KR102240763B1 - Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity - Google Patents
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Abstract
TAZ를 이용하여 췌장조직에서의 인슐린 생성 조절을 통한 혈당 조절용 조성물에 관한 것이다. 일 양상에 따르면, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써 인슐린 생성 조절을 통해 혈당을 조절할 수 있는 효과가 있으므로, 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애에 기인하는 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.It relates to a composition for controlling blood sugar by controlling insulin production in pancreatic tissue using TAZ. According to one aspect, by controlling the expression or activity of the TAZ gene or protein, it has the effect of controlling blood sugar through the regulation of insulin production, so it is useful for the prevention, improvement, or treatment of metabolic diseases, particularly metabolic diseases caused by pancreatic dysfunction. Can be used.
Description
TAZ를 이용한 췌장조직에서의 인슐린 생성 조절을 통한 혈당 조절용 조성물에 관한 것이다.It relates to a composition for controlling blood sugar through the control of insulin production in pancreatic tissue using TAZ.
TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)는 14-3-3과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ (PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ 유도된 지방세포 분화의 저해를 야기한다. 또한, 중간엽 줄기세포에서 TAZ의 발현 수준은 조골세포 또는 지방세포로 세포 운명 결정에 대하여 중요한 역할을 하므로, TAZ는 중간엽 줄기세포 분화의 전사 조절자로 작용하는 것으로 인식되고 있다. 이 뿐만 아니라, TAZ는 갑상선 (thyroid) 전사 인자-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-박스 전사 인자 (Tbx5), 페어드 박스 유전자 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) 및 Smad2/3-4 복합체를 포함하는 몇몇의 다른 전사인자와 상호작용을 하고, 그들의 전사 활성 및 세포 기능을 조절한다. TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) has been identified as a cellular protein that interacts with 14-3-3, and TAZ is also peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), adipocyte-specific Interacts with a typical transcription factor, resulting in inhibition of PPARγ-induced adipocyte differentiation. In addition, since the expression level of TAZ in mesenchymal stem cells plays an important role in determining cell fate into osteoblasts or adipocytes, TAZ is recognized to act as a transcriptional regulator of mesenchymal stem cell differentiation. In addition, TAZ has thyroid transcription factor-1 (TTF-1/Nkx2.1), T-box transcription factor (Tbx5), paired box gene 3 (Pax3), Gli-Similar 3 (Glis3) and It interacts with several other transcription factors, including the Smad2/3-4 complex, and regulates their transcriptional activity and cellular function.
따라서, TAZ는 신장 및 폐 형성 (Park, K. S., 등(2004) J Biol Chem 279, 17384-17390;Kang, H. S., 등(2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., 등 (2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), 심장 및 팔다리 발생 (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, E. N., and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci U S A 102, 18034-18039), 갑상선 분화 (Di Palma, T., 등 (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), 배아 줄기세포 자가-재생 (Varelas, X., 등 (2008) Nat Cell Biol 10, 837-848), 및 내피-중간엽 전이 및 암세포의 침습 (Chan, S. W., 등 (2008) Cancer Res 68, 2592-2598;Lei, Q. Y., 등 (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436)과 같은 생물학적 기능에 관여하는 것으로 알려져 있으나, 혈당 조절과의 연관성에 대해서는 아직 보고된 바가 없는 실정이다.Thus, TAZ is characterized by kidney and lung formation (Park, KS, et al. (2004) J Biol Chem 279, 17384-17390; Kang, HS, et al. (2009) Mol Cell Biol 29, 2556-2569; Makita, R., et al. ( 2008) Am J Physiol Renal Physiol 294, F542-5535, 8, 12), heart and limb development (Murakami, M., Nakagawa, M., Olson, EN, and Nakagawa, O. (2005) Proc Natl Acad Sci USA 102, 18034-18039), thyroid differentiation (Di Palma, T., et al. (2009) Exp Cell Res 315, 162-175), embryonic stem cell self-renewal (Varelas, X., et al. (2008) Nat Cell Biol 10 , 837-848), and endothelial-mesenchymal metastasis and invasion of cancer cells (Chan, SW, et al. (2008) Cancer Res 68, 2592-2598; Lei, QY, et al. (2008) Mol Cell Biol 28, 2426-2436) It is known to be involved in biological functions such as, but has not yet been reported on its association with blood sugar control.
일 양상은 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하여 췌장에서의 인슐린 생성 및 분비를 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 제공하는 것이다.One aspect is to provide a composition for controlling blood sugar comprising an agent that regulates the production and secretion of insulin in the pancreas by controlling the expression or activity of the TAZ gene or protein in the pancreas.
다른 양상은 상기 제제를 포함하는 췌장 기능 장애로부터 기인하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of metabolic diseases resulting from pancreatic dysfunction comprising the agent.
또 다른 양상은 상기 제제를 포함하는 췌장 기능 장애로부터 기인하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.Another aspect is to provide a food composition for preventing or improving metabolic diseases resulting from pancreatic dysfunction comprising the agent.
일 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 제공한다. 구체적으로, 상기 조성물은 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하여 췌장에서의 인슐린 생성 및 분비를 조절하는 제제를 포함하는 혈당 조절용 조성물을 의미할 수 있다.One aspect provides a composition for regulating blood sugar comprising an agent that modulates the expression or activity of a TAZ gene or protein. Specifically, the composition may refer to a composition for controlling blood sugar including an agent that regulates the production and secretion of insulin in the pancreas by controlling the expression or activity of the TAZ gene or protein in the pancreas.
