KR20210127919A - pMHC 점유의 스트렙타비딘-올리고 결합체 조성물 - Google Patents

pMHC 점유의 스트렙타비딘-올리고 결합체 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 상이한 핵산 분자로 바코딩된 pMHC 다량체 종 및 생물학적 샘플에서 항원 반응성 및 TCR 결합력을 결정하고, 상응하는 T 세포 전사체, T 세포 프로테옴, T 세포 후성 유전체 또는 TCR 유전자좌를 서열화하기 위한 그 용도를 설명한다.

Description

pMHC 점유의 스트렙타비딘-올리고 결합체 조성물
관련 출원
이 출원은 2018년 12월 18일 출원된 미국 가특허 출원 제62/781,377에 대하여 이익과 우선권을 주장하며, 그 내용은 여기에 참조로 통합된다.
바코딩된 항체 및 바코딩된 pMHC 다량체는 최근에 동족 세포(cognate cells) 및 결합 단백질/펩타이드의 대량(high-troughput) 시퀀싱이 가능하도록 개발되었다. 바코딩된 MHC 다량체는 잠재적으로 단일 세포 수준에서 이 정보를 전사체, 단백질체 및 TCR 서열 데이터와 결합할 수 있는 능력과 함께 TCR-pMHC 결합 이벤트의 대량 다량체화(multiplexed) NGS-기반 스크리닝을 가능하게 한다. 최근 예시들은 바코딩된 pMHC 다량체의 실현 가능성과 유용성을 보여준다1,4,5. 그러나 한 가지 한계는 TCR-pMHC 결합력을 측정하기 위해 스트렙타비딘 당 pMHC 단량체 로딩을 미세 조정하는 현재 기술의 불능이다. TCR-pMHC 결합력을 평가할 수 있는 바코딩된 pMHC 다량체가 필요하다. 화학적 결합을 피하고 MHC 단량체 시약을 절약하는 바코딩된 pMHC 다량체를 생산하는 비용-효율적인 방법도 필요하다.
발명의 개요
본원은 TCR-pMHC 결합력 평가와 병행하여 T 셀로믹스 분석을 조합하기 위한 플랫폼으로 사용될 수 있는 공유 및 비공유 결합된 바코딩된 SA-올리고 결합체(도 1)를 모두 생산하는 조성물 및 방법에 관한 것이다.
한 측면에서, 본 개시는 스트렙타비딘 분자에 비공유 결합된 적어도 하나의 비오티닐화된 pMHC 분자 및 동일한 백본 분자에 공유 또는 비공유 결합된 적어도 하나의 핵산 분자로 구성된 다양한 백본 (예. 스트렙타비딘) 점유의 바코딩된 pMHC 다량체 종류를 제공한다. 여기서 핵산은 중앙 바코드 영역을 포함할 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 원하는 스트렙타비딘 점유를 얻기위해 HPLC 정제를 이용하여 비오티닐화된 올리고로 스트렙타비딘을 바코딩하는 것을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 공유 결합(예. 티오에티르 결합 또는 비스-아릴히드라존(arylhydrazone) 결합체 결합)을 이용하여 스트렙타비딘 당 적어도 하나의 올리고로 스트렙타비딘을 바코딩하는 것을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시는 중앙 바코드 영역 및 폴리-A 꼬리를 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 바코딩된 pMHC 다량체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 중앙 바코드 영역 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 바코딩된 pMHC 다량체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 중앙 바코드 영역 및 주형 스위치 올리고 서열을 포함하는 적어도 하나의 핵산 분자로 바코딩된 pMHC 다량체를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 본원에 개시된 바코딩된 pMHC 다량체를 제조하거나 또는 사용하는 방법을 제공한다.
한 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 펩타이드-주조직 적합성 복합체 (pMHC) 바코딩된 다량체를 제공한다:
적어도 하나의 조정 가능한 pMHC 본체 (entity)로, 여기서 상기 pMHC 본체는 백본 분자에 의해 연결된 적어도 하나의 pMHC 분자; 및 백본 분자당 적어도 하나의 핵산 분자를 포함하고, 여기서 상기 핵산 분자는 공유 또는 비공유 결합된 결합체를 포함한다:
pMHC 다량체의 일부 구현예에서 핵산 분자는 다음을 포함한다:
pMHC 바코딩 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및 표적 올리고에 상보성을 갖는 뉴클레오티드의 두 번째 스트레치.
일부 구현예에서, pMHC 다량체는 NGS에서 사용된다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 백본 분자는 스트렙타비딘이다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 다량체는 백본 분자당 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 pMHC 본체를 포함한다.
일부 구현예에서, pMHC 다량체는 T 세포 수용체 (TCR)-pMHC 결합력을 모니터링하는데 사용된다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 공유 결합되어, 스트렙타비딘 당 적어도 4개의 MHC 단량체를 제공한다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 비공유 결합되고, 여기서 핵산 분자는 비오티닐화되고, 적어도 하나의 비오티닐화된 핵산 분자 및 스트렙타비딘은 비율로 복합체화되며, 여기서 그 비율은 1 스트렙타비딘: 1 올리고, 1 스트렙타비딘: 2 올리고, 1 스트렙타비딘: 3 올리고로 이루어진 군에서 선택된다.
일부 구현예에서, pMHC 다량체는 HPLC 정제 공정에 의해 제조된다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 공유 결합되고, 여기서 핵산 분자는 바코드 및 적어도 하나의 비오틴 결합 부위를 포함하고, 여기서 상기 결합 부위는 다음을 포함한다:
비오티닐화된 펩타이드, 비오티닐화된 단백질, 비오티닐화된 중합체, 비오티닐화된 형광단(fluorophores), 비오티닐화된 절단성 올리고 또는 비오티닐화된 제제.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 5' PCR 핸들 영역, 중앙 바코드 영역, 선택적으로 UMI, 또는 선택적으로 적어도 10개의 연속 아데닌의 3' 폴리-A 꼬리 영역으로 구성된다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 3' 말단 꼬리는 표적 올리고 서열에 상보적인 임의의 서열로 구성된다.
pMHC 다량체의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 임의의 상기 전술한 pMHC 다량체의 복수 서브 세트를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 pMHC 다량체의 각 서브 세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 특정 MHC 분자를 상응하는 T 세포 전사체와 연결하는 방법을 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
a) 복수의 임의의 전술한 pMHC 다량체 분자, T 세포 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI, 및 미끼(bait) 서열을 포함하는 결합 표적 올리고에 연결된 입자를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
b) 각 방울(droplet)이 단 하나의 입자 그리고 하나 이상의 pMHC 다량체 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
c) 각 방울에서 T 세포 cDNA 라이브러리 및 pMHC 바코드 라이브러리를 생성하는 단계; 및
d) T 세포 mRNA 라이브러리와 MCH 바코드 라이브러리를 모두 시퀀싱하여, 특정 MHC 분자를 상응하는 T 세포 전사체와 연결하는 단계.
방법의 일부 구현예에서, 미끼 서열은 3' 폴리-(dT)이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다량체 pMHC를 제공한다:
백본 분자에 의해 연결된 하나 이상의 pMHC 분자; 및 상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 증폭되도록 설계된 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역) 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열.
일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 백본에 연결된 제 1형 핵산 분자를 포함하고; 여기서 제 1형의 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRα 또는 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 백본에 연결된 제 1및 제 2형의 핵산 분자를 포함하고; 여기서
제 1형 핵산분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
제 2형 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
두 종류의 핵산 분자의 바코드 영역은 동일한 서열을 가지고;
선택적으로 두 종류의 핵산 분자 각각에 대한 UMI 서열은 무작위적이며 따라서 각각의 핵산의 동일한 영역에 위치하더라도 서로 상이하다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역, UMI 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 핵산 분자는 TCR 불변 유전자의 5' 말단에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, TCR 불변 유전자는 TCRα 불변 유전자, TCRβ불변 1 유전자 또는 TCRβ불변 2 유전자이다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 5' 말단 및/또는 3' 말단 핵산 분자는 백본 분자에 연결된다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 핵산 분자는 바코드 영역에 인접한 고유 분자 식별자 (UMI)를 추가로 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
임의의 상기 전술한 다량체 pMHC의 복수의 서브 세트, 여기서 다량체의 MHC의 각 서브 세트는 상이한 펩타이드와 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 특정 MHC 분자와 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ 서열을 연결하는 방법을 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
a) 임의의 상기 전술한 다량체 pMHC중 하나 이상을 제공하는 단계;
b) 상기 다량체 pMHC 분자를 T 세포와 접촉시키는 단계;
c) 다량체 MHC 분자에 결합하지 않은 세포로부터 다량체 MHC 분자에 결합된 T 세포를 분리하는 단계;
d) 분리된 T 세포를 용해하는 단계;
e) 각 DNA 분자가 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자의 서열과 pMHC 바코드를 포함하는 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
f) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 단계.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 단계 c)는 FACS 분류(sorting) 또는 마그네틱 비드-기반 분리에 의해 달성된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 다량체 pMHC 분자는 직접 또는 간접적으로 형광 표지된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 바코딩된 pMHC 분자와 결합된 T 세포는 단일 수집 튜브에서 대량 분류된다.
전술한 방법의 일부 구현예에서, 바코딩된 pMHC 분자와 결합된 동족 T 세포는 단일 세포로서 개별 플레이트 웰로 분류된다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 다량체 pMHC를 제공한다:
백본 분자에 의해 연결된 하나 이상의 pMHC 분자; 및 상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자, 여기서 상기 핵산 분자는 증폭되도록 설계된 핵산 (바코드 영역)의 중앙 스트레치 및 주형 스위치 올리고 서열을 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역, UMI 및 3' 주형 스위치 올리고 서열을 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 주형 스위치 올리고 서열은 3개의 리보구아노신의 3' 스트레치를 포함한다.
다량체 pMHC의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 조성물을 제공한다:
임의의 전술한 다량체 pMHC의 복수의 서브 세트, 여기서 다량체 pMHC의 각 서브 세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ상보적 서열에 연결하는 방법을 제공하며, 이는 다음을 포함한다:
a) 복수의 임의의 전술한 다량체 pMHC 분자, T 세포, 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고에 결합된 비즈를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
b) 각 방울(droplet)이 단 하나의 비드 그리고 하나 이상의 MHC 다량체 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
c) 각 DNA분자는 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자의 서열, 및 pMHC 바코드를 포함하는 것인, DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
d) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여, 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 단계.
방법의 일부 구현예에서, 비드는 하이드로겔 비드, 경질(hard) 비드 및 용해성 비드로부터 선택된다.
방법의 일부 구현예에서, 비드는 2 개의 올리고에 결합되며, 여기서 첫 번째 올리고는 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 두 번째 올리고는 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 2개의 올리고에 대한 중앙 세포 바코드는 동일한 서열을 갖는다.
방법의 일부 구현예에서, DNA 라이브러리 생성 단계 c)는 MMLV 역전사 효소를 사용하는 TCR mRNA의 역전사를 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, PCR 핸들은 바코드 서열의 라이브러리 준비를 가능하게 한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, PCR 핸들은 i7 어댑터 서열을 가질 수 있다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 바코드 영역은 적어도 4 개의 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, pMHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해, MHC 중쇄(heavy chain)를 통해, 또는 MHC 경쇄(light chain) (β2M)를 통해 백본에 연결된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, MHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해 백본에 연결된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 적어도 하나의 MHC 분자를 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 화학적 변형을 추가로 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나 이상의 핵산 분자의 5' 또는 3' 말단은 스페이서를 통해 아미노기에 부착된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 스페이서는 6-탄소 스페이서 또는 12-탄소 스페이서일 수 있다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 포스포로티오화된(phosphorothioated) 뉴클레오티드를 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자 및 백본 분자 사이의 연결은 핵산 분자의 유도성 해리(inducible dissociation)를 허용한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 공유 또는 비공유 결합을 통해 백본 분자에 연결된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 공유 결합은 티오에테르(thioether)이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 유도성 절단성(inducibly cleavable) 결합을 통해 백본 분자에 연결된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 유도성 절단성 결합은 광절단성이거나, 이황화 결합을 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 단량체이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, MHC 분자는 펩타이드와 복합체가 형성된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, MHC 분자는 비오티닐화 된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 백본은 형광 표지, His-태그 및 금속-이온 태그로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 추가로 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 백본은 형광 표지와 직접적으로 결합된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 형광 표지는 형광단-태그된 올리고이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 형광단-태그된 올리고는 백본에 연결된 핵산 분자에 상보적이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 백본은 형광단 표지된 항-스트렙타비딘 항체로 표지된다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 형광단은 형광 단백질, 형광 염료 또는 양자점(quantum dot)이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 적어도 하나의 핵산 분자는 DNA, RNA, 인공 뉴클레오티드, PNA 및 LNA로 이루어진 군에서 선택된 핵산 분자를 포함한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 동족 T 세포와 결합한다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 유세포 분석 애플리케이션과 양립할 수 있다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 유세포 분석 애플리케이션은 단일 세포 또는 대량(bulk) 세포 형광-활성화 세포 분류(FACS)이다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, 다량체 pMHC는 NGS-기반 애플리케이션과 양립할 수 있다.
임의의 전술한 다량체 pMHC 및 방법의 일부 구현예에서, NGS-기반 애플리케이션은 방울-기반 단일 세포 시퀀싱이다.
