CN113544244A - 通过酶和ph冲击从微生物细胞组合物中获得脂质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从细胞中获得脂质的方法，所述方法涉及裂解细胞以形成裂解的细胞组合物；任选地向所述裂解的细胞组合物中添加盐；顺序地以一个或多个循环将所述裂解的细胞组合物的pH升高至10或以上达某一时间段，之后将所述裂解的细胞组合物的pH降低至小于6的pH达某一时间段，以使所述细胞组合物破乳；以及从所述经破乳的细胞组合物中分离脂质。

Description

通过酶和PH冲击从微生物细胞组合物中获得脂质的方法
相关申请的交叉引用
本申请是要求2019年3月14日提交的美国临时申请号62/818563和2019年3月15日提交的美国临时申请号62/818944的优先权的国际申请，这些美国临时申请中的每一者的全部内容据此全文以引用方式并入。
技术领域
本发明涉及通过裂解细胞，顺序地升高和降低细胞的pH达一个或多个循环，以及分离脂质来从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法。本发明还涉及通过本发明的方法制备的脂质。
背景技术
一种从微生物细胞中获得脂质(诸如多不饱和脂肪酸)的典型方法涉及使能够生产所需脂质的微生物在发酵器、生物塘(pond)或生物反应器中生长；分离包含微生物细胞生物质的发酵液；干燥所述微生物细胞生物质；以及通过溶剂萃取分离脂质。分离中的步骤可包括用水稀释发酵液；将稀释的发酵液离心；裂解微生物细胞；以及通过向脂质可溶的混合物中添加与水不混溶的溶剂(例如，己烷)从裂解的细胞中萃取出细胞内脂质。
另一种从微生物细胞中去除脂质的萃取方法是使用机械力(例如，均质化)、酶促处理或化学处理破坏细胞壁以裂解发酵液中的细胞。可以使用有机溶剂(例如，异丙醇)从所得包含脂质、微生物细胞生物质和水的组合物中萃取脂质。可以从组合物中机械地分离脂质，并且必须从脂质和含水生物质废物流中去除醇。参见例如，国际公开案号WO 01/76385和WO 01/76715。
然而，使用上述方法中的任一方法的工业规模脂质生产需要大量挥发性且易燃的有机溶剂，从而产生了危险的操作条件。在萃取过程中使用有机溶剂还可需要使用防爆脂质回收系统，从而增加了脂质回收的成本。此外，在从微生物细胞中萃取脂质时使用有机溶剂可产生有机溶剂废物流，所述有机溶剂废物流需要完整的溶剂回收系统或适当的处置方法，这进一步增加了脂质萃取的整体生产成本。例如，对挥发性有机化合物(volatileorganic compound,VOC)排放的严格限制需要更多的人力并且增加了容器和其他设备的成本。
因此，需要不使用有机溶剂从细胞中获得脂质的方法以最小化上述问题。已经提出了几种在不使用有机溶剂的情况下从细胞中分离脂质的方法。例如，美国专利号6,750,048公开了一种水性洗涤方法，由此用水性洗涤溶液洗涤乳液，直到获得基本上非乳化的脂质。然而，在一些实施方式中，这种方法需要多个洗涤步骤，所述多个洗涤步骤需要大量的成本和时间。美国专利号7,431,952公开了一种方法，通过该方法将裂解的细胞离心以去除细胞壁碎片，然后萃取和纯化油状物。然而，这种方法提供了需要大量进一步纯化的粗制油状物。
发明内容
本发明涉及一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：裂解微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；任选地向裂解的细胞组合物中添加盐；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至为10或以上的pH达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至为6或更低的pH达某一时间段，以使该细胞组合物破乳；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
本发明还涉及一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：在约7至约9的pH和约60至约80℃的温度下酶促裂解所述微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；任选地向裂解的细胞组合物中添加盐；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至为10或以上的pH达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至为6或更低的pH达某一时间段，以使该细胞组合物破乳；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
本发明还涉及一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：在约7至约9的pH和约60℃至约80℃的温度下裂解微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；将裂解的细胞组合物加热至约80℃至约90℃的温度，并任选向裂解的细胞组合物中添加盐；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至为10或以上的pH达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至为6或更低的pH达某一时间段，以使该细胞组合物破乳；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
本发明还涉及一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：在约7至约9的pH和约60℃至约80℃的温度下裂解微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；将裂解的细胞组合物的温度从约4℃循环至约90℃达一个或多个循环；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至为10或以上的pH达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至为6或更低的pH达某一时间段，以使该细胞组合物破乳；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
本发明还涉及一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：在约7至约9的pH和约60℃至约80℃的温度下裂解微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至10或以上的pH达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至为6或更低的pH达某一时间段，随后将裂解的细胞组合物的温度从约4℃循环至约90℃达一个或多个循环以使细胞组合物破乳；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
本发明还涉及本发明的方法中的任何方法，其中所述方法还包括在裂解和破乳步骤期间以及在一个或多个pH冲击循环之前、之间或之后，将浓缩微生物细胞组合物的温度从约4℃循环至约90℃达一个或多个循环(“温度冲击”)。在一些实施方式中，温度冲击包括将温度从约80-90℃调节至约4-20℃并回到约80-90℃。
在前述实施方式中的每个实施方式中，回收的脂质任选地含有小于按重量或体积计5％的有机溶剂。
在前述实施方式中的每个实施方式中，使用按重量或体积计少于5％的有机溶剂。在一些实施方式中，不使用有机溶剂。
在一些实施方式中，提高pH包括添加碱。在一些实施方式中，所述碱的pKb是1至12。
在一些实施方式中，降低pH包括添加酸。在一些实施方式中，所述酸的pKa是1至12。
在一些实施方式中，所述方法包括通过搅拌、混合、共混、振荡、振动或它们的组合来搅动裂解的细胞组合物。
在一些实施方式中，裂解包括机械处理、物理处理、化学处理、酶处理，或它们的组合。在一些实施方式中，机械处理是均化。
在一些实施方式中，以按裂解的细胞组合物的重量计0.1％至20％的量添加盐。在一些实施方式中，盐选自由以下项组成的组：碱金属盐、碱土金属盐、硫酸盐、以及它们的组合。在一些实施方式中，盐是氯化钠。在一些实施方式中，盐是硫酸钠。
在一些实施方式中，从破乳步骤中省略盐。
在一些实施方式中，分离包括离心。在一些实施方式中，分离包括在30℃至90℃的温度下离心。
在一些实施方式中，该方法提供了包含按重量计至少50％的甘油三酯的脂质。
在一些实施方式中，该方法提供了茴香胺值为26或更低的脂质。
在一些实施方式中，该方法提供了过氧化值为5或更低的脂质。
在一些实施方式中，该方法提供了磷含量为100ppm或更低的脂质。
在一些实施方式中，该方法提供了具有按重量计至少10％的所需多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)的脂质。在一些实施方式中，该方法提供了具有按重量计至少10％的二十二碳六烯酸(“docosahexaenoic acid,DHA”)、按重量计至少5％的二十二碳五烯酸n-3(“docosapentaenoic acid n-3,DPA n-3”)、按重量计至少10％的二十碳五烯酸(“eicosapentaenoic acid,EPA”)、和/或按重量计至少10％的花生四烯酸(“arachidonic acid,ARA”)的脂质。
在一些实施方案中，细胞是微生物细胞。在一些实施方式中，该方法包括浓缩包含微生物细胞的发酵液。
在一些实施方式中，该方法包括浓缩裂解的细胞组合物。
在一些实施方式中，该方法包括精炼脂质。在一些实施方式中，精炼选自由以下项组成的组：碱炼、脱胶、酸处理、碱处理、冷却、加热、漂白、脱臭、脱酸、以及它们的组合。
本发明还涉及通过本发明的方法中的任何方法获得的脂质。
在一些实施方式中，脂质具有3或更低的整体香气强度。在一些实施方式中，脂质具有2或更低的整体芳香强度。
在一些实施方式中，脂质包含按重量计至少10％的所需多不饱和脂肪酸(PUFA)。在一些实施方式中，脂质包含按重量计至少10％的二十二碳六烯酸(“DHA”)、按重量计至少5％的二十二碳五烯酸n-3(“DPA n-3”)、按重量计至少10％的二十碳五烯酸(“EPA”)、和/或按重量计至少10％的ARA。
在一些实施方式中，脂质包含按重量计至少20％的二十碳五烯酸，以及按重量计少于5％的花生四烯酸、二十二碳五烯酸n-6、油酸、亚油酸、亚麻酸、二十碳烯酸、芥酸和十八碳四烯酸中的每一者。
在一些实施方式中，脂质的茴香胺值是26或更小。
在一些实施方式中，脂质是粗制脂质。在一些实施方式中，粗制脂质任选地具有按重量或体积计少于5％的有机溶剂。
本发明还涉及一种脂质，所述脂质具有是26或更小的茴香胺值，5或更小的过氧化值，100ppm或更小的磷含量，以及任选地按重量或体积计小于5％的有机溶剂。
本发明还涉及一种萃取的脂质，所述萃取的脂质包含按重量计至少70％的甘油三酯级分，其中所述甘油三酯级分的二十二碳六烯酸含量是按重量计至少40％，其中所述甘油三酯级分的二十二碳五烯酸n-6含量是按重量计至少0.5％至按重量计6％，并且其中油状物的茴香胺值是26或更小。在一些实施方式中，萃取的脂质具有的二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比率大于6:1。
在一些实施方式中，提取的脂质是粗制脂质或粗制油状物。在一些实施方式中，粗制脂质任选地具有按重量或体积计少于5％的有机溶剂。
本发明还涉及一种用于获得脂质的方法，所述方法包括精炼本发明的粗制脂质。在一些实施方式中，精炼选自由以下项组成的组：碱炼、脱胶、酸处理、碱处理、冷却、加热、漂白、脱臭、脱酸、以及它们的组合。
本发明的方法通过以下方式提供了超过本领域中已知的方法的特定优点：提高萃取的脂质组合物的量和/或质量，减少用于从细胞组合物中获得脂质的方法中的一个或多个步骤的处理时间，减少从细胞组合物中获得脂质所需的试剂的量，减少所述方法中利用的危险化学品的量以及由所述方法产生的危险废物的量，提高RBDW(经精炼、经漂白、经脱臭、经冬化)油状物的产量，降低商业规模生产中的可变性，以及降低萃取脂质的整体货币成本。
附图说明
并入本文并形成本说明书的一部分的附图示出了本发明，并与说明书一起进一步用于解释本发明的原理并且使得相关领域的技术人员能够制造和使用本发明。
图1提供了描述本发明的方法的示意性流程图。
具体实施方式
本文描述了一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，该方法包括：裂解微生物细胞以形成裂解的细胞组合物；任选地向裂解的细胞组合物中添加盐；顺序地以一个或多个循环将裂解的细胞组合物的pH升高至10或以上达某一时间段，之后将裂解的细胞组合物的pH降低至小于6的pH达某一时间段，以使细胞组合物破乳(“pH冲击”)；从经破乳的细胞组合物中分离脂质；以及回收脂质。
在各种实施方式中，该方法包括：
a)将包含微生物细胞的组合物加热至约60℃至约80℃的温度；
b)添加一种或多种能够破坏微生物细胞的细胞壁的酶达足以裂解所述微生物细胞的时间；
c)将裂解的细胞组合物加热至约80℃至约90℃的温度；
d)通过添加碱将组合物的pH调节至约10至约12的pH，并保持约10至约12的pH至少1小时；
e)通过添加酸将步骤(d)中获得的组合物的pH调节至约4至约6的pH，并保持约4至约6的pH至少0.5小时；
f)任选地重复步骤(d)和(e)，直到所述组合物被充分破乳；
g)从经破乳的裂解细胞组合物中分离脂质；以及
h)回收脂质。
在一些实施方式中，在(a)和/或(b)中，将pH从约7调节至约9。
在一些实施方式中，将(d)中的pH保持在10或以上达约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长的时间段。
在一些实施方式中，将(e)中的pH保持在6或以下达约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长的时间段。
在各种实施方式中，重复(d)和(e)1、2、3、4或5次。
