KR20210132716A - 효소 및 pH 충격에 의한 미생물 세포 조성물로부터의 지질 수득 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, 세포로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 임의적으로, 상기 용해된 세포 조성물에 염을 첨가하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 10 이상으로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 6 미만의 pH로 낮추어 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계; 및 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계를 포함한다.

Description

효소 및 pH 충격에 의한 미생물 세포 조성물로부터의 지질 수득 방법
본 발명은, 미생물 세포를 용해시키고, 후속적으로, 1회 이상의 주기 동안 상기 세포의 pH를 높이고 낮추고, 지질을 분리함으로써, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이다.
관련 출원에 대한 상호 참조
본원은, 2019년 3월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/818563호 및 2019년 3월 15일자로 출원된 미국 특허 가출원 제62/818944호를 우선권으로 주장하는 국제 출원이며, 각각의 이들 가출원의 전체 내용을 전체로 본원에 참고로 인용한다.
미생물 세포로부터 지질(예컨대, 다중불포화 지방산)을 수득하기 위한 전형적인 공정은, 발효기, 폰드(pond) 또는 생물반응기에서 목적하는 지질을 생산할 수 있는 미생물을 성장시키는 단계, 미생물 세포 바이오매스를 포함하는 발효 브로쓰를 분리하는 단계, 미생물 세포 바이오매스를 건조시키는 단계, 용매 추출에 의해 지질 분리하는 단계를 포함한다. 상기 분리 단계는, 발효 브로쓰를 물로 희석하고, 희석된 브로쓰를 원심분리하고, 미생물 세포를 용해시키고, 지질을 용해가능한 수-비혼화성 용매(예컨대, 헥산)를 이 혼합물에 가하여 상기 용해된 세포로부터 세포내 지질을 추출하는 것을 포함할 수 있다.
미생물 세포에서 지질을 제거하기 위한 또다른 추출 방법은, 기계적 힘(예컨대, 균질화), 효소 처리, 또는 세포벽을 파괴하기 위한 화학적 처리를 사용하여 발효 브로쓰 내의 세포를 용해키는 것이다. 유기 용매(예컨대, 이소프로필 알코올)를 사용하여, 지질, 미생물 세포 바이오매스 및 물을 포함하는 생성 조성물로부터 지질을 추출할 수 있다. 지질은 상기 조성물로부터 기계적으로 분리될 수 있고, 상기 알코올은 지질 및 수성 바이오매스 폐 스트림 둘 다로부터 제거되어야 한다. 예를 들어, 국제 특허 출원 제WO 01/76385 호 및 제WO 01/76715호를 참조한다.
그러나, 전술된 공정 중 하나를 사용하는 산업적 규모의 지질 생산은 다량의 휘발성 및 가연성 유기 용매를 필요로 하므로, 위험한 작업 조건을 생성한다. 추출 과정에서 유기 용매를 사용하면, 폭발-방지 지질 회수 시스템을 사용하는 것이 또한 필요하므로, 지질 회수 비용이 추가된다. 또한, 미생물 세포로부터 지질을 추출할 때 유기 용매를 사용하면, 완전한 용매 회수 시스템 또는 적절한 폐기 방법이 필요한 유기 용매 폐 스트림이 생성될 수 있으며, 이는 지질 추출의 총 생산 비용을 더욱 증가시킨다. 예를 들어, 휘발성 유기 화합물(VOC) 배출에 대한 엄격한 제한은 더 많은 인력과 선박 및 기타 장비에 대한 추가 비용을 필요로 한다.
따라서, 전술된 문제점을 최소화하기 위해, 유기 용매를 사용하지 않고 세포로부터 지질을 수득하는 공정이 필요하다. 유기 용매를 사용하지 않고 세포로부터 지질을 분리하기 위한 몇몇 방법이 제안되었다. 예를 들어, 미국 특허 제6,750,048호는, 실질적으로 비-유화된 지질을 수득할 때까지 에멀젼을 수성 세척 용액으로 세척하는 수성 세척 공정을 개시하고 있다. 그러나, 몇몇 실시양태에서, 상기 공정은 상당한 비용 및 시간을 필요로 하는 다중 세척 단계를 필요로 한다. 미국 특허 제7,431,952호는, 용해된 세포를 원심분리하여 세포벽 잔해물을 제거하고 이어서 오일을 추출 및 정제하는 방법을 개시하고 있다. 그러나, 상기 공정은, 대규모 추가 정제를 필요로 하는 조 오일를 제공한다.
본 발명은, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 임의적으로, 상기 용해된 세포 조성물에 염을 첨가하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 10 이상의 pH로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 6 이하의 pH로 낮추어 상기 세포 조성을 해유화시키는 단계; 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 약 7 내지 약 9의 pH 및 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도에서 상기 미생물 세포를 효소적으로 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 임의적으로, 상기 용해된 세포 조성물에 염을 첨가하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 10 이상으로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 6 이하의 pH로 낮추어 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계; 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 약 7 내지 약 9의 pH 및 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도에서 상기 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 상기 용해된 세포 조성물을 약 80℃ 내지 약 90℃의 온도로 가열하고 임의적으로 상기 용해된 세포 조성물에 염을 첨가하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 pH 10 이상으로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 pH 6 이하로 낮추어 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계; 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 약 7 내지 약 9의 pH 및 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도에서 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 1회 이상의 주기 동안, 상기 용해된 세포 조성물의 온도를 약 4℃에서 약 90℃로 순환시키는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 pH 10 이상으로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 pH 6 이하로 낮추어 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계; 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 약 7 내지 약 9의 pH 및 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도에서 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 pH 10 이상으로 높이고, 이어서 일정 기간 동안 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 pH 6 이하로 낮추고, 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 온도를 약 4℃에서 약 90℃로 순환시켜 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계; 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 용해 및 해유화 단계 동안 및 상기 1회 이상의 pH 충격 주기들 이전, 사이 또는 이후에, 상기 농축된 미생물 세포 조성물의 온도를 1회 이상의 주기 동안 약 4℃에서 약 90℃로 주기화하는 것("온도 충격")을 추가로 포함하는, 임의의 본 발명의 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 온도 충격은, 온도를 약 80℃ 내지 90℃에서 약 4℃ 내지 20℃로 조정하고 다시 약 80℃ 내지 90℃로 조정하는 것을 포함한다.
각각의 전술된 실시양태에서, 상기 회수된 지질은 임의적으로, 중량 또는 부피 기준으로 5% 미만의 유기 용매를 함유한다.
각각의 전술된 실시양태에서, 중량 또는 부피 기준으로 5% 미만의 유기 용매가 사용된다. 몇몇 실시양태에서, 유기 용매가 사용되지 않는다.
몇몇 실시양태에서, pH를 높이는 것은 염기를 첨가하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염기는 1 내지 12의 pKb를 가진다.
몇몇 실시양태에서, pH를 낮추는 것은 산을 첨가하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 산은 1 내지 12의 pKa를 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 교반, 혼합, 배합, 진탕, 진동, 또는 이들의 조합에 의해 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 용해는 기계적 처리, 물리적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리, 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 물리적 처리는 균질화이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 염은 상기 용해된 세포 조성물의 0.1 중량% 내지 20 중량%의 양으로 첨가된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 설페이트 염, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 염화나트륨이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 황산나트륨이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 염은 상기 해유화 단계에서 생략된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 분리는 원심분리를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 분리는 30℃ 내지 90℃의 온도에서의 원심분리를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 50 중량% 이상의 트라이글리세라이드를 포함하는 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 26 이하의 아니시딘가를 갖는 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 5 이하의 퍼옥사이드가를 갖는 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 100 ppm 이하의 인 함량을 갖는 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 10 중량% 이상의 목적하는 다중불포화 지방산(PUFA)을 갖는 지질을 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 10 중량% 이상의 도코사헥사엔산("DHA"), 5 중량% 이상의 도코사펜타엔산 n-3("DPA n-3"), 10 중량% 이상의 에이코사펜타엔산("EPA"), 및/또는 10 중량% 이상의 아라키돈산("ARA")을 갖는 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포는 미생물 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 미생물 세포를 포함하는 발료 브로쓰(broth)를 농축하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 용해된 세포 조성물을 농축하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 지질을 정제하는 단계를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 정제는 가성 정제, 탈검, 산 처리, 알칼리 처리, 냉각, 가열, 표백, 탈취, 탈산성화, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 임의의 본 발명의 방법에 의해 수득된 지질에 관한 것이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 3 이하의 총 방향 강도를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 2 이하의 총 방향 강도를 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상의 목적하는 다중불포화 지방산(PUFA)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상의 도코사헥사엔산("DHA"), 5 중량% 이상의 도코사펜타엔산 n-3("DPA n-3"), 10 중량% 이상의 에이코사펜타엔산("EPA"), 및/또는 10 중량% 이상의 ARA를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 20 중량% 이상의 에이코사펜타엔산 및 각각 5 중량% 미만의 아라키돈산, 도코사펜타엔산 n-6, 올레산, 리놀레산, 리놀렌산, 에이코사엔산, 에루크산 및 스테아리돈산을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 26 이하의 아니시딘가를 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 조 지질이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조 지질은 임의적으로 5 중량% 또는 부피% 미만의 유기 용매를 가진다.
본 발명은 또한, 26 이하의 아니시딘가, 5 이하의 퍼옥사이드가, 100 ppm 이하의 인 함량, 및 임의적으로, 중량 또는 부피 기준으로 5% 미만의 유기 용매를 갖는 지질에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 70 중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하는 추출된 지질에 관한 것이며, 이때 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사헥사엔산 함량은 40 중량% 이상이고, 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사펜타엔산 n-6 함량은 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이고, 상기 오일은 26 이하의 아니시딘가를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 추출된 지질은 6 초과:1의 도코사헥사엔산 대 도코사펜타엔산 n-6의 비를 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 추출된 지질은 조 지질 또는 조 오일이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조 지질은 임의적으로 5 중량% 또는 부피% 미만의 유기 용매를 가진다.
본 발명은 또한, 본 발명의 조 지질을 정제하는 것을 포함하는 지질 수득 방법에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 정제는 가성 정제, 탈검, 산 처리, 알칼리 처리, 냉각, 가열, 표백, 탈취, 탈산성화, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 방법은, 추출된 지질 조성물의 양 및/또는 품질을 개선하고, 세포 조성물로부터 지질을 수득하는 방법의 하나 이상의 단계에 대한 처리 시간을 줄이고, 세포 조성물에서 지질을 수득하는 데 필요한 시약의 양을 줄이고, 공정에 사용되는 유해 화학 물질의 양뿐만 아니라 공정에서 생성되는 유해 폐기물의 양을 줄이고, RBDW(정제, 표백, 탈취, 윈터라이즈드(winterized)) 오일의 수율을 높이고, 상업적 규모의 생산에서의 가변성을 줄이고, 지질 추출을 위한 총 금전적 비용을 줄임으로써, 당분야에 공지된 방법에 비해 특정 이점을 제공한다.
본원에 포함되고 본 명세서의 일부를 형성하는 첨부 도면은 본 발명을 예시하는 것이며, 하기 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명하고 당업자가 본 발명을 제조 및 사용할 수 있도록 하는 역할을 또한 한다.
도 1은, 본 발명의 공정을 설명하는 개략적인 흐름도를 제공한다.
본원에서는, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터 지질을 수득하는 방법이 기술되며, 상기 방법은, 미생물 세포를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 단계; 임의적으로, 상기 용해된 세포 조성물에 염을 첨가하는 단계; 순차적으로, 1회 이상의 주기에서, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 10 이상으로 높이고 이어서 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 일정 기간 동안 6 미만의 pH로 낮추어 상기 세포 조성물을 해유화시키는 단계("pH 충격"); 해유화된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및 상기 지질을 회수하는 단계를 포함한다.
다양한 실시양태에서, 상기 방법은,
(a) 미생물 세포를 포함하는 조성물을 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도로 가열하는 단계;
(b) 상기 미생물 세포의 용해에 충분한 시간 동안 상기 미생물 세포의 세포벽을 파괴할 수 있는 하나 이상의 효소를 첨가하는 단계;
(c) 용해된 세포 조성물을 약 80℃ 내지 약 90℃의 온도로 가열하는 단계;
(d) 염기를 첨가하고 1시간 이상 동안 약 10 내지 약 12의 pH를 유지함으로써, 상기 조성물의 pH를 약 10 내지 약 12의 pH로 조정하는 단계;
(e) 산을 첨가하고 0.5시간 이상 동안 약 4 내지 약 6의 pH를 유지함으로써, 상기 단계 (d)에서 수득된 조성물의 pH를 약 4 내지 약 6의 pH로 조정하는 단계;
(f) 임의적으로, 상기 조성물이 충분히 해유화될 때까지 상기 단계 (d) 및 (e)를 반복하는 단계;
(g) 해유화되고 용해된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및
(h) 상기 지질을 회수하는 단계
를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 단계 (a) 및/또는 (b)에서, pH가 약 7에서 약 9로 조정된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 (d)에서, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 50분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간 또는 그 이상의 기간 동안 pH가 10 이상으로 유지된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 단계 (e)에서, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 50분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간 또는 그 이상의 기간 동안 pH가 6 이하로 유지된다.
다양한 실시양태에서, 상기 단계 (d) 및 (e)가 1, 2, 3, 4, 또는 5회 반복된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 미생물 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 염과 접촉시켜 상기 용해된 세포 조성물의 해유화를 촉진하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 설페이트 염 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 염화나트륨, 염화칼륨 또는 황산나트륨이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 염기의 첨가 전에, 상기 용해된 세포 조성물을 5분 내지 10시간, 10분 내지 4시간, 30분 내지 2시간, 30분 내지 1시간, 30분 내지 1.5시간, 1시간 내지 1.5시간, 또는 1시간 내지 2시간 동안 가열하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 분리는 원심분리를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 분리는 50℃ 내지 90℃의 온도에서의 원심분리를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 용해 전에, 세포를 포함하는 발효 브로쓰의 세척, 원심분리, 증발 또는 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 세포를 포함하는 브로쓰를 농축하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 용해된 세포 조성물을 농축하는 것을 포함한다.
