KR20210103980A

KR20210103980A - Stomach extracellular matrix-derived scaffold for culture and transplantation of gastric organoid and preparing method thereof

Info

Publication number: KR20210103980A
Application number: KR1020210019945A
Authority: KR
Inventors: 조승우; 민성진; 최이선
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2020-02-14
Filing date: 2021-02-15
Publication date: 2021-08-24
Also published as: KR102578904B1

Abstract

The present invention relates to a scaffold for gastric organoid culture and transplantation using stomach extracellular matrix (SEM). Through simple chemical treatment of gastric tissues, a method was established to fabricate a large amount of decellularized scaffold, and the prepared decellularized gastric tissue matrix is to be used for culturing gastric organoids.

Description

STOMACH EXTRACELLULAR MATRIX-DERIVED SCAFFOLD FOR CULTURE AND TRANSPLANTATION OF GASTRIC ORGANOID AND PREPARING METHOD THEREOF

본 발명은 위 오가노이드 배양 및 이식을 위한 탈세포 위 조직 유래 지지체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.The present invention relates to a scaffold derived from decellularized gastric tissue for culturing and transplanting gastric organoids and a method for preparing the same.

최근 각광받고 있는 오가노이드는 신약 스크리닝, 약물 독성 평가, 질환 모델링, 세포 치료제 등 다양한 응용 분야에 적용이 가능한 조직 유사체로서 전 세계적으로 급격하게 성장하고 있는 기술이다.Organoids, which have recently been in the spotlight, are a technology that is rapidly growing worldwide as a tissue analogue that can be applied to various applications such as drug screening, drug toxicity evaluation, disease modeling, and cell therapy.

뇌, 장, 간, 위 등 장기 별로 다양한 오가노이드 종류가 존재하는데 이를 연구하는 전 세계 수많은 연구팀에서 현재까지 오가노이드를 배양하기 위해 배양 지지체로서 매트리젤 (Matrigel) 제품을 이용하고 있다. 하지만 매트리젤은 쥐의 육종암 조직에서 추출한 세포외기질 성분이기 때문에, 제품의 품질을 균일하게 유지하기 어려우며 고가이고 동물성 감염균 및 바이러스 전이 등 안전성 측면에서 문제가 있어 오가노이드 배양 시스템으로서 매트리젤은 해결해야 하는 많은 문제점을 가지고 있다. 특히, 암 조직 유래의 소재로서 특정 조직 오가노이드 배양을 위해 필요한 최적의 조직 특이적 미세환경을 제공해 주지 못한다. 매트리젤을 대체하기 위한 고분자 기반 하이드로젤 개발 연구가 일부 진행되어 왔으나 아직까지 매트리젤을 대체할만한 수준의 소재는 보고된 바 없다.Various types of organoids exist for each organ such as the brain, intestine, liver, and stomach. Numerous research teams around the world researching these types of organoids are using Matrigel products as a culture support to cultivate organoids. However, since Matrigel is an extracellular matrix component extracted from rat sarcoma tissue, it is difficult to maintain the quality of the product uniformly, is expensive, and there are problems in terms of safety such as animal infectious bacteria and virus transfer. There are many problems that need to be addressed. In particular, as a material derived from cancer tissue, it does not provide an optimal tissue-specific microenvironment necessary for culturing specific tissue organoids. Although some studies have been conducted on the development of polymer-based hydrogels to replace Matrigel, no material has been reported that can replace Matrigel.

위 오가노이드는 위 조직에서 줄기세포를 추출하여 이를 삼차원 배양하는 방법을 통해 생산될 수 있다. 기본 보고된 매트리젤을 이용한 프로토콜로 배양된 위 오가노이드는 증식 능력을 유지하면서 장기간 배양할 수 있는 장점이 있지만, 위 조직을 구성하는 다양한 세포 중 벽세포(Parietal cell) 및 주세포(Chief cell)처럼 중요한 기능을 하는 세포로의 분화가 어렵다는 문제가 있다. 따라서 기존 매트리젤 기반 배양 시스템보다 구조 및 기능적으로 성숙하고 발달된 위 오가노이드를 제작할 수 있는 새로운 배양 소재 기술의 개발이 요구되고 있다.Gastric organoids can be produced by extracting stem cells from gastric tissue and culturing them three-dimensionally. Although gastric organoids cultured with the basic reported protocol using Matrigel have the advantage of being able to be cultured for a long time while maintaining their proliferative ability, like parietal cells and chief cells, among various cells constituting gastric tissue, There is a problem in that differentiation into cells having important functions is difficult. Therefore, there is a demand for the development of a new culture material technology that can produce gastric organoids that are structurally and functionally more mature and developed than the existing Matrigel-based culture system.

또한, 위궤양 및 위암 절제 이후 등 대량의 조직 손상이 발생하는 질병에는 약물 치료만으로는 한계가 있기 때문에 본질적으로 조직을 재생시킬 수 있는 세포 치료 및 조직공학 기술의 개발이 필요한 실정이다. 위 오가노이드는 실제 위 조직에 존재하는 줄기세포를 포함한 다양한 세포들을 포함하고 있기 때문에, 오가노이드 기반 이식 및 치료가 각광을 받고 있다. 하지만 생체 내로 오가노이드의 효율적인 이식 및 생착을 증진시켜 줄 수 있는 이식용 소재의 개발도 필수적으로 요구되고 있다.In addition, since there is a limit to only drug treatment for diseases in which a large amount of tissue damage occurs, such as after gastric ulcer and gastric cancer resection, there is a need to develop cell therapy and tissue engineering technology capable of essentially regenerating tissue. Since gastric organoids contain various cells, including stem cells, that are actually present in gastric tissue, organoid-based transplantation and treatment are in the spotlight. However, it is also essential to develop a material for transplantation that can promote efficient transplantation and engraftment of organoids in vivo.

본 발명은 돼지 위 조직으로부터 탈세포 과정을 거쳐 탈세포 위 조직 유래 세포외기질 성분 기반의 하이드로젤 지지체를 제작하고, 이를 위 오가노이드 배양에 적용하는 새로운 배양 플랫폼을 제안한다. 개발된 탈세포 조직 유래 지지체는 낮은 비용으로 쉽게 대량 제작이 가능하며 위 조직 특이적인 다양한 세포외기질 및 성장인자들이 포함되어 있어 위 오가노이드 특이적 삼차원 미세환경을 제공해 줄 수 있다. 개발된 지지체는 기존의 매트리젤과 유사한 수준으로 위 오가노이드 형성 및 증식을 가능하게 하였으며 위 조직 특이적인 세포로의 분화 및 기능은 더욱 증진시킬 수 있음이 검증되었다. 나아가 탈세포 지지체는 손상된 위 조직 내로 위 오가노이드 이식 효율 및 생착을 향상시켜 오가노이드 이식용 소재로도 높은 활용 가능성을 보여준다.The present invention proposes a new culture platform for preparing a hydrogel scaffold based on an extracellular matrix component derived from a decellularized gastric tissue through a decellularization process from pig gastric tissue, and applying it to gastric organoid culture. The developed decellularized tissue-derived scaffold can be easily mass-produced at low cost, and contains various gastric tissue-specific extracellular matrix and growth factors, so it can provide a gastric organoid-specific three-dimensional microenvironment. The developed scaffold enabled the formation and proliferation of gastric organoids at a level similar to that of the existing Matrigel, and it was verified that differentiation and function into gastric tissue-specific cells could be further enhanced. Furthermore, the decellular scaffold improves the efficiency and engraftment of gastric organoid transplantation into damaged gastric tissue, showing high potential for use as a material for organoid transplantation.

대한민국 공개특허공보 제10-2017-0143465호Republic of Korea Patent Publication No. 10-2017-0143465

본 발명은 위 조직에 간단한 화학적 처리를 통해서, 대량의 탈세포 지지체를 제작할 수 있는 방법을 구축하였고 제작된 탈세포 위 조직 매트릭스를 위 오가노이드 배양에 이용하기 위한 것이다. The present invention is to construct a method capable of manufacturing a large amount of decellularized scaffold through simple chemical treatment of gastric tissue, and to use the prepared decellularized gastric tissue matrix for culturing gastric organoids.

그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical problem to be achieved by the present invention is not limited to the above-mentioned problems, and other problems not mentioned will be clearly understood by those skilled in the art from the following description.

이하에서는 첨부한 도면을 참조하여 본 발명을 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 따라서 여기에서 설명하는 실시예로 한정되는 것은 아니다. 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 구비할 수 있다는 것을 의미한다.Hereinafter, the present invention will be described with reference to the accompanying drawings. However, the present invention may be embodied in several different forms, and thus is not limited to the embodiments described herein. When a part "includes" a certain component, it means that other components may be further included, rather than excluding other components, unless otherwise stated.

달리 정의되지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.Unless otherwise defined, molecular biology, microbiology, protein purification, protein engineering, and DNA sequencing may be performed by conventional techniques commonly used in the art of recombinant DNA and within the abilities of those skilled in the art. Such techniques are known to those skilled in the art and are described in many standardized textbooks and reference books.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다.Unless defined otherwise herein, all technical and scientific terms used have the same meaning as commonly understood by one of ordinary skill in the art.

본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용가능하다. 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법학, 프로토콜 및 시약으로 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.Various scientific dictionaries containing the terms contained herein are well known and available in the art. Although any methods and materials similar or equivalent to those described herein are found to be used in the practice or testing herein, several methods and materials are described. The present invention is not limited to specific methods, protocols, and reagents, as it may be used in various ways depending on the context used by those skilled in the art. Hereinafter, the present invention will be described in more detail.

본 발명의 일 양상은 탈세포 위 조직 유래 세포외기질 (Stomach Extracellular Matrix; SEM)을 포함한 지지체 조성물을 제공한다. One aspect of the present invention provides a scaffold composition comprising a decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (Stomach Extracellular Matrix; SEM).

상기 “세포외기질(extracellular matrix)”은 포유류 및 다세포 생물(multicellular organisms)에서 발견된 조직의 탈세포화를 통해 제조된 세포 성장용 자연 지지체를 의미한다. 상기 세포외기질은 투석 또는 가교화를 통해 더 처리할 수 있다.The “extracellular matrix” refers to a natural scaffold for cell growth prepared through decellularization of tissues found in mammals and multicellular organisms. The extracellular matrix can be further processed through dialysis or crosslinking.

상기 세포외기질은 콜라겐, 엘라스틴(elastins), 라미닌(laminins), 글리코스아미노글리칸 (glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 항균제(antimicrobials), 화학유인물질(chemoattractants), 시토카인 (cytokines), 및 성장 인자에 제한되지 않는, 구조형 및 비구조형 생체 분자(biomolecules)의 혼합물일 수 있다.The extracellular matrix is limited to collagen, elastins, laminins, glycosaminoglycans, proteoglycans, antimicrobials, chemoattractants, cytokines, and growth factors. It may be a mixture of structural and non-structural biomolecules.

상기 세포외기질은 포유 동물에 있어서 다양한 형태로서 약 90%의 콜라겐을 포함할 수 있다. 다양한 생체 조직에서 유래한 세포외기질은 각각의 조직에 필요한 고유 역할 때문에 전체 구조체 및 조성이 상이할 수 있다. The extracellular matrix may contain about 90% collagen in various forms in mammals. The extracellular matrix derived from various living tissues may have a different overall structure and composition due to the unique role required for each tissue.

상기 “유래(derive)", "유래된(derived)"은 유용한 방법에 의해 언급한 원천으로부터 수득한 성분을 의미한다.As used herein, “derived” or “derived” means an ingredient obtained from the source mentioned by any useful method.

또한, 본 발명의 일 구체예로, 상기 탈세포 위 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 8 mg/mL 더욱 구제척으로 1 mg/mL 내지 5 mg/mL, 가장 구체적으로는 1, 3, 5 또는 7 mg/mL, 최적화된 구체예로는 5 mg/mL로 포함하는 것일 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다. In addition, in one embodiment of the present invention, the decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix is 0.01 to 10 mg/mL, specifically 0.5 to 8 mg/mL, more specifically, 1 mg/mL to 5 mg/mL, most Specifically, 1, 3, 5 or 7 mg/mL, in an optimized embodiment, may be included at 5 mg/mL. When included in a concentration outside of the above range, the desired effect of the present invention may not be obtained, or may be unsuitable for manufacturing or utilization.

본 발명의 일 구체예로, 상기 조성물은 0.1 내지 10Hz 기준 탄성계수가 1 내지 100Pa일 수 있고, 상기 조성물이 상기 범위의 탄성계수를 가짐으로써 안정적인 고분자 네트워크를 형성할 수 있다. In one embodiment of the present invention, the composition may have an elastic modulus of 0.1 to 10 Hz based on 1 to 100 Pa, and the composition may form a stable polymer network by having an elastic modulus in the above range.

상기 지지체 조성물은 탈세포화하여 수득한 위 조직 매트릭스 조성물을 기반으로 제조한 3차원 하이드로젤을 포함하며, 위 오가노이드 배양에 효과적으로 활용될 수 있다.The support composition includes a three-dimensional hydrogel prepared based on the gastric tissue matrix composition obtained by decellularization, and can be effectively utilized for culturing gastric organoids.

상기 탈세포화된 위 조직은 실제 조직 특이적 세포외기질 성분을 포함하므로 해당 조직의 물리적, 기계적, 생화학적 환경을 제공할 수 있으며, 위 조직 세포로의 분화 및 조직 특이적 기능성을 증진시키는데 매우 효율적이다.Since the decellularized gastric tissue contains an actual tissue-specific extracellular matrix component, it is possible to provide a physical, mechanical, and biochemical environment of the corresponding tissue, and is very efficient in promoting differentiation into gastric tissue cells and tissue-specific functionality. am.

상기 “오가노이드(organoid)”는 조직 또는 전분화능줄기세포에서 유래된 세포를 3D 형태로 배양하여 인공장기와 같은 형태로 제작한 초소형 생체기관을 의미한다.The “organoid” refers to a micro-organism produced in the form of an artificial organ by culturing cells derived from tissues or pluripotent stem cells in a 3D form.

상기 오가노이드는 줄기세포에서 발생하고 생체 내 상태와 유사한 방식으로 자가-조직화(또는 자가-패턴화)하는 장기 특이적 세포를 포함한 삼차원 조직 유사체로서 제한된 요소(Ex. growth factor) 패터닝에 의해 특정 조직으로 발달할 수 있다.The organoids are three-dimensional tissue analogs including organ-specific cells that arise from stem cells and self-organize (or self-pattern) in a manner similar to the in vivo state, and are limited to specific tissues by patterning of factors (Ex. growth factor). can develop into

상기 오가노이드는 세포의 본래 생리학적 특성을 가지며, 세포 혼합물(한정된 세포 유형뿐만 아니라 잔존 줄기 세포, 근접 생리학적 니치(physiological niche)를 모두 포함) 원래의 상태를 모방하는 해부학적 구조를 가질 수 있다. 상기 오가노이드는 3차원 배양 방법을 통해 세포와 세포의 기능이 더욱 잘 배열되고, 기능성을 가지는 기관 같은 형태와 조직 특이적 기능을 가질 수 있다.The organoid has the intrinsic physiological properties of the cell, and may have an anatomical structure that mimics the original state of a cell mixture (including both residual stem cells, proximal physiological niche as well as defined cell types). . The organoid may have a shape and tissue-specific function, such as an organ, in which cells and cell functions are better arranged through a three-dimensional culture method, and have functionality.