본 명세서에서 용어, "TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)"는 14-3-3 단백질과 상호작용하는 세포 단백질로 동정된 바 있으며, WWTR1으로도 명명될 수 있다. TAZ는 또한 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체-γ(PPARγ), 지방세포-특이적인 전사 인자와 상호작용을 수행하여, PPARγ-유도된 지방세포 분화의 저해를 야기하는 것으로 알려져 있다. 상기 TAZ는 단백질을 코딩하는 유전자의 서열은, 사람의 경우 GeneBank Accession No. NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, 또는 NM_181313.3, 마우스의 경우, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, 또는 NM_181516.6로부터 수득되는 서열일 수 있다. 상기 TAZ 단백질의 아미노산 서열은 GeneBank Accession No. NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, 또는 NP_851830.1로부터 수득되는 아미노산 서열일 수 있다. 상기 핵산 서열 또는 아미노산 서열과 일부 핵산 서열 또는 아미노산 서열이 일치하지 않더라도, 생물학적으로 동등한 활성을 갖는 핵산 서열 또는 아미노산 서열은 TAZ의 mRNA 또는 단백질로 간주될 수 있다.In the present specification, the term "TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif)" has been identified as a cellular protein that interacts with the 14-3-3 protein, and may also be referred to as WWTR1. TAZ is also known to interact with peroxisome proliferator-activated receptor-γ (PPARγ), an adipocyte-specific transcription factor, resulting in inhibition of PPARγ-induced adipocyte differentiation. The TAZ is the sequence of the gene encoding the protein, in the case of human, GeneBank Accession No. The sequence obtained from NM_000116.5, NM_001303465.1, NM_181311.3, NM_181312.3, or NM_181313.3, for mice, NM_001173547.2, NM_001242615.2, NM_001242616.2, NM_001290738.1, or NM_181516.6 I can. The amino acid sequence of the TAZ protein is GeneBank Accession No. It may be an amino acid sequence obtained from NP_000107.1, NP_001290394.1, NP_851828.1, NP_851829.1, or NP_851830.1. Even if the nucleic acid sequence or amino acid sequence and some nucleic acid sequence or amino acid sequence do not match, a nucleic acid sequence or amino acid sequence having biologically equivalent activity may be regarded as an mRNA or protein of TAZ.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질은 TAZ의 C-말단 도메인의 유전자 또는 단백질인 것일 수 있다. 상기 TAZ의 C-말단 도메인은 TAZ 단백질의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 예를 들어, 80번째, 예를 들어, 90번째, 예를 들어, 100번째, 예를 들어, 110번째, 예를 들어, 120번째, 예를 들어, 130번째, 예를 들어, 140번째, 예를 들어, 150번째, 예를 들어, 160번째, 예를 들어, 170번째, 예를 들어, 180번째, 예를 들어, 190번째, 예를 들어, 200번째 아미노산부터 C-말단까지의 영역일 수 있으나, 다른 단백질과 상호작용할 수 있는 TAZ 단백질의 도메인이라면 이에 제한되지 않는다. 구체적으로, 사람의 경우 상기 TAZ의 C-말단 도메인은 N-말단으로부터 124번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다. 또한, 마우스의 경우 상기 TAZ C-말단 도메인은 N-말단으로부터 164번째부터 C-말단까지의 영역일 수 있다. The TAZ gene or protein may be a gene or protein of the C-terminal domain of TAZ. The C-terminal domain of the TAZ is, for example, the 80th, for example, the 90th, for example, the 100th, for example, the 110th, for example, from the N-terminus of the amino acid sequence of the TAZ protein. 120th, e.g., 130th, e.g., 140th, e.g., 150th, e.g., 160th, e.g., 170th, e.g., 180th, e.g. 190 Second, for example, it may be a region from the 200th amino acid to the C-terminus, but is not limited thereto as long as it is a domain of a TAZ protein capable of interacting with other proteins. Specifically, in the case of a human, the C-terminal domain of the TAZ may be a region from the 124th to the C-terminal from the N-terminal. In addition, in the case of a mouse, the TAZ C-terminal domain may be a region from the 164th to the C-terminus from the N-terminus.
상기 조성물은 췌장의 α-세포 및 β-세포의 활성 또는 세포량(cell mass)을 조절하는 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 췌장세포에서 생성 및 분비되는 인슐린 및 글루카곤의 양을 조절하는 것일 수 있다.The composition may be one that modulates the activity or cell mass of α-cells and β-cells of the pancreas. In addition, the composition may be one to control the amount of insulin and glucagon produced and secreted by pancreatic cells.
상기 조성물은 글루코스 내성(glucose tolerance) 또는 인슐린 감수성(insulin resistance)을 조절하는 것일 수 있다. 상기 용어 "글루코스 내성"은 생체 내 글루코스 처리능력을 의미하는 것으로, 글루코스가 대사되는 속도를 측정하는 것으로, 많은 양의 글루코스를 복용한 후 시간 간격으로 혈당치를 측정하여 계산될 수 있으며, 용어 "당내성"또는 "내당능"과 혼용될 수 있다. 상기 용어 "인슐린 감수성"은 외래성 인슐린에 대한 생체의 감수성을 의미하는 것으로, 일정량의 인슐린을 투여하였을 때의 혈당 저하도로 계산될 수 있으며, 용어 "인슐린 저항성"또는 "인슐린 내성"과 혼용될 수 있다. The composition may be one that modulates glucose tolerance or insulin resistance. The term "glucose tolerance" refers to the ability to process glucose in a living body, and measures the rate at which glucose is metabolized. It can be calculated by measuring the blood glucose level at time intervals after taking a large amount of glucose. It can be used interchangeably with "sex" or "glucose tolerance". The term "insulin sensitivity" refers to the sensitivity of a living body to adventitious insulin, and can be calculated as a blood glucose lowering degree when a certain amount of insulin is administered, and may be used interchangeably with the terms "insulin resistance" or "insulin resistance". .
