KR20210125435A

KR20210125435A - 엘라이자 부스팅 검사법을 이용한 소 결핵병 잠복 감염우의 검출방법

Info

Publication number: KR20210125435A
Application number: KR1020210045164A
Authority: KR
Inventors: 박찬호; 윤병일; 박선일
Original assignee: 강원대학교산학협력단; 강원도
Priority date: 2020-04-08
Filing date: 2021-04-07
Publication date: 2021-10-18
Also published as: KR102368216B1

Abstract

본 발명은 현재 소 결핵병검진에 공인되어 사용되고 있는 세포성면역방법인 튜버큐린피내주사반응법 및 감마인터페론법에서 검출되지 않는 결핵잠복결핵 감염우에 대하여 엘라이자 부스팅검사법을 적용하여 결핵양성우를 검출방법을 제공하고자 한다. 상기 방법에서는 튜버큐린피내주사반응법에 사용되는 PPD진단액의 피내접종 전후로 엘라이자 검사결과(OD, SP값)를 부스팅한다는 점을 이용한다. 본 발명의 엘라이자부스팅검사법은 튜버큐린피내주사반응법(PPD 접종)전후의 엘라이자 항체가 S/P(%)값을 기반으로 결핵균 감염 여부를 검출하는 방법으로 결핵균이 감염된 "소 결핵발생농가"에서 잠복 결핵균을 박멸시킬 수 있는 검출방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

엘라이자 부스팅 검사법을 이용한 소 결핵병 잠복 감염우의 검출방법{Process for detecting latent infected cow with bovine tuberculosis using ELISA boosting method}

본 발명은 소 결핵병 잠복 감염우의 검출방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 결핵양성축개체에 대한 튜버큐린피내주사반응법에 사용되는 결핵진단액(PPD-T) 피내접종이 엘라이자항체 검사결과(흡광도OD, 및 양성대비 샘플측정값 S/P값)의 측정값 부스팅한다는 점을 이용하여 세포성면역방법으로 검출불가능한 결핵병에 감염후기 혹은 면역저하(Anergy)된 "소결핵병 잠복결핵양성우"를 색출할 수 있는 검출방법에 관한 것이다.

소 결핵병은 소결핵균(Mycobacterium bovis)에 의해 전염되는 인수공통전염병으로 국내에서는 제2종 가축전염병으로 지정되어 있다. 소 결핵병은 문헌적으로는 중증시 발열, 쇠약, 여윔, 림프절 종대, 빈혈, 비유량 저하등 임상증상을 보인다고하나, 실제로 결핵검진시 대부분 무증상으로 진행되어, 소 결핵병 검사에 의한 확진이 반드시 필요한 질병으로 알려져 있다. 오랜 기간 퇴치되지 않은 만성 소모성 질환으로, 심한 경제적 손실을 초래하지만 결핵검사에 막대한 예산을 투입하는데도 불구하고 전세계적으로 쉽게 박멸이 되지 않고 있는 실정이다.

국내에서 도축장에서의 소 결핵병 색출방법은 도축 검사자가 육안으로 '출하축 생ㆍ해체검사' 시 결핵의심병변에 대한 시료를 채취한 후 이 시료의 PCR 정밀검사를 통해 '결핵병 양성축' 을 확인하고 있다.

반면에 농장에서의 소 결핵병 검사방법은 전세계적으로 2가지의 세포성 면역검사법을 사용하고 있는데, 첫 번째로 1890년대 독일의 Robert Koch에 의해 개발된 old tuberculin (OT)을 응용한 소 미근부 추벽의 피내에 튜버큐린 피내검사용 피피디(purified protein derivative, PPD)진단액을 접종하는 '튜버큐린피내주사반응법'이 1970년대 이후부터 계속 사용되고 있다. 또한 2013년부터는 영국, 호주등 축산선진국에서 사용되고 있고 민감도 및 특이도가 우수한 세포성 면역방법인 '감마인터페론(γ-INF)법'을 도입하여 현재까지 검사방법으로 사용하고 있다.

상기 튜버큐린피내주사반응법은 지연형과민반응을 이용한 세포성면역진단법으로서 결핵균의 배양산물인 PPD(purified protein derivative) 결핵진단액(PPD-T)을 민감도가 높은 소의 미근부추벽에 피내접종하여, 그 개체가 이미 결핵균에 감염되었다면 항원인 PPD를 제거하기 위하여 면역세포들이 모이게 되고, 이에 따라 미근부의 접종 부위에 결절이 형성되는 것으로 감염축을 확인하는 방법이다. 단점으로는, 세포성면역반응이 감염 초ㆍ중기에 높은 검출률을 보여 결핵병감염 후기에는 검출률이 떨어지고(도 1 참조), 결핵유사세균(Johne's disease, paratuberculosis, 요네병)과 같은 비특이적 반응에 의한 위양성 반응과 면역억제성 질병과 동시감염시 위 음성 반응이 나타날 수 있다고 알려져있다.

