KR20210131895A - Glp-1 유도 활성을 갖는 단백질 변이체 및 이의 용도 - Google Patents

Glp-1 유도 활성을 갖는 단백질 변이체 및 이의 용도 Download PDF

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    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

본 발명은 GLP-1 유도능 및/또는 열 및 효소 저항성이 향상된 단백질 변이체, 이를 포함하는 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제 또는 대사 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

GLP-1 유도 활성을 갖는 단백질 변이체 및 이의 용도{Protein variants having GLP-1 inducing activity and their use}
본 발명은 GLP-1 유도능 및/또는 열 안정성 및 효소 저항성이 향상된 단백질 변이체, 이를 포함하는 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제 또는 대사 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.
식욕조절 호르몬인 글루카곤-유사 펩티드-1(glucagon-like peptide, GLP-1)는 음식섭취에 의해 소장에서 분비되는 호르몬으로, 포만감을 증가시켜 식욕을 조절하며, 췌장에서 인슐린 분비를 유도함으로써 혈당을 조절한다. GLP-1은 소장(ileum) 및 대장(colon)에 존재하는 장 내분비세포의 일종인 L-cells에서 분비된다.
GLP-1은 당뇨병, 비만, 심장병, 뇌혈관 질환, 동맥경화증 등 다양한 대사 질환의 치료에 유용한 것으로 알려져 있다. 또한 GLP-1은 췌장에서 포도당 의존적 인슐린 분비 자극, 인슐린 유전자 발현 증진, 췌장 베타세포 증식 증진 효과, 췌장 베타세포 생존 증진 효과, 글루카곤 분비 저해 효과, 혈당 강하 등을 통해 당뇨병 치료 효과를 나타내는데 관여하며, 위장이 비워지는 속도를 늦추고, 식욕을 억제하고, 포만감을 증진시키며 음식 섭취를 억제하는데 관여하여 비만 치료 효과를 나타내는데 관여한다. 그리고 국소 빈혈(ischemia)로부터 심장세포(cardiomyocytes) 보호 효과 및 심장마비 우려가 있는 환자의 심장기능 향상 효과를 통해 심장병 치료 효과를 나타낸다고도 보고된 바 있다(Sokos, G.G. et al., Glucagon-like peptide-1 infusion improves left ventricular ejection fraction and functional status in patients with chronic heart failure., J. Card. Fail. (2006) 12: 694-699.; Ban, K., et al., Cardioprotective and vasodilatory actions of glucagon-like peptide-1 receptor are mediated through both glucagon-like peptide-1 receptor-dependent and -independent pathways, Circulation (2008) 117: 2340-2350).
한편, 장내 미생물은 비만과 당뇨 등 대사성 질환과 깊은 상관관계가 있다고 알려져 있는데, 특히 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 균주는 고지방 식이 마우스에 투여 시 혈장 콜레스테롤을 감소시키고, 대상자의 에너지 소비를 증가시키며, 만복감 증가 및 체중 감소를 유도하는 등의 효과를 나타내어 비만을 비롯한 대사 장애 치료제로서의 가능성을 주목받고 있다(한국 공개특허 제2015-0133646호, 한국 공개특허 제2018-0053336호, 한국 등록특허 제1809172호 등).
이에, 본 발명자들은 아커만시아 뮤시니필라 표준 균주(Akkermansia muciniphila, Akk; 미국균주은행, 기탁번호: ATCC BAA-835)와 건강한 한국인 분변에서 분리한 아커만시아 뮤시니필라 SNUG-61027 균주(기탁번호: KCTC13530)를 이용하여 아커만시아 뮤시니필라가 열 발생을 목적으로 하는 갈색지방 활성에 영향을 주는 UCP-1 인자를 높이고, 소장에서 식욕조절 호르몬 GLP-1 발현을 유도함을 확인한 바 있다. 또한 본 발명자들은 아커만시아 뮤시니필라 균주 SNUG-61027에서 유래된 B2UM07 단백질(Gene: Amuc_1631, Carboxyl-terminal protease)이 GLP-1의 분비 유도를 촉진함을 밝혀내었다(한국 특허출원 제2019-0125670호).
나아가, 본 발명자들은 B2UM07 단백질의 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성을 향상시키고자 연구를 계속하였으며, 그 결과 B2UM07 단백질의 다양한 변이체를 제작하여 이들이 우수한 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성을 기초로 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕억제, 또는 대사 질환 치료 또는 예방에 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
한국 공개특허 제2015-0133646호 한국 공개특허 제2018-0053336호 한국 등록특허 제1809172호
따라서, 본 발명의 목적은 우수한 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성 중 하나 이상을 나타내는, 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및 이의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산 치환이 도입된 단백질 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 변이체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질 변이체를 포함하는, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 B2UM07 단백질에 다양한 돌연변이를 도입하여 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성을 향상시킴으로써, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제 및 다양한 대사 질환의 치료, 예방, 개선에 우수한 효과를 나타내는 단백질 변이체를 제작함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 명세서에서 용어 "단백질 변이체"는 야생형(wild type)의 전장(full length) B2UM07 단백질의 아미노산 서열(하기 서열번호 1)에서 1 이상의 아미노산이 치환, 부가 또는 결실된 형태의 변이를 포함하는 변이체를 의미한다. 본 명세서에서 단백질 변이체의 아미노산 번호는 야생형의 전장 B2UM07 단백질의 아미노산 서열(하기 서열번호 1)의 아미노산 번호를 기준으로 나타낸다.
[서열번호 1]
Figure pat00001
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명은 야생형(wild type)의 전장(full length) B2UM07 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)에서 N-말단의 아미노산 9개가 절단되고, C-말단에 6개의 히스티딘-태그가 연결된 하기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체에 관한 것이다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진다. 상기 서열번호 2의 단백질 변이체는 야생형의 전장 B2UM07 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 번호를 기준으로 하여 10-748-His로 나타낸다.
[서열번호 2]
Figure pat00002
본 발명의 일 실시 태양으로서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체는 B2UM07 단백질의 10 내지 748번 아미노산을 코딩하는 하기 서열번호 3의 DNA를 적절한 프라이머쌍으로 Amuc_1631 유전자에서 PCR 증폭시킨 후, 당업계에 통상적인 클로닝, 단백질의 발현 및 정제 과정을 거쳐 제작할 수 있다.
[서열번호 3]
Figure pat00003
Figure pat00004
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열에서 C-말단의 6개의 히스티딘 태그(histidine tag)가 37번과 38번 아미노산 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체에 관한 것이다. 상기 서열번호 4의 단백질 변이체는 야생형의 전장 B2UM07 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 번호를 기준으로 하여 (10-37)-His-(38-748)로 나타낸다.
[서열번호 4]
Figure pat00005
또한, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 서열번호 4의 아미노산 서열에서 하기 표 1의 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함하는 단백질 변이체에 관한 것이다. 하기 표 1 내지 표 4에 기재된 아미노산 번호는 야생형의 전장 B2UM07 단백질의 아미노산 서열(서열번호 1)의 아미노산 번호를 기준으로 나타낸다.
- C34A, C34S - C403A, C403T
- S36H - M414F, M414I
- A37H - V423I
- G45A, G45L, G45V - R438V, R438A, R438Q, R438N, R438H
- K46A, K46Q, K46N, K46H, K46T - T445I
- R59A, R59Q, R59N, R59H - G446R
- K60A, K60Q, K60N, K60H, K60T - A465D
- V78L - N467D
- K82A, K82Q, K82N, K82H, K82V, K82T - K482A, K482Q, K482N, K482H, K482T
- K94A, K94Q, K94N, K94H, K94T - S486A
- R95A, R95Q, R95N, R95H - A492L, A492V
- K96A, K96Q, K96N, K96H, K96T - A495I
- M213Q, M213V, M213I, M213A - R500A
- A231F - A501I, A501V
- A251P - K512A, K512Q, K512N, K512H, K512T
- T263I, T263L, T263V - R531A, R531Q, R531N, R531H
- D307A - A534F, A534V
- K324D, K324N, K324A, K324Q, K324N,
K324H, K324T		 - K555R, K555A, K555Q, K555N, K555H
- K368A, K368Q, K368N, K368H, K368T - Y583F, Y583V, Y583I, Y583A, Y583H
- G369A - C589A, C589S, C589T
- R402S, R402A, R402Q, R402N, R402H - G733A, G733V
바람직하게는, 상기 아미노산 치환은 하기 표 2의 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
- C34A, C34S - C403A, C403T
- S36H - M414F, M414I
- A37H - V423I
- G45A, G45L, G45V - R438V
- K46A - T445I
- R59A - G446R
- K60A - A465D
- V78L - N467D
- K82A - K482A
- K94A - S486A
- R95A - A492L, A492V
- K96A - A495I
- M213Q - R500A
- A231F - A501I, A501V
- A251P - K512A
- T263I, T263L, T263V - R531A
- D307A - A534F, A534V
- K324D, K324N - K555R,
- K368A - Y583F,
- G369A - C589A, C589S, C589T
- R402S - G733A, G733V
바람직하게는, 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 표 2의 아미노산 치환 중 하나의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하되, 상기 표 2의 아미노산 치환 중 2 내지 5개의 아미노산 치환을 포함할 수 있다. 이 경우, 상기 2 내지 5개의 아미노산 치환은 바람직하게는 K368A, C403A 및 C589A 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함할 수 있다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 단백질 변이체는 하기 표 3의 아미노산 치환 중 어느 하나를 포함할 수 있다.
