KR101576625B1 - 탄소나노튜브 정량검출용 프로브 및 이를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 탄소나노튜브 정량검출용 프로브, 이의 제조방법 및 이를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 탄소나노튜브 정량검출용 프로브는 탄소나노튜브를 랩핑하기 위하여 하나의 ssDNA를 사용하므로, 탄소나노튜브의 정량검출시 실험값의 일관성이 우수하며, 양으로는 10ng/3ml 이하, 농도로는 ppb 레벨까지 탄소나노튜브의 정량검출이 가능하므로 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 탄소나노튜브만을 선택적으로 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

탄소나노튜브 정량검출용 프로브 및 이를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출방법{Probe for use in quantification detection of carbon nanotube and quantification detection method of carbon nanotube using the same}
본 발명은 탄소나노튜브 정량검출용 프로브 및 이를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출방법에 관한 것이다.
탄소나노튜브(Carbon nanotube, CNT)는 1991년 일본전기회사(NEC) 부설 연구소의 '이지마 스미오' 박사가 전기방전법을 사용하여 흑연의 음극상에 형성시킨 탄소덩어리를 분석하는 과정에서 발견하였다. 형태는 탄소 6개로 이루어진 육각형 모양이 서로 연결되어 관 모양을 이루고 있다. 관의 지름이 수-수십 나노미터에 불과하여 탄소나노튜브로 일컬어지게 되었다. 나노미터는 10억 분의 1m로 보통 머리카락의 10만 분의 1 굵기이다.
전기 전도도는 구리와 비슷하고, 열전도율은 자연계에서 가장 뛰어난 다이아몬드와 같으며, 강도는 철강보다 100배나 뛰어나다. 탄소섬유는 1%만 변형시켜도 끊어지는 반면 탄소나노튜브는 15%가 변형되어도 견딜 수 있다.
탄소나노튜브가 발견된 이후, 과학자들은 합성과 응용에 심혈을 기울여왔으며, 반도체와 평판 디스플레이, 배터리, 초강력 섬유, 생체 센서, 텔레비전 브라운관 등 탄소나노튜브를 이용한 장치가 수없이 개발되고 있으며, 나노 크기의 물질을 집어 옮길 수 있는 나노집게로도 활용되고 있다. 이처럼, 나노 물질이 산업적으로 많이 이용되고 있으며, 대량으로 생산됨에 따라 환경에 대한 영향평가가 많이 대두되고 있으며 실제로 진행되고 있다. 여러 가지 나노 물질의 환경 내 거동 및 노출 평가를 하기 위해서는 기본적으로 그 나노 물질을 검출하고 정량화할 수 있는 기술 개발이 선행되어야 한다.
특히, 탄소나노튜브는 상술한 전기전도성, 강도 등의 특징으로 인해 산업 전반으로 응용이 되고 있으나, 화학적 구조가 C60, 그래핀, 그래파이트 등과 유사하여 화학적 방법으로 그 구조를 구별하고 정량하기는 쉽지 않다(도 15 참조).
탄소나노튜브 생산 공정에서 라만(Raman) 분광법, FT-IR 또는 UV-Vis 분광법이 정량법으로 많이 이용되고 있으나, 토양이나 기타 오염원에서의 정량법은 그 오염원에 존재하는 다른 여러 가지 유기물로 인해 생산공정에서 사용하는 정량법으로는 정량 분석이 불가능하다. 많은 경우에 특정 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 정확한 탄소나노튜브의 분석을 위해서는 탄소나노튜브의 분리 공정이 필요하다. 그러나, 다른 유기화합물의 분리 제거는 용이하나 도 15에서처럼 유사한 구조의 물질들은 서로 분리가 어려워 정량이 거의 불가능하다. 이에, 자연계에 존재하는 여러 탄소 물질들과 혼합된 상태의 탄소나노튜브도 선택적으로 검출하고 정량화할 수 있는 방법 개발이 아주 절실히 요구되는 실정이다.
비특허문헌 1(Hammes et al, Global Biogeochemical Cycles, 2007, Vol 21, GB3016)에서는 토양이나 퇴적물에서 화석 연료의 불완전 연소에 기인해서 생기는 블랙카본(Black Carbon) 정량법들에 관한 내용을 개시하고 있다. 이 방법으로는 CTO-375, BPCA, CR2O7 및 TOT/R 법 등이 있으며, 이 경우 용해된 유기 물질과 블랙카본을 구별할 수 있으나 탄소나노튜브만의 정량은 전적으로 불가능한 문제가 있다. 또한, 비특허문헌 2(O'Connell et al, Science 2002, 297, 593-596)에서는 탄소나노튜브 자체의 관성 질량을 이용한 초원심분리(Ultracentrifugation) 방법으로 탄소나노튜브만을 분리 정제해내려는 방법들이 실험실에서 진행되고 있으나, 이 방법 또한 비슷한 관성 질량을 갖는 탄소 물질들과 구별이 어렵다는 문제점을 개시하고 있다. 나아가, 비특허문헌 3(Cherukuri et al, J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15638-15639; Li et al, Nanotechnology 2006, 17, 3692-3698)에서는 Near IR이나 UV-Vis 분광법 같은 광학적인 방법도 많이 시도되고 있으나 근본적으로 다른 유기화합물이나 나노물질들과 특정 파장들이 중첩되므로 정량화에 문제가 있음을 개시하고 있다.
탄소나노튜브 자체는 물에 용해되지 않기 때문에 현탁액처럼 행동하고, 자체가 다양한 직경과 길이로 존재하기 때문에, 결국은 아주 불균일한 혼합물이다. 이에, 전통적인 크로마토그래피 방법으로 분석하는 것도 불가능하다.
탄소나노튜브의 정량에 있어서, 또 하나의 중요한 문제점은 검출 한계로써, 자연계에 오염원으로 존재하는 탄소나노튜브를 검출하기 위해서는 매우 민감한 검출법이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 탄소나노튜브만을 선택적으로 검출하고 정량하기 위한 방법에 관하여 연구를 하던 중, 본 발명에 따른 탄소나노튜브 정량검출용 프로브는, 상기 프로브 내 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)에 탄소나노튜브가 캡처(Capture) 되는 현상을 통해 탄소나노튜브에 대한 선택성이 우수하고, 양으로는 10ng/3ml 이하, 농도로는 ppb 레벨까지 탄소나노튜브의 정량검출이 가능한 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 탄소나노튜브 정량검출용 프로브를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 프로브를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부; 및
스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드;를 포함하되,
상기 DNA부는 탄소나노튜브(Carbon nanotube, CNT)를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 역할을 수행하고,
상기 자성 비드는 탄소 동소체 및 불순물을 함유하는 혼합물로부터 탄소나노튜브가 랩핑된 DNA부를 선택적으로 분리하기 위한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브 정량검출용 프로브를 제공한다.
또한, 본 발명은 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부를, 탄소나노튜브를 함유하는 혼합물에 첨가하여 탄소나노튜브를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 단계(단계 1);
스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드를 첨가하여 상기 단계 1에서 얻은 탄소나노튜브가 랩핑된 DNA부와 말단 비오틴을 상기 자성 비드 표면의 표면개질제에 결합시키고 자성을 가하여 분리하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 자성을 가하여 분리한 잔여물을 가열하여, DNA부에 랩핑되어 있던 탄소나노튜브를 분리하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 얻은 탄소나노튜브와 반응하는 형광시약을 첨가하여, 탄소나노튜브의 정량을 측정하는 단계(단계 4);를 포함하는 탄소나노튜브의 정량검출방법을 제공한다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브 정량검출용 프로브는 탄소나노튜브를 랩핑하기 위하여 하나의 ssDNA(단일 가닥 DNA)를 사용하므로, 탄소나노튜브의 정량검출시 실험값의 일관성이 우수하며, 양으로는 10ng/3ml 이하, 농도로는 ppb 레벨까지 탄소나노튜브의 정량검출이 가능하므로 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 탄소나노튜브만을 선택적으로 정량검출할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 비오틴의 분자구조와 비오틴-(GT)15의 염기서열을 도식화한 이미지이다.
도 2는 자성 비드에, 탄소나노튜브를 랩핑(wrapping)한 비오틴-(GT)15가 결합한 모식도를 나타내는 이미지이다.
도 3은 피라나 용액을 사용한 CNT 산화 및 정제과정을 모식도로 나타낸 이미지이다.