본 발명의 다른 일 양상은 (a) 분리된 위 조직을 탈세포화하여 탈세포된 위 조직을 제조하는 단계; (b) 상기 탈세포된 위 조직을 건조하여 탈세포 위 조직(Stomach Extracellular Matrix; SEM)을 제조하는 단계; 및 (c) 상기 건조된 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계; 를 포함하는 지지체 조성물 제조방법을 제공한다. Another aspect of the present invention comprises the steps of (a) decellularizing the isolated gastric tissue to prepare a decellularized gastric tissue; (b) drying the decellularized gastric tissue to prepare a decellularized gastric tissue (Stomach Extracellular Matrix; SEM); and (c) gelling the dried decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix; It provides a method for preparing a support composition comprising a.

상기 (a) 단계는 분리된 위 조직을 탈세포화하여 탈세포된 위 조직을 제조하는 단계이다.Step (a) is a step of preparing decellularized gastric tissue by decellularizing the isolated gastric tissue.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 분리된 위 조직은 탈세포 전에 세절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 본 발명은 탈세포 전에 위 조직을 세절하는 단계를 포함하여, 탈세포 공정이 더 효율적이고 완전한 세포 제거가 가능하다. 상기 분리된 위 조직의 세절 방법은 공지의 방법으로 이루어질 수 있다. In one embodiment of the present invention, the step of mincing the gastric tissue separated in step (a) before decellularization may be further included. According to the present invention, the decellularization process is more efficient and complete cell removal is possible, including the step of mincing the gastric tissue prior to decellularization. The method for shredding the isolated gastric tissue may be performed by a known method.

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (a) 단계에서 상기 위 조직을 탈세포화 용액에서 교반시키는 것일 수 있다. In one embodiment of the present invention, in step (a), the gastric tissue may be stirred in a decellularization solution.

상기 탈세포화 용액은 위 조직에서 세포를 제거하기 위한 다양한 성분을 포함할 수 있고, 예컨대, 고장성 식염수(hypertonic saline), 과산화 아세트산(peracetic acid), 트리톤 X-100 (Triton X-100), SDS 또는 기타 세제 성분을 포함할 수 있으나, 본 발명의 일 구체예에서 상기 탈세포화 용액은 0.1 내지 5%의 Triton X-100 및 0.01 내지 0.5% 수산화 암모늄, 더욱 구체적으로는 1% Triton X-100 및 0.1% 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)을 포함하는 것일 수 있다. 상기와 같은 탈세포화 용액을 사용함으로써, 기존의 공정에 비하여 완화된 조건에서 탈세포를 진행함으로써 제조된 지지체 내 DNA를 효과적으로 제거함과 동시에 위 조직 내의 다양한 단백질들이 더 많이 보존될 수 있다. The decellularization solution may include various components for removing cells from gastric tissue, for example, hypertonic saline, peracetic acid, Triton X-100 (Triton X-100), SDS or other detergent components, but in one embodiment of the present invention, the decellularization solution comprises 0.1 to 5% Triton X-100 and 0.01 to 0.5% ammonium hydroxide, more specifically 1% Triton X-100 and It may contain 0.1% ammonium hydroxide. By using the decellularization solution as described above, it is possible to effectively remove the DNA in the scaffold prepared by decellularization under a more relaxed condition compared to the conventional process, and at the same time preserve more various proteins in the gastric tissue.

상기 교반은 24 내지 72시간, 더욱 구체적으로 36 내지 60시간, 가장 구체적으로는 40 내지 56시간, 일 예시로 48시간 동안 이루어지는 것일 수 있고, 이러한 교반 (탈세포) 과정을 통해 위 조직 세포가 95 내지 99.9%, 더욱 구체적으로 96 내지 98%가 제거된 것일 수 있다. 상기 범위 외의 시간외로 탈세포가 이루어질 경우 제조된 지지체 조성물의 품질이 저하되거나 공정 경제성이 떨어지는 문제점이 있다. The agitation may be performed for 24 to 72 hours, more specifically 36 to 60 hours, most specifically 40 to 56 hours, for example, 48 hours, and through this stirring (decellularization) process, gastric tissue cells are 95 to 99.9%, more specifically, 96 to 98% may be removed. When decellularization is performed outside of the above range, there is a problem in that the quality of the prepared support composition is deteriorated or the economical efficiency of the process is deteriorated.

상기 (b) 단계는 상기 탈세포된 위 조직을 건조하여 탈세포 위 조직(Stomach Extracellular Matrix; SEM)을 제조하는 단계이다. Step (b) is a step of preparing a decellularized gastric tissue (Stomach Extracellular Matrix; SEM) by drying the decellularized gastric tissue.

상기 탈세포된 위 조직을 건조하는 방법은 공지의 방법으로 수행될 수 있으며, 자연건조 또는 동결 건조될 수 있고, 멸균을 위해 건조 후 전자 빔 또는 감마 방사선에 의해 에틸렌 옥사이드 가스 또는 초임계 이산화탄소에 노출시킬 수 있다. The method of drying the decellularized gastric tissue may be performed by a known method, may be naturally dried or freeze-dried, and after drying for sterilization, exposure to ethylene oxide gas or supercritical carbon dioxide by electron beam or gamma radiation can do it

본 발명의 일 구체예에서, 상기 (b) 단계 이후, 탈세포 위 조직 유래 세포외기질은 0.01 내지 10 mg/mL, 구체적으로 0.5 내지 8 mg/mL 더욱 구체적으로 1 mg/mL 내지 5 mg/mL, 가장 구체적으로는 1, 3, 5 또는 7 mg/mL, 최적화된 구체예로는 5 mg/mL로 포함하도록 조절하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 범위 외의 농도로 포함될 경우, 본 발명이 목적하는 효과를 얻을 수 없거나, 제조 또는 활용에 있어서 부적합할 수 있다. In one embodiment of the present invention, after step (b), the decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix is 0.01 to 10 mg/mL, specifically 0.5 to 8 mg/mL, more specifically 1 mg/mL to 5 mg/mL mL, most specifically 1, 3, 5 or 7 mg/mL, and in an optimized embodiment, may further include adjusting to contain 5 mg/mL. When included in a concentration outside of the above range, the desired effect of the present invention may not be obtained, or may be unsuitable for manufacturing or utilization.

상기 건조된 세포외기질은 박리(tearing), 제분(milling), 절단, 분쇄 및 전단 단계를 포함하는 방법에 의해 세분될 수 있다. 상기 세분된 세포외기질은 냉동 상태 또는 냉동 건조 상태에서, 분쇄 또는 제분과 같은 방법에 의해 분말 형상으로 가공될 수 있다.The dried extracellular matrix may be subdivided by a method comprising the steps of tearing, milling, cutting, grinding and shearing. The subdivided extracellular matrix may be processed into a powder form by a method such as pulverization or milling in a frozen state or freeze-dried state.

상기 (c) 단계는 상기 건조된 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 겔화(gelation)하는 단계이다. The step (c) is a step of gelation of the dried decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix.

상기 겔화를 통해 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 가교시켜 3차원 하이드로젤 형태의 지지체를 제작할 수 있고, 겔화된 지지체는 실험, 스크리닝 뿐만 아니라 오가노이드 배양과 관련된 분야에서 다양하게 활용될 수 있다.Through the gelation, a three-dimensional hydrogel-type scaffold can be produced by crosslinking the extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue, and the gelled scaffold can be used in various fields related to experiments and screening as well as organoid culture.

상기 “하이드로젤”은 졸-겔 상변이를 통해 물을 분산매로 하는 액체가 굳어 유동성을 상실하고 다공성 구조를 이루는 물질로서, 3차원 망목 구조와 미결정 구조를 갖는 친수성 고분자가 물을 함유하여 팽창함으로써 형성될 수 있다.The "hydrogel" is a material that loses fluidity and forms a porous structure by solidifying a liquid using water as a dispersion medium through a sol-gel phase change. can be formed.

상기 겔화는 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 산성 용액에서 펩신 또는 트립신과 같은 단백질 분해 효소로 용액화하고, 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 맞추고 37℃의 온도에서 30분 동안 이루어지는 것일 수 있다. The gelation is performed by dissolving the extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue in an acidic solution with a proteolytic enzyme such as pepsin or trypsin, using 10X PBS and 1 M NaOH to adjust the neutral pH and electrolyte state of 1X PBS buffer to 37 ° C. It may be made for 30 minutes at a temperature of

본 발명의 일 구체예로 상기 지지체 조성물 제조방법은 관류 방식을 포함하지 않을 수 있다. 관류 방식 (perfusion)을 적용하지 않아 탈세포 용액의 낭비를 줄일 수 있다. In one embodiment of the present invention, the method for preparing the support composition may not include a perfusion method. It is possible to reduce the wastage of the decellularization solution by not applying a perfusion method.

본 발명의 다른 일 양상은 상기 지지체 조성물 또는 상기 제조방법에 의해 제조된 지지체 조성물에서 위 오가노이드를 배양하는 방법을 제공한다. Another aspect of the present invention provides a method of culturing gastric organoids in the support composition or the support composition prepared by the production method.

기존의 매트리젤 기반 배양 시스템은 동물 암조직 유래의 추출물로서 배치 간의 차이가 크고 실제 위의 환경을 모사해주지 못하고, 위 오가노이드로 분화, 발달되는 효율이 미흡한 반면, 상기 지지체 조성물은 위 조직 유사 환경을 조성할 수 있으므로 위 오가노이드 배양에 있어서 적합하다.The existing Matrigel-based culture system is an extract derived from animal cancer tissue, and the difference between batches is large and does not mimic the actual gastric environment, and the efficiency of differentiation and development into gastric organoids is insufficient, whereas the support composition has a gastric tissue-like environment It is suitable for culturing gastric organoids because it can form

상기 배양은 적합한 조건에서 세포를 유지 및 성장시키는 과정을 의미하며, 적합한 조건은 예컨대, 세포가 유지되는 온도, 영양소 가용성, 대기 CO2 함량 및 세포 밀도를 의미할 수 있다.The culture refers to a process of maintaining and growing cells under suitable conditions, and suitable conditions may refer to, for example, a temperature at which cells are maintained, nutrient availability, atmospheric CO2 content, and cell density.

서로 다른 유형의 세포를 유지, 증식, 확대 및 분화시키기 위한 적절한 배양 조건은 당해 기술분야에 공지되어 있고, 문서화 되어있다. 상기 오가노이드 형성에 적합한 조건은 세포 분화 및 다세포 구조의 형성을 용이하게 하거나 허용하는 조건일 수 있다.Appropriate culture conditions for maintaining, proliferating, expanding and differentiating different types of cells are known and documented in the art. Conditions suitable for the formation of the organoid may be conditions that facilitate or allow cell differentiation and formation of multicellular structures.

본 발명에서 개발된 탈세포 위 조직 유래 인공 지지체는 기존의 대표적인 오가노이드 배양용 지지체인 매트리젤이 가지고 있는 한계를 극복한 새로운 위 오가노이드 배양 지지체로서 개발되어, 위 오가노이드 기반의 대규모 신약 스크리닝 플랫폼이나 조직 재생을 위한 세포 치료제 등 다양한 전임상, 임상 연구의 요소 기술로 활용되어 산업적, 경제적 측면에서 고부가가치를 창출하고 의료 신산업의 발전을 도모할 수 있을 것으로 기대된다.The decellularized gastric tissue-derived scaffold developed in the present invention has been developed as a new gastric organoid culture scaffold that overcomes the limitations of Matrigel, a representative organoid culture support, and is a large-scale drug screening platform based on gastric organoids. However, it is expected to be used as a component technology for various preclinical and clinical studies, such as cell therapy for tissue regeneration, to create high added value in industrial and economic terms and to promote the development of new medical industries.

탈세포 위 조직 유래 인공 매트릭스 지지체는 다양한 난치성 위 질환 (위궤양, 위암 등)을 체외에서 구현하고 그 기전을 밝히는 질병 모델링 연구 및 이식 치료 플랫폼 구축 등 다양한 분야에서 광범위하게 이용 가능할 것으로 기대된다. 이러한 난치성 위질환은 최근 유병률이 크게 증가하여 많은 연구가 필요한 상황이므로 연구용 시약으로서도 수익 창출이 가능하다. 또한, 위 조직 특이적 세포외기질 미세환경 내에서 위 오가노이드와 감염균 (예; 헬리코박터 파이로리)과의 공배양과 연계하여 최근 크게 각광받고 있으나 실질적인 연구가 어려웠던 기초 연구에도 활용될 수 있으므로 무궁한 응용 가능성을 가질 것으로 기대한다. Decellularized gastric tissue-derived artificial matrix scaffolds are expected to be widely used in various fields, such as disease modeling research that implements various intractable gastric diseases (gastric ulcer, gastric cancer, etc.) in vitro and elucidates the mechanism, and establishment of a transplant treatment platform. Since the prevalence of such intractable gastric diseases has increased significantly in recent years, many studies are required, so it is possible to generate profits as a research reagent. In addition, in connection with the co-culture of gastric organoids and infectious bacteria (eg, Helicobacter pylori) in the gastric tissue-specific extracellular matrix microenvironment, it has been receiving a lot of attention recently, but since it can be used in basic research where practical research has been difficult, it has endless application potential. expect to have

본 발명에서 개발된 인공 지지체는 조직 줄기세포 유래 위 오가노이드 뿐 아니라 위암 유래 오가노이드 배양에도 적용이 가능하므로 난치성 질환 및 암 환자 맞춤형 질환 모델 구축에 기여하여 정밀의학 플랫폼 기술로서도 활용될 수 있으며 최근 급증하는 정밀의학 시장의 규모를 고려하면 막대한 부가가치 창출이 가능할 것으로 기대된다.The artificial scaffold developed in the present invention can be applied not only to tissue stem cell-derived gastric organoids but also to gastric cancer-derived organoid culture. Considering the size of the precision medicine market, it is expected that enormous added value will be created.

종합적으로 위에서 기술했듯이 위 오가노이드의 응용을 위해서는 기본적으로 매트리젤이라는 배양용 지지체가 필수적으로 요구된다. 매트리젤과 비교하여 본 발명에서 개발된 인공 지지체는 배양 시스템으로서 매트리젤 이상의 기능성을 보여주며 보다 안전하고 비용적인 측면에서도 매우 유리한 장점을 가지고 있음이 검증된다. 따라서 이러한 매트리젤 대체 효과만으로도 막대한 경제적 수익 창출이 예측된다.Overall, as described above, for the application of the above organoids, a support for culture called Matrigel is essentially required. Compared to Matrigel, the artificial scaffold developed in the present invention is verified to have a very advantageous advantage in terms of safety and cost, showing more functionality than Matrigel as a culture system. Therefore, it is predicted that huge economic profits will be created only by the replacement effect of Matrigel.