상기 감마인터페론검사법은 동물에서 채혈한 전혈에 PPD 항원을 첨가하면 항원특이적 기억세포(T cell)를 빠르게 재자극하여 싸이토카인의 일종인 인터페론 감마를 분비하게 되는데, 이 인터페론 감마가 항원에 의해 유도된 세포성반응의 특이적 마커로 이용되며, 이를 측정하는 방법이다. 단점으로는, 감마인터페론법도 결핵병 감염 후기에는 검출률이 떨어지고 면역억제성 질병과 동시 감염시 위음성 반응을 일으킬 수 있다. 또한, 소를 현장에서 채혈 후 개체별로 반드시 헤파린 항응고제 처리된 튜브에 최소 5 ml 이상의 전혈(wohle blood)을 채혈하고, 실온(22±3℃)을 유지하여 실험실로 수송하여 16~24시간 정도의 배양시간이 필요하다.

위와 같은 단점을 보완하기위하여, 국내에서는 2009년부터 2013년까지 양성검출률을 높이기 위하여 결핵 감염 후기에 검출률이 높다고 알려진 체액성 면역방법인 '엘라이자검사법(바이오노트사 BTB 2.O, 중앙백신연구소 ProCheck)을 사용하였다. 검사소를 채혈 후 엘라이자검사하여 양성개체로 확인되면 2차로 '튜버큐린피내주사반응법'으로 확인하여 동시에 중복양성이 나올 경우 양성축으로 확인하였다. 그러나 엘라이자(ELISA)검사법은 단독 적용시에는 민감도가 너무 높고, 기존 사용중인 튜버큐린피내주사반응법과 동시에 비교시 일치율이 낮아서 폐지된 후 현재의 감마인터페론법으로 교체되었다.

현재 전 세계적으로 소 결핵검진에 사용되고 있는 세포성면역방법인 튜버큐린피내주사반응법 또는 감마인터페론법을 적용시 2가지 진단법에서 음성 결과가 나왔지만, 수년 후 도축장 출하시 결핵 양성축으로 확인되어 '잠복 감염우(latent infection cow)'로서 농장 내에 결핵감염을 진행시킬 위험성을 갖고 있다. 더욱더 주목해야 할 점은 세포성면역을 이용한 진단법은 소 사육농장에서 항염증제 사용, 분만, 젖소농가에서 흔히 발생되는 소백혈병(Leucosis), 소바이러스성설사(bovine viral diarrhea, BVD) 면역억제성질병등이 결핵과 동시 감염시 세포성면역저하(Anergy)로 인한 위음성을 일으킬 수 있어 검출에 한계를 보일수 있다.

현재처럼 결핵발생농가에서 세포성면역검사법으로만 진단검사 시 감염 후기이거나 세포성면역 저하된 결핵병 양성축이 검출되지 않는다면, 적합한 시기에 결핵발생농장에 '소 결핵병 잠복 감염우'가 검출되지 않고 잔존하여 결핵의 전파 요인이 되며 질병의 박멸에 한계를 보일 수 있다.

대한민국 특허공개공보 10-2017-0115211

본 발명의 발명자들은 소 결핵 발생 농가 및 결핵 감염우를 대상으로 2013년 12월부터 2016년 12월까지 약 3년간 튜버큐린피내주사반응법(Tuberculin test), 감마인터페론법(γ-INF), 엘라이자법의 상관관계와 일치율을 연구하여, 서로간의 상관관계뿐만 아니라 엘라이자법에서만 양성으로 확인된 개체에서 부검 시료 정밀검사를 통해 소결핵 양성축을 확인할 수 있었으며, 결핵 양성축(PPD, γ-INF 양성축)의 경우 PPD 접종 후 7일 전후에 개체에 따라 엘라이자법 결과값(OD, S/P(%)값) 수치가 증가한다는 사실을 발견하였다.