도 4는 산화 및 SDS 첨가에 따른 CNT 분산정도를 나타내는 이미지이다.
도 5는 CNT 정량을 위한 표준 곡선을 제작하는 과정을 모식도로 나타낸 이미지이다.
도 6은 SWCNT 20ng에 의한 1μM SYBR Green I의 형광감소량을 나타내는 이미지이다.
도 7은 각 CNT의 형광 감소량과 평균 검량선을 나타내는 이미지이다.
도 8은 0ng-60ng의 각 CNT들의 1μM SYBR Green I에 대한 소광 값을 나타내는 이미지이다.
도 9는 그래핀 옥사이드에 의한 0.02X(1μM) SYBR Green I의 소광을 나타내는 이미지이다.
도 10은 그래핀 옥사이드로부터 CNT를 분리 및 정량하기 위한 방법을 나타내는 이미지이다.
도 11은 그래핀 옥사이드로부터 탄소나노튜브의 분리 검출과 형광소광을 나타내는 이미지이다.
도 12는 2g, 20g, 50g, 100g 토양 내 CNT(1ppm)를 검출하는 프로토콜(protocol)을 나타내는 이미지이다.
도 13은 과량의 흙에서 추출한 20ng CNT의 F/F0 측정값을 나타내는 이미지이다.
도 14는 Neo-130F에 의한 로오다민 B.의 형광 감소량을 나타내는 이미지이다.
도 15는 C60, 탄소나노튜브, 그래핀 및 그래파이트의 구조를 나타내는 이미지이다.
도 16은 '비오틴-(GT)nssDNA-탄소나노튜브' 착물을 나타내는 이미지이다.
도 17은 '자성 비드-비오틴-(GT)nssDNA-탄소나노튜브' 착물을 나타내는 이미지이다.
도 18은 실험예 <6-1>에서 제조한 샘플을 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 19는 DNA를 증폭하기 위한 적절한 온도를 확인하기 위한 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20은 실험예 <6-2>에서 제조한 샘플을 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 21은 실험예 <6-2>에서 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA를 나타내는 이미지이다.
도 22는 실험예 <6-2>에서 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA의 탄소나노튜브 정량검출능력을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부; 및
스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드;를 포함하되,
상기 DNA부는 탄소나노튜브(Carbon nanotube, CNT)를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 역할을 수행하고,
상기 자성 비드는 탄소 동소체 및 불순물을 함유하는 혼합물로부터 탄소나노튜브가 랩핑된 DNA부를 선택적으로 분리하기 위한 역할을 수행하는 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브 정량검출용 프로브를 제공한다.
여기서, 상기 ssDNA의 염기서열은 30-500 머(mer)인 것이 바람직하다. 상기 염기서열이 30 머(mer) 미만인 경우 탄소나노튜브를 랩핑하기에 충분하지 못한 길이를 갖게 되어 정량검출이 어려워지는 문제가 있고, 상기 염기서열이 500 머(mer) 초과인 경우 두 개의 탄소나노튜브가 하나의 ssDNA에 랩핑되어 탄소나노튜브의 정량검출시 실험값의 일관성이 떨어지는 문제가 있다.
또한, 본 발명은 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부를, 탄소나노튜브를 함유하는 혼합물에 첨가하여 탄소나노튜브를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 단계(단계 1);
스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드를 첨가하여 상기 단계 1에서 얻은 탄소나노튜브가 랩핑된 DNA부와 말단 비오틴을 상기 자성 비드 표면의 표면개질제에 결합시키고 자성을 가하여 분리하는 단계(단계 2);
상기 단계 2에서 자성을 가하여 분리한 잔여물을 가열하여, DNA부에 랩핑되어 있던 탄소나노튜브를 분리하는 단계(단계 3); 및
상기 단계 3에서 얻은 탄소나노튜브와 반응하는 형광시약을 첨가하여, 탄소나노튜브의 정량을 측정하는 단계(단계 4);를 포함하는 탄소나노튜브의 정량검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명에 따른 탄소나노튜브의 정량검출방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브의 정량검출방법에 있어서, 상기 단계 1은 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부를, 탄소나노튜브를 함유하는 혼합물에 첨가하여 탄소나노튜브를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 단계이다(도 16 참조).
이때, 탄소나노튜브와 ssDNA의 결합은 열에 의해 다시 분리되기 쉬우므로 얼음조에서 강하게 음파처리(sonication)를 하며 랩핑하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브의 정량검출방법에 있어서, 상기 단계 2는 스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드를 첨가하여 상기 단계 1에서 얻은 탄소나노튜브가 랩핑된 DNA부와 말단 비오틴을 상기 자성 비드 표면의 표면개질제에 결합시키고 자성을 가하여 분리하는 단계이다. 구체적으로, 상기 단계 1에서 얻은 탄소나노튜브가 랩핑된 ssDNA를 함유하는 상층액에, 표면이 개질된 자성 비드를 첨가하여 탄소나노튜브가 랩핑된 ssDNA에 자성 비드가 결합된 착물을 제조하고, PCR(Polymerase Chain Reaction)용 자성 웰(Magnet well)을 사용하여 기타 이물질을 제거하는 단계이다(도 17 참조).
상기 자성 비드의 표면을 개질하는 표면개질제는 상기 DNA부의 비오틴과 선택적으로 결합하기 위한 역할을 수행한다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브의 정량검출방법에 있어서, 상기 단계 3은 상기 단계 2에서 자성을 가하여 분리한 잔여물을 가열하여, DNA부에 랩핑되어 있던 탄소나노튜브를 분리하는 단계이다.
이때, 상기 가열온도는 50-100℃인 것이 바람직하고, 95℃인 것이 가장 바람직하다. 상기 가열온도가 50℃ 미만인 경우, 상기 단계 5에서 얻은 착물로부터 탄소나노튜브를 분리하기에 충분하지 못한 열이 제공되어 탄소나노튜브의 분리가 용이하게 유도되지 못하는 문제가 있고, 100℃ 초과일 경우 용매가 물이기 때문에 100℃ 이상 가열시에는 가압을 하여야 하기 때문에 실용적이지 못한 문제가 있다.
본 발명에 따른 탄소나노튜브의 정량검출방법에 있어서, 상기 단계 4는 상기 단계 3에서 얻은 탄소나노튜브와 반응하는 형광시약을 첨가하여, 탄소나노튜브의 정량을 측정하는 단계이다.
이때, 상기 형광시약은 SYBR Green I, 로오다민 B(Rhodamine B), FAM, 메톡시쿠마린(Methoxycoumarin), DyLight®405, DyLight®350, DyLight®488, HEX, ROX, Cy5, Cy3, Cy2, TET, Cal Gold 540, VIC, Texas Red, Cal Red 610, Quasar 670, Quasar 705, HiLyte FluorTM405, 아미노쿠마린(Aminocoumarin), Pacific blueTM, EviTagTM quantum dots-Lake Placid Blue, ChromeoTM488, Alexa Fluor®488, FITC(Fluorescein Iso-thiocyanate), EviTagTM quantum dots-Adirondack Green, ChromeoTM505 등을 사용할 수 있으며, SYBR Green I 또는 로오다민 B(Rhodamine B)를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 형광시약은 탄소나노튜브와 결합하여 형광 세기가 감소(소광)하는 특성을 이용하여 탄소나노튜브를 정량, 검출하는 것을 특징으로 한다.
상기 탄소나노튜브 정량검출방법의 단계 1을 수행하기 이전에,
탄소 동소체 및 불순물을 함유하는 혼합물에 세정액을 첨가하여 혼합물을 산화시키는 단계(단계 A);
상기 단계 A에서 산화한 혼합물에 과량의 물을 처리하여 중화시키는 단계(단계 B); 및
상기 단계 B에서 중화한 혼합물에 계면활성제를 처리하여 탄소나노튜브를 분산시키고 불순물을 침전시키는 단계(단계 C);를 포함하는 전처리 단계를 먼저 수행할 수 있다.
이하, 본 발명에 따른 전처리 단계를 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 전처리 단계에 있어서, 상기 단계 A는 탄소 동소체 및 불순물을 함유하는 혼합물에 세정액을 첨가하여 혼합물을 산화시키는 단계이다.
