KR20210095464A - Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof - Google Patents

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KR20210095464A KR1020200009404A KR20200009404A KR20210095464A KR 20210095464 A KR20210095464 A KR 20210095464A KR 1020200009404 A KR1020200009404 A KR 1020200009404A KR 20200009404 A KR20200009404 A KR 20200009404A KR 20210095464 A KR20210095464 A KR 20210095464A
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Abstract

The present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising a TAZ protein or a variant thereof. According to an aspect, the pharmaceutical composition comprising the TAZ protein or the variant thereof can increase insulin sensitivity by enhancing the expression of IRS1 in muscle cells, so that the pharmaceutical composition can be used for the prevention, alleviation, or treatment of type 2 diabetes.

Description

TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof}A pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising a TAZ protein or a variant thereof {Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof}

TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.It relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising a TAZ protein or a variant thereof.

TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ (PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ 유도된 지방세포 분화의 저해를 야기한다. 또한, 중간엽 줄기세포에서 TAZ의 발현 수준은 조골세포 또는 지방세포로 세포 운명 결정에 대하여 중요한 역할을 하므로, TAZ는 중간엽 줄기세포 분화의 전사 조절자로 작용하는 것으로 인식되고 있다. 이 뿐만 아니라, TAZ는 갑상선 (thyroid) 전사 인자-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-박스 전사 인자 (Tbx5), 페어드 박스 유전자 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) 및 Smad2/3-4 복합체를 포함하는 몇몇의 다른 전사인자와 상호작용을 하고, 그들의 전사 활성 및 세포 기능을 조절한다. TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) has been identified as a cellular protein that interacts with 14-3-3, and TAZ is also a peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), adipocyte-specific It interacts with transcription factors, causing inhibition of PPARγ-induced adipocyte differentiation. In addition, since the expression level of TAZ in mesenchymal stem cells plays an important role in determining cell fate into osteoblasts or adipocytes, it is recognized that TAZ acts as a transcriptional regulator of mesenchymal stem cell differentiation. In addition to this, TAZ contains thyroid transcription factor-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-box transcription factor (Tbx5), paired box gene 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) and It interacts with several other transcription factors, including the Smad2/3-4 complex, and regulates their transcriptional activity and cellular function.

따라서, TAZ는 신장 및 폐 형성 (Park, K. S., 등(2004) J Biol Chem 279, 17384-17390;Kang, H. S., 등(2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., 등 (2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), 심장 및 팔다리 발생 (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, E. N., and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 18034-18039), 갑상선 분화 (Di Palma, T., 등 (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), 배아 줄기세포 자가-재생 (Varelas, X., 등 (2008) Nat Cell Biol 10, 837-848), 및 내피-중간엽 전이 및 암세포의 침습 (Chan, S. W., 등 (2008) Cancer Res 68, 2592-2598;Lei, Q. Y., 등 (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436)과 같은 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 근육세포에 있어서 혈당 조절과 관련된 Wnt 신호전달 및 인슐린 민감성과 TAZ의 연관성에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. Thus, TAZ is involved in kidney and lung formation (Park, KS, et al. (2004) J Biol Chem 279, 17384-17390; Kang, HS, et al. (2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., et al.) 2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), heart and limb development (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, EN, and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102, 18034-18039), thyroid differentiation (Di Palma, T., et al. (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), embryonic stem cell self-renewal (Varelas, X., et al. (2008) Nat Cell Biol 10) , 837-848), and endothelial-mesenchymal metastasis and invasion of cancer cells (Chan, SW, et al. (2008) Cancer Res 68, 2592-2598; Lei, QY, et al. (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436) It is known to be involved in biological functions such as, but the relationship between Wnt signaling and insulin sensitivity related to blood glucose control in muscle cells and TAZ is not yet known.

일 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof; a nucleic acid molecule encoding the protein; And to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising at least one selected from the group consisting of substances that increase the expression or activity of the TAZ.

다른 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.Another aspect is TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof; a nucleic acid molecule encoding the protein; And to provide a method of treating type 2 diabetes comprising administering to an individual other than a human at least one selected from the group consisting of a substance that increases the expression or activity of the TAZ.

일 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. One aspect is TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof; a nucleic acid molecule encoding the protein; And it provides a pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising at least one selected from the group consisting of substances that increase the expression or activity of the TAZ.

본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 포함한다. 본 명세서에서 용어, "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “prevention” includes all acts of inhibiting or delaying metabolic diseases by administering a pharmaceutical composition according to an aspect to an individual. As used herein, the term "treatment" refers to any act of administering a pharmaceutical composition according to an aspect to an individual so that symptoms of a metabolic disease are improved or beneficial.

본 명세서에서 용어, "TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)"는 14-3-3 단백질과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, WWTR1으로도 명명될 수 있다. TAZ는 또한 근육 세포 내 인슐린수용체물질(the insulin receptor substrate: IRS)1과 근육세포-특이적인 상호작용을 수행하여, 포도당 항상성 조절에 활용될 수 있다. 상기 TAZ는 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은, 사람의 경우 GeneBank Accession No. NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, 또는 NM_181313.3, 마우스의 경우, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, 또는 NM_181516.6로부터 수득되는 서열일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열은 GeneBank Accession No. NP_001161753, NP_001161753, NP_001335291.1, NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, 또는 NP_851830.1로부터 수득되는 아미노산 서열일 수 있다. 아울러, 상기 아미노산 서열은 예를 들어, 서열번호 1, 2 또는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일부 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 TAZ의 mRNA 또는 단백질로 간주될 수 있다.As used herein, the term "TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)" has been identified as a cellular protein that interacts with 14-3-3 protein, and may also be referred to as WWTR1. TAZ can also be utilized to regulate glucose homeostasis by performing muscle cell-specific interactions with the insulin receptor substrate (IRS)1 in muscle cells. The TAZ is the sequence of the gene encoding the protein, in the case of humans, GeneBank Accession No. NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, or NM_181313.3, for mouse, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, or NM_181516.6 can The amino acid sequence of the TAZ protein is GeneBank Accession No. It may be an amino acid sequence obtained from NP_001161753, NP_001161753, NP_001335291.1, NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, or NP_851830.1. In addition, the amino acid sequence may include, for example, the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, 2 or SEQ ID NO: 4. Even if the nucleic acid sequence or amino acid sequence and some nucleic acid sequence or amino acid sequence do not match, a nucleic acid sequence or amino acid sequence having a biologically equivalent activity may be regarded as an mRNA or protein of TAZ.

상기 TAZ 단백질은 인간, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개 등의 포유 동물 유래의 모든 TAZ 단백질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 사용 가능한 TAZ 단백질은 이들의 야생형(wild type)의 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 TAZ 단백질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 단백질의 변이체 (예컨대, 각 단백질의 아형(subtype)들)를 포함할 수 있다.The TAZ protein may include all TAZ proteins derived from mammals such as humans, horses, sheep, pigs, goats, camels, antelopes, and dogs. In addition, the TAZ protein usable in the present invention is a protein having an amino acid sequence of its wild type, as well as a variant of one or more proteins selected from the group consisting of TAZ proteins (eg, subtypes of each protein) may include.

TAZ 단백질의 변이체란 TAZ 단백질의 천연 아미노산 서열의 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 천연 아미노산 서열과 상이한 서열을 가지면서 천연(wild-type) 단백질의 고유의 생물학적 기능을 유지하는 단백질을 의미한다. 상기 변이체는 천연 단백질과 동일한 생물학적 활성을 나타내는 기능적 등가물이거나 필요에 의해서 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체일 수 있고, 물리, 화학적 환경에 대한 구조적 안정성이 증대되거나 생리학적 활성이 증대된 변이체일 수 있다.A variant of the TAZ protein means that one or more amino acid residues of the native amino acid sequence of the TAZ protein have a sequence different from the native amino acid sequence by deletion, insertion, non-conservative or conservative substitution, or a combination thereof, and a wild-type protein. It refers to a protein that maintains its intrinsic biological function. The variant may be a functional equivalent that exhibits the same biological activity as a natural protein or a variant in which the physicochemical properties of the protein are modified as necessary, and may be a variant with increased structural stability to physical and chemical environments or with increased physiological activity there is.

상기 TAZ 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 분리되거나, 재조합적 또는 합성적으로 제조된(non-naturally occurring) 것 일 수 있다.The TAZ protein or a variant thereof may be isolated from nature, or may be recombinantly or synthetically produced (non-naturally occurring).

또한, 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 핵산은 야생형 또는 상기한 바와 같은 변이체 형태의 TAZ 단백질을 코딩하는 염기서열로서, 하나 이상의 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 천연에서 분리되거나 화학적 합성법을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 TAZ 단백질을 코딩하는 염기서열을 갖는 핵산은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자(게놈, cDNA) 또는 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.In addition, the nucleic acid encoding the TAZ protein is a nucleotide sequence encoding the wild-type or mutant form of the TAZ protein as described above, and one or more bases may be mutated by substitution, deletion, insertion, or a combination thereof, and in nature It can be isolated or prepared using chemical synthesis. The nucleic acid having a nucleotide sequence encoding the TAZ protein may be single-stranded or double-stranded, and may be a DNA molecule (genomic, cDNA) or RNA (mRNA) molecule.

상기 TAZ의 변이체는 N- 말단이 절두된(truncated) C-말단 도메인을 포함할 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 예를 들어, 80번째, 예를 들어, 90번째, 예를 들어, 100번째, 예를 들어, 110번째, 예를 들어, 120번째, 예를 들어, 130번째, 예를 들어, 140번째, 예를 들어, 150번째, 예를 들어, 160번째, 예를 들어, 170번째, 예를 들어, 180번째, 예를 들어, 190번째, 예를 들어, 200번째 아미노산부터 C-말단까지의 영역일 수 있으나, 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 WW 도메인을 포함하는 TAZ 단백질 변이체라면 이에 제한되지 않는다. 상기 TAZ의 변이체는 서열번호 2, 서열번호 3 또는 서열번호 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것일 수 있다. 마우스의 경우 상기 TAZ C-말단 도메인은 N-말단으로부터 124번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다.The variant of the TAZ may include a C-terminal domain with an N-terminus truncated. From the N-terminus of the amino acid sequence of the TAZ protein, for example, the 80th, for example, the 90th, for example, the 100th, for example, the 110th, for example, the 120th, for example, 130th, eg 140th, eg 150th, eg 160th, eg 170th, eg 180th, eg 190th, eg 200 It may be a region from the first amino acid to the C-terminus, but if it is a TAZ protein variant including a WW domain capable of interacting with other proteins, it is not limited thereto. The TAZ variant may include a polypeptide comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 5. In the case of a mouse, the TAZ C-terminal domain may be a region from the 124th to the C-terminus from the N-terminus.

아울러, 상기 TAZ의 변이체는 단백질 가수분해에 저항성을 가지는 변이체라면 제한되지 않으나, 예를 들어 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 N 말단으로부터 58, 62, 306, 및 309번째 아미노산인 세린(Serine)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것일 수 있으며, 예를 들어 TAZ4SA일 수 있다.In addition, the variant of the TAZ is not limited as long as it is a variant having resistance to proteolysis, but for example, the 58, 62, 306, and 309 amino acids from the N-terminus of the protein comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 serine ( Serine) may be substituted with alanine, for example, TAZ4SA.

상기 용어 "포도당 내성"은 생체 내 포도당 처리능력을 의미하는 것으로, 포도당이 대사되는 속도를 측정하는 것으로, 많은 양의 포도당을 복용한 후 시간 간격으로 혈당치를 측정하여 계산될 수 있으며, 용어 "당내성"또는 "내당능"과 혼용될 수 있다. 상기 용어 "인슐린 감수성"은 외래성 인슐린에 대한 생체의 감수성을 의미하는 것으로, 일정량의 인슐린을 투여하였을 때의 혈당 저하도로 계산될 수 있으며, 용어 "인슐린 저항성"또는 "인슐린 내성"과 혼용될 수 있다.The term "glucose tolerance" refers to the ability to process glucose in vivo, and measures the rate at which glucose is metabolized. It can be used interchangeably with "sex" or "glucose tolerance". The term "insulin sensitivity" refers to the sensitivity of the body to exogenous insulin, and can be calculated as the degree of hypoglycemia when a certain amount of insulin is administered, and the term "insulin resistance" or "insulin resistance" may be used interchangeably. .

상기 조성물은 근육 세포의 인슐린 감수성을 증가시키는 것일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 포도당 내성을 억제시키고, 인슐린 민감성을 증진시켜 제 2형 당뇨병 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 공지의 천연 추출물, 천연물 기반 화합물, 합성 화합물 또는 이들의 조합일 수 있다. The composition may increase the insulin sensitivity of muscle cells. The pharmaceutical composition may further include a known active ingredient having preventive or therapeutic activity for type 2 diabetes mellitus by suppressing glucose tolerance and enhancing insulin sensitivity. The active ingredient may be a known natural extract, a natural product-based compound, a synthetic compound, or a combination thereof.