또 다른 측면에서, 본 개시는 다음을 포함하는 샘플에서 항원 반응성 세포를 검출하는 방법을 제공한다:
a) 하나 이상의 임의의 전술한 다량체 pMHC를 제공하는 단계;
b) 상기 다량체 pMHC 분자를 상기 샘플에 접촉시키는 단계; 및
c) 다량체 pMHC 분자와 상기 항원 반응성 세포의 결합을 검출하여, MHC 분자에 존재하는 항원에 반응하는 세포를 검출하는 단계, 여기서 상기 결합은 백본 분자를 통해 하나 이상의 MHC 분자에 연결된 상기 핵산 분자의 바코드 영역을 증폭함으로써 검출된다.
방법의 일부 구현예에서, 샘플은 혈액 샘플, 말초 혈액 샘플, 혈액 유래 샘플, 조직 샘플, 체액, 척수액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된다.
방법의 일부 구현예에서, 샘플은 포유류로부터 수득된다.
방법의 일부 구현예에서, 방법은 유세포 분석, FACS, 마그네틱-비드 기반 선별, 크기-배제, 구배 원심 분리, 컬럼 부착 및 젤 여과로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의한 세포 선별을 추가로 포함한다.
방법의 일부 구현예에서, 증폭은 PCR이다.
방법의 일부 구현예에서, 핵산 분자의 바코드 영역 검출은 바코드 영역의 시퀀싱 또는 qPCR에 의한 바코드 영역의 검출을 포함한다.
도 1은 바코딩된 pMHC 다량체를 제조하기 위해 스트렙타비딘에 결합하기 위한 변형된 올리고의 일반적인 구조를 나타낸다. 보라색 막대는 올리고를 나타내고, 녹색 별은 5' 변형을 나타낸다. 아래는 공유 결합에 사용된 올리고 서열이다. 올리고의 5' 말단은 12-탄소 스페이서가 있는 아미노기이고, 6-탄소 스페이서도 사용될 수 있다. 대안적인 올리고 변형은 티올(thiol) 그룹 또는 비오틴 그룹를 포함하지만 이에 제한되지 않는 아미노기 대신에 사용될 수 있다. 5' 비오틴 그룹은 스트렙타비딘에 대한 비공유 결합을 위해 사용될 수 있다. 이러한 올리고 변형은 올리고의 3' 말단에도 포함될 수 있다. PCR 핸들은 바코드 서열의 라이브러리 준비를 가능하게 하고, 이 특정 경우에, PCR 핸들은 i7 어댑터 서열이다. 사량체 바코드 서열은 PCR 핸들 뒤에 나오고 주어진 pMHC 복합체에 상응하는 서열이다. 이 서열에서 pMHC 바코드는 4096 개의 사량체 바코드 가능성까지 허용하는 6개의 뉴클레오티드로 구성된다. 더 긴 pMHC 바코드 서열은 증가된 처리량을 위해 사용될 수 있다. 올리고의 3' 말단에는 표적 서열, 이 경우에는 poly(dT)VN에 결합할 수 있는 폴리-A 꼬리가 있다. 이 올리고의 경우, 더 긴 아데닌 스트레치가 사용될 수 있지만, 25개의 아데닌이 사용된다. 폴리-A 꼬리의 5' 말단에 있는 B 뉴클레오티드 (G, C 또는 T)는 V 뉴클레오티드(G, C 또는 A)가 폴리(dT)VN의 마지막 3' 뉴클레오티드에서 두 번째에 결합하는 것을 가능하게 한다. 미끼(bait) 서열의 N 뉴클레오디드 (모든 염기)가 C이면 묘사된 올리고 서열과 상보적으로 결합한다. 올리고의 3' 말단에 선택적 포스포로티오화된(phosphorothioated) DNA 베이스는 엑소뉴클레아제 활성으로부터 보호를 제공한다. 변형된 베이스는 어느 위치에나 놓일 수 있다.
도 2는 이황화 브릿지가 사이에 있는 스트렙타비딘에 대한 바코딩 올리고의 결합을 보여준다. 제시된 예시에서, 결합은 Solulink 단백질-올리고뉴클레오티드 결합 키트 (Protein-Oligonucleotide Conjugation Kit, TriLink Biotech)를 사용하여 수행될 수 있다. 스트렙타비딘(이 경우 Prozyme)은 숙신이미딜-6-하이드라지노-니코틴아미드 (S-HyNic)로 변형된다. 5'-아미노-변형된 올리고는 숙신이미딜-4-포밀벤즈아미드 동족체 (S-SS-4FB)로 변형된다. 변형된 스트렙타비딘와 변형된 올리고가 결합되어 바코딩된 스트렙타미딘이 생성된다. 대안적인 방법론은 중간 광절단성 링커(표시되지 않음)로 올리고를 스트렙타비딘에 결합시키는 것을 포함한다.
도 3은 DNA 바코딩 올리고가 변성 조건하에서 스트렙타비딘으로부터 해리된다는 것을 보여준다. 중간 이황화 브릿지와 함께 스트렙타비딘에 결합된 66-mer 올리고를 SYBR-세이프 아가로스 젤 (레인 1a)에서 실시한다. 과잉 올리고는 100bp 래더 밴드 아래에 표시된다. 레인 2a에서, 레인 1a에서와 동일한 양의 바코딩된 스트렙타비딘을 젤에 로딩하기 전에 20 분간 베타-머캅토에탄올(beta-mercaptoethanol)과 함께 배양한다. 바코딩된 스트렙타비딘을 나타내는 밴드가 심하게 감소한다. 동일한 젤은 단백질을 시각화하기 위해 쿠마시 블루로 염색되었다. 레인 1b에서, 바코딘된 스트렙타비딘이 분명한 반면 레인 2b의 대부분의 단백질은 젤의 상단으로 이동되었다. 올리고의 음전하가 없으면 있는 그대로의(bare) 스트렙타비딘은 훨씬 느리게 이동한다.
도 4는 바코딩된 스트렙타비딘이 비오틴에 결합하는 능력을 보유함을 보여준다. 동일한 양의 바코드딩된 스트렙타비딘은 비오틴 마그네틱 비즈(레인 1a) 또는 스트렙타비딘 마그네틱 비즈(레인 2a)와 함께 배양되었다. 동일한 양의 비오틴 마그네틱 비즈 또는 스트렙타비딘 마그네틱 비즈가 이 실험에 사용되었다. 결합된 대 결합되지 않은 바코딩된 스트렙타비딘을 분리하기 위해 샘플을 마그네틱 분리기에 적용하였다. 양 반응에서 결합되지 않은 모든 분획을 수확하고 SYBR-세이프 아가로즈 젤에서 실시하였다. 동일한 젤은 단백질을 시각화하기 위해 쿠마시 블루로 염색되었다 (레인 1b 및 2b). 바코딩된 스트렙타비딘 (레인 1a 및 1b)의 소모는 비오틴 결합을 나타낸다. 비오틴과 스트렙타비딘 마그네틱 비즈는 둘 다 RayBiotech Inc.에서 구입하였다.
도 5는 바코딩된 pMHC 다량체 변이체를 보여준다. 맨 왼쪽 바코딩된 pMHC 다량체는 공유 결합에서 파생된 스트렙타비딘-올리고 결합체로 구성되며, 그 후 비오티닐화된 pMHC 단량체는 확립된 기술에 따라 사량체화(tetramerize) 하는데 사용된다. 이러한 공유 결합은 티오에테르 결합 형성을 포함하지만 이에 국한되지 않는 많은 결합 화학에서 파생될 수 있다.
다른 모든 결합체(conjugate)들은 비오티닐화된 올리고 및 스트렙타비딘 사이의 비공유 결합을 이용한다. 왼쪽에서 두 번째, 바코딩된 pMHC 다량체는 1: 1 (1b)의 비율로 정제된 스트렙타비딘-올리고 결합체로 구성되며, 그 다음 pMHC 삼량체화된다. 왼쪽에서 세 번째, 바코딩된 pMHC 다량체는 1: 2 (2b) 비율로 정제된 스트렙타비딘-올리고 결합체로 구성되며, 그 다음 pMHC 이량체화된다. 맨 오른쪽에서, 바코딩된 pMHC 다량체는 1: 3의 비율로 정제된 스트렙타비딘-올리고 결합체로 구성되며, 그 다음 pMHC 단량체와 결합되어 1: 1 몰비의 스트렙타비딘: 단량체를 제공한다. 서로 다른 색상의 올리고는 각각의 다량체 종에 대해 상이한 바코드 서열을 나타낸다. 하단 삼각형은 각 다량체화된 결합체의 예측된 TCR-pMHC 결합력, 4 개의 단량체> 3 개의 단량체> 2 개의 단량체> 1 개의 단량체를 나타낸다.
도 6은 4개의 패널, 바코딩된 pMHC 다량체 검출의 방법론을 나타내는 도 6a-6d을 포함한다. 도 6a에서, 형광단-함유 스트렙타비딘 (예: PE-스트렙타비딘)은 올리고에 대한 추가 결합을 위한 시작점으로 사용된다. 도 6b에서, 결합된 올리고에 상보적인 형광단-태그된 올리고는 pMHC 바코딩 올리고에 어닐링된다. 이 어닐링 올리고의 길이는 다양할 수 있다. 도 6c에서, 형광단 표지된 항-스트렙타비딘 항체는 바코딩된 pMHC 다량체를 검출하는데 사용된다. 사용되는 형광단의 화학 종은 형광 염료 및 양자점을 포함하지만 이에 국한되지 않는다. 올리고가 비공유적으로 연결된 바코딩된 pMHC 다량체 종도 이러한 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 도 6d는 항-스트렙타비딘 항체를 함유하는 상이한 형광 염료로 다른 pMHC 다량체 종(동일한 펩타이드 포함)을 개별적으로 표지할 가능성을 보여준다. 도 6a-6c의 세 가지 형광 표지 기술 중 하나가 적용될 수 있다. 이러한 방식으로, 다른 TCR은 유세포 분석을 사용하여 이러한 특정 pMHC 단백질 복합체에 대한 결합력에 대해 스크리닝될 수 있다. 이 특정 상황에서, 4개의 단량체 pMHC 다량체(사량체)는 공유 결합된 올리고를 필요로 하지 않고, 비공유 결합된 올리고를 이용하는 pMHC 다량체 종은, 필요한 모든 것이 올리고가 비오틴 결합 부위를 차단하는 것이라면, 상이한 올리고 바코드 서열을 필요로 하지 않는다. 다른 비오티닐화된 분자는 이론적으로 도 14에 설명된 대로 비오틴 결합 부위를 차단하는데 사용될 수 있다.
도 7은 면역-에피토프 결합력 모니터링을 위해 바코딩된 pMHC 다량체를 사용한 적용 예시를 보여준다. 종양-유래 돌연변이 유전자-암호화 단백질은 TCR 시퀀싱 연구를 위해 타일링된(tiled) 펩타이드이다. 이 서술에서, 동일한 돌연변이 단백질의 두 개의 중첩된 펩타이드 아미노산 서열 (숫자로 표시)은 보여지는 바와 같이 비오티닐화된 MHC (동일한 MHC 대립 유전자)와, 그 다음 바코딩된 스트렙타비딘 결합체와 개별적으로 복합체를 형성한다. pMHC에 무관하게 모든 결합체 종류에 대한 올리고 서열은 이들을 구별하는 고유한 바코드 서열을 포함한다 (스트렙타비딘에 부착된 컬러 라인으로 표시). 바코딩된 pMHC 다량체는 샘플과 함께 혼합된다. TCR 알파 및 베타 서열은 단일-세포 RNA 시퀀싱을 통해 얻어지며 동족 pMHC 다량체 종류와 쌍을 이룬다. 예를 들어, 이러한 결합체를 이용한 한 연구는 녹색 펩타이드-MHC 복합체 또는 적색 펩타이드-MHC 복합체가 상호 결합된 TCR 서열에 대해 더 높은 결합력을 갖는지 여부를 결정할 수 있다.
도 8은 바코딩된 pMHC 다량체 면역-에피토프 결합력 모니터링의 또 다른 적용 예시를 보여준다. 이 가상의 예시에서, 바이알은 스트렙타비딘: 올리고 비율 1:1, 1:2 또는 1:3로 구성된 바코딩된 pMHC 다량체 종의 정의된 혼합물을 포함하고 있으며, 이는 스트렙타비딘: pMHC 단량체 몰비는 각각 1:3, 1:2 및 1:1로 정의될 수도 있다. 결합체 종에 대한 올리고는 이들을 구별할 수 있는 고유한 바코드 서열 (다른 색상의 서열)을 포함한다. TCR-pMHC 결합력은 종양 미세 환경 내에서 감소하는 것으로 알려져 있기 때문에, 이러한 바코딩된 pMHC 다량체 결합체 종은 치료 과정, 예. 면역 관문 억제 (Immune Checkpoint Blockade (ICB))치료 동안 증가 또는 감소된 TCR 결합력을 설명할 수 있을 것으로 예상된다. 주어진 예시에서, ICB 처리 후 T 세포는 1 및 2 pMHC 단량체를 포함하는 다량체의 더 높은 판독 횟수에 의해 입증된 바와 같이 동족 pMHC 복합체와의 결합력이 증가한다.
