KR20210131078A - 생체 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 생체 조직 내 탄소 나노 물질의 정량 방법을 제공한다.
본원 발명 정량방법의 탄소 나노물질 분리 방법은 탄소 나노물질의 물성에 어떠한 영향도 주지 않고, 탄소 나노물질 회수 방법은 탄소 나노물질이 근 적외선(700 내지 1200 nm) 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 보유하는 반면, 유기체의 용해액은 근적외선 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이 무시할만한 수준이라는 점에서 뛰어난 정량 측정 능력을 나타낸다.
본원 발명 정량방법의 탄소 나노물질 분리 방법은 탄소 나노물질의 물성에 어떠한 영향도 주지 않고, 탄소 나노물질 회수 방법은 탄소 나노물질이 근 적외선(700 내지 1200 nm) 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 보유하는 반면, 유기체의 용해액은 근적외선 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이 무시할만한 수준이라는 점에서 뛰어난 정량 측정 능력을 나타낸다.
Description
본 발명은 생체 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법에 관한 것이다.
탄소 섬유, 탄소 나노튜브, 그래핀, 맥스 상 화합물 또는 맥신 등과 같은 탄소 나노물질은 응용과학 분야에서 널리 사용되었으나, 이들이 유기체에 유입될 시 인체에 미치는 영향에 대해서는 충분하게 연구되지 않았다.
유기체 내에, 특히 특정 생체 조직 내 분포하는 탄소 나노물질을 정량을 위해서는 조직으로부터 탄소 나노물질을 회수하는 과정과 회수된 나노물질을 정량하는 과정으로 구분하는 과정이 필요하다.
유기체 내에서 탄소 나노물질을 회수하는 방법으로는 강산, 강염기, 산화제 등의 화학물질을 이용해서 조직을 녹이는 방법을 사용하며, 이 과정에서 나노물질의 손상이 발생하여 탄소 나노물질의 농도 측정에 영향을 준다.
통상적으로는, 회수된 탄소 나노물질을 정량하는 방법은 탄소 나노물질을 열을 가해 태울 때 타는 온도가 유기탄소와 원소탄소가 다르다는 특성을 이용하는 열적 분석을 이용한다. 그러나 유기탄소/원소탄소 분석법은 고가의 장비가 필요하고 고비용 및 분석 간의 편차가 크다는 단점이 있다.
이에, 본 발명의 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 범용장비인 UV-Vis spectrometer와 단백질 분해효소를 이용하여 유기체 내 탄소 나노물질을 쉽고 효율적으로 정량할 수 있는 정량 방법을 개발하였다.
본 발명은
1) 분리된 생체 조직을 균질화하는 단계;
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;
3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계; 및
4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;
를 포함하는 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법을 제공하는 것이다.
이하, 본 발명의 구현예를 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이는 예시로서 제시되는 것으로, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않으며 본 발명은 후술할 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 일 구현예에서,
1) 분리된 생체 조직을 균질화하는 단계;
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;
3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계; 및
4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;
를 포함하는 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법은 1) 분리된 생체 조직을 균질화하는 단계;을 포함한다.
상기 1) 단계는 1) 분리된 생체 조직을 균질화시켜 시료의 불균일성을 해소하는 단계이다. 바람직하게는 분리된 생체 조직을 잘게 자른 후 수일동안, 예를 들어, 1일, 2일 3일, 4일 동안건조하여 시료를 균질화시킬 수 있다. 이러한 균질화 공정을 통하여 후속 단계의 분해 효소 처리를 통한 조직의 분해가 잘 이루어지게 할 수 있다.
상기 분리된 생체 조직은 포유 동물, 예를 들어 인간, 래트, 마우스, 햄스터, 돼지, 토끼, 말, 당나귀, 염소, 양, 기니 피그, 라마 등을 포함하나 이에 제한되지 않는 생체로부터 유래될 수 있으며, 이로부터 분리된 조직을 의미할 수 있다.
이러한 생체 조직은 예를 들어, 방관, 림프절, 폐, 심장, 신장, 위 장, 기도, 뇌, 간, 십이지장 등 포유동물 및/또는 인체 내 존재하는 어떠한 조직이라도 이용 가능하다.
이러한 조직은 바람직하게 폐, 심장, 간, 위일 수 있다.
본 발명에 따른 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법은 2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;를 포함한다.
상기 2)단계는 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시켜 생체 조직 내에 포함된 탄소 나노물질이 생체 조직 외부로 배출되게 하는 단계이다.
본 단계를 통하여 조직에 포함되는 단백질 성분을 포함하는 조직 성분들이 제거되고 탄소 나노물질을 고 수율로 획득할 수 있다.
상기 분해 효소는 프로테이네이즈 케이(proteinase K), 트립신(trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 써모리신(Thermolysin), 및 콜라게네이즈(collagenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 2) 단계의 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계는, 사용되는 분해 효소에 따라 적용 조건이 상이할 수 있다.