이에, 본 발명은 튜버큐린피내주사반응법 및 감마인터페론법등 기존의 세포성면역방법에서 검출해 내지 못하는 잠복 결핵 양성우를 검출하기 위하여, 종래에 튜버큐린피내주사반응법과의 일치율이 떨어진다는 이유로 확인 검사 항목에서 폐지된 엘라이자법의 개선 방안을 밝히고, '엘라이자 부스팅 검사법'을 제시하여 현재 검출할수 없는 결핵 잠복 감염우를 검출하여 인수공통 전염병인 소 결핵병의 근절방안을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위해 본 발명은 (a) 결핵균잠복감염우로 의심되는 소에 PPD(purified protein derivative)를 접종 전 1차 채혈하여 1차 시료를 얻고, PPD 접종 후 7일 내지 14일 이후에 2차 채혈하여 2차 시료를 얻는 단계;

(b) 엘라이자 검사법으로 채혈된 1차 시료 및 2차 시료의 항체가 OD 값을 측정하여 하기 수식 1에 의하여 S/P(%)값을 계산하는 단계; 및

<수식 1>

(c) 측정된 1차 시료의 S/P(%)값이 80% 이상이고, 2차 시료의 S/P(%)값도 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P (%)값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 또는 1차 시료의 S/P(%)값이 0% 이상 30% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우 결핵우로 판정하는 단계를 포함하는, 소의 결핵균 감염 여부의 검출방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예로, 단계(a)의 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 결핵집단발생 농가의 소인 경우 단계(c)에서 1차 시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50%미만이거나, 50% 이상 80%미만이거나, 80% 이상으로 증가하는 경우 결핵우로 판정할 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 단계(a)의 상기 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 튜버큐린피내주사반응법 및 감마인터페론검사법에서 음성인 소일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 단계(a)의 상기 결핵균잠복감염우로 의심되는 소는 한우 또는 젖소일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 단계(a)의 상기 2차 시료가 PPD를 접종 후 7일~10일째 채혈되는 것일 수 있다.

본 발명의 일 구현예로, 단계(b)에서 항체가 OD 값이 음성대조군에서 0.15이상이고 양성대조군에서 1.5이하일 때 재검사하는 것일 수 있다.

본 발명에 의해, 결핵균 감염 여부의 검출방법에서 튜버큐린피내주사반응법 및 감마인터페론법 등 이 두가지 세포성면역검사법에서 검출되지 않는 위음성개체에 대하여 체액성면역법인 엘라이자 부스팅 검사법을 동시적용하여 잠복 결핵 양성우를 색출할 수 있다는 것이 밝혀졌다.

따라서, 본 발명의 엘라이자 부스팅 검사법에서 소 체내에 튜버큐린 피내검사용 피피디(PPD) 진단액을 접종하여 접종전후의 엘라이자 항체가 S/P(%)값을 기반으로 결핵균 감염 여부를 검출하는 방법은 결핵균이 감염된 "소 결핵발생농가"에서 기존엔 검출되지 않고 잔존하여 농장전파를 일으키는 잠복 결핵균을 박멸시킬 수 있는 검출방법으로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 세포성 면역반응 vs. 체액성 면역반응을 개략적으로 나타낸 그래프이다.
도 2는 엘라이자검사법에서만 양성개체 부검시 폐 및 림프절 등 부검 병변사진을 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 (a) 결핵균잠복감염우로 의심되는 소에 PPD(purified protein derivative)를 접종 전 1차 채혈하여 1차 시료를 얻고, PPD 접종 후 7일 내지 14일 이후에 2차 채혈하여 2차 시료를 얻는 단계;

<수식 1>

소 결핵은 소결핵균(Mycobacterium bovis)에 의해 전염되는 인수공통전염병으로 국내에서는 제2종 가축전염병으로 지정되어 있다. 농장에서의 소 결핵병 검사방법은 튜버큐린피내주사반응법과 감마인터페론(γ-INF)검사법을 사용하고 있으나, 위음성의 경우가 발생하고 있어 축산 농가에 막대한 손실과 위험을 입히고 있다. 결핵 발생축(PPD법 및/또는 γ-INF법 양성)으로 판별되는 경우에는 도축장으로 이동된다. 도축장에서 검사자가 방혈 후 해체검사시 육안적으로 주로 폐, 페종격 림프절, 인후두 림프절, 흉벽, 복강 장기에서 결핵 결절, 진주상 결절, 치즈양 육아종성변변을 확인하여 도축장 의심 병변을 샘플링하고 각 연구기관에서 PCR 검사를 통해 양성축을 확인하게 된다. 다른 질병에 비해 육안병변이 특이적이고 전형적인 병변이므로, 육안병변이 확인되는 경우에는 결핵병변의 PCR 검사에서 대부분 양성을 보이게 되는데, 양성축이 확인된 농가는 결핵발생 농가로 지정되어 동거축 전 두수확인검사를 위해 튜버큐린피내주사반응법과 감마인터페론검사를 동시에 실시한다.