Figure pat00006
보다 바람직하게는, 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하되, C403A/C589A 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 하기 표 4의 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함할 수 있다.
- Q43C - E379C
- R59C - K409C
- R95C - K416C
- K99C - S464C
- S107C - R468C
- A119C - Q523C
- K138C - A530C
- T142C - Q562C
- A158C - D575C
- K161C - Q585C
- A164C - T590C
- A189C - S596C
- K193C - A610C
- N203C - A627C
- R220C - K634C
- K258C - A651C
- S311C - S658C
- A332C - K700C
- S358C - E710C
- K363C - S745C
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하되, 표 1 내지 표 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체에 비하여 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성 중 하나 이상이 증가될 수 있다. 표 1 내지 표 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 단백질 변이체는 또한 이와 기능적으로 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 동등물 또는 기능적 유도체를 본 발명의 범위에 포함한다.
구체적으로, 표 1 내지 표 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 비하여 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 약 50% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 70% 이상 증가된 GLP-1 유도능을 나타낼 수 있다.
또한, 표 1 내지 표 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 단백질 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질에 비하여 약 0.2℃ 이상, 약 0.5℃ 이상, 약 0.8℃ 이상, 약 1℃ 이상 또는 약 1.5℃ 이상 증가된 용융온도(Tm)을 가짐으로써 향상된 열 안정성을 나타낼 수 있다.
또한, 표 1 내지 표 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 본 발명의 단백질 변이체는 트립신 및 키모트립신과 같은 소화효소에 의한 분해로부터 향상된 안정성, 즉 효소 저항성을 나타낼 수 있다.
본원에서, 용어 "효소 저항성"은 시험관 내에서의 또는 생체 내에서의 소화효소 분해에 대한 안정성을 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 소화 효소 저항성은 당업계에 공지된 통상적인 수단 및 방법을 통하여 측정할 수 있다.
본 발명의 일 실시 태양으로서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 표 1 내지 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 본 발명의 단백질 변이체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 본 발명에 따른 단백질 변이체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩 영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩 영역을 제외한 부분에서도 단백질의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 폴리뉴클레오티드는 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양으로서, 본 발명은 본 발명의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한 것이다.
본 명세서에서 "벡터"는 숙주 세포에 본 발명의 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 도입하여 단백질 변이체를 발현시키기 위한 수단을 말한다. 본 발명의 벡터는 플라스미드, 코스미드 및 바이러스(예를 들면 박테리오파지) 등을 포함한 모든 통상적인 벡터를 포함하며, 바람직하게는 플라스미드 벡터이다. 당업자는 표준적인 재조합 기술에 의해 벡터를 구축할 수 있다.
본 발명의 벡터는 다양한 조절서열을 포함할 수 있다. 전사 및 번역을 조절하는 조절서열과 함께 벡터 및 발현 벡터에는 다른 기능을 제공하는 핵산 서열도 포함될 수 있다.
본 발명의 일 실시태양으로서, 본 발명은 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다.
본 명세서에서 용어 "숙주세포"는 진핵생물 및 원핵생물을 포함하며, 상기 벡터를 복제할 수 있거나 벡터에 의해 코딩되는 유전자를 발현할 수 있는 임의의 형질 전환 가능한 생물을 의미한다. 숙주세포는 상기 벡터에 의해 형질감염(transfected) 또는 형질전환(transformed) 될 수 있으며, 이는 외생의 핵산 분자가 숙주세포 내에 전달되거나 도입되는 과정을 의미한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 숙주세포는 세균 세포, 보다 바람직하게는 그람 음성 세균세포, 더욱 바람직하게는 E.coli이다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 표 1 내지 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명의 약학 조성물은 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 발명에서, 상기 대사 질환은 대사 증후군, 비만, 인슐린 저항성, 글루코스 내성, 당뇨병, 동맥경화, 이상지질혈증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 지방간, 심혈관질환, 고혈압 및 골다공증을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서, "치료"는 질병, 장애 또는 상태의 증상 또는 역효과 중 적어도 하나를 예방하거나(즉, 발생하지 않도록 방지), 감소 또는 완화시키는 것을 의미한다. 본원에서 "치료"는 치료적 처치 및 예방적 또는 방지적 조치를 모두 지칭하며, 목적하는 병리적 상태 또는 장애를 예방하거나 둔화(경감)하는 것이다. 본 발명의 하나의 구체예에서, 치료를 필요로 하는 대상은 이미 질병 또는 장애를 겪고 있는 대상 뿐만 아니라, 질병 또는 장애를 가질 가능성이 높거나 이를 예방하고자 하는 대상을 모두 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다. 비경구용 제형은 멸균될 수 있으며, 멸균 기술의 비-제한적인 예는 세균-억제 필터를 통한 여과, 터미날 멸균화, 멸균 제제의 합체, 방사선 조사, 가열, 진공 건조 및 동결 건조를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제, 방부제, 완충제(예컨대, 염 형태의 아세트산, 시트르산, 인산 등) 등을 추가로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 동결건조 제형으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 예컨대, 경구 투여, 정맥 내 주입, 국소 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.0001-100 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약학 조성물은 관련 분야에서 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방 목적으로 통상적으로 사용되는 추가의 약제와 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체, 또는 서열번호 4의 아미노산 서열에서 표 1 내지 3에 기재된 아미노산 치환, 및 C403A/C589A 아미노산 치환과 함께 표 4에 기재된 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체를 포함하는 식품 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 식품 조성물은 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 개선 또는 예방에 유용할 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 개선 또는 예방에 효과가 있는 식품, 예컨대, 식품의 주원료, 부원료, 식품 첨가제, 건강기능식품 또는 기능성 음료로 용이하게 활용할 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
상기 식품용 조성물이란, 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미한다.
본 발명의 조성물이 식품 조성물 형태로 제공되는 경우, 본 발명의 조성물은 상기 유효성분 이외에, 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소, 조미제 및 향미제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 식품 조성물은 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 생산될 수 있고, 본 발명의 약학 조성물과 동일한 중량의 단백질 변이체를 함유할 수 있다. 예컨대, 본 발명에 따른 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.001중량% 내지 100중량%, 바람직하게는 1 중량% 내지 99 중량%로 본 발명의 단백질 변이체를 포함할 수 있고, 음료의 경우, 100 mL 당 0.001 g 내지 10 g, 바람직하게는 0.01 g 내지 1 g의 비율로 포함될 수 있다. 식품 중의 단백질 변이체의 양은 식품의 용량, 식품의 소비 빈도, 식품에 함유된 균주의 종류, 식품 중의 수분량, 및/또는 식품 중의 균주의 생존을 위한 부가의 조건을 포함한 다양한 요인에 좌우될 수 있다.
본 발명의 또 다른 관점에서, 약학적 유효량의 본 발명에 따른 단백질 변이체를 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방이 요구되는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
상기 질환의 예방 또는 치료의 개체는 인간을 포함한 모든 동물을 포함한다. 예를 들어, 개, 고양이, 마우스 등의 동물일 수 있으며, 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 또 다른 관점에서 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방에 사용되기 위한 본 발명의 단백질 변이체 또는 조성물의 용도, 및 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방을 위한 약제 제조를 위한 본 발명의 단백질 변이체 또는 조성물의 용도를 제공한다.
상기 질환의 예방 또는 치료 방법에 사용되는 약학 조성물 및 투여 방법은 상기에서 설명한 바와 동일하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 그 기재를 생략한다.
본 발명은 그 적용에 있어서 하기 설명에 제시되거나 또는 도면에 예시된 성분의 배열 및 구성의 세부 사항으로 제한되지 않는다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하고 다양한 방식으로 실시되거나 또는 수행될 수 있다. 또한, 본원에 사용된 어구 및 전문 용어는 설명하기 위한 것이며 제한적인 것으로 간주되서는 안된다. 본원에서 "포함하는", "포함하는" 또는 "갖는", "함유하는", "포함한" 및 그의 변형의 사용은 그 다음에 열거된 항목 및 그의 등가물뿐만 아니라 부가 항목을 포괄한다는 것을 의미한다.
본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 개시내용과 관련하여 사용되는 과학적 및 기술적 용어는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 의미를 가져야 한다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서 수행된다. 일반적으로, 본원에 기재된 생화학, 효소학, 분자 및 세포 생물학, 미생물학, 바이러스학, 세포 또는 조직 배양, 유전학 및 단백질 및 핵 화학과 관련되어 사용되는 명명법 및 이의 기술은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고 통상적으로 사용되는 것이다. 본 개시내용의 방법 및 기술은 일반적으로, 관련 기술분야에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서, 또한 달리 표시되지 않는 한 본 명세서 전반에 걸쳐 인용되고 논의된 다양한 일반적인 방법 또는 언급된 지침 또는 프로토콜에 기재된 바와 같이 수행된다.
본 발명의 단백질 변이체는 우수한 GLP-1 유도능, 향상된 열 안정성 및 효소 저항성을 나타내어, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방에 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 단백질 변이체 P9-00(1-748-His), P9-01(10-748-His) 및 P9-02((10-37)-His-(38-748))의 GLP-1 유도능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 P9-02 기반 변이체들의 GLP-1 발현량을 ELISA로 관찰한 결과를 P9-02의 GLP-1 발현량에 대한 상대 비율로 나타낸 것이다.
도 3은 P9-02의 단백질 용융온도와 비교하여 P9-02 기반 변이체들의 단백질 용융온도(Tm)의 증감을 실시간 PCR로 관찰한 결과이다.