이때, 상기 세정액은 피라나 용액(Piranha solution), 질산(Nitric acid) 또는 암모늄 하이드록사이드:과산화수소(50:50) 혼합물 등을 사용할 수 있으며, 피라나 용액을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 산화는 탄소나노튜브를 물에 쉽게 분산시키기 위하여 탄소 동소체에 함유되어 있는 긴 사슬 형태의 탄소나노튜브를 짧게 자르고 표면을 개질할 뿐만 아니라, 불순물에 포함된 많은 유기물들을 제거하기 위함이다.
본 발명에 따른 전처리 단계에 있어서, 상기 단계 B는 상기 단계 A에서 산화한 혼합물에 과량의 물을 처리하여 중화시키는 단계이다. 구체적으로, 상기 단계 A의 산화과정을 마친 탄소나노튜브는 피라나 용액을 제거하고 정제하기 위하여 용액 전체를 팔콘(falcon) 튜브로 옮긴다. 3500rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 다시 증류수를 채워 세척, 원심분리, 상층액 제거를 pH가 중성이 될 때까지 반복하였다. 이때, 정제방법은 원심분리를 하는 방법, 필터 페이퍼를 사용하는 방법, 규조토를 이용하여 필터하는 방법 모두를 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 전처리 단계에 있어서, 상기 단계 C는 상기 단계 B에서 중화한 혼합물에 계면활성제를 처리하여 불순물을 침전시키는 단계이다.
이때, 상기 계면활성제는 소듐 도데실 설페이트(Sodium Dodecyl Sulfate, SDS), 리튬 도데실 설페이트(Lithium Dodecyl Sulfate, LDS), 소듐 도데실 벤젠 설포네이트(Sodium Dodecyl Benzene Sulfonate, SDBS), 테트라데실 트리메틸 암모늄 브로마이드(Tetradecyl Trimethyl Ammonium Bromide, TTAB), 소듐 콜레이트(Sodium Cholate, SC), FL(Fairy Liquid), 데실아민(Decylamine), 도데실아민(Dodecylamine), 헥사데실아민(Hexadecylamine) 등을 사용할 수 있으며, 소듐 도데실 설페이트를 사용하는 것이 바람직하다.
상기 탄소나노튜브의 정량검출방법의 장점으로는, 하나의 탄소나노튜브를 랭핑하기 위하여 하나의 ssDNA를 사용하므로 실험값의 일관성이 있으며, 가열을 통해 탄소나노튜브를 순수하게 분리한 후 이를 형광시료에 첨가하여 형광감소량을 측정하므로, 사용한 자성 비드나 ssDNA로부터 받을 수 있는 형광 변화가 없어 정량검출의 정확도가 매우 우수하다. 또한, 여러 가지 탄소 동소체들(C60, 그래핀, 그래파이트 등) 중 오직 선택적으로 탄소나노튜브를 양으로는 10ng/3ml 이하, 농도로는 ppb 레벨까지 검출이 가능하므로 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 탄소나노튜브만을 선택적으로 검출할 수 있다. 나아가, ssDNA와 자성 비드를 직접 결합시키게 되면 자성 비드 1개당 1개의 'ssDNA-탄소나노튜브' 착물이 결합하여 결과적으로 탄소나노튜브를 효율적으로 정량하지 못하는 문제점이 있지만, 본 발명과 같이 링커(Linker)로써 비오틴(Biotin)을 사용하게 되면, 자성 비드 1개당 여러 개의 '비오틴-ssDNA-탄소나노튜브'가 결합할 수 있게 되므로 탄소나노튜브를 효율적으로 정량 할 수 있다.
이에, 탄소나노튜브 검량선을 작성하고 그래핀 옥사이드(Graphene oxide, GOs)로부터 탄소나노튜브의 선택적 검출능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, CNT와 그래핀 없이 비오틴-GT만을 이용하여 형광 값을 찍으면, 형광 값이 거의 감소하지 않으며, CNT를 넣지 않고 그래핀만을 넣어 형광을 측정하면 비오틴-GT DNA가 그래핀 옥사이드를 랩핑하지 않고 세척하는 과정에서 대부분 제거되므로 형광값이 거의 감소하지 않았다. 하지만, CNT가 존재하는 시료에서는 비오틴-GT DNA에 의하여 CNT가 랩핑되고, SWCNT와 MWCNT에 관계없이 농도에 비례하여 형광을 감소시키는 것으로 나타났다(실험예 1의 도 3, 도 4, 도 5, 도 6, 도 7, 도 8 및 실험예 2의 표 1, 표 2, 도 9, 도 10, 도 11 참조).
또한, 토양으로부터 탄소나노튜브의 정량검출능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, CNT를 첨가한 샘플 2와 4에서 30ng의 CNT가 검출되었다. 아울러, 샘플 4를 보면 토양 속에 CNT와 함께 섞여있는 그래핀으로부터도 CNT만을 완벽하게 검출해 낸 것을 확인할 수 있었다. 비록, 샘플 1의 오차 값이 4.32 ng으로 샘플 2와 4에서 측정된 30ng에 대해 작지 않은 오차 값을 얻었지만, 이는 전체 실험 조건을 더욱 안정화시키면 더 작은 오차 값을 얻을 수 있을 것이라 예상할 수 있다(실험예 3의 표 3, 표 4 참조).
나아가, 과량의 흙으로부터 미량 농도의 CNT 검출능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 각 토양 샘플에서 20ng 내외의 CNT가 검출되었고, 이는 샘플 제작 시 넣어준 CNT 20ng의 양과 일치한 것으로 나타났다(실험예 4의 표 5, 도 12, 도 13 참조).
또한, 물벼룩에 축적된 탄소나노튜브 정량검출 능력을 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 물벼룩을 산화시킨 후 프로토콜을 따라 실험하였을 때 스파이킹(spiking)한 농도의 CNT를 거의 정확하게 정량하였으며, 또한 1ng/㎕ CNT에 3시간동안 노출된 물벼룩에서도 약 340ng의 CNT(Neo-130F)가 축적된다는 것을 계산을 통해 알 수 있었다(실험예 5의 표 6, 도 14 참조).
나아가, 상기 실험예 2-5에서 사용한 비오틴-(GT)15 ssDNA를 사용하는 대신에, 랜덤 염기서열을 갖는 DNA 역시 탄소나노튜브를 랩핑(Wrapping)하고, 탄소나노튜브의 정량검출능력이 있는지 평가하기 위하여 실험을 수행한 결과, 실제 나와야 할 탄소나노튜브의 양보다 어느 정도 벗어난 범위에서 나타났다. 구체적으로, 50ng이 나와야 할 샘플에서는 24.48ng의 탄소나노튜브가, 100ng의 탄소나노튜브가 나와야 할 샘플에서는 53.37ng의 탄소나노튜브가 검출되었다. 이는 실제로 나와야 할 탄소나노튜브의 양에 대한 절반의 값인데, 그 이유로는 탄소나노튜브를 랩핑한 DNA는 이중(duplex)으로 한쪽 DNA에는 비오틴이 결합해 있지만, 다른 한쪽 DNA에는 비오틴이 결합되어 있지 않기 때문에 비오틴-DNA에 랩핑되지 않은 물질 제거 시 비오틴이 결합하지 않은 다른 한쪽 DNA가 절반의 탄소나노튜브를 랩핑한 채 제거되었기 때문이다. 이를 이용하여 검출된 탄소나노튜브 양을 정확히 2배씩 계산하면 약 49ng과 107ng이 나오게 된다(실험예 6의 표 7-11 및 도 18-22 참조).
따라서, 본 발명에 따른 탄소나노튜브 정량검출용 프로브는 탄소나노튜브를 랩핑하기 위하여 하나의 ssDNA를 사용하므로, 탄소나노튜브의 정량검출시 실험값의 일관성이 우수하며, 양으로는 10ng/3ml 이하, 농도로는 ppb 레벨까지 탄소나노튜브의 정량검출이 가능하므로 자연계의 시료에서(토양, 수계 오염원) 탄소나노튜브만을 선택적으로 검출할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 한정되는 것은 아니다.
1. 실험 준비
(1) 탄소나노튜브( CNTs )
탄소나노튜브는 SWCNT(Single Walled Carbon NanoTube)와 MWCNT(Multi Walled Carbon NanoTube)로 구분하여 실험하였다. 모든 실험에서 탄소나노튜브를 물에 잘 분산시키기 위하여 피라나 용액(piranha solution)을 사용하여 산화시킨 후 사용하였다.