상기 조성물은 PDX1(pancreatic and duodenal homeobox 1)의 DNA 결합 또는 전사 활성을 조절하는 것일 수 있다. 일 실시예에 따르면, TAZ 과발현에 의해 PDX1의 DNA-결합 활성이 유의적으로 증가됨을 확인하였다.The composition may be one that modulates the DNA binding or transcriptional activity of PDX1 (pancreatic and duodenal homeobox 1). According to an example, it was confirmed that the DNA-binding activity of PDX1 was significantly increased by TAZ overexpression.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 췌장에서의 인슐린 생성 분비를 촉진함으로써 혈당을 감소시키는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시켜 혈당을 정상 수치 범위로 조절할 수 있다. 상기 혈당 정상 수치는 8시간 동안 금식한 후 채혈하여 혈당을 측정하는 경우를 기준으로, 예를 들어, 130 mg/dL 이하, 예를 들어, 125 mg/dL 이하, 예를 들어, 120 mg/dL 이하, 예를 들어, 115 mg/dL 이하, 예를 들어, 110 mg/dL 이하, 예를 들어, 105 mg/dL 이하, 예를 들어, 100 mg/dL 이하일 수 있고, 예를 들어, 70 mg/dL 이상, 예를 들어, 75 mg/dL 이상, 예를 들어, 80 mg/dL 이상, 예를 들어, 85 mg/dL, 예를 들어, 90 mg/dL 이상, 예를 들어, 95 mg/dL 이상일 수 있고, 이들을 조합한 범위일 수 있다.In one embodiment, the composition may decrease blood sugar by promoting the secretion of insulin production in the pancreas by increasing the expression or activity of the TAZ gene or protein. Specifically, the composition may increase the expression or activity of the TAZ gene or protein to regulate blood sugar within a normal range. The normal blood sugar level is based on the case of measuring blood sugar by collecting blood after fasting for 8 hours, for example, 130 mg/dL or less, for example, 125 mg/dL or less, for example, 120 mg/dL Below, for example, 115 mg/dL or less, for example, 110 mg/dL or less, for example, 105 mg/dL or less, for example, 100 mg/dL or less, for example, 70 mg /dL or higher, e.g., 75 mg/dL or higher, e.g., 80 mg/dL or higher, e.g., 85 mg/dL or higher, e.g., 90 mg/dL or higher, e.g. 95 mg/ It may be greater than or equal to dL, and may be a range in which these are combined.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 증가시키는 방법으로는 유전자 카피 수의 증가, 고유 프로모터보다 강력한 프로모터로의 교체 및 돌연변이에 의한 TAZ 발현의 증가에 의한 것이 포함된다. 상기 유전자 카피 수의 증가는 외래 유전자의 도입에 의한 카피 수의 증가뿐만 아니라, 내재적 유전자의 증폭에 의한 것도 포함될 수 있다. 상기 유전자 프로모터의 교체는 하류에 연결된 유전자를 증가 발현시키는 특성을 가진 외래 프로모터의 도입은 물론 내재 프로모터로의 교체에 의한 것도 포함될 수 있다. 이러한 내재적 유전자 또는 단백질의 증폭은 당업계에 알려진 방법에 의하여 용이하게 이루어질 수 있다. Methods for increasing the expression or activity of the TAZ gene or protein include an increase in the number of gene copies, replacement with a promoter stronger than the native promoter, and increase in TAZ expression by mutation. The increase in the number of gene copies may include not only an increase in the number of copies due to introduction of a foreign gene, but also amplification of an intrinsic gene. The replacement of the gene promoter may include introduction of a foreign promoter having a characteristic of increasing expression of a downstream-linked gene, as well as replacement with an intrinsic promoter. The amplification of such an endogenous gene or protein can be easily performed by methods known in the art.
일 구체예에 있어서, 상기 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하여 혈당을 정상적인 수준 보다 높은 수준으로 증가시킬 수 있다. 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 방법으로는 상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성 억제제는 TAZ 단백질의 기능을 저해 또는 방해하는 것일 수 있다. 이와 같은 저해 또는 방해는 TAZ 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 TAZ 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는, TAZ 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, TAZ 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다. 예를 들어, "녹아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, "녹다운"은 RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다. In one embodiment, the composition may increase blood sugar to a level higher than a normal level by inhibiting the expression or activity of the TAZ gene or protein. As a method of inhibiting the expression or activity of the TAZ gene or protein, the inhibitor of expression or activity of the TAZ protein may inhibit or interfere with the function of the TAZ protein. Such inhibition or interference may be achieved by interfering with the transcription of the TAZ gene or by inhibiting the translation of the mRNA of the TAZ gene. Alternatively, the activity of the TAZ protein may be reduced or inactivated by specifically binding to the active site of the TAZ protein or causing a protein structure modification. For example, "knockout" means to induce complete inactivation of a normal gene by introducing the DNA caused by the deletion of the gene from the outside, and "knockdown" refers to the degradation of the mRNA expressed using RNAi or the like. It means to reduce the amount of gene expression by doing it.
상기 TAZ 유전자의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 인핸서(enhancer)에 결합하는 전사활성화인자(activator), TAZ 사일렌서(siliencer)에 결합하는 억제자(repressor), TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA, siRNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA, shRNA) 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. Agents that regulate the expression or activity of the TAZ gene include a transcription activator that binds to a TAZ enhancer, a repressor that binds to a TAZ silencer, and an antisense that complementarily binds to TAZ mRNA. It may be any one selected from the group consisting of nucleotides, small interfering RNA (siRNA), short hairpin RNA (shRNA), and combinations thereof.
상기 뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드의 빌딩 블록일 수 있고, 본 발명의 목적을 위하여 천연 발생 및 비-천연 발생 뉴클레오티드를 모두 포함할 수 있다. 천연적으로, 뉴클레오티드, 예컨대 DNA 및 RNA 뉴클레오티드는 리보스 당 모이어티, 핵염기 모이어티 및 하나 이상의 포스페이트 기(뉴클레오시드에는 부재함)를 포함할 수 있다. 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 또한 "단위" 또는 "단량체"와 상호교환적으로 지칭될 수 있다.The nucleotide may be a building block of oligonucleotides and polynucleotides, and may include both naturally occurring and non-naturally occurring nucleotides for the purposes of the present invention. Naturally, nucleotides such as DNA and RNA nucleotides may contain ribose sugar moieties, nucleobase moieties and one or more phosphate groups (absent in nucleosides). Nucleosides and nucleotides may also be referred to interchangeably with “units” or “monomers”.