도 9는 NGS를 통한 검출을 위한 비공유 결합 바코딩된 pMHC 다량체 제조를 보여준다. 비오티닐화된 올리고 (pMHC 다량체-특정 바코드 함유)는 스트렙타비딘 (또는 스트렙타비딘-형광단 결합체)과 0.5-1.0 올리고 대 1 스트렙타비딘의 비율로 혼합된다. 1: 1의 SA: 올리고 결합체는 미반응 (unreacted) 비오티닐화된 스트렙타비딘, 미반응 비오티닐화된 올리고 및 다른 SA: 올리고 비율의 결합체가 제거되도록 HPLC를 통해 정밀하게 정제된다. 그 다음 결합체는 비오티닐화된 pMHC 단량체와 다량체화된다. 최종 생성물은 각 스트렙타비딘이 1개의 올리고와 3개의 pMHC 단량체를 갖는 바코딩된 pMHC 삼량체이다. 동일한 개념은 1: 2 및 1: 3의 스트렙타비딘: 올리고 비율로 구성된 결합체를 제조할 때 사용된다.
도 10은 다른 단량체 비율의 바코딩된 pMHC가 충분히 높은 농도로 사용될 때 그리고 중간 정도의 결합력의 TCR을 검출할 때 유사하게 T 세포를 검출할 수 있음을 보여준다. 스트렙타비딘-올리고 결합체는 비오티닐화된 올리고를 스트렙타비딘에 SA: 올리고 비율 1: 1 또는 1: 2로 연결하여 제조되었다. 스트렙타비딘 단독을 대조군으로 사용하였으며, 이는 하단의 도면 범례(legend)에 서술한 바와 같이 스트렙타비딘(사량체) 당 4개의 pMHC 단량체를 갖는다. 1: 1 SA: 올리고 결합체는 3 개의 단량체를 포함하는 반면 1: 2 SA: 올리고 결합체는 2 개의 단량체를 포함한다. 이 실험의 목적을 위해, 모든 바코드 결합체에 대한 올리고는 동일한 69mer 뉴클레오티드 서열로 구성되었다. 왼쪽 3 개 컬럼은 CMV pp65 펩타이드와 복합체를 형성한 HLA-A* 11: 01 MHC I을 사용한 다량체 염색을 나타내며, 그 다음 스트렙타비딘, 올리고 하나와 스트렙타비딘 또는 올리고 둘과 스트렙타비딘과 함께 다량체화하였다. 중간 3 개 컬럼은 EBV 399-408 펩타이드와 복합체를 형성한 HLA-A* 11: 01 MHC I를 사용한 다량체 염색을 나타낸다. 오른쪽 3 개 컬럼은 EBV 416-424 펩타이드와 복합체를 형성한 HLA-A* 11: 01 MHC I을 사용한 다량체 염색을 나타낸다. 각 염색에 사용된 스트렙타비딘의 양은 줄의 맨 왼쪽에 표시되었다. 다량체 양성 염색 백분율은 각 상자에 표시된다. 이전에 펩타이드 확장된 세포는 항-CD3, 항-CD8, 생/사(live/dead) 염료 및 비-형광단 바코딩된 pMHC 다량체 (또는 사량체)로 염색하는 데 사용되었다. 2 차 염색은 pMHC 다량체를 검출할 수 있도록 항-스트렙타비딘-PE로 구성되었다. 유세포 분석 게이트 범례는 그림 상단에 표시된다.
도 11은 서로 다른 올리고 및 단량체 비율의 바코딩된 pMHC 다량체는 pMHC-TCR 결합력을 구별할 수 있음을 보여준다. 스트렙타비딘-올리고 결합체는 공유 결합 (티오에테르 결합)을 통해 올리고를 스트렙타비딘에 공유적으로 연결하거나 다양한 SA: 올리고 비율로 비오티닐화된 올리고를 스트렙타비딘에 연결함으로써 제조되었다. 이 실험의 목적을 위해, 모든 결합체에 대한 올리고는 동일한 46mer 뉴클레오티드 서열로 구성되었다. 공유 결합체는 4개의 비오틴 결합 부위가 모두 이용 가능한 채로 하나의 하나의 올리고에 결합된 하나의 스트렙타비딘 분자를 나타낸다. 1b 결합체는 3개의 비오틴 결합 부위가 남아있는 채로 하나의 비오티닐화된 올리고에 연결된 하나의 스트렙타비딘을 나타낸다. 2b 결합체는 두 개의 비오틴 결합 부위가 남아있는 채로 두 개의 비오티닐화된 올리고에 결합된 하나의 스트렙타비딘을 나타낸다. 3b 결합체는 하나의 비오틴 결합 부위가 남아있는 채로 3 개의 비오티닐화된 올리고에 연결된 하나의 스트렙타비딘을 나타낸다. H-2Kb 비오티닐화된 단량체 (MBLI)는 고 친화성 SIINFEKL 펩타이드 또는 저 친화성 SIIVFEKL 펩타이드와 복합체를 형성했다. 이 경우 친화성은 MHC와 펩타이드의 상호 작용이 아닌, pMHC 복합체와 형질 전환의 OT-I TCR 사이의 상호 작용 강도를 의미한다. 이 경우 결합력은 여러 pMHC가 TCR 결합 평가에 관여될 때 결합된 친화성을 의미한다.
pMHC 분자는 바코딩된 pMHC 다량체를 제조하기 위해 스트렙타비딘-올리고 결합체와 복합체를 형성한다. OT-I 비장 세포는 다양한 SA 양 (0.25ug 첫 번째 열, 0.1ug 두 번째 열, 0.025ug 세 번째 열)으로 다양한 바코딩된 H-2Kb 바코딩된 pMHC 다량체 종으로 염색되었다. 공유 결합체는 1 SA 대 4 단량체의 몰비를 사용하여 사량체화된 pMHC이다. 1b 결합체는 1 SA 대 3 단량체의 몰비를 사용하여 삼량체화된 Pmhc이다. 2b 결합체는 1 SA 대 2 단량체의 몰비를 사용하여 이량체화된 pMHC이다. 3b 결합체는 1 SA 대 1 단량체의 몰비를 사용하여 결합된 pMHC이다. 세포는 항-CD3, 항-CD8, 생/사 염료 및 각각의 비-형광단 바코딩된 pMHC 다량체 종으로 동시에 염색되었다. 2 차 염색은 pMHC 다량체를 검출하기 위해 항-스트렙타비딘-PE로 구성되었다. 유세포 분석 게이트 범례는 도면 상단에 표시된다. pMHC 다량체 양성 염색 백분율은 각 상자에 저, 중 또는 고 강도로 표시된다.
도 12는 TCR에 대한 pMHC 결합력을 구별하기 위해 상이한 pMHC 점유의 바코딩된 pMHC 다량체를 사용한 가상 실험 결과를 보여준다. SIINFEKL 및 SIIVFEKL 펩타이드-유래 바코딩된 pMHC 다량체는 가상 실험 환경에서 OT-I 비장 세포 (왼쪽)와 혼합된 것으로 묘사된다. 각 다량체의 종류 비율은 실험 목표에 따라 조정될 수 있다. 대안적으로, 세포의 부분 표본(aliquot)은 SIINFEKL 또는 SIIVFEKL 바코딩된 pMHC 다량체와 함께 개별적으로 배양될 수 있다. 각 다량체 종은 다른 다량체 종과 구별하기 위해 고유한 바코드 서열을 보유한다. FACS 분류는 방울(droplet)-기반 단일 세포 시퀀싱 또는 기타 단일 세포 시퀀싱 플랫폼 (중간) 이전에 사용될 수 있다. 오른쪽에는 예측된 바코드 판독 빈도가 있다. 이 경우 높은 친화성/결합력 SIINFEKL-기반 pMHC 바코드 판독은 모든 단량체 종에서 우세한 반면 낮은 친화성/결합력 SIIVFEKL-기반 pMHC 바코드 판독은 4 개의 단량체 종에서만 나타날 수 있다. 이러한 특정 상황의 경우, 각 펩타이드 (SIINFEKL 대 SIIVFEKL)에 대한 4 개의 단량체-기반 pMHC 다량체 종만 사용해도 이 특정 TCR에 대해 더 높은 결합력을 갖는 pMHC 복합체를 결정하기에 충분할 것이다. 그러나, 결합력 차이가 더 미세하고 다른 TCR이 관련된 경우에, pMHC 바코딩된 종의 사용은 잠재적으로 결합력의 차이를 나타낼 수 있다.
도 13은 바코딩된 pMHC 다량체는 직접 결합된 형광단으로 생성될 수 있음을 보여준다. 스트렙타비딘-올리고 결합체는 티오에테르 결합 (Cov)을 통해 올리고 스트렙타비딘을 공유적으로 연결하거나 1 SA: 1 올리고 (1b)의 비율로 비 오티닐화된 올리고를 스트렙타비딘에 연결함으로써 제조되었다. 또한, SA-올리고 결합체를 포함하는 형광단 (Alexa Fluor 647)이 제조되었다. 이 경우, AF647은 먼저 스트렙타비딘에 직접 결합되고, 그 후 올리고가 스트렙타비딘에 직접 결합되었다. 이 실험의 목적을 위해, 결합체는 동일한 69mer 뉴클레오티드 서열로 구성되었다. 공유 결합체는 4개의 비오틴 결합 부위가 모두 이용 가능한 채로 하나의 올리고에 결합된 하나의 스트렙타비딘 분자를 나타낸다. 1b 결합체는 3개의 비오틴 결합 부위가 남아있는 채로 하나의 비오티닐화된 올리고에 결합된 하나의 스트렙타비딘을 나타낸다. 결합체는 표시된 비율로 HLA-A* 02: 01 단량체를 포함하는 비오티닐화된 CMV pp65 NLVPMVATV 펩타이드 또는 음성 대조군 HLA-A* 02: 01 단량체 (MBLI)로 다량체화 되었다. CMV pp65 펩타이드 (NLVPMVATV)로 이전에 확장된 인간 HLA-A* 02: 01 PBMC는 결합체로 염색하는 데 사용되었다. 세포는 항-CD3, 항-CD8, 생/사 염료 및 바코딩된 pMHC 다량체로 염색되었다. 중간 컬럼 샘플은 대조군으로서 MBLI 상용 CMV pp65 HLA-A* 02: 01 PE 사량체로 염색되었다. 형광단이 없는 결합체를 포함하는 샘플은 항-SA-PE로 2 차적으로 염색되었다. 유세포 분석 게이트 범례는 도면 상단에 표시된다. 백분율 pMHC 다량체 양성 염색은 각 상자에 표시된다.
도 14는 바코딩된 pMHC 다량체 종을 생성하는 대안적인 방법을 보여준다. 표시된 모든 결합체 종은 공유 결합(예: 티오에테르 결합)을 통해 스트렙타비딘 당 하나의 올리고를 보유한다. 실제 실험 환경에서, 각 결합체 종(4, 3, 2 또는 1 단량체)은 다른 색상으로 표시된 고유한 바코드 서열을 가지고 있다. 비오티닐화된 펩타이드, 비오티닐화된 단백질, 비오티닐화된 지질, 비오티닐화된 형광단, 비오티닐화된 중합체 또는 절단성 비오티닐화된 올리고 (모든 가능성은 일반적으로 자주색으로 표시됨)는 최적화된 비율로 SA-올리고 결합체와 배양되고 원하는 비오틴 점유율에 맞게 HPLC-정제된다. 다음 이러한 정제된 결합체는 비오티닐화된 pMHC 단량체와 다량체화되어 스트렙타비딘 당 비오틴 결합 부위를 완전히 점유하게 된다. 하단 삼각형은 각 다량체화된 결합체의 예측된 TCR-pMHC 결합력, 4 개의 단량체> 3 개의 단량체> 2 개의 단량체> 1 개의 단량체를 나타낸다.
도 15는 면역-에피토프 우성 분석을 위한 대량(bulk) pMHC 다량체 바코드 시퀀싱을 나타낸다. 이 구현예에서, 바코딩된 pMHC 다량체 (다른 색의 선을 가진 별)는 마그네틱 비드 또는 FACS와 같은 농축(enrichment)을 사용하거나 사용하지 않고 세포로부터 정량화된다. 표시된 예에서, 5 개의 서로 다른 gp100 펩타이드는 각각의 gp100 펩타이드/MHC 복합체가 고유한 다량체 바코드(다른 색으로 표시됨)와 연관된 별도의 바코드 pMHC 다량체로 만들어졌다. 바코딩된 pMHC 다량체는 공유 또는 비공유 결합된 올리고를 사용할 수 있다. 올리고는 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 처리된다.
소형 바코딩된 올리고 라이브러리 (예: 8 개 이하)가 필요한 적용(application)의 경우, pMHC 다량체 바코드 정량화는 시퀀싱을 사용하지 않고도 확인될 수 있다. pMHC 다량체 영역에 상보적인 형광 표지된 올리고는 세포와 함께 배양하기 전에 사전-어닐링될 수 있다. 각 바코딩된 pMHC 다량체 유형은 세포와 배양 및 후속의 유세포 분석 전에 올리고를 함유하는 별개의 형광단에 어닐링될 것이다. 예를 들어, gp100 #1 펩타이드 및 관련 올리고 서열을 포함하는 pMHC 다량체는 상보적인 AlexaFluor488-올리고에 사전 어닐링되고, gp100 #2 펩타이드 및 관련 올리고 서열을 포함하는 pMHC 다량체는 상보적인 AlexaFluor532-올리고 등에 사전 어닐링된다.