본 발명은 또한, 지질 수득 방법에 관한 것이며, 상기 방법은, 본 발명의 조 지질을 정제하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 정제는 가성 정제, 탈검, 산 처리, 알칼리 처리, 냉각, 가열, 표백, 탈취, 탈산성화, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일반적으로, 본 발명의 방법은, 지질을 추출하거나 달리 분리하기 위해 유기 용매를 사용하지 않는다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, 유기 용매는, 미생물 세포를 포함하는 발효 브로쓰에 첨가되지 않거나, 세포 조성물에 첨가되지 않거나, 용해된 세포 조성물에 첨가되지 않거나, 본 발명의 공정 동안 지질을 추출하기에 충분한 양 또는 농도로 지질에 첨가되지 않는다. 본원에서 "유기 용매"는, 하나 이상의 탄소 원자를 포함하는 용매를 지칭한다. 본원에서 "용매"는, 소수성 또는 친유성이고 지질은 아닌 제제를 지칭한다. 본원에서 "소수성"은, 다량의 물로부터 반발되는 제제를 지칭한다. 본원에서 "친유성"은, 지질을 용해시키는 제제를 지칭한다. 본 발명의 방법에 사용되지 않는 유기 용매는, 비제한적으로, 극성 용매, 비극성 용매, 수-혼화성 용매, 수-비혼화성 용매, 및 이들의 조합물을 포함한다. 상기 유기 용매의 비제한적인 예는 치환된 및 비치환된 C4-C8 알킬(예컨대, 헥산 등), C5-C12 사이클로알킬, C4-C12 알켄, C1-C8 알코올(예컨대, 이소프로판올 등), C1-C8 알데하이드, C4-C8 에터, C1-C8 에스터, C6-C12 아릴, C1-C8 아마이드, C5-C12 헤테로아릴, 및 이들의 조합물을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 해유화된 세포 조성물에 유기 용매가 첨가될 수 있다. 상기 실시양태에서, 상기 유기 용매는 5 부피% 미만, 4 부피% 미만, 3 부피% 미만, 2 부피% 미만, 1 부피% 미만, 0.5 부피% 미만, 0.1 부피% 미만, 또는 0.05% 부피% 미만의 농도로 첨가된다. 본원에 정의된 바와 같은 유기 용매는 임의적으로, 예를 들어, 상기 용해된 세포 조성물과 접촉하기 위한 염기 및/또는 염의 성분으로서 상기 용해된 세포 조성물에 임의적으로 첨가될 수 있다. 그러나, 상기 실시양태에서, 상기 유기 용매는, 지질이 용매에 의해 상기 미생물 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물 또는 상기 해유화된 세포 조성물로부터 실질적으로 추출되지 않도록 하는 농도(즉, 5 부피% 또는 중량% 미만, 4 부피% 또는 중량% 미만, 3 부피% 또는 중량% 미만, 2 부피% 또는 중량% 미만, 1 부피% 또는 중량% 미만, 0.5 부피% 또는 중량% 미만, 0.1 부피% 또는 중량% 미만, 또는 0.05 부피% 또는 중량% 미만의 농도)로 존재한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 예를 들어 물로 세척하는 것을 포함하지 않거나, 상기 방법은, 상기 용해된 세포 조성물 또는 상기 해유화된 세포 조성물의 세척 횟수를 줄인다. "세척"은, 예를 들어, 물 또는 완충액으로 조성물을 희석하고, 예를 들어 원심분리에 의해 물 또는 완충액을 제거하는 공정을 지칭한다. 세포 조성물의 세척은, 세포로부터 수득된 지질의 전체 수율을 감소시킬 수 있다. 본 발명에서, 상기 세척은 1회, 2회, 3회 또는 그 이상으로 감소될 수 있다.
정의
본원에서 "지질" 또는 "오일"은, 하나 이상의 지방산(자유 지방산 및 지방산 에스터 포함), 인지질, 트라이아실글리세롤(즉, 트라이글리세라이드), 다이아실글리세라이드, 모노아실글리세라이드, 리소인지질, 비누, 포스파타이드, 왁스, 스테롤 및 스테롤 에스터, 카로티노이드, 크산토필, 탄화수소, 및 당업자에게 공지된 기타 지질을 포함한다. 지질은 극성 지질 및 중성 지질을 포함한다.
본원에서 "극성 지질"은, 극성 기를 함유하고 극성 용매에 더 쉽게 용해되는 지질을 지칭한다. 극성 지질은 인지질을 포함한다. 본원에서 "인지질"은, 포스페이트 기를 갖는 지질을 지칭한다. 본원에서 "중성 지질"은, 극성 영역을 포함하지 않고 비극성 용매에 더 쉽게 용해되는 지질을 지칭한다. 중성 지질은 트라이아실글리세롤(TAG)을 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 예를 들어 원심분리 후의 분리 단계는 비중에 따른 분리를 기반으로 한다. 초기 처리 단계 후 해유화 이전의 "경질 상"은, 더 낮은 비중을 갖는 물질, 예컨대 상기 농축된 세포 조성물(또는 "바이오매스")로 주로 이루어진다. "중질 상"은, 더 높은 비중을 갖는 물질, 예를 들어 수성 상(예컨대, 물, 염, 설탕)으로 주로 이루어진다. 본 발명의 목적을 위해, 분리된 경질 상은 최소의 잔류 수성 물질을 함유할 수 있다.
지방산은 탄소 사슬의 길이와 포화 특성에 기초하여 분류된다. 지방산은 사슬에 존재하는 탄소의 개수에 기초하여 단쇄, 중쇄 또는 장쇄 지방산으로 명명된다. 지방산은, 탄소 원자들 사이에 이중 결합이 존재하지 않는 경우 포화 지방산으로 명명되고, 이중 결합이 존재하는 경우 불포화 지방산으로 명명된다. 불포화 장쇄 지방산은, 단지 하나의 이중 결합이 존재하는 경우 단일 불포화이고, 하나 초과의 이중 결합이 존재하는 경우 다중 불포화이다.
상기 지질에 존재하는 지방산은 4 내지 28개의 탄소 원자를 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 하나 이상의 다중불포화 지방산을 포함한다. 다중불포화 지방산(PUFA)은, 지방산의 메틸 말단으로부터 첫 번째 이중 결합의 위치에 기초하여 분류된다. 오메가-3(n-3) 지방산은 세 번째 탄소에 첫 번째 이중 결합을 포함하고, 오메가-6 (n-6) 지방산은 여섯 번째 탄소에 첫 번째 이중 결합을 포함한다. 예를 들어, 도코사헥사엔산("DHA")은, 흔히 "22:6 n-3"으로서 지정되는, 22개의 탄소의 탄소 길이 및 6개의 이중 결합을 갖는 오메가-3 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)이다. 본 발명의 목적을 위해, 장쇄 다중불포화 지방산(LC-PUFA)은, 18개 이상의 탄소 사슬 길이의 지방산으로 정의되며, 바람직하게는 3개 이상의 이중 결합을 함유하는 20개 이상의 탄소 사슬 길이의 지방산이다. 오메가-6 시리즈의 LC-PUFA는, 비제한적으로, 다이-호모-감마-리놀레산(C20:3n-6), 아라키돈산(C20:4n-6)("ARA"), 도코사테트라엔산 또는 아드렌산(C22:4n-6), 및 도코사펜타엔산(C22:5n-6)("DPA n-6")을 포함한다. 오메가-3 시리즈의 LC-PUFA는, 비제한적으로, 에이코사트라이엔산(C20:3n-3), 에이코사테트라엔산(C20:4n-3), 에이코사펜타엔산(C20:5n-3)("EPA"), 도코사펜타엔산(C22:5n-3)("DPA n-3"), 및 도코사헥사엔산(C22:6n-3)("DHA")을 포함한다. LC-PUFA는 또한, 22개 초과의 탄소 및 4개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산, 예컨대, 비제한적으로, C24:6(n-3) 및 C28:8(n-3)을 포함한다.
용어 "지방산", "다중불포화 지방산" 및 "PUFA"는, 자유 지방산 형태뿐만 아니라 다른 형태, 예컨대 트라이아실글리세롤(TAG) 형태, 인지질(PL) 형태 및 기타 에스터화된 형태도 포함한다. 본원에서 용어 "에스터" 및 "에스터화된"은, PUFA 분자의 카르복실산 기 내의 수소가 다른 치환기로 대체된 것을 지칭한다. 전형적인 에스터는 당업자에게 공지되어 있으며, 이에 대한 논의는 문헌[Higuchi, T. et al., Pro-drugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, Bioreversible Carriers in Drug Design, Edward B. Roche ed., Amer. Pharma. Assoc., Pergamon Press (1987)] 및 문헌[Protective Groups in Organic Chemistry, McOmie ed., Plenum Press, New York (1973)]에 제공되어 있으며, 각각의 이들 문헌 전체를 본원에 참고로 인용한다. 통상적인 에스터의 예는 메틸, 에틸, 트라이클로로에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 3급-부틸, 벤질, 나이트로벤질, 메톡시벤질 및 벤즈하이드릴을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 또는 80 중량% 이상의 PUFA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 또는 80중량% 이상의 DHA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 중량으로 50 중량% 미만, 40 중량% 미만, 30 중량% 미만, 20 중량% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 또는 5% 미만의 EPA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 미만, 5 중량% 미만, 2 중량% 미만, 1 중량% 미만, 또는 0.5 중량% 미만의 스테롤을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 하나 이상의 PUFA는 하나 이상의 형태, 예컨대 트라이글리세라이드, 다이글리세라이드, 모노글리세라이드, 인지질, 자유 지방산, 에스터화된 지방산, 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산의 알칼리 토금속 염 및 이들의 조합물로 상기 지질에 존재한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 원심분리 후에 분리된 지질은 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 80 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량%, 또는 50 중량% 내지 95 중량%, 50 중량% 내지 90 중량%, 50 중량% 내지 85 중량%, 50 중량% 내지 80 중량%, 50 중량% 내지 75 중량%, 60 중량% 내지 95 중량%, 60 중량% 내지 90 중량%, 60 중량% 내지 85 중량%, 70 중량% 내지 95 중량%, 70% 내지 90 중량%, 70% 내지 85 중량%, 75 중량% 내지 95 중량%, 75 중량% 내지 90 중량%, 또는 75 중량% 내지 85 중량%의 트라이글리세라이드를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 트라이글리세라이드는 10 중량% 이상, 20 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 50 중량% 이상, 60 중량% 이상, 70 중량% 이상, 또는 80 중량% 이상의 DHA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 트라이글리세라이드는 50 중량% 이상, 40 중량% 이상, 30 중량% 이상, 20 중량% 이상, 15 중량% 이상, 10 중량%, 또는 5 중량% 이상의 EPA를 포함한다.
본원에 논의된 바와 같이, 원심분리 후 지질의 추가 정제는, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 90 중량% 이상, 95 중량% 이상, 99 중량% 이상, 또는 80 중량% 내지 99.5 중량%, 80 중량% 내지 99%, 80 중량% 내지 97 중량%, 80 중량% 내지 95 중량%, 80 중량% 내지 90 중량%, 85 중량% 내지 99.5 중량%, 85 중량% 내지 99중량%, 85 중량% 내지 97중량%, 85 중량% 내지 95 중량%, 85 중량% 내지 90 중량%, 90 중량% 내지 99.5 중량%, 90 중량% 내지 99중량%, 90 중량% 내지 97중량%, 90 중량% 내지 95 중량%, 95 중량% 내지 99.5 중량%, 95 중량% 내지 99중량%, 95 중량% 내지 97 중량%, 97 중량% 내지 99.5 중량%, 또는 98 중량% 내지 99.5 중량%의 트라이글리세라이드를 포함하는 지질을 제공할 수 있다.
본원에서 "세포"는, 지질-함유 생체적합 물질(biomaterial), 예컨대 미생물로부터 유래된 생체적합 물질을 지칭한다.
본원에서 "미생물 세포" 또는 "미생물"은, 유기체, 예컨대 조류, 박테리아, 진균, 원생생물 및 이들의 조합물을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는 진핵 세포이다. 본 발명에 사용하기에 적합한 미생물 세포는, 비제한적으로, 금조류(예컨대, 스트라메노필레스(Stramenopiles) 계의 미생물), 녹조류, 규조류, 와편모조류(예를 들면, 디오피세애(Dinophyceae) 목의 미생물, 예를 들어 크립테코디늄(Crypthecodinium) 속의 일원, 예컨대 크립테코디늄 코니(Crypthecodinium cohnii) 또는 씨. 코니(C. cohnii)), 효모(자낭균류 또는 담자균류), 및 무코르(Mucor) 및 모르티에렐라(Mortierella) 속의 진균, 예컨대, 비제한적으로, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 및 모르티에렐라 종(Mortierella sect), 슈무케리(schmuckeri)를 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 미생물 세포는 하기 유기체 그룹에서 확인되는 속을 추가로 포함할 수 있다: 스트라메노필레(Stramenopile), 하마토레(Hamatore), 프로테로모나드(Proteromonad), 오팔린(Opaline), 데벨파옐라(Develpayella), 디플로프리(Diplophry), 라브린툴리드(Labrinthulid), 트라우스토키트리드(Thraustochytrid), 바이오세사이드(Biosecid), 오오마이세트(Oomycete), 하이포키트리디오마이세트(Hypochytridiomycete), 코메이션(Commation), 레티쿨로스패라(Reticulosphaera), 펠라고모나스(Pelagomonas), 펠라고코커스(Pelagococcus), 올리콜라(Ollicola), 아우레오코커스(Aureococcus), 파르말레스(Parmales), 규조류(Diatom), 잔토피테(Xanthophyte), 갈조식물(Phaeophyte), 진안점조류(Eustigmatophyte), 침편모조류(Raphidophytes), 시누라조류(Synurids), 규질편모조류(Axodine)(예컨대 리조크로물리날레스(Rhizochromulinaales), 페디네랄레스(Pedinellales), 딕티오칼레스(Dictyochales)), 크리소메리달레스(Chrysomeridales), 사르시노크리시달레스(Sarcinochrysidales), 하이드루랄레스(Hydrurales), 히베르디알레스(Hibberdiales) 및 크로물리날레스(Chromulinales).
몇몇 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 미생물 세포는 라비린툴로마이코타(Labyrinthulomycota) 문의 미생물이다. 몇몇 실시양태에서, 라비린툴로마이코타 문의 미생물 세포는 트라우스토키트리드(thraustochytrid), 예컨대 쉬조키트리움(Schizochytrium) 또는 트라우스토키트리움(Thraustochytrium)이다. 본 발명에 따르면, 용어 "트라우스토키트리드"는, 트라우스토키트리아세애 과를 포함하는 트라우스토키트리알레스 목의 임의의 일원을 지칭하고, 용어 "라비린툴라이드(labyrinthulid)"는, 라비린툴라세애(Labyrinthulaceae) 과를 포함하는 라비린툴라레스(Labyrinthulales) 목의 임의의 일원을 지칭한다.
라비린툴라세애 과의 일원은 이전에 트라우스토키트리알레스 목의 일원으로 간주되었지만, 상기 유기체의 분류학적 분류에 대한 최근 개정판에서는 라비린툴라세애 과가 현재 라비린툴라레스 목의 일원으로 간주된다. 라비린툴라레스와 트라우스토키트리알레스는 라비린툴로마이코타 문의 일원으로 간주된다. 분류학 이론가들은 이제 일반적으로 상기 미생물 그룹과 스트라메노필레(Stramenopile) 계통의 조류 또는 조류-유사 원생생물을 함께 배취한다.
본 발명의 목적을 위해, 트라우스토키트리드로 기술된 미생물 세포의 균주는 하기 유기체를 포함한다: 목: 트라우스토키트리알레스; 과: 트라우스토키트리아세애; 속: 트라우스토키트리움(종: 아루디멘탈레(arudimentale), 아루레움(aureum), 벤티콜라(benthicola), 글로보숨(globosum), 킨네이(kinnei), 모티붐(motivum), 멀티루디멘탈레(multirudimentale), 파키데르뭄(pachydermum), 프롤리페룸(proliferum), 로제움(roseum) 및 스트리아툼(striatum) 종), 울케니아(Ulkenia)(종: 아뫼보이데아(amoeboidea), 미누타구엘렌시스(minutaguelensis), 프롤리아툼(proliatum)) 사일렌스(sailens), 사르카리아나(sarkariana), 쉬조키트롭스(schizochytrops), 비수르겐시스(visurgensis), 요르켄시스(yorkensis) 및 BP-5601 종), 쉬조키트리움(Schizochytrium)(종: 아그레가툼(aggregatum), 림나세움(limnaceum), 망그로베이(mangrovei), 미누툼(minutum) 및 옥토스포룸(octosporum) 종), 자포노키트리움(Japonochytrium)(종: 마리남 종), 아플라노키트리움(Aplanochytrium)(종: 할리오티디스(haliotidis), 케르구엘렌시스(kerguelensis), 프로푼다(profunda) 및 스토키노이(stocchinoi) 종), 알토르니아(Althornia)(종: 크로우치이(crouchii)) 또는 엘리나(Elina)(종: 마리살바(marisalba) 및 시노리픽드(sinorificd) 종). 본 발명의 목적을 위해, 울케니아 내로 기술된 종은 트라우스토키트리움 속의 일원으로 간주될 것이다. 아루란티아코키트리움(Aurantiacochytrium) 및 오블로고스포라(Oblogospora)는 본 발명에서 라비린툴로마이코타 문에 포함되는 2개의 추가적 속이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는 트라우스토키스트리움 속, 쉬조키트리움 속 및 이들의 혼합물의 것이다.