상기 "상보적으로 결합"하는 것의 의미는 뉴클레오시드/뉴클레오티드의 왓슨-크릭(Watson-Crick)의 염기 쌍과 관련이 있다. 왓슨-크릭 염기 쌍은 구아닌(G)-시토신(C) 및 아데닌(A)-티민(T)/우라실(U)이다. 올리고뉴클레오티드는 변형된 핵염기를 갖는 뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 예를 들어 5-메틸 시토신이 종종 시토신 대신에 사용될 수 있다. 상기 용어 "상보적으로 결합"은 비-변형된 핵염기와 변형된 핵염기 사이의 왓슨-크릭 염기-결합을 포함할 수 있다.The meaning of "complementarily binding" is related to the Watson-Crick base pair of nucleosides/nucleotides. Watson-Crick base pairs are guanine (G)-cytosine (C) and adenine (A)-thymine (T)/uracil (U). Oligonucleotides may include nucleosides with modified nucleobases. For example, 5-methyl cytosine can often be used in place of cytosine. The term “complementarily bonded” may include Watson-Crick base-bonding between a non-modified nucleobase and a modified nucleobase.
상기 안티센스 뉴클레오티드는 표적 핵산, 특히 표적 핵산 상의 인접 서열에 혼성화함으로써 표적 유전자의 발현을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드로 정의될 수 있다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 본질적으로 이중가닥이 아니고, 이에 따라 siRNA 또는 shRNA가 아니다.The antisense nucleotide may be defined as an oligonucleotide capable of regulating the expression of a target gene by hybridizing to a target nucleic acid, in particular, a sequence adjacent to the target nucleic acid. Antisense oligonucleotides are not essentially double-stranded and therefore not siRNA or shRNA.
상기 용어, "작은 간섭 RNA"는 유전자의 활성을 억제하는 RNAi(RNA interference)를 유발시킬 수 있는 RNA를 의미할 수 있다. 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현을 억제할 수 있는 miRNA, siRNA 등이 될 수 있는데, 상기 작은 간섭 RNA는 TAZ 유전자의 발현 또는 활성을 억제시키기만 하면 어떠한 형태의 것도 가능할 수 있다. 예를 들면, 화학합성 또는 생화학적 합성 또는 생체 내 합성에 의해 수득되는 siRNA, 혹은 약 60 내지 40개 염기 이상의 이중가닥 RNA가 체내에서 분해된 10 내지 30개 염기 이상의 이중가닥 RNA 등을 사용할 수 있다.The term "small interfering RNA" may refer to RNA capable of inducing RNA interference (RNAi) that inhibits the activity of a gene. The small interfering RNA may be miRNA or siRNA capable of suppressing the expression of the TAZ gene, and the small interfering RNA may be in any form as long as it suppresses the expression or activity of the TAZ gene. For example, siRNA obtained by chemical synthesis or biochemical synthesis or in vivo synthesis, or double-stranded RNA of 10 to 30 bases or more in which a double-stranded RNA of about 60 to 40 bases or more is degraded in the body can be used. .
상기 TAZ 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다. The agent that modulates the expression or activity of the TAZ protein is selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antigen-binding fragments, antibodies, natural products, and combinations thereof that specifically bind to the TAZ protein. It can be either.
상기 "앱타머"는 소정의 표적 분자에 대한 결합 활성을 갖는 핵산 분자를 의미할 수 있다. 상기 앱타머는 RNA, DNA, 수식(modified) 핵산 또는 이들의 혼합물일 수 있으며, 직쇄상 또는 환상의 형태일 수 있는데, 대체로, 상기 앱타머를 구성하는 뉴클레오티드의 서열이 짧을수록 화학합성 및 대량 생산이 보다 용이하고, 비용면에서의 장점이 우수하며, 화학수식이 용이하고, 생체 내 안정성이 우수하며, 독성이 낮다고 알려져 있다.The "aptamer" may mean a nucleic acid molecule having binding activity to a predetermined target molecule. The aptamer may be RNA, DNA, a modified nucleic acid, or a mixture thereof, and may be in a linear or cyclic form.In general, the shorter the sequence of the nucleotides constituting the aptamer, the better the chemical synthesis and mass production. It is known that it is easier, has excellent cost advantages, is easy to chemically formulate, has excellent in vivo stability, and has low toxicity.
상기 "항체"는 단백질 또는 펩티드 분자의 항원성 부위에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질성 분자를 의미할 수 있고, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법을 거쳐 제조될 수 있다. 상기 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함될 수 있을 뿐만 아니라, 인간화 항체 등의 특수 항체를 포함할 수도 있다. 아울러, 상기 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며 Fab, F(ab'), F(ab')2 또는 Fv 등이 될 수 있다.The "antibody" may mean a proteinaceous molecule capable of specifically binding to an antigenic site of a protein or peptide molecule, and such an antibody is cloned into an expression vector according to a conventional method, and the marker gene A protein encoded by is obtained, and can be prepared from the obtained protein through a conventional method. The form of the antibody is not particularly limited, and if a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, or any one having antigen binding properties, a part thereof is also included in the antibody of the present invention, and all immunoglobulin antibodies may be included, as well as humanized antibodies, etc. It may also contain a special antibody of. In addition, the antibody may include a functional fragment of an antibody molecule as well as a complete form having two full-length light chains and two full-length heavy chains. A functional fragment of an antibody molecule means a fragment that has at least an antigen-binding function, and may be Fab, F(ab'), F(ab')2, Fv, or the like.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.Another aspect provides a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising an agent that modulates the expression or activity of a TAZ gene or protein.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 등에 대해서는 상기한 바와 같다.Agents that control the expression or activity of the TAZ, TAZ gene or protein are as described above.