상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may further include a carrier, excipient or diluent. Carriers, excipients, or diluents can be, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.

상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.The pharmaceutical composition may have an oral or parenteral dosage form. The pharmaceutical composition may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injection solutions according to conventional methods, respectively. In the case of formulation, it can be prepared using a diluent or excipient such as a filler, extender, binder, wetting agent, disintegrant, surfactant, etc. commonly used.

상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제 또는 윤활제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 크림, 로션, 연고, 액제, 패취, 향낭(sachet), 주사제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다.In the pharmaceutical composition, the solid preparation for oral administration may be a tablet, pill, powder, granule, or capsule. The solid formulation may further include an excipient or lubricant. The excipient may be, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin. In addition, the lubricant may be magnesium stearate or talc. In the pharmaceutical composition, the oral liquid formulation may be a suspension, an oral solution, an emulsion, or a syrup. The liquid formulation may contain water or liquid paraffin. The liquid formulation may contain excipients, for example, wetting agents, sweetening agents, perfuming agents, or preservatives. In the pharmaceutical composition, the preparation for parenteral administration may be a cream, lotion, ointment, solution, patch, sachet, injection, sterile aqueous solution, non-aqueous solution, suspension, emulsion, freeze-dried or suppository. there is.

상기 약학적 조성물은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 약학적 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 250 mg 내지 약 6 g, 약 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회 내지 6회, 2 일 내지 3일에 1회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition may include TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof; a nucleic acid molecule encoding the protein; And it may include one or more selected from the group consisting of substances that increase the expression or activity of the TAZ in an effective amount. The effective amount includes factors including the severity of the disease, the age, weight, health, sex, sensitivity of the patient to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, and the drug used in combination or concurrently with the pharmaceutical composition. and other factors well known in the medical field. The effective amount is about 10 mg to about 10 g, about 100 mg to about 8 g, about 250 mg to about 6 g, about 500 mg to about 4 g, about 500 mg to about 2 g, or from about 500 mg to about 1 g. The pharmaceutical composition may be administered in a conventional manner via oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, or intradermal routes. The dosage of the pharmaceutical composition is, for example, from about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, from about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, or from about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg, based on an adult. kg, and may be administered once to 6 times a day, once every 2 to 3 days, or once several days.

상기 제2형 당뇨병은 비만, 고지방 식이, 아디포넥틴(adiponectin) 감소 돌연변이, 또는 스타틴(statin) 약물에 의하여 유도될 수 있다. The type 2 diabetes may be induced by obesity, a high-fat diet, an adiponectin-reducing mutation, or a statin drug.

또한 상기 스타틴은 예를 들면, 로바스타틴(lovastatin), 심바스타틴(simvastatin), 프라바스타틴(pravastatin), 플루바스타틴(fluvastatin), 아토르바스타틴(atorvastatin), 로수바스타틴(rosuvastatin), 이타바스타틴(itavastatin), 세리바스타틴(cerivastatin), 피타바스타틴(pitavastatin), 메바스타틴(mevastatin) 및 리바스타틴(rivastatin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 스타틴일 수 있다.In addition, the statin is, for example, lovastatin (lovastatin), simvastatin (simvastatin), pravastatin (pravastatin), fluvastatin (fluvastatin), atorvastatin (atorvastatin), rosuvastatin (rosuvastatin), itavastatin (itavastatin), ceriva It may be a statin selected from the group consisting of statin (cerivastatin), pitavastatin (pitavastatin), mevastatin (mevastatin) and rivastatin (rivastatin).

본 명세서에서 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질이란 근육 세포에서 TAZ 단백질의 발현량을 증가시키거나 TAZ의 반응 활성 또는 반응 속도의 향상을 유도할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 펩타이드, 항체, 앱타머, 천연추출물 또는 화학물질일 수 있으며, 예를 들면, 상기 물질은 근육세포 특이적으로 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 프로모터의 치환에 의한 물질일 수 있다. In the present specification, the substance that increases the expression or activity of TAZ means a substance capable of increasing the expression level of TAZ protein in muscle cells or inducing improvement of the reaction activity or reaction rate of TAZ, the type of which is particularly Without limitation, it may be a peptide, an antibody, an aptamer, a natural extract, or a chemical substance, for example, the substance may be a substance by substitution of a promoter that increases the expression or activity of TAZ specifically in muscle cells.

TAZ는 다양한 외부물질 투여 혹은 신호자극에 의해 발현 또는 활성이 증가될 수 있다. 그 예로 TAZ 활성은 radiation (UV, ionizing radiation 등), chemotherapeutic 약물, 외부 pathogens (rhinoviruses, N. gonorrhea, S. aureus, P. aeruginosa, C. parvum 등), 사이토카인, 산화적 스트레스 등에 의해 그 활성이 증가될 수 있다.TAZ expression or activity can be increased by administration of various foreign substances or signal stimulation. For example, TAZ activity is activated by radiation (UV, ionizing radiation, etc.), chemotherapeutic drugs, external pathogens (rhinoviruses, N. gonorrhea, S. aureus, P. aeruginosa, C. parvum, etc.), cytokines, oxidative stress, etc. can be increased.

또한 본 발명의 조성물은 TAZ를 코딩하는 핵산분자를 벡터를 통하여 도입할 수 있는데, 본 발명에서 사용할 수 있는 벡터는 예컨대 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스(Retrovirus) 벡터, HIV(Human immunodeficiency virus) 벡터, MLV(Murineleukemia virus)벡터, ASLV(Avian sarcoma/leukosis) 벡터, SNV(Spleen necrosis virus)벡터, RSV(Rous sarcoma virus)벡터, MMTV(Mouse mammary tumor virus) 벡터, 아데노바이러스(Adenovirus) 벡터, 아데노 관련 바이러스(Adenoassociatedvirus) 벡터, 헤르페스 심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus) 벡터 및 에피조말 (episomal) 벡터로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 벡터일 수 있다. In addition, the composition of the present invention can introduce a nucleic acid molecule encoding TAZ through a vector. The vector that can be used in the present invention includes, for example, a plasmid vector, a cosmid vector, a viral vector, a lentiviral vector, and a retrovirus vector. , HIV (Human immunodeficiency virus) vector, MLV (Murineleukemia virus) vector, ASLV (Avian sarcoma/leukosis) vector, SNV (Spleen necrosis virus) vector, RSV (Rous sarcoma virus) vector, MMTV (Mouse mammary tumor virus) vector, It may be one or more vectors selected from the group consisting of an adenovirus vector, an adenoassociatedvirus vector, a herpes simplex virus vector, and an episomal vector.

본 발명에서 "벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 발현 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 전달체를 의미할 수 있다. In the present invention, "vector" is an expression vector capable of expressing a target protein in a suitable host cell, and may refer to a gene delivery system including essential regulatory elements operably linked to express a gene insert.

본 발명의 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널, 인핸서 같은 발현 조절 요소 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 신호 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 또한, 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 벡터는 자가 복제하거나 숙주 DNA에 통합될 수 있다.The vector of the present invention includes a signal sequence or leader sequence for membrane targeting or secretion in addition to expression control elements such as a promoter, an operator, a start codon, a stop codon, a polyadenylation signal, and an enhancer, and may be prepared in various ways depending on the purpose. The promoter of the vector may be constitutive or inducible. In addition, the expression vector contains a selectable marker for selecting a host cell containing the vector, and in the case of a replicable expression vector, an origin of replication. Vectors can be self-replicating or integrated into host DNA.

다른 양상은 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체; 상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및 상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법을 제공한다. Another aspect is TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof; a nucleic acid molecule encoding the protein; And it provides a method of treating type 2 diabetes comprising administering to an individual other than a human at least one selected from the group consisting of a substance that increases the expression or activity of the TAZ.

상기 방법은 근육 세포 내 IRS 1 의 발현을 증진시켜 인슐린 민감성을 증진시켜 제2형 당뇨병을 치료할 수 있다.The method can treat type 2 diabetes by enhancing insulin sensitivity by enhancing the expression of IRS 1 in muscle cells.

또 다른 양상은 근육 세포 TAZ의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 근육 세포에 제2형 당뇨병 예방 또는 치료용 시험 물질을 가하는 단계; 상기 시험물질이 처리된 근육 세포에서 TAZ 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군에 비해 TAZ의 발현을 증가시킨 시험물질을 선별하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다. Another aspect includes measuring the expression level of muscle cell TAZ; adding a test substance for preventing or treating type 2 diabetes to the muscle cells; measuring the TAZ expression level in muscle cells treated with the test substance; And it provides a screening method of a substance for preventing or treating type 2 diabetes, comprising the step of selecting a test substance that has increased expression of TAZ compared to a control group not treated with the test substance.

구체적으로, 제2형 당뇨병 치료 시험 물질의 존재 및 부존재하에서 TAZ 단백질 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 제2형 당뇨병 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 근육 세포의 TAZ 단백질의 발현 수준을 간접적으로 또는 직접적으로 증가시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 제2형 당뇨병의 치료제로서 선택할 수 있다.Specifically, it is a method of comparing the increase or decrease of TAZ protein expression in the presence and absence of a type 2 diabetes treatment test substance, and it can be usefully used for screening a type 2 diabetes treatment agent. Substances that indirectly or directly increase the expression level of TAZ protein in muscle cells can be selected as the therapeutic agent for type 2 diabetes disclosed in the present invention.

즉, 제2형 당뇨병의 치료 시험 물질의 부존재시 및 존재시의 근육 세포에서 TAZ 단백질 발현 수준을 비교한 후, TAZ의 발현 수준을 증가시키는 물질을 제2형 당뇨병의 치료제로 예측할 수 있다.That is, after comparing the TAZ protein expression level in muscle cells in the absence and presence of the treatment test substance for type 2 diabetes, a substance that increases the expression level of TAZ can be predicted as a therapeutic agent for type 2 diabetes.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.Terms not otherwise defined herein have meanings commonly used in the art to which the present invention pertains.

일 양상에 따르면, TAZ 단백질 또는 이의 변이체를 포함하는 약학적 조성물은 근육세포 내 IRS1의 발현을 증진시켜 인슐린 민감성을 높일 수 있으므로 제 2형 당뇨병의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.According to one aspect, the pharmaceutical composition comprising the TAZ protein or a variant thereof can increase insulin sensitivity by enhancing the expression of IRS1 in muscle cells, so it can be used for preventing, improving, or treating type 2 diabetes.