도 1은 위 오가노이드 배양을 위한 탈세포 위 조직 유래 지지체 (Stomach Extracellular Matrix; SEM) 제작을 나타낸 것이다.
도 2는 제작한 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)의 특성을 분석한 것이다.
도 3은 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)의 농도에 따른 물성을 분석한 것이다.
도 4 및 5는 위 조직의 탈세포 방법을 비교 분석한 결과이다.
도 6은 위 조직의 탈세포 방법에 따른 위 오가노이드 배양 양상의 비교한 결과이다.
도 7은 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)의 단백체를 분석한 것이다.
도 8 및 9은 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)의 matrisome 단백질 종류 및 정량 분석한 결과이다.
도 10은 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)의 non-matrisome 단백질을 분석한 결과이다.
도 11은 위 오가노이드 배양에 최적의 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체의 농도를 선정한 것이다.
도 12는 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체의 농도에 따른 위 오가노이드 배양 양상을 비교한 것이다.
도 13은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체와 기존의 배양 지지체(매트리젤)에서 형성된 위 오가노이드 성장을 비교한 것이다.
도 14은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체와 기존의 배양 지지체(매트리젤)에서 형성된 위 오가노이드를 비교한 것이다.
도 15는 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체와 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드 산 분비 기능을 비교 분석한 것이다.
도 16은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체와 매트리젤의 혼합을 통한 위 오가노이드 분화 증진 효과를 나타낸 것이다.
도 17은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체와 매트리젤의 혼합을 통한 위 오가노이드 기능 증진 효과를 나타낸 것이다.
도 18은 위 오가노이드 배양을 위한 탈세포 위 조직 유래 지지체의 조직 특이적 효과를 확인한 것이다.
도 19는 피부 조직과 위 조직 사이의 세포외기질 성분 차이를 확인한 결과이다.
도 20은 탈세포 위 조직 유래 지지체의 조직 연령에 따른 세포외기질 성분 차이를 분석한 결과이다.
도 21은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 위 오가노이드 장기 배양을 위한 배양액 조건 최적화를 나타낸 것이다.
도 22는 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 위 오가노이드 장기 배양을 나타낸 것이다.
도 23 및 24는 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용해서 배양한 위 오가노이드의 전사체(transcriptome) 발현을 분석한 것이다.
도 25은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 위 오가노이드 생체 내 이식을 나타낸 것이다.
도 26 및 27은 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤의 장기 보관 가능성을 검증한 것이다.
도 28는 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체를 이용한 위암 오가노이드 배양을 나타낸 것이다.
도 29는 미세유체 디바이스와 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤을 이용한 위 오가노이드의 대량 배양 가능성 확인한 결과이다.1 shows the fabrication of a decellular gastric tissue-derived scaffold (Stomach Extracellular Matrix; SEM) for culturing gastric organoids.
2 is an analysis of the characteristics of the prepared decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM).
3 is an analysis of physical properties according to the concentration of the decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM).
4 and 5 are results of comparative analysis of the decellularization method of gastric tissue.
6 is a comparison result of gastric organoid culture according to the decellularization method of gastric tissue.
7 is an analysis of the proteomic of the decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM).
8 and 9 show the types and quantitative analysis of matrisome proteins of the decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM).
10 is a result of analyzing the non-matrisome protein of the decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM).
11 shows the optimal concentration of decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffolds for gastric organoid culture.
12 is a comparison of gastric organoid culture patterns according to the concentration of the decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold.
13 is a comparison of the growth of gastric organoids formed on a decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold and a conventional culture scaffold (Matrigel).
14 is a comparison of the gastric organoids formed from a decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold and a conventional culture scaffold (Matrigel).
15 is a comparative analysis of the gastric organoid acid secretion function cultured in the decellularized gastric tissue-derived hydrogel support and Matrigel.
Figure 16 shows the effect of promoting differentiation of gastric organoids through the mixing of the decellularized gastric tissue-derived hydrogel support and Matrigel.
17 shows the effect of enhancing gastric organoid function by mixing the decellularized gastric tissue-derived hydrogel support and Matrigel.
Figure 18 confirms the tissue-specific effect of the decellularized gastric tissue-derived scaffold for culturing gastric organoids.
19 is a result of confirming the difference in the extracellular matrix component between the skin tissue and the gastric tissue.
20 is a result of analyzing the difference in the extracellular matrix component according to the tissue age of the decellularized gastric tissue-derived scaffold.
21 shows the optimization of the culture medium for long-term culture of gastric organoids on decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffolds.
22 shows a gastric organoid culture using a hydrogel scaffold derived from decellularized gastric tissue.
23 and 24 are analysis of transcriptome expression of gastric organoids cultured using a hydrogel scaffold derived from decellularized gastric tissue.
25 shows transplantation of gastric organoids in vivo using decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffolds.
26 and 27 verify the long-term storage possibility of decellularized gastric tissue-derived hydrogels.
28 shows gastric cancer organoid culture using decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffolds.
29 is a result confirming the possibility of mass culture of gastric organoids using a microfluidic device and decellularized gastric tissue-derived hydrogel.

본 발명에서는 위 조직에 간단한 화학적 처리를 통해서, 대량의 탈세포 지지체를 제작할 수 있는 방법을 구축하였고 제작된 탈세포 위 조직 매트릭스를 위 오가노이드 배양에 이용한다. In the present invention, a method for preparing a large amount of decellularized scaffold through simple chemical treatment of gastric tissue was constructed, and the prepared decellularized gastric tissue matrix is used for culturing gastric organoids.

본 발명에서 개발된 탈세포 지지체가 세포 성분은 모두 제거되고, 위 조직에 함유된 다양한 세포외기질 및 성장인자들을 함유하고 있는 것을 확인하여, 위 오가노이드 배양을 위한 최적의 삼차원 미세환경을 제공해 줄 수 있음을 확인하였다.By confirming that the decellular scaffold developed in the present invention contains various extracellular matrices and growth factors contained in gastric tissue, all cellular components are removed, it will provide an optimal three-dimensional microenvironment for culturing gastric organoids. It was confirmed that it is possible.

개발된 탈세포 위 조직 유래의 하이드로젤 지지체 내에서 위 오가노이드가 발생하고 성장함을 확인하였고, 위 오가노이드 배양에 효율적으로 이용하기 위해 탈세포 지지체를 다양한 농도로 시험하여 위 오가노이드 배양에 최적화된 농도를 선별하였다.It was confirmed that gastric organoids were generated and grown in the developed decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold. In order to efficiently use the developed gastric organoid culture, the decellularized scaffold was tested at various concentrations and optimized for gastric organoid culture. The concentration was selected.

개발된 탈세포 지지체와 대조군인 매트리젤에서 비슷한 양상으로 위 오가노이드를 배양할 수 있고 다양한 위 조직 세포로의 분화도 이루어지는 것을 확인하였다. 이를 통해서, 탈세포 지지체를 매트리젤의 대체제로서 이용할 수 있는 가능성을 확인하였다. 또한, 필요시 매트리젤과의 적절한 배합을 통해 오가노이드 분화를 더욱 증진시킬 수 있는 조건을 찾아내었다. 이는 본 발명에서 개발된 지지체에서 배양된 위 오가노이드가 기존의 오가노이드 보다 더욱 실제 위 조직 구조 및 기능을 잘 모사할 수 있는 가능성을 보여준다.It was confirmed that gastric organoids could be cultured in a similar manner in the developed decellular support and Matrigel as a control, and differentiation into various gastric tissue cells was also made. Through this, the possibility of using the decellular support as an alternative to Matrigel was confirmed. In addition, conditions that can further enhance organoid differentiation were found through appropriate mixing with Matrigel, if necessary. This shows the possibility that the gastric organoid cultured on the scaffold developed in the present invention can better mimic the actual gastric tissue structure and function than the existing organoids.

본 발명에서 개발된 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체에 의한 오가노이드 분화 증진 효과뿐만 아니라 산 분비 기능 증진 효과도 확인하였다. 이를 통해 기존의 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드의 한계를 넘어 분화와 기능이 모두 증진된 위 오가노이드를 생산할 수 있는 배양 기술을 구축하였다. 장기 배양 동안에도 오가노이드의 줄기세포능 (stemness)이 매트리젤 조건과 비교하여 비슷한 수준으로 유지되는 것을 확인하였다.The effect of enhancing the organoid differentiation as well as the acid secretion function was confirmed by the decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold developed in the present invention. Through this, we established a culture technology capable of producing gastric organoids with enhanced differentiation and function beyond the limitations of the existing gastric organoids cultured in Matrigel. It was confirmed that even during long-term culture, the organoid stemness was maintained at a similar level compared to the Matrigel condition.

본 발명에서 개발한 탈세포 지지체의 조직 특이적인 효과를 확인하기 위해, 위, 장, 피부, 림프, 심장, 근육 유래의 탈세포 지지체에서 각각 위 오가노이드를 배양하고 비교하였다. 피부, 림프, 심장, 근육 같은 다른 조직 유래 탈세포 지지체에 비해 탈세포 위 조직 유래 지지체에서 배양된 위 오가노이드의 형성 효율 및 줄기세포 관련 유전자 발현이 가장 우수한 것을 관찰하여 개발된 지지체가 조직 특이적 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다. In order to confirm the tissue-specific effect of the decellularized scaffolds developed in the present invention, gastric organoids were cultured and compared in decellularized scaffolds derived from stomach, intestine, skin, lymph, heart, and muscle, respectively. The scaffold developed by observing that the formation efficiency of gastric organoids and stem cell-related gene expression cultured on the scaffolds derived from acellular gastric tissue was the best compared to the scaffolds derived from other tissues such as skin, lymph, heart, and muscle. It has been confirmed that this may have an impact.

본 발명에서 생쥐에서 위궤양 모델을 제작하여 탈세포 지지체를 이용하여 위 오가노이드를 이식하였을 때 위 조직에 생착이 되어 이식이 가능함을 확인하였고, 따라서 탈세포 지지체의 이식용 소재로서의 높은 활용 가능성도 확인하였다.In the present invention, when a gastric ulcer model was produced in a mouse and transplanted with a gastric organoid using a decellularized scaffold, it was confirmed that it was engrafted in the gastric tissue and could be transplanted. did.

본 발명에서 탈세포 지지체를 냉장 및 냉동 상태에서 장기간 보관한 뒤, 위 오가노이드 배양에 이용했을 때 새롭게 제작한 지지체와 비교하여 유사한 수준으로 위 오가노이드 형성이 가능하다는 것을 검증하였다. 이는 개발된 지지체의 장기 보관 가능성 및 안정성을 보여주는 결과로서 추후 탈세포 지지체의 상용화 및 산업화 가능성이 높음을 시사한다. In the present invention, it was verified that gastric organoid formation was possible at a similar level compared to the newly prepared scaffold when the decellularized scaffold was stored for a long time in refrigerated and frozen conditions and then used for gastric organoid culture. This is a result showing the long-term storage potential and stability of the developed scaffold, suggesting a high possibility of commercialization and industrialization of the decellularized scaffold in the future.

본 발명에서 탈세포 지지체를 이용해 줄기세포 유래 오가노이드 뿐 아니라 위암 오가노이드도 성공적으로 배양 가능함을 확인하였다. 따라서 추후 개인 맞춤형 체외 암 모델로서 적용하여 항암 약물 스크리닝 및 신약 개발에도 적용 가능한 고도화된 배양 요소 기술로서도 높은 활용도를 가진다. In the present invention, it was confirmed that not only stem cell-derived organoids but also gastric cancer organoids can be successfully cultured using the decellular support. Therefore, it has high utility as an advanced culture element technology that can be applied as a personalized in vitro cancer model in the future to be applied to anticancer drug screening and new drug development.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, preferred examples are presented to help the understanding of the present invention. However, the following examples are only provided for easier understanding of the present invention, and the contents of the present invention are not limited by the following examples.

실시예 1: 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물의 제조Example 1: Preparation of scaffold composition containing extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물을 다음과 같이 제조하였다 (도 1 (A) 참고).A scaffold composition including an extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue was prepared as follows (refer to FIG. 1 (A)).

실시예 1-1. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질 (Stomach Extracellular Matrix; SEM)의 제조 Example 1-1. Preparation of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (Stomach Extracellular Matrix; SEM)

돼지 위 조직 분리하고 세절하여 준비하였고, 상기 위 조직을 1% Triton X-100 및 0.1% 수산화 암모늄(ammonium hydroxide)과 함께 교반하여 위 조직의 세포만을 제거하여 탈세포 위 조직을 제조하였다. Pig gastric tissue was isolated and minced, and the gastric tissue was stirred with 1% Triton X-100 and 0.1% ammonium hydroxide to remove only the cells of the gastric tissue to prepare a decellularized gastric tissue.

이후, 탈세포 위 조직을 동결건조, 분쇄하여 탈세포 위 조직 유래 세포외기질 (Stomach Extracellular Matrix; SEM)을 제조하였다. Thereafter, the decellularized gastric tissue was lyophilized and pulverized to prepare a decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (Stomach Extracellular Matrix; SEM).

실시예 1-2. 지지체 조성물의 제조Example 1-2. Preparation of the support composition

상기 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 10 mg을 4 mg/ml 펩신 용액 (돼지 위 점막 유래 펩신 파우더 4 mg를 0.02 M HCl 1 ml에 녹인 용액)에 48시간 동안 용해시킨다. 10X PBS와 1 M NaOH를 이용하여 중성 pH와 1X PBS 버퍼의 전해질 상태로 균일하게 섞은 후 37℃의 온도에서 30분 동안 겔화(gelation)시켜 하이드로젤 형태의 지지체 조성물을 제조하였다 (도 1 (B)). 10 mg of the decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix is dissolved in a 4 mg/ml pepsin solution (a solution of 4 mg of pepsin powder derived from porcine gastric mucosa in 1 ml of 0.02 M HCl) for 48 hours. After uniformly mixing in an electrolyte state of neutral pH and 1X PBS buffer using 10X PBS and 1 M NaOH, gelation was performed at 37° C. for 30 minutes to prepare a hydrogel-type support composition (FIG. 1 (B) )).

실험예 1: 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 분석Experimental Example 1: Analysis of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

실시예 1-1.의 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 아래와 같이 분석하였다.The extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue of Example 1-1 was analyzed as follows.

실험예 1-1. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 특성 분석Experimental Example 1-1. Characterization of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

실시예 1-1.의 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 특성을 분석하였다. The characteristics of the extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue of Example 1-1 were analyzed.

제작한 탈세포 위 조직 유래 세포외기질 (SEM) 지지체에서 세포가 충분히 제거되었는지 확인하기 위해 탈세포 과정 전후의 DNA양을 비교하고, 세포외기질(Extracellular matrix) 성분들은 남아있는지 확인하기 위해 대표적인 세포외기질 성분인 Glycosaminoglycans(GAG)양을 정량 비교한 결과, 탈세포 과정 후 세포는 모두 제거되고, GAG는 실제 위 조직에서와 유사한 수준으로 유지되고 있는 것을 확인하였다 (도 2 (A)).In order to confirm that the cells are sufficiently removed from the prepared decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (SEM) scaffold, the amount of DNA before and after the decellularization process is compared, and to check whether the extracellular matrix components remain, representative cells As a result of quantitative comparison of the amount of Glycosaminoglycans (GAG), which is an external matrix component, it was confirmed that all cells were removed after the decellularization process, and GAG was maintained at a level similar to that in the actual gastric tissue (FIG. 2 (A)).