또한, 이 농가로부터 최근에 구입과 판매 등 역학적으로 관련된 인근 농가에 대한 결핵 검사를 수행하게 된다. 즉, 도축장에서 결핵감염이 발견되면 동거축확인검사나 역학관련 농가검사로 결핵을 추적검사하는 것이 결핵을 색출하는 일반적인 경로이다.

그러나 도축장에서의 생해체검사 후 정밀검사로 결핵 양성축을 색출할수 있지만 발견시 이미 다수의 결핵전파가 이루어져 적기에 질병예방이 어렵다.

도축장 결핵발생 농가는 동거축들의 확인검사가 2-3개월 간격으로 3회 이루어지는데, 이 과정에서 일부 농가는 동거축 진단검사에서 추가적으로 결핵 양성축이 발생된다. 그러나, 튜버큐린피내주사반응법이나 감마인터페론법에서 확인되지 않고 이후 도축장 출하시나 결핵진단에서 결핵 양성축으로 발견되는 경우가 있다. 이러한 경우, 결핵 양성축은 튜버큐린피내주사반응법과 감마인터페론검사법에서 확인되지 않은 채로 '잠복감염우(latent infection cow)'로 진행되어, 이러한 잠복감염우가 속해 있는 농장은 농장 내에 결핵 감염과 진행이 연속될 위험성을 갖게 된다.

본 발명의 결핵균 감염 검출 방법은 결핵균잠복감염우로 의심되는 소에 PPD(purified protein derivative)를 접종하기 전에 1차 채혈하여 1차 시료를 얻고, PPD를 접종하고 7 내지 14일 이후에 2차 채혈하여 2차 시료를 얻는 단계[즉, 단계(a)]를 포함한다. 단계(a)에서, 상기 결핵균잠복감염우로 의심되는 소는 튜버큐린피내주사반응법 및/또는 감마인터페론검사법에서 음성인 소일 수 있으며, 한우 또는 젖소일 수 있다. 일반적으로, 한우는 2-3년 생존하는 경우가 많고, 젖소는 우유를 생산하기 때문에 7-8년 생존하는 경우가 많다. 따라서, 젖소의 경우에 결핵균에 감염되고 잠복감염우가 되는 경우에는 생산되는 우유에 영향을 미칠 수가 있어서 잠복감염우의 색출이 특히 중요하다.

본 발명에서 상기 단계(a)의 상기 2차 시료는 PPD를 접종하고 7일 ~ 10일째 채혈될 수 있다. 이는 체액성 면역반응의 경우에 항원 감작 후에 세포성 면역보다 후기에 반응이 진행되므로(도 1 참조), 항원 감작 후의 후기 검출에서는 체액성 면역반응을 검출하는 엘라이자검사법이 유용하게 사용될 수 있으며, 세포성 면역반응인 튜버큐린피내주사반응법과 감마인터페론검사법을 보완하여 엘라이자검사법을 추가로 실시하는 경우에 세포성 면역반응에서 검출되지 않았던 결핵감염우를 추가로 검출할 수 있어, 결핵잠복감염우의 색출 및 결핵균 박멸에 기여할 수 있기 때문이다.

본 발명의 결핵균 감염 검출방법은 엘라이자 부스팅 검사법으로 채혈된 1차 시료 및 2차 시료의 항체가 (OD)S/P(%)값을 측정하여 하기 수식 1에 의하여 S/P(%)값을 계산하는 단계[즉, 단계(b)]를 포함한다.

<수식 1>

단계(b)에서, 엘라이자 검사법은 상업적으로 판매되는 엘라이자 검사 키트를 사용하여 수행될 수 있다.

또한, 본 발명은 측정된 1차 시료의 S/P(%)값이 80% 이상이고, 2차 시료의 S/P(%)값도 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P (%)값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 또는 1차 시료의 S/P(%)값이 0% 이상 30% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우 결핵우로 판정하는 단계인 단계 (c)를 포함한다.

본 발명에서 단계(a)의 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 결핵집단발생 농가의 소인 경우 단계(c)에서 1차 시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50%미만이거나, 50% 이상 80%미만이거나, 80% 이상으로 증가하는 경우 결핵우로 판정할 수 있다.

본 발명에서 상기 결핵집단발생 농가의 소란 결핵 양성개체가 단일 농가 전체 소 사육두수의 1/3 이상에서 발견되었고, 결핵발생축과 같은 우사에서 3 내지 4개월 이상 동거한 경우의 소를 의미할 수 있다.