도 4는 페길화된 변이체 P9-2CA(P9-02((10-37)-His-(38-748)) C403A/C589A) 및 40 종의 P9-2CA 기반 변이체들의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 페길화된 P9-2CA 기반 변이체들의 GLP-1 유도능을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 전장 P9 기반 변이체 제작 및 효능 비교
1-1: C-말단에 6개의 히스티딘이 태깅된 전장 B2UM07 단백질(P9-00(1-748-His)(서열번호 113))의 클로닝
pET26b::P9-00(1-748-His)를 제작하기 위해, 서열번호 5와 서열번호 6의 프라이머를 이용하여 실시예 1-2에서 제작된 pET26b::P9-01(10-748-His)에서 획득한 제1 중간산물(5Kb), 및 서열번호 7과 서열번호 8의 프라이머를 이용하여 A. muciniphila genomic DNA(Promega, Wizard Genomic DNA purification kit 사용)에서 획득한 제2 중간산물(2Kb)를 각각 DNA 중합효소(pfu, SPD16-R250, 솔젠트)를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 제1 및 제2 산물에 DpnI 효소(FastDigest DpnI, 써모피셔 사이언티픽)를 처리한 후, Gibson Assembly Master Mix(E2611S, 뉴 잉글랜드 바이오랩)를 이용하여 하나의 플라스미드로 합성하였다. 합성 후, DH5α 수용성 세포에 형질전환시켜 LB 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 시퀀싱을 통해 돌연변이 여부를 확인하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
하기 표 5은 서열번호 5 내지 8의 프라이머 서열을 나타낸다.
pET26b_P9-his_F 5'-ttaactttaagaaggagatatacatatggaaaaaaacgcacccttttccgttatg-3'(서열번호 5)
pET26b_R 5'-ttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagttttccggaggattccagcttcagcat-3'(서열번호 6)
pET_P9_1_F 5'-cctccggaaaactcgagcaccaccaccaccaccactgagatccggctgctaacaaagccc-3'(서열번호 7)
pET_P9_748-his_R 5'-atgtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaatt-3'(서열번호 8)
1-2: P9-01(10-748-His)(서열번호 2)의 클로닝
B2UM07 단백질의 10 내지 748번 아미노산을 코딩하는 DNA (서열번호 3)를 NdeI과 XhoI 제한효소 서열을 포함한 프라이머 쌍으로 Amuc_1631 유전자에서 PCR 증폭시켰다. 발현벡터로 사용할 pET26b(+) 벡터 (노보진, USA)와 증폭된 PCR 산물에 NdeI과 XhoI 제한효소를 처리하고 정제시켰다. 이들을 라이게이션(ligation)시킨 뒤, DH5α 수용성 세포(competent cell)에 형질전환시키고 LB 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 시퀀싱을 통해 돌연변이 여부를 확인하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
1-3: P9-02((10-37)-His-(38-748))(서열번호 4)의 클로닝
pET26b::P9-02((10-37)-His-(38-748))를 제작하기 위해, 서열번호 9와 서열번호 12의 프라이머를 이용하여 실시예 1-2에서 제작된 pET26b::P9-01(10-748-His)에서 획득한 제1 중간산물(5Kb), 및 서열번호 10과 서열번호 11의 프라이머를 이용하여 A. muciniphila genomic DNA(Promega, Wizard Genomic DNA purification kit 사용)에서 획득한 제2 중간산물(2Kb)를 각각 DNA 중합효소(pfu, SPD16-R250, 솔젠트)를 이용하여 증폭시켰다. 증폭된 제1 및 제2 산물에 DpnI 효소(FastDigest DpnI, 써모피셔 사이언티픽)를 처리한 후, Gibson Assembly Master Mix(E2611S, 뉴 잉글랜드 바이오랩)를 이용하여 하나의 플라스미드로 합성하였다. 합성 후, DH5α 수용성 세포에 형질전환시켜 LB 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 시퀀싱을 통해 돌연변이 여부를 확인하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
하기 표 6은 서열번호 9 내지 12의 프라이머 서열을 나타낸다.
pET_P9_ΔHis_F 5'-agctggaatcctccggaaaatgagatccggctgctaacaaagccc-3'(서열번호 9)
pET_P9_ΔHis_R 5'-ttgttagcagccggatctcattttccggaggattccagcttcagca-3'(서열번호 10)
pET_P9(His-38)_F 5'-caccaccaccaccaccacgctacggacttcaaccaggtgggc-3'(서열번호 11)
pET_P9(His-38)_R 5'-gtggtggtggtggtggtgcgcagaggcgcaggaagtaatggc-3'(서열번호 12)
실시예 2: 전장 P9 기반 변이체의 발현 및 정제
LB 배지를 제조하기 위하여, 깨끗한 비커에 ~400 ml DW 및 마그네틱 바를 넣었다. 비커에 12.5 g의 LB 브로스(BD DifcoTM LB 브로스, 밀러)를 넣고 교반하면서 녹였다. 상기 용액을 측정 실린더로 옮기고 DW를 사용하여 부피를 500 ml로 조정하였다. 상기 용액 500 ml를 1 L 플라스크로 옮기고 플라스크의 상단을 알루미늄 호일로 덮고 플라스크를 고압 증기 멸균(121℃, 15분)으로 멸균하였다. ~40℃미만까지 냉각시키고 사용하기 전에 40 mg/ml 카나마이신 스톡 500 μl를 첨가하였다.
실시예 1에서 얻은 P9-00, P9-01 및 P9-02의 발현에 적합한 각각의 발현 플라스미드를 E. coli에 형질전환시키고, 상기 각각의 발현 플라스미드를 보유하는 형질전환된 E. coli의 단일 또는 다수의 콜로니를 25 ml LB 배지(40 μg/ml 카나마이신이 보충됨)에 접종하였다. OD600이 ~1.0에 도달할 때까지 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 항온처리하였다.
상기 균을 접종한 25 ml LB 배지를, 500 ml LB 배지를 함유하는 1 L 플라스크에 옮겼다. OD600이 0.7~0.8에 도달할 때까지 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 항온처리하였다. 단백질 발현을 유도하기 위하여, 250 μL의 1 M 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드(IPTG) 스톡을 첨가하고 4시간 동안 200 rpm으로 진탕시키면서 30℃에서 항온처리하였다. 이후, 원심 분리 (6000g, 20분)하여 세포를 수확하였다. 세포 펠릿은 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
Ni-NTA 크로마토그래피를 위한 E. coli 세포 용해물 제조를 위하여, 40 ml의 용해 완충액(2 mM 2-머캅토에탄올이 보충된 1X PBS(20X PBS 희석, 바이오세상))에 수확된 세포 펠렛을 재현탁시키고 100 ml 유리 비커에 옮겼다. 초음파 처리기(sonicator)의 프로브를 비커 바닥에서 1 cm 위의 위치에 놓았다. 1초 당 20kHz의 짧은 펄스 (펄스 켜짐, 45 μm 진폭) 후 1초 간격(펄스 꺼짐)을 240회 반복하여 8분 동안 얼음에서 세포 현탁액을 초음파 처리하였다(즉, 펄스 ON : OFF = 1초 : 1초, 45 μm 진폭, 8 분 처리; 현탁액은 항상 얼음 위에서 유지함). 이후, 얼음에서 8분 동안 냉각시키고, 상기 초음파 처리를 반복하였다. 그 다음, 4℃에서 20분 동안 36,000g로 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거하였다.
Ni-NTA 크로마토그래피를 수행하기 위하여, 60 ml 개방 컬럼 (바이오-라드사 제품)에 0.5 ml의 settled Ni-NTA 수지(HisPur Ni-NTA 수지, 써모피셔)를 첨가하였다. 1 컬럼 부피(CV)의 DW로 수지를 세척하고 2CV의 1X PBS로 수지를 평형화시켰다. 상기 컬럼에 상기 제조한 세포 용해물을 로딩하고 컬럼을 4℃에서 30분 동안 회전시켰다. 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 20 mM 이미다졸 및 2 mM 2-머캅토에탄올을 함유하는 세척 완충액 200ml로 수지를 세척하였다. 이후, 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 150 mM NaCl, 200 mM 이미다졸 및 2 mM 2-머캅토에탄올을 함유하는 용출 완충액 1 ml로 His-태그된 단백질을 용출시켰다. 이 단계를 10회 반복하여 각 분획을 별도의 튜브에 수집하였다. 상기 분획들을 SDS-PAGE로 분석하였다.
단백질 샘플의 투석을 위하여, 목표 단백질을 함유하는 1~5개의 분획을 수집하였다. 5~10분 동안 1xPBS로 투석 카세트(써모피셔 사이언티픽 Slide-A-Lyzer 투석 카세트(10K MWCO))를 수화시켰다. 수집된 단백질을 10 ml 실린지(syringe)를 사용하여 수화된 투석 카세트에 주입하였다. 차가운 1xPBS 완충액을 샘플 부피의 100배 이상으로 비커에 채우고 교반용 마그네틱 바를 넣었다. 이 비커에 단백질 샘플을 함유하는 투석 카세트를 첨가한 후, 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 새로운 1x PBS 완충액으로 비커를 다시 채우고 4℃에서 밤새 교반하였다. 10 ml 실린지를 사용하여 샘플을 수득하였다. 투석된 단백질 샘플은 100 μL의 분취량으로 -80℃에서 동결된 상태로 유지시켰다.