예를 들어, 프로테이네이즈 케이를 45 내지 65℃ 의 온도에서
10 내지 48시간, 예컨대, 20 내지 28 시간 동안 처리하여 반응을 수행하는 것일 수 있다.
이러한 분해 효소의 처리는 조직에 따라 1회 내지 3회 반복하여 수행될 수도 있다.
본 발명에 따른 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법은 3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계;를 포함한다.
상기 3) 단계에 따른 탄소 나노물질의 회수는 원심분리 등과 같은 밀도 구배 원리를 통해 물질을 분리할 수 있다.
예를 들어, 상기 2) 단계의 용해된 시료의 원심분리 과정을 통해 탄소 나노물질을 회수하는 단계이다. 바람직하게는 1회 내지 3회의 원심분리를 통해 탄소 나노물질의 회수율을 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 원심분리하고 상층액을 제거한 후 다시한번 동일한 방식으로 원심분리를 수행하여 회수율을 증가시킬 수 있다. 보다 바람직하게 이 과정에서 상층액을 제거한 후 초음파 분산하여 시료를 균질화한 후 추가의 분해 효소를 첨가하고 배양하여 조직을 추가로 용해시킨 후 원심분리를 수행할 수 있다.
상기 3) 단계의 원심 분리는 예를 들어, 15000 g 내지 30000 g 의 중력 조건으로 수행되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 원심분리는 탄소 나노물질을 튜브 바닥에 가라않게 할 정도가 적절하며, 상기 기재 범위에 반드시 제한되는 것은 아니다.
상기 탄소 나노 물질은 카본 블랙, 나노다이아몬드, 탄소 나노튜브, 탄소 나노섬유, 그래핀, 맥신, 버키볼 및 이들의 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것일 수 있다.
상기 변형이라 함은 탄소 나노물질을 물리적, 화학적으로 변형시켜 다른 특성을 발현시킨 임의의 탄소 나노물질이다. 구체적인 일 예시로서, 상기 변형은 관능화된 탄소 나노튜브이다.
상기 3) 단계의 탄소 나노물질 회수율은 85 내지 100%인 것일 수 있다.
본 발명에 따른 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법은 4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;를 포함한다.
상기 4) 단계는 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질을 회수하는 단계이다. 바람직하게는 상기 탄소 나노물질의 농도의 측정은 예를 들어 자외선-가시광선 분광분석기를 이용하여 수행된다.
자외선-가시광선 분광분석 방법은 탄소 나노물질이 근 적외선(700 내지 1200 nm) 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 보유하는 반면, 조직의 용해액은 근적외선 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이 무시할만한 수준이라는 점에서 생체 조직 내 탄소 나노물질의 정량을 측정하는데에 있어 뛰어난 정량 측정 능력을 나타낸다.
이에 따라 회수된 탄소 나노물질을 자외선-가시광선 분광분석기에 적용하고 설정된 검량선을 통해 비교를 수행함으로써, 조직 내 탄소 나노물질의 함량을 확인할 수 있다.
이러한 공정을 통해 조직 내 탄소 나노물질의 침착 정도, 이에 따른 질환으로의 발전 가능성 등에 대한 판단에 관한 정보를 제공할 수 있다.
본원 발명의 탄소 나노물질 정량 방법은 탄소 나노물질의 물성에 영향을 주지 않는 단백질 분해효소를 이용하여 시료를 용해시켜 탄소 나노물질을 분리한 후, 시료를 자외선-가시광선 분광분석기를 이용하여 정량한다.
상기 정량방법의 탄소 나노물질 분리 방법은 탄소 나노물질의 물성에 어떠한 영향도 주지 않고, 탄소 나노물질 회수 방법은 탄소 나노물질이 근 적외선(700 내지 1200 nm) 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 보유하는 반면, 조직의 용해액은 근적외선 영역에서 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼이 무시할만한 수준이라는 점에서 뛰어난 정량 측정 능력을 나타낸다.
도 1은 본 발명의 조직 내 탄소 나노물질 정량 방법의 개략도를 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 주사전자 현미경의 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 회수된 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 정량 방법을 검량선으로 나타낸 것이다.
도 2는 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 주사전자 현미경의 이미지를 나타낸 것이다.
도 3은 회수된 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 정량 방법을 검량선으로 나타낸 것이다.
실시예
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 실험예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 및 실험예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 조직 내 나노물질의 회수 방법
본 발명에 따른 발명 실시의 모식도를 도 1에 구체적으로 나타내었다.
인두 등의 호흡기 계통을 통해 탄소 나노물질을 흡입시켰다. 구체적으로 각각의 마우스에 카본블랙, 나노다이아몬드, 탄소나노튜브, 탄소나노섬유, 그래핀을 마우스 당 30 마이크로그램 또는 마우스 체중 kg 당 1.5 mg 흡입시켰다.
1일 후에 마우스를 희생시키고 2일차에 조직을 분쇄하였다. 분쇄한 조직에 대하여 프로테이네이즈 케이와 같은 소화 효소를 처리한 후, 탄소 나노물질을 분리하고 이의 흡광도를 측정하였으며, 이를 다조물질에 해당하는 탄소 나노물질과 비교하였다.