- 단일벽 탄소나노튜브(SWCNT)
SWCNT는 Sigma Aldrich의 CNT-(6,5)키랄성(chirality), 탄소 > 90%, 77 % = (SW-CNT로서의 탄소), 0.7-0.9 nm 직경(형광량에 의한)(Aldrich)를 사용하였다.
- 다중벽 탄소나노튜브(MWCNT)
MWCNT는 국내 CNT제조사에서 제공받은 CM 130, CM 280, TMC 100, JC 130, K-nanos 100p, K-nanos 200p, Neotube, Neo-130F를 사용하였으며, 대부분의 많은 실험은 K-nanos 100p(직경: 7-15 nm, 길이: 10-50, 탄소 함유량: > 90%)를 대표 나노물질로 사용하여 수행하였다. 물벼룩에서 나노튜브를 검출하고 정량하는 실험은 Neo-130F를 이용하였다. Neo-130F는 물에 쉽게 분산되도록 표면 개질 된 제품으로 SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 용액에 분산시키지 않고 바로 물에 분산시켜 사용하였다.
(2) 분산제
모든 산화를 거친 탄소나노튜브는 물에 완전히 분산시키기 위하여 0.1 w.t.% SDS(Sodium Dodecyl Sulfate) 용액을 분산제로 사용하였다.
(3) 그래핀 옥사이드( Graphene Oxide , GOs )
그래핀은 GRAPHENEALL사의 물에 분산된 산화된 단층 그래핀, 그래핀 옥사이드(단일 층 그래핀 산화물, 수용액, 125mL (0.038g))를 사용하였다.
(4) DNA( Deoxyribonucleic acid )
- GT 반복 연속 염기서열(sequence) DNA
탄소나노튜브를 랩핑(wrapping)하여 기타 이물질 또는 탄소 동소체로부터 분리하기 위한 프로브(probe) DNA는 말단에 비오틴(biotin)이 결합되어 있고, DNA 염기 중 탄소나노튜브와 결합력이 강한 G(guanine)와 T(thymine) 서열이 15회 반복된 ssDNA를 디자인 하였다(Biotin-(GT)15, 도 1 참조).
디자인한 ssDNA는 국내 DNA 제조 회사인 Bioneer에 의뢰하여 100μM로 주문 제작한 뒤 1μM로 희석하여 사용하였다.
(5) 자성 비드( Magnetic beads )
자성 비드는 비오틴 DNA를 캡처(capture)하기 위하여 스트렙타비딘(streptavidin)으로 표면이 개질 된 Dynabeads사의 M-280 스트렙타비딘 자성 비드(크기: 2ml, 10mg/mL, 용량: 2pmol/ul)를 사용하였다.
자성 비드와 비오틴 DNA를 결합시키고(도 2 참조), 이물질을 씻어내기 위하여 완충액(결합 완충액(2X), 세척 완충액(1X))를 제조하여 사용하였다.
2X 결합 완충액은 10mM Tris-HCl pH: 7.5, 1 mM EDTA, 2M NaCl로 구성되어 있으며, 이를 반으로 희석하여 1X 세척 완충액으로 사용하였다.
또 다른 자성 비드로는 Bioneer사의 스트렙타비딘으로 표면이 개질된 자성 비드를 이용하였다. 이 비드는 사용 전 세척이 필요 없다는 장점이 있지만 비오틴 DNA의 용량이 작다는 단점이 있다.
(6) 형광시약( Fluorescence reagent )
- SYBR Green I
형광시약은 Sigma Aldrich사의 SYBR Green I 핵산 겔 스테인(nucleic acid gel stain), 10,000X(0.5M)을 구입하여1X로 희석하였다.
탄소나노튜브를 정량하기 위한 최종 형광시약은 가로×세로의 길이가 1 cm ×1 cm 인 셀에 100 mM 인산완충액(pH 7.0) 300 ㎕, 1 X SYBR Green I 6 ㎕를 넣고 2694 ㎕의 3차 증류수를 채워, 최종농도 10 mM 인산완충액과 0.02 X(1μM) SYBR Green I 을 포함하는 3 ml 용액을 제작하여 사용했다.
형광분광기는 Perkin Elmer사의 LS55 모델을 사용하였고, 여기파장 480 nm, 측정파장 500-560 nm, Ex 슬릿(slit)의 넓이는 5.0 nm, Em 슬릿(slit)의 넓이는 20.0 nm, 스캔 속도는 50 nm/분으로 측정하였고, CNT를 첨가한 뒤 피펫으로 혼합하여 정확히 15분 뒤 형광 값이 더 이상 감소하지 않을 때 측정하였다.
- 로오다민 B(rhodamine B)
생물체 내의 CNT를 검출하는 실험은 로오다민 B 시약을 100μM을 제조하여 사용하였다. 탄소나노튜브를 정량하기 위한 최종 형광시약은 가로×세로의 길이가 1 cm ×1 cm 인 셀에 100 mM 인산완충액(pH 7.0) 300 ㎕, 100 μM 로오다민 B 6 ㎕를 넣고 2694 ㎕의 3차 증류수를 채워, 최종농도 10 mM 인산완충액과 1μM 로오다민 B를 포함하는 3 ml 용액을 제작하여 사용했다.
형광분광기는 Perkin Elmer사의 LS55 모델을 사용하였고, 여기파장 535 nm, 측정파장 560 ~ 660 nm, Ex 슬릿(slit)의 넓이는 10 nm, Em 슬릿(slit)의 넓이는 20.0 nm, 스캔 속도는 1500 nm/분으로 측정하였고, CNT를 첨가한 뒤 피펫으로 혼합하여 정확히 15분 뒤 형광 값이 더 이상 감소하지 않을 때 측정하였다.
(7) 토양
실험에 사용한 토양은 실제로 CNT를 포함하는 토양을 구하기 어렵기 때문에 실험실에서 제조하여 사용하였다.
토양은 밭의 흙을 페트리 접시(petri dish)에 얇게 펴서 3시간 이상 120 ℃ 오븐에서 가열하여 수분을 모두 제거하였고, 200 ㎛ 채로 커다란 모래를 걸러서 사용하였다.
(8) 물벼룩
안전성평가연구소에서 사용중인 물벼룩을 다음 5가지 조건에 노출한 후 실험을 수행하였다.
① CNT에 노출되지 않은 물벼룩 4마리
② 100ng의 CNT에 스파이킹(spiking)된 물벼룩 4마리
③ 10ng의 CNT에 스파이킹(spiking)된 물벼룩 4마리
④ 10mg/L에 3시간 노출된 물벼룩 4마리(미지 농도의 CNT 축적)
⑤ 1mg/L에 3시간 노출된 물벼룩 4마리(미지 농도의 CNT 축적)
< 실험예 1> 탄소나노튜브 검량선 작성
<1-1> CNT 산화
실험을 진행하기 전, CNT를 물에 쉽게 분산시키기 위해 CNT 산화과정을 수행하였다. 구체적으로, CNT의 표면 개질 뿐만 아니라, 긴 사슬 형태의 CNT를 짧게 자르기 위해 강한 산성을 보이는 피라나 용액(piranha solution)을 사용하여 CNT를 산화시켰다.
① 얼음조에 비커를 놓고 96% H2SO4와 30% H2O2를 4:1 부피비로 천천히 혼합하여 피라나 용액을 제조하였다. 이때, 피라나 용액은 매우 강한 산이므로 모든 것을 부식시킬 수 있으므로 주의한다.
② 산화시킬 용기에 탄소나노튜브를 담고 얼음조에서 탄소나노튜브 1mg 당 1ml 부피의 피라나 용액을 서서히 첨가한다.
③ 용액을 모두 첨가하고 열이 다 식으면 서서히 가열하여 60℃에서 3시간 동안 가열한다.
④ 산화과정을 마친 탄소나노튜브는 피라나 용액을 제거하고 정제하기 위하여 용액 전체를 팔콘(falcon) 튜브로 옮긴다. 3500rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액을 제거한 뒤 다시 증류수를 채워 세척, 원심분리, 상층액 제거를 pH가 중성이 될 때까지 반복하였다. 이때, 정제방법은 원심분리를 하는 방법, 필터 페이퍼를 사용하는 방법, 규조토를 이용하여 필터하는 방법 모두를 사용할 수 있다.