실시예 3: 전장 P9 기반 변이체의 GLP-1 발현 검정
3-1: 시험관내 분석을 위한 NCI-H716 세포 배양 및 ELISA 시험
사람의 장내에 존재하는 Human L cell 인 NCI-H716(ATCC® CCL-251TM)을 ATCC에서 분양 받아 본 실험에서 사용하였다. 배양액은 RPMI1640 (welgene; LM 011-51)과 10% FBS, 1% Penicillin-Streptomycin를 혼합하여 사용하였다. NCI-H716 세포를 상기 배양액에서 계대배양 후(Cell passage number 30 이하), 콜라겐 코팅된 96 well plate에 2X104-6X104 cells/200 μl로 접종하여, 1일 배양 후 사용하였다.
Plate의 배양액을 제거 후, 실시예 1 및 2에서 클로닝, 발현 및 정제된 단백질 변이체 P9-00, P9-01 및 P9-02를 0.05-0.1 mg/ml 농도로 각 well에 3번 반복하여 200 μl 주입하여 2시간 반응 후, 상층액을 분리하여 ELISA 분석하여 GLP-1 유도능을 확인하였다. ELISA 분석시 RayBio® Human/Mouse/Rat GLP-1 Enzyme Immunoassay kit를 이용하여 kit의 권장 프로토콜에 따라서 실험을 진행하였다.
3-2: 전장 P9 기반 변이체의 GLP-1 유도능 비교 결과
실시예 3-1에 따라 단백질 변이체 P9-00, P9-01 및 P9-02의 GLP-1 유도능을 측정한 결과, P9-01은 P9-00보다 약 3.5배 증가된 GLP-1 유도능을 나타내었으며, P9-02는 P9-01 대비 20% 이상 증가된 GLP-1 유도능을 나타내었다(도 1 참조).
실시예 4: P9-02((10-37)-His-(38-748)) 기반 추가 변이체의 제조
실시예 3-2에서 가장 우수한 GLP-1 유도능을 나타낸 P9-02를 기초로, 전체 플라스미드 부위 특이적 돌연변이 유도(whole plasmid site-directed mutagenesis) 방법을 사용하여 추가 변이체를 제작하였다. 실시예 1-3에서 제작된 P9-02 단백질을 코딩하는 pET26b::P9-02((10-37)-His-(38-748)) 플라스미드를 각 돌연변이체 별로 표 6에 기재되어 있는 상보적인 변이원성 프라이머 쌍(complementary mutagenic primer pair)을 이용하여 플라스미드 전체를 PCR로 증폭시켰다. 이때 high-fidelity non-strand-displacing DNA 중합효소(nPfu-forte, 엔지노믹스)를 사용하였다. 증폭된 PCR 산물에 DpnI 효소 (FastDigest DpnI, 써모피셔 사이언티픽)를 처리한 후, DH5α 수용성 세포에 형질전환시켜 LB 플레이트에 도말하였다. 단일 콜로니에서 플라스미드를 추출하여 시퀀싱을 통해 돌연변이 여부를 확인하고, 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.
하기 표 7는 서열번호 13 내지 112의 부위 특이적 돌연변이 유도용 프라이머 서열을 나타낸다.
P9_G45A_F 5'-gacttcaaccaggtggccaagcaaatgtccctg-3' (서열번호 13)
P9_G45A_R 5'-cagggacatttgcttggccacctggttgaagtc-3' (서열번호 14)
P9_G45V_F 5'-gacttcaaccaggtggtcaagcaaatgtccctg-3' (서열번호 15)
P9_G45V_R 5'-cagggacatttgcttgaccacctggttgaagtc-3' (서열번호 16)
P9_G45L_F 5'-tacggacttcaaccaggtgctaaagcaaatgtccctgctgc-3' (서열번호 17)
P9_G45L_R 5'-gcagcagggacatttgctttagcacctggttgaagtccgta-3' (서열번호 18)
P9_T263I_F 5'-tcaaaatctccatgggtatagaactcaccggcatcggc-3' (서열번호 19)
P9_T263I_R 5'-gccgatgccggtgagttctatacccatggagattttga-3' (서열번호 20)
P9_T263V_F 5'-cgtttcaaaatctccatgggtgtggaactcaccggcatc-3' (서열번호 21)
P9_T263V_R 5'-gatgccggtgagttccacacccatggagattttgaaacg-3' (서열번호 22)
P9_V423I_F 5'-aaaatgtggatggcctgataattgacctgcgcagc-3' (서열번호 23)
P9_V423I_R 5'-gctgcgcaggtcaattatcaggccatccacatttt-3' (서열번호 24)
P9_A492L_F 5'-catccgcctctgaaattctgctagcggcccttcaggattac-3' (서열번호 25)
P9_A492L_R 5'-gtaatcctgaagggccgctagcagaatttcagaggcggatg-3' (서열번호 26)
P9_A492V_F 5'-cctctgaaattctggttgcggcccttcagga-3' (서열번호 27)
P9_A492V_R 5'-tcctgaagggccgcaaccagaatttcagagg-3' (서열번호 28)
P9_L495I_F 5'-ttctggctgcggccattcaggattacggc-3' (서열번호 29)
P9_L495I_R 5'-gccgtaatcctgaatggccgcagccagaa-3' (서열번호 30)
P9_A501V_F 5'-gattacggccgcgtcgtgattgtgggg-3' (서열번호 31)
P9_A501V_R 5'-ccccacaatcacgacgcggccgtaatc-3' (서열번호 32)
P9_A501I_F 5'-caggattacggccgcatcgtgattgtggggga-3' (서열번호 33)
P9_A501I_R 5'-tcccccacaatcacgatgcggccgtaatcctg-3' (서열번호 34)
P9_G733A_F 5'-ggaactccgcgaagccatcaacatcgtcc-3' (서열번호 35)
P9_G733A_R 5'-ggacgatgttgatggcttcgcggagttcc-3' (서열번호 36)
P9_G733V_F 5'-cggaactccgcgaagtcatcaacatcgtcca-3' (서열번호 37)
P9_G733V_R 5'-tggacgatgttgatgacttcgcggagttccg-3' (서열번호 38)
P9_G369A_F 5'-gaaggatgaacttgccaaagctgaaatcattgaacttacc-3' (서열번호 39)
P9_G369A_R 5'-ggtaagttcaatgatttcagctttggcaagttcatccttc-3' (서열번호 40)
P9_K368Q_F 5'-cctctgaaggatgaacttgcccagggtgaaatcattgaacttacc-3' (서열번호 41)
P9_K368Q_R 5'-ggtaagttcaatgatttcaccctgggcaagttcatccttcagagg-3' (서열번호 42)
P9_C589S_F 5'-atgaccagattacgcccagcaccaactacaaaaag-3' (서열번호 43)
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P9_C589A_R 5'-agtcctttttgtagttggtggcgggcgtaatctggtcatag-3' (서열번호 86)
P9_C403A_F 5'-cggagaccgccgcgctgccaaggatgtc-3' (서열번호 87)
P9_C403A_R 5'-gacatccttggcagcgcggcggtctccg-3' (서열번호 88)
P9_K46A_F 5'-cttcaaccaggtgggcgcgcaaatgtccctgctg-3' (서열번호 89)
P9_K46A_R 5'-cagcagggacatttgcgcgcccacctggttgaag-3' (서열번호 90)
P9_R59A/K60A_F 5'-gctccagaatttccacttctccgccgcagaattcagcgatgaactatcc-3' (서열번호 91)
P9_R59A/K60A_R 5'-ggatagttcatcgctgaattctgcggcggagaagtggaaattctggagc-3' (서열번호 92)
P9_K82A_F 5'-gcgcaaggtagaccccaacgcaatattcttcacccagcag-3' (서열번호 93)
P9_K82A_R 5'-ctgctgggtgaagaatattgcgttggggtctaccttgcgc-3' (서열번호 94)
P9_K94A/R95A/K96A_F 5'-ccagcaggacgtagacgccctcgcagcagcatacggtaaggagctggacgac-3' (서열번호 95)
P9_K94A/R95A/K96A_R 5'- gtcgtccagctccttaccgtatgctgctgcgagggcgtctacgtcctgctgg-3' (서열번호 96)
P9_K368A_F 5'-cctctgaaggatgaacttgccgcaggtgaaatcattgaacttac-3' (서열번호 97)
P9_K368A_R 5'-gtaagttcaatgatttcacctgcggcaagttcatccttcagagg-3' (서열번호 98)
P9_K482A_F 5'-gccccattgtggtgctcatcaatgcactcagcgcatc-3' (서열번호 99)
P9_K482A_R 5'-gatgcgctgagtgcattgatgagcaccacaatggggc-3' (서열번호 100)
P9_R500A_F 5'-cttcaggattacggcgccgccgtgattgtggg-3' (서열번호 101)
P9_R500A_R 5'-cccacaatcacggcggcgccgtaatcctgaag-3' (서열번호 102)
P9_K512A_F 5'-gaatccaccttcggggcggggtctgtgcagca-3' (서열번호 103)
P9_K512A_R 5'-tgctgcacagaccccgccccgaaggtggattc-3' (서열번호 104)
P9_R531A_F 5'-tttcttcgcggccgcagaccgtgcgggc-3' (서열번호 105)
P9_R531A_R 5'-gcccgcacggtctgcggccgcgaagaaa-3' (서열번호 106)
P9_C34S_F 5'-cgccattacttccagcgcctctgcgca-3'(서열번호 107)
P9_C34S_R 5'-tgcgcagaggcgctggaagtaatggcg-3'(서열번호 108)
P9_S36H/A37H_F 5'-cgccattacttcctgcgcccatcatcaccaccaccaccaccacg-3` (서열번호 109)
P9_S36H/A37H_R 5'-cgtggtggtggtggtggtgatgatgggcgcaggaagtaatggcg-3'(서열번호 110)
P9_S486A_F 5'-gctcatcaataaactcagcgcagccgcctctgaaatt-3' (서열번호 111)
P9_S486A_R 5'-aatttcagaggcggctgcgctgagtttattgatgagc-3' (서열번호 112)
돌연변이 여부를 확인한 결과, 하기 표 8에 기재된 총 63개의 P9-02 기반 추가 변이체를 위한 플라스미드가 제작되었음을 확인하였다.