본 발명의 상기 단계(b)에서 항체가 OD 값이 음성대조군에서 0.15이상이고 양성대조군에서 1.5이하일 때 재검사를 수행할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

<실시예>

1. 결핵우 검사

(1) 재료 및 방법

2013년 12월부터 2016년 12월까지 강원도 남부지역의 원주, 홍천, 횡성 소재 농가에서 관내 소 사육 농가에 대한 "결핵병 및 브루셀라명 방역실시요령"에 따라 튜버큐린피내주사반응법, 감마인터페론검사법, 엘라이자검사법 등 3개 검사법에 의한 결핵 발생률을 조사하고 각 검사법 간의 상관관계를 비교분석하였다. 또한, 도축장 해체검사 및 결핵진단검사에서 우결핵 양성축으로 판정된 소의 병변 부위 및 혈액 시료를 채취하여 PCR 및 조직검사를 실시하여 결핵균을 확인하였다.

각각의 진단법에 대한 검사키트 및 검진대상은 다음과 같다. 튜버큐린피내주사반응법은 결핵 발생 농가 소, 역학 관련 소, 젖소(1세 이상)를 대상으로 수행하였다. 감마인터페론검사법(TB- Feron, ㈜바이오노트사, 한우 중심)은 결핵 발생 농가 소, 역학 관련 소, 한우 모니터링 검사 및 각종검사 의뢰축(종축장정기검사소, 당후대 육종검진 종축개량협회 의뢰축, 가축방역지원본부 모니터링)을 대상으로 수행하였다. 엘라이자 검사법(BTB 2.0, ㈜바이오노트사)은 결핵 만성 발생 농가의 소를 대상으로 PPD-T법 및 감마인터페론검사법으로 검진하였다. PCR 검사(PCR-RT PCR-Digital PCR) 및 병리조직검사는 도축장 해체 검사시 결핵 양성축으로 의심되는 소의 폐, 흉벽, 폐종격 림프절 등 병변검사 및 각종 결핵 진단에서 양성축으로 판정된 소의 인후두 및 이하 림프절 등 경부 림프절 및 혈액 시료를 채취하여 검사를 실시하였다.

(2) 튜버큐린피내주사반응법(PPD-T진단액접종, ㈜중앙백신연구소)

"결핵병 및 브루셀라병 방역실시요령"에 따라 우결핵을 검진할 대상 동물의 미근부 추벽 피내에 튜버큐린 피내검사용 피피디(PPD) 진단액을 접종한 후 피내접종 전후로 접종 부위의 피부 두께를 측정하였다. 접종 부위의 피부 두께 판정은 접종 후 48시간부터 72시간 사이에 실시하며 접종 부위의 피부 두께를 측정하여 종창 차이가 5 ㎜ 이상일 때 양성, 3 ㎜ 이상 5 ㎜ 미만일 때 의양성, 3 ㎜ 미만일 때 음성으로 판정하였다.

(3) 감마인터페론(TB- Feron, ㈜바이오노트사)

1) 혈액 시료 채취

소의 경정맥 및 꼬리 혈관에서 최소 5 ml 이상 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 헤파린 튜브에 넣어 항응고제와 혼합하였다. 용혈이 일어나지 않도록 부드럽게 잘 흔들어주고 채혈한 혈액 검체는 실온(18-25 ℃)을 유지하여 채혈 후 24시간 이내에 검사실험실로 신속히 수송하였다.

2) 혈액의 분주

헤파린에 담은 혈액 검체는 검체 튜브를 10회 정도 위아래로 뒤집어 부드럽게 흔들어 잘 혼합하였다(살아있는 림프구를 필요로 하는 실험이므로 세포의 손상이 일어나지 않는 범위에서 혼합함). 24 웰 세포배양용 트레이(tray)의 각 웰에 상기에서 준비된 전혈을 3 웰에 1.5 ㎖씩 분주하였다. 전혈이 분주된 3개의 웰에 각각 100 ㎕의 멸균 피비에스, 피피디 에이, 피피디 비를 무균적으로 첨가하였다. 평평한 표면에서 시계 방향, 반시계 방향으로 10회씩 둥글게 회전시켜 주었다(이 때 거품이 발생하거나, 다른 웰로 오염되지 않도록 주의하였음). 용혈이 발생한 전혈은 위음성으로 판정될 가능성이 있으므로 채혈 및 분주 시 용혈이 일어나지 않도록 주의하였다.

3) 배양

감작 항원과 전혈이 담겨진 24 웰 세포 배양용 트레이를 CO₂ 인큐베이터 37 ℃에서 16~24시간 배양하였다.