⑤ 중성이 된 산화 탄소나노튜브를 필터 페이퍼로 걸러주고 120℃ 오븐에서 건조하였다. 도 3에 피라나 용액을 사용한 CNT 산화 및 정제과정을 모식도로 나타내었다.
<1-2> 탄소나노튜브 분산( CNT dispersion )
표면 산화된 CNT는 보다 물에 잘 분산시키기 위하여 0.1 w.t.% SDS 용액에 분산시켰으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에서 볼 수 있듯이 산화를 하지 않고 증류수에 분산시킨 탄소나노튜브는 대부분이 분산되지 않았고 곧 가라앉았으며, 산화한 탄소나노튜브를 증류수에 분산시켰을 때에는 소량 분산이 되었지만 수 시간 후에 침전물이 생겼다. 비슷한 결과로 산화하지 않은 탄소나노튜브를 0.1 w.t. % SDS 용액에 분산시켰을 때에는 탄소나노튜브가 상당량 분산되었지만 수 시간 후 침전물로 가라앉았으며, 산화한 탄소나노튜브를 0.1 w.t.% SDS 용액에 분산시켰을 때에는 침전 없이 탄소나노튜브가 전량 분산되었다.
<1-3> 탄소나노튜브 검량선 작성
분산된 CNT 샘플을 1ng/㎕농도로 맞추어 표준용액으로 만들고, CNT를 정량하기 위한 표준 곡선(standard curve)를 제작하였다. 형광시료는 3차 증류수 2694ul에 100 mM 인산완충액(pH 7.0) 300ul, 1X(50μM) SYBR Green I 6ul를 첨가하여 최종농도 10mM 인산완충액(pH 7.0)과 0.02X(1μM) SYBR Green I 을 포함하는 3ml의 형광시약을 제조하였고, 1ng/㎕ CNT (0.01 w.t.% SDS 용액에 용해) 20㎕ (CNT 20ng) 를 적가하여, 그 형광의 소광 값을 측정하였다. CNT 정량을 위한 표준 곡선을 제작하는 과정을 도 5에 나타내었다. 측정된 형광 값은 530nm 파장에서 측정된 형광 값 F를 베이스(base)용액의 형광 측정값인 F0로 나누어 형광 감소비율 (F/F0)을 이용하여 표준 곡선을 작성하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타난 바와 같이, 형광 량은 일정하게 감소하였고, 측정 때마다 변동이 심한 최고 방출파장인 521nm보다 변동이 적은 530nm에서 형광 방출량 값을 계산하였다. 같은 방법으로 1개의 SWCNT와 7가지의 MWCNT의 표준 곡선을 도 7과 도 8에 각각 나타내었다.
< 실험예 2> 그래핀 옥사이드(Graphene oxide, GOs)로부터 탄소나노튜브의 선택적 검출 평가
소광 측정을 통해 표준 곡선을 얻고난 후, 실제로 계획한 프로세스(process)가 작동하는지 알아보기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<2-1> 그래핀 옥사이드의 CYBR Green I 형광소광
먼저 그래핀 옥사이드가 SYBR Green I 용액에 어떠한 영향을 미치는지 확인하기 위하여 0.02X(1μM) SYBR Green I 형광시약에 그래핀 옥사이드를 20ng씩 적가하며 형광 값을 측정한 결과, 도 9와 같이 첨가한 그래핀 옥사이드의 양에 비례하여 형광 값이 감소하였다.
<2-2> 그래핀 옥사이드로부터 탄소나노튜브 정량검출
예상한 바와 같이 그래핀 옥사이드가 SYBR Green I의 형광 감소량에 영향을 주었으며, 탄소나노튜브 검출 시 제거해야 할 대상으로 확인되었다. 따라서 비오틴-(GT)15 ssDNA를 이용하여 그래핀 옥사이드로부터 탄소나노튜브를 선택적으로 분리하고 정량검출하기 위해서 도 10 및 하기와 같이 실험을 설계하고 수행하였다.
① 그래핀 옥사이드 용액 3 ㎕(0.912㎍)와 1ng/㎕ CNT(SWCNT 또는 K-nanos 100p) 10㎕ (10 ng), 20㎕(20 ng), 30㎕(30 ng)를 각각의 튜브에 넣고 혼합한다. 대조군으로 그래핀 대신 3차 증류수를 사용한다.
② 각 샘플에 CNT를 선택적으로 랩핑(wrapping) 할 수 있도록 디자인 한 1μM 비오틴-(GT)15 15㎕ (CNT 용량 : 2ng/pmole)을 넣고 30분 동안 얼음물에서 초음파분해(sonication)시켜 SWCNT에 비오틴-(GT)15가 랩핑(wrapping)하도록 한다.
③ 80 ㎍ (비오틴 용량 : 2pmole 비오틴 / 10㎍ 비드) 자성 비드를 넣고 자성 비드와 비오틴-DNA가 결합할 수 있도록 1시간 동안 혼합(vortexing)한 후, 자성 웰(magnet well)을 사용하여 내부 용액을 제거하고, 1X 세척 완충액 100ul씩을 이용하여 총 8회 이상 세척한다.
④ 세척을 마친 샘플은 3차 증류수 50㎕를 첨가하여 95℃ 오븐에서 1시간 이상 가열한다.
⑤ 그동안 10mM 인산완충액(pH 7.0), 0.02X SYBR Green 형광 시약을 제작하여 F0값을 측정한다.
⑥ 가열을 마친 샘플은 바로 자성 웰로 옮겨 자성 비드로부터 분리된 용액을 취한 뒤 형광시료에 넣어주고, 소광 값을 측정한다. 그 결과를 도 11 및 하기 표 1에 나타내었다.
구분 SWCNT K-nanos 100p
10 ng 9.6 ± 0.6 ng 11.8 ± 1.2 ng
20 ng 20.4 ± 0.4 ng 20.9 ± 0.7 ng
30 ng 30.4 ± 0.2 ng 27.6 ± 1.8 ng
도 11 및 상기 표 1에 나타난 바와 같이, 실험에 대한 결과는 매우 정확한 것으로 나타났다. 또한, 실험의 신뢰도를 높이기 위하여 하기 표 2와 같이 샘플을 구성하여 실험을 수행하였다.
샘플 함유한 CNT 양(ng) 측정된 CNT 양(ng)
비오틴 GT + 자성 비드
(CNT 및 그래핀 없음)		 0 0.55 ± 0.15
비오틴 GT + 그래핀 + 자성 비드
(CNT 없음)		 0 1.20 ± 0.23
비오틴 GT + 30ng SWCNT + 자성 비드
(그래핀 없음)		 30 30.52 ± 0.73
비오틴 GT + 30ng MWCNT + 자성 비드
(그래핀 없음)		 30 30.24 ± 1.72
상기 표 2에 나타난 바와 같이, CNT와 그래핀 없이 비오틴-GT만을 이용하여 형광 값을 찍으면, 형광 값이 거의 감소하지 않으며, CNT를 넣지 않고 그래핀만을 넣어 형광을 측정하면 비오틴-GT DNA가 그래핀 옥사이드를 랩핑하지 않고 세척하는 과정에서 대부분 제거되므로 형광값이 거의 감소하지 않았다. 하지만, CNT가 존재하는 시료에서는 비오틴-GT DNA에 의하여 CNT가 랩핑되고, SWCNT와 MWCNT에 관계없이 농도에 비례하여 형광을 감소시키는 것으로 나타났다.
< 실험예 3> 토양으로부터 탄소나노튜브의 정량검출능력 평가
상기 실험들을 통해 탄소 동소체인 그래핀 옥사이드 중, CNT만을 선택적으로 분리, 검출하여 그 양을 정량할 수 있다는 것을 확인하였다. 따라서, 상기 방법을 이용하여 토양 속에서 CNT를 검출하고 그 양을 정량해 보고자 하기와 같은 실험을 수행하였다.
실제로 CNT가 포함되어있는 토양은 찾기 어려우므로 CNT가 포함되어 있는 흙을 실험실에서 인위적으로 제작하였다. 먼저 연구실 근처 밭에서 흙을 구해 120℃ 오븐에서 1시간 동안 잘 건조시켰다. 건조한 흙은 200㎛ 채로 걸러 굵은 모래와 나뭇가지 등을 제거하였다. 하기 표 3과 같이, 4개의 샘플을 구성한 후, 피라나 용액을 사용하여 하룻밤 동안 산화시켰다.