在一些实施方式中，该方法包括将微生物细胞组合物或裂解的细胞组合物与盐接触，以促进裂解的细胞组合物的破乳。在一些实施方式中，盐选自由以下项组成的组：碱金属盐、碱土金属盐、硫酸盐、以及它们的组合。在一些实施方式中，盐是氯化钠、氯化钾、或硫酸钠。
在一些实施方式中，该方法包括在添加碱之前加热裂解的细胞组合物5分钟至10小时、10分钟至4小时、30分钟至2小时、30分钟至1小时、30分钟至1.5小时、1小时至1.5小时、或1小时至2小时。
在一些实施方式中，分离包括离心。在一些实施方式中，分离包括在50℃至90℃的温度下离心。
在一些实施方式中，该方法包括：在裂解之前，对包含细胞的发酵液进行洗涤、离心、蒸发，或它们的组合。在一些实施方式中，该方法包括浓缩包含细胞的培养液。在一些实施方式中，该方法包括浓缩裂解的细胞组合物。
本发明还涉及一种用于获得脂质的方法，所述方法包括精炼本发明的粗制脂质。在一些实施方式中，精炼选自由以下项组成的组：碱炼、脱胶、酸处理、碱处理、冷却、加热、漂白、脱臭、脱酸、以及它们的组合。
通常，本发明的方法不利用有机溶剂来萃取或以其他方式分离脂质。因此，在一些实施方式中，在本发明的方法期间不将有机溶剂以足以萃取脂质的量或浓度添加至包含微生物细胞的发酵液中，至细胞组合物中，至裂解的细胞组合物中，或至脂质中。如本文所用，“有机溶剂”是指包含至少一个碳原子的溶剂。如本文所用，“溶剂”是指为疏水或亲脂性并且不是脂质的试剂。如本文所用，“疏水性的”是指被大量水排斥的试剂。如本文所用，“亲脂性的”是指溶解脂质的试剂。本发明方法中不使用的有机溶剂包括但不限于极性溶剂、非极性溶剂、可与水混溶的溶剂、与水不混溶的溶剂，以及它们的组合。有机溶剂的非限制性示例包括取代和非取代的C4-C8烷基(例如，己烷等)、C5-C12环烷基、C4-C12烯烃、C1-C8醇(例如，异丙醇等)、C1-C8醛、C4-C8醚、C1-C8酯、C6-C12芳基、C1-C8酰胺、C5-C12杂芳基，以及它们的组合。
在一些实施方式中，可以将有机溶剂添加至微生物细胞组合物、裂解的细胞组合物或破乳的细胞组合物中。在此类实施方式中，以按体积计小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或小于0.05％的浓度添加有机溶剂。可以将如本文所定义的有机溶剂任选地添加至裂解的细胞组合物中，例如作为用于与裂解的细胞组合物接触的碱和/或盐的组分。然而，在此类实施方式中，有机溶剂以这样的浓度存在，所述浓度使得脂质基本上不会被溶剂从微生物细胞组合物、裂解的细胞组合物或破乳的细胞组合物中萃取出(即，以按体积或重量计小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或小于0.05％的浓度)。
在一些实施方式中，本发明的方法不包括洗涤，例如用水洗涤，或者该方法减少了裂解的细胞组合物或破乳的细胞组合物的洗涤次数。“洗涤”是指用例如水或缓冲液稀释组合物并例如通过离心去除水或缓冲液的过程。洗涤细胞组合物可降低从细胞中获得的脂质的总产量。在本发明中，洗涤可减少1倍、2倍、3倍或更多倍。
定义
如本文所用，“脂质”或“油状物”是指一种或多种脂肪酸(包括游离脂肪酸和脂肪酸酯)、磷脂、三酰基甘油(即甘油三酯)、二酰基甘油酯、单酰基甘油酯、溶血磷脂、肥皂、磷脂、蜡、甾醇和甾醇酯、类胡萝卜素、叶黄素、烃，以及本领域普通技术人员已知的其它脂质。脂质包括极性脂质和中性脂质。
如本文所用，“极性脂质”是指含有极性基团且更易溶于极性溶剂的脂质。极性脂质包括磷脂。如本文所用，“磷脂”是指具有磷酸基团的脂质。如本文所用，“中性脂质”是指不含极性区域且更易溶于非极性溶剂的脂质。中性脂质包括三酰基甘油(triacylglycerol,TAG)。
如本文所用，例如离心后的分离阶段是基于根据比重的分离。在初始处理之后但在破乳之前，“轻相”主要由具有较低比重的材料，例如浓缩细胞组合物(或“生物质”)组成。“重相”主要由具有较高比重的材料，例如水相(例如，水、盐、糖)组成。出于本发明的目的，分离的轻相可含有最少的残留水性材料。
脂肪酸基于碳链的长度和饱和特性进行分类。基于链中存在的碳数，脂肪酸被称为短链、中链或长链脂肪酸。当碳原子之间不存在双键时，脂肪酸被称为饱和脂肪酸，并且当碳原子之间存在双键时，脂肪酸被称为不饱和脂肪酸。当只存在一个双键时，不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，并且当存在多于一个双键时，不饱和长链脂肪酸是多不饱和的。
脂质中存在的脂肪酸可以具有4个至28个碳原子。在一些实施方式中，脂质包含一种或多种多不饱和脂肪酸。多不饱和脂肪酸(PUFA)基于来自脂肪酸甲基端的第一双键的位置进行分类：ω-3(n-3)脂肪酸在第三碳上含有第一双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六碳上含有第一双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是链长为22个碳并且具有6个双键的ω-3长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid,LC-PUFA)，通常被称为“22:6n-3”。出于本申请的目的，长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)被定义为具有18个或更长碳链长度的脂肪酸，并且优选是具有20个或更长碳链长度、含有3个或更多个双键的脂肪酸。ω-6系列的LC-PUFA包括但不限于二均-γ-亚油酸(C20:3n-6)、花生四烯酸(C20:4n-6)(“ARA”)、二十二碳四烯酸或肾上腺酸(C22:4n-6)、和二十二碳五烯酸(C22:5n-6)(“DPA n-6”)。ω-3系列的LC-PUFA包括但不限于二十碳三烯酸(C20:3n-3)、二十碳四烯酸(C20:4n-3)、二十碳五烯酸(C20:5n-3)(“EPA”)、二十二碳五烯酸(C22:5n-3)(“DPA n-3”)、和二十二碳六烯酸(C22:6n-3)(“DHA”)。LC-PUFA还包括具有大于22个碳和4个或更多个双键的脂肪酸，包括但不限于C24:6(n-3)和C28:8(n-3)。
术语“脂肪酸”、“多不饱和脂肪酸”和“PUFA”不仅包括游离脂肪酸形式，还包括其他形式，诸如三酰甘油(TAG)形式、磷脂(PL)形式和其他酯化形式。如本文所用，术语“酯”和“酯化的”是指PUFA分子的羧酸基团中的氢被另一个取代基取代。典型的酯是本领域技术人员已知的，其讨论由Higuchi,T.等人，Pro-drugs as Novel Delivery Systems，第14卷，A.C.S.Symposium Series,Bioreversible Carriers in Drug Design,Edward B.Roche编著，Amer.Pharma.Assoc.,Pergamon Press(1987)和Protective Groups in OrganicChemistry,McOmie编著，Plenum Press,New York(1973)提供，所述文献中的每一篇文献都全文以引用方式并入本文。常见酯的示例包括甲基、乙基、三氯乙基、丙基、丁基、戊基、叔丁基、苄基、硝基苄基、甲氧基苄基和二苯甲基。
在一些实施方式中，脂质包含按重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的PUFA。在一些实施方式中，脂质包含按重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的DHA。在一些实施方式中，脂质包含按重量计小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于15％、小于10％、或小于5％的EPA。在一些实施方式中，脂质包含按重量计小于10％、小于5％、小于2％、小于1％、或小于0.5％的甾醇。在一些实施方式中，一种或多种PUFA以一种或多种形式存在于脂质中，诸如甘油三酯、甘油二酯、甘油单酯、磷脂、游离脂肪酸、酯化脂肪酸、脂肪酸的碱金属盐、脂肪酸的碱土金属盐，以及它们的组合。
在一些实施方式中，在本发明的方法中在离心后分离的脂质包含按重量计至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、或50％至95％、50％至90％、50％至85％、50％至80％、50％至75％、60％至95％、60％至90％、60％至85％、70％至95％、70％至90％、70％至85％、75％至95％、75％至90％、或75％至85％的甘油三酯。
在一些实施方式中，甘油三酯包含按重量计至少10％、至少20％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的DHA。在一些实施方式中，甘油三酯包含按重量计至少50％、至少40％、至少30％、至少20％、至少15％、至少10％、或至少5％的EPA。
如本文所讨论的，离心后脂质的附加精炼可提供包含按重量计至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％、或80％至99.5％、80％至99％、80％至97％、80％至95％、80％至90％、85％至99.5％、85％至99％、85％至97％、85％至95％、85％至90％、90％至99.5％、90％至99％、90％至97％、90％至95％、95％至99.5％、95％至99％、95％至97％、97％至99.5％、或98％至99.5％的甘油三酯的脂质。
如本文所用，“细胞”是指含脂质的生物材料，例如来源于微生物的生物材料。如本文所用，“微生物细胞”或“微生物”是指例如藻类、细菌、真菌、原生生物以及它们的组合的生物，例如单细胞生物。在一些实施方式中，微生物细胞是真核细胞。适用于本发明的微生物细胞包括但不限于金藻(例如，不等鞭毛(Stramenopiles)界的微生物)；绿藻；硅藻；沟鞭藻(例如，沟鞭藻纲(Dinophyceae)目的微生物，包括隐甲藻属(Crypthecodinium)的成员，例如寇氏隐甲藻(Crypthecodinium cohnii或C.cohnii))；酵母(子囊菌(Ascomycetes)或担子菌(Basidiomycetes))；以及毛霉属(Mucor)和被孢霉属(Mortierella)的真菌，包括但不限于高山被孢霉(Mortierella alpina)和舒克里被孢霉(Mortierellasect.schmuckeri)。适用于本发明的微生物细胞还可包括但不限于在以下生物组中发现的属：不等鞭毛属(stramenopiles)、汉姆门(Hamatores)、普罗特蒙门(Proteromonads)、欧帕门(Opalines)、德维尔派门(Develpayella)、戴普罗弗门(Diplophrys)、拉普利门(Labrinthulids)、破囊壶菌属(Thraustochytrids)、拜尔瑟门(Biosecids)、卵菌纲(Oomycetes)、海植戴尔门(Hypochytridiomycetes)、康曼门(Commation)、瑞可罗门属(Reticulosphaera)、普莱格门(Pelagomonas)、普莱格可门(Pelagococcus)、欧里可拉门(Ollicola)、奥瑞可门(Aureococcus)、帕玛藻目(Parmales)、硅藻属(Diatoms)、黄藻门(Xanthophytes)、褐藻门(Phaeophytes)、黄绿藻门(Eustigmatophytes)、绿鞭藻门(Raphidophytes)、新纽门(Synurids)、爱科斯汀门(Axodines)(包括瑞佐克姆纲(Rhizochromulinaales)、金须藻属(Pedinellales)、单硅鞭毛藻目(Dictyochales))、克里索达纲(Chrysomeridales)、萨西诺达纲(Sarcinochrysidales)、水树藻目(Hydrurales)、蛰居金藻目(Hibberdiales)、和色金藻目(Chromulinales)。
在一些实施方式中，用于本发明的微生物细胞是网菌门(Labyrinthulomycota)的微生物。在一些实施方式中，网菌门的微生物细胞是破囊壶菌属(thraustochytrid)，诸如裂殖壶菌属(Schizochytrium)或壶菌属(Thraustochytrium)。根据本发明，术语“破囊壶菌属(thraustochytrid)”是指破囊壶菌目的任何成员，所述破囊壶菌目包括破囊壶菌科，并且术语“网粘菌(labyrinthulid)”是指网粘菌目(Labyrinthulales)的任何成员，所述网粘菌目包括网粘菌科(Labyrinthulaceae)。
网粘菌科的成员先前被认为是破囊壶菌目的成员，但是在此类生物的系统分类的较新修订版本中，网粘菌科现在被认为是网粘菌目的成员。网粘菌目和破囊壶菌目都被认为是网菌门的成员。分类学理论家现在通常将这两组微生物与原生藻菌(Stramenopile)谱系的藻类或藻类样原生生物放在一起。
出于本发明的目的，被描述为破囊壶菌属的微生物细胞株包括以下生物：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(种：阿迪门多(arudimentale)、金黄色破囊壶菌(aureum)、碧席考拉(benthicola)、球破囊壶菌(globosum)、金尼破囊壶菌(kinnei)、动孢破囊壶菌(motivum)、多增殖性破囊壶菌(multirudimentale)、厚皮破囊壶菌(pachydermum)、层出破囊壶菌(proliferum)、粉红破囊壶菌(roseum)和纹带破囊壶菌(striatum))、吾肯氏壶菌属(种属：变形吾肯氏壶菌(amoeboidea)、克格伦吾肯氏壶菌(kerguelensis)、小吾肯氏壶菌(minuta)、深海吾肯氏壶菌(profunda)、辐射吾肯氏壶菌(radiata)、塞仓(sailens)、沙氏吾肯氏壶菌(sarkariana)、斯佐凯(schizochytrops)、威瑟氏吾肯氏壶菌(visurgensis)、约肯氏吾肯氏壶菌(yorkensis)种和种BP-5601)、裂殖壶菌属(种：聚合裂殖壶菌(aggregatum)、利纳赛恩(limnaceum)、红树林裂殖壶菌(mangrovei)、微小裂殖壶菌(minutum)和八孢裂殖壶菌(octosporum)种)、日本壶菌属(Japonochytrium)(种：麦尼(marinam))、Aplanochytrium属(种：海罗迪(haliotidis)、克格伦吾肯氏壶菌、深海吾肯氏壶菌和斯托凯(stocchinoi)种)、阿尔托尼氏壶菌属(Althornia)(种：克劳迪(crouchii)种)、或埃氏壶菌属(Elina)(种：玛瑞萨(marisalba)和欣诺瑞弗卡(sinorificd)种)。出于本发明的目的，吾肯氏壶菌属中描述的种将被认为是壶菌属的成员。在本发明中，Aurantiacochytrium属和Oblogospora属是由网菌门所涵盖的两个附加属。在一些实施方式中，微生物细胞属于破囊壶菌属(Thraustochystrium)、裂殖壶菌属，以及它们的混合物。