도 16은 NGS-기반 단일 세포 시퀀싱 플랫폼과 함께 바코딩된 pMHC 다량체의 사용을 보여준다. 표적 세포에 결합된 바코딩된 pMHC 다량체 (이 예시에서 공유 결합된 올리고)는 단일 방울(droplet)에 포획된다. 대부분의 개별 방울은 표적 올리고를 포함하는 입자와 함께 하나의 T-세포/바코딩된 pMHC 복합체를 포함한다. 이 예시에서 바코딩 올리고는 폴리-A를 포함한다. 올리고 및 T 세포 mRNA는 모두 추가 라이브러리 준비를 위해 역-전사된다. 선택적으로, 올리고와 스트렙타비딘 사이의 절단성 결합 (UV 또는 이황화물)은 올리고와 스트렙타비딘의 결합 동안 도입될 수 있다. 특히, 이황화 결합은 용해 완충액(lysis buffer)의 환원 환경으로 인해 방울에서 해리될 것이다.
도 17은 8 개의 패널을 포함한다. 도 17a-17h는 TCR 및 pMHC 복합체 판독을 특이적으로 서열화하기 위해 바코딩된 pMHC 다량체를 표적으로 하는 TCR 유전자좌를 보여준다. 대량 시퀀싱 및 방울-기반 NGS 플랫폼에서 올리고 디자인에 대한 대안은 pMHC 복합체의 동일성(identity)을 유지하면서 원하는 내인성 mRNA 전사물을 표적으로 하는 올리고를 갖는 것이다. 해당 pMHC 동일성과 함께 TCR 클론성(clonality) 또는 단일 세포 TCR 레퍼토리를 구체적으로 조사하기 위해 바코딩된 pMHC 다량체에 대한 다양한 디자인이 표시되어있다. 이러한 디자인은 한 번의 판독으로 pMHC 바코드와 함께 TCR 전사물의 시퀀싱을 허용한다. PCR 핸들은 PCR 프라이머가 증폭을 위해 결합하는 영역을 포함한다. 바코드 (BC)는 pMHC 복합체를 식별하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. TCR 상보적 서열 (TCR compl)은 TCR 불변 유전자에 상보적이다. TCR 상보적 서열은 역전사 동안 프라이머 역할을 한다.
도 17a에서, 바코딩 올리고는 바코딩된 사량체를 제조하기 위해 스트렙타비딘에 공유 결합된다. 이 바코딩된 사량체는 TCRβ 불변 영역 유전자에 상보적인 3' 서열을 포함한다. 5' 말단 (각 J 유전자에 가장 가까움)에서 두 불변 유전자 사이에 상당한 서열 유사성이 있으므로, TCRβ 불변 유전자 올리고 서열은 TCRβ 불변 1 유전자 및 TCRβ 불변 2 유전자 모두에 상보적이다. 정제된 바코딩된 스트렙타비딘 결합체는 그 다음 pMHC와 사량체화된다. 고유 분자 식별자 (UMI)는 하류의 PCR 중복제거를 위해 사량체 바코드 근처에 배치될 수 있으므로 더 정확한 pMHC 결합 정량화도 가능하다. TCRβ 표적 올리고는 단독으로 TCR 클론성을 연구하는데 사용될 수 있다. 대안적으로, 올리고를 표적화하는 TCRα 불변 유전자는 단독으로 사용될 수 있다 (표시되지 않음).
도 17b에서, A로부터 정제된 스트렙타비딘-올리고 결합체는 TCRα 불변 유전자를 표적으로 하는 공유 결합된 올리고를 포함하도록 추가로 변형된다. 이 구성(construct)은 완전한 TCRα/β 서열 (도 17d-h와 동일)을 얻기하기 위한 단일 세포 시퀀싱 플랫폼에 적합하다. 이러한 이중 올리고 스트렙타비딘 결합체는 그 다음 사량체화된다.
도 17c에서, 비오티닐화된 올리고를 표적으로 하는 TCRβ는 스트렙타비딘에 비-공유적으로 부착되고, 정제된 다음 비오티닐화된 pMHC 단량체로 삼량체화된다.
도 17d에서, c로부터 정제된 TCRβ 결합체는 스트렙타비딘에 비-공유적으로 부착되고, 정제된 다음 비오티닐화된 pMHC 단량체로 이량체화된다.
도 17e에서, TCRβ 및 TCRα 표적 서열을 모두 포함하고 양 끝에 비오티닐화된 단일 올리고가 사용된다. 원하는 결합체는 정제되고 비오티닐화된 pMHC 단량체와 이량체화된다. 이를 위한 대안적인 올리고 디자인은 두 반쪽 사이에 절단성 (UV 또는 이황화물) 결합을 포함한다.
도 17f에서, TCRβ 및 TCRα 표적 서열을 모두 포함하는 양 끝에 비오티닐화된 단일 올리고가 사용된다. 맞는 크기의 스트렙타비딘-올리고 결합체는 정제되고 비오티닐화된 pMHC 단량체와 2x 삼량체화되어, 올리고당 총 6개의 pMHC 단량체를 제공한다. 도면 17e와 같이, 이 디자인은 두 반쪽 사이에 절단성 (UV 또는 이황화물) 결합을 포함하도록 추가로 강화될 수 있다.
도 17g에서, TCRb 및 TCRa 표적화 서열을 모두 포함하는 단일 올리고는 스트렙타비딘에 공유적으로 부착된다. 정제된 결합체는 비오티닐화된 pMHC 단량체와 사량체화된다. 도 17e 및 17f와 같이, 이 결합체는 절단성 결합을 포함할 수 있다.
도 17h에서, TCRb 및 TCRa 표적화 서열을 모두 포함하는 단일 비오티닐화된 올리고는 스트렙타비딘에 비-공유적으로 부착될 수 있다. 정제된 결합체는 비오티닐화된 pMHC와 삼량체화된다. Fig 17e-g에서와 같이, 이 결합체는 절단성 결합을 포함할 수 있다.
도 18은 FACS 분류된 단일 세포 TCR 클론성 또는 쌍을 이루는 TCRa/b 시퀀싱에 사용되는 TCR 유전자좌 표적 바코딩된 pMHC 다량체를 보여준다. 설명을 위해 몇 가지 디자인만 표시되지만 이전 도면에서 임의의 바코딩된 pMHC 다량체 디자인이 사용될 수 있다.
TCRβ 불변 유전자 표적 올리고를 포함하는 바코딩된 사량체가 왼쪽에 표시되어 있다. 대안으로, TCRα 불변 유전자 표적 올리고는 사용되거나 둘 다 이전 도면에 설명된 디자인과 함께 사용될 수 있다. 이러한 상보적인 TCR α/β 올리고 서열은 내인성 TCRα/β mRNA 전사체에 대한 역전사 프라이머 역할을 할 것이다. 세포 분류 애플리케이션에서 바코딩된 pMHC 다량체를 표적으로 하는 TCR을 이용하기 위해, 형광은 도 6에 설명된 바와 같이 통합될 수 있다. T 세포는 먼저 단일 세포로 분류되고 웰-내(in-well) 역전사되고, 그 다음 클론성 연구를 위해 단일 튜브에서 대량으로 처리된다. T 세포 #1은 바코드 서열 #1을 포함하는 바코딩된 pMHC 다량체에 의해 결합되는 반면 T 세포 #2는 바코드 서열 #2를 포함하는 바코딩된 pMHC 다량체에 의해 결합된다. 오른쪽에서, 바코딩된 pMHC 다량체는 이전 도면에 설명된 대로 TCR α 및 β표적화 서열을 모두 포함한다. T 세포는 단일 세포로 분류되고 개별 플레이트 웰, 이 경우에는 96 웰 플레이트에서 처리된다.
클론성 연구는 연구자에게 주어진 pMHC 복합체에 대한 TCR 사용의 폭을 이해하도록 허용한다. TCRα 및 TCRβ 바코딩 올리고가 둘 다 사용된다면 대량 시퀀싱에 대한 불리한 점은 TCRα 및 TCRβ 서열이 쌍을 이룰 수 없다는 것이다. 이 문제를 극복하기 위해, TCRα 및 TCRβ 서열의 페어링을 허용하도록 T 세포가 오른쪽에 표시된 대로 처리될 수 있다.
라이브러리 준비 전략은 아래에 설명되어 있으며, 이전 도면에서 확장된다:
i) 단일 분류된 T 세포는 역전사되고 그 후 대량으로 처리된다. RNase 처리 뒤에 브릿지 어댑터 연결(ligation)이 이어진다. 브릿지 어댑터는 모든 역전사 유전자에 공통적이다. 후속 PCR 증폭은 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
ii) 단일 분류된 세포는 SMARTScribe RT (Clontech)에 의해 역전사된다. SMARTer 첫 번째-가닥 합성 및 RT 주형 전환은 5'-RACE 준비(Ready) cDNA를 생성한다. 대량의 후속 PCR 증폭은 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
iii) 단일 세포 분류된 T 세포는 용해되고 웰-내 RT, 웰-내 RNase 처리 뒤에 웰-내 브릿지 어댑터 연결이 이어진다. 브리지 어댑터 상류 서열은 모든 웰에 공통적이지만 모든 웰은 TCR 서열에 가장 가까운 부위에서 고유한 세포 바코드를 가진 브릿지 어댑터를 받는다. 이 방법론의 주요 장점은 동일한 세포에서 발생하는 TCRα 및 TCRβ 서열이 쌍을 이룰 수 있어 개별 T 세포의 완전한 TCR 서열이 확인될 수 있다는 것이다. 연결된(ligated) 전사체는 최종 라이브러리 준비를 생성하는 공통 프라이머를 사용하여 후속 PCR 증폭을 위해 풀링된다.
iv) 단일 분류된 T 세포는 용해되고 웰-내 SMARTScribe RT (Clontech)를 거친다. SMARTer 첫 번째-가닥 합성 및 RT 주형 전환은 5'-RACE 준비 cDNA를 생성한다. 각 웰을 개별적으로 바코드화하기 위해, SMARTerIIA 결합 서열의 상류에 고유한 세포 바코드 서열을 가진 SMARTerIIA 올리고에 상보적인 정방향 프라이머를 사용하여 웰-내 PCR 증폭이 수행된다. 이것은 개별 웰로부터 전사체를 구별할 것이다. 정방향 프라이머의 5' 말단에서 공통 프라이밍 부위 (즉, i5 서열)는 샘플 풀링을 허용한다. 공통 프라이머를 사용한 풀링된 PCR 증폭은 최종 라이브러리 준비를 생성한다. iii와 마찬가지로, 이 방법론의 주요 장점은 동일한 세포로부터 발생하는 TCRα 및 TCRβ 서열이 쌍을 이룰 수 있다는 것이다.
도 19는 브릿지 어댑터를 사용한 클론성 연구를 위한 TCR 표적 바코딩된 pMHC 다량체 라이브러리 준비를 보여준다. 도 18(i)에 설명된 바와 같이, 동족 T 세포에 의해 결합된 바코딩된 pMHC 다량체는 먼저 단일 세포를 분류하고, 역전사되고 다음 대량 처리된다. 디스플레이를 위해, TCRα 및 TCRβ 유래 전사체는 모두 표시되지만 클론성 연구에는 하나만 사용되어야 한다. 도 6에 설명된 형광단 추적 전략의 사용은 FACS 분류에 필요하다. 웰-내 RT 뒤에 RNase 처리 후 브릿지 어댑터 연결이 이어진다. 대량 시퀀싱을 위한 브릿지 어댑터 (i5 서열)는 모든 세포에 대해 동일하고, 새롭게 역-전사된 TCR 전사체의 3' 말단에 연결에 필요한 브릿지 어댑터의 하단 올리고에 5' 인산염을 포함한다. 브릿지 어댑터는 또한 어댑터 연결의 안정성을 향상시키기 위해 연결되지 않은 가닥의 3' 말단에 6개의 무작위 뉴클레오티드를 포함한다. 연결 후, 공통 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
도 20은 SMARTScribe 효소 (Clontech)를 사용한 대량 시퀀싱을 위한 TCR 표적 바코딩된 pMHC 다량체 라이브러리 준비를 보여준다. 도 18 (ii)에서 설명된 바와 같이, 동족 T 세포에 의해 결합된 바코딩된 pMHC 다량체는 먼저 단일 세포를 분류하고, 역전사되고 다음 대량 처리된다. 디스플레이를 위해, TCRα 및 TCRβ 유래 전사체는 모두 표시되지만 클론성 연구에는 하나만 사용되어야 한다. 도 6에 설명된 형광단 추적 전략의 사용은 FACS 분류에 필요하다. SMARTScribe 효소가 포함된 웰-내 RT는 새로 역-전사된 전사체의 3' 말단에 주형 전환을 통해 SMARTerIIA 올리고 서열을 추가한다. 주형 전환 후, 공통 프라이머를 사용한 대량 PCR 증폭은 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
도 21은 브릿지 어댑터를 사용한 단일 세포 쌍 TCRα/β 시퀀싱을 위한 TCR 표적 바코딩된 pMHC 다량체 라이브러리 제조를 보여준다. 도 18(iii)에 설명된 바와 같이, 동족 T 세포에 의해 결합된 바코딩된 pMHC 다량체는 단일 세포를 개별 웰로 분류한다. 도 6에 설명된 형광단 추적 전략의 사용은 FACS에 필요하다. 분류된 세포는 용해되고 웰-내 RT, 웰-내 RNase 처리 및 웰-내 브릿지 어댑터 연결을 거친다 (단순화를 위해 연결 단계(ligation step)에서 단일 TCR 전사체만 표시). 각 웰에 대한 브릿지 어댑터 (예: i5 서열)는 TCRα/β 서열의 페어링을 가능하게 하는 고유한 세포 바코드를 포함한다. 이 도면에서, 00001은 특정 웰의 세포 바코드를 나타낸다. 브릿지 어댑터의 연결 가닥(ligating strand)에 5' 인산염은 새로 역-전사된 TCR 전사체의 3' 말단에 연결을 가능하게 한다. 브릿지 어댑터는 또한 어댑터 결합의 안정성을 향상시키기 위해 연결되지 않은 가닥의 3' 말단에 6개의 무작위 뉴클레오티드를 포함한다. 연결 후, 공통 프라이머를 사용한 PCR 증폭을 위해 샘플은 풀링되어 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
도 22는 SMARTScrib 효소를 사용한 단일 세포 시퀀싱을 위한 TCR 표적 바코딩된 pMHC 다량체 라이브러리 준비를 보여준다. 도 18(iv)에서 설명된 바와 같이, 동족 T 세포에 의해 결합된 바코딩된 pMHC 다량체는 단일 세포를 개별 웰로 분류한다. 도 6에 설명된 형광단 추적 전략의 사용은 FACS에 필요하다. 분류된 세포는 용해되고 주형 스위칭을 통해 SMARTerIIA 올리고 서열을 새롭게 역-전사된 전사체의 3' 말단에 추가하는 SMARTScribe 효소(Clontech)를 사용하여 웰-내 RT를 거친다. 이 후, 웰-내 RCR 증폭(단순화를 위해 단일 전사체만 표시)은 결합 서열뿐만 아니라 세포 바코드 서열(모든 웰에 고유) 및 5' 말단에 공통 i5 서열을 모두 포함하는 정방향 프라이머를 사용하여 수행된다. 이 도면에서, 세포 바코드는 00001로 표시된다. 고유한 세포 바코드를 포함하는 정방향 프라이머의 사용은 TCRα/β 서열의 페어링을 가능하게 한다. 추가적 PCR 증폭을 위해 샘플은 풀링되어 최종 라이브러리 준비를 생성한다.