샘플 구성
1 흙 1g
2 흙 1g + SWCNT 1mg
3 흙 1g + 그래핀 10 mg
4 흙 1g + 그래핀 10 mg + SWCNT 1 mg
토양을 피라나 용액으로 산화할 때에는 토양 자체에 유기물이 많아 거품이 많이 발생하였다. 따라서, 큰 용기를 사용하여 산화시켰다. 산화를 마친 샘플들은 셀라이트 545를 이용하여 필터하고 중성이 될 때까지 물로 세척하였다. 용액 전량을 부피플라스크로 옮긴 후 0.1 w.t. %의 SDS 용액 100ml을 넣어 CNT를 분산시켰다. 분산된 용액을 10배로 묽힌 뒤 30㎕를 취하여 비오틴-(GT)15를 이용하여 분산된 CNT를 랩핑하였다. 랩핑된 CNT는 자성 비드를 사용하여 캡처(capture)하고, 남은 유기물과 토양 찌꺼기, 그리고 그 외의 불순물들을 제거하기 위하여 100㎕ 세척 완충액과 3차 증류수를 사용하여 10회 이상 세척하였다. 세척을 마친 샘플은 30㎕의 3차 증류수를 첨가한 뒤 95℃오븐에서 가열하고 형광측정을 하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.
샘플 흙 CNT 그래핀 기대값(ng) 측정값(ng)
1 + - - 0 4.32 ± 3.10
2 + + - 30 30.93 ± 1.38
3 + - + 0 3.84 ± 0.31
4 + + + 30 33.83 ± 0.74
표 4에 나타난 바와 같이, CNT를 첨가한 샘플 2와 4에서 30ng의 CNT가 검출되었다. 또한 샘플 4를 보면 토양 속에 CNT와 함께 섞여있는 그래핀으로부터도 CNT만을 완벽하게 검출해 낸 것을 확인할 수 있었다. 비록, 샘플 1의 오차 값이 4.32 ng으로 샘플 2와 4에서 측정된 30ng에 대해 작지 않은 오차 값을 얻었지만, 이는 전체 실험 조건을 더욱 안정화시키면 더 작은 오차 값을 얻을 수 있을 것이라 예상할 수 있다.
< 실험예 4> 과량의 흙으로부터 미량 농도의 CNT 검출능력 평가
상기 실험예 2-3에서 개시한 탄소나노튜브 검출법은 1mg의 탄소나노튜브를 1g의 토양에서 검출하고, 이를 일부 취하여 3ml의 SYBR Green I 시약에서 20ng의 CNT를 정량 한 것이다. 이는 수계를 기준으로 한다면 6.66ppb의 농도로 매우 우수한 검출능력이지만 토양을 기준으로 계산하면 1000ppm이라는 매우 진한 농도이다. 때문에 토양을 기준으로 토양 내의 CNT가 수에서 수십 ppm의 농도까지 측정 가능한지 테스트해보고, 이것이 적은 양의 토양 혹은 100g 이상의 과량의 토양에서 역시 사용 할 수 있는 방법인지 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
동일한 농도의 여러 스케일의 샘플이 모두 같은 결과값을 나타내는지 동시에 확인하기 위하여 2g, 20g, 50g, 100g의 흙을 각각 10ml, 100ml, 250ml, 500ml 부피 플라스크에 넣고 산화 SWCNT를 2㎍, 20㎍, 50㎍ , 100㎍ 씩 첨가하였다(각 1ppm농도). 2g의 흙은 100㎛ 채에 거르고, 20g과 50g의 흙은 200㎛ 채에 흙을 걸러 사용하였다. 100g의 흙은 채에 거르지 않고 단면 면적이 0.25cm2 이상의 돌과 나뭇가지만 제거하고 바로 사용하였다(도 12 참조).
2g과 20g의 흙은 CNT와 함께 산화한 뒤 셀라이트 545를 통해서 필터가 가능하였지만 50g과 100g의 토양 샘플은 필터가 불가능하였기 때문에 흙은 산화하지 않고, 대신 미리 산화시킨 CNT를 첨가하였다.
위에서 만든 샘플은 CNT를 골고루 분산시키기 위해 0.1 w.t.% SDS 용액에 분산시킨 뒤 3시간 동안 위 아래로 흔들어주며 초음파분해를 수행하였다. 완전히 균일하게 분산된 CNT 샘플은 100㎕ (20ng)씩 취하여 각각의 에펜돌프 튜브(eppendorf tube)에 옮겨 넣은 뒤 15㎕ (15pmole)의 비오틴-(GT)15을 이용하여 1시간 동안 얼음물에서 강하게 초음파분해 하여 CNT를 랩핑하였다. 이후, 다시 샘플에 자성 비드를 60㎕ (결합 용량 : 128pmole DNA/mg 비드, 2mg 비드/ml 용액, ∴ 256 fmole DNA/ul)씩 첨가하여 1시간 동안 충분히 혼합(vortexing)해주어 자성 비드와 비오틴 DNA-CNT 착물이 잘 결합할 수 있도록 해주었다. 캡쳐가 끝난 샘플은 자성 웰에서 100㎕ 의 세척 완충액을 사용하여 정제한 뒤 100㎕의 증류수를 넣고 95℃ 오븐에서 1시간 동안 가열하였다.
가열이 끝난 샘플은 다시 자성 웰에서 비드를 제거하고 나머지 용액을 0.002X SYBR Green I검출시약에 첨가하여 정량하였다. 그 결과를 도 13 및 하기 표 5에 나타내었다.
샘플 측정된 양
CNT 흙 부피 aCO.C/S bCo.C/L 취한 양
2 ㎍ 2 g 10 ml

1ppm

200ng/mL
100㎕
(20ng)		 22.6 ng
20 ㎍ 20 g 100 ml 23.4 ng
50 ㎍ 50 g 250 ml 24.5 ng
100 ㎍ 100 g 500 ml 18.2 ng
상기 표 5에서,
aCO.C/S는 토양 내 CNT의 농도이고,
bCo.C/L은 액체 내 CNT의 농도이다.
상기 표 5 및 도 13에 나타난 바와 같이, 각 토양 샘플에서는 20ng 내외의 CNT가 검출되었고, 이는 샘플 분석 시 취한 CNT 20ng의 양과 일치하였다.
< 실험예 5> 물벼룩에 축적된 탄소나노튜브 정량검출능력 평가
① 깨끗한 환경에서 자란 물벼룩 4마리, ② 10ng/㎕ 농도의 탄소나노튜브 용액을 0.1㎕ 스파이킹(spiking) 하여 100ng CNT와 함께 있는 물벼룩 4마리, ③ 1ng/㎕ 농도의 탄소나노튜브 용액을 0.1㎕ 스파이킹(spiking) 하여 10ng CNT와 함께 있는 물벼룩 4마리, ④ 10ng/㎕ 농도의 탄소나노튜브 용액에 3시간 노출시켜 미지 농도의 CNT가 축적된 물벼룩 4마리, ⑤ 1ng/㎕ 농도의 탄소나노튜브 용액에 3시간 노출시켜 미지 농도의 CNT가 축적된 물벼룩 4마리를 가지고 실험을 진행하였다.
농도를 알고 있는 CNT를 정량 분석한 실험(①,②,③)에서는 4마리의 물벼룩을 모두 사용하였으며, 농도를 모르는 CNT를 정량 분석한 실험(④,⑤)에서는 한 마리의 물벼룩만을 가지고 실험하였다.
<5-1> Neo -130F의 로오다민 B( rhodamine B) 소광 그래프 작성
100μM의 로오다민 B 시약을 제조하였고, 이를 10mM 인산완충액에 희석하여 최종농도 1μM 로오다민 B 3ml 형광시약을 제조하였다. 순수한 물에 분산시킨 1ng/㎕의 Neo-130F를 10 ng씩 적가 하면서 Neo-130F에 의해 소광 되는 1μM 로오다민 B. 형광시약의 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. 그 결과를 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 바와 같이, Neo-130F는 다른 탄소나노튜브들과는 다르게 50 ng 이상의 농도에서 로오다민 B의 형광감소량이 예측된 감소량보다 덜 감소하기 시작하였다.