适用于本发明的微生物细胞包括但不限于拟网粘菌类(Labyrinthulids)，所述拟网粘菌类选自：目：网粘菌目，科：网粘菌科，属：网粘菌属(种：埃格瑞尼(algeriensis)、考诺赛斯(coenocystis)、查托尼(chattonii)、巨藻属(macrocystis)、大西洋巨藻属(macrocystis atlantica)、巨藻属(macrocystis)、玛瑞那(marina)、小吾肯氏壶菌(minuta)、罗斯科弗尼(roscoffensis)、凡卡诺维(valkanovii)、维丽那(vitellina)、太平洋维丽那(vitellina pacifica)、维丽那(vitellina)、和佐普菲(zopfii)种)、Labyrinthuloides属(种：海罗迪(haliotidis)和优克尼斯(yorkensis)种)、Labyrinthomyxa属(种：玛瑞那种)、戴普罗弗属(种：阿凯瑞(archeri)种)、皮霍索属(Pyrrhosorus)(种：玛瑞纽斯(marinus)种)、索罗迪普罗属(Sorodiplophrys)(种：斯特考瑞(stercorea)种)、和克莱米多属(Chlamydomyxa)(种：拉普利诺(labyrinthuloides)和蒙塔那(montana)种)(尽管目前对皮霍索属、索罗迪普罗属和克莱米多属的确切分类学定位没有一致意见)。
网菌门的宿主细胞包括但不限于保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、以SAM2179保藏的微生物(被保藏者命名为“吾肯氏壶菌属SAME 179”)、任何壶菌属种(包括前述的吾肯氏壶菌属种，例如威瑟氏吾肯氏壶菌(U visurgensis)、阿姆氏吾肯氏壶菌(U.amoeboida)、萨迦氏吾肯氏壶菌(U sarkariana)、深海吾肯氏壶菌(Uprofunda)、辐射吾肯氏壶菌(U radiata)、小吾肯氏壶菌(U.minuta)、和吾肯氏壶菌种BP-5601)，并且包括纹状破囊壶菌(Thraustochytrium striatum)、金黄色破囊壶菌(Thraustochytrium aureum)、粉红破囊壶菌(Thraustochytrium roseum)；以及任何日本壶菌属种。破囊壶菌属的菌株包括但不限于壶菌属种(23B)(ATCC 20891)；纹状破囊壶菌(Schneider)(ATCC 24473)；金黄色破囊壶菌(Goldstein)(ATCC 34304)；粉红破囊壶菌(Goldstein)(ATCC 28210)；日本壶菌属种(LI)(ATCC 28207)；ATCC 20890；ATCC 20892；来源于上述微生物中的任何微生物的突变菌株；以及它们的混合物。裂殖壶菌属包括但不限于聚合裂殖壶菌(Schizochytrium aggregatum)、蛞蝓形裂殖壶菌(Schizochytriumlimacinum)、裂殖壶菌属种(S31)(ATCC 20888)、裂殖壶菌属(S8)(ATCC 20889)、裂殖壶菌属(LC-RM)(ATCC 18915)、裂殖壶菌属(SR 21)、保藏菌株ATCC 28209、保藏蛞蝓形裂殖壶菌菌株IFO 32693，来源于上述微生物中的任何微生物的突变菌株，以及它们的混合物。在一些实施方式中，宿主细胞是裂殖壶菌属或壶菌属。裂殖壶菌可以通过连续的二分和通过形成最终释放游动孢子的孢子囊进行复制。然而，壶菌属只能通过形成孢子囊来复制，所述孢子囊随后释放游动孢子。在一些实施方式中，本发明的宿主细胞是重组宿主细胞。
用于本发明的微生物细胞的有效培养条件包括但不限于允许脂质生产的有效培养基、生物反应器、温度、pH和氧气条件。有效培养基是指通常培养微生物细胞的任何培养基。此类培养基通常包括具有可同化的碳源、氮源和磷酸盐源以及适当的盐、矿物质、金属和其他营养物(例如维生素)的水性培养基。用于本发明的微生物细胞可以在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微量滴定皿和陪替氏平皿中培养。在一些实施方式中，培养在适合于重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。
在一些实施方式中，微生物细胞能够在12g/L或更低、5g/L或更低、或3g/L或更低氯化钠的盐度水平下生长。
在一些实施方式中，微生物细胞产生包含ω-3PUFA和/或ω-6PUFA的脂质。在一些实施方式中，微生物细胞产生包含DHA、DPA(n-3)、DPA(n-6)、EPA、花生四烯酸(ARA)等以及它们的组合的脂质。产生包含PUFA的脂质的微生物的非限制性示例在上文中公开，并且也在美国专利号5,340,594、5,340,742和5,583,019中发现，这些美国专利的每一个美国专利都全文以引用方式并入本文。
在一些实施方式中，微生物细胞包含按重量计至少30％的脂质、按重量计至少35％的脂质、按重量计至少40％的脂质、按重量计至少50％的脂质、按重量计至少60％的脂质、按重量计至少70％的脂质、或按重量计至少80％的脂质。在一些实施方式中，用于本发明的微生物细胞能够产生至少0.1克/升/小时(g/L/h)的DHA、至少0.2g/L/h的DHA、至少0.3g/L/h的DHA、或至少0.4g/L/h的DHA。
方法
本发明的方法包括裂解微生物细胞组合物或细胞生物质以形成裂解的细胞组合物。如本文所用，术语“细胞生物质”是指微生物细胞群。如本文所用，术语“裂解”是指使细胞的细胞壁和/或细胞膜破裂的过程。在一些实施方式中，裂解包括例如以下方法：机械处理、化学处理、酶促处理、物理处理，或它们的组合。在各种实施方式中，通过添加能够破坏微生物细胞的细胞壁的酶来进行裂解。
如本文所用，“机械处理”包括但不限于均化细胞、向细胞施加超声波、冷压细胞、研磨细胞等，以及它们的组合。在一些实施方式中，该方法包括通过均质化裂解细胞。在一些实施方式中，该方法包括使用均化器裂解细胞。
均化细胞可包括但不限于利用法国压力细胞压榨机、超声波仪、均化器、球磨机、棒磨机、砾磨机、珠磨机、高压研磨辊、立式轴冲击器、工业搅拌机、高剪切混合器、桨式混合器、polytron均化器等，以及它们的组合的方法。在一些实施方式中，使细胞流经任选被加热的均化器。在一些实施方式中，合适的均化可包括在高压和/或低压下1至3次通过均化器。在一些实施方式中，均化期间的压力可以是150巴至1,400巴、150巴至1,200巴、150巴至900巴、150巴至300巴、300巴至1,400巴、300巴至1,200巴、300巴至900巴、400巴至800巴、500巴至700巴、或600巴。
如本文所用，物理处理可包括但不限于加热细胞、干燥细胞等，以及它们的组合。
加热细胞可包括但不限于电阻加热、对流加热、蒸汽加热、流体浴加热、太阳能加热、聚焦太阳能加热等，这些中任何一种都可以在槽、池、试管、导管、烧瓶或其他包封装置中执行。在一些实施方式中，在槽中加热细胞，该槽在其壁中/壁上包括电阻线圈。在一些实施方式中，在液体浴中加热细胞，该液体浴包括穿过其中的管道。在一些实施方式中，在具有夹套加热的槽中加热细胞，该槽是在槽周围使用加热“夹套”的槽，加热流体通过该加热“夹套”循环。
干燥细胞可以包括但不限于暴露于气流、暴露于热(例如，对流热、受热表面等)、暴露于太阳能、冷冻干燥(冻干)、喷雾干燥，以及它们的组合。在一些实施方式中，干燥包括将细胞施加至任选地被加热的转鼓上。
如本文所用，化学处理包括但不限于升高或降低细胞或细胞组合物的pH、使细胞或细胞组合物与合适的化学物质接触等。
提高细胞或细胞组合物的pH可包括但不限于向细胞组合物中添加碱。在一些实施方式中，适用于本发明的碱包括但不限于氢氧化物碱(例如，LiOH、NaOH、KOH、Ca(OH)2等，以及它们的组合)、碳酸盐碱(例如，Na2CO3、K2CO3、MgCO3等，以及它们的组合)、碳酸氢盐碱(例如，LiHCO3、NaHCO3、KHCO3等，以及它们的组合)，以及它们的组合。碱可以是固体(例如，晶体、颗粒、丸粒等)或液体(例如，水溶液、醇溶液，例如甲醇、乙醇、丙醇等中的氢氧化物碱)以及它们的组合的形式。在一些实施方式中，将细胞组合物的pH升高至8或以上、9或以上、10或以上、11或以上、12或以上，或7至13、7至12、7至11、7至10、7至9、8至13、8至12、8至11、8至10、8至9、9至12、9至11、9至10、10至12、或10至11的pH。
在一些实施方式中，提高细胞的pH可包括但不限于执行氯碱工艺。在一些实施方式中，对含有氯化钠和细胞组合物的发酵液进行电解，这将导致氢氧化钠的形成。氢氧化钠的形成提高了细胞的pH。在一些实施方式中，发酵液可包含氯化钙或氯化钾代替氯化钠或作为氯化钠的补充。对这种发酵液进行电解分别导致氢氧化钙或氢氧化钾的形成，从而提高了细胞的pH。
酶促裂解是指通过使细胞与一种或多种酶接触来裂解细胞的细胞壁或细胞膜。适用于本发明的酶包括但不限于β-葡聚糖酶、木聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶、几丁质酶、果胶酶，以及它们的组合。蛋白酶的非限制性示例包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、碱性蛋白酶(alacase)，以及它们的组合。纤维素酶的非限制性示例包括蔗糖酶、麦芽糖酶、乳糖酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、淀粉酶、溶菌酶、神经氨酸苷酶、半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、葡糖醛酸酶、透明质酸酶、支链淀粉酶、葡糖脑苷脂酶、半乳糖神经酰胺酶、乙酰半乳糖胺酶、岩藻糖苷酶、己糖胺酶、艾杜糖醛酸酶、麦芽糖酶-葡糖淀粉酶，以及它们的组合。几丁质酶的非限制性示例包括壳三糖酶。果胶酶的非限制性示例包括果胶解离酶(pectolyase)、果胶裂解酶(pectozyme)、聚半乳糖醛酸酶，以及它们的组合。在一些实施方式中，一些酶通过加热被激活。在一些实施方式中，酶选自β-葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶，以及它们的组合。在一些实施方式中，酶是
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如本文所用，“裂解的细胞组合物”是指这样的组合物，该组合物包含一个或多个裂解的细胞与脂质(来自裂解的细胞)以及任选的含有微生物细胞的培养液的组合，该一个或多个裂解的细胞包括细胞碎片和其它细胞内含物。在一些实施方式中，微生物细胞被包含在包含微生物细胞和水的发酵液或培养基中。在一些实施方式中，裂解的细胞组合物是指包含一个或多个裂解的细胞、细胞碎片、脂质、细胞的天然内含物和来自培养液的水性组分的组合物。在一些实施方式中，裂解的细胞组合物是水包油乳液形式，所述乳液包含连续水相和分散脂质相的混合物。在一些实施方式中，分散的脂质相以按乳化的裂解细胞组合物的重量计1％至60％、1％至50％、1％至40％、1％至30％、1％至20％、5％至60％、5％至50％、5％至40％、5％至30％、5％至20％、10％至60％、10％至50％、10％至40％、20％至60％、20％至50％、20％至40％、30％至60％、30％至50％、或40％至60％的浓度存在。
虽然不受任何特定理论的束缚，但是据信本发明的方法将乳化的裂解细胞组合物破碎或破乳，从而允许脂质从裂解的细胞组合物中分离出来。如本文所用，术语“乳液”和“乳化的”是指两种或更多种不混溶的相或层的混合物，其中一个相或层分散在另一个相或层中。如本文所用，术语“破碎”、“破乳”、和“破裂”是指分离乳液的不混溶相或层的过程。例如，破乳或破碎乳化的裂解细胞组合物是指乳化的裂解细胞组合物从具有一个或多个相或层的乳液变为具有两个或更多个相或层的组合物的过程。例如，在一些实施方式中，本发明的方法将乳化的裂解细胞组合物从单相破碎成两个或更多个相。在一些实施方式中，两个或更多个相包括脂质相和水相。在一些实施方式中，本发明的方法将乳化的裂解细胞组合物从一个或多个相破碎成至少三个相。在一些实施方式中，该三个相包括脂质相、水相和固相。在一些实施方式中，该三个相包括脂质相、乳液相和水相。
在一些实施方式中，本发明的方法通过去除或破碎至少75％的乳液、至少80％的乳液、至少85％的乳液、至少90％的乳液、至少95％的乳液、至少99％的乳液来对裂解的细胞组合物进行破乳以形成经破乳的细胞组合物。在一些实施方式中，本发明的方法通过去除或破碎按重量或体积计75％的乳液至99％的乳液、75％的乳液至95％的乳液、75％的乳液至90％的乳液、75％的乳液至85％的乳液、75％的乳液至80％的乳液、80％的乳液至99％的乳液、80％的乳液至95％的乳液、80％的乳液至90％的乳液、80％的乳液至85％的乳液、85％的乳液至99％的乳液、85％的乳液至95％的乳液、85％的乳液至90％的乳液、90％的乳液至99％的乳液、90％的乳液至95％的乳液、或95％的乳液至99％的乳液来对裂解的细胞组合物进行破乳。
在一些实施方式中，在裂解细胞之前，可以洗涤细胞和/或对细胞进行巴氏灭菌。
在一些实施方式中，洗涤细胞包括使用水溶液，例如水，以去除任何细胞外水溶性或水分散性化合物。在一些实施方式中，细胞可以洗涤一次、两次、三次或更多次。在一些实施方式中，对细胞进行巴氏灭菌包括将细胞加热至足以灭活任何不需要的酶或激活任何需要的酶的温度，所述酶是例如任何可能降解脂质或降低PUFA产量的酶。在一些实施方式中，巴氏灭菌温度是约60℃至约80℃。在一些实施方式中，可以首先洗涤细胞，然后进行巴氏灭菌。