본 발명에 사용하기에 적합한 미생물 세포는, 비제한적으로, 하기로부터 선택되는 라비린툴라이드를 포함한다: 목: 라비린툴라레스, 과: 라비린툴라세애, 속: 라비린툴라(종: 알게리엔시스(algeriensis), 코에노시스티스(coenocystis), 샤토니이(chattonii), 마크로시스티스(macrocystis), 마크로시스티스 아틀란티카(macrocystis atlantica), 마크로시스티스, 마리나(Marina), 미누타(minuta), 로스코펜시스(roscoffensis), 발카노비이(valkanovii), 비텔리나(vitellina), 비텔리나 퍼시피카(vitellina pacifica), 비텔리나 및 조프피이(zopfii) 종), 라비린툴로이드(Labyrinthuloide)(종: 할리오티디스(haliotidis) 및 요르켄시스(yorkensis) 종), 라비린토믹사(Labyrinthomyxa)(종: 마리나(marina) 종), 디플로프리스(종: 아르케리(archeri) 종), 피로소루스(Pyrrhosorus)(종: 마리누스(marinus) 종), 소로디플로프리스(Sorodiplophrys)(종: 스테르코레아(stercorea) 종) 및 클라미도믹사(Chlamydomyxa)(종: 라비린툴로이데스(labyrinthuloides) 및 몬타나(montana) 종)(현재로서는 정확한 분류학적 위치에 대한 합의는 없지만 피로소루스(Pyrrhosorus), 소로디플로프리스(Sorodiplophrys) 및 클라미도믹사(Chlamydomyxa)).
라비린툴로마이코타 문의 숙주 세포는, 비제한적으로, 기탁 균주 PTA-10212, PTA-10213, PTA-10214, PTA-10215, PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, PTA-9698, PTA-10208, PTA-10209, PTA-10210, PTA-10211; SAM2179로서 기탁된 미생물(기탁자에 의해 "울케니아 사메(Ulkenia SAME) 179"로 명명됨), 임의의 트라우스토키트리움 종(전술된 울케니아 종(예컨대, 울케니아 비사르켄시스(U. visurgensis), 울케니아 아뫼보이다(U. amoeboida), 울케니아 사르카리아나(U. sarkariana), 울케니아 프로푼다(U. profunda), 울케니아 라디아타(U. radiata), 울케니아 미누타((U. minuta) and 울케니아 BP-5601 종) 및 포함), 및 임의의 트라우스토키트리움 스트리아툼(Thraustochytrium striatum), 트라우스토키트리움 아우레움(Thraustochytrium aureum), 트라우스토키트리움 로세움(Thraustochytrium roseum); 및 임의의 자포노키트리움 종을 포함한다. 트라우스토키트리알레스 균주는, 비제한적으로, 트라우스토키트리움 종 (23B) (ATCC 20891); 트라우스토키트리움 스트리아툼(슈나이더(Schneider))(ATCC 24473); 트라우스토키트리움 아우레움(골드스타인(Goldstein))(ATCC 34304); 트라우스토키트리움 로세움(골드스타인)(ATCC 28210); 자포노키트리움 종 (LI)(ATCC 28207); ATCC 20890; ATCC 20892; 임의의 전술된 미생물로부터 유래된 돌연변이 균주; 및 이들의 혼합물을 포함한다. 쉬조키트리움은 쉬조키트리움 아그레가툼(Schizochytrium aggregatum), 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum), 쉬조키트리움 종 (S31) (ATCC 20888), 쉬조키트리움 종 (S8) (ATCC 20889), 쉬조키트리움 종 (LC-RM) (ATCC 18915), 쉬조키트리움 종 (SR 21), 기탁된 균주 ATCC 28209, 기탁된 쉬조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum) 균주 IFO 32693, 임의의 전술된 미생물로부터 유래된 돌연변이 균주, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 쉬조키트리움 또는 트라우스토키트리움이다. 쉬조키트리움은, 연속적인 이분할(bipartition) 및 궁극적으로 유주자(zoospore)를 방출하는 포자낭(sporangia) 형성 둘 다에 의해 복제할 수 있다. 그러나, 트라우스토키트리움은 포자낭을 형성함으로써만 복제하며, 이어서 이는 유주자를 방출한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 숙주 세포는 재조합 숙주 세포이다.
본 발명과 함께 사용하기 위한 미생물 세포에 대한 효과적인 배양 조건은, 비제한적으로, 지질 생산을 허용하기에 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH, 및 산소 조건을 포함한다. "효과적인 배지"는, 미생물 세포가 전형적으로 배양되는 임의의 배지를 지칭한다. 상기 배지는 전형적으로, 동화가능 탄소, 질소 및 포스페이트 공급원뿐만 아니라 적절한 염, 미네랄, 금속 및 기타 영양소, 예컨대 비타민을 갖는 수성 배지를 포함한다. 본 발명에 사용하기 위한 미생물 세포는 통상적인 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 미세역가 접시 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 재조합 세포에 적합한 온도, pH 및 산소 함량에서 배양이 수행된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는 12 g/L 이하, 5 g/L 이하, 또는 3 g/L 이하의 염화나트륨의 염도(salinity) 수준에서 성장할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는, 오메가-3 및/또는 오메가-6 PUFA를 포함하는 지질을 생성한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는, DHA, DPA(n-3), DPA(n-6), EPA, 아라키돈산(ARA) 및 이들의 조합물을 포함하는 지질을 생성한다. PUFA를 포함하는 지질을 생산하는 미생물의 비제한적인 예는 상기 개시되었고, 또한 미국 특허 제5,340,594호, 제5,340,742호 및 제5,583,019호에서 확인할 수 있으며, 각각의 이들 특허 전체를 본원에 참고로 인용한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는 30 중량% 이상의 지질, 35 중량% 이상의 지질, 40 중량% 이상의 지질, 50 중량% 이상의 지질, 60 중량% 이상의 지질, 70 중량% 이상의 지질, 또는 80 중량% 이상의 지질을 포함하다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 미생물 세포는 0.1 g/L/h 이상의 DHA, 0.2 g/L/h 이상의 DHA, 0.3 g/L/h 이상의 DHA, 또는 0.4 g/L/h 이상의 DHA를 생성할 수 있다.
공정
본 발명의 방법은, 미생물 세포 조성물 또는 세포 바이오매스를 용해시켜 용해된 세포 조성물을 형성하는 것을 포함한다. 본원에서 용어 "세포 바이오매스"는, 미생물 세포의 집단을 지칭한다. 본원에서 용어 "용해" 및 "용해시키다"는, 세포의 세포벽 및/또는 세포막을 파열시키는 과정을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해는 기계적 처리, 화학적 처리, 효소적 처리, 물리적 처리, 또는 이들의 조합과 같은 공정을 포함한다. 다양한 실시양태에서, 상기 용해는 미생물 세포의 세포벽을 파괴할 수 있는 효소의 첨가에 의해 일어난다.
본원에서 "기계적 처리"는, 비제한적으로, 세포를 균질화하는 것, 세포에 초음파를 적용하는 것, 세포를 냉압착하는 것, 세포를 밀링하는 것, 및 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 균질화에 의해 세포를 용해시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 세포를 균질화기로 용해시키는 것을 포함한다.
세포의 균질화는, 비제한적으로, 프렌치 가압 세포 프레스(French pressure cell press), 초음파 처리기, 균질화기, 볼 밀, 로드 밀, 페블 밀, 비드 밀, 고압 분쇄 롤, 수직 샤프트 임팩터, 산업용 블렌더, 고전단 혼합기, 패들 혼합기, 폴리트론 균질화기, 및 이들의 조합을 이용하는 공정을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 임의적으로 가열되는 균질화기를 통해 세포가 유동한다. 몇몇 실시양태에서, 적합한 균질화는 고압 및/또는 저압에서 균질화기를 통한 1 내지 3회 통과를 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 균질화 동안의 압력은 150 bar 내지 1,400 bar, 150 bar 내지 1,200 bar, 150 bar 내지 900 bar, 150 bar 내지 300 bar, 300 bar 내지 1,400 bar, 300 bar 내지 1,200 bar, 300 bar 내지 9000 bar, 400 bar 내지 800 bar, 500 bar 내지 700 bar 또는 600 bar일 수 있다.
본원에 사용된 물리적 처리는, 비제한적으로, 세포 가열, 세포 건조, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
세포의 가열은, 비제한적으로, 저항 가열, 대류 가열, 스팀 가열, 유체 욕 내의 가열, 태양 에너지에 의한 가열, 집중된 태양 에너지에 의한 가열 등을 포함할 수 있으며, 이들 중 임의의 것은 탱크, 풀, 튜브, 도관, 플라스크 또는 기타 보유 장치에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포는, 벽 내부에/상에 저항 코일을 포함하는 탱크에서 가열된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는, 통과 배관을 포함하는 액체 욕에서 가열된다. 몇몇 실시양태에서, 세포는 자켓식 가열을 갖는 탱크에서 가열되며, 이는, 상기 탱크 주위로 가열 유체가 순환되는 가열 "자켓"을 사용하는 탱크이다.
세포의 건조는, 비제한적으로, 공기 흐름에 대한 노출, 열에 대한 노출(예컨대, 대류열, 가열된 표면 등), 태양 에너지에 대한 노출, 동결 건조(freeze drying, lyophilizing), 분무 건조 및 이들의 조합을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 건조는, 임의적으로 가열되는 회전 드럼에 세포를 적용하는 것을 포함한다.
본원에 사용되는 화학적 처리는, 비제한적으로, 세포 또는 세포 조성물의 pH를 높이거나 낮추는 것, 세포 또는 세포 조성물을 적합한 화학물질 등과 접촉시키는 것 등을 포함한다.
세포 또는 세포 조성물의 pH를 높이는 것은, 비제한적으로, 세포 조성물에 염기를 첨가하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명에 사용하기에 적합한 염기는 하이드록사이드 염기(예를 들어, LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, 및 이들의 조합물), 카보네이트 염기(예를 들어, Na2CO3, K2CO3, MgCO3, 및 이들의 조합물), 바이카보네이트 염기(예를 들어, LiHCO3, NaHCO3, KHCO3, 및 이들의 조합물), 및 이들의 조합물을 포함한다. 상기 염기는 고체(예컨대, 결정, 과립, 펠렛 등) 또는 액체(예를 들면, 수용액, 알코올성 용액, 예컨대 메탄올, 에탄올 또는 프로판올 중 하이드록사이드 염기) 및 이들의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물의 pH를 8 이상, 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 또는 7 내지 13, 7 내지 12, 7 내지 11, 7 내지 10, 7 내지 9, 8 내지 13, 8 내지 12, 8 내지 11, 8 내지 10, 8 내지 9, 9 내지 12, 9 내지 11, 9 내지 10, 10 내지 12, 또는 10 내지 11의 pH로 높인다.
몇몇 실시양태에서, 세포의 pH를 높이는 것은, 비제한적으로, 클로르알칼리 공정을 수행하는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 염화나트륨 및 세포 조성물을 함유하는 발효 브로쓰는 전기분해를 거쳐 수산화나트륨을 형성할 것이다. 수산화나트륨의 형성은 세포의 pH를 높인다. 몇몇 실시양태에서, 발효 브로쓰는 염화나트륨 대신에 또는 이에 더하여 염화칼슘 또는 염화칼륨을 포함할 수 있다. 상기 발효 브로쓰를 전기분해하면, 수산화칼슘 또는 수산화칼륨이 각각 형성되어, 세포의 pH가 높아진다.
효소적 용해는, 세포와 하나 이상의 효소의 접촉에 의한 세포벽 또는 세포막의 용해를 의미한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 효소는, 비제한적으로, 베타-글루카나제, 자일라나제, 프로테아제, 만나나제, 셀룰라제, 헤미셀룰라제, 키티나제, 펙티나제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 프로테아제의 비제한적인 예는 세린 프로테아제, 트레오닌 프로테아제, 시스테인 프로테아제, 아스파테이트 프로테아제, 메탈로프로테아제, 글루탐산 프로테아제, 알라카제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 셀룰라제의 비제한적인 예는 수크라제, 말타제, 락타제, 알파-글루코시다제, 베타-글루코시다제, 아밀라제, 리소자임, 뉴라미니다제, 갈락토시다제, 알파-만노시다제, 글루쿠로니다제, 히알루로니다제, 풀루라나제, 글루코세레브로시다제, 갈락토실세라미다제, 아세틸갈락토사미니다제, 푸코시다제, 헥소사미니다제, 이두로니다제, 말타제-글루코아밀라제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 키티나제의 비제한적인 예는 키토트리오시다제를 포함한다. 펙티나제의 비제한적 예는 펙톨리아제, 펙토자임, 폴리갈락투로나제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 몇몇 효소는 가열에 의해 활성화된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 효소는 베타-글루카나제, 자일라나제, 셀룰라제, 프로테아제, 펙티나제, 만나나제, 아밀라제, 및 이들의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 효소는 알칼라제(Alcalase)(등록상표)이다.
본원에서 "용해된 세포 조성물"은, 하나 이상의 용해된 세포를 포함하는 조성물(세포 잔해물 및 기타 세포 함유물을, (용해된 세포로부터의) 지질, 및 임의적으로, 미생물 세포를 함유하는 브로쓰와의 조합으로 포함함)을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포는, 미생물 세포 및 물을 포함하는 발효 브로쓰 또는 배지에 함유된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물은, 하나 이상의 용해된 세포, 세포 잔해물, 지질, 세포의 천연 내용물, 및 브로쓰로부터의 수성 성분을 포함하는 조성물을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물은, 연속적인 수성 상 및 분산된 지질 상의 혼합물을 포함하는 수중유 에멀젼의 형태이다. 몇몇 실시양태에서, 분산된 지질 상은, 유화되고 용해된 세포 조성물에 1 중량% 내지 60 중량%, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 40 중량%, 1 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 60 중량%, 5 중량% 내지 50 중량%, 5 중량% 내지 40 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 60 중량%, 10 중량% 내지 50 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 60 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 60 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 또는 40 중량% 내지 60 중량%의 농도로 존재한다.