Figure pat00007
상기 표에서 K324D/A534V, M414I/K555R, 및 R438V/G446R은 PCR 오류로 인해 수득되었다. 또한, 다중 변이체 중, K368A/K46A, K368A/K82A, K368A/K94A/R95A/K96A, C403A/C589A, C403A/C589A/S36H/A37H, C403A/C589A/K46A, C403A/C589A/K82A, C403A/C589A/K94A/R95A/K96A, C403A/C589A/K368A, C589A/C34S, 및 C589A/S36H/A37H는 각각의 해당 단일 변이체 제작을 위한 프라이머를 이용하여 순차적으로 돌연변이를 일으킴으로써 제작하였다.
각각의 변이체 발현에 적합한 플라스미드를 실시예 2와 동일한 방법으로 E.coli에 형질전환시켜 각각의 변이체를 발현시키고, 실시예 2에서와 동일한 방법으로 각각의 변이체를 정제하였다.
실시예 5: P9-02((10-37)-His-(38-748)) 기반 추가 변이체의 GLP-1 유도능 확인
실시예 3-1과 동일한 방법으로 변이체의 GLP-1 유도능을 측정하여, P9-02를 기초로 한 추가 변이체들 각각의 P9-02 대비 GLP-1의 증감을 하기 표 9에 나타내었다.
　
　		 P9 variants 1차 실험 2 차 실험
fold p-value fold p-value
1 P9-02(10-37)-His-(38-748) 1.00
2 C34A 0.33 ***
3 C34S 0.27 *** 0.27 ***
4 S36H/A37H 1.05 - 1.03 -
5 G45A 1.32 **
6 G45L 0.01 ***
7 G45V 0.01 ***
8 K46A 0.69 **
9 R59A/K60A 0.39 ***
10 V78L 0.73 -
11 K82A 0.76 **
12 K94A/R95A/K96A 1.01 - 1.03 -
13 M213Q 1.00 -
14 A231F 0.00 ***
15 A251P 0.48 ***
16 T263I 1.41 **
17 T263L 0.07 -
18 T263V 1.24 *
19 D307A 0.97 -
20 K324D 0.35 -
21 K324D/A534V 0.01 ***
22 K324N 0.74 ***
23 K368A 1.28 ***
24 K368A/K46A 0.75 ***
25 K368A/K82A 0.56 ***
26 K368A/K94A/R95A/K96A 1.58 ***
27 G369A 0.53 **
28 R402S 0.34 ***
29 R402S/Y583F 0.49 ***
30 C403A 1.24 ** 1.61 ***
31 C403A/C589A 1.62 *** 1.50 *
32 C403A/C589A/S36H/A37H 1.11 * 1.53 *
33 C403A/C589A/K46A 0.93 - 1.06 -
34 C403A/C589A/K82A 1.15 ** 1.47 **
35 C403A/C589A/K94A/
R95A/K96A		 1.40 *
36 C403A/C589A/K368A 1.06 - 1.45 *
37 C403T 0.07 ***
38 M414F 0.84 -
39 M414I 0.23 ***
40 M414I/K555R 0.71 *
41 V423I 0.44 ***
42 R438V 0.31 ***
43 R438V/G446R 0.32 ***
44 T445I 0.76 - 0.97 -
45 A465D 0.07 ***
46 N467D 0.47 ***
47 K482A 0.06 ***
48 S486A 0.91 - 0.95 -
49 A492L 1.02 -
50 A492V 0.16 ***
51 A495I 0.45 ***
52 R500A 0.38 ***
53 A501I 0.01 ***
54 A501V 0.00 ***
55 K512A 0.00 ***
56 R531A 0.41 ***
57 A534F 0.21 ***
58 C589A 2.59 * 4.44 ***
59 C589A/C34S 0.51 **
60 C589A/S36H/A37H 1.44 **
61 C589S 1.78 ***
62 C589T 1.49 ***
63 G733A 1.24 **
64 G733V 1.29 ***
상기 표 9 및 도 2에 나타낸 바와 같이, P9-02를 기초로 한 추가 변이체들 중에서 G733A, G45A, T263I, T263V, K368A, K368A/K94A/R95A/K96A, C403A, C403A/C589A, C403A/C589A/S36H/A37H, C403A/C589A/K82A, C403A/C589A/K94A/R95A/K96A, C403A/C589A/K368A, C589A, C589A/S36H/A37H, C589S, C589T 및 G733V 변이를 추가로 포함하는 변이체에서 P9-02보다도 GLP-1 유도능이 현저히 향상됨을 확인하였다.
실시예 6: P9-02((10-37)-His-(38-748)) 기반 추가 변이체의 온도 안정성 확인
실시예 4에서 제조한 각각의 변이체의 온도 안정성을 확인하기 위하여, ThermoFisher Cat#4461146 kit를 제조사의 프로토콜에 따라서 이용하여 각 단백질의 Tm을 측정하였다.
단백질의 용융 반응을 일으키기 위하여, Protein Thermal ShiftTM 염료 (1000X)는 8X로 희석하여 준비하고, 반응 플레이트는 얼음 위에 놓았다. 반응 플레이트에 5 μL Protein Thermal ShiftTM 버퍼 및 12.5 μL 단백질 샘플을 첨가하였다. 상기 희석된 8X Protein Thermal Shift Dye 2.5 μL를 첨가하고 위 아래로 10회 피펫팅하여 혼합하였다. MicroAmp® 광학 접착 필름으로 플레이트를 밀봉하고 1분 동안 1000 rpm으로 회전시킨 다음 상기 플레이트를 얼음 위에 놓았다.
분석을 위하여, 상기 플레이트를 로딩시키고, 실시간 PCR을 아래와 같이 설정하여 실행하였다; 웰당 반응 부피: 20 μL, mode 램프 모드: 연속, profile 열 프로파일(1 단계, 온도 14℃, 2분, 1.6℃/s; 2 단계, 온도 99℃까지 0.05℃/s로 온도 상승), 여기 필터: x4 (580 nm), 방출 필터: m4 (623 nm)의 광학 필터.
실험 결과, P9-01(10-748-His)와 P9-02((10-37)-His-(38-748))의 Tm은 각각 47.6℃와 47.2℃로 유사하게 측정되었다.
한편, P9-02를 기초로 한 추가 변이체들 중 G733A, S36H/A37H, K94A/R95A/K96A, M213Q, M414F, T445I, S486A 및 A492L 변이를 포함하는 P9 변이체에서 P9-02에 비하여 Tm이 향상됨을 관찰하였다(도 3).
P9-02를 기초로 한 추가 변이체들 각각의 P9-02 대비 Tm 증감은 하기 표 10에 나타낸다.
　 P9 variants ΔTm(℃) P9 variants ΔTm(℃)
1 P9-02(10-37)-His-(38-748) 0 33 C403A/C589A/K46A -3.9
2 C34A 0.8 34 C403A/C589A/K82A -8.4
3 C34S 0.3 35 C403A/C589A/K94A/R95A/K96A N/A
4 S36H/A37H 0.7 36 C403A/C589A/K368A -2.6
5 G45A -1.0 37 C403T -0.3
6 G45L -7.9 38 M414F 0.5
7 G45V -9.4 39 M414I 0.0
8 K46A -2.0 40 M414I/K555R -0.2
9 R59A/K60A -2.6 41 V423I 0.0
10 V78L -2.9 42 R438V 3.0
11 K82A -6.5 43 R438V/G446R 0.9
12 K94A/R95A/K96A 0.8 44 T445I 1.6
13 M213Q 0.7 45 A465D -5.3
14 A231F -6.8 46 N467D -0.2
15 A251P 4.9 47 K482A -4.8
16 T263I -1.3 48 S486A 0.6
17 T263L -0.6 49 A492L 0.2
18 T263V -0.9 50 A492V -6.9
19 D307A -0.7 51 A495I -3.5
20 K324D 2.2 52 R500A -1.5
21 K324D/A534V 0.6 53 A501I N/D
22 K324N 1.8 54 A501V -3.7
23 K368A -0.8 55 K512A 0.1
24 K368A/K46A -2.7 56 R531A -1.5
25 K368A/K82A -7.5 57 A534F -2.6
26 K368A/K94A/R95A/K96A -0.2 58 C589A -1.7
27 G369A 0.9 59 C589A/C34S -2.0
28 R402S 1.1 60 C589A/S36H/A37H -2.0
29 R402S/Y583F 0.1 61 C589S -3.6
30 C403A -0.1 62 C589T -2.9
31 C403A/C589A -2.3 63 G733A 1.4
32 C403A/C589A/S36H/A37H -2.0 64 G733V -1.2
상기 실험 결과들을 통하여, P9-02에서 G733A, S36H/A37H, K94A/R95A/K96A, M213Q, M414F, T445I, S486A, 및 A492L 변이를 추가로 포함하는 변이체가 P9-02에 비하여 향상된 온도 안정성을 나타냄을 알 수 있었다.