도 1은 TAZ에 의한 IRS1 발현 및 인슐린 신호전달 증진을 확인한 것으로, 8주 내지 10주령의 야생형 (WT) 및 근육특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스에 인슐린을 복강내 주사하고 이의 결과를 확인한 결과(도 1A), 이의 리보솜 단백질 S6 키나아제, AS160, 인산화된 총 AKT의 비율을 평가한 결과(도 1B), 혈청-결핍 WT 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 1 nM 인슐린으로 처리하고 이의 용해물을 본석한 결과(도 1C), 혈청이 고갈된 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근아세포를 1nM 인슐린으로 처리한 결과(도 1D), 및 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스, WT 및 TAZ-KO MEF, Con 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 세포 유래의 골격 근육에서 Irs1 전사수준을 확인한 결과(도 1E)를 나타낸 것이다(*P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 2는 근육세포 내 포도당 항상성 과정에 있어서 TAZ의 역할을 확인한 것으로, 글루코스 섭취를 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포에서 분석한 결과(도 2A), 원형질 막 (PM) 및 사이토졸 (Cyt)으로 분별하고 Glut4 항체를 사용한 면역 블롯팅에 의해 분석을 수행한 결과(도 2B), 포도당 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, D- 포도당을 복강 내 주사 하였다. 지정된 시점에서 혈당을 측정한 결과(도 2C), 인슐린 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 4 시간 동안 금식시키고, 인슐린을 복강 내 투여하고, 이의 혈당 수준을 확인한 결과(도 2D), WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식 시키거나 임의로 식이시키고, 혈청 인슐린 농도를 분석한 결과(도 2E)를 나타낸 도이다(* p < 0.05; ** p < 0.01, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 3은 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스에 8주 동안 고지방식이 (HFD)를 하였다. 포도당 내성을 평가한 결과(도 3A), 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스를 8 주 동안 HFD 조건에 노출시키고 인슐린 내성을 평가한 결과(도 3B), 8 주의 HFD 공급 동안 마우스의 체중을 측정한 결과(도 3C), HFD를 투여한 WT 및 근육-특이적 TAZ-녹아웃 (mKO) 마우스의 부고환 백색 지방 조직 (epididymal white adipose tissue: eWAT)을 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 통해 분석한 결과(도 3D), 상기 마우스의 간 샘플을 H & E 염색을 통해 분석한 결과(도 3E)를 나타낸 도이다(* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 4는 TAZ가 결합하는 Irs1 조절 요소를 확인하기 위해, FLAG-TAZ (F-TAZ)-발현하는 C2C12 세포를 사용하여 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 한 결과(도 4A), ChIP- qPCR을 수행하여 TBE1 영역이 TAZ가 결합하는 부위인지 확인하는 실험을 수행한 결과(도 4B), c-Jun 및 Tead4가 Irs1 발현을 조절하고, 유사하게 c-Jun 및 Tead4가 TAZ/YAP 표적 유전자를 자극하는 것이 알려져 있으므로, si-RNA를 사용하여 c-Jun 및 Tead4를 모두 고갈시킨 경우 고갈이 Irs1의 발현이 조절되는지 확인한 결과(도 4C 및 4D), TBE1의 전사 조절 활성을 구체적으로 확인하기 위하여, TBE1을 둘러싸는 대략 500 bp의 DNA 요소를 클로닝하고 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 삽입 하였고, 이를 확인한 결과(도 4E 및 4F)에 나타낸 도이다(***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 5는 ChIP 된 DNA를 프라이머 세트 플랭킹 TBE1 (n = 3)을 갖는 qRT-PCR로 c-Jun이 TBE1에 직접 모집되는지 확인하기 위해 ChIP 분석을 수행하였고 그 결과(도 5A), TAZ가 c-Jun과 물리적으로 상호 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포를 F-TAZ- 및 c-Jun- 발현 플라스미드로 공동 형질 감염시켜 이를 면역블롯팅으로 분석을 수행한 결과(도 5B), 내인성 c-Jun 역시 TAZ와 상호 작용하는지 확인하기 위하여 C2C12 세포 용해물을 IgG 또는 c-Jun 항체로 면역 침전시키고, TAZ 및 c-Jun 항체를 사용하여 면역 복합체를 검출한 결과(도 5C), 야생형 (TBE-luc) 또는 돌연변이 c-Jun- 결합 부위 (TBE1m-luc)를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 c-Jun- 및 TAZ-발현 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 형질 감염 24 시간 후 분석한 결과(도 5D), TAZ의 특정 도메인을 변형시킨 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화될 수 있는지 확인하기 위하여 야생형 (아미노산 1-395), N- 말단-삭제된 TAZ (아미노산 124-395 및 164-395) 및 WW 도메인 절단 TAZ 발현 플라스미드 (ΔWW)를 293T 세포에 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 형질감염시켜 면역 블롯팅으로 이를 확인한 결과(도 5E), TAZ 돌연변이체의 전사 활성을 평가하기 위하여, TBE1-luc 리포터 플라스미드를 사용하였다. 293T 세포를 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 TAZ 결실 돌연변이체와 함께 형질 감염시켜, 면역 블롯팅으로 이를 확인한 결과(도 5F)를 나타낸 도이다(*p<0.05; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 6은 W8주 내지 10 주령의 야생형 (WT) 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 24 시간 동안 L 세포 유래의 Wnt3a-로 조절된 또는 대조군 배지로 처리하여 면역블롯팅으로 분석한 결과(도 6A), 상기 세포의 Irs1 발현을 qRT-PCR로 확인한 결과(도 6B), 대조군 (Con) 및 TAZ- 녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포를 24 시간 동안 대조군 또는 Wnt3a- 조절된 배지로 처리하고, IRS1 및 TAZ의 수준을 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 6C), 이후 세포로부터의 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR에 의해 Irs1 발현을 분석한 결과(도 6D), 생체 내 Wnt 신호 전달-유도 된 Irs1 발현에서 TAZ의 역할을 연구하기 위해 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 위장성 근육세포를 β- 카테닌 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 6E), 상기 마우스에서 Irs1 전사수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를(도 6G), 상기 마우스의 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 확인한 결과(도6G 및 6H)에 나타낸 도이다(*p<0.05; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 7은 스타틴에 의하여 유도된 TAZ 억제가 인슐린 민감성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험으로 면역 블롯팅으로 IRS1 및 TAZ 수준을 분석한 결과 (도 7A), RNA를 상기 위장 근육으로부터 분리하였고, IRS1 전사수준을 qRT-PCR로 분석한 결과(도 7B), 6주령의 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, 2g/kg 체중으로 D-글루코스를 복강 내 주사하고 혈청 내 포도당 수준을 측정한 결과(도 7C), 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 4 시간 동안 절식시킨 다음, 1.25 U/kg 체중으로 인슐린을 투여하여 혈청 포도당 수준을 분석한 결과(도 7D), C2C12 근관세포를 지정된 농도로 48 시간 동안 DMSO 또는 심바스타틴으로 처리하고, 이를 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 7E), 및 상기 세포를 수거하고, Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과(도 7F), 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7E의 조건과 동일한 실험을 수행한 결과(각각 도 7G 및 7H)에 나타낸 것이다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.005 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
도 8은 인슐린 신호 전달에 대한 심바스타틴의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 대조군 및 심바스타틴-처리 된 인슐린을 복강 내 주사하고 이를 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 8A), IRS1 및 TAZ 대 α-튜불린의 비를 분석, 총 AKT, AS160 및 리보솜 단백질 S6 키나아제에 대한 인산화된 비율을 측정한 결과(도 8B), C2C12 근관세포를 대조군, 야생형 TAZ 또는 단백질 분해성 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입하고 10 μM 심바스타틴 또는 DMSO를 48 시간 동안 세포에 첨가하고, 수득된 세포에서 IRS1 및 TAZ 수준을 면역 블롯팅으로 분석한 결과(도 8C), 상기 세포에서의 Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과(도 8D) 및 포도당 흡수 수준을 대조군, 야생형 TAZ 및 TAZ4SA-과발현 C2C12 근관세포에서 분석한 결과(도 8E)에 나타낸 도이다(*p<0.05; **p<0.01; ***p<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)).
Figure 1 confirms the enhancement of IRS1 expression and insulin signaling by TAZ, and the results of intraperitoneal injection of insulin into wild-type (WT) and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice aged 8 to 10 weeks and confirming the results (FIG. 1A), its ribosomal protein S6 kinase, AS160, as a result of evaluating the ratio of total phosphorylated AKT (FIG. 1B), serum-deficient WT and TAZ-knockout (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEF) with 1 nM insulin As a result of treatment with and lysates thereof (FIG. 1C), serum-depleted control (Con) and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myoblasts were treated with 1 nM insulin (FIG. 1D), and WT and muscle -Specific TAZ-knockout (mKO) mouse, WT and TAZ-KO MEF, Con and TAZ-knockdown (Ti) in skeletal muscle derived from C2C12 cells The result of confirming the transcription level of Irs1 (Fig. 1E) is shown (*P <0.05;**P<0.005, two tailed Student's t-test).
Figure 2 confirms the role of TAZ in the process of glucose homeostasis in muscle cells, and the result of analyzing glucose uptake in control (Con) and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myotube cells (Figure 2A), plasma membrane (PM) and cytosol (Cyt) and analysis by immunoblotting using Glut4 antibody (Fig. 2B), for glucose tolerance test, WT and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice were treated for 16 hours. was fasted for a while, and D-glucose was injected intraperitoneally. As a result of measuring blood glucose at designated time points (Fig. 2C), for insulin resistance test, WT and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice were fasted for 4 hours, insulin was administered intraperitoneally, and their blood glucose level was measured As a result of the confirmation (FIG. 2D), WT and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice were fasted or arbitrarily fed for 16 hours, and the results of analyzing the serum insulin concentration (FIG. 2E) are shown (* p <0.05; **p < 0.01, two tailed Student's t-test).
3 shows 8-week-old WT and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice on a high-fat diet (HFD) for 8 weeks. As a result of evaluating glucose tolerance (FIG. 3A), 8-week-old WT and muscle-specific TAZ-knockout (mKO) mice were exposed to HFD conditions for 8 weeks and insulin resistance was evaluated (FIG. 3B), HFD feeding for 8 weeks As a result of measuring the body weight of mice during (Fig. 3C), hematoxylin and eosin ( H & E) is a diagram showing the result of analysis through staining (FIG. 3D), and the result of analyzing the mouse liver sample through H & E staining (FIG. 3E) (* p <0.05; ** p <0.01; ***p < 0.005, two tailed Student's t-test).
Figure 4 shows the results of chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing using FLAG-TAZ (F-TAZ)-expressing C2C12 cells to confirm the Irs1 regulatory element to which TAZ binds (Figure 4A), ChIP-qPCR As a result of performing an experiment to confirm that the TBE1 region is the site where TAZ binds (Fig. 4B), c-Jun and Tead4 regulate Irs1 expression, and similarly c-Jun and Tead4 stimulate TAZ/YAP target genes As it is known that, when both c-Jun and Tead4 are depleted using si-RNA, as a result of confirming whether the depletion regulates the expression of Irs1 ( FIGS. 4C and 4D ), in order to specifically confirm the transcriptional regulatory activity of TBE1, An approximately 500 bp DNA element surrounding TBE1 was cloned and inserted into a luciferase reporter plasmid, and it is a diagram showing the result (FIGS. 4E and 4F) (*** p <0.005, two-tailed Student's t-test (two tailed) Student's t-test)).
Fig. 5 shows ChIP analysis was performed on the ChIPed DNA by qRT-PCR with primer set flanking TBE1 (n = 3) to confirm that c-Jun was directly recruited to TBE1. As a result (Fig. 5A), TAZ was c To confirm whether or not physically interacts with -Jun, 293T cells were co-transfected with F-TAZ- and c-Jun- expression plasmids and analyzed by immunoblotting (Fig. 5B), endogenous c In order to confirm that -Jun also interacts with TAZ, C2C12 cell lysate was immunoprecipitated with IgG or c-Jun antibody, and immune complexes were detected using TAZ and c-Jun antibody (FIG. 5C), wild-type (TBE) -luc) or a luciferase reporter plasmid with a mutant c-Jun- binding site (TBE1m-luc) was transfected into 293T cells along with c-Jun- and TAZ-expressing plasmids. As a result of analyzing the luciferase reporter gene activity 24 hours after transfection (FIG. 5D), when a specific domain of TAZ is modified, in order to check whether the TAZ signaling activity can be changed, wild-type (amino acids 1-395), N- Terminal-deleted TAZ (amino acids 124-395 and 164-395) and WW domain truncated TAZ expression plasmid (ΔWW) were transfected with c-Jun expression plasmid into 293T cells and confirmed by immunoblotting (FIG. 5E) , To evaluate the transcriptional activity of TAZ mutants, the TBE1-luc reporter plasmid was used. 293T cells were transfected with the TAZ deletion mutant together with the c-Jun expression plasmid, and the result was confirmed by immunoblotting (FIG. 5F) (* p <0.05; *** p <0.005, both sides Student's) t-test (two tailed Student's t-test).
Figure 6 shows W8-10-week-old wild-type (WT) and TAZ-knockout (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) treated with L-cell-derived Wnt3a- conditioned or control medium for 24 hours by immunoblotting. As a result of the analysis (FIG. 6A), as a result of confirming the Irs1 expression of the cells by qRT-PCR (FIG. 6B), control (Con) and TAZ- knockdown (Ti) C2C12 myotube cells were treated with control or Wnt3a- regulated for 24 hours. After treatment with the medium, and analysis of the levels of IRS1 and TAZ by immunoblotting (FIG. 6C), total RNA was extracted from the cells, and Irs1 expression was analyzed by qRT-PCR (FIG. 6D), in vivo To study the role of TAZ in intra-Wnt signaling-induced Irs1 expression, wild-type, muscle-specific TAZ-knockout (TAZmKO), muscle-specific adenomatous polyp E. coli (APC)-knockout (APCmKO), and muscle- Gastrointestinal muscle cells of specific APC and TAZ double-knockout (DbmKO) mice were analyzed by immunoblotting using β-catenin antibody (FIG. 6E), and the Irs1 transcription level in the mice was analyzed by qRT-PCR. (FIG. 6G) is a diagram showing the results (FIGS. 6G and 6H) confirming the glucose tolerance and insulin sensitivity of the mouse (* p <0.05; *** p <0.005, two-tailed Student's t -test)).
7 is an experiment to determine whether statin-induced TAZ inhibition can change insulin sensitivity. As a result of analyzing IRS1 and TAZ levels by immunoblotting ( FIG. 7A ), RNA was isolated from the gastrointestinal muscle, IRS1 As a result of analyzing the transcription level by qRT-PCR (FIG. 7B), simvastatin or vehicle was administered to 6-week-old mice for 3 weeks, the mice were fasted for 16 hours, and D-glucose was injected intraperitoneally at 2 g/kg body weight. As a result of measuring the glucose level in the serum (Fig. 7C), the mice were administered simvastatin or vehicle for 3 weeks, the mice were fasted for 4 hours, and then the serum glucose level was analyzed by administering insulin at 1.25 U/kg body weight. As a result (FIG. 7D), C2C12 myotube cells were treated with DMSO or simvastatin at the indicated concentration for 48 hours, which was analyzed by immunoblotting (FIG. 7E), and the cells were harvested, and Irs1 expression was measured by qRT-PCR. As a result of analysis by (FIG. 7F), it is shown in the results of performing the same experiment as in FIG. 7E with cerivastatin instead of simvastatin (FIGS. 7G and 7H, respectively) (*p<0.05;**p<0.01; * **p<0.005 two tailed Student's t-test).
FIG. 8 shows the results of intraperitoneal injection of control and simvastatin-treated insulin to further confirm the effect of simvastatin on insulin signal transduction (FIG. 8A), IRS1 and TAZ versus α-tubulin As a result of measuring the ratio of phosphorylated to total AKT, AS160 and ribosomal protein S6 kinase ( FIG. 8B ), C2C12 myotube cells were treated as a control group, wild-type TAZ or proteolytic degradation resistant TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) transduced with a retroviral vector, 10 μM simvastatin or DMSO was added to the cells for 48 hours, and the IRS1 and TAZ levels in the obtained cells were analyzed by immunoblotting ( FIG. 8C ). Irs1 expression was analyzed by qRT-PCR (FIG. 8D) and glucose uptake levels were analyzed in control, wild-type TAZ and TAZ4SA-overexpressing C2C12 myotube cells (FIG. 8E) (* p <0.05; * * p <0.01; *** p <0.005, two-tailed Student's t-test).