임의의 특정 이론에 구속되고자 하지 않으면서, 본 발명의 방법은, 상기 유화되고 용해된 세포 조성물을 해체하거나 해유화시켜, 상기 용해된 세포 조성물로부터 지질이 분리되도록 하는 것으로 생각된다. 본원에서 용어 "에멀젼" 및 "유화된"은, 하나의 상 또는 층이 다른 상 또는 층에 분산되어 있는, 둘 이상의 비혼화성 상 또는 층의 혼합물을 지칭한다. 본원에서 용어 "해체(break or break up)" 및 "해유화"는, 에멀젼의 비혼화성 상들 또는 층들을 분리하는 공정을 지칭한다. 예를 들어, 유화되고 용해된 세포 조성물을 해유화시키거나 해체하는 것은, 유화되고 용해된 세포 조성물이 하나 이상의 상 또는 층을 갖는 에멀젼으로부터 둘 이상의 상 또는 층을 갖는 조성물로 변화되는 과정을 지칭한다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 유화되고 용해된 세포 조성물을 단일 상에서 2개 이상의 상으로 해체한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 2개 이상의 상은 지질 상 및 수성 상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 유화되고 용해된 세포 조성물을 하나 이상의 상에서 3개 이상의 상으로 해체한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 3개의 상은 지질 상, 수성 상 및 고체 상을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 3개의 상은 지질 상, 에멀젼 상 및 수성 상을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 75% 이상의 에멀젼, 80% 이상의 에멀젼, 85% 이상의 에멀젼, 90% 이상의 에멀젼, 95% 이상의 에멀젼, 99% 이상의 에멀젼을 제거하거나 해체함으로써, 용해된 세포 조성물을 해유화시켜, 해유화된 세포 조성물을 형성한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 중량 또는 부피 기준으로 상기 에멀젼의 75% 내지 상기 에멀젼의 99%, 상기 에멀젼의 75% 내지 상기 에멀젼의 95%, 상기 에멀젼의 75% 내지 상기 에멀젼의 90%, 상기 에멀젼의 75% 내지 상기 에멀젼의 85 중량%, 상기 에멀젼의 75% 내지 상기 에멀젼의 80%, 상기 에멀젼의 80% 내지 상기 에멀젼의 99%, 상기 에멀젼의 80% 내지 상기 에멀젼의 95%, 상기 에멀젼의 80% 내지 상기 에멀젼의 90%, 상기 에멀젼의 80% 내지 상기 에멀젼의 85%, 상기 에멀젼의 85% 내지 상기 에멀젼의 99%, 상기 에멀젼의 85% 내지 상기 에멀젼의 95%, 상기 에멀젼의 85% 내지 상기 에멀젼의 90%, 상기 에멀젼의 90% 내지 상기 에멀젼의 99%, 상기 에멀젼의 90% 내지 상기 에멀젼의 95%, 또는 상기 에멀젼의 95% 내지 상기 에멀젼의 99%를 제거 또는 해체함으로써, 용해된 세포 조성물을 해유화시킨다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포를 용해시키기 전에, 상기 세포를 세척 및/또는 저온살균할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 세포의 세척은, 임의의 세포외 수용성 또는 수-분산성 화합물을 제거하기 위해 수용액(예컨대, 물)을 사용하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 세포를 1회, 2회, 3회 또는 그 이상 세척할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 세포의 저온살균은, 임의의 바람직하지 않은 효소를 불활성화시키거나 임의의 바람직한 효소(예컨대, 지질을 분해하거나 PUFA의 생성을 감소시킬 수 있는 임의의 효소)를 활성화하기에 충분한 온도로 세포를 가열하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 저온살균 온도는 약 60℃ 내지 약 80℃이다. 몇몇 실시양태에서, 세포를 먼저 세척하고, 이어서 저온살균할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 세포 조성물을 용해 및/또는 해유화시키기 위해, 상기 세포 조성물의 pH를 높이는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키기 위해, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 높이는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, pH를 높이는 것은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 염기와 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 용해된 세포 조성물을 염기와 접촉시켜 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 것을 포함한다. 본원에서 "접촉"은, (예를 들어, 하나의 조성물을 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 첨가함으로써, 또는 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 하나의 조성물에 첨가함으로써) 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 제2 조성물과 조합하는 것을 지칭한다. 본원에서 "조성물"은, 순수한 물질을 포함할 수 있거나 둘 이상의 물질, 성분, 부형제, 분획 등의 조합물을 포함할 수 있다. 상기 용해된 세포 조성물을 제1 염기와 접촉시키면, 상기 용해된 세포 조성물의 pH가 높아진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물을 일정 기간 동안 제1 염기와 접촉시키고, 이어서 일정 기간 동안 제1 산과 접촉시키고, 이어서 가열, 교반 또는 이들의 조합을 수행하고, 후속적으로, 제2 또는 후속 염기 및 이어서 제 2 또는 후속 산과 접촉시켜, 해유화된 조성물을 수득한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 염기는 1 내지 12, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 3 내지 10, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 10, 또는 5 내지 8의 pKb를 가진다. 본원에서 용어 "pKb"는, 염기의 염기 회합 상수(base association constant)(Kb)의 음의 대수를 지칭한다. Kb는, 물에서의 염기의 이온화에 대한 평형 상수를 지칭한다.
본 발명과 함께 사용하기에 적합한 염기는 하이드록사이드 염기(예를 들어, LiOH, NaOH, KOH, Ca(OH)2, 및 이들의 조합물), 카보네이트 염기(예를 들어, Na2CO3, K2CO3, MgCO3, 및 이들의 조합물), 바이카보네이트 염기(예를 들어, LiHCO3, NaHCO3, KHCO3 및 이들의 조합물), 및 이들의 조합물을 포함한다.
상기 염기는 고체 형태(예컨대, 결정, 과립, 펠렛 등) 또는 액체 형태(예컨대, 수용액, 메탄올, 에탄올, 프로판올 및 등) 및 이들의 조합을 포함한다. 따라서, 본 발명과 함께 사용하기 위한 염기에 용매가 임의적으로 존재할 수 있다. 본원에서 "용매"는, 소수성 또는 친유성 제제를 지칭한다. 본원에서 "소수성"은, 다량의 물로부터 반발되는 제제를 지칭한다. 본원에서 "친유성"은, 지질에 용해되는 제제를 지칭한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 염기와 접촉시키면, 상기 용해된 세포 조성물의 pH가 높아진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물을 염기와 접촉시키면, 상기 용해된 세포 조성물의 pH가 9 이상, 10 이상, 11 이상, 12 이상, 또는 약 9 내지 약 14, 약 9 내지 약 13.5, 약 9 내지 약 13, 약 9 내지 약 12.5, 약 9 내지 약 12, 약 9 내지 약 11.5, 약 9 내지 약 11, 약 9 내지 약 10.5, 약 9 내지 약 10, 약 9 내지 약 9.5, 약 9.5 내지 약 14, 약 9.5 내지 약 13.5, 약 9.5 내지 약 13, 약 9.5 내지 약 12.5, 약 9.5 내지 약 12, 약 9.5 내지 약 11.5, 약 9.5 내지 약 11, 약 9.5 내지 약 10.5, 약 9.5 내지 약 10, 약 10 내지 약 14, 약 10 내지 약 13.5, 약 10 내지 약 13, 약 10 내지 약 12.5, 약 10 내지 약 12, 약 10 내지 약 11.5, 약 10 내지 약 11, 약 10 내지 약 10.5, 약 10.5 내지 약 14, 약 10.5 내지 약 13.5, 약 10.5 내지 약 13, 약 10.5 내지 약 12.5, 약 10.5 내지 약 12, 약 10.5 내지 약 11.5, 약 10.5 내지 약 11, 11 내지 약 13.5, 약 11 내지 약 13, 약 11 내지 약 12.5, 약 11 내지 약 12, 약 11 내지 약 11.5, 약 11.5 내지 약 14, 약 11.5 내지 약 13.5, 약 11.5 내지 약 13, 약 11.5 내지 12.5, 약 11.5 내지 약 12, 약 12 내지 약 14, 약 12 내지 약 13.5, 약 12 내지 약 13, 약 12 내지 약 12.5, 약 12.5 내지 약 14, 약 12.5 내지 약 13.5, 약 12.5 내지 약 13, 약 13 내지 약 14, 약 13 내지 약 13.5, 또는 약 13.5 내지 약 14의 pH로 높아진다.
몇몇 실시양태에서, pH를 높이기 위해, 염기가 중량(또는 부피) 기준으로 상기 세포 브로쓰의 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 9%, 약 2% 내지 약 8%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 6%, 약 3% 내지 약 6%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 또는 약 4% 내지 약 5%의 양으로 첨가된다.
몇몇 실시양태에서, 산의 첨가에 의해 pH가 낮아진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 산은 1 내지 12, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 6, 1 내지 5, 2 내지 12, 2 내지 10, 2 내지 8, 2 내지 6, 2 내지 5, 3 내지 10, 3 내지 6, 3 내지 5, 4 내지 10, 4 내지 8, 4 내지 6, 5 내지 10, 또는 5 내지 8의 pKa를 가진다. 본원에서 용어 "pKa"는, 산의 염기 회합 상수(Ka)의 음의 대수를 지칭한다. pKa는, 물에서의 산의 이온화에 대한 평형 상수를 나타낸다.
상기 산은, 비제한적으로, 황산; 인산; 염산; 브롬화수소산; 요오드화수소산; 차아염소산; 염산; 과염소산; 플루오로황산; 질산; 플루오로안티몬산; 불화붕소산; 헥사플루오로인산; 크롬산; 붕산; 아세트산; 시트르산; 폼산; 및 이들의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 pH는 약 6.5 이하; 약 6 이하; 약 5.5 이하; 약 5 이하; 약 4.5 이하; 약 4 이하; 약 3.5 이하; 약 3 이하; 약 2.5 이하; 약 2 이하; 약 1.5 이하; 약 1 이하; 및 약 0.5 이하로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, 상기 pH는 약 0.5 내지 약 6.5; 약 0.5 내지 약 6; 약 0.5 내지 약 5.5; 약 0.5 내지 약 5; 약 0.5 내지 약 4.5; 약 0.5 내지 약 4; 약 0.5 내지 약 3.5; 약 0.5 내지 약 3; 약 0.5 내지 약 2.5; 약 0.5 내지 약 2; 약 0.5 내지 약 1.5; 약 0.5 내지 약 1; 약 1 내지 약 7; 약 1 내지 약 6.5; 약 1 내지 약 6; 약 1 내지 약 5.5; 약 1 내지 약 5; 약 1 내지 약 4.5; 약 1 내지 약 4; 약 1 내지 약 3.5; 약 1 내지 약 3; 약 1 내지 약 2.5; 약 1 내지 약 2; 약 1 내지 약 1.5; 약 1.5 내지 약 7; 약 1.5 내지 약 6.5; 약 1.5 내지 약 6; 약 1.5 내지 약 5.5; 약 1.5 내지 약 5; 약 1.5 내지 약 4.5; 약 1.5 내지 약 4; 약 1.5 내지 약 3.5; 약 1.5 내지 약 3; 약 1.5 내지 약 2.5; 약 1.5 내지 약 2; 약 2 내지 약 7; 약 2 내지 약 6.5; 약 2 내지 약 6; 약 2 내지 약 5.5; 약 2 내지 약 5; 약 2 내지 약 4.5; 약 2 내지 약 4, 약 2 내지 약 3.5; 약 2 내지 약 3; 약 2 내지 약 2.5; 약 2.5 내지 약 7; 약 2.5 내지 약 6.5; 약 2.5 내지 약 6; 약 2.5 내지 약 5.5; 약 2.5 내지 약 5; 약 2.5 내지 약 4.5; 약 2.5 내지 약 4; 약 2.5 내지 약 3.5; 약 2.5 내지 약 3; 약 3 내지 약 7; 약 3 내지 약 6.5; 약 3 내지 약 6; 약 3 내지 약 5.5; 약 3 내지 약 5; 약 3 내지 약 4.5; 약 3 내지 약 4; 약 3 내지 약 3.5; 약 3.5 내지 약 7; 약 3.5 내지 약 6.5; 약 3.5 내지 약 6; 약 3.5 내지 약 5.5; 약 3.5 내지 약 5; 약 3.5 내지 약 4.5; 약 3.5 내지 약 4; 약 4 내지 약 7; 약 4 내지 약 6.5; 약 4 내지 약 6; 약 4 내지 약 5.5; 약 4 내지 약 5; 약 4 내지 약 4.5; 약 4.5 내지 약 7; 약 4.5 내지 약 6.5; 약 4.5 내지 약 6; 약 4.5 내지 약 5.5; 약 4.5 내지 약 5; 약 5 내지 약 7; 약 5 내지 약 6.5; 약 5 내지 약 6; 약 5 내지 약 5.5; 약 5.5 내지 약 7; 약 5.5 내지 약 6.5; 약 5.5 내지 약 6; 및 약 6 내지 약 6.5로부터 선택된다.
몇몇 실시양태에서, pH를 낮추기 위해, 산이 상기 세포 브로쓰의 중량(또는 부피) 기준으로 약 0.5% 내지 약 1%, 약 1% 내지 약 2%, 약 2% 내지 약 10%, 약 2% 내지 약 9%, 약 2% 내지 약 8%, 약 2% 내지 약 7%, 약 2% 내지 약 6%, 약 3% 내지 약 6%, 약 4% 내지 약 6%, 약 5% 내지 약 6%, 약 2% 내지 약 5%, 약 2% 내지 약 4%, 약 2% 내지 약 3%, 약 3% 내지 약 5%, 약 3% 내지 약 4%, 또는 약 4% 내지 약 5%의 양으로 첨가된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 염과 접촉시켜, 상기 용해된 세포 조성물의 해유화를 촉진하는 것을 포함한다. 본원에서 "염"은, 산의 수소 이온을 금속(예컨대, 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 전이 금속 등) 또는 양으로 하전된 화합물로 치환하여 형성된 이온성 화합물(예를 들어, NH4 + 등)을 지칭한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 염은, 비제한적으로, 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 및 이들의 조합물을 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기 위한 염에 존재하는 음으로 하전된 이온 화학종은 할라이드, 설페이트, 바이설페이트, 설파이트, 포스페이트, 수소 포스페이트, 이수소 포스페이트, 카보네이트, 바이카보네이트, 및 이들의 조합물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명에 사용하기 위한 염은 염화나트륨, 황산나트륨, 탄산나트륨, 염화칼슘, 황산칼륨, 황산마그네슘, 글루탐산 모노나트륨, 황산암모늄, 염화칼륨, 염화철, 황산철, 황산알루미늄 및 이들의 조합물로부터 선택된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 염은 NaOH를 포함하지 않는다. 상기 염은 고체(예컨대, 결정질, 무정형, 펠릿화 및/또는 과립 형태) 및/또는 용액(예컨대, 희석 용액, 포화 용액 또는 과포화 용액)(예를 들어, 물, 알코올, 및 이들의 조합물 포함)으로서 첨가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 염은 5 g/L 내지 25 g/L, 5 g/L 내지 10 g/L, 10 g/L 내지 15 g/L, 15 g/L 내지 20 g/L, 20 g/L 내지 25 g/L, 또는 10 g/L 내지 20 g/L의 양으로 첨가된다.