또한, 마찬가지로 탈세포 과정 후에 세포는 모두 제거되고 위 조직의 매트릭스 구조는 잘 유지되었는지 확인하기 위해 H&E 조직 염색을 통해 분석한 결과, 세포핵이 관찰되지 않았기에 세포가 대부분 제거된 것을 확인할 수 있었다 (도 2 (B)). Also, after the decellularization process, all cells were removed and the matrix structure of the gastric tissue was well maintained. 2 (B)).

한편, 전체적인 위 조직의 매트릭스 구조는 그대로 남아있는 것을 확인하기 위해 제작한 탈세포 위 조직 유래 지지체의 하이드로젤 형성 후 주사전자현미경(Scanning electron microscopy, SEM) 분석을 통해 하이드로젤 내부의 구조를 확인하였다. 그 결과, SEM 하이드로젤이 콜라겐 하이드로젤과 유사한 형태의 나노섬유 구조를 가지는 것을 관찰하여 위 오가노이드의 부착 및 성장에 적합한 내부 구조를 가지고 있음을 확인하였다 (도 2 (C)).On the other hand, to confirm that the matrix structure of the entire gastric tissue remains as it is, the structure inside the hydrogel was confirmed through scanning electron microscopy (SEM) analysis after the formation of the hydrogel of the decellularized gastric tissue-derived scaffold. . As a result, it was observed that the SEM hydrogel had a nanofiber structure similar to that of the collagen hydrogel, confirming that it had an internal structure suitable for the attachment and growth of the gastric organoids (Fig. 2 (C)).

실험예 1-2. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 농도별 특성 분석Experimental Example 1-2. Analysis of concentration-specific characteristics of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

실시예 1-1.의 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 농도별 특성을 분석하였다. The concentration-specific characteristics of the extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue of Example 1-1 were analyzed.

탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 농도별로 지지체 조성물을 이용하여 하이드로젤을 형성한 뒤 4가지 SEM 농도에 따른 물성 변화를 유변학 분석을 통해 측정하였다. After forming a hydrogel using a support composition for each concentration of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue, changes in physical properties according to the four SEM concentrations were measured through rheological analysis.

그 결과, 도 3에서 확인되는 바와 같이, 모든 농도 조건에서 storage modulus (G') 값이 loss modulus (G'') 값 보다 일관되게 높음을 확인함으로써 하이드로젤 내 가교를 통해 안정적인 고분자 네트워크가 형성됨을 확인하였다. SEM 농도가 증가할수록 기계적 물성(modulus)도 커지는 것을 확인하였다. As a result, as confirmed in FIG. 3, by confirming that the storage modulus (G') value is consistently higher than the loss modulus (G'') value in all concentration conditions, a stable polymer network is formed through crosslinking in the hydrogel. Confirmed. It was confirmed that as the SEM concentration increased, the mechanical properties (modulus) also increased.

실험예 1-3. 탈세포 조건별 비교 분석Experimental Example 1-3. Comparative analysis by decellularization condition

본 연구에서 확립한 탈세포 방법 (Protocol 1)과 기존 문헌에 보고된 바가 있는 탈세포 방법 (Protocol 2)을 비교하기 위한 실험을 수행하였다. An experiment was performed to compare the decellularization method established in this study (Protocol 1) and the decellularization method (Protocol 2) previously reported in the literature.

기존 문헌은 4% sodium deoxycholate (SDC)을 4시간 처리한 후 Dnase Ⅰ을 이용하여 DNA를 제거하였고, 본 연구에서는 조직 내 단백질의 손상을 최소화하기 위해 더 완화된 조건인 비이온성 1% Triton X-100과 0.1 % ammonium hydroxide를 혼합한 용액만을 사용하였다.In the existing literature, DNA was removed using Dnase I after 4% sodium deoxycholate (SDC) was treated for 4 hours, and in this study, nonionic 1% Triton X- Only a mixture of 100 and 0.1 % ammonium hydroxide was used.

그 결과, 탈세포 공정 후 남은 DNA의 양을 비교해 보았을 때 두 가지 프로토콜 모두 DNA가 성공적을 제거된 것을 확인하였으나, GAG 정량을 통해 남아있는 세포외기질 성분을 비교해보면 프로토콜 1로 처리된 조직에서는 GAG 성분이 잘 보존되어 있는 반면 프로토콜 2로 처리된 조직에는 남아있는 GAG 성분이 유의미하게 줄어든 것을 확인할 수 있다 (도 4 (a)).As a result, when comparing the amount of DNA remaining after the decellularization process, both protocols confirmed that DNA was successfully removed. While the components were well preserved, it can be seen that the remaining GAG components were significantly reduced in the tissue treated with protocol 2 (Fig. 4 (a)).

또한, 제작한 탈세포 매트릭스를 이용하여 하이드로젤을 제작한 후 기계적 물성 (modulus)을 측정하였다. 프로토콜 1로 제작한 하이드로젤의 물성이 유의미하게 높은 것을 확인하였다 (도 4(b)).In addition, mechanical properties (modulus) were measured after preparing a hydrogel using the prepared decellular matrix. It was confirmed that the physical properties of the hydrogel prepared in Protocol 1 were significantly high (Fig. 4(b)).

H&E 조직학 분석으로 비교해본 결과, 두 방법 모두 세포는 잘 제거되었으나 프로토콜 1에서 세포외기질 성분들이 더욱 잘 보존되어 있는 것을 확인하였다 (도 4 (c)).As a result of comparison by H&E histological analysis, it was confirmed that cells were well removed in both methods, but the extracellular matrix components were more well preserved in protocol 1 (FIG. 4 (c)).

탈세포 방법으로 제작된 매트릭스의 단백체 (proteomics) 분석을 실시하였다. 프로토콜 1이 프로토콜 2에 비해 더 많은 개수의 위 조직 특이적 세포외기질 단백질을 보존하는데 효과적임을 확인하였다 (도 4 (d)).Proteomics analysis of the matrix prepared by the decellularization method was performed. It was confirmed that protocol 1 was effective in preserving a greater number of gastric tissue-specific extracellular matrix proteins compared to protocol 2 (Fig. 4 (d)).

이를 통해 본 연구에서 확립한 탈세포 프로토콜이 기존의 방법보다 위 조직의 세포외기질 성분을 더욱 잘 보존할 수 있으며, 따라서 위 오가노이드 배양에 더욱 유리하게 작용할 수 있을 것으로 예측할 수 있다.Through this, it can be predicted that the decellularization protocol established in this study can preserve the extracellular matrix component of gastric tissue better than the conventional method, and thus can act more favorably for gastric organoid culture.

한편, 본 연구에서 확립한 탈세포 방법 (Protocol 1)과 기존에 많이 쓰이는 탈세포 방법 (Protocol 3)을 비교하기 위한 실험을 수행하였다.Meanwhile, an experiment was performed to compare the decellularization method established in this study (Protocol 1) and the conventional decellularization method (Protocol 3).

구체적으로, 프로토콜 3는 본 연구에서 확립한 탈세포 프로토콜 1에 탈세포 시약으로 많이 쓰이는 3% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 추가로 24시간 처리한 프로토콜이다. Specifically, protocol 3 is a protocol in which 3% sodium dodecyl sulfate (SDS), which is widely used as a decellularization reagent, was added to the decellularization protocol 1 established in this study for 24 hours.

그 결과, 탈세포 공정 후 남은 DNA의 양을 비교해 보았을 때 두 가지 프로토콜 모두 DNA가 성공적을 제거된 것을 확인하였으나, GAG 정량을 통해 남아있는 세포외기질 성분을 비교해보면 프로토콜 3으로 처리된 조직에서는 남아있는 GAG 성분이 유의미하게 감소된 것을 확인할 수 있다 (도 5(a))As a result, when comparing the amount of DNA remaining after the decellularization process, both protocols confirmed that the DNA was successfully removed, but comparing the remaining extracellular matrix components through GAG quantification, It can be seen that the GAG component is significantly reduced (Fig. 5 (a))

또한, 제작한 탈세포 매트릭스를 이용하여 하이드로젤을 제작한 후 기계적 물성 (modulus)을 측정하였고, 각 프로토콜로 제작한 하이드로젤의 물성은 큰 차이가 없는 것을 확인하였다 (도 5 (b)).In addition, the mechanical properties (modulus) were measured after the hydrogel was prepared using the decellularized matrix, and it was confirmed that there was no significant difference in the physical properties of the hydrogel prepared by each protocol (FIG. 5 (b)).

H&E 조직학 분석으로 비교해본 결과, 두 방법 모두 세포는 잘 제거되었으나 프로토콜 1에서 세포외기질 성분들이 더욱 잘 보존되어있는 것을 확인하였다 (도 5 (c))As a result of comparison by H&E histological analysis, it was confirmed that cells were well removed in both methods, but the extracellular matrix components were more well preserved in protocol 1 (Fig. 5 (c))

각 탈세포 방법으로 제작된 매트릭스의 단백체 (proteomics) 분석을 실시하였고, 그 결과 프로토콜 1이 프로토콜 3에 비해 더 많은 개수의 위 조직 특이적 세포외기질 단백질을 보존하는데 효과적임을 확인하였다 (도 5(d))Proteomics analysis of the matrix prepared by each decellularization method was performed, and as a result, it was confirmed that protocol 1 was effective in preserving a greater number of gastric tissue-specific extracellular matrix proteins compared to protocol 3 (Fig. d))

이를 통해 본 연구에서 확립한 탈세포 프로토콜이 SDS 시약을 사용하는 방법보다 위 조직의 세포외기질 성분을 더 잘 보존할 수 있으며, 따라서 위 오가노이드 배양에 더욱 유리하게 작용할 수 있을 것을 예측할 수 있다.Through this, it can be predicted that the decellularization protocol established in this study can better preserve the extracellular matrix component of gastric tissue than the method using SDS reagent, and thus can act more favorably for gastric organoid culture.

실험예 1-4. 탈세포 조건별 위 오가노이드 배양 양상 차이 확인Experimental Example 1-4. Confirmation of differences in gastric organoid culture patterns by decellularization conditions

위 오가노이드 배양 매트릭스 제작을 위한 탈세포 공정에 있어 본 연구에서 확립한 탈세포 방법 (Protocol 1)과 기존에 많이 쓰이는 탈세포 방법 (Protocol 3)을 비교하기 위한 실험을 진행하였다. An experiment was conducted to compare the decellularization method established in this study (Protocol 1) and the conventionally used decellularization method (Protocol 3) in the decellularization process for the preparation of the above organoid culture matrix.

구체적으로, 각 프로토콜로 제작된 탈세포 매트릭스 하이드로젤에 위 오가노이드를 배양하여 형성 효율 및 유전자 발현을 분석하였다. Specifically, formation efficiency and gene expression were analyzed by culturing gastric organoids on decellular matrix hydrogels prepared by each protocol.

그 결과, 배양 5일차의 오가노이드 형태 분석을 통해, 프로토콜 1로 제작한 탈세포 매트릭스에서 배양된 위 오가노이드가 프로토콜 3으로 제작한 오가노이드 보다 더욱 크기가 크고 구형 구조를 잘 유지하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 형성효율을 정량해본 결과, 프로토콜 1이 유의미하게 높은 것을 확인하였다 (도 6 (a)).As a result, through the organoid morphology analysis on the 5th day of culture, it was confirmed that the gastric organoids cultured in the decellular matrix prepared in Protocol 1 were larger in size than the organoids prepared in Protocol 3 and well maintained the spherical structure. did. In addition, as a result of quantifying the formation efficiency, it was confirmed that Protocol 1 was significantly higher (FIG. 6 (a)).

배양 5일차에 정량적 qPCR 실험을 통해 줄기세포능 (stemness)에 중요한 Lgr5 유전자 발현을 비교해 보았을 때, 프로토콜 1로 제작된 탈세포 위 조직 유래 매트릭스에서 형성된 위 오가노이드가 유의미하게 높은 발현을 보이는 것을 확인하였다 (도 6 (b)).When comparing the expression of the Lgr5 gene, which is important for stemness, through quantitative qPCR experiment on the 5th day of culture, it was confirmed that gastric organoids formed in the decellularized gastric tissue-derived matrix prepared in Protocol 1 showed significantly high expression. (Fig. 6(b)).

이를 통해 본 연구에서 확립한 탈세포 프로토콜이 기존의 방법보다 위 오가노이드 배양에 더욱 적합한 것을 검증하였다.Through this, it was verified that the decellularization protocol established in this study was more suitable for gastric organoid culture than the existing method.

실험예 1-5. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질(SEM)의 단백체 분석Experimental Example 1-5. Proteomic analysis of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (SEM)

제작한 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)은 실제 위 조직 내에 존재하는 다양한 위 조직 특이적 단백질들을 포함하고 있다. 따라서 세부적인 구성 성분들을 파악하기 위해 SEM 지지체에 대한 proteomics 분석을 실시하여 다양한 세포외기질 관련 단백질들(glycoproteins, proteoglycans, collagens, secreted factor 등)이 탈세포 매트릭스에 포함되어 있는 것을 확인하였다.The fabricated decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM) contains various gastric tissue-specific proteins present in actual gastric tissue. Therefore, proteomics analysis was performed on the SEM scaffold to identify detailed components, and it was confirmed that various extracellular matrix-related proteins (glycoproteins, proteoglycans, collagens, secreted factor, etc.) were included in the decellular matrix.

그 결과, 도 7에서 확인된 바와 같이, 제작한 탈세포 위 조직 유래 지지체(SEM)은 실제 위 조직 내에 존재하는 다양한 위 조직 특이적 단백질들을 포함하고 있었다. 4개의 다른 조직 배치 유래의 SEM 샘플을 분석하였을 때 이러한 세포외기질 성분들은 공통적으로 거의 유사하게 관찰이 되었다. 따라서 탈세포 공정을 거친 SEM 하이드로젤 지지체를 이용한 배양을 통해 균일한 수준의 위 오가노이드 생산이 가능할 것을 유추할 수 있다.As a result, as confirmed in FIG. 7 , the prepared decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM) contained various gastric tissue-specific proteins present in actual gastric tissue. When SEM samples from four different tissue batches were analyzed, these extracellular matrix components were observed to be almost similar in common. Therefore, it can be inferred that a uniform level of gastric organoid production is possible through culture using the SEM hydrogel scaffold that has undergone the decellularization process.

실험예 1-6. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 단백질 종류 및 정량 분석Experimental Example 1-6. Protein type and quantitative analysis of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

본 발명의 세포외기질의 단백질 종류 및 정량 분석하였다. Protein types and quantitative analysis of the extracellular matrix of the present invention.

구체적으로, 탈세포 위 조직을 lysis buffer [4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), and 1X protease inhibitor]를 이용하여 용액화 한 뒤, 단백질 성분들을 추출하여 펩타이드 수준으로 분해하였다. 그 후 질량 분석기 (mass spectrometer)와 MaxQuant 소프트웨어를 이용하여, 펩타이드의 종류와 상대적인 값을 검출하였다. 이후 기존 라이브러리를 이용하여 matrisome 등 상세 분류를 진행하였다.Specifically, the decellularized gastric tissue was lysed using a lysis buffer [4% sodium dodecyl sulfate (SDS), 0.1 M Tris-HCl (pH 7.6), and 1X protease inhibitor], and protein components were extracted to reduce the peptide level. decomposed into Then, the type and relative value of the peptide were detected using a mass spectrometer and MaxQuant software. After that, detailed classification such as matrisome was performed using the existing library.