이하 실험예 및 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실험예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, it will be described in more detail through experimental examples and examples. However, these Examples are for illustrative purposes, and the scope of the present invention is not limited to these Experimental Examples and Examples.

실험예 1. 실험에 사용한 쥐의 제조Experimental Example 1. Preparation of mice used in the experiment

고려대학교 생명 동물 관리위원회의 승인을 받아, 고려대학교의 무균 시설에 마우스를 사육시켰다. 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 마우스의 경우, Taz의 엑손 2 옆에 위치한 LoxP 부위를 함유하는 플랭킹된 대립 유전자를 활용하여 제조하였다. LoxP 부위는 네오마이신 선별 카세트의 상류에 위치하고, 네오마이신 선택 카세트를 EIIa-Cre 마우스와의 교차를 통한 부분 재조합에 의해 결실시켰다. Taz 플록스 된 대립 유전자를 갖는 마우스를 근육 크레아틴 키나아제 (MCK)-Cre 마우스와 교차시켰다. MCK-Cre 대립 유전자의 존재하에, Taz의 플록스된 엑손 2는 Cre- 매개 재조합에 의해 절단되었다. 근육-특이적 TAZ- 및 APC-더블 녹아웃 마우스를 생성하기 위해, APCfl / fl 마우스를 MCK-Cre : Tazfl / fl 마우스와 교차시켰다. APCfl / fl (C57BL / 6-Apctm1Tyj / J, # 009045), MCK-Cre (FVB-Tg (Ckmm-cre) 5Khn / J, # 006405) 및 EIIa-Cre (FVB / N-Tg (EIIa-cre) C5379Lmgd / J, # 003314) 마우스를 Jackson Laboratory에서 구입하였다. 고지방식이 조건의 경우, 8 주령 마우스에 8 주 동안 Research Diet (D12331)의 식이를 섭취시켰다.With the approval of the Korea University Life Animal Management Committee, mice were bred in Korea University's sterile facility. For muscle-specific TAZ-knockout mice, a flanking allele containing a LoxP site located next to exon 2 of Taz was prepared utilizing. The LoxP site was located upstream of the neomycin selection cassette, and the neomycin selection cassette was deleted by partial recombination through crossover with EIIa-Cre mice. Mice carrying the Taz floxed allele were crossed with muscle creatine kinase (MCK)-Cre mice. In the presence of the MCK-Cre allele, the floxed exon 2 of Taz was cleaved by Cre-mediated recombination. To generate muscle-specific TAZ- and APC-double knockout mice, APCfl/fl mice were crossed with MCK-Cre:Taz fl/fl mice. APC fl/fl (C57BL/6-Apctm1Tyj/J, #009045), MCK-Cre (FVB-Tg (Ckmm-cre) 5Khn/J, #006405) and EIIa-Cre (FVB/N-Tg (EIIa-cre) ) C5379Lmgd/J, # 003314) mice were purchased from Jackson Laboratory. For the high-fat diet condition, 8-week-old mice were fed a diet of Research Diet (D12331) for 8 weeks.

실험예 2. 세포 배양Experimental Example 2. Cell Culture

C2C12 세포 (ATCC)를 20 % 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양하였다. MEF를 마우스 배아로부터 수득하고 10 % 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM에서 배양시켰다. 두 성장 배지 모두에 페니실린 및 스트렙토마이신이 보충되었다. 근원적 분화를 위해, C2C12 세포를 배양 플레이트에 시딩하고 24 시간 동안 유지시켰다. 세포가 컨플리언시에 도달하면, 배지를 2 % 말 혈청을 함유하는 DMEM으로 변경하여 분화를 촉진시켰다. 모든 세포를 5 % CO2 대기로 37 ℃에서 배양하였다.C2C12 cells (ATCC) were cultured in DMEM containing 20% fetal bovine serum. MEFs were obtained from mouse embryos and cultured in DMEM containing 10% fetal bovine serum. Both growth media were supplemented with penicillin and streptomycin. For myogenic differentiation, C2C12 cells were seeded in culture plates and maintained for 24 h. When cells reached confluence, the medium was changed to DMEM containing 2% horse serum to promote differentiation. All cells were incubated at 37° C. in a 5% CO 2 atmosphere.

실시예 1. 근육세포에서 TAZ의 대사기능의 확인 Example 1. Confirmation of metabolic function of TAZ in muscle cells

TAZ의 대사 기능을 이해하기 위해 근육 크레아틴 키나아제-Cre 마우스를 사용하여 근육-특이적 TAZ 녹아웃(TAZ-knockout: mKO) 마우스를 제조하였다. 근육과 같은 조직에서 주로 나타나는 인슐린-의존적 포도당의 이용과정은 인슐린 수용체 (IR)의 활성화와 IRS1/2, Akt 키나아제와 리보솜 S6 키나아제 (S6K) 및 160kDa (AS160)와 같은 기질의 순차적 활성이 필요한 것으로 알려져 있다. 특히, 인슐린 신호 전달에서 TAZ의 역할을 확인하기 위해, 8주 내지 10주령의 야생형 (WT) 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에 인슐린을 복강내 주사하였고, 상기 근육 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이의 결과를 도 1A에 나타내었다. 이후, 리보솜 단백질 S6 키나아제, AS160, 인산화된 총 AKT의 비율을 평가하고 이를 도 1B에 나타내었다. 혈청-결핍 WT 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포 (MEF)를 1 nM 인슐린으로 처리하였다. 지정된 시점에서 면역 블롯팅에 의해 세포 용해물을 분석하였고, 이의 결과를 도 1C에 나타내었다. 혈청이 고갈된 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된 (Ti) C2C12 근아세포를 1nM 인슐린으로 처리하였다. 지정된 시점에서 제조된 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이의 결과를 도 1D에 나타내었다. Irs1 전사는 WT 및 TAZ- 녹아웃(mKO), WT 및 TAZ-KO MEF, Con 및 Ti C2C12 세포 유래의 골격 근육에서 qRT-PCR에 의해 분석하였고, 이의 결과를 도 1E 에 나타내었다. To understand the metabolic function of TAZ, muscle-specific TAZ knockout (TAZ-knockout: mKO) mice were prepared using muscle creatine kinase-Cre mice. Insulin-dependent glucose utilization, which occurs mainly in tissues such as muscle, requires the activation of the insulin receptor (IR) and the sequential activation of substrates such as IRS1/2, Akt kinase and ribosomal S6 kinase (S6K) and 160 kDa (AS160). is known In particular, to confirm the role of TAZ in insulin signaling, 8 to 10 week old wild-type (WT) and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice were intraperitoneally injected with insulin, and the muscle lysates were immunoblotted. Analyzed by lot, the results are shown in Figure 1A. Thereafter, the ratio of ribosomal protein S6 kinase, AS160, and total phosphorylated AKT was evaluated and shown in FIG. 1B . Serum-deficient WT and TAZ-knockout (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEF) were treated with 1 nM insulin. Cell lysates were analyzed by immunoblotting at the indicated time points, and the results are shown in Figure 1C. Serum-depleted control (Con) and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myoblasts were treated with 1 nM insulin. Cell lysates prepared at designated time points were analyzed by immunoblotting, and the results are shown in FIG. 1D . Irs1 transcription was analyzed by qRT-PCR in skeletal muscle derived from WT and TAZ-knockout (mKO), WT and TAZ-KO MEF, Con and Ti C2C12 cells, and the results are shown in FIG. 1E .

도 1A 및 B에 나타낸 바와 같이, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 WT 마우스보다 Akt 활성이 낮았고, 이 결과는 S6K 및 AS160의 인산화 감소를 통하여도 확인되었다. 도 1C 및 1D에 나타난 바와 같이 IRS1에서만 IR 단백질 수준의 변화 없이 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에서 상당히 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다. 상기와 같은 IRS1 수준의 감소과 Akt 활성감소는 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 근육 조직에서만 나타나는 것이 확인되었으며, 아울러 도 1E에서는 Irs1 전사 수준이 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스, TAZ-녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF) 및 TAZ- 녹다운된(Ti) C2C12 근육 모세포에서 감소된 것을 확인할 수 있었다. 1A and B, muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice had lower Akt activity than WT mice, and this result was also confirmed through reduced phosphorylation of S6K and AS160. As shown in FIGS. 1C and 1D , it was confirmed that only IRS1 was significantly downregulated in muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice without a change in IR protein level. The decrease in IRS1 level and Akt activity as described above were confirmed to appear only in muscle tissue of muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice, and in FIG. 1E, Irs1 transcription levels were muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice, TAZ - Knockout (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEF) and TAZ- It was confirmed that it was reduced in knockdown (Ti) C2C12 myoblasts.

실시예 2. 근육세포에서 TAZ에 의한 인슐린 신호전달 과정 및 인슐린 민감성 감소의 상승확인Example 2. Confirmation of increase in insulin signaling process and insulin sensitivity reduction by TAZ in muscle cells

근육세포 내 포도당 항상성 과정에 있어서 TAZ의 역할을 확인하기 위해, 2- 데옥시포도당 흡수를 시험관 내(in vitro)에서 C2C12 근아세포에서 정량화하였다. To confirm the role of TAZ in the intramuscular glucose homeostasis process, 2-deoxyglucose uptake was quantified in C2C12 myoblasts in vitro.

글루코스 섭취를 대조군 (Con) 및 TAZ-녹다운된(Ti) C2C12 근관세포에서 분석하였고, 이의 결과를 도 2A 에 나타내었다. Con 및 TAZ-녹다운된(Ti) C2C12 근관세포를 100 nM 인슐린으로 처리하였다. 30 분 후, 원형질 막 (PM) 및 사이토졸 (Cyt)으로 분별하고 Glut4 항체를 사용한 면역 블롯팅에 의해 분석을 수행하고, 인슐린 수용체 β-서브 유닛 및 α-튜불린을 각각 PM 및 Cyt 로딩 대조군으로 사용 하였고, 이의 결과를 도 2B에 나타내었다. 포도당 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, D- 포도당을 복강 내 주사 하였다. 지정된 시점에서 혈당을 측정하였고, 이의 결과를 도 2C에 나타내었다. 인슐린 내성 시험을 위해, WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 4 시간 동안 금식시키고, 인슐린을 복강 내 투여하였다. 지정된 시점에 혈당 수준을 측정하였고, 이의 결과를 도 2D에 나타내었다. WT 및 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 16 시간 동안 금식시키거나 임의로 식이시키고, 혈청 인슐린 농도를 분석하였으며, 이의 결과를 도 2E 에 나타내었다. Glucose uptake was analyzed in control (Con) and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myotube cells, and the results are shown in FIG. 2A . Con and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myotube cells were treated with 100 nM insulin. After 30 min, fractionation into plasma membrane (PM) and cytosol (Cyt) and analysis by immunoblotting using Glut4 antibody were performed, and insulin receptor β-subunit and α-tubulin were treated with PM and Cyt loading controls, respectively. was used, and the results are shown in Figure 2B. For glucose tolerance testing, WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice were fasted for 16 h, and D-glucose was injected intraperitoneally. Blood glucose was measured at designated time points, and the results are shown in FIG. 2C. For insulin resistance testing, WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice were fasted for 4 hours, and insulin was administered intraperitoneally. Blood glucose levels were measured at designated time points, and the results are shown in FIG. 2D. WT and TAZ knockout (mKO) mice were fasted or fed ad libitum for 16 hours, and serum insulin concentrations were analyzed, and the results are shown in FIG. 2E .