<5-2> 축적된 양을 알고 있는 물벼룩으로부터 탄소나노튜브 정량검출
네 마리의 물벼룩이 들어있는 에펜돌프 튜브(eppendorf tube) 내에서 직접 피라나 용액을 제작하였다. 에펜돌프 튜브를 얼음조에 띄우고, 40㎕의 96% H2SO4와 10㎕의 30% H2O2를 첨가하였다. 제조된 샘플은 바로 60℃로 가열하였으며, 3시간 동안 산화시켰다. 산화 5분 만에 물벼룩은 형체를 알 수 없게 되었으며 30분이 지난 후는 찌꺼기가 보이지 않는 노란색 투명한 액체가 되었다. 1시간 후에는 다시 무색 투명한 액체가 되었다.
산화가 끝난 튜브는 얼음조로 옮긴 뒤 5N NaOH 275㎕를 첨가하여 중화시켰다.
상기 샘플에 15pmole의 비오틴-(GT)15를 첨가하여 다시 얼음물에서 강하게 초음파 분해를 수행하여 CNT를 랩핑(wrapping)하고 일정량의 자성 비드를 넣고 1시간 동안 혼합(vortexing)하여 CNT-DNA 착물을 캡처(capture)했다.
캡처한 CNT-DNA 착물은 세척 과정을 거친 후 95℃ 오븐에서 가열한 뒤 자성 웰을 이용하여 상층액 만을 취한 후 형광감소량을 측정하였다. 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.
샘플 CNT 물벼룩 산화 취한 양 a측정된 양
1 10 ng - -
모든 양
 13.12 ± 1.46 ng
2 - + + 1.83 ± 0.39 ng
3 10 ng + + 10.46 ± 2.00 ng
4 알려지지않음 + + 20㎕ / 500㎕ 13.58 ± 0.51 ng
5 알려지지않음 + + 10㎕ / 500㎕ 6.77 ± 0.21 ng
상기 표 6에서,
a는 검량선을 사용하여 계산한 값을 나타낸다.
상기 표 6에 나타난 바와 같이, 물벼룩을 산화시킨 후 프로토콜을 따라 실험하였을 때 스파이킹(spiking)한 농도의 CNT를 거의 정확하게 정량하였으며, 또한 1ng/㎕ CNT에 3시간동안 노출된 물벼룩에서도 약 340ng의 CNT(Neo-130F)가 축적된다는 것을 계산을 통해 알 수 있었다.
< 실험예 6> 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA를 사용한 탄소나노튜브의 정량검출능력 평가
상기 실험예 2-5에서 사용한 비오틴-(GT)15 ssDNA를 사용하는 대신에, 랜덤 염기서열을 갖는 DNA 역시 탄소나노튜브를 랩핑(Wrapping)하고, 탄소나노튜브의 정량검출능력이 있는지 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
<6-1> 실험준비
랜덤 염기서열 DNA를 복제/제작하기 위해 주형 가닥인 pUC19 Vector(1mg/ml)를 준비하였다. 여기서, pUC19는 2,686 base per이므로 1mg은 5.64×10-10 몰이다. 즉, pUC19 Vector 1mg/ml = 564nM이므로, 이를 105배 묽혀서 5.64pM의 pUC19 Vector 용액을 제작하였다.
DNA 복제를 위하여 바이오니어에서 비오틴이 결합되어 있는 프라이머(Primer) F1과 R1을 주문 제작하였다.
프라이머 F1 : 비오틴-CGA AAC CCG ACA GGA CTA TAA A
프라이머 R1 : CTA CAT ACC TCG CTC TGC TAA TC
rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 사용하여 DNA를 복제하기 위하여 바이오니어에서 [Hotstart Taq DNA 중합효소, 250U(5U/μl)]를 준비하였다. 상기 상품은 중합효소와 효소 희석 버퍼, dNTPs 혼합물, 10× 반응 버퍼가 함께 있다.
rtPCR을 위하여 하기 표 7과 같이 샘플 조성을 구성하였다.
구분 pUC19
(5.64pM)		 비오틴 프라이머 F1
(10μM)		 프라이머 R1
(10μM)		 Rxn 버퍼
(10×)		 dNTP
(10mM)		 중합효소
(5단위/㎕)		 SYBRGreen
(5×)		 물 총
1 1.0 2.0 2.0 2.5 2.5 0.2 1.0 13.8 25.0
2 0.5 13.5
상기 표 7에서,
단위는 ㎕이다.
상기 표 7에 나타난 바와 같이, DNA가 증폭되는지 확인하기 위하여 SYBR Green(5×) 1.0㎕를 함께 첨가해 총 부피가 25㎕가 되는 샘플을 두 가지 제조하였다. rtPCR 기기로는 CFX96 real-time system을 사용하였다. 그 결과를 도 18에 나타내었다.
도 18은 실험예 <6-1>에서 제조한 샘플을 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 18에 나타난 바와 같이, 중합효소의 양에 관계없이 DNA의 증폭이 잘 되는 것을 확인하였다. 이때, 중합효소 0.2㎕와 0.5㎕의 차이가 크지 않아 중간 양인 0.3㎕를 사용하기로 하였다.
다음으로, DNA를 증폭하기 위한 적절한 온도를 결정하기 위하여 어닐링 온도(Annealing Temperature)를 체크하였다. 하기 표 8과 같은 조성의 샘플을 8개 준비하여 각기 다른 온도(65.0℃, 64.5℃, 63.3℃, 61.4℃, 59.0℃, 57.0℃, 55.7℃, 55.0℃)에서 어닐링 온도를 설정하였으며, 그 결과를 도 19 및 하기 표 9에 나타내었다.
구분 pUC19
(5.64pM)		 비오틴 프라이머 F1
(10μM)		 프라이머 R1
(10μM)		 Rxn 버퍼
(10×)		 dNTP
(10mM)		 중합효소
(5단위/㎕)		 SYBRGreen
(5×)		 물 총
1 1.0 2.0 2.0 2.5 2.5 0.3 1.0 13.7 25.0
상기 표 8에서,
단위는 ㎕이다.
도 19는 DNA를 증폭하기 위한 적절한 온도를 확인하기 위한 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction) 결과를 나타내는 그래프이다.
샘플 온도 임계 주기(t) 용융 온도
1 65.0℃ 20.43 88.50℃
2 64.5℃ 20.35 88.50℃
3 63.3℃ 21.01 88.50℃
4 61.4℃ 21.60 89.00℃
5 59.0℃ 21.27 89.00℃
6 57.0℃ 21.62 89.00℃
7 55.7℃ 23.01 88.50℃
8 55.0℃ 23.06 89.00℃
도 19 및 표 9에 나타난 바와 같이, 가장 짧은 임계 주기에서 증폭 값이 나타난 64.5℃가 pUC19 Vector를 증폭하기에 가장 적절한 온도로 측정되었다.
<6-2> 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA의 제조
pUC19를 증폭하기 위하여 하기 표 10과 같은 두 종류의 샘플을 제작하였다.
구분 pUC19
(5.64pM)		 비오틴 프라이머 F1
(10μM)		 프라이머 R1
(10μM)		 Rxn 버퍼
(10×)		 dNTP
(10mM)		 SYBRGreen
(5×)		 중합효소
(5단위/㎕)		 물 총
#1 2.0 4.0 4.0 5.0 5.0 2.0 0.6 27.4 50.0
#2 - 29.4
상기 표 10에서,
단위는 ㎕이다.
다량의 결과물을 얻기 위하여, 전체 부피는 총 50㎕로 하였고, 총 400㎕의 PCR 결과물을 얻기 위하여 상기 샘플 #2를 총 8 웰 제작하였다. 샘플 #1은 샘플 #2가 제대로 증폭하였는지 알기 위한 샘플로 SYBR Green을 첨가해 주었다. 어닐링 온도(Annealing Temperature)는 64.5℃에서 진행하였다. 그 결과를 도 20에 나타내었다.
도 20은 실험예 <6-2>에서 제조한 샘플을 rtPCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)로 관찰한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 20에 나타난 바와 같이, 임계 주기(Threshold Cycle, C(t))는 34.07, 용융 온도는 89.00인 것으로 나타났다.