구체적 실험 방법은 아래와 같다.
탄소 나노 물질(카본 블랙, 나노다이아몬드, 탄소 나노튜브, 탄소 나노섬유, 그래핀 등)을 포함하는 나노 물질이 노출된 폐장을 잘게 자른 후 2일 동안 50 내지 60℃ 건조 후 조직을 균질화하였다. 그 후 조직 건조 중량 0.02g 당 1 mL의 소화 버퍼에 혼합하여 56 ℃에서 24시간 동안 배양하였다. 프로테이네이즈 케이는 광범위한 pH 영역에서 활성이 높기 때문에 buffer는 증류수, 생리식염수 등으로 변경이 가능하다.
시료를 15000g 이상으로 원심분리하여 나노물질과 용해되지 않은 조직성분을 남기고 상층액을 제거한 뒤 1mL의 소화 완충액(200 μg proteinase K in Tris buffer, 50 mM tris-HCl, 10 mM CaCl2, pH 8.0)을 다시 첨가하였고 5분 정도 초음파 분산한 뒤 다시 56 ℃에서 24시간 동안 배양하였다.
시료를 15000 g 이상으로 원심분리하여 상층액을 버리고 1 mL의 증류수를 첨가하였고 5분 정도 초음파 분산하여 나노물질이 고루 분산되도록 유도하였다. 회수된 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 주사전자현미경을 도 2에 나타내었다.
실시예 2. 회수된 나노물질의 정량 방법
회수된 나노물질의 정량을 위해서 검량선을 그렸다. 회수된 (A) 카본 블랙 (B) 나노다이아몬드 (C) 탄소 나노튜브 (D) 탄소 나노섬유 및 (E) 그래핀의 농도별 검량선을 도 3에 나타내었다. 나노물질을 UV-Vis 분광계를 이용하여 750 nm에서 9.4 내지 100 μg/mL 농도의 흡광도를 측정하였다. 검량선은 모든 탄소 나노물질에서 9.4 내지 100 μg/mL 범위에서 R2 = 0.95 이상의 직선성을 나타내었다. 검량선에 대한 각 농도에서 나노물질 측정의 정확도를 이미 알고 있는 나노물질의 농도를 기준으로 평가할 때 95% 이상의 정확도를 나타내었다. 한편, 상기 측정된 흡광도를 대조군의 검량선에 적용하여 농도를 계산한 결과, 조직에서 회수되는 탄소 나노물질의 회수율은 85% 이상임을 확인하였다.
상기 결과로부터 유기체, 혹은 장기, 조직 내에 존재하는 탄소 계열 나노 물질의 정량이 가능함을 확인하였으며, 특히 화학 물질을 이용하여 조직에 손상을 가하는 과정이나 OC/EC 분석법과 같은 고가의 장비 없이 손쉽게 높은 효율로 탄소 나노물질을 분석하였다는 점에서 우수한 효과를 확인하였다.
Claims (8)
1) 분리된 생체 조직을 균질화하는 단계;
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;
3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계; 및
4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;
를 포함하는 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법.
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;
3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계; 및
4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;
를 포함하는 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법.
제1항에 있어서, 분해 효소는 프로테이네이즈 케이(proteinase K), 트립신(trypsin), 키모트립신(Chymotrypsin), 펩신(Pepsin), 써모리신(Thermolysin), 및 콜라게네이즈(collagenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것인, 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법.
제2항에 있어서, 상기 분해 효소는 프로테이네이즈 케이(proteinase K)인 것인, 조직 내 탄소 나노물질의 정량방법.
제1항에 있어서,
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;는,
45 내지 65℃ 의 온도에서
20 내지 28 시간 동안 배양하여 용해시키는 것인
탄소 나노물질의 정량 방법.
2) 1)단계의 균질화된 시료에 분해 효소를 첨가하여 시료를 용해시키는 단계;는,
45 내지 65℃ 의 온도에서
20 내지 28 시간 동안 배양하여 용해시키는 것인
탄소 나노물질의 정량 방법.
제1항에 있어서, 3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계;는 15000 g 내지 30000 g 의 중력 조건으로 원심분리를 수행되는 것인, 탄소 나노물질의 정량 방법.
제1항에 있어서, 탄소 나노 물질은 카본 블랙, 나노다이아몬드, 탄소 나노튜브, 탄소 나노 섬유, 그래핀, 맥신, 버키볼 및 이들의 변형으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것인, 탄소 나노물질의 정량 방법.
제1항에 있어서, 3) 2) 단계의 용해된 시료로부터 탄소 나노물질을 회수하는 단계;의 탄소 나노물질 회수율은 85 내지 100%인 것인, 탄소 나노물질의 정량 방법.
제1항에 있어서, 4) 3) 단계의 회수된 탄소 나노물질의 농도를 측정하는 단계;의 탄소 나노물질의 농도의 측정은 자외선-가시광선 분광분석기를 이용하여 수행되는 것인, 탄소 나노물질의 정량 방법.
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