 PIV3 관련 URTI를 발병하였음을 보여준다. 환자는 리바비린을 투여받았지만(평가된 마지막 시점에서) 질환 증상을 계속 나타내었고 PIV3-특이적 T 세포를 입증하는데 실패하였다(도 6c). 종합해 보면, 이들 데이터는 면역저하된 환자에서 바이러스 감염의 제어에서 CARV 특이적 T 세포의 생체내 관련성을 시사한다.
결론
[0119] 호흡기 신시티알 바이러스(RSV), 인플루엔자, 파라인플루엔자 바이러스(PIV) 및 사람 메타뉴모바이러스(hMPV)를 포함하는 커뮤니티-획득 호흡기 바이러스(CARV)로 인한 호흡기 바이러스 감염은 동종이계 조혈 줄기 세포 이식체 (allo-HSCT) 수용자의 최대 40%에서 검출되고, 이들은 세기관지염 및 폐렴과 같은 중증 질환을 유발할 수 있고 치명적일 수 있다. 이러한 CARV에 대해 승인된 항바이러스제의 부재 및 입양적으로 전달된 생체 외 확장된 바이러스 특이적 T 세포(VST)가 잠복 [엡스타인-바 바이러스(EBV), 거대세포 바이러스(CMV), BK 바이러스(BKV), 사람 헤르페스바이러스 6(HHV6)] 및 용해성 [allo-HSCT의 수용자에서 용해성 [아데노바이러스(AdV)] 바이러스의 치료가 임상적으로 유리할 수 있음을 입증하는 데이터를 고려하여, 상기 접근법을 적어도 인플루엔자, RSV, hMPV 및 PIV3으로 확장할 잠재력을 탐구하는 것으로 간주되었다.
[0120] 따라서, 본원 발명자들은 건강한 공여자로부터의 PBMC를 특정 표적 바이러스[인플루엔자 - NP1 및 MP1; RSV - N 및 F; hMPV - F, N, M2-1 및 M; PIV3 - M, HN, N 및 F]로부터의 면역원성 항원에 걸쳐 있는 펩믹스(중복 펩타이드 라이브러리) 칵테일에 노출시킴에 이어서 G-Rex에서 활성화 사이토킨 존재 하에 확장시켰다. 10 내지 13일에 걸쳐, 본원 발명자들은 평균 8.5배 확장을 달성하였다(0.25x 107 PBMC/cm2에서 평균 1.9±0.2x 107 세포/cm2로의 증가, n=12). 배양물은 거의 전적으로 CD3+ T 세포(96.2±0.6%, 평균±SEM), 세포독성(CD8+) 및 헬퍼(CD4+) T 세포의 혼합물로 구성되었으며, 활성화 마커 CD25, CD69 및 CD28의 발현 및 중심(CD45RO +/CD62L+) 및 이펙터 기억 마커(CD45RO+/CD62L) 발현의 상향조절에 의해 입증된 바와 같이 표현형은 즉각적인 이펙터 기능 및 장기간 지속성과 일치하고, 최소 PD1 또는 Tim3을 갖는다. 다중-호흡기-VST의 항-바이러스 특이성은 면역원으로서 개별 자극 항원 각각을 사용하는 IFNγ ELISpot 검정에서 시험하였다. 스크리닝된 모든 12개 라인은 표적 바이러스 각각에 대해 반응성이었다[인플루엔자: 평균 735±75.6 SFC/2x105, RSV: 758±69.8, hMPV: 526± 100.8, PIV3: 391±93.7]. 확장된 VST는 Th2/억제성 사이토킨의 기준선 수준만으로, TNFa, GM-CSF 및 그랜자임 B에 의해 입증된 바와 같이 Th1-극성화된 이펙터 세포이다.
[0121] 상기 세포들은 표준 Cr51 방출 검정에서 시험되었고, 바이러스 펩믹스-부하된 자가 PHA 아세포를 용해시킬 수 있었고(40:1 E:T - 인플루엔자: 13±5%, RSV: 36±8%, hMPV: 26±7%, PIV: 22±5%, n=8), 자가-또는 동종이식편반응의 증거가 없고, HSCT 수용자에서 임상적 사용을 위한 이들의 선택성 및 이들의 안정성을 입증한다.