상기 PCR 결과물을 모두 수집하여 Amicon® Ultra Centrifugal Filters Ultracel-30K에 넣고, 14,000xg로 10분 동안 스핀(spin)하였다. 이후, 필터 튜브(Filter tube)를 뒤집어 스핀하여 내용물을 회수하였다. 상기 필터에 100㎕ 증류수를 더 첨가하여 세척한 후 회수하여 증류수를 사용해 총 120㎕로 제조하였다. 이를 정량하기 위해 [OPTIZEN 2120UV UV/Vis Spectrophotometer]를 사용하여 260nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 회수한 PCR 결과물의 농도가 약 1μM임을 확인하였다. 상기 실험 결과, 총 328 base per의 비오틴이 결합해 있는 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA를 제조하였다. 이를 도 21에 나타내었다(Sence DNA : 서열번호: 1 / Anti-Sence DNA : 서열번호: 2).
도 21은 실험예 <6-2>에서 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA를 나타내는 이미지이다.
<6-3> 탄소나노튜브 정량검출능력 평가
상기 실험예 <6-2>에서 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA의 탄소나노튜브 정량검출능력을 평가하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다. 이때, 랩핑에는 K-nanos 100p를 사용하였다.
탄소나노튜브를 검출하기 전 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA를 ssDNA(단일 가닥 DNA) 상태로 만들기 위하여 95℃ 오븐에서 10분 이상 가열 후 0℃ 얼음에서 급랭하였다.
0.1 w.t.%의 SDS 용액에 분산되어 있는 1mg/㎕의 탄소나노튜브를 각각 50㎕(50ng)과 100㎕(100ng) 취하여 에펜드로프(eppendrof) 튜브에 넣고, 합성한 비오틴-(랜덤 염기서열, 328 base per) DNA(0.1μM)를 50㎕ 첨가한 뒤 1시간 동안 얼음조에서 초음파 처리하여 랩핑하였다. 이후, 상기 실험예 2-5와 같이 자성 비드를 사용하여 캡처(capture)와 세척, 95℃의 열처리 과정을 거쳐 형광을 측정하였다. 동일 실험을 3회 반복하였다. 그 결과를 도 22에 나타내었다.
도 22는 실험예 <6-2>에서 제조한 랜덤 염기서열(Random Sequence) DNA의 탄소나노튜브 정량검출능력을 평가한 결과를 나타내는 이미지이다.
도 22에 나타난 바와 같이, 실험 결과는 실제 나와야 할 탄소나노튜브의 양보다 어느 정도 벗어난 범위에서 나타났다. 구체적으로, 50ng이 나와야 할 샘플에서는 24.48ng의 탄소나노튜브가, 100ng의 탄소나노튜브가 나와야 할 샘플에서는 53.37ng의 탄소나노튜브가 검출되었다. 이는 실제로 나와야 할 탄소나노튜브의 양에 대한 절반의 값인데, 그 이유로는 탄소나노튜브를 랩핑한 DNA는 이중(duplex)으로 한쪽 DNA에는 비오틴이 결합해 있지만, 다른 한쪽 DNA에는 비오틴이 결합되어 있지 않기 때문에 비오틴-DNA에 랩핑되지 않은 물질 제거 시 비오틴이 결합하지 않은 다른 한쪽 DNA가 절반의 탄소나노튜브를 랩핑한 채 제거되었기 때문이다. 이를 이용하여 검출된 탄소나노튜브 양을 정확히 2배씩 계산하면 약 49ng과 107ng이 나오게 된다. 상기 결과를 하기 표 11에 나타내었다.
구분 CNT 양 형광강도(F/F0) 검출 CNT 양 계산된 CNT 양
#1 50 ng 0.86 24.48±1.78 ng 48.97±3.56 ng
#2 100 ng 0.70 53.38±0.31 ng 106.75±0.62 ng
또한, 샘플 #2의 100ng에서, 탄소나노튜브가 약 6-7ng 차이가 나는 이유는 각 탄소나노튜브의 용량별 SYBR Green 소광 그래프를 보면 알 수 있다. 모든 탄소나노튜브의 첨가량이 증가할수록 포화(saturation)되어 기울기가 약간 감소된다. 이때문에, 100ng의 탄소나노튜브를 검출할 때에는 약 10ng까지 검출 오차가 생길 것으로 예상된다.
<110> Korea Institute of Toxicology <120> Probe for use in quantification detection of carbon nanotube and quantification detection method of carbon nanotube using the same <130> 2014P-11-004 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Random Sequence DNA_sence <400> 1 cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc 60 tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc 120 gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc 180 aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac 240 tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt 300 aacaggatta gcagagcgag gtatgtag 328 <210> 2 <211> 328 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Random Sequence DNA_antisence <400> 2 ctacatacct cgctctgcta atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt 60 gtcttaccgg gttggactca agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa 120 cggggggttc gtgcacacag cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc 180 tacagcgtga gctatgagaa agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc 240 cggtaagcgg cagggrcgga acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct 300 ggtatcttta tagtcctgtc gggtttgg 328

Claims (7)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 랜덤(Random) 염기서열을 갖는 ssDNA(단일 가닥 DNA)의 말단에 비오틴(Biotin)이 결합된 DNA부를, 탄소나노튜브를 함유하는 혼합물에 첨가하여 탄소나노튜브를 선택적으로 랩핑(Wrapping)하는 단계(단계 1);
    스트렙타아비딘(Streptavidin) 및 아비딘(avidin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 표면개질제가 표면에 개질된 자성 비드를 첨가하여 상기 단계 1에서 얻은 탄소나노튜브를 랩핑한 DNA부와 말단 비오틴을 상기 자성 비드 표면의 표면개질제에 결합시키고 자성을 가하여 분리하는 단계(단계 2);
    상기 단계 2에서 자성을 가하여 분리한 잔여물을 가열하여, DNA부에 랩핑되어 있던 탄소나노튜브를 분리하는 단계(단계 3); 및
    상기 단계 3에서 얻은 탄소나노튜브와 반응하는 형광시약을 첨가하여, 탄소나노튜브의 정량을 측정하는 단계(단계 4);를 포함하며, 상기 단계 4의 형광시약은 SYBR Green I, 로오다민 B(Rhodamine B), FAM, 메톡시쿠마린(Methoxycoumarin), DyLight®405, DyLight®350, DyLight®488, HEX, ROX, Cy5, Cy3, Cy2, TET, Cal Gold 540, VIC, Texas Red, Cal Red 610, Quasar 670, Quasar 705, HiLyte FluorTM405, 아미노쿠마린(Aminocoumarin), Pacific blueTM, EviTagTM quantum dots-Lake Placid Blue, ChromeoTM488, Alexa Fluor®488, FITC(Fluorescein Iso-thiocyanate), EviTagTM quantum dots-Adirondack Green 및 ChromeoTM505로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브의 정량검출방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 단계 4의 형광시약은 탄소나노튜브와 선택적으로 반응하여 형광 세기가 감소하는 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브의 정량검출방법.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 단계 3의 가열온도는 50-100℃인 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브의 정량검출방법.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 ssDNA의 염기서열은 30-500 머(mer)인 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브의 정량검출방법.
  7. 제3항에 있어서,
    상기 단계 4의 형광시약은 SYBR Green I 또는 로오다민 B(Rhodamine B)인 것을 특징으로 하는 탄소나노튜브의 정량검출방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107857964A (zh) * 2017-11-22 2018-03-30 江南大学 一种无规聚合物‑碳纳米管纳米复合材料的制备方法
KR20210131078A (ko) 2020-04-23 2021-11-02 동아대학교 산학협력단 생체 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275396A1 (en) 2006-03-17 2007-11-29 Ming Zheng Detection of DNA hybridization with a carbon nanotube label

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070275396A1 (en) 2006-03-17 2007-11-29 Ming Zheng Detection of DNA hybridization with a carbon nanotube label

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Espelund, M., et al., Nucleic Acid Research, Vol.18(20), pp.6157-6158 (1990)*
Heller DA., et al., Science, Vol.311, pp.508-511 (2006. 1. 27.)
Mao, P., et al., Enzyme and Microbial Technology, Vol.54, pp.15-19 (2014)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107857964A (zh) * 2017-11-22 2018-03-30 江南大学 一种无规聚合物‑碳纳米管纳米复合材料的制备方法
KR20210131078A (ko) 2020-04-23 2021-11-02 동아대학교 산학협력단 생체 조직 내 탄소 나노물질의 정량 방법

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