그 결과, 매트리젤 및 SEM에 포함된 matrisome 단백질들을 단백체 분석을 통해 검출하여 종류별로 분류함. SEM에서 검출된 matrisome 단백질의 개수가 매트리젤 보다 많은 것을 확인할 수 있다 (도 8 (a)).As a result, the matrisome proteins included in Matrigel and SEM were detected through proteomic analysis and classified by type. It can be confirmed that the number of matrisome proteins detected by SEM is greater than that of matrigel (FIG. 8 (a)).

또한, 매트리젤 및 SEM을 구성하고 있는 matrisome 단백질들의 상대적인 정량 분석을 진행하여 이를 수치로 나타낸 결과, 매트리젤은 96% 이상의 glycoproteins으로 구성되어 있음을 확인할 수 있고, SEM은 collagens 40%, proteoglycans 35%, glycoproteins 15% 정도로 각 matrisome 단백질들이 고르게 분포하고 있는 것을 확인하였다 (도 8 (b)).In addition, as a result of numerically expressing the relative quantitative analysis of the matrisome proteins constituting Matrigel and SEM, it can be confirmed that Matrigel is composed of more than 96% glycoproteins, and SEM is 40% collagens and 35% proteoglycans , it was confirmed that each matrisome protein was evenly distributed to about 15% of the glycoproteins (Fig. 8 (b)).

따라서 SEM 지지체가 기존 매트리젤과 비교하여 훨씬 다양한 종류의 세포외기질 성분들을 포함하고 있기 때문에 위 오가노이드 배양에 보다 적합한 미세환경을 제공해 줄 수 있을 것으로 기대할 수 있다.Therefore, it can be expected that the SEM scaffold can provide a more suitable microenvironment for culturing gastric organoids because it contains a much more diverse type of extracellular matrix components compared to the existing Matrigel.

상기 matrisome 단백체 데이터에 대해서 상대 정량 분석을 실시한 결과, 매트리젤의 경우 95% 이상 대부분의 단백질이 glycoproteins으로 이루어진 것을 확인할 수 있고, 가장 많이 포함되어 있는 10가지 matrisome 단백질들을 확인해 보았을 때에도 대표적인 glycoprotein인 laminin이 굉장히 높은 비율을 차지하고 있는 것을 확인하였다. 그리고 실제 위 조직에 특이적으로 많이 발현된다고 알려진 단백질들은 한 개도 검출되지 않았다 (도 9 (a)).As a result of relative quantitative analysis of the matrisome proteomic data, it was confirmed that more than 95% of the proteins in Matrigel were composed of glycoproteins. It was found that a very high percentage was occupied. And, in fact, none of the proteins that are known to be highly expressed specifically in gastric tissue were detected (FIG. 9 (a)).

마찬가지로 SEM에 포함되어 있는 matrisome 단백질들의 상대 정량 분석을 실시하였을 때, SEM에는 collagens, proteoglycans, glycoproteins 순으로 matrisome 단백질들이 많이 함유되어 있고 골고루 분포하고 있는 것을 확인하였다. 또한, 가장 많이 포함되어 있는 10가지 matrisome 단백질들을 살펴보았을 때, 매트리젤과 달리 콜라겐이 굉장히 많이 존재하는 것을 확인하였다. 그리고 SEM에서 실제 위 조직에 특이적으로 많이 발현된다고 알려진 non-matrisome 단백질들이 5종류가 검출되었다. 이러한 위 조직 특이적 성분들도 위 오가노이드 성장 및 발달에 긍정적인 영향을 미칠 것으로 기대된다 (도 9 (b)). Similarly, when the relative quantitative analysis of the matrisome proteins included in the SEM was performed, it was confirmed that the SEM contained a lot of matrisome proteins in the order of collagens, proteoglycans, and glycoproteins and that they were evenly distributed. In addition, when looking at the 10 types of matrisome proteins that contain the most, it was confirmed that collagen was present very much, unlike Matrigel. In addition, 5 types of non-matrisome proteins known to be highly expressed in actual gastric tissue were detected by SEM. These gastric tissue-specific components are also expected to have a positive effect on gastric organoid growth and development (FIG. 9 (b)).

따라서, 이러한 단백체 구성을 가진 SEM 지지체가 기존의 매트리젤 보다 위 오가노이드 배양에 더욱 적합한 하이드로젤로 적용될 수 있을 것으로 기대할 수 있다.Therefore, it can be expected that the SEM scaffold with this proteomic composition can be applied as a hydrogel more suitable for gastric organoid culture than the conventional Matrigel.

실험예 1-7. 탈세포 위 조직 내의 non-matrisome 단백질 분석Experimental Example 1-7. Analysis of non-matrisome proteins in decellular gastric tissue

본 발명의 탈세포 위 조직 내에 포함된 non-matrisome 단백질을 매트리젤과 비교 분석하였다. The non-matrisome protein contained in the decellularized gastric tissue of the present invention was compared and analyzed with Matrigel.

그 결과, 도 10에서 확인된 바와 같이, 매트리젤은 대부분의 구성 단백질이 matrisome 단백질인 것을 확인하였고, 이 중 matrisome 단백질이 아닌 non-matrisome 단백질들을 GOBP (gene ontology biological process) 방법으로 분석하여, 어떠한 biological process와 관련된 단백질들이 많이 포함되어 있는지 분석하여 비교하였다. 매트리젤은 번역 (translation) 또는 대사 관련 단백질들을 많이 함유하고 있는 것으로 확인되었다 (도 10 (a)).As a result, as confirmed in FIG. 10, Matrigel confirmed that most of the constituent proteins were matrisome proteins, and among them, non-matrisome proteins, not matrisome proteins, were analyzed by the GOBP (gene ontology biological process) method, and any We analyzed and compared whether a lot of proteins related to biological processes were included. Matrigel was confirmed to contain a lot of translation or metabolism-related proteins (Fig. 10 (a)).

SEM에는 non-matrisome 단백질들을 비교적 더 많이 함유하고 있음을 확인하였다. 이러한 단백질들의 역할을 GOBP 방법으로 분석해본 결과, 세포 기관 조직 (organelle organization), 세포 골격 조직 (cytoskeleton organization) 등 세포와 조직의 형성에 관련된 단백질들을 특히 많이 함유하고 있는 것을 확인하였다 (도 10 (b)).It was confirmed that the SEM contained relatively more non-matrisome proteins. As a result of analyzing the roles of these proteins by the GOBP method, it was confirmed that they particularly contain a large amount of proteins related to the formation of cells and tissues, such as organelle organization and cytoskeleton organization (Fig. 10 (b) )).

따라서, 이러한 non-matrisome 단백질들을 포함하고 있는 SEM 지지체가 기존의 매트리젤 보다 위 오가노이드 배양에 더욱 적합한 하이드로젤로 적용될 수 있을 것으로 기대된다.Therefore, it is expected that the SEM scaffold containing these non-matrisome proteins can be applied as a hydrogel more suitable for gastric organoid culture than the conventional Matrisome.

실험예 2: 탈세포 위 조직 유래 세포외기질을 포함한 지지체 조성물의 분석Experimental Example 2: Analysis of scaffold composition including extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

실험예 2-1. 지지체 조성물 내 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 최적 농도 선정Experimental Example 2-1. Selection of the optimal concentration of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue in the support composition

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)과 관련하여 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 최적농도를 선정하였다. With respect to the support composition (hydrogel) prepared in Example 1-2., the optimal concentration of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue was selected.

구체적으로, 탈세포 위 조직 유래 지지체를 오가노이드 배양에 적용할 때 가장 최적의 하이드로젤 농도를 선정하기 위해 SEM 농도 별 (1, 3, 5, 및 7 mg/mL)로 하이드로젤을 제작하고 위 오가노이드를 배양하였다. 생쥐의 위 조직으로부터 가장 기능적인 단위체인 위샘 (stomach gland) 조직을 추출하고 이를 각 하이드로젤 내에서 삼차원 배양하여 위 오가노이드를 형성을 유도하였다. 배양 5일차에 각 SEM 농도 조건에서 형성된 위 오가노이드의 형태와 형성 효율을 매트리젤에서 형성된 위 오가노이드와 비교하였다. Specifically, to select the most optimal hydrogel concentration when decellularized gastric tissue-derived scaffolds are applied to organoid culture, hydrogels were prepared with each SEM concentration (1, 3, 5, and 7 mg/mL) and the gastric Organoids were cultured. The most functional unit, the gastric gland tissue, was extracted from the gastric tissue of the mouse and three-dimensionally cultured in each hydrogel to induce the formation of gastric organoids. The morphology and formation efficiency of gastric organoids formed in each SEM concentration condition on the 5th day of culture were compared with those of gastric organoids formed in Matrigel.

그 결과, 도 11에서 확인되는 바와 같이, 모든 농도 조건의 SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드가 대조군으로 이용한 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 비슷하게 구형으로 형성되는 것을 확인하였다. 그리고, 1 mg/ml 농도의 경우는 크기가 비교적 작은 오가노이드가 형성되었다 (도 11 (A)). 각 SEM 농도 별로 위 오가노이드 형성 효율을 비교해 보았을 때, SEM 하이드로젤을 이용한 배양의 경우 대부분의 농도에서 매트리젤에 비해서 형성 효율이 낮지만 5 mg/ml 농도의 SEM 하이드로젤에서 다른 농도에 비해서 가장 높은 형성 효율을 보여줌을 확인하였다 (도 11 (B)).As a result, as shown in FIG. 11 , it was confirmed that the gastric organoids cultured in SEM hydrogels of all concentration conditions were formed in a spherical shape similar to the organoids cultured in Matrigel used as a control. And, in the case of a concentration of 1 mg/ml, organoids having a relatively small size were formed (FIG. 11 (A)). When comparing the above organoid formation efficiency for each SEM concentration, in the case of culture using SEM hydrogel, the formation efficiency was lower than that of Matrigel at most concentrations, but the 5 mg/ml concentration of SEM hydrogel was the most compared to other concentrations. It was confirmed that it showed high formation efficiency (FIG. 11 (B)).

실험예 2-2. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 농도별 지지체 조성물에서 배양된 위 오가노이드 배양 양상 비교Experimental Example 2-2. Comparison of culture patterns of gastric organoids cultured in a support composition by concentration of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix

실시예 1-2.에서 제조된 지지체 조성물 (하이드로젤)과 관련하여 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 농도별 위 오가노이드 배양 양상을 비교하였다. In relation to the support composition (hydrogel) prepared in Example 1-2., the gastric organoid culture pattern was compared according to the concentration of the extracellular matrix derived from the decellularized gastric tissue.

구체적으로, 탈세포 위 조직 유래 지지체를 위 오가노이드 배양에 적용 시 최적의 SEM 하이드로젤 농도를 선별하기 위해 SEM 농도별(1, 3, 5, 및 7 mg/mL)로 제작된 하이드로젤에서 위 오가노이드를 배양하였다. 매트리젤은 대조군으로 이용하였다. Specifically, in order to select the optimal SEM hydrogel concentration when decellularized gastric tissue-derived scaffolds are applied to gastric organoid culture, in hydrogels prepared by SEM concentration (1, 3, 5, and 7 mg/mL), Organoids were cultured. Matrigel was used as a control.

그 결과, 각 농도 별로 제작된 SEM 하이드로젤에서 5일간 배양된 위 오가노이드의 mRNA 발현양을 정량적 PCR (q-PCR) 분석을 통해 비교해 보았을 때, 줄기세포능(stemness)과 관련된 유전자인 Lgr5는 1 mg/ml 농도와 7 mg/ml 농도에서 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 위 조직의 특정 세포 종류에서 발현하는 유전자인 Pgc (chief cell)와 Atp4a, Atp4b (parietal cell)는 농도가 높아질수록 발현이 증가하는 경향을 보인다. 전반적으로 5 mg/ml SEM 농도가 대조군인 매트리젤 그룹에 비해 줄기세포능(stemness - Lgr5 발현)은 유지되면서 다양한 위 조직 특이적 세포 종류로의 분화를 촉진하기 적합한 농도인 것으로 판단된다 (도 12 (A)). As a result, when the mRNA expression levels of gastric organoids cultured for 5 days in SEM hydrogels prepared for each concentration were compared through quantitative PCR (q-PCR) analysis, Lgr5, a gene related to stemness, was It was confirmed that there was a significant decrease at the concentration of 1 mg/ml and the concentration of 7 mg/ml. In addition, the expression of Pgc (chief cell), Atp4a, and Atp4b (parietal cell) genes expressed in specific cell types of gastric tissue tends to increase as the concentration increases. Overall, the 5 mg/ml SEM concentration is considered to be a suitable concentration to promote differentiation into various gastric tissue-specific cell types while maintaining stemness (Lgr5 expression) compared to the control Matrigel group (Fig. 12) (A)).

또한, 같은 5일차에 면역염색을 통해 위 조직 세포 마커인 Muc5ac(gastric pit cell)와 HK(parietal cell)의 발현양을 비교한 결과, 전체적으로 위 조직 특이적 마커 단백질 발현양이 SEM 하이드로젤 농도가 높아질수록 증가함을 확인하였다 (또 12 (B)). SEM 하이드로젤 농도 스크리닝을 통해서 추후 실험은 위 오가노이드의 증식과 분화 효과를 모두 기대할 수 있는 SEM 5 mg/ml 조건으로 확정하여 진행하였다.In addition, as a result of comparing the expression levels of gastric tissue cell markers Muc5ac (gastric pit cell) and HK (parietal cell) through immunostaining on the same day 5, the overall gastric tissue-specific marker protein expression level was significantly higher than the SEM hydrogel concentration. It was confirmed that it increases with increasing height (also 12 (B)). Through SEM hydrogel concentration screening, subsequent experiments were carried out by confirming the SEM 5 mg/ml condition in which both the proliferation and differentiation effects of gastric organoids can be expected.

실험예 2-3. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체에서 배양된 위 오가노이드 배양 양상 비교Experimental Example 2-3. Comparison of culture patterns of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix support composition and gastric organoid cultured on conventional culture support

본 발명의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 (매트리젤)에서 배양된 위 오가노이드 배양 양상을 비교하였다. The culture of gastric organoids cultured on the support composition of the present invention and the conventional culture support (Matrigel) was compared.

구체적으로, 오가노이드 배양에 가장 널리 이용되는 매트리젤과 탈세포 위 조직 유래 SEM 하이드로젤 (5 mg/ml) 지지체에서 자라는 위 오가노이드의 비교하였다.Specifically, we compared Matrigel, which is most widely used for organoid culture, and gastric organoids grown on decellularized gastric tissue-derived SEM hydrogel (5 mg/ml) scaffolds.

그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이, 각 지지체에서 형성된 위 오가노이드가 모두 계속 크기가 커지면서 계대 배양 직전 5~6일까지 배양이 잘 되는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 13 , it was confirmed that all of the gastric organoids formed on each support continued to increase in size and cultured well until 5 to 6 days immediately before subculture.