본 명세서에서 용어, "대사성 질환(metabolic disease)"은 생체 내 물질대사 장애에 의해 발생하는 질환을 말한다. 구체적으로, 상기 대사성 질환은 췌장 기능 장애로부터 기인한 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 대사성 질환은 당뇨병, 고혈당증(hyperglycemia), 비만, 비알코올성 지방간, 공복혈당장애(impaired fasting glucose), 내당능장애(impaired glucose tolerance), 고지혈증(hyperlipidemia), 단백뇨, 고혈압, 고콜레스테롤혈증, 협심증, 심근경색, 뇌졸중, 심부전, 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 지연성 저혈당(prolonged hypoglycemia), 반응성 저혈당(reactive hypoglycemia), 사병성 저혈당(factitious hypoglycemia), 외인성 저혈당(exogenous hypoglycemia), 저혈당 뇌병증(hypoglycemic encephalopathy), 저혈당 혼수(hypoglycemic coma) 및 저혈당 무감지증으로 이루어진 군으로부터 선택된 것일 수 있다. 상기 당뇨병은 췌장에서 인슐린 분비 기능 장애로부터 발병된 제1형 당뇨병일 수 있다.As used herein, the term "metabolic disease" refers to a disease caused by metabolic disorders in vivo. Specifically, the metabolic disease may be caused by a pancreatic dysfunction. For example, the metabolic diseases are diabetes, hyperglycemia, obesity, non-alcoholic fatty liver, impaired fasting glucose, impaired glucose tolerance, hyperlipidemia, hypercholesterolemia, and hyperlipidemia. , Angina, myocardial infarction, stroke, heart failure, hyperinsulinemia, prolonged hypoglycemia, reactive hypoglycemia, factitious hypoglycemia, exogenous hypoglycemia, hypoglycemia hypoglycemic encephalopathy), hypoglycemic coma, and hypoglycemic anesthesia. The diabetes may be
본 명세서에서 용어, "예방"은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 포함한다. 본 명세서에서 용어, "치료"는 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term "prevention" includes all actions of inhibiting or delaying metabolic diseases by administering a pharmaceutical composition according to an aspect to an individual. As used herein, the term "treatment" refers to any action to improve or benefit the symptoms of a metabolic disease by administering a pharmaceutical composition according to an aspect to an individual.
상기 약학적 조성물은 혈당 조절 활성, 인슐린 생성 조절, 글루카곤 생성 조절, 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료 활성을 갖는 공지의 유효 성분을 더 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 공지의 천연 추출물, 천연물 기반 화합물, 합성 화합물 또는 이들의 조합일 수 있다. The pharmaceutical composition may further include a known active ingredient having an activity to regulate blood sugar, regulate insulin production, regulate glucagon production, or prevent or treat metabolic diseases. The active ingredient may be a known natural extract, a natural product-based compound, a synthetic compound, or a combination thereof.
상기 약학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 담체, 부형제, 또는 희석제는 예를 들어, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알기네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 또는 광물유를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may further include a carrier, excipient, or diluent. Carriers, excipients, or diluents are, for example, lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate, or mineral oil.
상기 약학적 조성물은 경구 또는 비경구 투여 제형을 갖는 것일 수 있다. 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화될 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.The pharmaceutical composition may have an oral or parenteral dosage form. The pharmaceutical compositions may be formulated in the form of oral dosage forms such as powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to a conventional method, respectively. In the case of formulation, it can be prepared using diluents or excipients such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
상기 약학적 조성물에 있어서, 경구 투여를 위한 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 또는 캡슐제일 수 있다. 상기 고형 제제는 부형제 또는 윤활제를 더 포함할 수 있다. 부형제는 예를 들면, 전분, 칼슘 카르보네이트(calcium carbonate), 수크로스, 락토스, 또는 젤라틴일 수 있다. 또한, 상기 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 또는 탈크일 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 경구를 위한 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제, 또는 시럽제일 수 있다. 상기 액상 제제는 물, 또는 리퀴드 파라핀을 포함할 수 있다. 상기 액상 제제는 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 또는 보존제를 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 있어서, 비경구 투여를 위한 제제는 크림, 로션, 연고, 액제, 패취, 향낭(sachet), 주사제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 또는 및 좌제일 수 있다.In the pharmaceutical composition, the solid preparation for oral administration may be a tablet, a pill, a powder, a granule, or a capsule. The solid formulation may further include an excipient or a lubricant. The excipient may be, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, or gelatin. In addition, the lubricant may be magnesium stearate or talc. In the pharmaceutical composition, the liquid formulation for oral administration may be a suspension, an inner solution, an emulsion, or a syrup. The liquid formulation may contain water or liquid paraffin. The liquid formulation may contain an excipient, such as a wetting agent, a sweetening agent, a fragrance, or a preservative. In the pharmaceutical composition, formulations for parenteral administration may be creams, lotions, ointments, solutions, patches, sachets, injections, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried or suppositories. have.
상기 약학적 조성물은 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 유효한 양으로 포함할 수 있다. 상기 유효한 양은 질환의 중증도, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 상기 약학적 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 상기 유효한 양은 상기 약학적 조성물 당 약 10 mg 내지 약 10 g, 약 100 mg 내지 약 8 g, 약 250 mg 내지 약 6 g, 약 약 500 mg 내지 약 4 g, 약 500 mg 내지 약 2 g, 또는 약 500 mg 내지 약 1 g일 수 있다. 상기 약학적 조성물은 경구, 경피, 피하, 직장, 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 국소, 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여될 수 있다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 예를 들어, 성인 기준으로 약 0.001 ㎎/kg 내지 약 100 ㎎/kg, 약 0.01 ㎎/kg 내지 약 10 ㎎/kg, 또는 약 0.1 ㎎/kg 내지 약 1 ㎎/kg의 범위 내이고, 1일 1회 내지 6회, 2 일 내지 3일에 1회, 또는 수일 1회 투여될 수 있다.The pharmaceutical composition may contain an effective amount of an agent that modulates the expression or activity of the TAZ gene or protein. The effective amount is the severity of the disease, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the time of administration, the route of administration and the rate of excretion, the duration of treatment, factors including drugs used in combination or concurrent with the pharmaceutical composition. And other factors well known in the medical field. The effective amount is about 10 mg to about 10 g, about 100 mg to about 8 g, about 250 mg to about 6 g, about 500 mg to about 4 g, about 500 mg to about 2 g, or It may be from about 500 mg to about 1 g. The pharmaceutical composition may be administered in a conventional manner through oral, transdermal, subcutaneous, rectal, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, intrasternal, topical, or intradermal routes. The dosage of the pharmaceutical composition is, for example, about 0.001 mg/kg to about 100 mg/kg, about 0.01 mg/kg to about 10 mg/kg, or about 0.1 mg/kg to about 1 mg/kg on an adult basis. It is in the range of kg, and may be administered once to 6 times a day, once every 2 to 3 days, or once a few days.