[0122] 최종적으로, 이들 발견의 임상적 유의성을 평가하기 위해, 본원 발명자들은 활성 RSV, hMPV 및 PIV3 감염을 갖는 5명의 동종이계 HSCT 수용자의 말초 혈액을 조사하였다. 이들 환자 중 4명은 성공적으로 1 내지 5주 이내에 바이러스를 제어하였고, 이는 내인성 반응 T 세포의 증폭과 일치하고 후속적으로 바이러스 제거 시 기준선 수준으로 복귀하고, 한명의 환자는 감염 바이러스에 대해 면역 반응을 상승시키는데 실패하였고, 균등하게 지금까지 감염을 제거하는데 실패하였다. 상기 데이터는 생체외 확장된 세포의 입양 전달이 이 자신의 세포 면역이 부재인 환자에서 임상적으로 유익해야함을 시사한다.
[0123] 결론적으로, 본원 발명자들은 4개의 표적 바이러스로부터 유래된 12개의 면역우성 항원에 대한 특이성을 갖는 폴리클로날(CD4+ 및 CD8+) 다중-호흡기 (다중-R)-VST의 단일 제조물을 신속하게 생성할 수 있는 것으로 나타났다: GMP 준수 제조 방법을 사용하는 인플루엔자, RSV, hMPV 및 PIV3. 확장된 세포는 Th1 극성화되고 다기능적이며 감염되지 않은 자가 또는 동종이계 표적에 대해 활성이 없는 바이러스 항원 발현 표적 세포에 선택적으로 반응하고 이를 사멸시킬 수 있어 바이러스 표적에 대한 선택성과 임상 사용을 위한 안전성 모두를 입증한다. 다양한 구현예에서, 상기 다중-호흡기 바이러스-표적화된 세포 (다중-R-VST)는 면역저하된 개체를 포함하는 제어되지 않는 CARV 감염을 갖는 면역저하된 개체에 대한 광범위 스펙트럼의 이득을 제공한다.
실시예 6
건강한 공여자로부터 폴리클로날 RSV-특이적 VST의 생성
[0124] RSV는 특히 위험한 호흡기 질환이다. 이는 미국에서 연간 57,000건 초과의 어린 아동(5세 미만) 입원에 기여하고 미국에서 매년 177,000건의 입원 및 14,000명의 성인(>65세) 사망을 유도한다(질환 통제 및 예방 센터). RSV는 흔히 하부 호흡기 감염으로 진행하여 폐렴과 같은 질환을 유발하고, 이는 치명적일 수 있고(문헌참조: Paulsen and Danziger-Isakov, Clin Chest Med 38 (2017)), 이것은 동종이계 조혈 줄기 세포 또는 고체 기관 이식을 받은 환자를 포함하는 면역저하된 개체에서 질환의 주요 원인이다. 더욱이, 리바비린은 RSV에 의해 유발된 중증의 폐렴을 갖는 어린이를 치료하기 위해 FDA 승인되었지만, 상기 치료법은 고가이고 투여하기 어렵고 독성 문제와 관련되고 다른 환자 그룹에 대해서는 승인되지 않는다. 따라서, 효과적인 RSV 치료가 당업계에 크게 요구되고 있다.
[0125] 도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예에 기재된 다중-R-VST에 포함된, RSV 항원 N 및 F에 추가로, RSV 게놈은 또한 다른 항원을 포함한다: G, M2-1, M, NS1, NS2, M2-2, P, L, 및 SH (도 7). RSV 감염을 치료하기 위한 본원 발명의 다중-R-VST의 효능을 입증하였기 때문에, 이들만이 펩믹스 RSV 항원 N 및 F와 함께 생성되었지만, 본원 발명자들은 본원 발명자가 보다 광범위한 RSV 항원 어레이에 대한 특이성을 갖는 VST를 생성할 수 있는지를 조사해야만 했다.