실험예 2-4. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체에서 배양된 위 오가노이드 비교Experimental Example 2-4. Comparison of the support composition of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue and gastric organoids cultured on the conventional culture support

오가노이드 배양에 가장 널리 이용되는 매트리젤과 탈세포 위 조직 유래 SEM 하이드로젤 (5 mg/ml) 지지체에서 배양된 위 오가노이드의 다양한 비교 분석하였다. Various comparative analyzes were conducted between Matrigel, the most widely used organoid culture, and gastric organoids cultured on a SEM hydrogel (5 mg/ml) scaffold derived from decellularized gastric tissue.

구체적으로, 배양 5일차에 각 배양 지지체에서 배양된 위 오가노이드의 유전자 발현과 단백질 발현을 비교하였다.Specifically, gene expression and protein expression of gastric organoids cultured on each culture support on the 5th day of culture were compared.

탈세포 SEM 하이드로젤 지지체와 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드의 마커 발현을 mRNA 수준에서 비교해 보았을 때, 줄기세포 마커인 Lgr5와 Axin2 발현은 비슷한 수준을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 위의 다양한 세포 종류에서 발현되는 유전자인 Muc6 (neck cell), Gif (parietal cell), Pgc, Pga5 (chief cell)을 비교해 보았을 때에도 비슷한 수준을 보이는 것을 확인하였다 (도 14 (A)). When the expression of the markers of the gastric organoids cultured on the decellularized SEM hydrogel support and Matrigel was compared at the mRNA level, it was confirmed that the stem cell markers, Lgr5 and Axin2, showed similar levels. In addition, it was confirmed that the genes expressed in the above various cell types, Muc6 (neck cell), Gif (parietal cell), Pgc, and Pga5 (chief cell), showed similar levels when compared (FIG. 14 (A)).

또한, 면역염색을 통해서 단백질 발현을 비교해 보았을 때 두 그룹의 오가노이드 모두 줄기세포 마커 및 증식과 관련된 LGR5, SOX9, KI67 및 분화 관련 마커 MUC5AC (gastric pit cell), CHGA (endocrine cell), HK (parietal cell)들이 모두 비슷한 수준으로 잘 발현되는 것을 확인하였다. 각 오가노이드에서 세포 간 상호작용 (cell-cell interaction) 또는 밀착 연접 (tight-junction)과 관련된 ECAD와 ZO1도 잘 발현하였으며, 형태학적으로도 오가노이드가 위 조직 구성 세포로 이루어져 있으며 상피조직 (epithelium)의 형상이 잘 유지되고 있음을 확인하였다 (도 14 (B)). In addition, when protein expression was compared through immunostaining, both groups of organoids were stem cell markers and proliferation-related LGR5, SOX9, KI67 and differentiation-related markers MUC5AC (gastric pit cell), CHGA (endocrine cell), HK (parietal cells) were all well expressed at a similar level. In each organoid, ECAD and ZO1 related to cell-cell interaction or tight junction were also well expressed. Morphologically, the organoid consists of gastric cells and epithelial tissue (epithelium). ), it was confirmed that the shape was well maintained (FIG. 14 (B)).

따라서 탈세포 위 조직 유래 SEM 하이드로젤이 기존의 배양 지지체인 매트리젤과 비교하여, 위 오가노이드를 비슷한 수준으로 배양할 수 있는 지지체임을 확인하였다.Therefore, it was confirmed that the decellularized gastric tissue-derived SEM hydrogel was a support capable of culturing gastric organoids at a similar level compared to Matrigel, which is a conventional culture support.

실험예 2-5. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체에서 배양된 위 오가노이드의 산 분비 비교 분석Experimental Example 2-5. Comparative analysis of acid secretion between the support composition of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue and gastric organoids cultured on the conventional culture support

본 발명의 하이드로젤 지지체에서 5일 간 배양된 위 오가노이드의 기능성을 매트리젤에서 같은 기간 배양된 위 오가노이드와 비교 분석하였다. The functionality of gastric organoids cultured for 5 days on the hydrogel support of the present invention was compared and analyzed with those of gastric organoids cultured on Matrigel for the same period.

구체적으로, Acridine Orange 염색 실험으로 위의 중요한 기능 중 하나인 산 분비 기능을 확인하였다.Specifically, the acid secretion function, one of the important functions of the above, was confirmed by the Acridine Orange staining experiment.

그 결과, 도 15에서 확인된 바와 같이, 산성에 가까울수록 초록색 형광(F_500-550) 세기는 약해지고 빨간색 형광(F_600-650) 세기는 증가하였다. Acridine Orange 염색 후 형광 발현을 각 그룹마다 비교하였다. SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드의 산 분비가 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드와 비슷한 수준을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 탈세포 위 조직 유래 지지체를 이용하여 배양한 위 오가노이드가 기존의 매트리젤에서 배양된 오가노이드를 대체하기에 기능적으로 문제가 없을 것으로 생각된다. As a result, as confirmed in FIG. 15 , the closer to acidity, _{the weaker the green fluorescence (F 500-550} ) intensity and the higher the red fluorescence (F _600-650 ) intensity. Fluorescence expression after Acridine Orange staining was compared for each group. It was confirmed that the acid secretion of gastric organoids cultured in SEM hydrogel showed a similar level to that of gastric organoids cultured in Matrigel. Therefore, gastric organoids cultured using decellularized gastric tissue-derived scaffolds are thought to have no functional problem as they can replace organoids cultured in the existing Matrigel.

실험예 2-6. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 혼합에 의한 오가노이드의 분화 증진 효과 확인Experimental Example 2-6. Confirmation of the effect of promoting differentiation of organoids by mixing the support composition of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue and the existing culture support

본 발명의 하이드로젤 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 혼합에 의한 오가노이드의 분화 증진 효과를 확인하였다. The effect of enhancing the differentiation of organoids by mixing the hydrogel support composition of the present invention and the existing culture support was confirmed.

구체적으로, 기존의 위 오가노이드 배양 지지체인 매트리젤의 사용을 최대한 대체하면서 위 오가노이드의 분화를 더욱 증진시킬 수 있는 배양 시스템의 구축을 위해 SEM 하이드로젤과 매트리젤을 9:1(v/v)로 섞어서 새로운 배양 지지체로 테스트 진행하였다. 매트리젤 그룹은 대조군으로 이용하였다. Specifically, in order to construct a culture system that can further enhance the differentiation of gastric organoids while maximally replacing the use of Matrigel, which is a conventional gastric organoid culture support, SEM hydrogel and Matrigel were mixed 9:1 (v/v). ) and tested with a new culture support. The Matrigel group was used as a control group.

그 결과, SEM/MAT(9:1) 하이드로젤과 매트리젤에서 5일 간 배양된 위 오가노이드의 각 마커에 대한 mRNA 발현량을 비교한 결과, 줄기세포능(stemness)와 관련된 Lgr5의 발현도 유의미하게 증가할 뿐만 아니라, 특정한 위 조직 세포에서 발현되는 다양한 분화 마커 Gif (parietal cell)와 Pgc (chief cell)도 유의미하게 발현양이 증가한 것을 확인하였다. Pga5 (chief cell) 발현도 매트리젤에서 배양된 오가노이드에 비해 증가하였다 (도 16 (A)). As a result, as a result of comparing mRNA expression levels for each marker of gastric organoids cultured for 5 days in SEM/MAT (9:1) hydrogel and Matrigel, the expression level of Lgr5 related to stemness In addition to a significant increase, it was confirmed that the expression levels of various differentiation markers Gif (parietal cell) and Pgc (chief cell) expressed in specific gastric tissue cells were also significantly increased. Pga5 (chief cell) expression was also increased compared to organoids cultured in Matrigel (FIG. 16 (A)).

또한, SEM/MAT(9:1) 하이드로젤 지지체에서 5일 간 배양된 위 오가노이드의 면역염색을 통해 다양한 마커 단백질 발현을 확인한 결과, MUC5AC (gastric pit cell), CHGA (endocrine cell), HK (parietal cell), ECAD (epithelial cell)의 발현을 통해 위 오가노이드의 분화가 증진되면서 잘 형성되는 것을 확인할 수 있었다 (도 16 (B)). In addition, as a result of confirming the expression of various marker proteins through immunostaining of gastric organoids cultured for 5 days on a SEM/MAT (9:1) hydrogel support, MUC5AC (gastric pit cell), CHGA (endocrine cell), HK ( parietal cells) and ECAD (epithelial cell), it was confirmed that the gastric organoids were well formed while the differentiation was enhanced (FIG. 16 (B)).

이러한 결과를 통해 SEM 기반 하이드로젤에 매트리젤을 소량 혼합해 주면 위 오가노이드의 증식 및 분화를 더욱 증진시킬 수 있는 배양 지지체의 구성이 가능함을 알 수 있다. From these results, it can be seen that if a small amount of Matrigel is mixed with the SEM-based hydrogel, it is possible to construct a culture support that can further enhance the proliferation and differentiation of the gastric organoids.

실험예 2-7. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 혼합에 의한 오가노이드의 기능 증진 효과 확인Experimental Example 2-7. Confirmation of organoid function enhancement effect by mixing the support composition of the extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue and the existing culture support

본 발명의 하이드로젤 지지체 조성물과 기존 배양 지지체 혼합에 의한 오가노이드의 기능 증진 효과를 확인하였다. The functional enhancement effect of organoids was confirmed by mixing the hydrogel support composition of the present invention and the existing culture support.

구체적으로, SEM/MAT(9:1) 하이드로젤 지지체에서 5일 간 배양된 위 오가노이드의 기능 증진 정도를 분석하였다. Acridine Orange 염색 실험으로, 위의 중요한 기능 중 하나인 산 분비 기능을 확인하였다. 매트리젤 그룹은 대조군으로 이용하였다. Specifically, the degree of functional enhancement of gastric organoids cultured for 5 days on a SEM/MAT (9:1) hydrogel support was analyzed. The acid secretion function, which is one of the important functions of the above, was confirmed by the acridine orange staining experiment. The Matrigel group was used as a control group.

그 결과, 도 17에서 확인되는 바와 같이 Acridine Orange 염색 후 형광 발현을 각 그룹마다 비교하였다. SEM/MAT(9:1) 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드의 산 분비가 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드보다 유의미하게 증진된 것을 확인하였다. 본 실험을 통해 탈세포 위 조직 유래 SEM 하이드로젤 지지체를 혼합하면 기능적으로 더 우수한 위 오가노이드를 제작할 수 있는 가능성을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 17 , the fluorescence expression after Acridine Orange staining was compared for each group. It was confirmed that the acid secretion of gastric organoids cultured in SEM/MAT (9:1) hydrogel was significantly enhanced compared to gastric organoids cultured in Matrigel. Through this experiment, we confirmed the possibility of producing functionally superior gastric organoids by mixing the SEM hydrogel scaffold derived from decellularized gastric tissue.

실험예 2-8. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물의 조직 특이적 효과 확인Experimental Example 2-8. Confirmation of tissue-specific effect of support composition of extracellular matrix derived from decellularized gastric tissue

탈세포 위 조직 유래 지지체에 포함된 위 특이적 세포외기질 성분들이 위 오가노이드 배양에 있어 조직 특이적 효과를 보여주는지 확인하기 위해 다른 장기 유래 탈세포 지지체에서 위 오가노이드를 배양하고 비교하는 실험을 수행하였다. In order to confirm whether the gastric-specific extracellular matrix components contained in the decellularized gastric tissue-derived scaffolds show tissue-specific effects in culturing gastric organoids, an experiment was conducted to culture and compare gastric organoids in other organ-derived decellularized scaffolds. carried out.

구체적으로, 각 조직 유래 탈세포 지지체에서 위 오가노이드를 5일 간 배양한 후 다양한 분석을 진행하였다. Specifically, after culturing the above organoids for 5 days on decellularized scaffolds derived from each tissue, various analyzes were performed.

그 결과, 위, 장, 피부, 림프, 심장, 근육 유래 탈세포 지지체를 이용하여 배양 시도한 결과, 위 및 장 유래 탈세포 지지체에서 위 오가노이드가 잘 형성된 것을 확인하였다. 반면 피부와 같은 다른 조직 유래 탈세포 지지체의 경우 위 오가노이드가 제대로 형성이 되지 않은 것을 확인하였다 (도 18 (A)).As a result, as a result of culturing using decellularized scaffolds derived from stomach, intestine, skin, lymph, heart, and muscle, it was confirmed that gastric organoids were well formed in decellularized scaffolds derived from stomach and intestine. On the other hand, in the case of a decellular scaffold derived from other tissues such as skin, it was confirmed that gastric organoids were not properly formed (FIG. 18 (A)).

오가노이드 형성 효율을 정량 분석해 보았을 때, 위와 장 유래 탈세포 지지체는 비슷한 형성 효율을 보이는 것을 확인한 반면에 피부 조직 유래의 탈세포 지지체의 경우 형성 효율이 감소하는 것이 관찰되었다 (도 18 (B)).When the organoid formation efficiency was quantitatively analyzed, it was confirmed that the gastric and intestinal-derived decellularized scaffolds exhibited similar formation efficiency, whereas in the case of skin tissue-derived decellularized scaffolds, the formation efficiency was reduced (Fig. 18 (B)) .

각 장기 유래 탈세포 지지체에서 5일동안 배양된 위 오가노이드의 마커 mRNA 발현을 비교한 결과 Stemness와 관련된 Lgr5의 발현양이 피부 조직 유래 지지체에서 배양된 오가노이드에서는 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다 (도 18 (C)).As a result of comparing the expression of marker mRNA of gastric organoids cultured for 5 days in each organ-derived decellularized scaffold, the expression of Lgr5 related to stemness was It was confirmed that the expression level was significantly decreased in the organoids cultured on the skin tissue-derived support (FIG. 18 (C)).

본 실험을 통해 위 오가노이드 배양에 있어 위 조직 유래 탈세포 지지체가 가지는 조직 특이적 효과를 확인할 수 있었고 위와 유사한 소화기 조직인 장 유래 탈세포 지지체도 비슷한 효과를 보이는 것을 확인하였다. Through this experiment, it was possible to confirm the tissue-specific effect of the gastric tissue-derived decellularized scaffold in culturing gastric organoids, and it was confirmed that the intestinal-derived decellularized scaffold, a digestive tissue similar to the above, also exhibited similar effects.

한편, 탈세포 위 조직 유래 지지체 (SEM)와 탈세포 피부 조직 유래 지지체 (SkEM) 내에 포함된 ECM 단백질의 상대적인 정량을 통해, 탈세포 위 조직 유래 지지체의 조직 특이적인 효과를 확인하고자 하였다.On the other hand, we tried to confirm the tissue-specific effect of the decellularized gastric tissue-derived scaffold through the relative quantification of ECM proteins contained in the decellularized gastric tissue-derived scaffold (SEM) and the decellularized skin tissue-derived scaffold (SkEM).