다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 포함하는 대사성 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.Another aspect provides a food composition for preventing or improving metabolic diseases comprising an agent that modulates the expression or activity of a TAZ gene or protein.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제, 대사성 질환 등에 대해서는 상기한 바와 같다.Agents that regulate the expression or activity of the TAZ, TAZ gene or protein, and metabolic diseases are as described above.
본 명세서에서, 용어 "개선"은 상기 식품 조성물을 개체에 투여하여 대사성 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 포함한다.In the present specification, the term "improvement" includes all actions to improve or benefit the symptoms of metabolic disease by administering the food composition to an individual.
상기 식품 조성물은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제를 캡슐화, 분말화, 또는 현탁액 등으로 제제화하여 기능성 식품으로 이용하거나 각종 식품에 첨가할 수 있다. 상기 식품은 예를 들어, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올음료, 비타민 복합제, 기능성 식품 및 건강 식품이다.The food composition may be used as a functional food or added to various foods by encapsulating, powdering, or formulating an agent that regulates the expression or activity of a TAZ gene or protein into a suspension. The foods are, for example, meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gum, dairy products including ice cream, various soups, beverages, tea, drinks, alcoholic beverages, vitamins. It is a combination drug, functional food and health food.
또 다른 양상은 췌장에서 TAZ(Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif) 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 단계를 포함하는 혈당 조절 방법을 제공한다.Another aspect provides a method for regulating blood glucose comprising the step of regulating the expression or activity of a transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ) gene or protein in the pancreas.
상기 TAZ, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 등에 대해서는 상기한 바와 같다.Agents that control the expression or activity of the TAZ, TAZ gene or protein are as described above.
또 다른 양상은 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환을 예방 또는 치료하는 방법; 및 대사성 질환의 치료제를 제조하기 위한, 상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절하는 제제 또는 이를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물의 의약적 용도를 제공한다.Another aspect is a method of preventing or treating a metabolic disease comprising administering an agent that modulates the expression or activity of a TAZ gene or protein or a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient; And for preparing a therapeutic agent for metabolic diseases, it provides a pharmaceutical use of a pharmaceutical composition comprising the same as an active ingredient or an agent that modulates the expression or activity of the TAZ gene or protein.
일 양상에 따르면, 췌장에서 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써 췌장으로부터 인슐린 및 글루카곤의 생산 및 분비를 조절할 수 있는 효과가 있으므로, 혈당 조절과 관련된 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애로부터 기인한 대사성 질환의 예방, 개선, 또는 치료에 사용할 수 있다.According to one aspect, since it has the effect of regulating the production and secretion of insulin and glucagon from the pancreas by regulating the expression or activity of the TAZ gene or protein in the pancreas, metabolic diseases related to blood sugar regulation, especially metabolic due to pancreatic dysfunction. It can be used to prevent, ameliorate, or treat diseases.
도 1은 TAZ 결핍이 유발하는 췌장 조직 내 이자섬의 기능 및 구조적 이상을 확인한 결과이다. 도 1A는 췌장에서 TAZ 발현에 대한 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=4). 도 1B는 췌장 조직 내 이자섬에서 TAZ의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=4, 막대눈금: 50 ㎛). 도 1C는 WT 및 TAZ KO 마우스의 췌장 조직의 HE 염색 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=6, 막대눈금: 200 및 50 ㎛). 도 1D는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장 조직 내 이자섬에서 생성되는 인슐린 및 글루카곤의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 ㎛). 도 1E는 WT 및 TAZ KO 마우스의 혈액 샘플에서 인슐린 및 글루카곤의 ELISA 결과를 나타낸 것이다(그룹당 n=6, *P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정(two tailed Student's t-test)). 모든 실험은 적어도 3회 반복하였고, 대표 도면을 나타낸 것이다.
도 2는 TAZ KO 마우스 췌장의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 2A는 WT 및 TAZ KO 마우스의 연령대별 인슐린 생성에 대한 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 2B는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장에서 PDX1 및 p65 발현을 확인하는 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 2C는 WT 및 TAZ KO 마우스 췌장의 콜라겐 축적(트리크롬 염색), 췌장 조직의 외분비선 부위의 HE 염색, 및 E-카데린 발현을 확인하는 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, 막대눈금: 10, 20, 50 및 100 ㎛)
도 3은 췌장 특이적 TAZ KO(TAZ P-KO) 마우스의 췌장의 구조 및 기능의 손상을 나타낸 것이다. 도 3A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장에서 HE 염색 및 인슐린 및 글루카곤의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 200 및 50 ㎛). 도 3B는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장에서 preproinsulin, insulin, pdx1, mafA, 및 glucagon의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다. 도 3C는 GLUT2 및 PDX1 단백질 발현의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다. 도 3D는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장으로부터 분리된 이자섬 세포에서 preproinsulin, glut2, mafA, glucagon, 및 foxA2의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, **P<0.005; ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 4는 마우스 췌장 및 분리된 이자섬의 조직학적 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 4A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 췌장 외분비선 부위의 HE 염색 및 E-카데린 단백질의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 및 20 ㎛). 도 4B는 글루카곤 및 p65의 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(막대눈금: 50 ㎛). 도 4C는 가스트린 및 소마토스타틴의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(데이터는 평균±표준측정오차(SEM: Standard Error of Measurment), n= 5로 나타냄, *P<0.05; **P<0.005, 양측 스튜던트 t-검정). 도 4D는 이자섬의 분리 및 1차 배양 후 세포 모양을 나타낸 것이다.