도 23은 2개의 패널을 포함한다. 도 23a-23b는 방울-기반 단일 세포 TCRα/β 단일세포 시퀀싱을 위한 스위치 올리고를 포함하는 바코딩된 pMHC 다량체를 보여준다. 도 23a에서 스위치 서열을 포함하는 공유적으로 결합된 올리고를 갖는 pMHC 다량체. 도 23b에서 스위치 서열을 포함하는 비-공유적으로 결합된 올리고를 갖는 pMHC 다량체. 이러한 유형의 pMHC 다량체에 대한 추가적인 디자인은 도 5 및 도 10에 설명된 것을 포함하지만 이에 국한되지 않는다.
도 24는 PCR 핸들, 세포 바코드 (BC) 및 TCR 불변 유전자 상보적 서열로 구성된 올리고에 결합된 방울-기반 시퀀싱 비즈 (하이드로 겔 비즈, 경질(hard) 비즈 또는 용해성 비즈를 포함하지만 이에 국한되지 않음)의 사용을 보여준다. 단순화를 위해, 하나의 방울만 표시된다. 각 비드는 TCRα및/또는 TCRβ 표적화 올리고 서열을 포함할 수 있다. TCRα 및 TCRβ 유형 올리고가 모두 사용된다면, 둘 다 주어진 비드에 대해 동일한 세포 바코드를 포함할 것이다. TCRα 및/또는 TCRβ 올리고는 광절단 결합 또는 이황화 결합을 포함하지만 이에 국한되지 않는 여러 수단 중 하나에 의해 해리될 수 있다. 또한, 각 올리고는 PCR 중복제거(deduplication)을 위한 UMI를 포함할 수 있다.
단일 비드 및 단일 세포 (이 경우 바코딩된 사량체 양성 T 세포가 표시됨)를 포함하는 단일 방울은 젤 비드 올리고, T 세포 mRNA 및 사량체-양성 T 세포-결합 바코딩 올리고를 모두 방출하는 용해 시약을 포함할 것이다. pMHC 사량체 결합 올리고는 또한 절단성 결합에 의해 해리되도록 만들어질 수 있다. 역전사는 비드 올리고의 3' 말단에서 3중의 데옥시시티딘(deoxycytidine) 스트레치를 사용하여 TCR mRNA 전사물로부터 TCR V(D)J 서열을 추가한다. (단순화를 위해 단일 역전사된 유전자만 방울 아래 표시됨). 이 데옥시시티딘 스트레치는 주형 전환을 위해 스위치 올리고에 결합한다. 후속의 2 차 가닥 합성 및 PCR 증폭은 라이브러리 준비를 완료한다.
본 개시는 단일 세포 또는 대량 세포 형광-활성화 세포 분류(FACS)뿐만 아니라 NGS-기반 애플리케이션과의 호환성, 다중 분석 및 단일 세포 분석을 포함한 기타 플랫폼을 포함하지만 이에 국한되지 않는 유세포 측정 애플리케이션과 호환되는 바코딩된 pMHC 다량체의 생성을 설명한다. 본 개시는 또한 공유 및 비공유 올리고 부착 모두를 통한 바코딩된 pMHC의 제조 및 pMHC-TCR 결합력 평가에서 이러한 다량체의 조합을 설명한다. 본 개시는 또한 TCR 서열 및 pMHC 다량체 바코드를 동시에 처리하여 시퀀싱 라이브러리 준비를 단순화하는 TCR α/β 불변 유전자를 표적으로 하는 새로운 pMHC 다량체 바코딩 접근법을 설명한다. 바코딩 올리고 길이 및/또는 서열은 고정되지 않으며 다양한 베이스 변형의 사용을 포함하여 다양할 수 있다.
본 개시는 pMHC 다량체, 일부 구현예에서 pMHC 사량체에 대한 적어도 두 개의 올리고 바코딩 전략을 설명한다. 첫 번째는 특정 pMHC를 TCR 서열을 포함하는 상응하는 T 세포 전사체와 연결하는 바코딩된 폴리-A 꼬리 올리고를 사용한다. 두번째 바코딩 접근 방식은 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자좌를 표적으로 하는 스트렙타비딘에 결합된 올리고를 사용하여, 올리고 모두 사량체 바코드를 보유한다. 중요한 것은, TCRα 및 TCRβ 올리고가 동시에 사용되는 경우, 주어진 사량체에 대한 동일한 사량체 바코딩 정보를 포함한다는 것이다. 이 접근 방식을 사용하면, 모든 역-전사된 TCR 서열은 별도의 라이브러리 준비가 필요하지 않은 사량체 바코드 시퀀스를 포함한다.
MHC 단백질
본 개시의 조성물 및 방법에서 제공되고 사용되는 MHC 단백질은 MHC 단백질이 원래 포함하는 펩타이드를 다른 펩타이드로 교환하는 것이 바람직한 당 업계에 공지된 임의의 적합한 MHC 분자일 수 있다. 일반적으로, 그것들은 공식 (α-β-P)n을 가지며, 여기서 n은 적어도 2, 예를 들면 2-10 사이, 예컨대 4이다. α는 클래스 I 또는 클래스 II MHC 단백질의 α 사슬이다. β는 β사슬이며, 여기서는 클래스 II MHC 단백질의 β사슬 또는 MHC 클래스 I 단백질에 대한 β2 마이크로 글로불린으로 정의된다. P는 펩타이드 항원이다.
MHC 단백질은 포유 동물 또는 조류 종, 예를 들면 영장류 종, 특히 인간; 생쥐(mice), 쥐(rats) 및 햄스터를 포함한 설치류; 토끼; 말, 소, 개, 고양이; 기타에서 유래될 수 있다. 예를 들어, MHC 단백질은 인간 HLA 단백질 또는 뮤린 H-2 단백질에서 유래될 수 있다. HLA 단백질은 클래스 II 서브유닛 HLA-DPα, HLA-DPβHLA-DQα, HLA-DQβ, HLA-DRα 및 HLA-DRβ 및 클래스 I 단백질 HLA-A, HLA-B, HLA-C, 및 β2-마이크로 글로불린을 포함한다. H-2 단백질은 클래스 I 서브유닛 H-2K, H-2D, H-2L 및 클래스 II 서브유닛 I-Aα, I-Aβ, I-Eα 및 I-Eβ 및 β2-마이크로 글로불린을 포함한다. 일부 대표적인 MHC 단백질의 서열은 Kabat 등. Sequences of Proteins of Immunological Interest, NIH 공개 번호 91-3242, pp724-815에서 찾을 수 있다. 본 발명에서 사용에 적합한 MHC 단백질 서브유닛은 예를 들어 막관통(transmembrane) 도메인 및 세포질 도메인의 결실에 의해 당 업계에 공지된 바와 같이 제조되는, 정상적으로 막-결합된 단백질의 가용성 형태이다.
클래스 I 단백질의 경우, 가용성 형태는 α1, α2 및 α3 도메인을 포함한다. 가용성 클래스 II 서브유닛은 α 서브유닛에 대한 α1 및 α2 도메인, 및 β 서브유닛에 대한 β1 및 β2 도메인을 포함한다.
α 및 β 서브유닛은 개별적으로 생산되고 안정한 이종 이중(heteroduplex) 복합체를 형성하기 위해 시험관 내(in vitro)에서 결합되도록 허용되건, 서브유닛 모두가 단일 세포에서 발현될 수 있다. MHC 서브유닛을 생산하는 방법은 당 업계에 공지되어있다.
MHC-펩타이드 복합체를 준비하기 위해, 서브 유닛은 항원성 펩타이드와 결합하고 시험관 내에서 접혀 사슬 내 이황화 결합 도메인과 함께 안정적인 이종이량체(heterodimer) 복합체를 형성할 수 있다. 펩타이드는 초기 폴딩 반응에 포함될 수 있거나, 이후 단계에서 빈(empty) 이종이량체에 추가될 수 있다. 본 발명의 방법에서, 이것은 퇴장(exiting) 펩타이드가 될 것이다. 폴딩을 허용하는 조건 및 서브유닛과 펩타이드의 결합은 당 업계에 공지되어 있다. 하나의 예시로서, 가용화된(solubilized) α 및 β 서브유닛의 대략 등몰량(equimolar)은 요소 용액에서 혼합될 수 있다. 리폴딩(refolding)은 요소없는 완충 용액으로 희석 또는 투석에 의해 시작된다. 펩타이드는 약 1 내지 3일 동안 약 pH 5 내지 5.5에서 빈(empty) 클래스 II 이종이량체에 로딩된 후, 중화, 농축 및 완충액 교환이 이어질 수 있다. 그러나, 특정 폴딩 조건은 본 발명의 실시에 중요하지 않다.
단량체 복합체 (α-β-P)(여기서는 단량체)는 다량체화될 수 있다. 결과물(resulting) 다량체는 오랜 기간 동안 안정적이다. 바람직하게는, 다량체는 당 업계에 공지된 바와 같이 (예, 미국 특허 번호 5,635,363에 기재된 바와 같이) α 또는 β 서브유닛의 특정 부착 부위를 통해 단량체를 다가 본체(multivalent entity)에 결합시킴으로써 형성될 수 있다. 단량체 또는 다량체 형태의 MHC 단백질은 비즈 또는 기타 지지체에 결합될 수도 있다.
종종, 다량체 복합체는 면역 염색 또는 당 업계에 공지된 다른 방법에서 사용될 때 직접적으로 검출될 수 있도록 표지되거나, 당 업계에 공지되고 본원에 기재된 바와 같이 복합체와 특이적으로 결합할 2차 표지된 면역 시약과 함께 사용될 것이다. 예를 들어, 표지는 플루오르세신 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate, FITC), 로다민(rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), 피코에리신(phycoerythrin, PE), 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC), 브릴리언트 바이올렛TM 421, 브릴리언트 UVTM 395, 브릴리언트 바이올렛TM 480, 브릴리언트 바이올렛TM 421 (BV421), 브릴리언트 블루TM 515, APC-R700 또는 APC-Fire750와 같은 형광단일 수 있다. 일부 구현예에서, 다량체 복합체는 다른 부분(moiety)과 특이적으로 결합할 수 있는 부분에 있해 표지된다. 예를 들어, 표지는 비오틴, 스트렙타비딘, 올리고 뉴클레오티드 또는 리간드일 수 있다. 관심있는 다른 표지는 염료, 효소, 화학발광제, 입자, 방사성 동위원소, 또는 다른 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 물질을 포함할 수 있다.
본원에 개시된 조성물은 임의의 적합한 MHC 단백질을 포함할 수 있다. 전형적인 MHC 단백질 및 여기에 개시된 펩타이드는 H-2 Kb 단량체, HLA-A*02:01 단량체, HLA-A*24:02 단량체, HLA-A*02:01 사량체, HLA-A*24:02사량체, 및 H-2 Kb 사량체를 포함한다. 그러나, 예를 들어, MHC 대립 유전자에 대한 펩타이드의 친화성을 예측하기 위한 공지된 기술에 따라, 임의의 MHC 대립 유전자는 적절한 퇴장(exiting) 펩타이드의 선택시 본원의 조성물 및 방법에 사용될 수 있다.
정의:
관사 "a" 및 "an"은 관사의 문법적 대상 중 하나 또는 하나 이상 (즉, 적어도 하나)을 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 예를 들어, "하나의 요소"는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.
용어 "아미노산"은 아미노산 작용기와 산 작용기를 모두 포함하고 자연-발생 아미노산의 중합체에 포함될 수 있는, 천연 또는 합성의 모든 분자를 포괄하는 것으로 의도된다. 전형적인 아미노산은 자연-발생 아미노산; 이들의 유사체, 유도체 및 동종체(congener); 변이 측쇄를 갖는 아미노산 유사체; 및 앞서 말한 임의의 것의 모든 입체 이성질체를 포함한다.