4) 혈장 검체의 채취

배양 후 500 x g에서 10분간 원심분리(실온)하여 침전된 적혈구를 제외한 상층액의 혈장을 피펫을 이용하여 깨끗한 혈청 검사를 위해 마이크로 튜브로 옮겼다. 이 때 적혈구가 혼입되지 않도록 하며, 혼입시 다시 원심분리하여 다시 상청 혈장을 회수하였다.

5) 혈장 검체의 보관

혈장을 채취일에 사용하지 않을 경우 2~8 ℃에서 7일간 보관 가능하다. -20 ℃에서는 2~3개월간 보관 가능하며, 단, 엘라이자 시험 전에는 실온(18~25 ℃)에 15~30분 정도 두고, vortexing 후 사용하였다.

6) γ-INF 엘라이자 검사(TB- Feron, ㈜바이오노트사)

제조사의 지시에 따라 각 시료의 γ-INF 수치를 측정하였다.

7) 결과 판정(Interpretation)

① 확인(Test validation)

- 음성대조군(NC)의 평균흡광도 < 0.2, 양성대조군(PC)의 평균흡광도 ≥1.0

② 결과 판정(Interpretation)

- 양성: PPD Bovine 흡광도 - PBS 흡광도 ≥ 0.1 및 PPD Bovine 흡광도 - PPD Avian 흡광도 ≥ 0.1

- 음성: PPD Bovine 흡광도 - PBS흡광도 < 0.1 또는 PPD Bovine 흡광도 - PPD Avian 흡광도 < 0.1

피피디 비(PPD Bovine)를 첨가한 혈장의 흡광도 값이 멸균 피비에스를 첨가한 혈장의 흡광도보다 0.1 이상 크고, 피피디 에이(PPD Avian)를 첨가한 혈장의 흡광도보다 0.1 이상 큰 소는 우 결핵균 감염이 있다는 것을 의미한다.

(4) 엘라이자 검사법(BTB 2.0, ㈜바이오노트사)

효소 면역 측정법으로 순수하게 분리된 BTB 항원을 플레이트에 흡착하고 MPB70 효소를 접합시켜 시료중의 소 결핵 항체에 대하여 부착하여 반응하도록 하여, 소의 혈청/혈장에서 소 결핵에 대한 항체를 검출하였다. 37 ℃에서 1시간 동안 플레이트에 검체를 반응시키고 세척한 후, 기질액을 첨가하여 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 측정파장 450 nm, 참조파장 620 nm에서 발색 정도인 흡광도 OD(Optical density)를 측정하여 소 결핵에 대한 항체 음, 양성을 구별하였다.

1) 검사 절차

제조사의 지시에 따라 각 시료의 흡광도를 측정하였다.

2) 결과 판정

S/P 값은 하기 수식 1으로 계산하였고, 계산된 S/P 값을 기준으로 결과를 판정하였다.

<수식 1>

이 때, 양성대조군의 평균 OD 값은 약 2.5 ~ 3.0이었으며, 음성대조군의 평균 OD 값은 약 0.05 ~ 0.1이었다.

S/P(%)값의 판정 기준은 다음과 같다.

- 음성: [S/P(%)값 30% 미만] 30% 미만의 S/P(%)값을 나타내는 검체는 음성으로 판정하였다.

- 의양성: [30% ≤ S/P(%)값 < 50%] 30% 이상 50% 미만의 S/P(%)값을 나타내는 검체는 의양성으로 판정하였고, 의양성 검체는 결핵 발생 상황에 따라 2차 PPD 확진검사에 포함시켰다.

- 양성: [50 ≤ S/P(%)값] 50% 이상의 S/P(%)값을 나타내는 검체는 양성으로 판정하였다. 1차 검사에서 양성 판정 검체는 2 웰 이상 재검사하고 재검 결과에서 1웰 이상 양성으로 판정되면 최종 양성으로 판정하였다. 최종 양성으로 판정된 검체는 다른 임상결과나 실험결과(PPD검사 혹은 r-IFN 검사 등)를 함께 이용하여 전문 수의사가 종합적으로 최종 진단을 수행하였다.

2. 각 검사법의 상관관계 비교

2013년 12월부터 2016년 12월까지 약 3년간 소 결핵 발생 농가 및 결핵 발생축을 대상으로 튜버큐린피내주사반응법, γ-INF법, 엘라이자법의 상관관계와 일치율을 연구하여, 각 검사법 간의 상관관계를 알아보았다. 또한, 엘라이자법에서만 양성을 보인 개체에서 부검시료를 채취하여 정밀검사를 통해 소결핵 양성축임을 확인할수 있었다. 또한, 결핵 발생축(튜버큐린피내주사반응법 및/또는 γ-INF법 양성)의 경우 엘라이자법에서 PPD 접종 후 7일을 전후하여 검사 결과에 변화가 있다는 사실을 발견하였다.