在一些实施方式中，本发明的方法包括提高细胞组合物的pH以裂解和/或破乳细胞组合物。在一些实施方式中，本发明的方法包括提高裂解的细胞组合物的pH以使裂解的细胞组合物破乳。在一些实施方式中，提高pH包括使细胞组合物或裂解的细胞组合物与碱接触。在一些实施方式中，本发明的方法包括使裂解的细胞组合物与碱接触以对裂解的细胞组合物进行破乳。如本文所用，“接触”是指将细胞组合物或裂解的细胞组合物与第二组合物组合(例如，通过向细胞组合物或裂解的细胞组合物中添加组合物，通过向组合物中添加细胞组合物或裂解的细胞组合物，等等)。如本文所用，“组合物”可包含纯材料或包含两种或更多种材料、物质、赋形剂、部分等的组合。使裂解的细胞组合物与第一种碱接触提高了裂解的细胞组合物的pH。
在一些实施方式中，使裂解的细胞组合物与第一碱接触达某一时间段，之后与第一酸接触达某一时间段，然后加热、搅动或它们的组合，随后与第二碱或后续碱接触，之后与第二酸或后续酸接触，以提供破乳的组合物。
在一些实施方式中，碱的pKb是1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、3至10、3至6、3至5、4至10、4至8、4至6、5至10、或5至8。如本文所用，术语“pKb”是指碱基的缔合常数Kb的负对数。Kb是指碱在水中电离的平衡常数。
适用于本发明的碱包括但不限于氢氧化物碱(例如，LiOH、NaOH、KOH、Ca(OH)2等，以及它们的组合)、碳酸盐碱(例如，Na2CO3、K2CO3、MgCO3等，以及它们的组合)、碳酸氢盐碱(例如，LiHCO3、NaHCO3、KHCO3等，以及它们的组合)，以及它们的组合。碱可以是固体(例如，晶体、颗粒、丸粒等)或液体(例如，水溶液、醇溶液，例如甲醇、乙醇、丙醇等中的氢氧化物碱)以及它们的组合的形式。因此，溶剂可以任选地存在于用于本发明的碱中。如本文所用，“溶剂”是指疏水或亲脂性的试剂。如本文所用，“疏水性的”是指被大量水排斥的试剂。如本文所用，“亲脂性”是指溶解在脂质中的试剂。
在一些实施方式中，使细胞组合物或裂解的细胞组合物与碱接触提高了裂解的细胞组合物的pH。在一些实施方式中，使裂解的细胞组合物与碱接触将裂解的细胞组合物的pH升高至9或以上、10或以上、11或以上、12或以上、或约9至约14、约9至约13.5、约9至约13、约9至约12.5、约9至约12、约9至约11.5、约9至约11、约9至约10.5、约9至约10、约9至约9.5、约9.5至约14、约9.5至约13.5、约9.5至约13、约9.5至约12.5、约9.5至约12、约9.5至约11.5、约9.5至约11、约9.5至约10.5、约9.5至约10、约10至约14、约10至约13.5、约10至约13、约10至约12.5、约10至约12、约10至约11.5、约10至约11、约10至约10.5、约10.5至约14、约10.5至约13.5、约10.5至约13、约10.5至约12.5、约10.5至约12、约10.5至约11.5、约10.5至约11、约11至约14、约11至约13.5、约11至约13、约11至约12.5、约11至约12、约11至约11.5、约11.5至约14、约11.5至约13.5、约11.5至约13、约11.5至约12.5、约11.5至约12、约12至约14、约12至约13.5、约12至约13、约12至约12.5、约12.5至约14、约12.5至约13.5、约12.5至约13、约13至约14、约13至约13.5、或约13.5至约14的pH。
在一些实施方式中，碱以按重量(或体积)计为细胞培养液的约2％至约10％、约2％至约9％、约2％至约8％、约2％至约7％、约2％至约6％、约3％至约6％、约4％至约6％、约5％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％、约2％至约3％、约3％至约5％、约3％至约4％、或约4％至约5％的量添加，以提高pH。
在一些实施方式中，通过添加酸来降低pH。在一些实施方式中，酸的pKa是1至12、1至10、1至8、1至6、1至5、2至12、2至10、2至8、2至6、2至5、3至10、3至6、3至5、4至10、4至8、4至6、5至10、或5至8。如本文所用，术语“pKa”是指酸的碱基缔合常数Ka的负对数。Ka是指酸在水中电离的平衡常数。
酸包括但不限于硫酸；磷酸；盐酸；氢溴酸；氢碘酸；次氯酸；亚氯酸；氯酸；高氯酸；氟磺酸；硝酸；氟锑酸；氟硼酸；六氟磷酸；铬酸；硼酸；醋酸；柠檬酸；甲酸；以及它们的组合。在一些实施方式中，pH选自约6.5或更低；约6或更低；约5.5或更低；约5或更低；约4.5或更低；约4或更低；约3.5或更低；约3或更低；约2.5或更低；约2或更低；约1.5或更低；约1或更低；以及约0.5或更低。在其他实施方式中，pH选自约0.5至约6.5；约0.5至约6；约0.5至约5.5；约0.5至约5；约0.5至约4.5；约0.5至约4；约0.5至约3.5；约0.5至约3；约0.5至约2.5；约0.5至约2；约0.5至约1.5；约0.5至约1；约1至约7；约1至约6.5；约1至约6；约1至约5.5；约1至约5；约1至约4.5；约1至约4；约1至约3.5；约1至约3；约1至约2.5；约1至约2；约1至约1.5；约1.5至约7；约1.5至约6.5；约1.5至约6；约1.5至约5.5；约1.5至约5；约1.5至约4.5；约1.5至约4；约1.5至约3.5；约1.5至约3；约1.5至约2.5；约1.5至约2；约2至约7；约2至约6.5；约2至约6；约2至约5.5；约2至约5；约2至约4.5；约2至约4、约2至约3.5；约2至约3；约2至约2.5；约2.5至约7；约2.5至约6.5；约2.5至约6；约2.5至约5.5；约2.5至约5；约2.5至约4.5；约2.5至约4；约2.5至约3.5；约2.5至约3；约3至约7；约3至约6.5；约3至约6；约3至约5.5；约3至约5；约3至约4.5；约3至约4；约3至约3.5；约3.5至约7；约3.5至约6.5；约3.5至约6；约3.5至约5.5；约3.5至约5；约3.5至约4.5；约3.5至约4；约4至约7；约4至约6.5；约4至约6；约4至约5.5；约4至约5；约4至约4.5；约4.5至约7；约4.5至约6.5；约4.5至约6；约4.5至约5.5；约4.5至约5；约5至约7；约5至约6.5；约5至约6；约5至约5.5；约5.5至约7；约5.5至约6.5；约5.5至约6；以及约6至约6.5。
在一些实施方式中，酸以按重量(或体积)计为细胞培养液的约0.5％至约1％、约1％至约2％、约2％至约10％、约2％至约9％、约2％至约8％、约2％至约7％、约2％至约6％、约3％至约6％、约4％至约6％、约5％至约6％、约2％至约5％、约2％至约4％、约2％至约3％、约3％至约5％、约3％至约4％、或约4％至约5％的量添加，以降低pH值。
在一些实施方式中，该方法包括将细胞组合物或裂解的细胞组合物与盐接触，以促进裂解的细胞组合物的破乳。如本文所用，“盐”是指通过用金属(例如，碱金属、碱土金属、过渡金属等)或带正电荷的化合物(例如，NH4 +等)取代来自酸的氢离子而形成的离子化合物。适用于本发明的盐包括但不限于碱金属盐、碱土金属盐等，以及它们的组合。用于本发明的盐中存在的带负电荷的离子物质包括但不限于卤化物、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、碳酸盐、碳酸氢盐等，以及它们的组合。在一些实施方式中，用于本发明的盐选自：氯化钠、硫酸钠、碳酸钠、氯化钙、硫酸钾、硫酸镁、谷氨酸单钠、硫酸铵、氯化钾、氯化铁、硫酸铁、硫酸铝，以及它们的组合。在一些实施方式中，盐不包括NaOH。盐可以以固体(例如，结晶、无定形、丸状和/或颗粒状形式)和/或以包含例如水、醇等的溶液(例如，稀溶液、饱和溶液、或超饱和溶液)以及它们的组合的形式加入。
在一些实施方式中，盐以5g/l至25g/l、5g/l至10g/l、10g/l至15g/l、15g/l至20g/l、20g/l至25g/l、或10g/l至20g/l的量添加。
在一些实施方式中，当添加盐来对细胞组合物或裂解的细胞组合物进行破乳时，细胞组合物或裂解的细胞组合物的温度小于或等于60℃、小于或等于55℃、小于或等于45℃、小于或等于40℃、小于或等于35℃、小于或等于30℃、或小于或等于25℃。在一些实施方式中，当添加盐来对细胞组合物或裂解的细胞组合物进行破乳时，裂解的细胞组合物的温度是0℃至60℃、0℃至55℃、0℃至50℃、0℃至45℃、0℃至40℃、0℃至35℃、0℃至30℃、0℃至25℃、20℃至60℃、20℃至55℃、20℃至50℃、20℃至45℃、20℃至40℃、20℃至35℃、20℃至30℃、30℃至60℃、30℃至55℃、30℃至50℃、30℃至45℃、30℃至40℃、30℃至40℃、40℃至60℃、40℃至55℃、40℃至50℃、或50℃至60℃。
在一些实施方式中，该方法包括在pH冲击循环中的一个或多个pH冲击循环之前、期间或之后的温度冲击循环。“温度冲击循环”在本文中是指将细胞组合物或裂解的细胞组合物升高至约80℃、约85℃、约90℃、约95℃或更高的温度达某一时间段(例如，约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长时间)然后降低至约30℃、约25℃、约20℃、约15℃、约10℃、约5℃、或约4℃的温度达某一时间段(例如，约5分钟、约10分钟、约20分钟、约30分钟、约50分钟、约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、约3小时或更长时间)以促进破乳。在一些实施方式中，温度冲击循环发生在pH冲击循环之前。在其他实施方式中，温度冲击循环发生在pH冲击循环中的两个或更多个pH冲击循环之间。
在一些实施方式中，该方法包括使细胞组合物或裂解的细胞组合物与按裂解的细胞组合物或细胞组合物的重量计20％或更少、15％或更少、10％或更少、7.5％或更少、5％或更少、或2％或更少的盐接触。在一些实施方式中，一种方法包括使细胞组合物或裂解的细胞组合物与按细胞组合物或裂解的细胞组合物的重量(例如，总培养液重量)计0.1％至20％、0.1％至15％、0.1％至10％、0.5％至20％、0.5％至15％、0.5％至10％、0.5％至5％、0.5％至4％、0.5％至3％、0.5％至2.5％、0.5％至2％、0.5％至1.5％、0.5％至1％、1％至20％、1％至15％、1％至10％,1％至5％、1％至4％、1％至3％、1％至2.5％、1％至2％、1％至1.5％、1.5％至5％、1.5％至4％、1.5％至3％、1.5％至2.5％、1.5％至2％、2％至20％、2％至15％、2％至10％、2％至5％、2％至4％、2％至3％、2％至2.5％、2.5％至5％、2.5％至4％、2.5％至3％、3％至5％、3％至4％、4％至5％、5％至20％、5％至15％、5％至10％、10％至20％、10％至15％、或15％至20％的盐接触。例如，当裂解的细胞组合物重1,000kg时，与按重量计0.5％至20％的盐接触需要将5kg至200kg的盐与裂解的细胞组合物混合。
在一些实施方式中，该方法包括加热细胞组合物或裂解的细胞组合物以对裂解的细胞组合物进行破乳。在一些实施方式中，将细胞组合物或裂解的细胞组合物加热足够长的时间段，以使碱和/或盐对细胞组合物或裂解的细胞组合物进行破乳。在一些实施方式中，该方法包括加热细胞组合物或裂解的细胞组合物达至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少66小时、至少72小时、至少78小时、至少84小时、至少90小时或至少96小时。在一些实施方式中，该方法包括加热裂解的细胞组合物达5分钟至96小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时、5分钟至1小时、10分钟至4小时、10分钟至2小时、10分钟至1小时、1小时至2小时、1小时至96小时、1小时至84小时、1小时至72小时、1小时至60小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至4小时、4小时至96小时、4小时至84小时、4小时至72小时、4小时至60小时、4小时至48小时、4小时至36小时、4小时至24小时、8小时至96小时、8小时至84小时、8小时至72小时、8小时至60小时、8小时至48小时、8小时至36小时、8小时至24小时、8小时至12小时、12小时至96小时、12小时至84小时、12小时至72小时、12小时至60小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、24小时至96小时、24小时至84小时、24小时至72小时、24小时至60小时、24小时至48小时、或24小时至36小时。
在一些实施方式中，可以在至少10℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、或至少100℃的温度下加热细胞组合物或裂解的细胞组合物。在一些实施方式中，方法包括在10℃至100℃、10℃至90℃、10℃至80℃、10℃至70℃、20℃至100℃、20℃至90℃、20℃至80℃、20℃至70℃、30℃至100℃、30℃至90℃、30℃至80℃、30℃至70℃、40℃至100℃、40℃至90℃、40℃至80℃、50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、60℃至100℃、60℃至90℃、60℃至80℃、70℃至100℃、70℃至90℃、80℃至100℃、80℃至90℃、或90℃至100℃的温度下加热细胞组合物或裂解的细胞组合物。在一些实施方式中，在加热期间，可以向细胞组合物或裂解的细胞组合物中添加盐。
在一些实施方式中，细胞组合物或裂解的细胞组合物可以在封闭系统或具有蒸发器的系统中加热。在一些实施方式中，细胞组合物或裂解的细胞组合物可以在具有蒸发器的系统中加热，使得存在于细胞组合物或裂解的细胞组合物中的水中的一部分水通过蒸发去除。在一些实施方式中，一种方法包括在具有蒸发器的系统中加热细胞组合物或裂解的细胞组合物，以去除细胞组合物或裂解的细胞组合物中存在的按重量计高达1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的水。在一些实施方式中，一种方法包括在具有蒸发器的系统中加热细胞组合物或裂解的细胞组合物，以去除1％至50％、1％至45％、1％至40％、1％至35％、1％至30％、1％至25％、1％至20％、1％至15％、1％至10％、1％至5％、5％至50％、5％至45％、5％至40％、5％至35％、5％至30％、5％至25％、5％至20％、5％至15％、5％至10％、10％至50％、10％至45％、10％至40％、10％至35％、10％至30％、10％至25％、10％至20％、10％至15％、15％至50％、15％至45％、15％至40％、15％至35％、15％至30％、15％至25％、15％至20％、20％至50％、20％至45％、20％至40％、20％至35％、20％至30％、20％至25％、25％至50％、25％至45％、25％至40％、25％至35％、25％至30％、30％至50％、30％至45％、30％至40％、30％至35％、35％至50％、35％至45％、35％至40％、40％至50％、40％至45％、或45％至50％。