도 2A에서 확인한 바와 같이, 포도당 흡수는 TAZ-녹다운된 세포(Ti)에서 유의하게 감소 하였다. Akt는 골격근에서 포도당 흡수를 촉진하기 위해 Glut4 원형질막 발현을 유도하는 것으로 알려져 있는데, 특히 도 2에서 확인한 바와 같이, 100nM의 인슐린을 가한 대조군과 TAZ-녹다운 C2C12 근관세포(Ti)에서는 30분 이후 플라즈마 멤브리인(PM)에 위치하는 Glut4 수준이 TAZ 녹다운 세포에서 감소하는 것에 확인되었고, 이는 결국 TAZ가 혈장막으로의 Glut4 전위를 통해 포도당 흡수를 유도할 수 있는 기능이 있는 것을 나타낸다. 또한 도 2C에서 포도당 주입한 경우 TAZ 녹아웃(mKO)에서 혈당 제거능이 감소되는 것을 확인되었으며, 이러한 인슐린-매개된 혈당의 감소는 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에서 특히 현저하게 감소되는 것이 확인되었다. 또한 야생형과 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 금식시키거나 임의로 배식을 한 경우, 도 2E에서 확인할 수 있는 바와 같이, TAZ 녹아웃 마우스에서 혈청 인슐린 수준이 다소 상승한 것으로 나타나, TAZ 녹아웃으로 인해 나타나는 손상된 포도당 항상성은 인슐린 민감성 및 포도당 내성(glucose tolerance)의 손상에 의해 나타나는 것으로 확인되었다. 종합적으로 TAZ가 인슐린 민감성과 포도당 내성과 연관성이 높은 것을 확인하였다. As confirmed in Figure 2A, glucose uptake was significantly decreased in TAZ-knockdown cells (Ti). Akt is known to induce Glut4 plasma membrane expression to promote glucose uptake in skeletal muscle. In particular, as shown in FIG. 2 , in control and TAZ-knockdown C2C12 myotube cells (Ti) to which 100 nM of insulin was applied, plasma membrane was formed after 30 min. It was confirmed that the level of Glut4 located in brine (PM) was decreased in TAZ knockdown cells, indicating that TAZ has the ability to induce glucose uptake through Glut4 translocation to the plasma membrane. In addition, it was confirmed in Figure 2C that when glucose was injected, the blood glucose removal ability was reduced in TAZ knockout (mKO), and this insulin-mediated decrease in blood sugar was particularly significantly reduced in muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice. became In addition, when wild-type and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice were fasted or arbitrarily cultured, as can be seen in FIG. 2E , the serum insulin level was slightly elevated in TAZ knockout mice, which appears due to TAZ knockout. Impaired glucose homeostasis has been shown to be caused by impairment of insulin sensitivity and glucose tolerance. Overall, it was confirmed that TAZ was highly correlated with insulin sensitivity and glucose tolerance.

실시예 3. TAZ에 의한 포도당 내성 효과확인Example 3. Confirmation of glucose tolerance effect by TAZ

상기 실험예를 통해 제조한 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스에 8주 동안 고지방식이 (HFD)를 하였다. 포도당 내성을 평가하기 위해, 마우스를 16 시간 동안 기아 상태로 만들고, 복강 내 주사를 통해 D-글루코스를 주입하였다. 일정 시점에서 혈당 수준을 측정하였고, 이를 도 3A에 나타내었다. 또한 8 주령 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 8 주 동안 HFD 조건에 노출시키고 인슐린 내성을 평가하였다. 4 시간의 금식 후, 마우스에 인슐린을 복강 내 투여하였다. 일정 시점에서 혈당 수준을 측정하였고, 이를 도 3B에 나타내었다. 8 주의 HFD 공급 동안, 마우스의 체중을 매주 측정하였고, 이를 도 3C에 나타내었다. 또한 상기와 같이 HFD를 투여한 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스를 안락사시키고, 부고환 백색 지방 조직 (epididymal white adipose tissue: eWAT)을 HFD 공급 WT 및 mKO 마우스로부터 단리하고, 고정시키고, 탈수시키고, 파라핀으로 고정시켰다. 그 후, eWAT를 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 통해 절단하고 분석하여 WT 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스 사이의 표현형 차이를 확인하였고 이를 도 3D에 나타내었다. 지방 세포 크기는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 측정되었다(스케일 바 = 100 μm). 간을 HFD 공급 야생형 및 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스로부터 해부하고 고정시키고, 탈수시키고, 파라핀으로 고정시켰다. 파라핀 고정 조직의 절편 후, 간 샘플을 H & E 염색을 통해 분석하였다. 간에서 지질을 염색하기 위해, 단리된 간을 OCT 화합물에 매립하고, 냉동시키고, 크라이오톰을 사용하여 절편화하였다. 간에서 지질을 시각화하기 위해 샘플을 오일-레드-O 염색법으로 염색하였고, 이를 도 3E에 나타내었다(스케일 바 = 100 μm). 스튜던트 t-테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.8-week-old WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice prepared in the above experimental example were subjected to a high-fat diet (HFD) for 8 weeks. To evaluate glucose tolerance, mice were starved for 16 h and injected with D-glucose via intraperitoneal injection. Blood glucose levels were measured at certain time points and are shown in FIG. 3A . In addition, 8-week-old WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice were exposed to HFD conditions for 8 weeks and insulin resistance was assessed. After 4 hours of fasting, the mice were intraperitoneally administered with insulin. Blood glucose levels were measured at certain time points, and are shown in FIG. 3B . During 8 weeks of HFD feeding, mice were weighed weekly, and this is shown in FIG. 3C . In addition, WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice administered with HFD as described above were euthanized, and epididymal white adipose tissue (eWAT) was isolated from HFD-fed WT and mKO mice, fixed, and It was dehydrated and fixed with paraffin. Thereafter, eWAT was cleaved through hematoxylin and eosin (H & E) staining and analyzed to identify phenotypic differences between WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice, which are shown in FIG. 3D . Adipocyte size was measured using ImageJ software (scale bar = 100 μm). Livers were dissected from HFD fed wild-type and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice, fixed, dehydrated, and paraffin-fixed. After sectioning of paraffin-fixed tissue, liver samples were analyzed via H&E staining. For lipid staining in the liver, isolated livers were embedded in OCT compounds, frozen, and sectioned using a cryotome. To visualize lipids in the liver, samples were stained with Oil-Red-O staining, which is shown in Figure 3E (scale bar = 100 μm). Statistical analysis was performed using Student's t-test.

도 3A및 3B에서 확인한 바와 같이, WT와 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 대사장애가 있는지 확인하였으나, 표현형을 확인한 결과 인슐린 감수성의 차이를 제외하고는 대사 장애가 검출되지 않았고, 간 및 지방 조직에서 표현형 차이는 존재하지 않음을 확인하였다. 그러나 고지방 식이를 투여한 경우 몇 가지 표현형의 차이가 확인되었는데, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 감소된 인슐린 감수성과 혈청 내 포도당 제거가 효과적으로 일어나지 않음을 확인할 수 있었다. 또한 도 3C및 도 3D에서 확인한 바와 같이 지방 세포 크기가 증가함에 따라 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스의 체중이 증가되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3E에서 확인한 바와 같이, 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스는 간 섹션에서 증가된 양의 지질 방울이 확인되어 지방간 표현형이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 이러한 결과를 통해 TAZ가 근육에서 인슐린 신호 전달 및 항상성 유지에 중요한 조절자로 기능할 수 있으며, 이는 TAZ와 인슐린 감수성 및 포도당 내성이 강력하게 연관되어 있음을 확인할 수 있었다. As confirmed in Figures 3A and 3B, it was confirmed whether there was a metabolic disorder in WT and muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice, but as a result of confirming the phenotype, no metabolic disorder was detected except for the difference in insulin sensitivity, liver and adipose tissue It was confirmed that there was no phenotypic difference. However, when a high-fat diet was administered, several phenotypic differences were confirmed, and it was confirmed that muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice had reduced insulin sensitivity and no effective serum glucose clearance. Also, as confirmed in FIGS. 3C and 3D , it was confirmed that the body weight of the muscle-specific TAZ knockout (mKO) mice increased as the fat cell size increased. In addition, as confirmed in FIG. 3E , in the muscle-specific TAZ knockout (mKO) mouse, an increased amount of lipid droplets was confirmed in the liver section, and it was confirmed that the fatty liver phenotype appeared. Therefore, these results confirm that TAZ can function as an important regulator for insulin signaling and homeostasis maintenance in muscle, and it can be confirmed that TAZ is strongly associated with insulin sensitivity and glucose tolerance.

실시예 4. 근육세포에서 TAZ의 신호전달 과정의 확인Example 4. Identification of TAZ signaling process in muscle cells

TAZ가 결합하는 Irs1 조절 요소를 확인하기 위해, FLAG-TAZ (F-TAZ)-발현하는 C2C12 세포를 사용하여 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 수행하였다. 도 4A에 염색질 면역침강 (ChIP) 시퀀싱을 수행한 결과를 나타내었으며, 도 4A를 통해 TAZ-결합 DNA 요소 중에서, 1 차 표적 요소 (TAZ 결합 요소 # 1; TBE1)는 H3Kme1과 관련된 ChIP 서열 분석 데이터를 포함하여 ChIP 서열 분석의 피크 점수 및 NCBI 시퀀스 리드 아카이브에서 얻은 H3Kme1, H3Kme3 및 H3K27ac 정보를 포함하는 게놈 영역 측면에서 Irs1의 염색질 변형 상태를 고려하여 선택하였다. To identify the Irs1 regulatory element to which TAZ binds, chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing was performed using FLAG-TAZ (F-TAZ)-expressing C2C12 cells. FIG. 4A shows the results of chromatin immunoprecipitation (ChIP) sequencing. Through FIG. 4A, among TAZ-binding DNA elements, the primary target element (TAZ binding element #1; TBE1) is ChIP sequencing data related to H3Kme1 were selected considering the chromatin modification status of Irs1 in terms of genomic regions containing H3Kme1, H3Kme3 and H3K27ac information obtained from the NCBI sequence read archive and peak scores of ChIP sequencing analysis including

아울러, ChIP- qPCR을 수행하여 TBE1 영역이 TAZ가 결합하는 부위인지 확인하는 실험을 수행하였고 이를 도 4B에 나타내었다. ChIP은 대조군과 F-TAZ 과발현시킨 C2C12세포로 확인하였다. 도 4B에서 확인한 바와 같이, 전사 활성 영역은 TBE1과 중첩되고, TAZ가 전사 활성 Irs1 cis-조절 요소와 연관성이 있는 것을 확인할 수 있었으며, 이와 같은 TBE1에 대한 TAZ 결합은 ChIP-PCR을 통해 확인할 수 있었다. In addition, by performing ChIP-qPCR, an experiment was performed to determine whether the TBE1 region is a site to which TAZ binds, which is shown in FIG. 4B . ChIP was confirmed with the control group and C2C12 cells overexpressing F-TAZ. As confirmed in FIG. 4B, the transcriptional active region overlapped with TBE1, and it could be confirmed that TAZ was associated with the transcriptionally active Irs1 cis-regulatory element, and such TAZ binding to TBE1 was confirmed through ChIP-PCR. .

아울러, c-Jun 및 Tead4가 Irs1 발현을 조절하고, 유사하게 c-Jun 및 Tead4가 TAZ/YAP 표적 유전자를 자극하는 것이 알려져 있으므로, si-RNA를 사용하여 c-Jun 및 Tead4를 모두 고갈시킨 경우, 상기 인자의 고갈이 Irs1의 발현을 조절할 수 있는지를 실험해보았으며, 이를 도 4C및 도 4D에 나타내었다. 도 4C및 도 4D에서 확인할 수 있는 바와 같이, c-Jun 및 Tead4가 고갈되는 경우 Irs1도 상당히 하향 조절되는 것을 확인할 수 있었다. TBE1의 전사 조절 활성을 구체적으로 확인하기 위하여, TBE1을 둘러싸는 대략 500 bp의 DNA 요소를 클로닝하고 루시퍼라제 리포터 플라스미드에 삽입 하였고, 이를 확인한 결과를 도 4E 및 4F에 나타내었다. 도 4E에서 확인할 수 있는 바와 같이, 리포터 유전자 활성은 TAZ 및 c-Jun 또는 Tead4의 존재 하에 유도되며, TAZ와 c-Jun 및 Tead4이 모두 존재하는 경우 시너지 효과가 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3F에서 확인한 바와 같이, 리포터 플라스미드는 TAZ- 넉다운 세포에 도입되었을 때, 그 리포터 유전자 활성이 WT보다 현저하게 감소되었다. 따라서, TAZ는 공동-자극자(costimulator)인 c-Jun 및 Tead4를 매개로 한 Irs1 전사를 유도할 수 있음을 확인하였다. In addition, it is known that c-Jun and Tead4 regulate Irs1 expression, and similarly c-Jun and Tead4 stimulate TAZ/YAP target genes, so when both c-Jun and Tead4 were depleted using si-RNA , it was tested whether the depletion of this factor can regulate the expression of Irs1, which is shown in FIGS. 4C and 4D. As can be seen in Figures 4C and 4D, it was confirmed that when c-Jun and Tead4 are depleted, Irs1 is also significantly down-regulated. In order to specifically confirm the transcriptional regulatory activity of TBE1, an approximately 500 bp DNA element surrounding TBE1 was cloned and inserted into a luciferase reporter plasmid, and the confirmed results are shown in FIGS. 4E and 4F. As can be seen in FIG. 4E, reporter gene activity is induced in the presence of TAZ and c-Jun or Tead4, and it was confirmed that a synergistic effect occurs when both TAZ and c-Jun and Tead4 are present. In addition, as confirmed in Fig. 3F, when the reporter plasmid was introduced into TAZ-knockdown cells, the reporter gene activity was significantly reduced compared to that of WT. Therefore, it was confirmed that TAZ can induce Irs1 transcription mediated by costimulators c-Jun and Tead4.