[0126] 상기 목적을 위해, PBMC는 실시예 1에 기재된 바와 같이 단리하였고, 도 8에 나타낸 바와 같이, 2.5x106 PBMC/cm2은 실시예 1 및 2에 기재된 바와 같이 10 내지 15일 동안 IL4, IL7 및 상기 언급된 RSV 항원 모두를 포함하는 펩믹스와 함께 배양하였다.
결과
[0127] 10일 동안 세포에서 평균 대략 5배 증가를 성취하였다(도 9a). 본원 발명자들은 유동 세포측정을 사용하여 상기된 바와 같은 확장된 세포를 면역표현형 분류하였다. 확장된 세포는 거의 전적으로 세포독성 (CD8+; ~33%) 및 헬퍼 (CD4+; ~66%) T 세포의 혼합물과 함께 CD3+ T 세포로 구성되었다[도 9b]. 추가로, 확장된 세포는 활성화 마커 CD25, CD69, 및 CD28의 상향조절에 의해 입증된 바와 같이 이펙터 기능과 장기 기억, 및 최소 PD1 또는 Tim3 표면 발현과 일치하는 표현형을 나타냈다[도 9c].
[0128] 본원 발명자들은 항원 노출 후 본원 발명의 RSV-VST의 사이토킨 프로필을 조사하였다. 도 10a에 나타낸 바와 같이, VST는 다른 RSV 항원의 첨가에 의해 유도된 약한 반응 뿐만 아니라 RSV 항원 N, F 및 G에 응답하여 대량의 IFNγ를 생성하였다. 그랜자임 B 생성의 유사한 프로필은 펩믹스 자극 후 나타났고, 이는 이들 확장된 세포의 세포용해 잠재력을 시사한다[도 10b]. 추가로, Th1 사이토킨 GM-CSF, IFNγ, 및 TNFα (도 11a) 및 Th2 사이토킨 IL-5, IL-6, 및 IL-10 (도 11b)의 분석은 명백하게 RSV-특이적 VST가 Th1 회피됨을 보여주었다. 이를 종합해보면, 이들 데이터는 본원 발명의 다중-R-VST의 Th1-극성화된 및 다기능성 특징을 입증한다.
[0129] 따라서, 본원에 개시된 방법은 RSV 항원에 대한 특이성을 갖는 VST의 확장을 시사하는 소진의 징후 없이 활성화된 세포독성 및 헬퍼 T 세포의 폴리클로날 집단의 신속한 확장을 유도한다.
[0130] 상기된 다양한 구현예는 추가의 구현예를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 명세서에 언급되고/되거나 출원 데이터 시트에 열거된 미국 특허, 미국 특허 출원 공개공보, 미국 특허 출원, 외국 특허 출원 및 비-특허 공개공보는 이들의 전문이 본원에 참조로 인용된다. 구현예의 양상은 경우에 따라 여전히 추가의 구현예를 제공하기 위해 다양한 특허, 출원 및 공개공보의 개념을 사용하기 위해 변형될 수 있다.
[0131] 이들 및 다른 변화는 상기 상세한 기재 사항 측면에서 구현예에 가해질 수 있다. 일반적으로, 하기의 청구항에서, 사용된 용어는 명세서 및 청구항에 기재된 특정 구현예로 청구사항을 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하지만, 상기 청구항에 해당되는 완전한 균등 범위와 함께 모든 가능한 구현예를 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 청구항은 본원의 개시내용에 의해 제한되지 않는다.