특히, P9-02에서 G733A 변이를 추가로 포함하는 P9 단백질 변이체에서 GLP-1 유도능 및 온도 안정성이 모두 향상됨을 확인하였다.
실시예 7: P9-2CA(P9-02((10-37)-His-(38-748)) C403A/C589A) 기반 추가 변이체의 제조
실시예 4에서 제작된 pET26b::P9-02((10-37)-His-(38-748)) C403A/C589A를 템플레이트로 하여, 실시예 4에서와 동일한 방법을 사용하여 추가 변이체를 제작하였다.
하기 표 11은 서열번호 114 내지 193의 부위 특이적 돌연변이 유도용 프라이머 서열(5'-> 3'방향임)을 나타낸다.
추가적인 변이 Forward Reverse
1 Q43C gcggctacggacttcaactgcgtgggcaagcaaatgtcc (서열번호 114) ggacatttgcttgcccacgcagttgaagtccgtagccgc (서열번호 115)
2 R59C cagaatttccacttctcctgcaaagaattcagcgatg (서열번호 116) catcgctgaattctttgcaggagaagtggaaattctg (서열번호 117)
3 R95C gacgtagacgccctcaaatgcaaatacggtaaggagctg (서열번호 118) cagctccttaccgtatttgcatttgagggcgtctacgtc (서열번호 119)
4 K99C gccctcaaaagaaaatacggttgcgagctggacgactaccttatg (서열번호 120) cataaggtagtcgtccagctcgcaaccgtattttcttttgagggc (서열번호 121)
5 S107C ctggacgactaccttatgtgcggccagatg (서열번호 122) catctggccgcacataaggtagtcgtccag (서열번호 123)
6 A119C cccaggccatgcactgcctttaccgccagc (서열번호 124) gctggcggtaaaggcagtgcatggcctggg (서열번호 125)
7 K138C cctatgcgcgggatttgctgaaatgcggaggcttcacc (서열번호 126) ggtgaagcctccgcatttcagcaaatcccgcgcatagg (서열번호 127)
8 T142C gctgaaaaagggaggcttctgctttgacaaagacaagtct (서열번호 128) agacttgtctttgtcaaagcagaagcctccctttttcagc (서열번호 129)
9 A158C cgccgcaaaacagcctgctggcccaaggatgag (서열번호 130) ctcatccttgggccagcaggctgttttgcggcg (서열번호 131)
10 K161C acagccgcgtggccctgcgatgaggcggaaatg (서열번호 132) catttccgcctcatcgcagggccacgcggctgt (서열번호 133)
11 A164C cgtggcccaaggatgagtgcgaaatgcagcaggtctg (서열번호 134) cagacctgctgcatttcgcactcatccttgggccacg (서열번호 135)
12 A189C cctgcgccgtgaaaccgtatgccgcctggcca (서열번호 136) tggccaggcggcatacggtttcacggcgcagg (서열번호 137)
13 K193C gtagcgcgcctggcctgcgaacagaacaagccc (서열번호 138) gggcttgttctgttcgcaggccaggcgcgctac (서열번호 139)
14 N203C ccgatcccctggcctgtgaaaaacccgcgg (서열번호 140) ccgcgggtttttcacaggccaggggatcgg (서열번호 141)
15 R220C gcgttatgaacgcattcagtgcaatattcaggaaacgg (서열번호 142) ccgtttcctgaatattgcactgaatgcgttcataacgc (서열번호 143)
16 K258C gcgccaagtggaccgtttctgcatctccatgggtacggaac (서열번호 144) gttccgtacccatggagatgcagaaacggtccacttggcgc (서열번호 145)
17 S311C gccattgactccgacaactgtggagaaatggtg (서열번호 146) caccatttctccacagttgtcggagtcaatggc (서열번호 147)
18 A332C gtggtggatatgatccgcggatgcgaaaatacccaga (서열번호 148) tctgggtattttcgcatccgcggatcatatccaccac (서열번호 149)
19 S358C acgctgacccgctgcaaggtacctctg (서열번호 150) cagaggtaccttgcagcgggtcagcgt (서열번호 151)
20 K363C ccgctccaaggtacctctgtgcgatgaacttgccaaaggtg (서열번호 152) cacctttggcaagttcatcgcacagaggtaccttggagcgg (서열번호 153)
21 E379C aacttaccggagctccgtgcggcaggaaccgcattgg (서열번호 154) ccaatgcggttcctgccgcacggagctccggtaagtt (서열번호 155)
22 K409C gccaaggatgtcaaatgcatcctggaacggatgaacaa (서열번호 156) ttgttcatccgttccaggatgcatttgacatccttggc (서열번호 157)
23 K416C aaaatcctggaacggatgaactgcgaaaatgtggatggcctggta (서열번호 158) taccaggccatccacattttcgcagttcatccgttccaggatttt (서열번호 159)
24 S464C gcggcaacgtggatatcaaatgcgcccacaacc (서열번호 160) ggttgtgggcgcatttgatatccacgttgccgc (서열번호 161)
25 R468C tcaaatccgcccacaactgccagaaactcttcaat (서열번호 162) attgaagagtttctggcagttgtgggcggatttga (서열번호 163)
26 Q523C cagcctgtggacatcggctgctacctgcctttcttcgcg (서열번호 164) cgcgaagaaaggcaggtagcagccgatgtccacaggctg (서열번호 165)
27 A530C tgcctttcttcgcgtgcagagaccgtgcgg (서열번호 166) ccgcacggtctctgcacgcgaagaaaggca (서열번호 167)
28 Q562C caaaggcgtggaaagcgatatctgccttcccaccgctacg (서열번호 168) cgtagcggtgggaaggcagatatcgctttccacgcctttg (서열번호 169)
29 D575C ggcattcgaactgggagaatgcattctggactacgcgatg (서열번호 170) catcgcgtagtccagaatgcattctcccagttcgaatgcc (서열번호 171)
30 Q585C tacgcgatgccctatgactgcattacgcccgccaccaac (서열번호 172) gttggtggcgggcgtaatgcagtcatagggcatcgcgta (서열번호 173)
31 T590C gaccagattacgcccgcctgcaactacaaaaaggactc (서열번호 174) gagtcctttttgtagttgcaggcgggcgtaatctggtc (서열번호 175)
32 S596C ccaactacaaaaaggactgctccatcgcggccat (서열번호 176) atggccgcgatggagcagtcctttttgtagttgg (서열번호 177)
33 A610C gtgctgaaagatgccagctgcaagcgcgtggaaaaagac (서열번호 178) gtctttttccacgcgcttgcagctggcatctttcagcac (서열번호 179)
34 A627C gattgccagggaagatatctgcatgatgaaacagcgcatc (서열번호 180) gatgcgctgtttcatcatgcagatatcttccctggcaatc (서열번호 181)
35 K634C gccatgatgaaacagcgcatctgcgacaacaagctttccctgaac (서열번호 182) gttcagggaaagcttgttgtcgcagatgcgctgtttcatcatggc (서열번호 183)
36 A651C ggaacaggaaaactcctgcctggaagaacgccgc (서열번호 184) gcggcgttcttccaggcaggagttttcctgttcc (서열번호 185)
37 S658C ggaagaacgccgcaaatgcatcaacaaggaacgt (서열번호 186) acgttccttgttgatgcatttgcggcgttcttcc (서열번호 187)
38 K700C gcccctggcggatccggaatgcgacaatgaacaattcatgca (서열번호 188) tgcatgaattgttcattgtcgcattccggatccgccaggggc (서열번호 189)
39 E710C caattcatgcacctggcgtgcgaccccacggcagaactg (서열번호 190) cagttctgccgtggggtcgcacgccaggtgcatgaattg (서열번호 191)
40 S745C caggatatgctgaagctggaatgctccggaaaatg (서열번호 192) cattttccggagcattccagcttcagcatatcctg (서열번호 193)
돌연변이 여부를 확인한 결과, 하기 표 12에 기재된 총 40개의 P9-2CA 기반 추가 변이체를 위한 플라스미드가 제작되었음을 확인하였다.
Q43C/C403A/C589A A164C/C403A/C589A E379C/C403A/C589A C403A/C589A/T590C
R59C/C403A/C589A A189C/C403A/C589A C403A/K409C/C589A C403A/C589A/S596C
R95C/C403A/C589A K193C/C403A/C589A C403A/K416C/C589A C403A/C589A/A610C
K99C/C403A/C589A N203C/C403A/C589A C403A/S464C/C589A C403A/C589A/A627C
S107C/C403A/C589A R220C/C403A/C589A C403A/R468C/C589A C403A/C589A/K634C
A119C/C403A/C589A K258C/C403A/C589A C403A/Q523C/C589A C403A/C589A/A651C
K138C/C403A/C589A S311C/C403A/C589A C403A/A530C/C589A C403A/C589A/S658C
T142C/C403A/C589A A332C/C403A/C589A C403A/Q562C/C589A C403A/C589A/K700C
A158C/C403A/C589A S358C/C403A/C589A C403A/D575C/C589A C403A/C589A/E710C
K161C/C403A/C589A K363C/C403A/C589A C403A/Q585C/C589A C403A/C589A/S745C
하기와 같이 각각의 변이체 발현에 적합한 플라스미드를 E.coli에 형질전환시켜 각각의 변이체를 발현시키고 정제하였다.