용어 "유래된"은 재배열되지 않은 가변 영역 및/또는 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 절편으로부터 "유래된" 재배열된 가변 영역 유전자와 관련하여 사용될 때, 재배열된 가변 영역 유전자의 서열을 다시 배열하여 가변 도메일을 발현하는 유전자를 형성하도록 재배열된 일련의 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 절편까지 추적하는 능력을 의미한다 (해당되는 경우 스플라이스 차이 및 체세포 돌연변이 고려). 예를 들어, 체세포 돌연변이를 겪은 재배열된 가변 영역 유전자는 여전히 재배열되지 않은 가변 영역 유전자 절편에서 유래된다. 일부 구현예에서, 내인성 유전자좌가 보편적 경쇄 또는 중쇄 유전자좌로 대체되는 경우, 용어 "유래된"은 서열이 체세포 돌연변이를 겪었더라도 서열의 근원을 상기 재배열된 유전자좌로 추적할 수 있는 능력을 나타낸다.
"PCR 핸들"은 본원에 설명된 바코드 영역의 PCR 증폭을 허용하는 모든 프라이머와 동일한 불변 서열을 의미한다.
용어 "바코딩된 영역"은 고유한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 영역을 의미한다. 이 뉴클레오티드 서열의 최소 길이는 고유하게 표지되어야하는 MHC 다량체의 총 수에 의존한다. 예를 들면, 4 개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열은 256 개의 상이한 서열을 가질 수 있으며, 이는 최대 256 개의 MHC 다량체를 고유하게 표지할 수 있다. 6 개 뉴클레오티드 길이의 뉴클레오티드 서열은 4096 개의 상이한 서열을 가질 수 있으며, 이는 최대 4096개의 MHC 다량체를 고유하게 표지할 수 있다. 더 긴 사량체 서열은 처리량 증가를 위해 사용될 수 있다.
용어 "상보성"은 2 개의 핵산 가닥의 영역 사이 또는 동일한 핵산 가닥의 2 개의 영역 사이의 서열 상보성의 광범위한 개념을 의미한다. 첫 번째 핵산 영역의 아데닌 잔기는 잔기가 티민 또는 우라실인 경우, 첫 번째 영역에 역평행한(antiparallel) 두 번째 핵산 영역의 잔기와 특정 수소 결합 ("염기 쌍")을 형성할 수 있는 것으로 알려져 있다. 유사하게, 첫 번째 핵산 가닥의 시토신 잔기는 잔기가 구아닌인 경우, 첫 번째 가닥에 역평행한 두 번째 핵산 가닥의 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있는 것으로 알려져 있다. 핵산의 첫 번째 영역은, 두 영역이 역평행 방식으로 배열될 때, 적어도 첫 번째 영역의 하나의 뉴클레오타이드 잔기가 두번째 영역의 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있는 경우, 동일하거나 다른 핵산의 두 번째 영역에 상보적이다. 바람직하게는, 첫 번째 영역은 제 1부분을 포함하고 두번째 영역은 제 2 부분을 포함하며, 이에 의해 제 1 및 제 2 부분이 역평행한 방식으로 배열될 때, 제1부분의 뉴클레오티드 잔기의 적어도 약 50%, 바람직하게는 적어도 75%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 95%는 제 2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다. 보다 바람직하게는, 제 1 부분의 모든 뉴클레오티드 잔기는 제 2 부분의 뉴클레오티드 잔기와 염기쌍을 이룰 수 있다.
구현예 1. 다량체 주조직 적합성 복합체(MHC)는 다음을 포함한다:
백본 분자에 의해 연결된 하나 이상의 MHC 분자; 및
백본 분자에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자로, 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역). 및 표적 올리고에 상보성을 나타내는 서열을 갖는 핵산의 두 번째 스트레치를 포함하는 핵산 분자.
구현예 2. 구현예 1의 다량체 MHC로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 5' PCR 핸들 영역, 중앙 바코드 영역 및 3' 폴리-A 꼬리 영역을 포함하고, 선택적으로 적어도 하나의 핵산 분자는 5' PCR 핸들 영역, 중앙 바코드 영역, 고유 분자 식별자 (UMI) 및 3' 폴리-A 꼬리 영역을 포함한다.
구현예 3. 구현예 1 또는 2의 다량체 MHC로서, 폴리-A 꼬리는 적어도 10개의 연속적인 아데닌을 포함한다.
구현예 4. 구현예 1-3의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 표적 올리고의 매칭 뉴클레오티드가 C, G 또는 A이면, 폴리-A 꼬리의 5' 말단 뉴클레오티드는 G, C 또는 T이다.
구현예 5. 구현예 1-4의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 적어도 10개의 뉴클레오티드이고, 선택적으로 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 10-200개의 뉴클레오티드이다.
구현예 6. 구현예 1-5의 어느 하나에 따른 다량체 MHC의 복수의 서브세트를 포함하는 조성물로서, 다량체 MHC의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
구현예 7. 특정 MHC 분자를 상응하는 T 세포 전사체와 연결하는 방법은 다음을 포함한다:
a) 구현예 1-5의 어느 하나에 따른 복수의 다량체 MHC 분자, T 세포 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 3'-폴리-(dT)를 포함하는 상보적 표적 올리고에 연결된 입자를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
b) 각 방울이 단 하나의 입자 그리고 하나 이상의 다량체 MHC 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
c) 각 방울에서 T 세포 cDNA 라이브러리 및 MHC 바코드 라이브러리를 생성하는 단계; 및
d) T 세포 mRNA 라이브러리와 MCH 바코드 라이브러리를 모두 시퀀싱하여, 특정 MHC 분자를 상응하는T 세포 전사체와 연결하는 단계.
구현예 8. 다량체 MHC는 다음을 포함한다:
백본 분자에 의해 연결된 하나 또는 하나 이상의 MHC 분자; 및
상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자로, 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역), 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자.
구현예 9. 구현예 8의 다량체 MHC는, 백본에 연결된 제 1형의 핵산 분자를 포함하고; 여기서 제 1형의 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCR α 또는 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 뉴틸레오디티드 서열을 포함한다.
구현예 10. 구현예 8의 다량체 MHC는, 백본에 연결된 제1형 및 제 2형의 핵산 분자를 포함하고, 여기서
제1형 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
제 2형 핵산분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
두 가지 유형의 핵산 분자의 바코드 영역은 동일한 서열을 갖고; 선택적으로 각 유형의 핵산 분자는 UMI를 추가로 포함하고, 제 1 형의 핵산 분자의 UMI 서열은 제 2 형의 핵산 분자의 UMI 서열과 상이하다.
구현예 11. 구현예 8-10의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예 12. 구현예 8-11의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 핵산 분자는 TCR 불변 유전자의 5' 말단에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
구현예 13. 구현예 8-12의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 TCR 불변 유전자는 TCRα 불변 유전자, TCRβ 불변 1 유전자, 또는 TCRβ 불변 2 유전자이다.
구현예 14. 구현예 8-13의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 5' 말단 및/또는 3' 말단 핵산 분자는 백본 분자와 연결된다.
구현예 15. 구현예 8-14의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 핵산 분자는 바코드 영역에 인접한 고유 식별 분자 (UMI)를 추가로 포함한다.
구현예 16. 구현예 8-14의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 여기서 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 적어도 10개의 뉴클레오티드이고, 선택적으로 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 10-200개의 뉴클레오티드이다.
구현예 17. 구현예 8-16의 어느 하나에 따른 복수의 다량체 MHC의 서브세트를 포함하는 조성물로서, 여기서 다량체 MHC의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
구현예 18. 특정 MHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ 서열에 연결하는 방법은 다음을 포함한다:
a) 구현예 8-16의 어느 하나에 따른 하나 이상의 다량체 주요 생체 결합성 복합체를 제공하는 단계;
b) 상기 다량체 MHC 분자를 T 세포와 접촉시키는 단계;
c) 다량체 MHC 분자에 결합하지 않은 세포로부터 다량체 MHC 분자에 결합된 T 세포를 분리하는 단계;
d) 분리된 T 세포를 용해하는 단계;
e) 각 DNA 분자가 TCRα 및/또는 TCRβ 유전자의 서열과 MHC 바코드를 포함하는 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
f) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여, 특정 MHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ 서열에 연결하는 단계.
구현예 19. 구현예 18의 방법으로서, 단계 c)는 FACS 분류(sorting) 또는 마그네틱 비드-기반 분리에 의해 달성된다.
구현예 20. 구현예 18 또는 19의 방법으로서, 다량체 MHC 분자는 직접 또는 간접적으로 형광 표지된다.
구현예 21. 구현예 18-20의 어느 하나의 방법으로서, 바코딩된 MHC 분자에 결합된 T 세포는 단일 수집 튜브에서 대량 분류된다.
구현예 22. 구현예 18-21의 어느 하나의 방법으로서, 바코딩된 MHC 분자와 결합된 동족 T 세포는 단일 세포로서 개별 플레이트 웰로 분류된다.
구현예 23. 다량체 MHC는 다음을 포함한다:
백본 분자에 의해 연결된 둘 이상의 MHC 분자; 및
상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자로서, 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역), 및 주형 스위치 올리고 서열을 포함하는 핵산 분자.
구현예 24. 구현예 23의 다량체 MHC로서, 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역, UMI 및 3' 주형 스위치 올리고 서열을 포함한다.
구현예 25. 구현예 23 또는 24의 다량체 MHC로서, 주형 스위치 올리고 서열은 3개의 리보구아노신의 3' 스트레치를 포함한다.
구현예 26. 구현예 23-25의 어느 하나의 다량체 MHC로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 적어도 10개의 뉴클레오티드이고, 선택적으로 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 10-200개의 뉴클레오티드이다.
구현예 27. 구현예 23-26의 어느 하나에 따른 복수의 다량체 MHC의 서브세트를 포함하는 조성물로서, 여기서 다량체 MHC의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는다.
구현예 28. 특정 MHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ 서열에 연결하는 방법은 다음을 포함한다:
a) 구현예 23-26의 어느 하나에 따른 복수의 다량체 MHC 분자, T 세포, 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고에 결합된 비즈를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
b) 각 방울(droplet)이 단 하나의 비드 그리고 하나 이상의 다량체 MHC 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
c) 각 DNA분자는 TCRα 및/또는 TCRβ유전자의 서열, 및MHC 바코드를 포함하는 것인, DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
d) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여, 특정 MHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 단계.
구현예 29. 구현예 28의 방법으로서, 비드는 하이드로겔 비드, 경질(hard) 비드 및 용해성 비드로부터 선택된다.
구현예 30. 구현예 28 또는 29의 방법으로서, 비드는 2개의 올리고에 결합되고, 여기서 첫 번째 올리고는5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 두 번째 올리고는 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 2개의 올리고에 대한 중앙 세포 바코드는 동일한 서열을 갖는다.
구현예 31. 구현예 28-30의 어느 하나의 방법으로서, DNA 라이브러리 제조 단계 c)는 MMLV 역전사 효소를 사용한 TCR mRNA 역전사를 포함한다.
구현예 32. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, PCR 핸들은 바코드 서열의 라이브러리 준비를 가능하게 한다.
구현예 33. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, PCR 핸들은 i7 어댑터 서열을 갖는다.
구현예 34. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 바코드 영역은 적어도 4개의 뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 35. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 바코드 영역은 6개의 뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 36. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 백본 분자는 다당류, 글루칸, 덱스트란, 스트렙타비딘, 및 스트렙타머 다량체로 이루어진 군에서 선택된다.
구현예 37. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, MHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해, MHC 중쇄를 통해, 또는 MHC 경쇄(b2M)를 통해 백본에 연결된다.
구현예 38. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, MHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해서 백본에 연결된다.
구현예 39. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 다량체 MHC는 적어도 4개의 MHC 분자를 포함한다.
구현예 40. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 화학적 변형을 추가로 포함한다.
구현예 41. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나 핵산의 5' 또는 3' 말단은 스페이서를 통해서 아미노기에 부착된다.
구현예 42. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 스페이서는 6개의 탄소 스페이서 또는 12개의 탄소 스페이서이다.
구현예 43. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 포스포로티오화된(phosphorothioated) 뉴클레오티드를 포함한다.
구현예 44. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산 분자와 백본 분자 사이의 연결은 핵산 분자의 유도성 해리를 허용한다.
구현예 45. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 이황화 브릿지를 통해서 백본 분자에 연결된다.
구현예 46. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 이황화 브릿지는 숙신이미딜-6-히드라지노-니코틴아마이드(succinimidyl-6-hydrazino-nicotinamide, S-HyNic) 변형된 백본 분자와 5'-아미노-변형된 숙신이디딜-4-포르밀벤자마이드 유사체(succinimidyl-4-formylbenzamide analog, S-SS-4FB) 변형 핵산 분자와 결합하여 형성된다.
구현예 47. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산분자는 광절단 결합을 통해 백본 분자에 연결된다.
구현예 48. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, MHC 분자는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 단량체이다.
구현예 49. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, MHC 분자는 펩타이드와 복합체가 형성된다.
구현예 50. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, MHC 분자는 비오티닐화 된다.
구현예 51. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 백본은 형광 표지, His-태그 및 금속-이온 태그로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 추가로 포함한다.
구현예 52. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 백본은 형광 표지와 직접적으로 결합된다.
구현예 53. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광 표지는 4FB로 변형되고 S-HyNic-변형된 백본과 결합된다.
구현예 54. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광 표지는 형광단-태그된 올리고이다.