몇몇 실시양태에서, 염을 첨가하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 경우, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물의 온도는 60℃ 이하, 55℃ 이하, 45℃ 이하, 40℃ 이하, 35℃ 이하, 30℃ 이하, 또는 25℃ 이하이다. 몇몇 실시양태에서, 염을 첨가하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 경우, 상기 용해된 세포 조성물의 온도는 0℃ 내지 60℃, 0℃ 내지 55℃, 0℃ 내지 50℃, 0℃ 내지 45℃, 0℃ 내지 40℃, 0℃ 내지 35℃, 0℃ 내지 30℃, 0℃ 내지 25℃, 20℃ 내지 60℃, 20℃ 내지 55℃, 20℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 45℃, 20℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 35℃, 20℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 30℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃, 30℃ 내지 40℃, 30℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 55℃, 40℃ 내지 50℃, 또는 50℃ 내지 60℃이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 1회 이상의 pH 충격 주기들 이전, 도중, 또는 이후에 온도 충격 주기를 포함한다. 본원에서 "온도 충격 주기"는, 해유화를 촉진하기 위해 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 일정 기간(예를 들어, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 50분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간 또는 그 이상) 동안 약 80℃, 약 85℃, 약 90℃, 약 95℃ 또는 그 이상의 온도로 높이고 이어서 일정 기간(예를 들어, 약 5분, 약 10분, 약 20분, 약 30분, 약 50분, 약 1시간, 약 1.5시간, 약 2시간, 약 2.5시간, 약 3시간 또는 그 이상) 동안 약 30℃, 약 25℃, 약 20℃, 약 15℃, 약 10℃, 약 5℃, 또는 약 4℃의 온도로 낮추는 경우의 주기를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 온도 충격 주기는 상기 pH 충격 주기 이전에 수행된다. 또다른 실시양태에서, 상기 온도 충격 주기는 2회 이상의 상기 pH 충격 주기들 사이에서 수행된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을, 상기 용해된 세포 조성물 또는 상기 세포 조성물의 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 10 중량% 이하, 7.5 중량% 이하, 5 중량% 이하, 또는 2 중량% 이하의 염과 접촉시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을, 상기 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물(예컨대, 총 브로쓰 중량)의 0.1 중량% 내지 20 중량%, 0.1 중량% 내지 15 중량%, 0.1 중량% 내지 10 중량%, 0.5 중량% 내지 20 중량%, 0.5 중량% 내지 15 중량%, 0.5 중량% 내지 10 중량%, 0.5 중량% 내지 5 중량%, 0.5 중량% 내지 4중량%, 0.5 중량% 내지 3 중량%, 0.5 중량% 내지 2.5 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 0.5 중량% 내지 1 중량%, 1 중량% 내지 20 중량%, 1 중량% 내지 15 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 1 중량% 내지 4 중량%, 1 중량% 내지 3 중량%, 1 중량% 내지 2.5 중량%, 1 중량% 내지 2 중량%, 1 중량% 내지 1.5 중량%, 1.5 중량% 내지 5 중량%, 1.5 중량% 내지 4 중량%, 1.5 중량% 내지 3 중량%, 1.5 중량% 내지 2.5 중량%, 1.5 중량% 내지 2 중량%, 2 중량% 내지 20 중량%, 2 중량% 내지 15 중량%, 2 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 2 중량% 내지 4 중량%, 2 중량% 내지 3 중량%, 2 중량% 내지 2.5 중량%, 2.5 중량% 내지 5 중량%, 2.5 중량% 내지 4 중량%, 2.5 중량% 내지 3 중량%, 3 중량% 내지 5 중량%, 3 중량% 내지 4 중량%, 4 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 또는 15 중량% 내지 20 중량%의 염과 접촉시키는 것을 포함한다. 예를 들어, 상기 용해된 세포 조성물의 중량이 1,000 kg인 경우, 0.5 중량% 내지 20 중량%의 염과 접촉시키려면 5 kg 내지 200 kg의 염을 상기 용해된 세포 조성물과 합쳐야 한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 가열하여, 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물은, 염기 및/또는 염이 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키기에 충분한 시간 기간 동안 가열된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 5분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 36시간 이상, 42시간 이상, 48시간 이상, 54시간 이상, 60시간 시간 이상, 66시간 이상, 72시간 이상, 78시간 이상, 84시간 이상, 90시간 이상 또는 96시간 이상 동안 가열하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 용해된 세포 조성물을 5분 내지 96시간, 5분 내지 4시간, 5분 내지 2시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 4시간, 10분 내지 2시간, 10분 내지 2시간, 10분 내지 1시간, 1시간 내지 2시간, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 84시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 60시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 4시간, 4시간 내지 96시간, 4시간 내지 84시간, 4시간 내지 72시간, 4시간 내지 60시간, 4시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 4시간 내지 24시간, 8시간 내지 96시간, 8시간 내지 84시간, 8시간 내지 72시간, 8시간 내지 60시간, 8시간 내지 48시간, 8시간 내지 36시간, 8시간 내지 24시간, 8시간 내지 12시간, 12 시간 내지 96시간, 12시간 내지 84시간, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 60시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간, 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 84시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간 또는 24시간 내지 36시간 동안 가열하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 10℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상, 85℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상, 또는 100℃ 이상의 온도에서 가열할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 10℃ 내지 100℃, 10℃ 내지 90℃, 10℃ 내지 80℃, 10℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 100℃, 20℃ 내지 90℃, 20℃ 내지 80℃, 20℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 100℃, 30℃ 내지 90℃, 30℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 100℃, 40℃ 내지 90℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 100℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 100℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 100℃, 80℃ 내지 90℃ 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 가열하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 가열 동안 상기 염이 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 첨가될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물은 밀봉된 시스템 또는 증발기를 갖는 시스템에서 가열될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 존재하는 물의 일부가 증발에 의해 제거되도록, 증발기를 갖는 시스템에서 가열될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 가열하여, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 존재하는 물의 1 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 45 중량% 또는 50 중량%의 물을 제거하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 증발기를 갖는 시스템에서 가열하여 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 45 중량%, 1 중량% 내지 40 중량%, 1 중량% 내지 35 중량%, 1 중량% 내지 30 중량%, 1 중량% 내지 25 중량%, 1 중량% 내지 20 중량%, 1 중량% 내지 15 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 50 중량%, 5 중량% 내지 45 중량%, 5 중량% 내지 40 중량%, 5 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 10 중량% 내지 50 중량%, 10 중량% 내지 45 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 35 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 15 중량% 내지 50 중량%, 15 중량% 내지 45 중량%, 15 중량% 내지 40 중량%, 15 중량% 내지 35 중량%, 15 중량% 내지 30 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 15 중량% 내지 20 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 20 중량% 내지 45 중량%, 20 중량% 내지 40 중량%, 20 중량% 내지 35 중량%, 20 중량% 내지 30 중량%, 20 중량% 내지 25 중량%, 25 중량% 내지 50 중량%, 25 중량% 내지 45 중량%, 25 중량% 내지 40 중량%, 25 중량% 내지 35 중량%, 25 중량% 내지 30 중량%, 30 중량% 내지 50 중량%, 30 중량% 내지 45 중량%, 30 중량% 내지 40 중량%, 30 중량% 내지 35 중량%, 35 중량% 내지 50 중량%, 35 중량% 내지 45 중량%, 35 중량% 내지 40 중량%, 40 중량% 내지 50 중량%, 40 중량% 내지 45 중량%, 또는 45 중량% 내지 50 중량%의 물을 제거하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 사전-결정된 시간 동안 용기에 유지하여 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 5분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 36시간 이상, 42시간 이상, 48시간 이상, 54시간 이상, 60시간 이상, 66시간 이상, 72시간 이상, 78시간 이상, 84시간 이상, 90시간 이상 또는 96시간 이상 동안 용기에 유지하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 상기 주기의 각각의 pH 수준에서 5분 내지 96시간, 5분 내지 4시간, 5분 내지 2시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 4시간, 10분 내지 2시간, 10분 내지 1시간, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 84시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 60시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 36시간 내지 24시간, 1시간 내지 4시간, 1시간 내지 2시간, 4시간 내지 96시간, 4시간 내지 84시간, 4시간 내지 72시간, 4시간 내지 60시간, 4시간 내지 48 시간, 4시간 내지 36시간, 4시간 내지 24시간, 8시간 내지 96시간, 8시간 내지 84시간, 8시간 내지 72시간, 8시간 내지 60시간, 8시간 내지 48시간, 8시간 내지 36시간, 8시간 내지 24시간, 8시간 내지 12시간, 12시간 내지 96시간, 12시간 내지 84시간, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 60시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간, 12시간 내지 24시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 84시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 또는 24시간 내지 36시간 동안 유지하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 임의적으로 저온살균 전 및/또는 후에, 상기 용해된 세포 에멀젼을 산화방지제와 접촉시키는 것을 포함한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 산화방지제는, 비제한적으로, 토코페롤, 토코트라이엔올, 폴리페놀, 레스베라트롤, 플라보노이드, 카로티노이드, 리코펜, 카로틴, 루테인, 아스코르브산, 아스코르빌 팔미테이트 및 이들의 조합물을 포함한다.
본원에서 용어 "교반하다" 및 "교반"은, 힘의 적용을 통해 상기 용해된 세포 조성물에서의 움직임에 영향을 주는 공정을 지징한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 교반, 혼합, 배합, 진탕, 진동 또는 이들의 조합에 의해 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 조성물을 교반하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 공정은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시킨다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 0.1 hp/1,000 gal(용해된 세포 조성물) 내지 10 hp/1,000 gal, 0.5 hp/1,000 gal 내지 8 hp/1,000 gal, 1 hp/1,000 gal 내지 6 hp/1,000 gal, 또는 2 hp/1,000 gal 내지 5 hp/1,000 gal에서 교반하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 교반기를 사용하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반기는, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 염기 및/또는 염을 분산시키는 분산형 교반기이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반기는 하나 이상의 임펠러를 가진다. 본원에서 "임펠러"는, 회전시 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물에 움직임을 부여하도록 배열된 장치를 지칭한다. 본 발명과 함께 사용하기에 적합한 임펠러는 직선형 블레이드 임펠러, 러쉬톤(Rushton) 블레이드 임펠러, 축류 임펠러, 방사류 임펠러, 오목형 블레이드 디스크 임펠러, 고효율 임펠러, 프로펠러, 패들, 터빈, 및 이들의 조합을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 90 ft/m 내지 1,200 ft/m, 200 ft/m 내지 1,000 ft/m, 300 ft/m 내지 1,000 ft/m, 800 ft/m, 400 ft/m 내지 700 ft/m 또는 500 ft/m 내지 600 ft/m의 임펠러 팁 속도를 갖는 교반기를 사용하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 350 cm/s 내지 900 cm/s, 350 cm/s 내지 850 cm/s, 350 cm/s 내지 800 cm/s, 350 cm/s 내지 750 cm/s, 350 cm/s 내지 700 cm/s, 350 cm/s 내지 650 cm/s, 350 cm/s 내지 600 cm/s, 350 cm/s 내지 550 cm/s, 350 cm/s 내지 500 cm/s, 350 cm/s 내지 450 cm/s, 350 cm/s 내지 400 cm/s, 400 cm/s 내지 900 cm/s, 400/s 내지 850 cm/s, 400 cm/s 내지 800 cm/s, 400 cm/s 내지 750 cm/s, 400 cm/s 내지 700 cm/s, 400 cm/s 내지 650 cm/s, 400 cm/s 내지 600 cm/s, 400 cm/s 내지 550 cm/s, 400 cm/s 내지 500 cm/s, 400 cm/s 내지 450 cm/s, 450 cm/s 내지 900 cm/s, 450 cm/s 내지 850 cm, 450 cm/s 내지 800 cm/s, 450 cm/s 내지 750 cm/s, 450 cm/s 내지 700 cm/s, 450 cm/s 내지 650 cm/s, 450 cm/s 내지 600 cm/s, 450 cm/s 내지 550 cm/s, 450 cm/s 내지 500 cm/s, 500 cm/s 내지 900 cm/s, 500 cm/s 내지 850 cm/s, 500 cm/s 내지 800 cm/s, 500 cm/s 내지 750 cm/s, 500 cm/s 내지 700 cm/s, 500 cm/s 내지 650 cm/s, 500 cm/s 내지 600 cm/s, 500 cm/s 내지 550 cm/s, 550 cm/s 내지 900 cm/s, 550 cm/s 내지 850 cm/s, 550 cm/s 내지 800 cm/s, 550 cm/s 내지 750 cm/s, 550 cm/s 내지 700 cm/s, 550 cm/s 내지 650 cm/s, 550 cm/s 내지 600 cm/s, 600 cm/s 내지 900 cm/s, 600 초 내지 850 cm/s, 600 cm/s 내지 800 cm/s, 600 cm/s 내지 750 cm/s, 600 cm/s 내지 700 cm/s, 600 cm/s 내지 650 cm/s, 650 cm/s 내지 900 cm/s, 650 cm/s 내지 850 cm, 650 cm/s 내지 800 cm/s, 650 cm/s 내지 750 cm/s, 650 cm/s 내지 700 cm/s, 700 cm/s 내지 900 cm, 700 cm/s 내지 850 cm, 700 cm/s 내지 800 cm/s, 700 cm/s 내지 750 cm/s, 750 cm/s 내지 900 cm/s, 750 cm/s 내지 850 cm/s, 750 cm/s 내지 800 cm/s, 800 cm/s 내지 900 cm, 800 cm/s 내지 850 cm/s, 또는 850 cm/s 내지 900 cm/s의 임펠러 팁 속도를 갖는 교반기를 사용하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 것을 포함한다. 본원에서 "임펠러 팁 속도"는, 중심 축을 중심으로 회전할 때 임펠러의 가장 바깥쪽 부분의 속도를 지칭한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 교반(및 임의적으로 본원에 기술된 바와 같은 추가 단계)은 임펠러를 포함하는 용기에서 수행되고, 이때 임펠러 직경 대 용기 부피의 비는 0.1 내지 0.5, 0.1 내지 0.4, 0.2 내지 0.5, 0.2 내지 0.4, 0.3 내지 0.5, 또는 0.3 내지 0.4이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 교반(및 임의적으로 본원에 기술된 바와 같은 추가 단계)은 임펠러를 포함하는 용기에서 수행되며, 이때 임펠러 직경 대 용기의 내부 직경의 비는 0.25 이상, 0.34 이상, 0.65 이상, 0.25 내지 0.65, 0.25 내지 0.33, 0.3 내지 0.6, 0.3 내지 0.5, 0.3 내지 0.4, 0.34 내지 0.65, 0.34 내지 0.6, 0.34 내지 0.55, 0.34 내지 0.55, 0.37 내지 0.55, 0.4 내지 0.65, 0.4 내지 0.6, 0.4 내지 0.5, 또는 0.42 내지 0.55이다.