在一些实施方式中，该方法包括将细胞组合物或裂解的细胞组合物在容器中保持预定时间，以对裂解的细胞组合物进行破乳。在一些实施方式中，该方法包括将细胞组合物或裂解的细胞组合物在容器中保持至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少66小时、至少72小时、至少78小时、至少84小时、至少90小时或至少96小时。在一些实施方式中，该方法包括将细胞组合物或裂解的细胞组合物在循环中的每个pH水平下保持5分钟至96小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时、5分钟至1小时、10分钟至4小时、10分钟至2小时、10分钟至1小时、1小时至96小时、1小时至84小时、1小时至72小时、1小时至60小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至4小时、1小时至2小时、4小时至96小时、4小时至84小时、4小时至72小时、4小时至60小时、4小时至48小时、4小时至36小时、4小时至24小时、8小时至96小时、8小时至84小时、8小时至72小时、8小时至60小时、8小时至48小时、8小时至36小时、8小时至24小时、8小时至12小时、12小时至96小时、12小时至84小时、12小时至72小时、12小时至60小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、24小时至96小时、24小时至84小时、24小时至72小时、24小时至60小时、24小时至48小时、或24小时至36小时。
在一些实施方式中，该方法包括任选地在巴氏灭菌之前和/或之后，将裂解的细胞乳液与抗氧化剂接触。适用于本发明的抗氧化剂包括但不限于生育酚、生育三烯酚、多酚、白藜芦醇、类黄酮、类胡萝卜素、番茄红素、胡萝卜素、叶黄素、抗坏血酸、棕榈酸抗坏血酸酯等，以及它们的组合。
如本文所用，术语“搅动”是指通过施加力影响裂解的细胞组合物中的运动的过程。在一些实施方式中，本发明的方法包括通过搅拌、混合、共混、振荡、振动或它们的组合来搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物。在一些实施方式中，搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物的过程使细胞组合物或裂解的细胞组合物破乳。
在一些实施方式中，本发明的方法包括以0.1hp/1,000gal裂解的细胞组合物至10hp/1,000gal裂解的细胞组合物、0.5hp/1,000gal裂解的细胞组合物至8hp/1,000gal裂解的细胞组合物、1hp/1,000gal裂解的细胞组合物至6hp/1,000gal裂解的细胞组合物、或2hp/1,000gal裂解的细胞组合物至5hp/1,000gal的裂解的细胞组合物搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物。
在一些实施方式中，本发明的方法包括使用搅拌器搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物。在一些实施方式中，搅拌器是分散型搅拌器，该分散型搅拌器将碱和/或盐分散在细胞组合物或裂解的细胞组合物中。在一些实施方式中，搅拌器具有一个或多个叶轮。如本文所用，“叶轮”是指被布置成当旋转时将运动传递给细胞组合物或裂解的细胞组合物的装置。适用于本发明的叶轮包括直叶片叶轮、拉什顿叶片叶轮、轴流式叶轮、径流式叶轮、凹叶片盘式叶轮、高效叶轮、螺旋桨、桨叶、涡轮机等，以及它们的组合。在一些实施方式中，一种方法包括使用搅拌器搅拌细胞组合物或裂解的细胞组合物，该搅拌器具有90ft/min至1,200ft/min、200ft/min至1,000ft/min、300ft/min至800ft/min、400ft/min至700ft/min、或500ft/min至600ft/min的叶轮尖端速度。在一些实施方式中，一种方法包括使用搅拌器搅拌细胞组合物或裂解的细胞组合物，该搅拌器具有350厘米/秒至900厘米/秒、350厘米/秒至850厘米/秒、350厘米/秒至800厘米/秒、350厘米/秒至750厘米/秒、350厘米/秒至700厘米/秒、350厘米/秒至650厘米/秒、350厘米/秒至600厘米/秒、350厘米/秒至550厘米/秒、350厘米/秒至500厘米/秒、350厘米/秒至450厘米/秒、350厘米/秒至400厘米/秒、400厘米/秒至900厘米/秒、400厘米/秒至850厘米/秒、400厘米/秒至800厘米/秒、400厘米/秒至750厘米/秒、400厘米/秒至700厘米/秒、400厘米/秒至650厘米/秒、400厘米/秒至600厘米/秒、400厘米/秒至550厘米/秒、400厘米/秒至500厘米/秒、400厘米/秒至450厘米/秒、450厘米/秒至900厘米/秒、450厘米/秒至850厘米/秒、450厘米/秒至800厘米/秒、450厘米/秒至750厘米/秒、450厘米/秒至700厘米/秒、450厘米/秒至650厘米/秒、450厘米/秒至600厘米/秒、450厘米/秒至550厘米/秒、450厘米/秒至500厘米/秒、500厘米/秒至900厘米/秒、500厘米/秒至850厘米/秒、500厘米/秒至800厘米/秒、500厘米/秒至750厘米/秒、500厘米/秒至700厘米/秒、500厘米/秒至650厘米/秒、500厘米/秒至600厘米/秒、500厘米/秒至550厘米/秒、550厘米/秒至900厘米/秒、550厘米/秒至850厘米/秒、550厘米/秒至800厘米/秒、550厘米/秒至750厘米/秒、550厘米/秒至700厘米/秒、550厘米/秒至650厘米/秒、550厘米/秒至600厘米/秒、600厘米/秒至900厘米/秒、600厘米/秒至850厘米/秒、600厘米/秒至800厘米/秒、600厘米/秒至750厘米/秒、600厘米/秒至700厘米/秒、600厘米/秒至650厘米/秒、650厘米/秒至900厘米/秒、650厘米/秒至850厘米/秒、650厘米/秒至800厘米/秒、650厘米/秒至750厘米/秒、650厘米/秒至700厘米/秒、700厘米/秒至900厘米/秒、700厘米/秒至850厘米/秒、700厘米/秒至800厘米/秒、700厘米/秒至750厘米/秒、750厘米/秒至900厘米/秒、750厘米/秒至850厘米/秒、750厘米/秒至800厘米/秒、800厘米/秒至900厘米/秒、800厘米/秒至850厘米/秒、或850厘米/秒至900厘米/秒的叶轮尖端速度。如本文所用，“叶轮尖端速度”是指当叶轮围绕其中心轴线旋转时，叶轮最外侧部分的速度。
在一些实施方式中，搅动(和任选地如本文所述的附加步骤)在包括叶轮的容器中执行，其中叶轮直径与容器体积的比率为0.1至0.5、0.1至0.4、0.2至0.5、0.2至0.4、0.3至0.5、或0.3至0.4。
在一些实施方式中，搅动(和任选地如本文所述的附加步骤)在包括叶轮的容器中进行，其中叶轮直径与容器内径的比率是至少0.25、至少0.34、至少0.65、0.25至0.65、0.25至0.33、0.3至0.6、0.3至0.5、0.3至0.4、0.34至0.65、0.34至0.6、0.34至0.55、0.37至0.55、0.4至0.65、0.4至0.6、0.4至0.5、或0.42至0.55。
在一些实施方式中，搅动包括混合细胞组合物或裂解的细胞组合物，使得细胞组合物或裂解的细胞组合物置于由雷诺数为10至10,000、1,000至10,000、1,500至10,000、或2,000至10,000所描述的流动条件下。在一些实施方式中，搅动期间裂解的细胞乳液的雷诺数是2,000或更高、3,000或更高、或5,000或更高、或2,000至10,000、3,000至10,000、或5,000至10,000。
在一些实施方式中，一种方法包括搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物达至少5分钟、至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少8小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时、至少30小时、至少36小时、至少42小时、至少48小时、至少54小时、至少60小时、至少66小时、至少72小时、至少78小时、至少84小时、至少90小时或至少96小时。在一些实施方式中，一种方法包括搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物达5分钟至96小时、5分钟至4小时、5分钟至2小时、5分钟至1小时、10分钟至4小时、10分钟至2小时、10分钟至1小时、1小时至96小时、1小时至84小时、1小时至72小时、1小时至60小时、1小时至48小时、1小时至36小时、1小时至24小时、1小时至4小时、4小时至96小时、4小时至84小时、4小时至72小时、4小时至60小时、4小时至48小时、4小时至36小时、4小时至24小时、8小时至96小时、8小时至84小时、8小时至72小时、8小时至60小时、8小时至48小时、8小时至36小时、8小时至24小时、8小时至12小时、12小时至96小时、12小时至84小时、12小时至72小时、12小时至60小时、12小时至48小时、12小时至36小时、12小时至24小时、20小时至40小时、24小时至96小时、24小时至84小时、24小时至72小时、24小时至60小时、24小时至48小时、或24小时至36小时。
在一些实施方式中，一种方法包括同时搅动和加热细胞组合物或裂解的细胞组合物，以使细胞组合物或裂解的细胞组合物破乳。在一些实施方式中，一种方法包括在至少10℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、或至少100℃的温度下搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物。在一些实施方式中，一种方法包括在10℃至100℃、10℃至90℃、10℃至80℃、10℃至70℃、20℃至100℃、20℃至90℃、20℃至80℃、20℃至70℃、30℃至100℃、30℃至90℃、30℃至80℃、30℃至70℃、40℃至100℃、40℃至90℃、40℃至80℃、50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、60℃至100℃、60℃至90℃、60℃至80℃、70℃至100℃、70℃至90℃、80℃至1000℃、80℃至90℃、或90℃至100℃的温度下搅动细胞组合物或裂解的细胞组合物。
在一些实施方式中，形成裂解的细胞组合物、使裂解的细胞组合物与第一碱接触或提高裂解的细胞组合物的pH、使裂解的细胞组合物与盐接触、加热裂解的细胞组合物和搅动裂解的细胞组合物的各种组合可以在单一容器中进行。在一些实施方式中，形成细胞组合物、使细胞组合物与碱接触或提高细胞组合物的pH、使细胞组合物与盐接触、加热细胞组合物和搅动细胞组合物的各种组合可以在单一容器中进行。在一些实施方式中，单一容器包括发酵容器。在一些实施方式中，发酵容器可以具有至少20,000升、至少50,000升、至少100,000升、至少120,000升、至少150,000升、至少200,000升、或至少220,000升的体积。在一些实施方式中，发酵容器可以具有20,000升至220,000升、20,000升至100,000升、20,000升至50,000升、50,000升至220,000升、50,000升至150,000升、50,000升至100,000升、100,000升至220,000升、100,000升至150,000升、100,000升至120,000升、150,000升至220,000升、150,000升至200,000升、或200,000升至220,000升的体积。
在一些实施方式中，可以将容器中形成的一定量的细胞组合物或裂解的细胞组合物转移到一个或多个搅动容器中。在一些实施方式中，搅动容器可以具有至少20,000升、至少30,000升、至少40,000升或至少50,000升、至少100,000升、至少150,000升、至少200,000升或更高的体积。在一些实施方式中，搅动容器可以具有20,000升至50,000升、20,000升至40,000升、20,000升至30,000升、30,000升至50,000升、30,000升至40,000升或40,000升至50,000升或更高的体积。
在一些实施方式中，搅动容器可以具有以下特性的任意组合。在一些实施方式中，搅动容器可以具有两个叶轮。在一些实施方式中，叶轮是拉什顿叶片叶轮。在一些实施方式中，叶轮彼此分开至少等于最小叶轮直径的距离。在一些实施方式中，叶轮从尖端到尖端是30英寸至40英寸、33英寸至37英寸、33英寸、34英寸、35英寸、36英寸或37英寸。在一些实施方式中，搅动容器具有至少10,000升、至少20,000升、至少30,000升、至少40,000升或至少50,000升的体积。在一些实施方式中，搅动容器的内径是90英寸至110英寸、95英寸至105英寸、98英寸、99英寸、100英寸、101英寸、或102英寸。在一些实施方式中，第一叶轮位于距搅动容器底部15英寸至20英寸、16英寸至19英寸、或17英寸至18英寸处，第二叶轮位于第一叶轮上方60英寸至80英寸、65英寸至75英寸、68英寸、69英寸、70英寸、71英寸、72英寸、73英寸、74英寸、或75英寸处。在一些实施方式中，将裂解的细胞组合物以至少50rpm、至少60rpm、或至少70rpm搅动。在一些实施方式中，将裂解的细胞组合物以50rpm至70rpm、50rpm至60rpm、60rpm至70rpm、70rpm至100rpm、100rpm至150rpm、150rpm至200rpm、200rpm至250rpm或更高的速度搅动。