참조문헌
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Claims (60)

  1. 다수의 바이러스 항원을 인지하는 세포독성 T-림프구(CTL)의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 다수의 바이러스 항원이 PIV로부터의 적어도 하나의 제1 항원 및 하나 이상의 제2 바이러스로부터의 적어도 하나의 제2 항원을 포함하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 CTL이 말초혈액 단핵 세포(PBMC)를 다수의 펩믹스(pepmix) 라이브러리와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리가 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 포함하며, 상기 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나가 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 상기 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리가 각각의 제2 항원에 걸쳐 있는, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 CTL이 T 세포를 다수의 펩믹스 라이브러리로 프라이밍된 수지상 세포(DC)와 접촉시켜 생성되고, 각각의 펩믹스 라이브러리가 바이러스 항원의 적어도 일부에 걸쳐 있는 다수의 중복 펩타이드를 포함하고, 상기 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나가 PIV-3 기원의 제1 항원에 걸쳐 있고, 상기 다수의 펩믹스 라이브러리의 적어도 하나의 추가 펩믹스 라이브러리가 각각의 제2 항원에 걸쳐 있는, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 CTL이 PIV-3 항원을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 플라스미드 및 각각의 제2 항원을 암호화하는 적어도 하나의 DNA 플라스미드로 핵감염된 수지상 세포(DC)와 T 세포를 접촉시킴으로써 생성되는, 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 플라스미드가 적어도 하나의 PIV-3 항원 및 적어도 하나의 제2 항원을 암호화하는, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CD4+ T-림프구 및 CD8+ T-림프구를 포함하는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, αβT 세포 수용체를 발현하는 CTL을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, MHC-제한된 CTL을 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 바이러스가 호흡기 신시티알 바이러스(respiratory syncitial virus)(RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스(metapneumovirus)(hMPV) 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 바이러스가 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스 또는 이의 조합을 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 제2 바이러스가 호흡기 신시티알 바이러스 (RSV), 인플루엔자, 사람 메타뉴모바이러스 및 이의 조합으로 이루어진, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 1, 2, 3 또는 4개의 제1 항원을 포함하는, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 제1 항원이 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 하기의 4개의 제1 항원을 포함하는 조성물:
    PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, 및 PIV-3 항원 F.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 또는 3개의 제2 바이러스를 포함하는, 조성물.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 제2 바이러스를 포함하는, 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 3개의 제2 바이러스가 인플루엔자, RSV, 및 hMPV인, 조성물.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 각각의 제2 바이러스 당 적어도 2개의 제2 항원을 포함하는, 조성물.
  19. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 제2 항원을 포함하는, 조성물.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 항원이 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 조성물.
  21. 제19항에 있어서, 상기 제2 항원이 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, 또는 둘다를 포함하는, 조성물.
  22. 제19항에 있어서, 상기 제2 항원이 RSV 항원 N, RSV 항원 F, 또는 둘다를 포함하는, 조성물.
  23. 제19항에 있어서, 상기 제2 항원이 hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, hMPV 항원 N, 및 이의 조합을 포함하는, 조성물.
  24. 제19항에 있어서, 상기 제2 항원이 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N 각각을 포함하는, 조성물.
  25. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 항원이 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N을 포함하는, 조성물.
  26. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 항원이 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 이루어지거나 필수적으로 이루어진, 조성물.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL이 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 생체외 배양되는, 조성물.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다중바이러스 CTL이 배양 9 내지 18일 이내에 충분히 확장하여 이들이 환자에게 투여될 준비가 되어 있는, 조성물.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL이 하기로부터 선택되는 하나 이상의 성질을 나타내는, 조성물.
    a. 무시할만한 동종이식편반응;
    b. 동일한 환자로부터 수거되지만 IL-7 및 IL-4 둘다의 존재하에 배양되지 않은 상응하는 항원-특이적 T 세포 보다, 환자로부터 수거한 항원-특이적 T 세포의 적은 활성화 유도된 세포사; 및
    c. 70% 초과의 생존능.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 배양 중에 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성인, 조성물.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 펩믹스가 화학적으로 합성되고, 임의로 >90% 순수한, 조성물.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL이 Th1 극성화된(polarized) 것인, 조성물.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL이 바이러스 항원-발현 표적 세포를 용해시킬 수 있는, 조성물.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 CTL이 비-감염된 자가 또는 동종이계 표적 세포를 유의적으로 용해시키지 않은, 조성물.
  35. 정맥내 전달용으로 제형화된 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물로서, 상기 조성물이 배양 중에 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성인, 약제학적 조성물.
  36. 표적 세포를 용해시키는 방법으로서, 상기 표적 세포를 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제35항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서, 상기 접촉이 대상체의 생체내에서 수행되는, 방법.