그 결과, 도 19에서 확인되는 바와 같이 SEM과 SkEM에서 검출된 총 55개의 세포외기질 단백질들을 비교해 보았을 때, 41개의 세포외기질 단백질이 SkEM에서 보다 SEM에 더욱 많이 포함되어 있는 것을 알 수 있다. 이 중 오가노이드의 발달에 중요하다고 알려진 fibronectin, laminin 등의 주요 세포외기질 성분이 SEM에 더 많이 포함되어 있기 때문에 SEM이 위 오가노이드의 배양에 더욱 적합할 것으로 판단되었다. As a result, as shown in FIG. 19 , when comparing a total of 55 extracellular matrix proteins detected in SEM and SkEM, it can be seen that 41 extracellular matrix proteins are contained in SEM more than in SkEM. Among them, SEM was judged to be more suitable for culturing gastric organoids because SEM contains more major extracellular matrix components such as fibronectin and laminin, which are known to be important for organoid development.

실험예 2-9. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물의 조직 연령에 따른 세포외기질 성분 차이 분석Experimental Example 2-9. Analysis of differences in extracellular matrix components according to tissue age of the scaffold composition of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix

본 발명의 지지체 조성물의 조직 연령에 따른 세포외기질 성분 차이를 분석하였다.The difference in extracellular matrix components according to the tissue age of the scaffold composition of the present invention was analyzed.

구체적으로, 어린 돼지 위 조직에서 유래한 SEM 하이드로젤 (Piglet)과 성체 돼지 위 조직에서 유래한 SEM 하이드로젤 (Adult pig)에서 위 오가노이드를 배양했을 때 위 오가노이드의 유전자 발현 차이와 각 하이드로젤에 포함된 세포외기질 단백질 성분의 차이를 분석하였다. Specifically, when gastric organoids were cultured in SEM hydrogel (Piglet) derived from young pig stomach tissue and SEM hydrogel (adult pig) derived from adult pig stomach tissue, the difference in the gene expression of gastric organoids and each hydrogel The differences in the extracellular matrix protein components included in the were analyzed.

각 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드의 유전자 발현 차이를 qPCR 실험을 통해 분석한 결과 Piglet 위 조직 유래 지지체에서 배양된 위 오가노이드가 adult pig 위 조직 유래 지지체에서 배양된 위 오가노이드에 비해 전체적으로 증가된 줄기세포 및 분화 마커 발현을 보이는 것을 확인하였다 (도 20 (a)).As a result of analyzing the difference in gene expression of gastric organoids cultured in each hydrogel through a qPCR experiment, gastric organoids cultured on a support derived from piglet gastric tissue were overall increased compared to gastric organoids cultured on a support derived from gastric tissue of an adult pig. It was confirmed that the expression of stem cells and differentiation markers was shown (FIG. 20 (a)).

각 하이드로젤에 포함된 세포외기질 단백질 성분의 상대 정량 비교를 통해 piglet 위 조직 유래 지지체가 adult pig 위 조직 유래 지지체에 비해 상대적으로 많은 양의 세포외기질 단백질을 포함하고 있는 것을 확인하였다. 특히, fibronectin 및 laminin과 같은 주요 세포외기질 성분이 piglet 조직 유래 지지체에 더 풍부하게 포함되어 있기 때문에, 어린 개체의 조직으로부터 제작된 지지체가 위 오가노이드의 형성 및 분화에 더 효과적임을 알 수 있다 (도 20 (b)).Through a comparative quantitative comparison of the extracellular matrix protein components contained in each hydrogel, it was confirmed that the support derived from the piglet gastric tissue contained a relatively large amount of the extracellular matrix protein compared to the support derived from the adult pig gastric tissue. In particular, since major extracellular matrix components such as fibronectin and laminin are more abundantly contained in the piglet tissue-derived scaffold, it can be seen that the scaffold prepared from the tissue of a young individual is more effective in the formation and differentiation of gastric organoids ( Fig. 20 (b)).

실험예 2-10. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물에서 위 오가노이드 장기 배양을 위한 배양액 조건 최적화Experimental Example 2-10. Optimization of culture medium conditions for long-term culture of gastric organoids in a support composition of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix

본 발명의 지지체 조성물에서 위 오가노이드 장기 배양을 위한 배양액 최적화 조건을 선정하였다.In the support composition of the present invention, culture medium optimization conditions for long-term culture of gastric organoids were selected.

구체적으로, 도 21 (a)에서 확인되는 바와 같이 기존의 배양액 조성(검정색 표기 시약)에 추가적으로 첨가하는 인자(빨간색 표기 시약)를 조정하면서 실험하였다. Specifically, as shown in Fig. 21 (a), the experiment was performed while adjusting the factors (red reagents) added additionally to the existing culture solution composition (black reagents).

그 결과 도 21 (b)에서 확인되는 바와 같이, 기존의 배양액 조성(Conv), A83-01 추가한 조성(Conv + A), Nicotinamide 추가한 조성(Conv + Ni), 그리고 둘 다 추가한 조성(Conv + A +Ni)에서 각각 위 오가노이드의 장기 배양을 시도하였다. 계대 배양이 최대로 진행된 횟수를 조사하고 오가노이드 형태 분석을 통해 기존 배양액 조건과 추가 인자를 하나씩만 첨가한 배양액 조건에서는 모두 장기간 계대 배양이 가능하지 않았다. 하지만 A83-01과 Nicotinamide를 모두 첨가한 개선된 배양액 조건에서는 계대 배양이 최소 8회 이상 가능한 것을 확인하였다. As a result, as confirmed in FIG. 21 (b), the composition of the existing culture medium (Conv), the composition added with A83-01 (Conv + A), the composition added with nicotinamide (Conv + Ni), and the composition added with both ( Conv + A + Ni) was attempted for long-term culture of gastric organoids, respectively. Long-term subculture was not possible in both the existing culture medium condition and the culture medium condition in which only one additional factor was added through the investigation of the maximum number of subcultures and analysis of organoid morphology. However, it was confirmed that subcultures were possible at least 8 times in the improved culture medium condition in which both A83-01 and nicotinamide were added.

실험예 2-11. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물에서 위 오가노이드 장기 배양Experimental Example 2-11. Long-term culture of gastric organoids in a support composition of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix

상기 실험예에서 확립한 배양액 조건 하에서 탈세포 위 조직 유래 지지체 내에서 위 오가노이드 장기 배양 시도 및 다양한 stemness 마커를 분석하였다. 매트리젤 그룹은 대조군으로 이용하였다. Under the culture conditions established in the above experimental example, long-term gastric organoid culture attempts and various stemness markers were analyzed in decellularized gastric tissue-derived scaffolds. The Matrigel group was used as a control group.

SEM 하이드로젤에서 계대 배양을 지속하면서 2달가량 (61일) 배양했을 때 위 오가노이드 형태 이미지에서 확인되는 바와 같이 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드와 마찬가지로 구형의 모양이고 크기도 유사한 수준으로 계속 유지되며 배양되는 것을 확인하였다 (도 22 (A)). When subcultured in SEM hydrogel for about 2 months (61 days), as confirmed in the image of the organoid shape, it has a spherical shape and a similar size to the organoid cultured in Matrigel. and it was confirmed that it was cultured (FIG. 22 (A)).

배양 5일차 때와 11일차에 SEM 하이드로젤과 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드의 stemness관련 mRNA 발현 양상을 비교하였다. 줄기세포 마커(stemness)와 관련 있는 Lgr5, Axin2, Olfm4 유전자의 발현이 매트리젤 그룹보다 비슷하거나 더 높게 발현되면서 유지되는 것을 확인하였다 (도 22 (B)).The stemness-related mRNA expression patterns of gastric organoids cultured in SEM hydrogel and Matrigel on day 5 and 11 of culture were compared. It was confirmed that the expression of Lgr5, Axin2, Olfm4 genes related to stem cell markers was maintained while being similar or higher than that of the Matrigel group (FIG. 22 (B)).

각각 계대 배양을 8회 시도한 뒤 45일차에, SEM 하이드로젤 그룹과 MAT 매트리젤 그룹의 Lgr5, Axin2, Olfm4 발현양을 비교해 보았을 때도 SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드에서 비슷하거나 더 높은 수준으로 유지되고 있는 것을 확인하였다 (도 22 (C)). On the 45th day after each passage 8 times, the expression levels of Lgr5, Axin2, and Olfm4 in the SEM hydrogel group and the MAT matrix gel group were compared, and the gastric organoids cultured in the SEM hydrogel maintained a similar or higher level. It was confirmed that it is (Fig. 22 (C)).

이를 통해 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체에서 위 오가노이드가 최소 2달 이상 장기 배양 가능하고, 같은 배양 기간동안 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 비교하여 비슷하거나 더 향상된 수준의 줄기세포능(stemness)을 지니고 있는 것을 확인하였다. Through this, gastric organoids can be cultured for at least 2 months on a decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffold, and a similar or improved level of stemness compared to organoids cultured on Matrigel during the same culture period. It was confirmed that it has

실험예 2-11. 탈세포 위 조직 유래 세포외기질의 지지체 조성물에서 배양된 위 오가노이드의 전사체(transcriptome) 발현 분석Experimental Example 2-11. Transcriptome expression analysis of gastric organoids cultured in a support composition of decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix

본 발명 지지체 조성물에서 배양된 위 오가노이드의 전사체(transcriptome) 발현을 분석하였다. Transcriptome expression of gastric organoids cultured in the scaffold composition of the present invention was analyzed.

구체적으로, SEM 하이드로젤에서 배양한 위 오가노이드의 유전자 발현을 RNA-sequencing 분석을 통해 확인하고, 매트리젤에서 배양된 오가노이드와 전사체 발현 정도를 비교하였다. 두 그룹을 비교했을 때, 발현양이 차이가 나는 유전자 (Differentially Expressed Gene; DEG)를 선별하였고 이를 이용해 Gene Ontology 분석을 실시하였다.Specifically, the gene expression of the above organoids cultured in SEM hydrogel was confirmed through RNA-sequencing analysis, and the transcript expression level was compared with organoids cultured in Matrigel. When comparing the two groups, genes with different expression levels (Differentially Expressed Genes; DEGs) were selected, and gene ontology analysis was performed using them.

SEM 하이드로젤과 매트리젤에서 각각 배양한 위 오가노이드에서 모두 발현하는 유전자들 중에서, 2 fold, p-value < 0.05, FDR < 0.1의 통계적 기준으로 DEG 590개를 선별하여 heatmap으로 도식화 하였다. 두 오가노이드를 비교해 보았을 때 각 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드들이 형태는 유사하지만 상당히 많은 수의 유전자들의 발현이 차이를 보이는 것을 확인하였다 (도 23 (A)). Among the genes expressed in all of the gastric organoids cultured in SEM hydrogel and Matrigel, respectively, 590 DEGs were selected based on the statistical criteria of 2 fold, p-value < 0.05, and FDR < 0.1 and diagrammed as a heatmap. When the two organoids were compared, it was confirmed that the above organoids cultured in each hydrogel had similar shapes, but showed differences in the expression of a significant number of genes (FIG. 23 (A)).

Gene ontology 분석을 실시하여 SEM 하이드로젤 그룹에서 증가된 유전자 카테고리 (주황색)와 감소된 유전자 카테고리 (녹색)를 각각 분석하였다. 세포외영역 (extracellular region), 세포외영역 부분 (extracellular region part), 단백질성 세포외기질 (proteinaceous extracellular matrix), 세포외기질 (extracellular matrix) 등 세포외기질과 관련된 카테고리에 속하는 유전자들의 발현이 상당히 증가된 것을 확인할 수 있었다. 반면, 콜레스테롤 생합성 과정 (cholesterol biosynthetic process), 스테롤 생합성 과정 (sterol biosynthetic process), 스테로이드 대사 과정 (steroid metabolic process)등 지방 대사 관련된 유전자 발현의 감소가 가장 크게 관찰되었다 (도 23 (B)). Gene ontology analysis was performed to analyze the increased gene category (orange) and decreased gene category (green) in the SEM hydrogel group, respectively. Expression of genes belonging to categories related to extracellular matrix, such as extracellular region, extracellular region part, proteinaceous extracellular matrix, and extracellular matrix, is significantly higher. increase could be observed. On the other hand, the greatest decrease in the expression of genes related to fat metabolism such as cholesterol biosynthetic process, sterol biosynthetic process, and steroid metabolic process was observed (FIG. 23 (B)).

매트리젤 그룹보다 SEM 그룹에서 4배 이상 발현양이 증가된 DEG 유전자들을 총 28개 선별했을 때 대부분의 유전자들이 세포외기질 관련 유전자 카테고리에 포함되어 있는 것을 확인하여 세포외기질 관련 유전자들의 발현이 대폭 증가됨을 확인하였다. 특히, 증가된 28개의 유전자 중에 25개의 유전자가 세포외영역 (extracellular region) 카테고리에 포함되어 가장 크게 증가된 것을 확인하였다. 또한, 세포외영역 부분(extracellular region part) 관련 14개, 단백질성 세포외기질 (proteinaceous extracellular matrix) 관련 4개, 세포외기질 (extracellular matrix) 관련 4개, 세포 증식 조절 (regulation of cell proliferation) 관련 4개의 유전자가 포함되어 있는 것을 확인하여 SEM 하이드로젤이 매트리젤에 비해 위 오가노이드의 세포외기질 및 세포 증식 관련된 유전자들의 발현을 크게 증가시킨 것을 확인하였다 (도 23 (C)).When a total of 28 DEG genes whose expression was increased 4 times or more in the SEM group than in the Matrigel group were selected, it was confirmed that most genes were included in the extracellular matrix-related gene category, and the expression of extracellular matrix-related genes was significantly increased. was confirmed to be increased. In particular, among the increased 28 genes, 25 genes were included in the extracellular region category, confirming the largest increase. In addition, 14 related to the extracellular region part, 4 related to the proteinaceous extracellular matrix, 4 related to the extracellular matrix, and 4 related to the regulation of cell proliferation It was confirmed that four genes were included, and it was confirmed that the SEM hydrogel significantly increased the expression of the extracellular matrix and cell proliferation-related genes of the gastric organoid compared to Matrigel (FIG. 23 (C)).

한편, 생쥐의 위조직의 전사체를 RNA-sequencing 분석을 통해 확인하고, 이를 각 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드의 전사체와 비교 분석하였다.On the other hand, the transcript of the gastric tissue of the mouse was confirmed through RNA-sequencing analysis, and it was compared and analyzed with the transcript of the gastric organoid cultured in each hydrogel.

각 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드의 전사체를 생쥐 위조직과 비교하여 증가한 유전자들과 감소한 유전자들의 비율을 각 ontology 별로 나누어 나타낸 결과, Ontology는 세포외기질 및 세포-매트릭스 간의 상호작용과 관련된 단어들로 선별하여 분석을 진행하였다. 위 오가노이드가 대부분의 카테고리에서 위 조직에 비해서 발현양이 떨어지지만, SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드가 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드에 비해서 증가된 유전자의 개수가 더 많은 것을 확인하였다 (도 24 (a)).As a result of comparing the transcriptome of gastric organoid cultured in each hydrogel with that of mouse gastric tissue, the ratio of increased and decreased genes was divided by ontology. were selected and analyzed. Although gastric organoids have lower expression levels than gastric tissues in most categories, it was confirmed that gastric organoids cultured in SEM hydrogel had a higher number of increased genes than gastric organoids cultured in Matrigel ( Fig. 24 (a)).