在一些实施方式中，通过从容器中泵送细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质，从该容器中收获细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质。在一些实施方式中，在不搅动容器的情况下，从容器中收获细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质。在一些实施方式中，通过在不搅动的情况下从容器中泵送细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质而从该容器中收获细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质。在一些实施方式中，细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质是在不吹气的情况下从容器中收获的。在一些实施方式中，通过上述技术收获细胞组合物、裂解的细胞组合物或脂质，产生了具有低茴香胺值(例如，26或更小、25或更小、20或更小、15或更小、10或更小、5或更小、2或更小、或1或更小)和/或低磷含量(例如，100ppm或更小、95ppm或更小、90ppm或更小、85ppm或更小、80ppm或更小、75ppm或更小、70ppm或更小、65ppm或更小、60ppm或更小、55ppm或更小、50ppm或更小、45ppm或更小、40ppm或更小、35ppm或更小、30ppm或更小、25ppm或更小、20ppm或更小、15ppm或更小、10ppm或更小、5ppm或更小、4ppm或更小、3ppm或更小、2ppm或更小、或1ppm或更小)的粗制脂质。
在一些实施方式中，分离包括将经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物离心(例如，在30℃至100℃的温度下)，由此离心从经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物中分离出脂质。
在一些实施方式中，一种方法包括在至少10℃、至少20℃、至少25℃、至少30℃、至少35℃、至少40℃、至少45℃、至少50℃、至少55℃、至少60℃、至少65℃、至少70℃、至少75℃、至少80℃、至少85℃、至少90℃、至少95℃、或至少100℃的温度下离心经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物。在一些实施方式中，一种方法包括在10℃至100℃、10℃至90℃、10℃至80℃、20℃至100℃、20℃至90℃、20℃至80℃、25℃至100℃、25℃至90℃、25℃至80℃、25℃至75℃、30℃至100℃、30℃至90℃、30℃至80℃、40℃至100℃、40℃至90℃、40℃至80℃、50℃至100℃、50℃至90℃、50℃至80℃、50℃至70℃、60℃至100℃、60℃至90℃、60℃至80℃、60℃至70℃、70℃至100℃、或70℃至90℃的温度下离心经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物。
在一些实施方式中，离心是以1千克/分钟(kg/min)至500kg/min、1kg/min至400kg/min、1kg/min至300kg/min、1kg/min至200kg/min、1kg/min至100kg/min、1kg/min至75kg/min、1kg/min至50kg/min、1kg/min至40kg/min、1kg/min至30kg/min、1kg/min至25kg/min、1kg/min至10kg/min、10kg/min至500kg/min、10kg/min至400kg/min、10kg/min至300kg/min、10kg/min至200kg/min、10kg/min至100kg/min、10kg/min至75kg/min、10kg/min至50kg/min、10kg/min至40kg/min、10kg/min至30kg/min、20kg/min至500kg/min、20kg/min至400kg/min、20kg/min至300kg/min、20kg/min至200kg/min、20kg/min至100kg/min、20kg/min至75kg/min、20kg/min至50kg/min、20kg/min至40kg/min、25kg/min至500kg/min、25kg/min至400kg/min、25kg/min至300kg/min、25kg/min至200kg/min、25kg/min至100kg/min、25kg/min至75kg/min、25kg/min至50kg/min、30kg/min至60kg/min、30kg/min至50kg/min、30kg/min至40kg/min、50kg/min至500kg/min、100kg/min至500kg/min、或200kg/min至500kg/min的进料速率(经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物进入离心机)进行的。
分离所需的总时间可以取决于经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物的体积而变化。分离的典型总时间(例如，离心时间)是至少30秒、至少60秒、至少2分钟、至少3分钟、至少4分钟、至少5分钟、至少0.1小时、至少0.2小时、至少0.5小时、至少1小时、至少2小时、至少4小时、至少6小时、至少8小时、至少10小时、至少12小时、或0.1小时至24小时、0.5小时至24小时、1小时至12小时、2小时至10小时、或4小时至8小时。
在一些实施方式中，本发明的方法包括以1,000g至25,000g、1,000g至20,000g、1,000g至10,000g、2,000g至25,000g、2,000g至20,000g、2,000g至15,000g、3,000g至25,000g、3,000g至20,000g、5,000g至25,000g、5,000g至20,000g、5,000g至15,000g、5,000g至10,000g、5,000g至8,000g、10,000g至25,000g、15,000g至25,000g、或至少1,000g、至少2,000,g、至少4,000g、至少5,000g、至少7,000g、至少8,000g、至少10,000g、至少15,000g、至少20,000g、或至少25,000g的离心力离心经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物。如本文所用，“g”指标准重力或大约9.8m/s2。在一些实施方式中，本发明的方法包括以4,000rpm至14,000rpm、4,000rpm至10,000rpm、6,000rpm至14,000rpm、6,000rpm至12,000rpm、8,000rpm至14,000rpm、8,000rpm至12,000rpm、或8,000rpm至10,000rpm离心经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物。
在一些实施方式中，本发明的方法包括在从经处理的细胞组合物或经处理的裂解细胞组合物中分离出脂质后干燥脂质，以便从脂质中去除水。在一些实施方式中，干燥脂质可包括但不限于加热脂质以蒸发水分。在一些实施方式中，在干燥后，脂质的水含量为按脂质的重量百分比计小于3％、小于2.5％、小于2％、小于1.5％、小于1％、小于0.5％、小于0.1％、或0％。在一些实施方式中，在干燥后，脂质的水含量为按脂质的重量百分比计0％至3％、0％至2.5％、0％至2％、0％至1.5％、0％至1％、0％至0.5％、0.1％至3％、0.1％至2.5％、0.1％至2％、0.1％至1.5％、0.1％至1％、0.1％至0.5％、0.5％至3％、0.5％至2.5％、0.5％至2％、0.5％至1.5％、0.5％至1％、1％至3％、1％至2.5％、1％至2％、1％至1.5％、1.5％至3％、1.5％至2.5％、1.5％至2％、2％至3％、2％至2.5％、或2.5％至3％。
在一些实施方式中，该方法还包括通过选自碱炼(caustic refining)、脱胶、碱精炼(alkali-refining)、漂白、脱臭、脱酸等，以及它们的组合的一种或多种工艺来精炼脂质，以去除一种或多种磷脂(phospholipid)、游离脂肪酸、磷脂(phosphatide)、色素体、甾醇、臭味和其他杂质。如本文所用，“精炼油状物”是已精炼的粗制脂质或粗制油状物。在一些实施方式中，本发明的方法提高了由使用本发明萃取的脂质生产的RBD(经精炼、漂白、脱臭的)或RBDW(经精炼、漂白、脱臭和冬化的)油状物的产率。在各种实施方式中，在精制中的精炼、漂白、脱臭或冬化步骤中的一个或多个步骤中产率得以提高。
如本文所用，“粗制脂质”或“粗制油状物”是未被精炼的脂质或油状物。在一些实施方式中，从经破乳的细胞组合物中分离出的脂质是粗制脂质。
图1示意性地描述了本发明的各种示例性方法。
在一些实施方式中，本发明的方法包括浓缩包含微生物细胞的培养液和/或浓缩裂解的细胞组合物。如本文所用，“浓缩”是指从组合物中去除水。浓缩可包括但不限于蒸发、化学干燥、离心等，以及它们的组合。
在一些实施方式中，浓缩包含微生物细胞的培养液，以提供按培养液的重量计至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、或至少30％的脂质浓度。在一些实施方式中，浓缩包含微生物细胞的培养液以提供按培养液的重量计4％至40％、4％至30％、4％至20％、4％至15％、5％至40％、5％至30％、5％至20％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、15％至40％、15％至30％、20％至40％、20％至30％、25％至40％、或30％至40％的脂质浓度。
在一些实施方式中，浓缩细胞组合物或裂解的细胞组合物，以提供按裂解的细胞组合物的重量计至少4％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、或至少55％的脂质浓度。在一些实施方式中，浓缩细胞组合物或裂解的细胞组合物以提供按裂解的细胞组合物的重量计4％至40％、4％至30％、4％至20％、4％至15％、5％至40％、5％至30％、5％至20％、10％至40％、10％至30％、10％至20％、15％至40％、15％至30％、20％至40％、20％至30％、25％至40％、或30％至40％的脂质浓度。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制备的脂质具有2或更低的整体香气强度。如本文所用，术语“整体香气强度”是指由一组感官分析人员给予脂质的嗅觉感官评级。如本文所用，术语“感官分析人员”是指对物质的感官特征提供反馈和/或评级的训练有素的个人。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制备的脂质具有3或更低的整体芳香强度。如本文所用，术语“整体芳香强度”是指由一组感官分析人员给予脂质的味觉或味道感官评级。在一些实施方式中，使用通用光谱描述性分析方法来评定样品的香气和芳香特征。该方法使用0-15的强度等级，其中0＝未检测到，15＝非常高的强度，以测量油状物的香气和芳香属性。
在一些实施方式中，通过本发明的方法制备的脂质不具有以鱼腥味为特征的余味。如本文所用，术语“余味”是指脂质中风味感觉的持续，如由一组感官分析人员所表征的。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了过氧化值(peroxide value,PV)为5或更小、4.5或更小、4或更小、3.5或更小、3或更小、2.5或更小、2或更小、1.5或更小、1或更小、0.5或更小、0.2或更小、或0.1或更小的粗制脂质。如本文所用，术语“过氧化值”或“PV”是指在脂质氧化期间发生的初级反应产物(例如过氧化物和氢过氧化物)的度量。在一些实施方式中，PV是脂质质量的指标，并且在具有低PV(即，5或更小)的脂质中发生的氧化程度显示出比具有大于5的PV的脂质增加的稳定性和感官特征。在一些实施方式中，如上所述向裂解的细胞组合物中添加碱提高了裂解的细胞组合物的pH并抑制了脂质氧化，从而使裂解的细胞组合物中的自由基数量最小化，使得从本发明的方法获得的粗制脂质具有低PV(即，5或更小)。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了茴香胺值(AV)为26或更小、25或更小、20或更小、15或更小、10或更小、5或更小、2或更小、或1或更小的粗制脂质。如本文所用，术语“茴香胺值”或“AV”是指在脂质氧化期间发生的次级反应产物(例如醛和酮)的度量。在一些实施方式中，AV是脂质质量和脂质中已经发生的氧化程度的指标。与AV大于26的脂质相比，具有低AV(即，26或更小)的脂质表现出增加的稳定性和感官特征。在一些实施方式中，如上所述向裂解的细胞组合物中添加碱提高了裂解的细胞组合物的pH并抑制了脂质氧化，从而使裂解的细胞组合物中的自由基数量最小化，使得从本发明的方法获得的粗制脂质具有低AV(即，26或更小)。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了具有100ppm或更小、95ppm或更小、90ppm或更小、85ppm或更小、80ppm或更小、75ppm或更小、70ppm或更小、65ppm或更小、60ppm或更小、55ppm或更小、50ppm或更小、45ppm或更小、40ppm或更小、35ppm或更小、30ppm或更小、25ppm或更小、20ppm或更小、15ppm或更小、10ppm或更小、5ppm或更小、4ppm或更小、3ppm或更小、2ppm或更小、或1ppm或更小的磷含量的粗制脂质。
在一些实施方式中，本发明的方法提供了比如果使用溶剂执行萃取(例如，典型己烷萃取或
Figure BDA0003254107350000331
工艺(Westfalia Separator AG,Germany))具有更低茴香胺值、更低过氧化值、更低磷含量和/或更高萃取产率的粗制脂质。
Figure BDA0003254107350000332
工艺是一种用水溶性有机溶剂萃取脂质的工艺，如美国专利号5,928,696和国际公开号WO 01/76385和WO 01/76715中所述，该等专利中的每一者全文以引用方式并入本文。