몇몇 실시양태에서, 상기 교반은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물이 10 내지 10,000, 1,000 내지 10,000, 1,500 내지 10,000, 또는 2,000 내지 10,000의 레이놀즈 수(Reynolds number)로 기술된 유동 조건 하에 놓이도록, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 혼합하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 동안, 상기 용해된 세포 에멀젼은 2,000 이상, 3,000 이상, 또는 5,000 이상, 또는 2,000 내지 10,000, 3,000 내지 10,000, 또는 5,000 내지 10,000의 레이놀즈 수를 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 5분 이상, 10분 이상, 20분 이상, 30분 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 8시간 이상, 12시간 이상, 18시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 36시간 이상, 42시간 이상, 48시간 이상, 54시간 이상, 60시간 시간 이상, 66시간 이상, 72시간 이상, 78시간 이상, 84시간 이상, 90시간 이상 또는 96시간 이상 동안 교반하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 5분 내지 96시간, 5분 내지 4시간, 5분 내지 2시간, 5분 내지 1시간, 10분 내지 4시간, 10분 내지 2시간, 10분 내지 1시간, 1시간 내지 96시간, 1시간 내지 84시간, 1시간 내지 72시간, 1시간 내지 60시간, 1시간 내지 48시간, 1시간 내지 36시간, 1시간 내지 24시간, 1시간 내지 4시간, 4시간 내지 96시간, 4시간 내지 84시간, 4시간 내지 72시간, 4시간 내지 60시간, 4시간 내지 48시간, 4시간 내지 36시간, 4시간 내지 24시간, 8 시간 내지 96시간, 8시간 내지 84시간, 8시간 내지 72시간, 8시간 내지 60시간, 8시간 내지 48시간, 8시간 내지 36시간, 8시간 내지 24시간, 8시간 내지 12시간, 12시간 내지 96시간, 12시간 내지 84시간, 12시간 내지 72시간, 12시간 내지 60시간, 12시간 내지 48시간, 12시간 내지 36시간, 12시간 내지 24시간, 20시간 내지 40시간, 24시간 내지 96시간, 24시간 내지 84시간, 24시간 내지 72시간, 24시간 내지 60시간, 24시간 내지 48시간, 또는 24시간 내지 36시간 동안 교반하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 농축된 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 동시에 교반 및 가열하여 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 해유화시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 10℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상, 85℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상, 또는 100℃ 이상의 온도에서 교반하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물을 10℃ 내지 100℃, 10℃ 내지 90℃, 10℃ 내지 80℃, 10℃ 내지 70℃, 20℃ 내지 100℃, 20℃ 내지 90℃, 20℃ 내지 80℃, 20℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 100℃, 30℃ 내지 90℃, 30℃ 내지 80℃, 30℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 100℃, 40℃ 내지 90℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 100℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 100℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 70℃ 내지 100℃, 70℃ 내지 90℃, 80℃ 내지 1000℃, 80℃ 내지 90℃, 또는 90℃ 내지 100℃의 온도에서 교반하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물을 형성하는 것, 상기 용해된 세포 조성물을 제1 염기와 접촉시키는 것 또는 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 높이는 것, 상기 용해된 세포 조성물을 염과 접촉시키는 것, 상기 용해된 세포 조성물을 가열하는 것, 및 상기 용해된 세포 조성물을 교반하는 것의 다양한 조합이 단일 용기에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물을 형성하는 것, 상기 세포 조성물을 염기와 접촉시키거나 상기 세포 조성물의 pH를 높이는 것, 상기 세포 조성물을 염과 접촉시키는 것, 세포 조성물을 가열하는 것, 및 세포 조성물을 교반하는 것의 다양한 조합이 단일 용기에서 수행될 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 단일 용기는 발효 용기를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 발효 용기는 20,000 L 이상, 50,000 L 이상, 100,000 L 이상, 120,000 L 이상, 150,000 L 이상, 200,000 L 이상, 또는 220,000 L 이상의 부피를 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 발효 용기는 20,000 L 내지 220,000 L, 20,000 L 내지 100,000 L, 20,000 L 내지 50,000 L, 50,000 L 내지 220,000 L, 50,000 L 내지 150,000 L, 50,000 L 내지 100,000 L, 100,000 L 내지 220,000 L, 100,000 L 내지 150,000 L, 100,000 L 내지 120,000 L, 150,000 L 내지 220,000 L, 150,000 L 내지 200,000 L, 또는 200,000 L 내지 220,000 L의 부피를 가질 수 있다
몇몇 실시양태에서, 용기 내에 형성된 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물의 소정량을 하나 이상의 교반 용기로 옮길 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 20,000 L 이상, 30,000 L 이상, 40,000 L 이상 또는 50,000 L 이상, 100,000 L 이상, 150,000 L 이상, 200,000 L 이상, 또는 그 이상의 부피를 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 20,000 L 내지 50,000 L, 20,000 L 내지 40,000 L, 20,000 L 내지 30,000 L, 30,000 L 내지 50,000 L, 300,000 L 내지 40,000 L, 40,000 L 내지 50,000 L, 또는 그 이상의 부피를 가질 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 하기 특성의 임의의 조합을 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 2개의 임펠러를 가질 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 상기 임펠러는 러쉬톤 블레이드 임펠러이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 임펠러들은 가장 작은 임펠러의 직경과 적어도 동일한 거리만큼 서로 분리된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 임펠러는 팁에서 팁까지 30 in 내지 40 in, 33 in 내지 37 in, 33 in, 34 in, 35 in, 36 in 또는 37 in이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 10,000 L 이상, 20,000 L 이상, 30,000 L 이상, 40,000 L 이상 또는 50,000 L 이상의 부피를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 교반 용기는 90 in 내지 110 in, 95 in 내지 105 in, 98 in, 99 in, 100 in, 101 in, 또는 102 in의 내경을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 제1 임펠러는 상기 교반 용기의 하부로부터 15 in 내지 20 in, 16 in 내지 19 in, 또는 17 in 내지 18 in에 배치되고, 제2 임펠러는 상기 제1 임펠러의 60 in 내지 80 in, 65 in 내지 75 in, 68 in, 69 in, 70 in, 71 in, 72 in, 73 in, 74 in 또는 75 in 위에 배치된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물은 50 rpm 이상, 60 rpm 이상, 또는 70 rpm 이상으로 교반된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물은 50 rpm 내지 70 rpm, 50 rpm 내지 60 rpm, 60 rpm 내지 70 rpm, 70 rpm 내지 100 rpm, 100 rpm 내지 150 rpm, 150 rpm 내지 200 rpm, 150 rpm 내지 200 rpm, 200 rpm, 250 rpm, 또는 그 이상으로 교반된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질은, 상기 용기로부터 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질을 펌핑함으로써 상기 용기로부터 수확된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질은 상기 용기의 교반 없이 상기 용기로부터 수확된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질은 교반 없이 상기 용기로부터 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물 또는 상기 지질을 펌핑함으로써 상기 용기로부터 수확된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질은 공기의 취입 없이 상기 용기로부터 수확된다. 몇몇 실시양태에서, 전술된 기술에 의해 상기 세포 조성물, 상기 용해된 세포 조성물, 또는 상기 지질을 수확하는 것은 낮은(예를 들어, 26 이하, 25 이하, 20 이하, 15 또는 이하, 10 이하, 5 이하, 2 이하, 또는 1 이하의) 아니시딘가 및/또는 낮은(예를 들어, 100 ppm 이하, 95 ppm 이하, 90 ppm 이하, 85 ppm 이하, 80) ppm 이하, 75 ppm 이하, 70 ppm 이하, 65 ppm 이하, 60 ppm 이하, 55 ppm 이하, 50 ppm 이하, 45 ppm 이하, 40 ppm 이하, 35 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하, 또는 1 ppm 이하의) 인 함량을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 분리는, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물을 (예를 들어, 30℃ 내지 100℃의 온도에서) 원심분리하는 것을 포함하고, 이에 의해 원심분리는 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물로부터 지질을 분리한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물을 적어도 10℃ 이상, 20℃ 이상, 25℃ 이상, 30℃ 이상, 35℃ 이상, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 65℃ 이상, 70℃ 이상, 75℃ 이상, 80℃ 이상, 85℃ 이상, 90℃ 이상, 95℃ 이상, 또는 100℃ 이상의 온도에서 원심분리하는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물을 10℃ 내지 100℃, 10℃ 내지 90℃, 10℃ 내지 80℃, 20℃ 내지 100℃, 20℃ 내지 90℃, 20℃ 내지 80℃, 25℃ 내지 100℃, 25℃ 내지 90℃, 25℃ 내지 80℃, 25℃ 내지 75℃, 30℃ 내지 100℃, 30℃ 내지 90℃, 30℃ 내지 80℃, 40℃ 내지 100℃, 40℃ 내지 90℃, 40℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 100℃, 50℃ 내지 90℃, 50℃ 내지 80℃, 50℃ 내지 70℃, 60℃ 내지 100℃, 60℃ 내지 90℃, 60℃ 내지 80℃, 60℃ 내지 70℃, 70℃ 내지 100℃ 또는 70℃ 내지 90℃의 온도에서 원심분리하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 원심분리는 1 kg/m(분 당 kg) 내지 500 kg/m, 1 kg/m 내지 400 kg/m, 1 kg/m 내지 300 kg/m, 1 kg/m 내지 200 kg/m, 1 kg/m 내지 100 kg/m, 1 kg/m 내지 75 kg/m, 1 kg/m 내지 50 kg/m, 1 kg/m 내지 40 kg/m, 1 kg/m 내지 30 kg/m, 1 kg/m 내지 25 kg/m, 1 kg/m 내지 10 kg/m, 10 kg/m 내지 500 kg/m, 10 kg/m 내지 400 kg/m, 10 kg/m 내지 300 kg/m, 10 kg/m 내지 200 kg/m, 10 kg/m 내지 100 kg/m, 10 kg/m 내지 75 kg/m, 10 kg/m 내지 50 kg/m, 10 kg/m 내지 40 kg/m, 10 kg/m 내지 30 kg/m, 20 kg/m 내지 500 kg/m, 20 kg/m 내지 400 kg/m, 20 kg/m 내지 300 kg/m, 20 kg/m 내지 200 kg/m, 20 kg/m 내지 100 kg/m, 20 kg/m 내지 75 kg/m, 20 kg/m 내지 50 kg/m, 20 kg/m 내지 40 kg/m, 25 kg/m 내지 500 kg/m, 25 kg/m 내지 400 kg/m, 25 kg/m 내지 300 kg/m, 25 kg/m 내지 200 kg/m, 25 kg/m 내지 100 kg/m, 25 kg/m 내지 75 kg/m, 25 kg/m 내지 50 kg/m, 30 kg/m 내지 60 kg/m, 30 kg/m 내지 50 kg/m, 30 kg/m 내지 40 kg/m, 50 kg/m 내지 500 kg/m, 100 kg/m 내지 500 kg/m, 또는 200 kg/m 내지 500 kg/m의 (상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물의 원심분리기로의) 공급 속도로 수행된다.
상기 분리에 필요한 총 시간은, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물의 부피에 따라 달라질 수 있다. 상기 분리를 위한 전형적인 총 시간(예컨대, 원심분리 시간)은 30초 이상, 60초 이상, 2분 이상, 3분 이상, 4분 이상, 5분 이상, 0.1시간 이상, 0.2시간 이상, 0.5시간 이상, 1시간 이상, 2시간 이상, 4시간 이상, 6시간 이상, 8시간 이상, 10시간 이상, 12시간 이상, 또는 0.1시간 내지 24시간, 0.5 시간 내지 24시간, 1시간 내지 12시간, 2시간 내지 10시간, 또는 4시간 내지 8시간이다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물을 1.000 g 내지 25,000 g, 1,000 g 내지 20,000 g, 1,000 g 내지 10,000 g, 2,000 g 내지 25,000 g, 2,000 g 내지 20,000 g, 2,000 g 내지 15,000 g, 3,000 g 내지 25,000 g, 3,000 g 내지 20,000 g, 5,000 g 내지 25,000 g, 5,000 g 내지 25,000 g,0 g,0 8,000 g 내지 8,000 g, 10,000 g 내지 25,000 g, 15,000 g 내지 25,000 g, 또는 1,000 g 이상, 2,000 g 이상, 4,000 g 이상, 5,000 g 이상, 7,000 g 이상, 8,000 g 이상, 10,000 g 이상, 15,000 g 이상, 20,000 g 이상, 또는 25,000 g 이상의 원심력에서 원심분리하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된 "g"는 표준 중력 또는 대략 9.8 m/s2를 의미한다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물을 4,000 rpm 내지 14,000 rpm, 4,000 rpm 내지 10,000 rpm, 6,000 rpm 내지 14,000 rpm, 6,000 rpm 내지 12,000 rpm, 8,000 rpm 내지 12,000 rpm, 또는 8,000 rpm 내지 10,000 rpm에서 원심분리하는 것을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 지질로부터 물을 제거하기 위해, 상기 처리된 세포 조성물 또는 상기 처리되고 용해된 세포 조성물로부터 상기 지질을 분리한 후 상기 지질을 건조시키는 것을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질을 건조시키는 것은, 비제한적으로, 상기 지질을 가열하여 물을 증발시키는 것을 포함할 수 있다. 몇몇 실시양태에서, 건조 후, 상기 지질은 지질의 중량% 기준으로 3% 미만, 2.5% 미만, 2% 미만, 1.5% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 0.1% 미만, 또는 0%의 물 함량을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 건조 후, 상기 지질은 지질의 중량% 기준으로 0% 내지 3%, 0% 내지 2.5%, 0% 내지 2%, 0% 내지 1.5%, 0% 내지 1%, 0% 내지 0.5%, 0.1% 내지 3%, 0.1% 내지 2.5%, 0.1% 내지 2%, 0.1% 내지 1.5%, 0.1% 내지 1%, 0.1% 내지 0.5%, 0.5% 내지 3%, 0.5% 내지 2.5%, 0.5% 내지 2%, 0.5% 내지 1.5%, 0.5% 내지 1%, 1% 내지 3%, 1% 내지 2.5%, 1% 내지 2%, 1% 내지 1.5%, 1.5% 내지 3%, 1.5% 내지 2.5%, 1.5% 내지 2%, 2% 내지 3%, 2% 내지 2.5%, 또는 2.5% 내지 3%의 물 함량을 가진다.
몇몇 실시양태에서, 상기 방법은, 가성 정제, 탈검, 알칼리 정제, 표백, 탈취, 탈산성화 및 이들의 조합으로부터 선택된 하나 이상의 공정에 의해 지질을 정제하여 하나 이상의 인지질, 자유 지방산, 포스페이트, 착색체, 스테롤, 냄새 및 기타 불순물을 제거하는 것을 추가로 포함한다. 본원에서 "정제유"는, 정제된 조 지질 또는 조 오일이다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 본 발명을 사용하여 추출된 지질로부터 생성된 RBD(정제, 표백, 탈취) 또는 RBDW(정제, 표백, 탈취 및 윈터라이즈드) 오일의 수율을 개선한다. 다양한 실시양태에서, 상기 정제의 정제, 표백, 탈취 또는 윈터라이즈드 단계 중 하나 이상에서 수율이 개선된다.
본원에서 "조 지질" 또는 "조 오일"은, 정제되지 않은 지질 또는 오일이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 해유화된 세포 조성물로부터 분리된 지질은 조 지질이다.
본 발명의 다양한 예시적인 공정이 도 1에 개략적으로 기술되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 상기 미생물 세포를 포함하는 브로쓰를 농축하고/하거나 상기 용해된 세포 조성물을 농축하는 것을 포함한다. 본원에서 "농축"은, 조성물로부터 물을 제거하는 것을 지칭한다. 농축은, 비제한적으로, 증발, 화학적 건조, 원심분리, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 미생물 세포를 포함하는 브로쓰는 상기 브로쓰의 중량 기준으로 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 또는 30% 이상의 지질 농도를 제공하도록 농축된다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 세포를 포함하는 브로쓰는 상기 브로쓰의 중량 기준으로 4% 내지 40%, 4% 내지 30%, 4% 내지 20%, 4% 내지 15%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 15% 내지 40%, 15% 내지 30%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30%, 25% 내지 40%, 또는 30% 내지 40%의 지질 농도를 제공하도록 농축된다.
몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물은 농축되어, 상기 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 4% 이상, 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 45% 이상, 50% 이상, 또는 55% 이상의 지질 농도를 제공한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 세포 조성물 또는 상기 용해된 세포 조성물은 상기 용해된 세포 조성물의 중량 기준으로 4% 내지 40%, 4% 내지 30%, 4% 내지 20%, 4% 내지 15%, 5% 내지 40%, 5% 내지 30%, 5% 내지 20%, 10% 내지 40%, 10% 내지 30%, 10% 내지 20%, 15% 내지 40%, 15% 내지 30%, 20% 내지 40%, 20% 내지 30 중량%, 25% 내지 40%, 또는 30% 내지 40%의 지질 농도를 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 지질은 2 이하의 총 아로마 강도를 가진다. 본원에서 용어 "총 아로마 강도(overall aroma intensity)"는, 감각 분석가의 패널에 의해 지질에 부여된 후각 감각 등급을 지칭한다. 본원에서 용어 "감각 분석가"는, 성분의 감각 특징에 대한 피드백을 제공하고/하거나 등급을 매기는 훈련된 개인을 지칭한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 지질은 3 이하의 총 방향 강도를 가진다. 본원에서 용어 "총 방향 강도(overall aromatic intensity)"는, 감각 분석가 패널에 의해 지질에 부여된 미각(gustatory or taste) 또는 감각 등급을 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, 범용 스펙트럼 기술 분석 방법을 사용하여 샘플의 아로마 및 방향 특성을 평가할 수 있다. 이 방법은 0 내지 15(이때, 0 = 감지되지 않음, 15 = 매우 높은 강도)의 강도 스케일을 사용하여, 오일의 아로마 및 방향 속성을 측정한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 지질은, 비린내(fishy)로 특징지어지는 뒷맛을 갖지 않는다. 본원에서 용어 "뒷맛"은, 감각 분석가의 패널에 의해 특징지어지는 바와 같이 지질에서의 풍미 감각의 지속성을 지칭한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은 5 이하, 4.5 이하, 4 이하, 3.5 이하, 3 이하, 2.5 이하, 2 이하, 1.5 이하, 1 이하, 0.5 이하, 0.2 이하, 또는 0.1 이하의 퍼옥사이드가(PV)를 갖는 조 지질을 제공한다. 본원에서 용어 "퍼옥사이드가(peroxide value)" 또는 "PV"는, 지질의 산화 동안 발생되는 1차 반응 생성물(예컨대, 퍼옥사이드 및 하이드로퍼옥사이드)의 측정치를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, PV는 지질 품질 및 지질에서 발생된 산화 정도의 지표이며, 낮은(즉, 5 이하의) PV를 갖는 지질은, 5 초과의 PV를 갖는 지질보다 증가된 안정성 및 감각 프로파일을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 상기 논의된 바와 같이, 상기 용해된 세포 조성물에 염기를 첨가하면, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 높이고 지질 산화를 억제함으로써, 상기 용해된 세포 조성물에서 자유 라디칼의 개수를 최소화하여, 본 발명의 방법으로부터 수득된 조 지질이 낮은(즉, 5 이하의) PV를 갖게 된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 26 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 5 이하, 2 이하, 또는 1 이하의 아니시딘가를 갖는 조 지질을 제공한다. 본원에서 용어 "아니시딘가" 또는 "AV"는, 지질의 산화 동안 발생되는 2차 반응 생성물(예컨대, 알데하이드 및 케톤)의 측정치를 지칭한다. 몇몇 실시양태에서, AV는 지질의 품질 및 지질에서 발생한 산화 정도의 지표이다. 낮은(즉, 26 이하의) AV를 갖는 지질은, 26 초과의 AV를 갖는 지질보다 증가된 안정성 및 감각 프로파일을 나타낸다. 몇몇 실시양태에서, 상기 논의된 바와 같이, 상기 용해된 세포 조성물에 염기를 첨가하면, 상기 용해된 세포 조성물의 pH를 높이고 지질 산화를 억제함으로써, 상기 용해된 세포 조성물에서 자유 라디칼의 개수를 최소화하여, 본 발명의 방법으로부터 수득된 조 지질이 낮은(즉, 26 이하의) AV를 갖게 된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 100 ppm 이하, 95 ppm 이하, 90 ppm 이하, 85 ppm 이하, 80 ppm 이하, 75 ppm 이하, 70 ppm 이하, 65 ppm 이하, 60 ppm 이하, 55 ppm 이하, 50 ppm 이하, 45 ppm 이하, 40 ppm 이하, 35 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하, 또는 1 ppm 이하의 인 함량을 갖는 조 지질을 제공한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법은, 용매를 사용하여 추출이 수행되는 경우(예컨대, 비정형 헥산 추출 또는 프리올렉스(FRIOLEX)(등록상표) 공정(웨스트팔리아 세파레이터 아게(Westfalia Separator AG)(독일))보다 더 낮은 아니시딘가, 더 낮은 퍼옥사이드가, 더 낮은 인 함량 및/또는 더 높은 추출 수율을 갖는 조 지질을 제공한다. 프리올렉스(등록상표) 공정은, 미국 특허 제5,928,696호 및 국제 특허 출원 공개 제WO 01/76385호 및 제WO 01/76715호에 기술된 방와 같이, 수용성 유기 용매를 사용하여 지질을 추출하는 공정이며, 각각의 상기 특허 및 출원 전체를 본원에 참고로 인용한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 용해된 세포 조성물을 가열하면, 2차 반응 생성물(예를 들어, 알데하이드 및 케톤)이, 상기 용해된 세포 조성물에 존재하는 단백질과의 마이야르(Maillard) 반응과 유사한 반응에 참여하게 된다. 상기 반응은, 지질의 산화를 감소시키는 산화방지 활성을 갖는 생성물을 생성하는 것으로 생각된다. 몇몇 실시양태에서, 산화방지 활성을 증가시키기 위해, 추가의 단백질(예컨대, 대두 단백질)이 상기 용해된 세포 조성물에 첨가될 수 있다. 지질의 산화 감소는 지질의 AV를 감소시키고/시키거나, 지질의 뒷맛을 감소시키고/시키거나, 지질의 안정성을 증가시킨다. 몇몇 실시양태에서, 상기 안정성은 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상 또는 20% 이상 증가된다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 의해 추출된 지질, 지질의 추출 후 남아 있는 바이오매스, 또는 이들의 조합물은 식품 또는 식품 성분, 예를 들어 이유식, 조제 분유, 음료, 소스, 유제품(예컨대, 우유, 요거트, 치즈 및 아이스크림), 오일(예컨대, 식용 오일 또는 샐러드 드레싱) 및 구운 식품 중; 영양 보충제(예컨대, 캡슐 또는 정제 형태); 임의의 비-인간 동물(예컨대, 이의 생산물(예컨대, 고기, 우유 또는 계란)을 인간이 소비하는 동물)을 위한 사료 또는 사료 보충제; 식품 보조제; 및 의약품(직접 또는 보조 요법 적용)에서의 성분으로서, 및 바이오 연료에 직접 사용될 수 있다. "동물"이라는 용어는, 동물계에 속하는 임의의 유기체를 지칭하며, 임의의 인간 동물, 및 생산물(예컨대, 우유, 계란, 가금류 고기, 쇠고기, 돼지고기 또는 양고기)이 유래되는 비-인간 동물을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질 및/또는 바이오매스는 해산물에 사용될 수 있다. 해산물은, 비제한적으로. 생선, 새우 및 갑각류로부터 유래된다. "생산물"이라는 용어는, 상기 동물로부터 유래된 임의의 생산물, 예컨대, 비제한적으로, 고기, 계란, 우유 또는 기타 생산물을 포함한다. 상기 지질 및/또는 바이오매스가 상기 동물에게 공급되는 경우, 고도불포화 지질이 상기 동물의 살, 우유, 계란 또는 기타 생산물 내로 혼입되어, 상기 지질의 함량을 증가시킬 수 있다.
지질 조성물
몇몇 실시양태에서, 본 발명은, 본 발명의 방법에 따라 추출된 미생물 지질에 관한 것이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 26 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 5 이하, 2 이하, 또는 1 이하의 아니시딘가, 및/또는 5 이하, 4.5 이하, 4 이하, 3.5 이하, 3 이하, 2.5 이하, 2 이하, 1.5 이하, 1 이하, 0.5 이하, 0.2 이하, 0.1 이하의 퍼옥사이드가, 및/또는 100 ppm 이하, 95 ppm 이하, 90 ppm 이하, 85 ppm 이하, 80 ppm 이하, 75 ppm 이하, 70 ppm 이하, 65 ppm 이하, 60 ppm 이하, 55 ppm 이하, 50 ppm 이하, 45 ppm 이하, 40 ppm 이하, 35 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하, 또는 1 ppm 이하의 인 함량을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 중량 또는 부피 기준으로 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 유기 용매를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 또는 50 중량% 이상의 목적하는 PUFA를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 상기 지질은 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 또는 50 중량% 이상의 DHA, 및/또는 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상의 DPA n-6, 및/또는 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 또는 20 중량% 이상의 EPA, 및/또는 10 중량% 이상, 15 중량% 이상, 20 중량% 이상, 25 중량% 이상, 30 중량% 이상, 35 중량% 이상, 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 또는 50 중량% 이상의 ARA를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 추출된 지질은, 용매를 사용하는 추출(예를 들어, 전형적인 헥산 추출 또는 프리올렉스(등록상표) 공정(웨스트팔리아 세파레이터 아게(독일)))이 수행되는 경우보다 더 낮은 아니시딘가, 더 낮은 퍼옥사이드가, 더 낮은 인 함량 및/또는 더 높은 추출 수율을 제공한다.
본 발명의 미생물 지질은 미생물로부터 유래된 임의의 지질, 예를 들어, 추가 처리 없이 미생물의 바이오매스로부터 추출된 조 오일; 조질 미생물 오일을 추가 처리 단계(예컨대, 정제, 표백 및/또는 탈취)로 처리하여 수득된 정제 오일; 조질 또는 정제된 미생물 오일을 희석하여 수득된 희석된 미생물 오일; 또는 오일 내 지방산(예컨대, DHA)의 농도를 증가시키기 위해, 예를 들어 조 오일 또는 정제된 미생물 오일을 추가의 정제 방법으로 처리하여 수득된 농축 오일일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0 중량% 이상, 0.1 중량% 이상, 0.2 중량% 이상, 0.5 중량% 이상, 약 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0 중량% 내지 1.5 중량%, 0% 내지 2 중량%, 0% 내지 5 중량%, 1 중량% 내지 1.5 중량%, 0.2 중량% 내지 1.5 중량%, 0.2 중량% 내지 2 중량%, 또는 0.2 중량% 내지 5 중량%의 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 또는 2 중량% 미만의 스테롤 에스터 분획을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 65 중량% 이상, 70 중량% 이상, 75 중량% 이상, 80 중량% 이상, 85 중량% 이상, 또는 90 중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 65 중량% 내지 95 중량%, 75 중량% 내지 95 중량%, 또는 80 중량% 내지 95 중량%, 또는 97 중량%, 또는 98 중량%의 트라이글리세라이드 분획을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상의 자유 지방산(FFA) 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0.5 중량% 내지 5 중량%, 0.5 중량% 내지 2.5 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 0.5 중량% 내지 1 중량%, 1 중량% 내지 2.5 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 1.5 중량% 내지 2.5 중량%, 2 중량% 내지 2.5 중량%, 또는 2 중량% 내지 5 중량%의 자유 지방산 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 또는 1 중량% 미만의 자유 지방산 분획을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0.5 중량% 이상, 1 중량% 이상, 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상의 스테롤 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 0.5 중량% 내지 1.5 중량%, 1 중량% 내지 1.5 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 5 중량%, 1 중량% 내지 2 중량%, 또는 1 중량% 내지 5 중량%의 스테롤 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 5 중량% 미만, 4 중량% 미만, 3 중량% 미만, 2 중량% 미만, 또는 1 중량% 미만의 스테롤 분획을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 1.5 중량% 이상, 2 중량% 이상, 2.5 중량% 이상, 3 중량% 이상, 3.5 중량% 이상, 또는 5 중량% 이상의 다이글리세라이드 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 1.5 중량% 내지 3 중량%, 2 중량% 내지 3 중량%, 1.5 중량% 내지 3.5 중량%, 1.5 중량% 내지 5 중량%, 2.5 중량% 내지 3 중량%, 2.5 중량% 내지 3.5 중량%, 또는 2.5 중량% 내지 5 중량%의 다이글리세라이드 분획을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은 상기 오일의 중량 기준으로 2% 미만, 1.5% 미만, 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 불감화물(unsaponifiable)을 포함한다.
상기 미생물 오일에 존재하는 지질 부류(예컨대, 트라이글리세라이드 분획)는 플래쉬 크로마토그래피에 의해 분리되고 박층 크로마토그래피(TLC)에 의해 분석되거나, 또는 당분야에 공지된 다른 방법에 의해 분리 및 분석될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 40 중량% 이상, 45 중량% 이상, 50 중량% 이상, 55 중량% 이상, 60 중량% 이상, 65 중량% 이상, 70 중량% 이상, 75 중량% 이상, 또는 80 중량% 이상의 DHA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 40 중량% 내지 45 중량%, 40 중량% 내지 50 중량%, 40 중량% 내지 60 중량%, 50% 내지 60 중량%, 55 중량% 내지 60 중량%, 40 중량% 내지 65 중량%, 50% 내지 65 중량%, 55 중량% 내지 65 중량%, 40 중량% 내지 70 중량%, 40 중량% 내지 80%, 50 중량% 내지 80 중량%, 55 중량% 내지 80 중량%, 60 중량% 내지 80 중량%, 또는 70 중량% 내지 80 중량%의 DHA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질은, 45 중량% 이하, 40 중량% 이하, 35 중량% 이하, 30 중량% 이하, 25 중량% 이하, 20 중량% 이하, 15 중량% 이하, 또는 13 중량% 이하의 DHA를 포함하는 스테롤 에스터 분획을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 10 중량% 이하, 9 중량% 이하, 8 중량% 이하, 7 중량% 이하, 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 또는 1 중량% 이하의 EPA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 2 중량% 내지 3 중량%, 2 중량% 내지 3.5 중량%, 2.5 중량% 내지 3.5 중량%, 2 중량% 내지 6 중량%, 2.5 중량% 내지 6 중량%, 3.0 중량% 내지 6 중량%, 3.5 중량% 내지 6 중량%, 5 중량% 내지 6 중량%, 또는 2 중량% 내지 10 중량%의 EPA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 EPA가 실질적으로 없다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 적어도 5:1, 적어도 7:1, 적어도 9:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 30:1, 또는 적어도 50:1의 DHA 대 EPA의 중량비를 포함하며, 이때 상기 미생물 지질 및/또는 이의 하나 이상의 분획은 10 중량% 이하의 EPA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 적어도 5:1, 그러나 20:1 미만의 DHA 대 EPA의 중량비를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, DHA 대 EPA의 중량비는 5:1 내지 18:1, 7:1 내지 16:1, 또는 10:1 내지 15:1이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 0.1 중량% 내지 0.25 중량%, 0.2 중량% 내지 0.25 중량%, 0.1 중량% 내지 0.5 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 1.5 중량%의 ARA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 1.5 중량% 이하, 1 중량% 이하, 0.5 중량% 이하, 0.2 중량% 이하, 또는 0.1 중량% 이하의 ARA를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 ARA가 실질적으로 없다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 적어도 20:1, 적어도 30:1, 적어도 35:1, 적어도 40:1, 적어도 60:1, 적어도 80:1, 적어도 100:1, 적어도 150:1, 적어도 200:1, 적어도 250:1, 또는 적어도 300:1의 DHA 대 ARA의 중량비를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트리글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 0.5 중량% 내지 1 중량%, 0.5 중량% 내지 2 중량%, 0.5 중량% 내지 2.5 중량%. 0.5 중량% 내지 3 중량%, 0.5 중량% 내지 3.5 중량%, 0.5 중량% 내지 5 중량%, 0.5 중량% 내지 6 중량%, 1 중량% 내지 2 중량%, 2 중량% 내지 3 중량%, 2 중량% 내지 3.5 중량%, 1 중량% 내지 2.5 중량%, 1 중량% 내지 3 중량%, 1 중량% 내지 3.5 중량%, 1 중량% 내지 5 중량%, 또는 1 중량% 내지 6 중량%의 DPA n-6을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 6 중량% 이하, 5 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2.5 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.5 중량% 이하의 DPA n-6을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 DPA n-6이 실질적으로 없다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 6 초과:1, 적어도 8:1, 적어도 10:1, 적어도 15:1, 적어도 20:1, 적어도 25:1, 적어도 50:1, 또는 적어도 100:1의 DHA 대 DPA n-6의 중량비를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은, 각각 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1.5 중량% 이하, 1 중량% 이하, 또는 0.5 중량% 이하의 리놀레산(18:2 n-6), 리놀렌산(18:3 n-3), 에이코사엔산(20:1 n-9) 및 에루크산(22:1 n-9)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질; 및/또는 스테롤 에스터 분획, 트라이글리세라이드 분획, 자유 지방산 분획, 스테롤 분획, 다이글리세라이드 분획, 극성 분획(인지질 분획 포함), 및 이들의 조합물로부터 선택된 상기 미생물 지질의 하나 이상의 분획은 5 중량% 이하, 4 중량% 이하, 3 중량% 이하, 2 중량% 이하, 1.5 중량% 이하, 또는 1 중량% 이하의 헵타데칸산(17:0)을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 상기 미생물 지질 및/또는 이의 하나 이상의 분획은 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.05 중량% 내지 3 중량%, 또는 0.1 중량% 내지 1 중량%의 헵타데칸산을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 추출된 미생물 지질은 70 중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하고, 이때 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사헥사엔산 함량은 50 중량% 이상이고, 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사펜타엔산 n-6 함량은 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이고, 상기 오일은 26 이하의 아니시딘가를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 미생물 지질은 70 중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하고, 이때 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사헥사엔산 함량은 40 중량% 이상이고, 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사펜타엔산 n-6 함량은 적어도 0.5 중량% 내지 6 중량%이고, 도코사헥사엔산 대 도코사펜타엔산 n-6의 비는 6:1 초과이고, 상기 지질은 26 이하의 아니시딘가를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 추출된 미생물 지질은 70 중량% 이상의 트라이글리세라이드 분획을 포함하고, 이때 상기 트라이글리세라이드 분획 중 도코사헥사엔산 함량은 60 중량% 이상이고, 상기 지질은 26 이하의 아니시딘가를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 임의의 전술된 지방산 프로파일을 갖는 추출된 미생물 지질은 26 이하, 25 이하, 20 이하, 15 이하, 10 이하, 5 이하, 2 이하, 또는 1 이하의 아니시딘가, 및/또는 5 이하, 4.5 이하, 4 이하, 3.5 이하, 3 이하, 2.5 이하, 2 이하, 1.5 이하, 1 이하, 0.5 이하, 0.2 이하, 또는 0.1 이하의 퍼옥사이드가, 및/또는 100 ppm 이하, 95 ppm 이하, 90 ppm 이하, 85 ppm 이하, 80 ppm 이하, 75 ppm 이하, 70 ppm 이하, 65 ppm 이하, 60 ppm 이하, 55 ppm 이하, 50 ppm 이하, 45 ppm 이하, 40 ppm 이하, 35 ppm 이하, 30 ppm 이하, 25 ppm 이하, 20 ppm 이하, 15 ppm 이하, 10 ppm 이하, 5 ppm 이하, 4 ppm 이하, 3 ppm 이하, 2 ppm 이하, 또는 1 ppm 이하의 인 함량을 가진다. 몇몇 실시양태에서, 임의의 전술된 지방산 프로파일을 갖는 추출된 미생물 지질은 ATCC 기탁 번호 PTA-9695, PTA-9696, PTA-9697, 또는 PTA-9698 하에 기탁된 트라우스토키트이드 종의 특징을 갖는 단리된 트라우스토키트리드 미생물로부터 추출된다. 몇몇 실시양태에서, 임의의 전술된 지방산 프로파일을 갖는 추출된 미생물 지질은 조 지질이다. 몇몇 실시양태에서, 상기 조 지질은 중량 또는 부피 기준으로 5% 미만의 유기 용매를 가진다. 몇몇 실시양태에서, 본 발명의 방법에 따라 추출된 미생물 지질은, 용매를 사용하여 추출이 수행된 경우(예를 들어, 프리올렉스 공정(웨스트팔리아 세파레이터 아게(독일)))보다 더 낮은 아니시딘가, 더 낮은 퍼옥사이드가, 더 낮은 인 함량 및/또는 더 높은 추출 수율을 제공한다.