콜로니를 34 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 10 mL의 TB 배지에 접종하여 P9-2CA 기반 추가 변이체의 발현을 위한 플라스미드를 보유하는 E.coli BL21 (DE3) 의 새로운 배양물을 준비하였다. 0.5%(w/v) 글리세롤, 0.05%(w/v) 글루코스, 0.4%(w/v) 락토스, 34 μg/ml 클로람페니콜 및 50 μg/ml 카나마이신이 보충된 500 mL TB 배지에 10 ml 배양물을 접종하였다. OD600 값이 4.0에 도달할 때까지 200 rpm으로 진탕시키면서 25℃에서 밤새 16 ~ 18시간 동안 세포를 항온처리하였다. 이후, 원심분리 (6000g, 20분)하여 세포를 수확하고 세포 펠릿은 사용하기 전까지 <-60℃에서 동결시켰다.
1X PBS (20X PBS 희석, 바이오세상) 및 2 mM 2-머캅토에탄올을 포함하는 냉각된 50 mL 용해 완충액으로 세포를 재현탁시키고, 실시예 2와 동일하게 초음파 처리하였다 (증폭 40 %). 이후, 샘플을 5분 동안 냉각시킨 후, 상기 초음파 처리 단계를 반복하였다. 그 다음, 4℃에서 20분 동안 20,000g로 원심 분리하여 세포 잔해물을 제거하였다.
41종 P9 변이체(P9-2CA 변이체, 및 40 종의 P9-2CA 기반 추가 변이체)를 Ni-NTA 및 음이온-교환 크로마토그래피를 통해 정제하였다.
먼저, Ni-NTA 크로마토그래피를 수행하기 위하여, 용해 완충액으로 평형화된 2 ml Ni-NTA 세파로스 수지를 함유하는 개방 컬럼을 준비하였다. 준비된 컬럼에 세포 용해물을 로딩하고 30 ~ 60분 동안 회전시켰다. 200 mL 세척 완충액 1 [150 mM NaCl, 15 mM 이미다졸 (pH 8.0) 및 2 mM 2-머캅토에탄올로 보충된 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충액]로 수지를 세척하였다. 이후, 50 mL 세척 완충액 2 [15 mM 이미다졸 (pH 8.0) 및 2 mM 2-머캅토에탄올로 보충된 20 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충액]로 수지를 세척하였다. 이후, 25 mL 용출 완충액 (200 mM 이미다졸 및 2 mM 2-머캅토에탄올로 보충된 20 mM Tris-HCl 완충액, pH 7.0)로 His-태깅된 단백질을 용출시켰다.
이후, 용출된 His-태깅된 단백질을 수집하여, 하기의 조건에서 음이온 교환 크로마토그래피(Hitrap Q HP 5ml)를 수행하였다.
Q-A 완충액: 20mM Tris-HCl, 1mM CaCl2 및 2mM TCEP(tris(2-carboxyethyl)phosphine), pH 7
Q-B 완충액: 20mM Tris-HCl, 1M NaCl, 1mM CaCl2 및 2mM TCEP, pH 7
유속: 5 ml/분
Q-A 완충액으로 평형화된 Hitrap Q HP (5ml) 컬럼 (싸이티바사 제품)을 준비하였다. 25 mL Q-A 완충액으로 His-태깅된 단백질 샘플을 2배 희석하고, 평형화된 컬럼에 펌프로 샘플을 로딩하였다. 이온 강도를 0.4 M NaCl (40% Q-B 완충액)까지 점진적으로 증가시키며 용출을 시작하였다. 순수한 2CA 기반 변이체를 함유하는 분획을 수집하였다. 상기 분획들을 SDS-PAGE로 분석하였다.
상기 정제된 단백질 변이체는 환원제인 TCEP가 존재하는 하기의 완충액에서 Cys-특이적 페길화되었다.
완충액: 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl 및 2 mM TCEP, pH 7
2CA 기반 변이체의 농도를 2.4 μM으로 조정하고, 100% DMSO에 5mM 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 말레이미드 (분자량 2000) (10 mg/ml)를 함유하는 100x 페길화 시약을 준비하였다. 2.4 μM 변이체 및 50 μM 페길화 시약을 실온에서 2시간 동안 반응시킨 후, 투석을 통해 페길화된 변이체의 완충액을 PBS 완충액으로 교환하였다.
DTT 및 2-머캅토에탄올과 같은 다른 환원제와는 달리, TCEP는 티올-기를 가지지 않는 환원제이므로 페길화 시약의 말레이미드 기와 반응하지 않는다. 따라서 P9 변이체의 시스테인은 환원 상태로 유지하면서 안정적으로 Cys-말레이미드 반응을 통해 Cys-특이적 페길화를 수행하였다.
페길화된 P9-2CA 변이체 및 40 종의 P9-2CA 기반 변이체의 SDS-PAGE 결과는 도 4에 나타낸다. 각 샘플을 0.05 mg/ml로 희석하여 세포 실험에 사용하였다.
실시예 8: 페길화된 P9-2CA(P9-02((10-37)-His-(38-748)) C403A/C589A) 기반 추가 변이체의 GLP-1 유도능 측정 (L-cell)
실시예 3-1과 동일한 방법으로 실시예 7에서 제조된 41종의 페길화된 변이체의 GLP-1 유도능을 측정하여, P9-2CA를 기초로 한 추가 변이체들 각각의 P9-2CA 대비 GLP-1의 증감을 하기 표 13에 나타낸다.
　 total GLP-1 (pg/ml) unpaired t-test 　
　 triple average STDEV p value
1 Q43C 2147.232 1925.314 1925.314 1999.287 128.1249 0.0093 **
2 R59C 1483.617 1164.228 1790.261 1479.369 313.0381 0.0048 **
3 R95C 5313.445 4511.384 5645.43 5156.753 583.0347 0.0129 *
4 K99C 5313.445 4580.259 5031.383 4975.029 369.8273 0.0085 **
5 S107C 4284.864 4692.652 3616.085 4197.867 543.5309 0.0994 ns
6 A119C 4925.781 4985.851 4749.879 4887.17 122.6325 0.0049 **
7 K138C 5378.242 4636.115 5731.619 5248.659 559.1296 0.01 *
8 T142C 5139.249 5031.383 5361.969 5177.534 168.5855 0.0029 **
9 A158C 8072.169 8760.39 7854.994 8229.184 472.6794 0.0002 ***
10 K161C 9335.989 9307.741 9623.228 9422.32 174.5643 <0.0001 ****
11 A164C 7150.699 6853.681 6089.732 6698.037 547.3404 0.0012 **
12 A189C 1056.635 1099.09 908.0768 1021.267 100.2979 0.0011 **
13 K193C 11163.67 10765.01 10896.29 10941.66 203.1648 <0.0001 ****
14 N203C 6812.269 5611.319 5836.783 6086.79 638.3164 0.0037 **
15 R220C 1000.544 750.2601 819.1758 856.6598 129.2836 0.0009 ***
16 K258C 8.565073 11.70263 7.726549 9.331418 2.095895 0.0003 ***
17 S311C 21612.47 21547.08 24250.14 22469.9 1542.078 <0.0001 ****
18 A332C 17694.8 17587.88 17748.5 17677.06 81.76543 <0.0001 ****
19 S358C 11368.5 11861.18 11299.81 11509.83 306.209 <0.0001 ****
20 K363C 22.31521 32.49304 35.15665 29.9883 6.777239 0.0003 ***
21 E379C 5890.087 8760.39 8096.667 7582.381 1502.673 0.0093 **
22 K409C 3465.884 3716.062 4182.238 3788.061 363.5638 0.2374 ns
23 K416C 6372.925 7348.402 7216.002 6979.109 529.1285 0.0008 ***
24 S464C 3352.259 4622.088 4706.894 4227.08 758.8033 0.1505 ns
25 R468C 5378.242 6145.345 5297.368 5606.985 467.9839 0.0039 **
26 Q523C 3795.73 3583.36 3682.433 3687.174 106.2642 0.2482 ns
27 A530C 5466.438 5696.225 6676.722 5946.462 642.776 0.0046 **
28 Q562C 7644.002 7207.324 6351.095 7067.474 657.7014 0.0013 **
29 D575C 8012.318 7895.352 5763.635 7223.769 1265.864 0.0074 **
30 Q585C 6351.095 6258.38 5123.928 5911.134 683.3149 0.0056 **
31 T590C 3696.738 3897.721 3762.553 3785.67 102.4662 0.1625 ns
32 S596C 4718.865 4649.978 5184.565 4851.136 290.8051 0.0084 **
33 A610C 5339.317 5418.417 5466.438 5408.057 64.19038 0.0015 **
34 A627C 1941.252 3740.486 3696.738 3126.158 1026.392 0.7875 ns
35 K634C 4663.675 4595.593 4014.062 4424.443 357.0271 0.0307 *
36 A651C 8423.119 8398.381 8623.66 8481.72 123.5443 <0.0001 ****
37 S658C 8472.812 7803.01 7400.654 7892.159 541.6101 0.0004 ***
38 K700C 2010.99 1814.275 1993.324 1939.53 108.8328 0.0077 **
39 E710C 5780.612 5245.92 5123.928 5383.487 349.2876 0.0036 **
40 S745C 4788.773 4436.224 4014.062 4413.02 387.8766 0.035 *
2CA - 3852.134 3071.471 3017.744 3313.783 466.9987 　 　
P9-01 1133.259 1139.945 834.6151 1035.94 174.3844 　 　
PBS 8.976569 7.392752 2.05063 6.139984 3.628943 　 　
P9-01을 제외한 모든 P9 변이체(2CA, No.1~40)를 Cys-특이적 페길화시켰다. 도 5에서 그래프 X 축의 숫자 1~40은 P9 변이체에 임의로 부여한 번호이며, 표 13에서 표기한 변이체와 동일하다. 2CA는 각 P9 변이체(No.1~40)의 템플레이트인 대조군 단백질이다.