실시예 5. 근육세포에서의 TAZ의 결합 도메인의 확인Example 5 Identification of the binding domain of TAZ in muscle cells

8주 내지 10 주령의 마우스 위장 근육 게놈 DNA를 초음파 처리하여 절단하고, 염색질 단편을 c-Jun 항체로 면역 침전시켰다. ChIP 된 DNA를 프라이머 세트 플랭킹 TBE1 (n = 3)을 갖는 qRT-PCR로 c-Jun이 TBE1에 직접 모집되는지 확인하기 위해 ChIP 분석을 수행하였고 그 결과를 도 5A에 나타내었다. 도 5A에서 확인한 바와 같이, TBE1영역은 c-Jun에 의해 점유되는 것이 확인되었으며, 특히 c-Jun에는 TAZ WW 도메인 27과 상호 작용할 수 있는 Pro-Pro-X-Tyr 모티프가 포함되어 있는 것이 알려져 있다. Genomic DNA of gastrointestinal muscle from 8 to 10 weeks of age was digested by sonication, and chromatin fragments were immunoprecipitated with c-Jun antibody. ChIP analysis was performed on the ChIPed DNA by qRT-PCR with the primer set flanking TBE1 (n = 3) to confirm that c-Jun was directly recruited to TBE1, and the results are shown in Fig. 5A. As confirmed in FIG. 5A, it was confirmed that the TBE1 region was occupied by c-Jun, and in particular, it is known that c-Jun contains a Pro-Pro-X-Tyr motif capable of interacting with TAZ WW domain 27. .

TAZ가 c-Jun과 물리적으로 상호 작용하는지 여부를 확인하기 위하여, 293T 세포를 F-TAZ- 및 c-Jun- 발현 플라스미드로 공동 형질 감염시켰다. 항 -FLAG 항체로 면역 침전시킨 후, 용리된 샘플을 TAZ 및 c-Jun 항체로 면역 블롯팅하여 분석을 수행하였으며, 이를 도 5B 에 나타내었다. 도 5B 에서 확인한 바와 같이, 이소성 발현된 TAZ 및 c-Jun은 서로 상호 작용하였다. To determine whether TAZ physically interacted with c-Jun, 293T cells were co-transfected with F-TAZ- and c-Jun-expressing plasmids. After immunoprecipitation with anti-FLAG antibody, the eluted sample was subjected to analysis by immunoblotting with TAZ and c-Jun antibodies, which is shown in FIG. 5B . As confirmed in FIG. 5B , the ectopic expressed TAZ and c-Jun interacted with each other.

아울러, 내인성 c-Jun 역시 TAZ와 상호 작용하는지 확인하기 위하여 C2C12 세포 용해물을 IgG 또는 c-Jun 항체로 면역 침전시키고, TAZ 및 c-Jun 항체를 사용하여 면역 복합체를 검출하였고, 결과를 도 5C에 나타내었다. 도 5 C에서 확인한 바와 같이, TAZ 및 c-Jun은 내인적으로 상호작용 하였다.In addition, to confirm that endogenous c-Jun also interacts with TAZ, C2C12 cell lysate was immunoprecipitated with IgG or c-Jun antibody, and immune complexes were detected using TAZ and c-Jun antibody, and the results are shown in FIG. 5C shown in As confirmed in FIG. 5C , TAZ and c-Jun interacted endogenously.

TBE 1 영역을 변형시키는 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위하여 TBE1-luc에서 c-Jun- 결합 부위를 돌연변이 시켰다. c-Jun- 결합 부위는 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 생성되었다. 야생형 (TBE-luc) 또는 돌연변이 c-Jun- 결합 부위 (TBE1m-luc)를 갖는 루시퍼라제 리포터 플라스미드를 c-Jun- 및 TAZ-발현 플라스미드와 함께 293T 세포에 형질 감염시켰다. 루시퍼라제 리포터 유전자 활성을 형질 감염 24 시간 후 분석하였고, 이 결과를 도 5D에 나타내었다. 도 5D 에서 확인한 바와 같이, TBE1-luc돌연변이체(TBE1m-luc)는 TAZ 및 c-Jun의 존재 하에 리포터 플라스미드의 활성이 확연하게 낮아지는 것이 확인되었다. If the TBE 1 region is modified, the c-Jun- binding site in TBE1-luc was mutated to check whether the TAZ signaling activity could be changed. The c-Jun-binding site was generated by site-directed mutagenesis. Luciferase reporter plasmids with wild-type (TBE-luc) or mutant c-Jun-binding sites (TBE1m-luc) were transfected into 293T cells along with c-Jun- and TAZ-expressing plasmids. Luciferase reporter gene activity was analyzed 24 hours after transfection, and the results are shown in FIG. 5D. As confirmed in FIG. 5D , it was confirmed that the TBE1-luc mutant (TBE1m-luc) significantly lowered the activity of the reporter plasmid in the presence of TAZ and c-Jun.

TAZ의 특정 도메인을 변형시킨 경우, TAZ 신호전달 활성을 변화될 수 있는지 확인하기 위하여 야생형 (아미노산 1-395), N- 말단-삭제된 TAZ (아미노산 124-395 및 164-395) 및 WW 도메인 절단 TAZ 발현 플라스미드 (ΔWW)를 293T 세포에 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 형질감염 시켰다. 세포 용해물을 FLAG 항체로 형질 감염한지 24 시간 후에 면역 침전시키고, 용리된 샘플을 TAZ 및 c-Jun 항체를 사용한 면역 블롯팅으로 분석하고, 그 결과를 도 5E 에 나타내었다. 도 5 E에서 나타난 바와 같이, WW 도메인이 결여된 TAZ 돌연변이체 구조물 (TAZΔWW 및 TAZ164-395)은 c-Jun과 상호 작용하지 않았으나, WW 도메인 함유 구조물 (TAZwt 및 TAZ124-395)은 c-Jun과 상호작용 하는 것을 확인할 수 있었다. Wild-type (amino acids 1-395), N-terminal-deleted TAZs (amino acids 124-395 and 164-395) and WW domain cleavage to confirm that TAZ signaling activity can be altered when specific domains of TAZ are modified TAZ expression plasmid (ΔWW) was transfected with c-Jun expression plasmid into 293T cells. Cell lysates were immunoprecipitated 24 hours after transfection with FLAG antibody, and the eluted samples were analyzed by immunoblotting using TAZ and c-Jun antibodies, and the results are shown in FIG. 5E . As shown in FIG. 5E , the TAZ mutant constructs lacking the WW domain (TAZΔWW and TAZ164-395) did not interact with c-Jun, whereas the constructs containing the WW domain (TAZwt and TAZ124-395) interacted with c-Jun. interaction could be observed.

TAZ 돌연변이체의 전사 활성을 평가하기 위하여, TBE1-luc 리포터 플라스미드를 사용하였다. 293T 세포를 c-Jun 발현 플라스미드와 함께 TAZ 결실 돌연변이체와 함께 형질 감염시켰다. 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 플라스미드를 형질 감염에 사용하였다. 세포를 용해시키고, 형질 감염 후 24 시간 후의 루시퍼라제 활성을 측정하였고, 그 결과를 도 5F에 나타내었다. 도 5F에서 확인한 바와 같이, c-Jun- 매개 리포터 유전자 활성은 WW 도메인을 함유하는 TAZ 단백질에 의해 증가되는 것을 확인하였다. 따라서, WW 도메인을 포함하는 TAZ 단백질이 포도당 내성 또는 인슐린 민감성과 관련성이 높은 것을 확인할 수 있었으며, 또한 상기 도메인을 포함하는 TAZ124-395 돌연변이체 역시 같은 효과를 나타내어 TAZ와 c-Jun의 상호 작용으로 인한 Irs1 전사가 유도되어 인슐린 민감성을 높일 수 있는 가능성을 확인하였다.To evaluate the transcriptional activity of the TAZ mutant, the TBE1-luc reporter plasmid was used. 293T cells were transfected with the TAZ deletion mutant along with the c-Jun expression plasmid. Renilla luciferase plasmid was used for transfection. Cells were lysed, and luciferase activity was measured 24 hours after transfection, and the results are shown in FIG. 5F. As confirmed in FIG. 5F , it was confirmed that c-Jun-mediated reporter gene activity was increased by the TAZ protein containing the WW domain. Therefore, it was confirmed that the TAZ protein including the WW domain was highly related to glucose tolerance or insulin sensitivity, and the TAZ124-395 mutant including the domain also showed the same effect, resulting in the interaction between TAZ and c-Jun. Irs1 transcription was induced and the possibility of enhancing insulin sensitivity was confirmed.

실시예 6. 근육세포에서 TAZ의 신호전달에 관여하는 인자의 확인Example 6. Identification of factors involved in TAZ signaling in muscle cells

인슐린 신호 전달체계의 손상은 포도당 대사과정을 손상시켜 당뇨병을 유도하는 것으로 알려져 있으므로, TAZ가 Wnt 신호전달 과정의 매개자로서, Wnt 신호전달로 유도된 Irs1 의 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 8주 내지 10 주령의 야생형 (WT) 및 TAZ- 녹아웃 (KO) 마우스 배아 섬유아세포(MEF)를 24 시간 동안 L 세포 유래의 Wnt3a-로 조절된 또는 대조군 배지로 처리하였다. 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 6A에 나타내었다. 상기 세포의 Irs1 발현을 qRT-PCR로 확인하였고, 이를 분석한 결과를 도 6B에 나타내었다. 이후, 대조군 (Con) 및 TAZ- 녹다운된 (Ti) C2C12 근관세포를 24 시간 동안 대조군 또는 Wnt3a- 조절된 배지로 처리하고, IRS1 및 TAZ의 수준을 면역 블롯팅으로 분석하고, 이를 도 6C에 나타내었다. 이후, 세포로부터의 총 RNA를 추출하고, qRT-PCR에 의해 Irs1 발현을 분석하였으며, 이의 결과를 도 6D에 나타내었다. Since damage to the insulin signaling system is known to induce diabetes by impairing glucose metabolism, we conducted an experiment to determine whether TAZ, as a mediator of Wnt signaling, affects the expression of Irs1 induced by Wnt signaling. did. Wild-type (WT) and TAZ-knockout (KO) mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from 8 to 10 weeks of age were treated with L-cell-derived Wnt3a- conditioned or control medium for 24 h. Cell lysates were analyzed by immunoblotting and are shown in Figure 6A. Irs1 expression of the cells was confirmed by qRT-PCR, and the analysis result is shown in FIG. 6B. Then, control (Con) and TAZ-knockdown (Ti) C2C12 myotube cells were treated with control or Wnt3a- conditioned medium for 24 hours, and the levels of IRS1 and TAZ were analyzed by immunoblotting, which is shown in FIG. 6C . It was. Then, total RNA from the cells was extracted, and Irs1 expression was analyzed by qRT-PCR, and the results are shown in FIG. 6D .

생체 내 Wnt 신호 전달-유도 된 Irs1 발현에서 TAZ의 역할을 연구하기 위해, Wnt 신호 전달의 음성 조절자로 선종성 용종 대장균(APC)에 대한 대립 유전자를 보유하는 마우스를 근육-특이적 TAZ 녹아웃(mKO) 마우스와 교차시켜 근육-특이적 TAZ 및 APC 이중 녹아웃된 마우스를 제조하였다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 위장성 근육세포를 β- 카테닌 항체를 이용한 면역 블롯팅으로 분석하였고, 그 결과를 도 6E에 나타내었다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 Irs1 전사수준을 qRT-PCR로 분석하였고, 이를 도 6G에 나타내었다. 야생형, 근육-특이적 TAZ- 녹아웃 (TAZmKO), 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO), 및 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스의 포도당 내성 및 인슐린 민감성을 확인한 결과를 도6G 및 6H 에 나타내었다. 스튜던트 t- 테스트를 사용하여 통계 분석을 수행하였다.To study the role of TAZ in Wnt signaling-induced Irs1 expression in vivo, mice carrying an allele for adenomatous polyp Escherichia coli (APC) as a negative regulator of Wnt signaling were subjected to muscle-specific TAZ knockout (mKO). ) mice were crossed to prepare muscle-specific TAZ and APC double knockout mice. Gastrointestinal myocytes of wild-type, muscle-specific TAZ-knockout (TAZmKO), muscle-specific adenomatous polyp E. coli (APC)-knockout (APCmKO), and muscle-specific APC and TAZ double-knockout (DbmKO) mice was analyzed by immunoblotting using β-catenin antibody, and the results are shown in FIG. 6E . Irs1 transcriptional levels of wild-type, muscle-specific TAZ-knockout (TAZmKO), muscle-specific adenomatous polyp E. coli (APC)-knockout (APCmKO), and muscle-specific APC and TAZ double-knockout (DbmKO) mice. It was analyzed by qRT-PCR, which is shown in Figure 6G. Glucose tolerance and insulin in wild-type, muscle-specific TAZ-knockout (TAZmKO), muscle-specific adenomatous polyp E. coli (APC)-knockout (APCmKO), and muscle-specific APC and TAZ double-knockout (DbmKO) mice The results of confirming the sensitivity are shown in FIGS. 6G and 6H. Statistical analysis was performed using Student's t-test.