在一些实施方式中，加热裂解的细胞组合物导致次级反应产物(例如，醛和酮)参与与裂解的细胞组合物中存在的蛋白质的类似于美拉德反应的反应。该反应被认为产生了具有抗氧化活性的产物，这减少了脂质的氧化。在一些实施方式中，可以向裂解的细胞组合物中添加附加的蛋白质，例如大豆蛋白，以增加抗氧化活性。脂质氧化的减少降低了脂质的AV，减少了脂质的任何余味和/或增加了脂质的稳定性。在一些实施方式中，稳定性增加了至少5％、至少10％、至少15％或至少20％。
在一些实施方式中，通过本发明的方法萃取的脂质、萃取脂质后剩余的生物质或它们的组合可以直接用作食物或食物成分，例如婴儿食品、婴儿配方食品、饮料、调味酱、基于乳制品的食物(例如牛奶、酸奶、奶酪和冰淇淋)、油(例如，食用油或沙拉酱)和烘焙食品；营养补充剂(例如，以胶囊或片剂形式)；任何非人动物(例如，其产品(例如，肉、奶或蛋)被人类食用的动物)的饲料或饲料补充剂；食物补充剂；和药物(在直接或辅助治疗应用中)；以及生物燃料中的成分。术语“动物”是指属于动物界的任何生物，并且包括任何人类动物，以及产品(例如，奶、蛋、禽肉、牛肉、猪肉或羊肉)所来源于的非人动物。在一些实施方式中，脂质和/或生物质可用于海鲜中。海鲜来源于但不限于鱼、虾和贝类。术语“产品”包括来源于此类动物的任何产品，包括但不限于肉、蛋、奶或其他产品。当将脂质和/或生物质饲喂给此类动物时，可以将多不饱和脂质掺入此类动物的肉、奶、蛋或其他产品中，以增加它们的这些脂质的含量。
脂质组合物
在一些实施方式中，本发明涉及根据本发明的方法萃取的微生物脂质。在一些实施方式中，微生物脂质具有为26或更小、25或更小、20或更小、15或更小、10或更小、5或更小、2或更小、或1或更小的茴香胺值，和/或为5或更小、4.5或更小、4或更小、3.5或更小、3或更小、2.5或更小、2或更小、1.5或更小、1或更小、0.5或更小、0.2或更小、或0.1或更小的过氧化值和/或为100ppm或更小、95ppm或更小、90ppm或更小、85ppm或更小、80ppm或更小、75ppm或更小、70ppm或更小、65ppm或更小、60ppm或更小、55ppm或更小、50ppm或更小、45ppm或更小、40ppm或更小、35ppm或更小、30ppm或更小、25ppm或更小、20ppm或更小、15ppm或更小、10ppm或更小、5ppm或更小、4ppm或更小、3ppm或更小、2ppm或更小、或1ppm或更小的磷含量。在一些实施方式中，脂质具有按重量或体积计小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％的有机溶剂。在一些实施方式中，脂质具有按重量计至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的所需PUFA。在一些实施方式中，脂质具有按重量计至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的DHA，和/或按重量计至少10％、至少15％、或至少20％的DPA n-6，和/或按重量计至少10％、至少15％、或至少20％的EPA，和/或按重量计至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、或至少50％的ARA。在一些实施方式中，根据本发明的方法萃取的脂质导致了比如果使用溶剂执行萃取(例如，典型的己烷萃取或
Figure BDA0003254107350000351
工艺(Westfalia Separator AG,Germany))更低的茴香胺值、更低的过氧化值、更低的磷含量和/或更高的萃取产率。
本发明的微生物脂质可以是来源于微生物的任何脂质，包括例如：从微生物的生物质中萃取的粗制油状物，没有进一步加工；通过用例如精炼、漂白和/或脱臭的进一步加工步骤处理粗制微生物油状物而获得的精炼油状物；通过稀释粗制或精炼的微生物油状物获得的稀释的微生物油状物；或者例如通过用进一步纯化方法处理粗制或精炼的微生物油状物以增加油状物中脂肪酸(例如DHA)的浓度而获得的富集油。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计0％、至少0.1％、至少0.2％、至少0.5％、至少约1％、至少1.5％、至少2％、或至少5％的甾醇酯级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计0％至1.5％、0％至2％、0％至5％、1％至1.5％、0.2％至1.5％、0.2％至2％、或0.2％至5％的甾醇酯级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计小于5％、小于4％、小于3％、或小于2％的甾醇酯级分。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％的甘油三酯级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计65％至95％、75％至95％、或按重量计80％至95％、或按重量计97％、或按重量计98％的甘油三酯级分。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、至少2.5％、或至少5％的游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计0.5％至5％、0.5％至2.5％、0.5％至2％、0.5％至1.5％、0.5％至1％、1％至2.5％、1％至5％、1.5％至2.5％、2％至2.5％、或2％至5％的游离脂肪酸级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％的游离脂肪酸级分。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计至少0.5％、至少1％、至少1.5％、至少2％、或至少5％的甾醇级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计0.5％至1.5％、1％至1.5％、0.5％至2％、0.5％至5％、1％至2％、或1％至5％的甾醇级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计小于5％、小于4％、小于3％、小于2％、或小于1％的甾醇级分。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计至少1.5％、至少2％、至少2.5％、至少3％、至少3.5％、或至少5％的甘油二酯级分。在一些实施方式中，微生物脂质包含按重量计1.5％至3％、2％至3％、1.5％至3.5％、1.5％至5％、2.5％至3％、2.5％至3.5％、或2.5％至5％的甘油二酯级分。
在一些实施方式中，微生物脂质包含按油状物的重量计小于2％、小于1.5％、小于1％、或小于0.5％的不皂化物。
微生物油状物中存在的脂质类，例如甘油三酯级分，可以通过快速色谱法分离并通过薄层色谱法(thin layer chromatography,TLC)分析，或者通过本领域已知的其他方法分离和分析。
在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、或至少80％的DHA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计40％至45％、40％至50％、40％至60％、50％至60％、55％至60％、40％至65％、50％至65％、55％至65％、40％至70％、40％至80％、50％至80％、55％至80％、60％至80％、或70％至80％的DHA。在一些实施方式中，微生物脂质包含甾醇酯级分，该甾醇酯级分包含按重量计45％或更少、40％或更少、35％或更少、30％或更少、25％或更少、20％或更少、15％或更少、或13％或更少的DHA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计10％或更少、9％或更少、8％或更少、7％或更少、6％或更少、5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、或1％或更少的EPA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计2％至3％、2％至3.5％、2.5％至3.5％、2％至6％、2.5％至6％、3.0％至6％、3.5％至6％、5％至6％、或2％至10％的EPA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分基本上不含EPA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包括为至少5:1，至少7:1、至少9:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少30:1、或至少50:1的DHA与EPA的重量比，其中微生物脂质和/或其一种或多种级分包含按重量计10％或更少的EPA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含为至少5:1但小于20:1的DHA与EPA的重量比。在一些实施方式中，DHA与EPA的重量比是5:1至18:1、7:1至16:1、或10:1至15:1。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计0.1％至0.25％、0.2％至0.25％、0.1％至0.5％、或0.1％至1.5％的ARA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计1.5％或更少、1％或更少、0.5％或更少、0.2％或更少、或0.1％或更少的ARA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分基本上不含ARA。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包括为至少20:1、至少30:1、至少35:1、至少40:1、至少60:1、至少80:1、至少100:1、至少150:1、至少200:1、至少250:1、或至少300:1的DHA与ARA的重量比。在一些实施方式中，微生物脂质和/或选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计0.5％至1％、0.5％至2％、0.5％至2.5％、0.5％至3％、0.5％至3.5％、0.5％至5％、0.5％至6％、1％至2％、2％至3％、2％至3.5％、1％至2.5％、1％至3％、1％至3.5％、1％至5％、或1％至6％的DP A n-6。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计6％或更少、5％或更少、3％或更少、2.5％或更少、2％或更少、1％或更少、或0.5％或更少的DPA n-6。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合的一种或多种级分基本上不含DPA n-6。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包括为大于6:1、或至少8:1、至少10:1、至少15:1、至少20:1、至少25:1、至少50:1、或至少100:1的DHA与DPA n-6的重量比。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1.5％或更少、1％或更少、或0.5％或更少的亚油酸(18:2n-6)、亚麻酸(18:3n-3)、二十碳烯酸(20:1n-9)和芥酸(22:1n-9)。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其选自甾醇酯级分、甘油三酯级分、游离脂肪酸级分、甾醇级分、甘油二酯级分、极性级分(包括磷脂级分)，以及它们的组合中的一种或多种级分包含按重量计5％或更少、4％或更少、3％或更少、2％或更少、1.5％或更少、或1％或更少的十七烷酸(17:0)。在一些实施方式中，微生物脂质和/或其一种或多种级分包含按重量计0.01％至5％、按重量计0.05％至3％、或按重量计0.1％至1％的十七烷酸。
在一些实施方式中，萃取的微生物脂质包含按重量计至少70％的甘油三酯级分，其中所述甘油三酯级分的二十二碳六烯酸含量是按重量计至少50％，其中所述甘油三酯级分的二十二碳五烯酸n-6含量是按重量计至少0.5％至按重量计6％，并且其中油状物的茴香胺值是26或更小。在一些实施方式中，萃取的微生物脂质包含按重量计至少70％的甘油三酯级分，其中所述甘油三酯级分的二十二碳六烯酸含量是按重量计至少40％，其中所述甘油三酯级分的二十二碳五烯酸n-6含量是按重量计至少0.5％至按重量计6％，其中二十二碳六烯酸与二十二碳五烯酸n-6的比率大于6:1，并且其中脂质具有26或更小的茴香胺值。在一些实施方式中，萃取的微生物脂质包含按重量计至少70％的甘油三酯级分，其中所述甘油三酯级分的二十二碳六烯酸含量是按重量计至少60％，并且其中脂质具有26或更小的茴香胺值。在一些实施方式中，具有上述脂肪酸谱中的任何脂肪酸谱的萃取的微生物脂质具有为26或更小、25或更小、20或更小、15或更小、10或更小、5或更小、2或更小、或1或更小的茴香胺值，和/或为5或更小、4.5或更小、4或更小、3.5或更小、3或更小、2.5或更小、2或更小、1.5或更小、1或更小、0.5或更小、0.2或更小、或0.1或更小的过氧化值，和/或为100ppm或更小、95ppm或更小、90ppm或更小、85ppm或更小、80ppm或更小、75ppm或更小、70ppm或更小、65ppm或更小、60ppm或更小、55ppm或更小、50ppm或更小、45ppm或更小、40ppm或更小、35ppm或更小、30ppm或更小、25ppm或更小、20ppm或更小、15ppm或更小、10ppm或更小、5ppm或更小、4ppm或更小、3ppm或更小、2ppm或更小、或1ppm或更小的磷含量。在一些实施方式中，从分离的具有以ATCC登录号PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697或PTA-9698保藏的破囊壶菌属物种的特征的破囊壶菌属微生物中萃取具有上述脂肪酸谱中的任何脂肪酸谱的萃取的微生物脂质。在一些实施方式中，具有上述脂肪酸谱中的任何脂肪酸谱的萃取的微生物脂质是粗制脂质。在一些实施方式中，粗制脂质具有按重量或体积计小于5％的有机溶剂。在一些实施方式中，根据本发明的方法萃取的微生物脂质导致了比如果使用溶剂执行萃取(例如，典型的己烷萃取或