도 5는 TAZ P-KO 마우스에서 관찰되는 당뇨-유사 표현형을 나타낸 것이다. 도 5A는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 혈청의 인슐린 및 글루카곤에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 5B는 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 글루코스 내성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5C는 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 인슐린 감수성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 5D는 연령에 따른 체중 변화를 나타낸 것이다. (그룹당 n=6, *P<0.05; **P<0.005, ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 6은 TAZ의 과발현 및 넉다운에 의한 β-세포 마커 발현의 상호 조절 결과를 나타낸 것이다. 도 6A는 안정적 TAZ/NIT-1 세포에서 TAZ 발현의 면역블롯 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 6B는 안정적 TAZ/NIT-1 세포에서 β-세포 마커의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(그룹당 n=5). 도 6C는 TAZ 넉다운된 TAZi/NIT-1 세포에서 β-세포 마커의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다(그룹당 n=4). (**P<0.005; ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정)
도 7은 TAZ에 의한 PDX1의 활성 증가 결과를 나타낸 것이다. 도 7A는 HEK293T 세포에서 PDX1 및 TAZ 발현에 대한 면역블롯 분석 결과 및 PDX 및/또는 TAZ의 존재 하에 인슐린 프로모터 활성의 리포터 분석(reporter assay) 결과를 나타낸 것이다(데이터는 평균±SEM(n= 5)로 나타냄, ***P<0.0005). 도 7B는 인슐린 프로모터 DNA에 바이오틴이 붙여 결합된 단백질 PDX1의 존재를 확인한 결과를 나타낸 것이다. 도 7C는 다양한 TAZ 절단(truncation) 단백질의 존재에 따른 PDX1의 DNA 결합력을 측정한 결과를 나타낸 것이다. 도 7D는 다양한 TAZ 절단 단백질의 존재 하에 PDX1의 인슐린 활성 촉진 분석결과를 나타낸 것이다(데이터는 평균±SEM(n= 5)로 나타냄, ***P<0.0005, 양측 스튜던트 t-검정). 도 7E는 면역침전법 및 면역블롯 분석에 의한 PDX1-TAZ 상호결합 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 비-β-세포에서 PDX1 및 TAZ에 의한 β-세포 마커의 전사가 증가된 결과를 나타낸 것이다. 도 8A는 NIT-1 세포에서 내인성 또는 외인성 PDX1 존재 하에 TAZ에 의해 인슐린 프로모터 활성이 증가된 결과를 나타낸 것이다. 글루카곤 프로코터 활성은 PDX1과 TAZ 단백질에 의해 영향을 받지 않는다. 도 8B는 NIT-1 세포에서 다양한 PDX 절단 단백질과 TAZ의 발현에 의해 인슐린 프로모터 활성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 8C는 PDX1 및 TAZ의 형질도입에 의해 C3H10T1/2 세포가 β-유사 세포로 분화하는데 있어, TAZ 및 PDX1의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다.
도 9는 고지방 식이가 TAZ P-KO 마우스의 글루코스 및 인슐린 저항성을 악화시킴을 나타낸 것이다. 도 9A는 고지방 식이가 공급된 이후의 체중 변화를 나타낸 것이다. 도 9B는 8주 동안 고지방 식이가 공급된 WT 및 TAZ P-KO 마우스에서 글루코스 내성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9C는 고지방 식이가 공급된 WT 및 TAZ P-KO 마우스에서 인슐린 감수성 분석 결과를 나타낸 것이다. 도 9D는 고지방 식이 후 WT 및 TAZ P-KO 마우스의 췌장에서 인슐린 및 글루카곤의 HE 염색 및 면역조직화학 결과를 나타낸 것이다(지방 조직은 HE 염색, 및 간 조직은 보디피(bodipy) 염색, 막대눈금: 20, 50 및 100 ㎛). 도 9E는 WT 및 TAZ P-KO 마우스 혈청의 인슐린 및 글루카곤에 대한 ELISA 결과를 나타낸 것이다. 도 9F는 췌장에서 분리된 이자섬 세포들에서 발현되는 mafA, nkx6.1, glut2, 및 pdx1의 상대적 전사 수준을 나타낸 것이다.1 is a result of confirming the functional and structural abnormalities of islets in pancreatic tissue caused by TAZ deficiency. 1A shows the results of immunoblot analysis for TAZ expression in the pancreas (n=4 per group). 1B shows the results of immunohistochemistry of TAZ in pancreatic islets (n=4 per group, bar scale: 50 μm). 1C shows the results of HE staining of pancreatic tissues of WT and TAZ KO mice (n=6 per group, bar scales: 200 and 50 μm). Figure 1D shows the results of immunohistochemistry of insulin and glucagon produced from pancreatic islets in pancreatic tissues of WT and TAZ KO mice (bar scale: 50 μm). 1E shows the ELISA results of insulin and glucagon in blood samples from WT and TAZ KO mice (n=6 per group, *P<0.05;**P<0.005, two tailed Student's t-test. )). All experiments were repeated at least 3 times, and representative drawings are shown.