도 6A 및 6B에서 확인한 바와 같이, Wnt3a로 24 시간 배양한 후, 야생형 MEF는 상당한 Irs1 발현의 유도가 확인되었다. 상기와 같은Irs1 발현의 유도는 TAZ-KO MEF에서 발생하지 않았으므로, Wnt3a- 매개 IRS1 유도는 TAZ에 의하여 나타나는 것을 확인하였다. 도 6C및 6D에서 확인한 바와 같이, C2C12 근관세포에서도 마찬가지로 Wnt3a-유도된 Irs1 발현이 TAZ- 녹다운 C2C12 근관세포에서는 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 도 6E및 6F에서 한 바와 같이, 위장관 근육에서 IRS1의 발현 수준은 근육-특이적 선종성 용종 대장균(APC)-녹아웃 (APCmKO) 마우스가 야생형보다 다소높은 것을 확인하였으나, 근육-특이적 APC 및 TAZ 이중-녹아웃 (DbmKO) 마우스에서는 현저하게 IRS1의 발현 수준이 낮은 것을 확인하였다. 따라서, 이러한 결과를 통해서 TAZ가 Wnt 신호전달에 의하여 유도되는 IRS1의 발현을 유도하는 것을 확인할 수 있었다. 도 6G 및 6H에서 확인한 바와 같이, APCmKO 마우스는 유의할 정도의 혈당 제거 활성을 나타내었지만, 이와 같은 활성은 DbmKO 마우스에서는 감소되는 것으로 나타났고, 또한 APCmKO 마우스는 인슐린 민감성이 유의하게 증가한 것으로 나타난 반면, DbmKO 마우스는 상기와 같은 민감성이 다소 낮아지는 것으로 나타나, Wnt 신호 전달-유도 된 인슐린 감수성이 TAZ에 의해 조절될 수 있음을 확인할 수 있었다. As confirmed in FIGS. 6A and 6B , after 24 hours of incubation with Wnt3a, significant induction of Irs1 expression was confirmed in wild-type MEFs. Since the above induction of Irs1 expression did not occur in TAZ-KO MEF, it was confirmed that Wnt3a-mediated IRS1 induction was shown by TAZ. As confirmed in FIGS. 6C and 6D , it was confirmed that Wnt3a-induced Irs1 expression was not observed in TAZ-knockdown C2C12 myotube cells as well in C2C12 myotubes. As shown in Figures 6E and 6F, the expression level of IRS1 in gastrointestinal muscles was confirmed that muscle-specific adenomatous polyp E. coli (APC)-knockout (APCmKO) mice were somewhat higher than wild-type, but muscle-specific APC and TAZ. In double-knockout (DbmKO) mice, it was confirmed that the expression level of IRS1 was remarkably low. Therefore, through these results, it was confirmed that TAZ induces the expression of IRS1 induced by Wnt signaling. As confirmed in FIGS. 6G and 6H , APCmKO mice showed significant blood glucose clearance activity, but this activity was decreased in DbmKO mice, and APCmKO mice showed a significant increase in insulin sensitivity, whereas DbmKO mice showed a significant increase in insulin sensitivity. Mice showed somewhat lowered sensitivity as described above, confirming that Wnt signal transduction-induced insulin sensitivity can be regulated by TAZ.

실시예 7. 스타틴 약물과 TAZ 발현 수준에 의한 인슐린 민감성 확인Example 7. Confirmation of insulin sensitivity by statin drug and TAZ expression level

스타틴 약물은 TAZ를 핵 내에 위치시켜 의한 TAZ수준을 변화시키므로, 스타틴에 의하여 유도된 TAZ 억제가 인슐린 민감성을 변화시킬 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 6 주령 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하였다. 마우스를 안락사시키고, 위장 근육을 분리하고, 면역 블롯팅으로 IRS1 및 TAZ 수준을 분석하였고, 이를 도 7A에 나타내었다. RNA를 상기 위장 근육으로부터 분리하였고, IRS1 전사수준을 qRT-PCR로 분석하였고, Gapdh 발현으로 정규화하여 도 7B에 나타내었다. 6주령의 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하고, 마우스를 16 시간 동안 금식시키고, 2g/kg 체중으로 D-글루코스를 복강 내 주사하였다. 지정된 시점에서 글루코 미터를 사용하여 혈청 포도당 수준을 측정하였다. 각 마우스에 대한 곡선 아래 면적을 계산하고 비히클 조건에 대한 배수 변화(n = 8)로 나타낸 결과를 도 7C에 나타내었다. 6 주령 마우스에 심바스타틴 또는 비히클을 3 주 동안 투여하였다. 마우스를 4 시간 동안 절식시킨 다음, 1.25 U/kg 체중으로 인슐린을 투여하였다. 지정된 시점에서 혈청 포도당 수준을 분석하였다. 각 마우스에 대한 곡선 아래 면적을 계산하고 비히클 상태에 대한 면적 변화 (n = 8)를 나타낸 결과를 도 7D에 나타내었다. C2C12 근관세포를 지정된 농도로 48 시간 동안 DMSO 또는 심바스타틴으로 처리하고, 세포 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 7E에 나타내었다. 상기 세포를 수거하고, Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석하고 Gapdh 발현 (n = 3)으로 정규화한 결과를 도 7F에 나타내었다. 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7E의 조건과 동일한 실험을 수행하였으며, 심바스타틴 대신 세리바스타틴으로 도 7F와 동일한 동일한 실험을 수행하였으며, 상기 결과를 각각 도 7G 및 7H에 나타내었다. Since the statin drug changes the TAZ level by locating the TAZ in the nucleus, an experiment was performed to confirm whether the TAZ inhibition induced by the statin could change the insulin sensitivity. 6-week-old mice were administered simvastatin or vehicle for 3 weeks. Mice were euthanized, gastrointestinal muscles were isolated, and IRS1 and TAZ levels were analyzed by immunoblotting, which is shown in FIG. 7A . RNA was isolated from the gastrointestinal muscle, and IRS1 transcription levels were analyzed by qRT-PCR, normalized to Gapdh expression, and shown in FIG. 7B. Six-week-old mice were administered simvastatin or vehicle for 3 weeks, the mice were fasted for 16 hours, and D-glucose was injected intraperitoneally at 2 g/kg body weight. Serum glucose levels were measured using a glucometer at designated time points. The area under the curve was calculated for each mouse and the results expressed as fold change (n = 8) for the vehicle condition are shown in Figure 7C. 6-week-old mice were administered simvastatin or vehicle for 3 weeks. Mice were fasted for 4 hours, and then insulin was administered at 1.25 U/kg body weight. Serum glucose levels were analyzed at designated time points. The results of calculating the area under the curve for each mouse and showing the area change (n = 8) with respect to the vehicle state are shown in Figure 7D. C2C12 myotube cells were treated with DMSO or simvastatin at the indicated concentrations for 48 hours, and the cell lysates were analyzed by immunoblotting, which is shown in FIG. 7E . The cells were harvested, and Irs1 expression was analyzed by qRT-PCR and normalized to Gapdh expression (n = 3) is shown in FIG. 7F . The same experiment as in FIG. 7E was performed with cerivastatin instead of simvastatin, and the same experiment as that of FIG. 7F was performed with cerivastatin instead of simvastatin, and the results are shown in FIGS. 7G and 7H, respectively.

도 7A에서 확인한 바와 같이, 심바스타틴-처리된 마우스에서 TAZ 및 IRS1의 수준이 감소하였고, 도 7B에서 확인할 수 있는 바와 같이, 심바스타틴은 IRS1의 수준을 감소시켰다. 도 7C에서 확인할 수 있는 바와 같이, in vivo 에서 심바스타틴은 대조군 대비 인슐린 민감성을 감소시켜 혈액 내 포도당 제거능을 현저하게 저해시켰다. 또한 도 7D에서 확인한 바와 같이, 인슐린-매개 혈액 내 포도당 수준의 감소는 심바스타틴-처리된 마우스에서 억제되었으며, 스타틴-매개된 TAZ 및 IRS1 수준의 감소는 도 7E및 7F에서 확인한 바와 같이, C2C12 근관세포에서도 현저하게 나타났다. 또한 도 7G 및 7H 에서 확인한 바와 같이, 세리바스타틴을 처리한 경우에도 유사한 결과가 나타나, 스타틴 약물에 의하여 인슐린 민감성이 유의하게 낮아지는 것을 확인할 수 있었다. 7A , the levels of TAZ and IRS1 were decreased in simvastatin-treated mice, and as can be seen in FIG. 7B , simvastatin decreased the levels of IRS1. As can be seen in FIG. 7C , in vivo, simvastatin significantly inhibited the ability to remove glucose from the blood by reducing insulin sensitivity compared to the control group. Also, as confirmed in FIG. 7D , insulin-mediated reduction of blood glucose level was inhibited in simvastatin-treated mice, and statin-mediated reduction of TAZ and IRS1 levels was reduced in C2C12 myotube cells, as confirmed in FIGS. 7E and 7F . also appeared prominently. In addition, as confirmed in FIGS. 7G and 7H , similar results were obtained even when cerivastatin was treated, and it was confirmed that insulin sensitivity was significantly lowered by the statin drug.

실시예 8. 스타틴 약물로 인한 인슐린 민감성 감소에 저항성을 가진 TAZ 돌연변이체 활성 확인Example 8. Confirmation of TAZ mutant activity with resistance to decrease in insulin sensitivity due to statin drugs

인슐린 신호 전달에 대한 심바스타틴의 효과를 추가적으로 확인하기 위하여, 대조군 및 심바스타틴-처리 된 마우스에 인슐린을 주입하고, 인슐린 신호 전달 조절 경로를 분석하였다. 비히클 또는 심바스타틴을 3주동안 투여한 6주령 마우스에 인슐린을 복강 내 주사하였다. 15분 후, 근육 용해물을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 도 8A에 나타내었다. 상기 기재된 바와 같이 분석 방법으로, 3 개의 독립적인 실험을 평가하여 IRS1 및 TAZ 대 α-튜불린의 비를 분석하였고, 총 AKT, AS160 및 리보솜 단백질 S6 키나아제에 대한 인산화된 비율을 측정하였고 이의 결과를 도 8B 에 나타내었다. C2C12 근관세포를 대조군, 야생형 TAZ 또는 단백질 분해성 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) 레트로 바이러스 벡터로 형질 도입하여 안정한 세포주를 확립하였다. 이어서, 10 μM 심바스타틴 또는 DMSO를 48 시간 동안 세포에 첨가하고, 수득된 세포에서 IRS1 및 TAZ 수준을 면역 블롯팅으로 분석하였고, 이를 8C에 나타내었다. 상기 세포에서의 Irs1 발현을 qRT-PCR에 의해 분석한 결과를 도 8D에 나타내었다. 포도당 흡수 수준을 대조군, 야생형 TAZ 및 TAZ4SA-과발현 C2C12 근관세포에서 분석하였고, 그 결과를 도 8E에 나타내었다. In order to further confirm the effect of simvastatin on insulin signaling, control and simvastatin-treated mice were injected with insulin, and the insulin signaling pathway was analyzed. Insulin was intraperitoneally injected into 6-week-old mice treated with vehicle or simvastatin for 3 weeks. After 15 minutes, muscle lysates were analyzed by immunoblotting, which is shown in Figure 8A. With the assay method as described above, three independent experiments were evaluated to analyze the ratio of IRS1 and TAZ to α-tubulin, and the phosphorylated ratio to total AKT, AS160 and ribosomal protein S6 kinase were determined and the results were It is shown in Figure 8B. C2C12 myotube cells were transduced with control, wild-type TAZ or proteolytic-resistant TAZ (TAZ4SA; TAZ S58, 62, 306, 309A) retroviral vectors to establish stable cell lines. Then, 10 μM simvastatin or DMSO was added to the cells for 48 h, and IRS1 and TAZ levels in the obtained cells were analyzed by immunoblotting, which is shown in 8C. The results of analyzing Irs1 expression in the cells by qRT-PCR are shown in FIG. 8D . Glucose uptake levels were analyzed in control, wild-type TAZ and TAZ4SA-overexpressing C2C12 myotube cells, and the results are shown in FIG. 8E .