Figure BDA0003254107350000391
工艺(Westfalia Separator AG,Germany))更低的茴香胺值、更低的过氧化值、更低的磷含量和/或更高的萃取产率。
已经大体描述了本发明，通过参考本文提供的实施例可以获得进一步的理解。给出这些实施例仅仅是为了说明的目的，而并非旨在为限制性的。以下实施例是对本发明的方法和通过本发明的方法制备的脂质的说明，而非限制性的。对从细胞中萃取脂质时通常遇到的各种条件和参数的其他合适的修改和调整，对于本领域技术人员来说是显而易见的，并且在本发明的精神和范围内。
实验例
实施例1.中试(AEX-O-1150-槽B)
将524.6kg的含有约10％w/w的裂殖壶菌微生物细胞的发酵液加热至60℃，并通过添加50％NaOH(可从Colonial Chemicals Solutions,916W Lathrop Ave,Savannah,GA31415获得)将pH调节至8.3。将基于培养液重量0.3％的量的
Figure BDA0003254107350000401
2.4FG(可从Novozymes,Franklinton,N.C.获得)添加至培养液中进行酶促裂解，并且在30分钟后，pH漂移至6.9，并重新调节至8.1。在酶促裂解2小时后，通过将pH提高至10.5并将温度升高至90℃来开始破乳过程。当温度达到90℃时，pH漂移至8.0并重新调节至10.2。破乳2小时后，添加10.49kg NaCl盐。盐添加30分钟后，通过添加50％柠檬酸(由固体柠檬酸(可从Tate&Lyle,2200E Eldorado St,Decatur Illinois USA,62521获得)在室内制备)将pH降至5.4。30分钟后，pH升高至9.7。在1.5小时后，将15ml组合物以约11000xg离心3分钟，发现破乳完全。将温度降至77℃，并将pH降至8.3以进行离心。将经破乳的培养液在三相中试离心机上以约8000xg离心。收集了29.6kg主要由粗制油状物组成的轻相，538.6kg主要由发酵培养基和一些残余细胞组成的重相，以及2.2kg主要由发酵培养基和一些细胞碎片组成的第三相。
实施例2.中试(AEX-O-1150-槽C)
将525.2kg的含有约10％w/w的裂殖壶菌微生物细胞的发酵液(与实施例1中的槽B相同批次的发酵液)加热至60℃，并通过添加50％NaOH(可从Colonial ChemicalsSolutions,916W Lathrop Ave,Savannah,GA 31415获得)将pH调节至7.9。将基于培养液重量0.3％的量的
Figure BDA0003254107350000402
2.4FG(可从Novozymes,Franklinton,N.C.获得)添加至培养液中进行酶促裂解。30分钟后，pH漂移至6.7并重新调节至8.1。在2小时的酶促裂解后，通过将pH提高至10.5并将温度升高至90℃来开始破乳过程。当温度达到90℃时，将pH重新调节至10.3。破乳1.5小时后，添加10.5kg NaCl盐。盐添加30分钟后，将温度降至85℃，并通过添加75％磷酸(可从Tate&Lyle,2200E Eldorado St,Decatur Illinois USA,62521获得)将pH降至5.5。30分钟后，pH升高至9.9。2小时后，将pH降至6.4。1.5小时后，将pH升至8.1，并离心15ml组合物以检查破乳水平。发现破乳不完全，并且将槽中的内容物在80℃放置过夜。
第二天，将温度升至85℃，并将pH降至6.4。30分钟后，将pH升至7.8，并且达到了约90％的破乳。将经破乳的培养液在三相中试离心机上以约8000xg离心。收集了31.6kg含2.46％水分的轻相(主要由粗制油状物组成)、550.6kg含82.1％水分的重相(主要由发酵培养基和一些残留细胞组成)和16.4kg含75.7％水分的第三相(主要由发酵培养基和一些细胞碎片组成)。
表1.实施例1和实施例2的游离脂肪酸、过氧化值和茴香胺值
实验运行 游离脂肪酸(％) 过氧化值(meq/kg) 茴香胺值
AEX-O-1150槽B 2.68 0.39 10.6
AEX-O-1150槽C 1.97 0.46 8.2
表2.来自实验例1和实验例2的实验室RBWD(经精炼、漂白、冬化、脱臭)的数据
批号 AEX-1150槽C AEX-1150槽B
粗制油状物
游离脂肪酸(％) 1.97 2.68
过氧化值(meq/kg) 0.46 0.39
茴香胺值 10.60 6.20
精炼油状物
产率 92.1％ 94.5％
皂 121.8 91.3
游离脂肪酸(％) 0.06 0.08
过氧化值(meq/kg) 0.67 0.73
茴香胺值 12.40 10.00
经漂白的油状物
产率 94.5％ 93.8％
皂 0.0 0.0
游离脂肪酸(％) 0.42 0.56
过氧化值(meq/kg) 1.21 0.81
茴香胺值 11.80 9.90
颜色 2.8R，18.0Y 0.9R，7.4Y
经冬化的油状物
产率 90.0％ 88.7％
实施例3.中试
将1797.6kg的含有约10％w/w的裂殖壶菌微生物细胞的发酵液加热至60℃，并通过添加50％NaOH(可从Colonial Chemicals Solutions,916W Lathrop Ave,Savannah,GA31415获得)将pH调节至8.0。将基于培养液重量0.3％的量的
Figure BDA0003254107350000421
2.4FG(可从Novozymes,Franklinton,N.C.获得)添加至培养液中进行酶促裂解两个小时。将裂解的组合物的pH调节至10.5，并加热至90℃。当温度达到90℃时，pH漂移至8.8，将pH调节至10.1。在90℃下1小时后，将温度降至82℃，并通过添加50％柠檬酸(由固体柠檬酸(可从Tate&Lyle,2200E Eldorado St,Decatur Illinois USA,62521获得)在室内制备)将pH降至5.2达30分钟。然后将pH升至10.1达40分钟，并再次使pH降至5.4。30分钟后，pH升高至8.2。将15ml样本以约11000xg离心3分钟，破乳作用是令人满意的。将经破乳的培养液在三相中试离心机上以约8000xg离心。收集了78.9kg主要由粗制油状物组成的轻相，1876.6kg主要由发酵培养基和一些残余细胞组成的重相，以及10.6kg主要由发酵培养基和一些细胞碎片组成的第三相。将粗制油状物干燥至0.27％水分，并在RBWD中加工。
表3.来自实施例3的中试RBWD(经精炼、漂白、冬化、脱臭的)的数据
RBD-O-1176
精炼油状物
起始重量(kg) 70.7
水(％) 5
皂(ppm) 334.84
游离脂肪酸(％) 0.28
过氧化值(meq/kg) 0.4
产率(％) 94.3
经漂白的油状物
起始重量(kg) 66.68
产率(％) 90.19
经冬化的油状物
起始重量(kg) 60.14
游离脂肪酸(％) 0.16
过氧化值(meq/kg) 0.25
产率(％) 87.4
经脱臭的油状物
起始重量(kg) 52.6
最终重量(kg) 52.1
游离脂肪酸(％) 0.08
过氧化值(meq/kg) 0.27
产率(％) 99.00

Claims (36)

1.一种从包含微生物细胞的组合物中获得脂质的方法，所述方法包括：
a)将所述包含微生物细胞的组合物加热至约60℃至约80℃的温度；
b)添加一种或多种能够破坏所述微生物细胞的细胞壁的酶达足以裂解所述微生物细胞的时间，并将所述微生物细胞加热至80℃；
c)将所述裂解的细胞组合物加热至约80℃至约90℃的温度；
d)通过添加碱将所述组合物的pH调节至约10至约12的pH，并保持约10至约12的pH至少1小时；
e)通过添加酸将步骤(c)中获得的所述组合物的pH调节至约4至约6的pH，并保持约4至约6的pH至少0.5小时；
f)任选地重复步骤(c)和(d)，直到所述组合物被充分破乳；
g)从所述经破乳的裂解细胞组合物中分离所述脂质；以及
h)回收所述脂质。
2.根据权利要求1所述的方法，其中(a)包括将所述组合物加热至约80℃。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中(a)和/或(b)还包括将所述pH从约7调节至约9。
4.根据任何前述权利要求所述的方法，其中在(d)之前、在(d)之后、在(e)之前、在(e)之后或它们的组合使所述组合物经受一个或多个温度冲击循环。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述温度冲击包括将温度从约80-90℃调节至约4-20℃并回到约80-90℃。
6.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(b)、(d)和/或(e)还包括添加按所述裂解的细胞组合物的重量计约0.05％至约20％的量的盐。
7.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(a)还包括搅动所述细胞。
8.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(a)的所述细胞是未洗涤的。
9.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(a)的所述细胞被包含在发酵液中。
10.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(g)包括离心所述经破乳的裂解细胞组合物。
11.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质包含多不饱和脂肪酸。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自ω-3脂肪酸、ω-6脂肪酸，以及它们的混合物。
13.根据权利要求11或权利要求12所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸选自二十二碳六烯酸(DHA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳五烯酸(DPA)、花生四烯酸(ARA)、γ-亚麻酸(GLA)、二均-γ-亚麻酸(DGLA)、十八碳四烯酸(SDA)，以及它们的混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是二十二碳六烯酸(DHA)。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是二十碳五烯酸(EPA)。
16.根据权利要求13所述的方法，其中所述多不饱和脂肪酸是花生四烯酸(ARA)。
17.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述微生物细胞是藻类细胞、酵母细胞、真菌细胞、原生生物细胞或细菌细胞中的一者或多者。
18.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述微生物细胞来自被孢霉属、隐甲藻属或破囊壶菌目。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述微生物细胞来自破囊壶菌目。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述微生物细胞来自壶菌属、裂殖壶菌属，或它们的混合物。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述微生物细胞来自高山被孢霉。
22.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述裂解的细胞组合物包含液体、细胞碎片和微生物油状物。
23.根据任何前述权利要求所述的方法，其中不使用有机溶剂从所述细胞中获得所述油状物。
24.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述酶选自β葡聚糖酶、木聚糖酶、纤维素酶、蛋白酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶，以及它们的组合。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述酶是蛋白酶。
26.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述酶以按所述裂解的细胞组合物的重量计约0.05％至约10％的量添加。
27.根据权利要求6-26中任一项所述的方法，其中所述盐选自由以下项组成的组：碱金属盐、碱土金属盐、硫酸盐，以及它们的组合。
28.根据任何前述权利要求所述的方法，其中(h)的所述脂质是粗制脂质。
29.根据权利要求28所述的方法，其中(h)还包括精炼所述粗制脂质以获得精炼的脂质。
30.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质包含按重量计至少30％的二十二碳六烯酸。
31.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质包含按重量计至少30％的二十碳五烯酸。
32.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质包含按重量计至少30％的花生四烯酸。
33.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质的茴香胺值小于约26。
34.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质的磷含量是约100ppm或更小。
35.根据任何前述权利要求所述的方法，其中所述脂质的过氧化值小于约5meq/kg。
36.一种通过任何前述权利要求所述的方法获得的脂质。
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