개별적인 유전자로 분석해본 결과, 세포외기질 (extracellular matrix)에 관련된 Nid1, Pxdn, 위 상피세포 (gastric epithelial cell)와 관련된 유전자인 Msi1, Dbn1, Chgb, Nrg1, 그리고 호르몬 반응 (hormone activity)과 관련있는 pyy, Cpt1c 등의 유전자의 발현양이 SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드에서 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드 보다 더욱 높고, 위 조직의 발현양에 가까운 것을 확인할 수 있었다 (도 24 (b)).Results done analysis to individual genes, extracellular matrix (extracellular matrix) in the associated Nid1, Pxdn, gastric epithelial cells (gastric epithelial cell), and genes Msi1, Dbn1, Chgb, Nrg1, and regulatory responses associated with respect to (hormone activity) It was confirmed that the expression levels of genes such as pyy and Cpt1c were higher in gastric organoids cultured in SEM hydrogel than in gastric organoids cultured in Matrigel, and close to the expression level of gastric tissue (Fig. 24 (b)) .

이러한 전사체 분석을 통해서, SEM 하이드로젤에서 배양된 위 오가노이드가 매트리젤에서 배양된 위 오가노이드에 비해 더욱 위 조직과 가깝다는 것을 확인할 수 있었다. Through this transcriptome analysis, it was confirmed that gastric organoids cultured in SEM hydrogel were closer to gastric tissue than gastric organoids cultured in Matrigel.

실험예 3:Experimental Example 3: 지지체 조성물의 활용 가능성 검증Verification of the applicability of the support composition

실험예 3-1. 탈세포 위 조직 유래 지지체 조성물을 이용한 위 오가노이드 생체 내 이식Experimental Example 3-1. In vivo transplantation of gastric organoids using decellularized gastric tissue-derived scaffold composition

본 발명의 하이드로젤 지지체를 위 오가노이드 이식용 소재로서 활용하기 위한 동물 실험을 수행하고 조직학 분석을 진행하였다. Animal experiments were performed to utilize the hydrogel scaffold of the present invention as a material for transplantation of gastric organoids, and histological analysis was performed.

구체적으로, 위 오가노이드를 마우스 위궤양 모델의 손상된 위 조직 내에 효율적으로 전달하고 생착시키기 위해 SEM 하이드로젤을 이용하여 위 오가노이드를 이식하였고, 이식 시 주사가 용이한 하이드로젤 점도를 맞추기 위해 SEM 하이드로젤은 1:20 (v/v) = SEM : 배양액 조성으로 혼합하여 사용하였다. 생체 내로 이식한 오가노이드의 추적을 위해 EGFP 발현 마우스 조직에서 추출된 줄기세포로 제작한 위 오가노이드를 이식에 이용하였다 또한, 쥐 위벽에 100% 아세트산을 capillary tube를 이용해 30초간 처리해주어 마우스 모델에서 위궤양을 유발하고, SEM 하이드로젤을 이용하여 위 오가노이드를 손상된 위 조직 부위에 이식한 후 오가노이드 생착 정도를 관찰하였다 (도 25 (a)). Specifically, gastric organoids were transplanted using SEM hydrogel to efficiently deliver and engraft gastric organoids in the damaged gastric tissue of a mouse gastric ulcer model. Silver 1:20 (v/v) = SEM: was used by mixing the culture medium composition. In order to track the transplanted organoids in vivo, gastric organoids prepared from stem cells extracted from EGFP-expressing mouse tissues were used for transplantation. A gastric ulcer was induced, and the degree of organoid engraftment was observed after transplanting the gastric organoid into the damaged gastric tissue site using SEM hydrogel (FIG. 25 (a)).

마우스 위궤양 모델에 DiI 형광 dye로 표지된 위 오가노이드를 탈세포 SEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 이식하고, 생착 여부를 이식 하루 뒤에 형광 발현을 통해 관찰한 결과, 위 조직 gland 부분에 전체적으로 이식된 오가노이드가 존재하는 것을 확인하였다. 오가노이드가 이식되지 않은 손상된 위 조직에서는 형광이 관찰되지 않았다 (도 25 (b)).In a mouse gastric ulcer model, gastric organoids labeled with DiI fluorescent dye were transplanted using a decellularized SEM hydrogel support, and engraftment was observed through fluorescence expression one day after transplantation. was confirmed to exist. No fluorescence was observed in the damaged gastric tissue in which the organoid was not transplanted (Fig. 25(b)).

마우스 위궤양 모델에 EGFP를 발현하는 위 오가노이드를 탈세포 SEM 하이드로젤 지지체를 이용하여 이식하고, 생착 여부를 하루 뒤에 형광 발현을 통해 관찰한 결과, 마찬가지로 이식된 오가노이드가 손상된 조직 부위에 잘 생착하고 존재하는 것을 확인하였다 (도 25 (c)). In a mouse gastric ulcer model, gastric organoids expressing EGFP were transplanted using a decellularized SEM hydrogel support, and engraftment was observed through fluorescence expression a day later. It was confirmed that there is (Fig. 25 (c)).

실험예 3-2. 장기보관 된 지지체 조성물을 이용한 위 오가노이드의 배양 가능성 검증Experimental Example 3-2. Validation of culturing potential of gastric organoids using long-term storage support composition

장기보관 된 본 발명의 지지체 조성물에서 위 오가노이드 배양 가능성을 검증하였다.The possibility of culturing gastric organoids in the support composition of the present invention stored for a long time was verified.

구체적으로, SEM 용액을 -80℃에서 장기간 냉동 보관하고, 이를 해동하여 제작한 SEM 하이드로젤을 위 오가노이드 배양에 이용하여 장기 보관 가능성 및 안정성을 확인하였다 (도 26 (A)). Specifically, the SEM solution was stored frozen at -80°C for a long time, and the SEM hydrogel prepared by thawing was used for gastric organoid culture to confirm the long-term storage potential and stability (FIG. 26 (A)).

그 결과, 도 26 (B)에서 확인되는 바와 같이, 장기간 냉동 보관 후 해동된 SEM 하이드로젤에서도 위 오가노이드 배양이 잘되는 것을 확인하였고(배양 5일째 오가노이드 이미지), 오가노이드 형성 효율도 배양 직전에 새로이 제작된 SEM 하이드로젤 및 매트리젤과 비슷하게 유지되는 것을 확인하였다. 또한 줄기세포 마커 및 분화 마커의 mRNA 발현양 차이도 크게 차이가 나지 않았다. 이를 통해 탈세포 위 조직 유래 지지체가 냉동 조건(-80℃)에서 장기간 최소 6개월까지 보관되어도 변성 없이 안정적으로 유지되어 위 오가노이드 배양에 사용 가능한 것을 확인하였다. 장기간 보관이 가능함을 통해 유효기간이 긴 제품으로 개발될 수 있음을 검증하였다. As a result, as shown in FIG. 26 (B), it was confirmed that the gastric organoid culture was well even in the SEM hydrogel thawed after long-term freezing storage (organoid image on the 5th day of culture), and the organoid formation efficiency was also observed immediately before the culture. It was confirmed that it remained similar to the newly prepared SEM hydrogel and Matrigel. Also, there was no significant difference in mRNA expression levels of stem cell markers and differentiation markers. Through this, it was confirmed that the decellularized gastric tissue-derived scaffold was stably maintained without denaturation even when stored for a long period of time up to at least 6 months under frozen conditions (-80° C.) and thus usable for culturing gastric organoids. It has been verified that it can be developed into a product with a long shelf life through the possibility of long-term storage.

한편, SEM 용액을 4℃에서 냉장 보관하고, 이를 위 오가노이드 배양에 이용하여 장기 보관 가능 여부, 변성 여부 및 안정성을 확인하였다 (도 27 (A)). On the other hand, the SEM solution was refrigerated at 4° C., and it was used for culturing the stomach organoids to check whether long-term storage, denaturation, and stability were possible (FIG. 27 (A)).

그 결과, 도 27 (B)에서 확인되는 바와 같이, 배양 직전에 새롭게 제작한 SEM 하이드로젤 및 매트리젤과 비교하여 냉장 보관된 SEM 용액으로 제작한 하이드로젤에서도 위 오가노이드가 비슷한 수준으로 잘 형성이 되며 유지, 배양이 잘 되는 것을 확인하였다(배양 5일째 오가노이드 이미지). 이를 통해 탈세포 위 조직 유래 지지체가 용액 형태로 4℃에 냉장 보관되어도 최소 1달까지 변성 없이 안정성을 잘 유지하며 냉장 보관 후에 위 오가노이드 배양에 사용 가능함을 확인하였다. 장기간 보관이 가능함을 통해 유효기간이 긴 제품으로 개발될 수 있음을 검증하였다.As a result, as confirmed in FIG. 27 (B), the above organoids were well formed at a similar level in the hydrogel prepared with the refrigerated SEM solution compared to the SEM hydrogel and Matrigel newly prepared just before culture. It was confirmed that it was maintained and cultured well (organoid image on the 5th day of culture). Through this, it was confirmed that the decellularized gastric tissue-derived scaffold maintains stability without denaturation for at least 1 month even when refrigerated at 4°C in solution form, and can be used for culturing gastric organoids after refrigeration. It has been verified that it can be developed into a product with a long shelf life through the possibility of long-term storage.

실험예 3-3. 지지체 조성물에서 위암 오가노이드의 배양 가능성 검증Experimental Example 3-3. Validation of culturing potential of gastric cancer organoids in support composition

본 발명의 지지체를 이용하여 위암 오가노이드의 배양 가능성을 확인하였다. The possibility of culturing gastric cancer organoids was confirmed using the scaffold of the present invention.

구체적으로, MKN-74, NCI-N87 위암 세포주를 SEM 하이드로젤에서 삼차원 배양했을 때 암 오가노이드가 형성됨을 확인하였다(배양 10일차 오가노이드 이미지 및 면역염색 분석). Specifically, it was confirmed that cancer organoids were formed when MKN-74 and NCI-N87 gastric cancer cell lines were three-dimensionally cultured on SEM hydrogel (organoid image and immunostaining analysis on the 10th day of culture).

그 결과, 도 28에서 확인되는 바와 같이, 광학 현미경 관찰을 통해 두 가지 위암 세포주로부터 SEM 하이드로젤 내에서 모두 오가노이드가 잘 형성된 것을 확인하였고, 면역염색으로 세포 증식과 관련된 Ki67 단백질을 염색하여 오가노이드 내 세포들의 증식이 활발히 일어나고 있는 것을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 28 , it was confirmed that organoids were well formed in both gastric cancer cell lines in the SEM hydrogel from the two gastric cancer cell lines through optical microscopy, and the Ki67 protein related to cell proliferation was stained by immunostaining to form organoids. It was confirmed that the proliferation of my cells is actively occurring.

본 실험을 통해 탈세포 위 조직 유래 SEM 하이드로젤 지지체는 줄기세포 유래의 위 오가노이드 뿐 아니라 위암 오가노이드의 배양도 가능함을 확인하여 SEM 하이드로젤이 위암 체외 모델 구축을 위한 배양 플랫폼의 요소 기술로 활용될 수 있는 가능성을 확인하였다. Through this experiment, it was confirmed that the decellularized gastric tissue-derived SEM hydrogel scaffold is capable of culturing not only stem cell-derived gastric organoids but also gastric cancer organoids. possibility was confirmed.

실험예 3-4. 지지체 조성물과 미세유체 칩을 이용한 위 오가노이드 대량 배양 가능성Experimental Example 3-4. Possibility of mass culture of gastric organoids using support composition and microfluidic chip 가능성 확인Possibility check

오가노이드 대량 배양과 다중 약물 스크리닝이 가능한 미세유체 칩에서 SEM 하이드로젤을 기반으로 하는 위 오가노이드 배양 플랫폼의 구축 가능성을 확인하였다. 미세유체 칩은 교반기(rocker)를 이용한 간단한 방식으로 미세한 배양액 흐름을 오가노이드에 제공해 줄 수 있다. 또한 다수의 챔버가 존재하여 오가노이드의 대량 생산이 가능하다 (도 29 (a)). The possibility of constructing a gastric organoid culture platform based on SEM hydrogel in a microfluidic chip capable of large-scale organoid culture and multi-drug screening was confirmed. The microfluidic chip can provide a microfluidic flow to the organoids in a simple manner using a rocker. In addition, a large number of chambers exist to enable mass production of organoids (Fig. 29 (a)).

상기 장치에서 본 발명의 지지체를 이용하여 위 오가노이드를 배양하였다.In the device, gastric organoids were cultured using the scaffold of the present invention.

미세유체 칩 내에서 위 오가노이드가 봉입된 SEM 하이드로젤을 배양한 결과 오가노이드 배양 챔버에 미세한 배양액 흐름을 주며 5일 동안 배양했을 때, 1 mm 수준의 크기까지 위 오가노이드가 성장하며 잘 배양되는 것을 확인할 수 있었다 (도 29 (b)).As a result of culturing the SEM hydrogel encapsulated in gastric organoids in a microfluidic chip, a fine flow of culture medium is given to the organoid culture chamber and when cultured for 5 days, gastric organoids grow to a size of 1 mm and are well cultured. was confirmed (Fig. 29 (b)).

이러한 결과를 통해 탈세포 위 조직 유래 하이드로젤 지지체 내에 삼차원 배양되는 위 오가노이드는 미세유체 칩 기술과 접목이 되면 조직 특이적 세포외기질 미세환경과 정밀한 미세유체 흐름의 동적 배양이 결합되어 효율적인 오가노이드 대량 생산이 가능함을 알 수 있다.Through these results, gastric organoids that are three-dimensionally cultured in decellularized gastric tissue-derived hydrogel scaffolds are efficient organoids by combining the tissue-specific extracellular matrix microenvironment with the dynamic culture of precise microfluidic flow when grafted with microfluidic chip technology. It can be seen that mass production is possible.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. The description of the present invention described above is for illustration, and those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains can understand that it can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

Claims

A scaffold composition comprising a decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (Stomach Extracellular Matrix; SEM).

According to claim 1,
The support composition that the decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix is included in an amount of 0.01 to 10 mg/mL.

According to claim 1,
The composition is a support composition having an elastic modulus of 1 to 100 Pa based on 0.1 to 10 Hz.

(a) decellularizing the isolated gastric tissue to prepare a decellularized gastric tissue;
(b) drying the decellularized gastric tissue to prepare a decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix (Stomach Extracellular Matrix; SEM); and
(c) gelation of the dried decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix; A method for preparing a support composition comprising a.

5. The method of claim 4,
The method for producing a support composition further comprising the step of mincing the gastric tissue separated in step (a) before decellularization.

5. The method of claim 4,
A method for preparing a support composition in which the gastric tissue in step (a) is stirred in a decellularization solution.

7. The method of claim 6,
The decellularization solution is a method for preparing a support composition comprising 0.1 to 5% of Triton X-100 and 0.01 to 0.5% of ammonium hydroxide.

5. The method of claim 4,
The decellularization of step (a) is a method for producing a support composition in which 95 to 99.9% of gastric tissue cells are removed.

5. The method of claim 4,
After step (b), the decellularized gastric tissue-derived extracellular matrix is a support composition manufacturing method further comprising the step of adjusting to be included in 0.01 to 10 mg / mL.

5. The method of claim 4,
The method for preparing the support composition does not include a perfusion method.

A method of culturing gastric organoids in the support composition of claim 1 or the support composition prepared by the method of claim 4.