본 발명이 일반적으로 기술되었지만, 본원에 제공된 실시예를 참조하여 추가의 이해를 얻을 수 있다. 이러한 실시예는 단지 예시의 목적으로 제공되며, 제한하려는 의도가 아니다. 하기 실시예는, 본 발명의 방법 및 본 발명의 방법에 의해 제조된 지질의 예이지만, 이에 제한되지 않는다. 세포로부터 지질을 추출할 때 일반적으로 접하게 되는 다양한 조건 및 매개변수의 다른 적합한 변경 및 개조는 당업자에게 자명할 것이며 본 발명의 진의 및 범위 이내이다.
실험 실시예
실시예 1. 파일럿 시험(AEX-O-1150-탱크 B)
약 10 중량%의 스키조키트리움 종 미생물 세포를 60℃로 가열하고, 50% NaOH(콜로니얼 케미컬스 솔루션스(Colonial Chemicals Solutions)(미국 조지아주 사바나 웨스턴 라스롭 애비뉴 916 소재)로부터 입수가능)를 첨가하여 pH를 8.3으로 조정하였다. 효소적 용해를 위해 알칼라제(등록상표) 2.4 FG(노보자임스(Novozymes)(미국 노스 캐롤라이나주 프랭클린턴 소재)로부터 입수가능)를 상기 브로쓰 중량을 기준으로 0.3%의 양으로 상기 브로쓰에 첨가하였으며, 30분 후, pH가 6.9로 떨어졌고, 이를 8.1로 재조정하였다. 2시간의 효소 용해 후, pH를 10.5로, 온도를 90℃로 증가시키면서 해유화 과정을 개시하였다. 온도가 90℃에 도달할 때까지, pH를 8.0으로 낮추고, 이를 10.2로 재조정하였다. 2시간의 해유화 후, 10.49 kg의 NaCl 염을 첨가하였다. 30분의 염 첨가 후, 50% 시트르산(고체 시트르산(테이트 앤 라일(Tate & Lyle)(미국 일리노이주 62521 디케이터, 이스트 엘도라도 스트리트 2200)로부터 입수가능)으로부터 사내 제조)을 첨가하여 pH를 5.4로 낮추었다. 30분 후, pH를 9.7로 올렸다. 1.5시간 후, 15 mL의 상기 조성물을 약 11000×g에서 3분 동안 원심분리하였으며, 해유화가 완료된 것을 확인하였다. 원심분리를 위해 온도를 77℃로 낮추고 pH를 8.3으로 낮추었다. 해유화된 브로쓰를 3상 파일럿 원심분리기 상에서 약 8000×g로 원심분리하여, 주로 조 오일로 이루어진 경질 상 29.6 kg, 주로 발효 배지 및 일부 잔류 세포로 주로 이루어진 중질 상 538.6 kg, 및 발효 배지 및 일부 세포 잔해물로 주로 이루어진 제3 상 2.2 kg을 수집하였다.
실시예 2. 파일럿 시험(AEX-O-1150-탱크 C)
약 10 중량%의 스키조키트리움 종 미생물 세포(실시예 1의 탱크 B와 동일한 배치 발효 브로쓰)를 60℃로 가열하고, 50% NaOH(콜로니얼 케미컬스 솔루션스(미국 조지아주 사바나 웨스턴 라스롭 애비뉴 916 소재)로부터 입수가능)를 첨가하여 pH를 7.9로 조정하였다. 효소적 용해를 위해 알칼라제(등록상표) 2.4 FG(노보자임스(미국 노스 캐롤라이나주 프랭클린턴 소재)로부터 입수가능)를 상기 브로쓰 중량을 기준으로 0.3%의 양으로 상기 브로쓰에 첨가하였다. 30분 후, pH를 6.7로 낮추고, 이를 8.1로 재조정하였다. 2시간의 효소적 용해 후, pH를 10.5로 증가시키고 온도를 90℃로 증가시켜 해유화 공정을 개시하였다. 온도가 90℃에 도달할 때까지, pH를 10.3으로 재조정하였다. 1.5시간의 해유화 후, 10.5 kg의 NaCl 염을 첨가하였다. 30분의 염 첨가 후, 온도를 85℃로 낮추고, 75% 인산(테이트 앤 라일(미국 일리노이주 62521 디케이터, 이스트 엘도라도 스트리트 2200)로부터 입수가능)을 첨가하여 pH를 5.5로 낮추었다. 30분 후, pH를 9.9로 올렸다. 2시간 후, pH를 6.4로 낮추었다. 1.5시간 후, pH를 8.1로 높이고, 15 mL의 상기 조성물을 원심분리하여 해유화 수준을 확인하였다. 해유화가 완료되지 않은 것으로 확인되었으며, 탱크의 내용물을 80℃에서 밤새 방치하였다.
다음날, 온도를 85℃로 높이고, pH를 6.4로 낮추었다. 30분 후, pH를 7.8로 높였으며, 약 90%의 해유화가 달성되었다. 해유화된 브로쓰를 약 8000×g에서 3상 파일럿 원심분리기에서 원심분리하였다. 2.46%의의 수분을 갖고 조 오일로 주로 이루어진 경질 상 31.6 kg, 82.1%의 수분을 갖고 발효 배지 및 일부 잔류 세포로 주로 이루어진 중질 상 550.6 kg, 75.7%의 수분을 갖고 발효 배지 및 일부 세포 잔해물로 주로 이루어진 제3 상 16.4 kg을 수집하였다.
Figure pct00001
Figure pct00002
실시예 3. 파일럿 시험
약 10 중량%의 스키조키트리움 종 미생물 세포를 함유하는 발료 브로쓰 1797.6 kg을 60℃로 가열하고, 50% NaOH(콜로니얼 케미컬스 솔루션스(미국 조지아주 사바나 웨스턴 라스롭 애비뉴 916 소재)로부터 입수가능)를 첨가하여 pH를 8.0으로 조정하였다. 효소적 용해를 위해 알칼라제(등록상표) 2.4 FG(노보자임스(미국 노스 캐롤라이나주 프랭클린턴 소재)로부터 입수가능)를 상기 브로쓰 중량을 기준으로 0.3%의 양으로 상기 브로쓰에 첨가하였다. 용해된 조성물의 pH를 10.5로 조정하고, 90℃로 가열하였다. 온도가 90℃에 도달하였을 때, pH를 8.8로 낮추고, pH를 10.1로 조정하였다. 90℃에서 1시간 후, 온도를 82℃로 낮추고, 50% 시트르산(고체 시트르산(테이트 앤 라일(미국 일리노이주 62521 디케이터, 이스트 엘도라도 스트리트 2200)로부터 입수가능)으로부터 사내 제조)을 첨가하여 30분 동안 pH를 5.2로 낮추었다. 30분 후, pH를 8.2로 높였다. 15 mL의 샘플을 약 11000×g에서 3분 동안 원심분리하였다. 해유화된 브로스를 3상 파일럿 원심분리기 상에서 약 8000×g로 원심분리하였다. 조 오일로 주로 이루어진 경질 상 78.9 kg, 발효 배지 및 일부 잔류 세포로 이루어진 중질 상 1876.6 kg, 및 발효 배지 및 일부 세포 잔해물로 이루어진 제3 상 10.6 kg을 수집하였다. 상기 조 오일을 0.27% 수분으로 건조시키고, RBWD에서 처리하였다.
Figure pct00003

Claims (36)

  1. (a) 미생물 세포를 포함하는 조성물을 약 60℃ 내지 약 80℃의 온도로 가열하는 단계;

    (b) 상기 미생물 세포의 용해(lysis)에 충분한 시간 동안 상기 미생물 세포의 세포벽을 파괴할(disrupting) 수 있는 하나 이상의 효소를 첨가하고 상기 미생물 세포를 80℃까지 가열하는 단계;
    (c) 용해된 세포 조성물을 약 80℃ 내지 약 90℃의 온도로 가열하는 단계;
    (d) 염기를 첨가하고 1시간 이상 동안 약 10 내지 약 12의 pH를 유지함으로써, 상기 조성물의 pH를 약 10 내지 약 12의 pH로 조정하는 단계;
    (e) 산을 첨가하고 0.5시간 이상 동안 약 4 내지 약 6의 pH를 유지함으로써, 상기 단계 (c)에서 수득된 조성물의 pH를 약 4 내지 약 6의 pH로 조정하는 단계;
    (f) 임의적으로, 상기 조성물이 충분히 해유화될(demulsified) 때까지 상기 단계 (c) 및 (d)를 반복하는 단계;
    (g) 해유화되고 용해된 세포 조성물로부터 지질을 분리하는 단계; 및
    (h) 상기 지질을 회수하는 단계
    를 포함하는, 미생물 세포를 포함하는 조성물로부터의 지질 수득 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (a)가, 상기 조성물을 약 80℃로 가열하는 것을 포함하는, 수득 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단계 (a) 및/또는 (b)가, pH를 약 7 내지 약 9로 조정하는 것을 추가로 포함하는, 수득 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 상기 단계 (d) 이전, 상기 단계 (d) 이후, 상기 단계 (e) 이전, 상기 단계 (e) 이후 또는 이들의 조합에서 1회 이상의 온도 충격(temperature shock) 주기에 적용되는, 수득 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 온도 충격이, 온도를 약 80℃ 내지 90℃에서 약 4℃ 내지 20℃로 조정하고 다시 약 80℃ 내지 90℃로 조정하는 것을 포함하는, 수득 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (b), (d) 및/또는 (e)가, 상기 용해된 세포 조성물의 약 0.05 중량% 내지 약 20 중량%의 양으로 염을 첨가하는 것을 추가로 포함하는, 수득 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a)가 상기 세포를 교반하는 것을 추가로 포함하는, 수득 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 세포가 세척되지 않는, 수득 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (a)의 세포가 발효 브로쓰(broth)에 함유되어 있는 것인, 수득 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (g)가, 상기 해유화되고 용해된 세포 조성물을 원심분리하는 것을 포함하는, 수득 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 다중불포화 지방산을 포함하는, 수득 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 다중불포화 지방산이 오메가-3 지방산, 오메가-6 지방산, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 수득 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 다중불포화 지방산이 도코사헥사엔산(DHA), 에이코사펜타엔산(EPA), 도코사펜타엔산(DPA), 아라키돈산(ARA), 감마-리놀렌산(GLA), 다이-호모-감마-리놀렌산(DGLA), 스테아리돈산(SDA), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는, 수득 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 다중불포화 지방산이 도코사헥사엔산(DHA)인, 수득 방법.
  15. 제13항에 있어서,
    상기 다중불포화 지방산이 에이코사펜타엔산(EPA)인, 수득 방법.
  16. 제13항에 있어서,
    상기 다중불포화 지방산이 아라키돈산(ARA)인, 수득 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 세포가 조류(algae), 효모, 진균, 원생생물 또는 박테리아 세포 중 하나 이상인, 수득 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미생물 세포가 모르티에렐라(Mortierella) 속, 크립테코디늄(Crypthecodinium) 속 또는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목으로부터 유래된 것인, 수득 방법.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 미생물 세포가 트라우스토키트리알레스 목으로부터 유래된 것인, 수득 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 미생물 세포가 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속, 쉬조키트리움(Schizochytrium) 속, 또는 이들의 혼합물로부터 유래된 것인, 수득 방법.
  21. 제18항에 있어서,
    상기 미생물 세포가 모르티에렐라 알피나(Mortierella Alpina)로부터 유래된 것인, 수득 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 용해된 세포 조성물이 액체, 세포 잔해물(debris) 및 미생물 오일을 포함하는, 수득 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포로부터 지질을 수득하는데 유기 용매가 사용되지 않는, 수득 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소가 베타-글루카나제, 자일라나제, 셀룰라제, 프로테아제, 펙티나제, 만나나제, 아밀라제 및 이들의 조합물로부터 선택되는, 수득 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 효소가 프로테아제인, 수득 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소가 상기 용해된 세포 조성물의 약 0.05 중량% 내지 약 10 중량%의 양으로 첨가되는, 수득 방법.
  27. 제6항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 염이 알칼리 금속 염, 알칼리 토금속 염, 설페이트 염, 및 이들의 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 수득 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 (h)의 지질이 조 지질(crude lipid)인, 수득 방법.
  29. 제28항에 있어서,
    상기 단계 (h)가, 상기 조 지질을 정제하여 정제된 지질을 수득하는 것을 추가로 포함하는, 수득 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 30 중량% 이상의 도코사헥사엔산을 포함하는, 수득 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 30 중량% 이상의 에이코사펜타엔산을 포함하는, 수득 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 30 중량% 이상의 아라키돈산을 포함하는, 수득 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 약 26 미만의 아니시딘가(anisidine value)를 갖는, 수득 방법.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 약 100 ppm 이하의 인 함량을 갖는, 수득 방법.
  35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 지질이 약 5 meq/kg 미만의 퍼옥사이드가(peroxide value)를 갖는, 수득 방법.
  36. 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 지질.
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