구체적으로, 2013년부터 2016년까지 3가지 검진법에 대한 반응 결과를 하기 표 1(튜버큐린피내주사반응법, γ-INF법과 엘라이자법의 일치율 조사)에 나타내었다.

상기 표 1에 나타난 바와 같이, PPD법 양성 및/또는 감마인터페론법 양성인 개체를 결핵 양성우로 판단하는 현재 정책에 의해, 양성우로 판별된 소들 중에서 엘라이자법에서도 양성으로 확인된 소 들의 비율을 조사한 결과, 2013년에는 6/10두(60%), 2014년에는 51/66두(77.3%), 2015년에는 6/37(16.1%), 2016년에는 13/57두(22.8%)로 나타나서, 2013년과 2014년에 일치율이 뚜렷하게 높은 값을 나타내어 연도별 일치율에 차이가 있는 것으로 나타났다.

이러한 차이의 원인을 찾은 결과, 2013년과 2014년에는 엘라이자검사법에서 튜버큐린피내주사반응법에 사용되는 PPD진단액의 접종 후 양성 개체의 살처분시 채혈을 하여 튜버큐린피내접종 이후 시간 간격(1주일 전후)을 두고 진행하였으나, 2015년과 2016년에는 PPD 접종시 채혈하였다는 점을 발견하였다. 이에 따라, PPD 접종 후 채혈하는 시점이 엘라이자검사법의 정확도에 영향을 미치는 것으로 판단하고, 이를 확인하기 위한 추가 실험을 진행하였다.

즉, 2015년과 2016년(의 결핵 발생 농가 검진시에는 ① 결핵 감염우(PPD법 및/또는 γ-INF법 양성) 및 ③ 엘라이자검사법에서만 양성을 나타내는 개체에 대하여 PPD 접종 전과 PPD 접종 후 1주일 전후로 각각 채혈을 실시하여 엘라이자검사 결과값을 비교하였다. 그 결과, 결핵 감염우의 대부분인 80% 정도의 개체에서 엘라이자항체가가 유의적으로 증가하였으며, 엘라이자검사법에서만 양성 반응을 나타냈던 개체들 중 일부에서 결핵 감염우와 동일하게 엘라이자항체가가 증가하는 것을 확인하였다. 이러한 개체들은 튜버큐린피내주사반응법 양성 및/또는 감마인터페론법 양성인 개체를 결핵 양성우로 판단하는 현재 정책 하에서는 결핵 감염우로 판단되지 않지만, 결핵균에 감염된 개체일 가능성이 높다고 판단하였다.

3. 기존공인검사법 음성이나 엘라이자검사법에서만 양성개체의 결핵발생확인

결핵이 집단발생농가에서 튜버큐린피내주사반응법 또는 γ-INF법에서 음성이어도 엘라이자검사법에서만 양성을 나타내는 개체(③)에 대하여 부검한 결과, 17두 중 17두에서 전 두수에서 결핵 양성으로 판정되었다(부검 및 PCR). 따라서, 엘라이자검사법이 잠복결핵우 색출에 유용하다는 것이 확인되었다(하기 표 2, 엘라이자검사법에서만 양성개체의 부검 및 PCR정밀검사시 결핵양성확인 데이터 참조). 또한, 결핵 집단발생 농가에서 엘라이자검사법 양성축이 나오면, 엘라이자 S/P(%)값이 40%이상인 경우에는 도축장 출하(도태)를 권고하였고, 이러한 경우에는 해당 결핵발생 농가에서 결핵 재발생이 없었다. 즉, 2013년 이후 결핵 발생 농가의 경우, 결핵 발생축(튜버큐린피내주사반응법 및/또는 γ-INF법 양성)은 살처분하고, 이후 엘라이자 검사법을 수행하여 도태 권고를 수행하였으며, 이러한 절차에 따라 수행된 결핵 발생 농가 20-30농가에서 음성농장으로 전환된 후 결핵이 재발율이 현저히 저하되었다.

4. 결핵양성축의 PPD 접종 전·후 엘라이자 S/P(%)값의 변화에 따른 분류

국내 공인검사법(튜버큐린피내주사반응법과 감마인터페론법)양성확인된 결핵 양성축 170두 중에서 튜버큐린피내주사반응법시 PPD진단액의 접종 전·후에 엘라이자검사 항체수치를 확보한 112두를 하기 표 3(결핵양성축의 PPD 접종 전·후 엘라이자 S/P(%)값의 변화)과 같이 분류하였다.