구현예 55. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광단-태그된 올리고는 5'-아미노 또는 3'-아미노 변형을 가지고 추가로 4FB로 변형되고 S-HyNic-변형된 백본과 결합된다.
구현예 56. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광단-태그된 올리고는 백본에 연결된 핵산 분자에 상보적이다.
구현예 57. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광단-태그된 올리고는 길이가 10개의 뉴클레오티드이다.
구현예 58. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 백본은 형광단 표지된 항-스트렙타비딘 항체로 표지된다.
구현예 59. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 형광단은 형광 염료 또는 양자점이다.
구현예 60. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 적어도 하나의 핵산 분자는 DNA, RNA, 인공 뉴클레오티드, PNA 및 LNA로 이루어진 군에서 선택된 핵산 분자를 포함한다.
구현예 61. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 다량체 MHC는 동족 T 세포와 결합한다.
구현예 62. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 다량체 MHC는 유세포 분석 애플리케이션과 양립할 수 있다.
구현예 63. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 유세포 분석 애플리케이션은 단일 세포 또는 대량(bulk) 세포 형광-활성화 세포 분류(FACS)이다.
구현예 64. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, 다량체 MHC는 NGS-기반 애플리케이션과 양립할 수 있다.
구현예 65. 이전 구현예의 어느 하나의 다량체 MHC 또는 방법으로서, NGS-기반 애플리케이션은 방울-기반 단일 세포 시퀀싱이다.
구현예 66. 샘플에서 항원 반응성 세포를 검출하는 방법은 다음을 포함한다:
a) 구현예 1-5, 8- 16, 23-26 및 32-63의 어느 하나에 따른 하나 이상의 다량체 주조직 적합성 복합체를 제공하는 단계;
b) 상기 다량체 MHC 분자를 상기 샘플에 접촉시키는 단계; 및
c) 다량체 MHC 분자와 상기 항원 반응성 세포의 결합을 검출하여, MHC 분자에 존재하는 항원에 반응하는 세포를 검출하는 단계로, 여기서 상기 결합은 백본 분자를 통해 하나 이상의 MHC 분자에 연결된 상기 핵산 분자의 바코드 영역을 증폭함으로써 검출되는 단계.
구현예 67. 구현예 66의 방법으로서, 샘플은 혈액 샘플, 말초 혈액 샘플, 혈액 유래 샘플, 조직 샘플, 체액, 척수액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택된다.
구현예 68. 구현예 66 또는 67의 방법으로서, 샘플은 포유류로부터 수득된다.
구현예 69. 구현예 66-68의 어느 하나의 방법으로서, 방법은 유세포 분석, FACS, 마그네틱-비드 기반 선별, 크기-배제, 구배 원심 분리, 컬럼 부착 및 젤 여과로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의한 세포 선별을 추가로 포함한다.
구현예 70. 구현예 66-69의 어느 하나의 방법으로서, 증폭은 PCR이다.
구현예 71. 구현예 66-70의 어느 하나의 방법으로서, 핵산 분자의 바코드 영역 검출은 바코드 영역의 시퀀싱 또는 qPCR에 의한 바코드 영역 검출을 포함한다.
실시예:
현재 일반적으로 설명되고 있는 발명은, 본 발명의 특정 측면 및 구현예의 예시 목적으로만 포함되는 다음의 실시예를 참조하여 보다 쉽게 이해될 것이고, 이는 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 바코딩된 pMHC 다량체 종의 구축 및 실험적 검증
다음은 임의의 서열로 이루어진 올리고의 공유 및 비공유 결합을 설명한다. 공유 결합을 위해, 올리고 (예. 도 1)는 티오에테르 결합의 형성을 통해 스트렙타비딘에 결합되지만, 다른 화학 및 결합 형성이 이용될 수 있다. 이 특정 예에서, 공유 결합은 올리고 및 스트렙타비딘 모두를 공통의 이종이작용성(heterobifunctional) 링커에 연결하여 스트렙타비딘-올리고 결합체를 생성한다 (도 5). 스트렙타비딘에 비-공유적으로 결합된 올리고는 최적의 비율로 비오티닐화된 올리고를 스트렙타비딘과 혼합하고 원하는 스트렙타비딘-올리고 결합체 종의 HPLC 정제에 의해 달성될 수 있다 (도 5 및 도 9). 공유 및 비-공유 유래 스트렙타비딘-올리고 결합체 종은 후속적으로 pMHC 다량체화에 적용될 수 있다 (도 5). 이러한 pMHC 다량체 종은 pMHC-TCR 결합력 연구를 위해 상이한 조합으로 사용될 수 있다 (도 11에 기재된 바와 같음). 또한, 단일 서브 타입의 pMHC 다량체 (예. pMHC 삼량체만)는 표적 pMHC-TCR 결합력이 충분히 높아서 스트렙타비딘 당 3 및 4 개의 단량체 사이의 차이가 TCR 검출에 영향을 미치지 않는 것으로 알려진 경우라면, 대량 또는 단일 세포 시퀀싱 플랫폼에서 단독으로 사용될 수 있다. 비-공유적으로 파생된 스트렙타비딘-올리고 결합체를 사용하는 것의 장점은 화학적 결합을 중단하고 스트렙타비딘 당 단량체를 적게 사용하는 비용 절감에 있다.
또 다른 예시로서, 보충 S-SS-4FB와 함께 Solulink 단백질-올리고뉴클레오티드 결합 키트가 사용될 수 있다. 스트렙타비딘은 S-HyNic으로 처음 변형되었다. 5'-아미노 변형 올리고는 S-SS-4FB로 변형되었다. 그 다음 변형된 올리고 및 변형된 스트렙타비딘은 결합되어 직접 바코딩된 스트렙타비딘을 생성하였다 (도 2). 대안적 결합 화학 접근법 및 재료 공급자는 바코딩 올리고를 단백질에 결합하고, 광절단성 연결을 포함하지만 이에 국한되지 않는 유도성 바코딩 올리고 해리를 허용하는데 사용될 수 있다. 실험은, 환원 조건 하에서 일시적으로 스트렙타비딘으로부터 올리고를 해리시키는 능력 (도 3)뿐만 아니라, 비오틴에 결합하는 바코딩된 스트렙타비딘의 능력(도 4)을 검증했다.
실시예 2: 바코딩된 사량체의 형광단 기반 추적
바코딩된 사량체는 단일 세포 및 대량 세포 분류 애플리케이션에 사용하기 위해 다양한 형광단 태깅 전략(도 6a-6c)과 조합될 수 있다.
실시예 3: 바코딩된 사량체를 표적으로 하는 TCR
바코딩된 pMHC 다량체는 설명된 동일한 결합 화학을 사용하여 TCRα 및/또는 TCRβ 불변 유전자 (도 17)를 표적화하도록 제조될 수 있다. 본 개시는 TCR 서열을 얻고 pMHC 정보를 매칭시키는데 관심이 있는 과학자에게 도움이 된다. 이 방법의 가장 큰 장점은 역-전사된 TCRα 및/또는 TCRβ 서열 모두가 pMHC 다량체 바코드를 포함하고 있기 때문에 하나의 라이브러리 준비만 필요하다는 것이다. 따라서, 단일 시퀀싱 판독은 TCR 서열과 pMHC 동일성 정보를 모두 포함한다. 이는 폴리-A-꼬리 또는 다른 캡쳐 서열-기반 라이브러리 준비 방법과 대조적으로, 더 작은 pMHC 바코드/항체 바코드 라이브러리는 별도로 처리되고 나중에 시퀀싱 시기에 mRNA-파생 라이브러리와 함께 결합된다. 본 개시에 설명된 TCR 표적화된 사량체는 단일 또는 대량 세포 분류에 사용하기 위해 형광단 검출과 조합될 수 있다 (도 6a-6c). 단일 세포 분류는 TCR 클론성 연구(도 18-20)뿐만 아니라, TCRα 및 TCRβ 쌍을 이룬 서열을 분류된 세포의 기원에 잠재적으로 연결할 수 있게 한다 (도 18, 21, 22).
실시예 4: 맞춤형 TCR 방울-기반 시퀀싱
다른 구현예에서, 바코딩된 pMHC 다량체는 pMHC 다량체-결합된 올리고가 pMHC 다량체 바코드 서열 및 PCR 핸들 서열과 함께 주형 스위치 서열을 포함하도록 제조될 수 있다 (도 23). 이것의 핵심은 스위치 올리고 서열이 MMLV 역전사 효소에 의해 추가된 데옥시시티딘(deoxycytidines)에 결합하기위해 3' 리보구아노신의 3' 스트레치를 포함한다는 것이다. 이 시나리오에서, 방울-기반 비즈 (하이드로겔 비즈, 경질 비즈 또는 용해성 비즈를 포함하지만 이에 국한되지 않음)는 전형적인 세포 바코드 및 PCR 핸들 서열을 사용하여 TCRα 및/또는 TCRβ 불변 유전자 상보적 올리고에 맞춤 결합될 것이다. UMI는 PCR 중복 제거를 위해 임의의 올리고 서열에 포함될 수 있다. TCRα 및 TCRβ 표적 올리고를 가진 비즈는 주어진 비드에 대해 동일한 바코드를 포함한다. 비드 및 pMHC 다량체 양성 T 세포를 모두 포함하는 단일 방울 내에서, MMLV 역전사 효소를 사용한 역전사는 TCR mRNA로부터 V(D)J 서열을 갖는 비드-기반 올리고를 확장할 뿐만 아니라, pMHC 다량체 바코드 및 PCR 핸들을 보유하는 주형 스위칭 올리고 서열을 포함한다. 후속 2차 가닥 합성 및 PCR 증폭은 시퀀싱을 위한 라이브러리 준비를 완료한다. 비드 올리고 및 pMHC 다량체 바코딩/주형 스위칭 올리고에 대한 올리고 서열, 길이 및 변형 (잠금 핵산(locked nucleic acid) 염기의 사용을 포함하지만 이에 국한되지 않음)은 변경될 수 있다. 이 구현예는 다른 역전사 효소 유도체와 양립될 수 있다. 이 시스템은 몇 가지 주요 이점을 갖는다. 하나는 TCR 서열과 pMHC 바코드 서열만 얻어져, 전체 전사체를 시퀀싱할 필요가 없다는 것이다. 또 다른 장점은 사량체 바코드 서열과 TCR 서열이 모두 동일한 전사체에 있기 때문에 단 하나의 라이브러리 준비만 필요하다는 것이다. 또 다른 장점은 TCRα 및 TCRβ 비드 올리고가 모두 사용되면, 각 방울 내 고유한 세포 바코드 서열 때문에 둘 다 자동으로 페어링된다는 것이다. 마지막으로, pMHC 다량체 양성 T세포만이 2개의 PCR 핸들 중 하나를 포함하는 주형 스위치/pMHC 다량체 바코딩된 올리고를 포함하기 때문에, pMHC 다량체 양성 T 세포만이 시퀀싱 라이브러리에 기여한다.
참고문헌에 의한 통합
본원에 언급된 모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 각각의 개별 간행물, 특허 또는 특허 출원이 참고문헌으로 포함되도록 구체적이고 개별적으로 표시된 것처럼, 전체적으로 참조문헌에 통합된다. 상충되는 경우, 여기에 정의된 정의를 포함하여, 본 출원이 우선한다.
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2. Stoeckius, M., et al., Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods, 2017. 14(9): p. 865-868.
3. Peterson, V.M., et al., Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nat Biotechnol, 2017. 35(10): p. 936-939.
4. Zhang, S.Q., et al., High-throughput determination of the antigen specificities of T cell receptors in single cells. Nat Biotechnol, 2018.
5. Dahotre, S.N., et al., DNA-Barcoded pMHC Tetramers for Detection of Single Antigen-Specific T Cells by Digital PCR. Anal Chem, 2019. 91(4): p. 2695-2700.
6. Altman, J.D. and M.M. Davis, MHC-Peptide Tetramers to Visualize Antigen-Specific T Cells. Curr Protoc Immunol, 2016. 115: p. 17 3 1-17 3 44.
7. Krogsgaard, M. AAI 2019, Abstract 194.58.
8. Krummey, S.M., et al., Low-Affinity Memory CD8+ T Cells Mediate Robust Heterologous Immunity. J Immunol, 2016. 196(6): p. 2838-46.
9. Zhou, Z.X., et al., Mapping genomic hotspots of DNA damage by a single-strand-DNA-compatible and strand-specific ChIP-seq method. Genome Res, 2013. 23(4): p. 705-15.
균등물
통상의 기술자는 통상적인 실험만을 사용하여 본원에 설명된 본 발명에 포함된 특정 구현예에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 균등물은 다음의 청구범위에 포함되도록 의도된다.

Claims (76)

  1. 적어도 하나의 조정 가능한 pMHC 본체 (entity)를 포함하는 펩타이드-주조직 적합성 복합체 (pMHC) 바코딩된 다량체로서, 상기 pMHC 본체는 다음을 포함하는 것인 펩타이드-주조직 적합성 복합체 (pMHC) 바코딩된 다량체:
    백본 분자에 의해 연결된 적어도 하나의 pMHC 분자: 및
    공유 또는 비-공유 결합된 결합체를 포함하는, 백본 분자당 적어도 하나의 핵산 분자.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 핵산 분자는 다음을 포함하는, pMHC 다량체:
    pMHC 바코딩 뉴클레오티드의 중앙 스트레치 및
    표적 올리고에 상보성을 갖는 뉴클레오티드의 두 번째 스트레치.