도 8A 및 8B에 나타난 바와 같이, 심바스타틴-처리된 마우스는 대조군 마우스보다 낮은 Akt 활성을 나타났고, 이는 AS160 및 S6K의 인산화 감소에 의해 확인되었다. 상기와 같은 결과를 통하여 심바스타틴-처리된 마우스에서 포도당 내성 및 인슐린 감수성이 나타나는 것을 확인할 수 있었다. 심바스타틴-매개된 Irs1 발현의 하향 조절 억제가 TAZ에 의해 조절되는지 여부를 확인하기 위해, WT TAZ 또는 단백질 분해 저항성 TAZ (TAZ4SA)를 C2C12 근관세포에서 안정적으로 발현시키고, Irs1 발현을 분석하였다. 도 8C 및 8D에 나타난 바와 같이, 야생형 TAZ는 심바스타틴의 존재 하에서 분해되어 Irs1 발현이 감소되는 것이 확인되었다. 반면, TAZ4SA-과발현 세포에서는 Irs1 발현 또는 전사의 감소는 나타나지 않는 것이 확인되었다. 또한, 도 8E에서 확인한 바와 같이, 심바스타틴 처리 후 TAZ4SA- 과발현 세포에서는 포도당 흡수가 감소되지 않았다. 이에, 종합적으로 스타틴 약물 매개에 의한 인슐린 감수성 감소는 IRS1 수준 및 AKT 활성 감소에 의한 것이고, 이에 따른 TAZ 고갈은 인슐린 감수성 감소의 원인인 되는 것을 확인하였다. 따라서, TAZ4SA-과발현된 TAZ 돌연변이체는 스타틴 약물에 의한 인슐린 감수성 감소에 영향을 받지 않을 수 있는 것을 확인할 수 있었다.8A and 8B , simvastatin-treated mice showed lower Akt activity than control mice, which was confirmed by reduced phosphorylation of AS160 and S6K. Through the above results, it was confirmed that glucose tolerance and insulin sensitivity appeared in simvastatin-treated mice. To determine whether simvastatin-mediated downregulation of Irs1 expression is regulated by TAZ, WT TAZ or proteolytic resistant TAZ (TAZ4SA) was stably expressed in C2C12 myotube cells, and Irs1 expression was analyzed. As shown in FIGS. 8C and 8D , it was confirmed that wild-type TAZ was degraded in the presence of simvastatin to reduce Irs1 expression. On the other hand, it was confirmed that there was no decrease in Irs1 expression or transcription in TAZ4SA-overexpressing cells. In addition, as confirmed in FIG. 8E , glucose uptake was not reduced in TAZ4SA- overexpressing cells after simvastatin treatment. Thus, overall, it was confirmed that the decrease in insulin sensitivity mediated by statin drugs is due to the decrease in IRS1 level and AKT activity, and thus TAZ depletion is the cause of the decrease in insulin sensitivity. Therefore, it could be confirmed that the TAZ4SA-overexpressed TAZ mutant may not be affected by the decrease in insulin sensitivity by statin drugs.

<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation Korea University Research and Business Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof <130> PN131443 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Asn Ser Thr Ala Pro Leu Ser Ala Arg Leu Phe Pro Lys Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Gln Thr Leu Phe Met Gly Gln Ser Gly Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Cys Ala Arg Leu Arg Leu Leu Cys Arg Leu Leu Ala Gln Trp Glu 35 40 45 Arg Pro Arg Pro Val Pro Gly Ile Lys Met Asn Pro Ser Ser Val Pro 50 55 60 His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln Val Ile His Val Thr Gln Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ser Val Met Asn Pro Lys 85 90 95 Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu 100 105 110 Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly 115 120 125 Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly Gly Ala Gln His Val Arg Ser 130 135 140 His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp 165 170 175 Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr 180 185 190 Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr 195 200 205 Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn Gln Pro Leu Asn His Val Asn 210 215 220 Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Ser Met Ala 225 230 235 240 Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn His Gln His Gln Gln Val Val 245 250 255 Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr 260 265 270 Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln 275 280 285 Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg 290 295 300 Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln 305 310 315 320 Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala Pro Val Asn Thr Pro Ala Met 325 330 335 Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu 340 345 350 Asn 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Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His 195 200 205 Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu 210 215 220 Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln 225 230 235 240 Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln 245 250 255 Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala 260 265 270 Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn 275 280 285 Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu 290 295 300 Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly 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and Business Foundation <120> Pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes comprising TAZ protein or a variant thereof <130> PN131443 <160> 5 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 452 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Met His Asn Ser Thr Ala Pro Leu Ser Ala Arg Leu Phe Pro Lys Gly 1 5 10 15 Gly Ser Leu Leu Gln Thr Leu Phe Met Gly Gln Ser Gly Ser Arg Gly 20 25 30 Gly Cys Ala Arg Leu Arg Leu Leu Cys Arg Leu Leu Ala Gln Trp Glu 35 40 45 Arg Pro Arg Pro Val Pro Gly Ile Lys Met Asn Pro Ser Ser Val Pro 50 55 60 His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln Val Ile His Val Thr Gln Asp 65 70 75 80 Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe Asn Ser Val Met Asn Pro Lys 85 90 95 Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu 100 105 110 Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly 115 120 125 Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly Gly Ala Gln His Val Arg Ser 130 135 140 His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala 145 150 155 160 Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp 165 170 175 Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr 180 185 190 Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr 195 200 205 Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn Gln Pro Leu Asn His Val Asn 210 215 220 Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Ser Met Ala 225 230 235 240 Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn His Gln His Gln Gln Val Val 245 250 255 Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr 260 265 270 Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln 275 280 285 Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg 290 295 300 Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln 305 310 315 320 Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala Pro Val Asn Thr Pro Ala Met 325 330 335 Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu 340 345 350 Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu 355 360 365 Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser 370 375 380 Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met 385 390 395 400 Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu 405 410 415 Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile 420 425 430 Pro Leu Phe Asn Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe 435 440 445 Leu Thr Trp Leu 450 <210> 2 <211> 395 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Asn Pro Ser Ser Val Pro His Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Gly Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Val Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser Ile Thr Ser Thr Ser 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Ala Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu Ser Pro Gln Asn His 195 200 205 Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser Val Pro Asn Ala Leu 210 215 220 Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile Gln 225 230 235 240 Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg Gln 245 250 255 Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Thr Glu Thr Met Ala 260 265 270 Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met Arg Ser Val Thr Asn 275 280 285 Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro Tyr His Ser Arg Glu 290 295 300 Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys Tyr Ser Val Pro Thr 305 310 315 320 Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu Met Asp Thr Gly Glu 325 330 335 Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro Gln Gln Thr Arg Phe 340 345 350 Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn Val Asp Leu Gly Thr 355 360 365 Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn Asp Val Glu Ser Ala 370 375 380 Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 <210> 3 <211> 272 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro 20 25 30 Arg Lys Val Met Asn Gln Pro Leu Asn His Val Asn Leu His Pro Ser 35 40 45 Ile Thr Ser Thr Ser Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro 50 55 60 Asn Leu Ala Met Asn His Gln His Gln Gln Val Val Ala Thr Ser Leu 65 70 75 80 Ser Pro Gln Asn His Pro Thr Gln Asn Gln Pro Thr Gly Leu Met Ser 85 90 95 Val Pro Asn Ala Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg 100 105 110 Leu Gln Arg Ile Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu 115 120 125 Glu Leu Met Arg Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu 130 135 140 Thr Glu Thr Met Ala Pro Val Asn Thr Pro Ala Met Ser Thr Asp Met 145 150 155 160 Arg Ser Val Thr Asn Ser Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 165 170 175 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 180 185 190 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Met Asp Glu 195 200 205 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ser Gly Gln Thr Pro Met Thr Val Asn Pro 210 215 220 Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 225 230 235 240 Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn 245 250 255 Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 260 265 270 <210> 4 <211> 400 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Asn Pro Ala Ser Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Pro Gly Gln Gln 1 5 10 15 Val Ile His Val Thr Gln Asp Leu Asp Thr Asp Leu Glu Ala Leu Phe 20 25 30 Asn Ser Val Met Asn Pro Lys Pro Ser Ser Trp Arg Lys Lys Ile Leu 35 40 45 Pro Glu Ser Phe Phe Lys Glu Pro Asp Ser Gly Ser His Ser Arg Gln 50 55 60 Ser Ser Thr Asp Ser Ser Gly Gly His Pro Gly Pro Arg Leu Ala Gly 65 70 75 80 Gly Ala Gln His Val Arg Ser His Ser Ser Pro Ala Ser Leu Gln Leu 85 90 95 Gly Thr Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ser Pro Ala Gln Gln His Ala His 100 105 110 Leu Arg Gln Gln Ser Tyr Asp Val Thr Asp Glu Leu Pro Leu Pro Pro 115 120 125 Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln Arg Tyr Phe Leu Asn 130 135 140 His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro Arg Lys Ala Met Asn 145 150 155 160 Gln Pro Leu Asn His Met Asn Leu His Pro Ala Val Ser Ser Thr Pro 165 170 175 Val Pro Gln Arg Ser Met Ala Val Ser Gln Pro Asn Leu Val Met Asn 180 185 190 His Gln His Gln Gln Gln Met Ala Pro Ser Thr Leu Ser Gln Gln Asn 195 200 205 His Pro Thr Gln Asn Pro Pro Ala Gly Leu Met Ser Met Pro Asn Ala 210 215 220 Leu Thr Thr Gln Gln Gln Gln Gln Gln Lys Leu Arg Leu Gln Arg Ile 225 230 235 240 Gln Met Glu Arg Glu Arg Ile Arg Met Arg Gln Glu Glu Leu Met Arg 245 250 255 Gln Glu Ala Ala Leu Cys Arg Gln Leu Pro Met Glu Ala Glu Thr Leu 260 265 270 Ala Pro Val Gln Ala Ala Val Asn Pro Pro Thr Met Thr Pro Asp Met 275 280 285 Arg Ser Ile Thr Asn Asn Ser Ser Asp Pro Phe Leu Asn Gly Gly Pro 290 295 300 Tyr His Ser Arg Glu Gln Ser Thr Asp Ser Gly Leu Gly Leu Gly Cys 305 310 315 320 Tyr Ser Val Pro Thr Thr Pro Glu Asp Phe Leu Ser Asn Val Asp Glu 325 330 335 Met Asp Thr Gly Glu Asn Ala Gly Gln Thr Pro Met Asn Ile Asn Pro 340 345 350 Gln Gln Thr Arg Phe Pro Asp Phe Leu Asp Cys Leu Pro Gly Thr Asn 355 360 365 Val Asp Leu Gly Thr Leu Glu Ser Glu Asp Leu Ile Pro Leu Phe Asn 370 375 380 Asp Val Glu Ser Ala Leu Asn Lys Ser Glu Pro Phe Leu Thr Trp Leu 385 390 395 400 <210> 5 <211> 34 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Leu Pro Leu Pro Pro Gly Trp Glu Met Thr Phe Thr Ala Thr Gly Gln 1 5 10 15 Arg Tyr Phe Leu Asn His Ile Glu Lys Ile Thr Thr Trp Gln Asp Pro 20 25 30 Arg Lys

Claims (6)

TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체;
상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및
상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는 제2형 당뇨병의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof;
a nucleic acid molecule encoding the protein; and
A pharmaceutical composition for preventing or treating type 2 diabetes, comprising at least one selected from the group consisting of substances that increase the expression or activity of the TAZ.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 근육 세포의 인슐린 감수성(insulin sensitivity)를 증가시키는 것인 조성물.The composition of claim 1 , wherein the composition increases insulin sensitivity of muscle cells. 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ의 변이체는 서열번호 2, 3, 또는 5로 이루어진 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 것인 조성물.The composition of claim 1, wherein the variant of TAZ comprises a polypeptide comprising an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2, 3, or 5. 청구항 1에 있어서, 상기 TAZ의 변이체는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드의 N 말단으로부터 58, 62, 306, 및 309번째 아미노산인 세린(Serine)이 알라닌(Alanine)으로 치환된 것인 조성물.The composition of claim 1, wherein the TAZ variant is substituted with alanine for serine, which is the 58, 62, 306, and 309 amino acids from the N-terminus of the polypeptide comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 . 청구항 1에 있어서, 상기 제2형 당뇨병은 비만, 고지방 식이, 아디포넥틴(adiponectin) 감소 돌연변이, 및 스타틴(statin) 약물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 조성물.The composition of claim 1, wherein the type 2 diabetes is at least one selected from the group consisting of obesity, a high-fat diet, adiponectin-reducing mutations, and statin drugs. TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 단백질 또는 이의 변이체;
상기 단백질을 코딩하는 핵산분자; 및
상기 TAZ의 발현 또는 활성을 증가시키는 물질로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는 제2형 당뇨병을 치료하는 방법.
TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) protein or a variant thereof;
a nucleic acid molecule encoding the protein; and
A method of treating type 2 diabetes, comprising administering at least one selected from the group consisting of substances that increase the expression or activity of the TAZ to an individual other than humans.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KR20100130015A (en) * 2009-06-02 2010-12-10 한국화학연구원 Pharmaceutical composition for the prevention or treatment of osteoporosis or obesity comprising a chloroimidazole derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
KR20190122163A (en) * 2018-04-19 2019-10-29 이화여자대학교 산학협력단 Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity

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