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 결핵 양성축의 상당수가 PPD 접종 전 항체가 S/P(%) 12%이하(D값이 0.3 이하)면서 PPD 접종 후에 증가한 경우(112두 중 78두)에 해당하여(표 3에서 4군), 이러한 경우에 잠복 감염의 확률이 높은 것으로 확인되었다. 또한, 결핵 양성축의 대부분(112두 중 104두)가 PPD 접종 후에 엘라이자검사 항체가가 증가하여, 이러한 경우에 결핵 여부를 추가로 검사하는 것이 잠복 감염의 색출할 확률이 높다는 것을 알 수 있다.

5. PPD 접종 전·후 엘라이자 S/P(%)값의 변화에 따른 양성축 판정

피내접종주사법 PPD 접종 전·후값을 소의 혈청/혈장에서 소 결핵에 대한 항체를 엘라이자 검사법(BTB 2.0, ㈜바이오노트사)으로 측정하고, 하기 수식 1에 의해 S/P(%)값을 계산하였다.

<수식 1>

* PC: 2.5 ~ 3.0, NC 0.05 ~ 0.1

결핵 양성 여부는 하기 표 4(PPD 접종 전·후 엘라이자 S/P(%)값 변화에 따른 양성축 검출 예)에 따라 분류하였다.

* 결핵 3회이상 반복발생농장에서 감염후 양성개체가 전체 소 사육두수의 1/3이상의 소에 발생되었고, 결핵발생축과 같은우사에서 3 내지 4개월 이상 동거하였다면 (BTB 5그룹)은 부스팅 후의 S/P 값이 BTB 1 또는 BTB 2 또는 BTB 3에 포함되는 경우에 양성으로 판단

상기 기준과 같이 결핵발생농가에서 세포성 면역과 함께 BTB 2.0(체액성 면역)을 함께 사용한 21 농장의 소 사육 농가(원주, 횡성, 홍천)는 결핵병이 재발하지 않았다. 결핵발생농가, 특히 집단 발생농가에서 대부분 PPD법 및 γ-INF검사법에서 일부 몇마리에서 음성인 경우에 부스팅 결합 BTB 2.0법에서 양성으로 확인되었고, 부검 및 PCR에서 양성으로 확인되었다.

또한, 결핵 최종 양성축(PPD, γ-양성축)에서 PPD 접종 전과 후에 비교한 결과, 강력한 부스팅이 일어남을 확인하였다.

※ 결핵진단법 중 엘라이자부스팅법 기대되는 구간(블루구간)

※ 튜버큐린피내주사반응법(T), 감마인터페론법(γ), 엘라이자법(E), 교집합(∩)

※ Group 1(E only)/ Group 0- ELISA BOOST- 진양성 개체 확인(현재 미검출)

Claims

(a) 결핵균잠복감염우로 의심되는 소에 PPD(purified protein derivative)를 접종 전 1차 채혈하여 1차 시료를 얻고, PPD 접종 후 7일 내지 14일 이후에 2차 채혈하여 2차 시료를 얻는 단계;
(b) 엘라이자 검사법으로 채혈된 1차 시료 및 2차 시료의 항체가 OD 값을 측정하여 하기 수식 1에 의하여 S/P(%)값을 계산하는 단계; 및
<수식 1>

(c) 측정된 1차 시료의 S/P(%)값이 80% 이상이고, 2차 시료의 S/P(%)값도 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%) 값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 1차 시료의 S/P (%)값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우; 또는 1차 시료의 S/P(%)값이 0% 이상 30% 미만이고, 2차 시료의 S/P(%)값이 50% 이상 80% 미만이거나 80% 이상인 경우 결핵우로 판정하는 단계를 포함하는, 소의 결핵균 감염 여부의 검출방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 결핵집단발생 농가의 소인 경우 단계(c)에서 1차 시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50% 미만이고, 2차시료의 S/P(%) 값이 30% 이상 50%미만이거나, 50% 이상 80%미만이거나, 80% 이상으로 증가하는 경우 결핵우로 판정하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 튜버큐린피내주사반응법 및 감마인터페론검사법에서 음성인 소인 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 결핵균잠복감염우로 의심되는 소가 한우 또는 젖소인 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제1항에 있어서, 단계(a)의 상기 2차 시료가 PPD를 접종하고 7일 내지 10일에 채혈되는 것을 특징으로 하는, 검출방법.
제1항에 있어서, 단계(b)에서 항체가 OD 값이 음성대조군에서 0.15이상이고 양성대조군에서 1.5이하일 때 재검사를 수행하는 것을 특징으로 하는, 검출방법.