  3. 청구항 2에 있어서, NGS에서 사용하기 위한 것인, pMHC 다량체.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 백본 분자는 스트렙타비딘인, pMHC 다량체.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체는 백본 분자당 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개 또는 적어도 4개의 pMHC 본체를 포함하는, pMHC 다량체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, T 세포 수용체 (TCR)-pMHC 결합력을 모니터링하는데 사용하기 위한 것인, pMHC 다량체.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 공유 결합되어, 스트렙타비딘 당 적어도 4개의 MHC 단량체를 제공하는 것인, pMHC 다량체.
  8. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 비-공유적으로 결합되고, 상기 핵산 분자는 비오티닐화되고, 적어도 하나의 비오티닐화된 핵산 분자 및 스트렙타비딘은 비율로 복합체화되며, 상기 비율은 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, pMHC 다량체:
    1 스트렙타비딘: 1 올리고,
    1 스트렙타비딘: 2 올리고, 및
    1 스트렙타비딘: 3 올리고.
  9. 청구항 1에 있어서, pMHC 다량체는 HPLC 정제 공정에 의해 제조되는 것인, pMHC 다량체.
  10. 청구항 1 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스트렙타비딘은 적어도 하나의 핵산 분자에 공유 결합되고, 상기 핵산 분자는 바코드 및 적어도 하나의 비오틴 결합 부위를 포함하며, 상기 결합 부위는 비오티닐화된 펩타이드, 비오티닐화된 단백질, 비오티닐화된 중합체, 비오티닐화된 형광단, 비오티닐화된 절단성 올리고 또는 비오티닐화된 제제를 포함하는 것인, pMHC 다량체.
  11. 청구항 1 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 5' PCR 핸들 영역, 중앙 바코드 영역, 선택적으로 UMI, 또는 선택적으로 적어도 10개의 연속 아데닌의 3' 폴리-A 꼬리 영역으로 구성되는 것인, pMHC 다량체.
  12. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 3' 말단 꼬리는 표적 올리고 서열에 상보적인 임의의 서열로 구성되는 것인, pMHC 다량체.
  13. 청구항 1 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개 뉴클레오티드 또는 그 이상인 것인, pMHC 다량체.
  14. 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 복수의 pMHC 다량체의 서브세트를 포함하는 조성물로서, pMHC 다량체의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는 것인, 조성물.
  15. 다음을 포함하는, 특정 MHC 분자를, 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 방법:
    a) 청구항 1 내지 13 중 어느 하나에 따른 pMHC 다량체 분자, T 세포, 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 미끼서열을 포함하는 결합 표적 올리고에 연결된 입자를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
    b) 각 방울이 단 하나의 입자 그리고 하나 이상의 pMHC 다량체 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
    c) 각 방울에서 T 세포 cDNA 라이브러리 및 pMHC 바코드 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    d) T 세포 mRNA 라이브러리와 MCH 바코드 라이브러리를 모두 시퀀싱하여, 특정 MHC 분자를 상응하는T 세포 전사체와 연결하는 단계.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 미끼 서열은 3' 폴리-(dT)인, 방법.
  17. 다음을 포함하는 다량체 pMHC:
    백본 분자에 의해 연결된 둘 이상의 MHC 분자; 및
    상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자로, 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역), 및 주형 스위치 올리고 서열을 포함하는 핵산 분자.
  18. 청구항 17에 있어서, 백본에 연결된 제 1형 핵산 분자를 포함하고; 상기 제 1형의 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRα 또는 TCRβ 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 다량체 pMHC.
  19. 청구항 17에 있어서, 백본에 연결된 제 1및 제 2형의 핵산 분자를 포함하고; 여기서
    상기 제 1형 핵산분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고,
    제 2형 핵산 분자는 중앙 바코드 영역 및 TCRβ불변 유전자에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하고;
    두 종류의 핵산 분자의 바코드 영역은 동일한 서열을 가지고;
    선택적으로 두 종류의 핵산 분자 각각에 대한 UMI 서열은 무작위적이며 따라서 각각의 핵산의 동일한 영역에 위치하더라도 서로 상이한 것인, 다량체 pMHC.
  20. 청구항 17 내지 19 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역, UMI 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 다량체 pMHC.
  21. 청구항 17 내지 20 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 TCR 불변 유전자의 5' 말단에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것인, 다량체 pMHC.
  22. 청구항 17 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TCR 불변 유전자는 TCRα 불변 유전자, TCRβ불변 1 유전자 또는 TCRβ불변 2 유전자인, 다량체 MHC.
  23. 청구항 17 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5' 말단 및/또는 3' 말단 핵산 분자는 백본 분자에 연결되는 것인, 다량체 MHC.
  24. 청구항 17 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 바코드 영역에 인접한 고유 분자 식별자 (UMI)를 추가로 포함하는 것인, 다량체 MHC.
  25. 청구항 17 내지 24 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개의 뉴클레오티드 또는 그 이상인 것인, 다량체 MHC.
  26. 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 따른 복수의 다량체 pMHC 서브세트를 포함하고, 상기 다량체 MHC의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는 것인, 조성물.
  27. 다음을 포함하는, 특정 MHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 방법:
    a) 청구항 17 내지 25 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 다량체 pMHC를 제공하는 단계;
    b) 상기 다량체 MHC 분자를 T 세포와 접촉시키는 단계;
    c) 다량체 MHC 분자에 결합하지 않은 세포로부터 다량체 MHC 분자에 결합된 T 세포를 분리하는 단계;
    d) 분리된 T 세포를 용해하는 단계;
    e) 각 DNA 분자가 TCRα 및/또는 TCRβ유전자의 서열과 pMHC 바코드를 포함하는 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    f) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여, 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 단계.
  28. 청구항 27에 있어서, 상기 단계 c)는 FACS 분류(sorting) 또는 마그네틱 비드-기반 분리에 의해 달성되는 것인, 방법.
  29. 청구항 27 또는 28에 있어서, 상기 다량체 pMHC 분자는 직접 또는 간접적으로 형광 표지되는 것인, 방법.
  30. 청구항 27 내지 29 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코딩된 pMHC 분자에 결합된 T 세포는 단일 수집 튜브에서 대량 분류되는 것인, 방법.
  31. 청구항 27 내지 30 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바코딩된 pMHC 분자와 결합된 동족 T 세포는 단일 세포로서 개별 플레이트 웰로 분류되는 것인, 방법.
  32. 다음을 포함하는 다량체 pMHC:
    백본 분자에 의해 연결된 하나 이상의 pMHC 분자; 및
    상기 백본에 연결된 적어도 하나의 핵산 분자로, 증폭되도록 설계된 핵산의 중앙 스트레치 (바코드 영역), 및 주형 스위치 올리고 서열을 포함하는 핵산 분자.
  33. 청구항 32에 있어서, 상기 핵산 분자는 5' PCR 핸들, 중앙 바코드 영역, UMI 및 3' 주형 스위치 올리고 서열을 포함하는 것인, 다량체 pMHC.
  34. 청구항 32 또는 33에 있어서, 상기 주형 스위치 올리고 서열은 3개의 리보구아노신의 3' 스트레치를 포함하는 것인, 다량체 pMHC.
  35. 청구항 32 내지 34 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 길이가 약 10 - 200 개 뉴클레오티드이거나 더 긴 것인, 다량체 pMHC.
  36. 청구항 32 내지 35 중 어느 한 항에 따른 복수의 다량체 pMHC 서브세트를 포함하고, 상기 다량체 pMHC의 각 서브세트는 상이한 펩타이드에 결합하고 상응하는 바코드 영역 서열을 갖는 것인, 조성물.
  37. 다음을 포함하는, 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 방법:
    a) 청구항 32 내지 35 중 어느 하나에 따른 복수의 pMHC 다량체 분자, T 세포 및 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCR 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하는 올리고에 결합된 비즈를 포함하는 테스트 샘플을 형성하는 단계;
    b) 각 방울이 단 하나의 비드 그리고 하나 이상의 다량체 MHC 분자에 결합된 하나의 T 세포를 포함하도록 테스트 샘플로부터 방울을 형성하는 단계;
    c) 각 DNA 분자가 TCRα 및/또는 TCRβ유전자의 서열과 pMHC 바코드를 포함하는 DNA 라이브러리를 생성하는 단계; 및
    d) DNA 라이브러리를 시퀀싱하여, 특정 pMHC 분자를 상응하는 TCRα 및/또는 TCRβ서열에 연결하는 단계.
  38. 청구항 37에 있어서, 상기 비드는 하이드로겔 비드, 경질 비드 및 용해성 비드로부터 선택되는 것인, 방법.
  39. 청구항 37 또는 38에 있어서, 상기 비드는 2 개의 올리고에 결합되고, 상기 첫 번째 올리고는 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRα 불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 두 번째 올리고는 5' PCR 핸들, 중앙 세포 바코드, UMI 및 TCRβ불변 유전자에 상보적인 3' 뉴클레오티드 서열을 포함하고; 2개의 올리고에 대한 중앙 세포 바코드는 동일한 서열을 갖는 것인, 방법.
  40. 청구항 37 내지 39의 어느 한 항에 있어서, 상기 DNA 라이브러리 제조 단계 c)는 MMLV 역전사 효소를 사용한 TCR mRNA 역전사를 포함하는 것인, 방법.
  41. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 PCR 핸들은 바코드 서열의 라이브러리 제조를 가능하게 하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  42. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기PCR 핸들은 i7 어댑터 서열을 갖는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  43. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 바코드 영역은 적어도 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  44. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 pMHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해, MHC 중쇄를 통해, 또는 MHC 경쇄(b2M)를 통해 백본에 연결되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  45. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 분자는 스트렙타비딘-비오틴 결합을 통해서 백본에 연결되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  46. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체 pMHC는 적어도 하나의 MHC 분자를 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  47. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 화학적 변형을 추가로 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  48. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나 핵산의 5' 또는 3' 말단은 스페이서를 통해서 아미노기에 부착되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  49. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서는 6-탄소 스페이서 또는 12-탄소 스페이서인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  50. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 5' 말단 및/또는 3' 말단에 포스포로티오화된 뉴클레오티드를 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  51. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자와 백본 분자 사이의 연결은 핵산 분자의 유도성 해리를 허용하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  52. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 공유 또는 비-공유 결합을 통해 백본 분자에 연결되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  53. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 공유 결합은 티오에테르인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  54. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 유도성 절단성 결합을 통해 백본 분자에 연결되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  55. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 유도성 절단성 결합은 광절단성이거나, 이황화 결합을 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  56. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 분자는 MHC 클래스 I 및/또는 MHC 클래스 II 단량체인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  57. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 분자는 펩타이드와 복합체가 형성되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  58. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 MHC 분자는 비오티닐화된 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  59. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 백본은 형광 표지, His-태그 및 금속-이온 태그로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 표지를 추가로 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  60. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 백본은 형광 표지와 직접적으로 결합되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  61. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형광 표지는 형광단-태그된 올리고인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  62. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단-태그된 올리고는 백본에 연결된 핵산 분자에 상보적인 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  63. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 백본은 형광단 표지된 항-스트렙타비딘 항체로 표지되는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  64. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 형광단은 형광 단백질, 형광 염료 또는 양자점인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  65. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 핵산 분자는 DNA, RNA, 인공 뉴클레오티드, PNA 및 LNA로 이루어진 군에서 선택된 핵산 분자를 포함하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  66. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체 pMHC는 동족 T 세포와 결합하는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  67. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체 pMHC는 유세포 분석 애플리케이션과 양립할 수 있는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  68. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 유세포 분석 애플리케이션은 단일 세포 또는 대량 세포 형광-활성화 세포 분류(FACS)인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  69. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 다량체 pMHC는 NGS-기반 애플리케이션과 양립할 수 있는 것인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  70. 이전 청구항의 어느 한 항에 있어서, 상기 NGS-기반 애플리케이션은 방울-기반 단일 세포 시퀀싱인, 다량체 pMHC 또는 방법.
  71. 다음을 포함하는, 샘플에서 항원 반응성 세포를 검출하는 방법:
    a) 청구항 1 내지 13 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 다량체 pMHC를 제공하는 단계;
    b) 상기 다량체 pMHC 분자를 상기 샘플에 접촉시키는 단계; 및
    c) 다량체 pMHC 분자와 상기 항원 반응성 세포의 결합을 검출하여, MHC 분자에 존재하는 항원에 반응하는 세포를 검출하는 단계로, 여기서 상기 결합은 백본 분자를 통해 하나 이상의 MHC 분자에 연결된 상기 핵산 분자의 바코드 영역을 증폭함으로써 검출되는 것인 단계.
  72. 청구항 71에 있어서, 상기 샘플은 혈액 샘플, 말초 혈액 샘플, 혈액 유래 샘플, 조직 샘플, 체액, 척수액 및 타액으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  73. 청구항 71 또는 72에 있어서, 상기 샘플은 포유류로부터 수득되는 것인, 방법.
  74. 청구항 1 내지 73 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유세포 분석, FACS, 마그네틱-비드 기반 선별, 크기-배제, 구배 원심 분리, 컬럼 부착 및 젤 여과로 이루어진 군에서 선택된 방법에 의한 세포 선별을 추가로 포함하는 것인, 방법.
  75. 청구항 1 내지 74 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 PCR인, 방법.
  76. 청구항 1 내지 75 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산 분자의 바코드 영역 검출은 바코드 영역의 시퀀싱 또는 qPCR에 의한 바코드 영역의 검출을 포함하는 것인, 방법.
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