  38. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 접촉이 대상체에 상기 CTL의 투여를 통해 생체내에서 수행되는, 방법.
  39. 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제35항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 5x106 내지 5x107 CTL/m²이 대상체에게 투여되는, 방법.
  41. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 면역저하된(immunocompromised), 방법.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 급성 골수 백혈병, 급성 림프아구성 백혈병 또는 만성 육아종 질환을 갖는, 방법.
  43. 제38항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 CTL을 받기 전 하기 이식체를 받은, 방법.
    a. 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 이식체;
    b. 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련없는 공여자 이식체;
    c. 감소된 강도 컨디셔닝과 함께 반수체-동일한 이식체; 또는
    d. 골수절제 컨디셔닝과 함께 매칭된 관련 공여자 이식체.
  44. 제38항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가
    a. 고체 기관 이식을 받고;
    b. 화학치료요법을 받고;
    c. HIV 감염을 갖고;
    d. 유전학적 면역결핍증을 갖고/갖거나;
    e. 동종이계 줄기 세포 이식체를 받은, 방법.
  45. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 수회 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  46. 제38항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 대상체에서 바이러스 감염을 효과적으로 치료하거나 예방하고, 상기 바이러스 감염이 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  47. 제38항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
  48. 다수의 바이러스 항원을 인지하는 세포독성 T-림프구 (CTL)의 폴리클로날 집단을 포함하는 조성물로서, 상기 다수의 바이러스 항원이 파라인플루엔자 바이러스 3형 (PIV-3), 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로부터 선택되는 적어도 하나의 항원을 포함하는, 조성물.
  49. 제48항에 있어서, 다수의 바이러스 항원을 인지하는 세포독성 T-림프구 (CTL)의 폴리클로날 집단을 포함하고, 상기 다수의 바이러스 항원이 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자 및 사람 메타뉴모니아바이러스 각각으로부터 기원하는 적어도 하나의 항원을 포함하는, 조성물.
  50. 제48항에 있어서, 다수의 바이러스 항원을 인지하는 세포독성 T-림프구 (CTL)의 폴리클로날 집단을 포함하고, 상기 다수의 바이러스 항원이 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자 및 사람 메타뉴모니아바이러스 각각으로부터 기원하는 적어도 2개의 항원을 포함하는, 조성물.
  51. 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다수의 항원이 PIV-3 항원 M, PIV-3 항원 HN, PIV-3 항원 N, PIV-3 항원 F, 인플루엔자 항원 NP1, 인플루엔자 항원 MP1, RSV 항원 N, RSV 항원 F, hMPV 항원 M, hMPV 항원 M2-1, hMPV 항원 F, 및 hMPV 항원 N으로 이루어지거나 필수적으로 이루어진, 조성물.
  52. 정맥내 전달용으로 제형화된 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 약제학적 조성물.
  53. 제52항에 있어서, 상기 조성물이 배양 중에 적어도 7일 동안 세균 및 진균류에 대해 음성이고; 5EU/ml 미만의 내독소를 나타내고, 마이코플라스마에 대해 음성인, 약제학적 조성물.
  54. 표적 세포를 용해시키는 방법으로서, 상기 표적 세포를 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항의 조성물 또는 제52항의 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  55. 제54항에 있어서, 상기 접촉이 대상체의 생체내에서 수행되는, 방법.
  56. 제36항 또는 제37항에 있어서, 상기 접촉이 대상체에 CTL의 투여를 통해 생체내에서 수행되는, 방법.
  57. 바이러스 감염을 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항의 조성물, 또는 제52항의 약제학적 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  58. 제38항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 수회 상기 대상체에게 투여되는, 방법.
  59. 제54항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 투여가 상기 대상체에서 바이러스 감염을 효과적으로 치료하거나 예방하고, 상기 바이러스 감염이 파라인플루엔자 바이러스 3형, 호흡기 신시티알 바이러스, 인플루엔자, 및 사람 메타뉴모바이러스로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  60. 제54항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 사람인, 방법.
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