상기 표 13 및 도 5에서 나타낸 바와 같이, 페길화된 P9의 GLP-1 유도능을 비교한 결과, 전반적으로 GLP-1 유도능이 증가하였다. 2CA를 기초로 한 추가 변이체들 중 Q43C, R59C, A189C, R220C, K258C, K363C, 및 K700C 변이를 포함하는 P9 변이체 (No. 1, 2, 12, 15, 16, 20, 및 38 변이체)에 페길화시켰을 때, (야생형에 비해서는 GLP-1 유도능이 증가하였으나) 2CA에 비하여 GLP-1 유도능이 감소함을 확인하였다. 또한, 2CA를 기초로 한 추가 변이체들 중 K99C, A119C, K138C, T142C, A158C, K161C, A164C, K193C, N203C, S311C, A332C, S358C, E379C, K416C, R468C, A530C, Q562C, D575C, Q585C, S596C, A610C, A651C, S658C, 및 E710C를 포함하는 P9 변이체 (No. 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 17, 18, 19, 21, 23, 25, 27, 28, 29, 30, 32, 33, 36, 37, 및 39 변이체)가 P 값<0.01 이면서 효능이 증가함을 확인하였다.
<110> Ko BioLabs, Inc. <120> Protein variants having GLP-1 inducing activity and their use <130> KPCA191644 <160> 193 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 748 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Akkermansia muciniphila SNUG-61027 (KBL983) B2UMO7 <400> 1 Met Glu Lys Asn Ala Pro Phe Ser Val Met Asn Met His Ser Phe Arg 1 5 10 15 Trp Ile Arg Leu Thr Ala Phe Ser Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ile Thr 20 25 30 Ser Cys Ala Ser Ala Ala Thr Asp Phe Asn Gln Val Gly Lys Gln Met 35 40 45 Ser Leu Leu Leu Gln Asn Phe His Phe Ser Arg Lys Glu Phe Ser Asp 50 55 60 Glu Leu Ser Thr Lys Phe Leu Glu Thr Tyr Leu Arg Lys Val Asp Pro 65 70 75 80 Asn Lys Ile Phe Phe Thr Gln Gln Asp Val Asp Ala Leu Lys Arg Lys 85 90 95 Tyr Gly Lys Glu Leu Asp Asp Tyr Leu Met Ser Gly Gln Met Met Asp 100 105 110 Ala Ala Gln Ala Met His Ala Leu Tyr Arg Gln Arg Ala Met Gln Arg 115 120 125 Ile Ser Tyr Ala Arg Asp Leu Leu Lys Lys Gly Gly Phe Thr Phe Asp 130 135 140 Lys Asp Lys Ser Ile Glu Arg Ser Arg Arg Lys Thr Ala Ala Trp Pro 145 150 155 160 Lys Asp Glu Ala Glu Met Gln Gln Val Trp Lys Asp Met Val Glu Glu 165 170 175 Gln Leu Leu Ser Glu Ile Leu Arg Arg Glu Thr Val Ala Arg Leu Ala 180 185 190 Lys Glu Gln Asn Lys Pro Asp Pro Leu Ala Asn Glu Lys Pro Ala Glu 195 200 205 Glu Lys Leu Leu Met Arg Tyr Glu Arg Ile Gln Arg Asn Ile Gln Glu 210 215 220 Thr Asp Leu Glu Asp Val Ala Glu Thr Leu Leu Ser Ala Val Ala Leu 225 230 235 240 Thr Tyr Asp Pro His Thr Asp Tyr Met Gly Ala Arg Gln Val Asp Arg 245 250 255 Phe Lys Ile Ser Met Gly Thr Glu Leu Thr Gly Ile Gly Ala Leu Leu 260 265 270 Gly Ser Glu Asp Asp Gly Ser Thr Lys Ile Thr Gly Ile Val Val Gly 275 280 285 Gly Pro Ala Asp Lys Ser Gly Glu Leu Lys Leu Asn Asp Arg Ile Val 290 295 300 Ala Ile Asp Ser Asp Asn Ser Gly Glu Met Val Asp Ile Leu Phe Met 305 310 315 320 Lys Leu Asp Lys Val Val Asp Met Ile Arg Gly Ala Glu Asn Thr Gln 325 330 335 Met Arg Leu Lys Val Glu Pro Ala Asp Ala Pro Gly Gln Ala Lys Ile 340 345 350 Ile Thr Leu Thr Arg Ser Lys Val Pro Leu Lys Asp Glu Leu Ala Lys 355 360 365 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184 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_A651C_F <400> 184 ggaacaggaa aactcctgcc tggaagaacg ccgc 34 <210> 185 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_A651C_R <400> 185 gcggcgttct tccaggcagg agttttcctg ttcc 34 <210> 186 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_S658C_F <400> 186 ggaagaacgc cgcaaatgca tcaacaagga acgt 34 <210> 187 <211> 34 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_S658C_R <400> 187 acgttccttg ttgatgcatt tgcggcgttc ttcc 34 <210> 188 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_K700C_F <400> 188 gcccctggcg gatccggaat gcgacaatga acaattcatg ca 42 <210> 189 <211> 42 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_K700C_R <400> 189 tgcatgaatt gttcattgtc gcattccgga tccgccaggg gc 42 <210> 190 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_E710C_F <400> 190 caattcatgc acctggcgtg cgaccccacg gcagaactg 39 <210> 191 <211> 39 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_E710C_R <400> 191 cagttctgcc gtggggtcgc acgccaggtg catgaattg 39 <210> 192 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_S745C_F <400> 192 caggatatgc tgaagctgga atgctccgga aaatg 35 <210> 193 <211> 35 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> P9-2CA_S745C_R <400> 193 cattttccgg agcattccag cttcagcata tcctg 35

Claims (22)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체.
  2. 서열번호 2의 아미노산 서열에서 C-말단의 6개의 히스티딘 태그(histidine tag)가 37번과 38번 아미노산 사이에 삽입된 것을 특징으로 하는, 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체.
  3. 서열번호 4의 아미노산 서열에서 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함하는 단백질 변이체.
    Figure pat00008
  4. 서열번호 4의 아미노산 서열에서 하기 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함하는 단백질 변이체.
    Figure pat00009
  5. 제4항에 있어서,
    서열번호 4의 아미노산 서열 중 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  6. 제4항에 있어서,
    서열번호 4의 아미노산 서열 중 2 내지 5개의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  7. 제6항에 있어서,
    K368A, C403A 및 C589A 중 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  8. 제4항에 있어서,
    하기 아미노산 치환 중 어느 하나를 포함하는 단백질 변이체.
    Figure pat00010
  9. 제8항에 있어서,
    G733A, G45A, T263I, T263V, K368A, K368A/K94A/R95A/K96A, C403A, C403A/C589A, C403A/C589A/S36H/A37H, C403A/C589A/K82A, C403A/C589A/K94A/R95A/K96A, C403A/C589A/K368A, C589A, C589A/S36H/A37H, C589S, C589T 및 G733V로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  10. 제8항에 있어서,
    G733A, S36H/A37H, K94A/R95A/K96A, M213Q, M414F, T445I, S486A 및 A492L로 이루어진 군으로부터 선택된 중 어느 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  11. 제8항에 있어서,
    G733A의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
  12. 제4항에 있어서,
    C403A/C589A 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 Q43C, R59C, R95C, K99C, S107C, A119C, K138C, T142C, A158C, K161C, A164C, A189C, K193C, N203C, R220C, K258C, S311C, A332C, S358C, K363C, E379C, K409C, K416C, S464C, R468C, Q523C, A530C, Q562C, D575C, Q585C, T590C, S596C, A610C, A627C, K634C, A651C, S658C, K700C, E710C, 및 S745C로 이루어진 군에서 선택되는 아미노산 치환 중 적어도 하나 이상을 포함하는 단백질 변이체.
  13. 제12항에 있어서,
    하기로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 아미노산 치환을 포함하는 단백질 변이체.
    Figure pat00011
  14. 제12항에 있어서,
    Cys-특이적 페길화되는 단백질 변이체.
  15. 제2항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질 변이체에 비하여 GLP-1 유도능, 열 안정성 및 효소 저항성 중 하나 이상이 증가된 것을 특징으로 하는 단백질 변이체.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 단백질 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  17. 제16항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  19. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 단백질 변이체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 대사 질환은 대사 증후군, 비만, 인슐린 저항성, 글루코스 내성, 당뇨병, 동맥경화, 이상지질혈증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 지방간, 심혈관질환, 고혈압 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  21. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 따른 단백질 변이체를 포함하는, 체중 및/또는 체지방 감소, 식욕 억제, 또는 대사 질환의 개선 또는 예방용 식품 조성물.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 대사 질환은 대사 증후군, 비만, 인슐린 저항성, 글루코스 내성, 당뇨병, 동맥경화, 이상지질혈증, 고지혈증, 고콜레스테롤혈증, 지방간, 심혈관질환, 고혈압 및 골다공증으로 구성된 군으로부터 선택되는, 식품 조성물.
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