2 shows the results of histological analysis of the pancreas of TAZ KO mice. Figure 2A shows the results of immunohistochemistry for insulin production by age group of WT and TAZ KO mice. Figure 2B shows the results of immunohistochemistry confirming the expression of PDX1 and p65 in the pancreas of WT and TAZ KO mice. Figure 2C shows the results of immunohistochemistry confirming collagen accumulation (trichrome staining) in the pancreas of WT and TAZ KO mice, HE staining of exocrine glands of pancreatic tissue, and E-cadherin expression. (N=6 per group, bar scale: 10, 20, 50 and 100 μm)
3 shows the damage to the structure and function of the pancreas of pancreatic-specific TAZ KO (TAZ P-KO) mice. Figure 3A shows the results of HE staining and immunohistochemistry of insulin and glucagon in the pancreas of WT and TAZ P-KO mice (bar scales: 200 and 50 μm). 3B shows the relative transcription levels of preproinsulin, insulin, pdx1, mafA, and glucagon in the pancreas of WT and TAZ P-KO mice. Figure 3C shows the immunohistochemistry results of GLUT2 and PDX1 protein expression. 3D shows the relative transcription levels of preproinsulin, glut2, mafA, glucagon, and foxA2 in islet cells isolated from pancreas of WT and TAZ P-KO mice. (N=6 per group, **P<0.005;***P<0.0005, two-tailed Student's t-test)
4 shows the results of histological analysis of mouse pancreas and isolated islets. 4A shows the results of HE staining and immunohistochemistry of E-cadherin protein in pancreatic exocrine glands of WT and TAZ P-KO mice (bar scales: 50 and 20 μm). 4B shows the immunohistochemistry results of glucagon and p65 (bar scale: 50 μm). Figure 4C shows the relative transcription levels of gastrin and somatostatin (data are expressed as mean±standard error of measurement (SEM), n=5, *P<0.05;**P<0.005, two-sided Student's t -black). Figure 4D shows the cell shape after isolation and primary culture of islets.
5 shows a diabetes-like phenotype observed in TAZ P-KO mice. 5A shows ELISA results for insulin and glucagon in serum of WT and TAZ P-KO mice. 5B shows the results of glucose tolerance analysis of WT and TAZ P-KO mice. 5C shows the results of insulin sensitivity analysis of WT and TAZ P-KO mice. 5D shows the change in weight according to age. (N=6 per group, *P<0.05;**P<0.005,***P<0.0005, two-tailed Student's t-test)
6 shows the results of mutual regulation of β-cell marker expression by overexpression and knockdown of TAZ. 6A shows the results of immunoblot analysis of TAZ expression in stable TAZ/NIT-1 cells. 6B shows the relative transcription levels of β-cell markers in stable TAZ/NIT-1 cells (n=5 per group). 6C shows the relative transcription levels of β-cell markers in TAZ-knocked-down TAZi/NIT-1 cells (n=4 per group). (**P<0.005;***P<0.0005, two-sided Student's t-test)
7 shows the result of increasing the activity of PDX1 by TAZ. Figure 7A shows the results of immunoblot analysis for PDX1 and TAZ expression in HEK293T cells and reporter assay results of insulin promoter activity in the presence of PDX and/or TAZ (data is mean±SEM (n=5). Represented by ***P<0.0005). 7B shows the result of confirming the presence of the protein PDX1 bound by attaching biotin to the insulin promoter DNA. 7C shows the results of measuring the DNA binding force of PDX1 according to the presence of various TAZ truncation proteins. Figure 7D shows the results of the insulin activity promotion assay of PDX1 in the presence of various TAZ cleavage proteins (data are represented by mean±SEM (n=5), ***P<0.0005, two-sided Student's t-test). Figure 7E shows the PDX1-TAZ interaction results by immunoprecipitation and immunoblot analysis.
8 shows the result of increased transcription of β-cell markers by PDX1 and TAZ in non-β-cells. 8A shows the result of increased insulin promoter activity by TAZ in the presence of endogenous or exogenous PDX1 in NIT-1 cells. Glucagon procoter activity is not affected by PDX1 and TAZ proteins. 8B shows the results of insulin promoter activity analysis by expression of various PDX cleavage proteins and TAZ in NIT-1 cells. 8C shows the relative transcription levels of TAZ and PDX1 in the differentiation of C3H10T1/2 cells into β-like cells by transduction of PDX1 and TAZ.
9 shows that a high fat diet worsens glucose and insulin resistance in TAZ P-KO mice. Figure 9A shows the change in body weight after a high fat diet is supplied. 9B shows the results of glucose tolerance analysis in WT and TAZ P-KO mice fed a high fat diet for 8 weeks. 9C shows the results of insulin sensitivity analysis in WT and TAZ P-KO mice fed a high fat diet. 9D shows the results of HE staining and immunohistochemistry of insulin and glucagon in the pancreas of WT and TAZ P-KO mice after a high fat diet (HE staining for adipose tissue, and bodipy staining for liver tissue, bar scale) : 20, 50 and 100 μm). 9E shows ELISA results for insulin and glucagon in WT and TAZ P-KO mouse serum. 9F shows the relative transcription levels of mafA, nkx6.1, glut2 , and pdx1 expressed in islet cells isolated from the pancreas.
이하 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.It will be described in more detail through the following examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. TAZ 넉아웃(TAZ KO) 마우스를 이용한 TAZ 역할 확인Example 1. Checking the role of TAZ using a TAZ knockout (TAZ KO) mouse
1.1 TAZ 넉아웃(TAZ KO) 마우스 제작1.1 TAZ knockout (TAZ KO) mouse production
수컷 야생형(WT) C57BL/6 마우스는 Jackson 실험실(Minneapolis, 미국)에서 구입하였다. TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질도입시키고, 상기 배아줄기세포를 배반포의 포배강에 주입하여 키메라 마우스를 얻은 후, 상기 키메라 마우스로부터 TAZ+/- 유전형질을 갖는 이형접합체 마우스을 얻었다. 이어서 상기 이형접합체 마우스를 상호교배시켜 TAZ-/- 유전형질을 갖는 동형접합체 마우스를 수득하여 TAZ 넉아웃(KO) 마우스를 제작하였다. 모든 동물은 무균 조건에서 사육되었고, 이화여자대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인(2010-13-3, 2015-01-020, 및 17-013)을 받아 IACUC 지침에 따라 실시되었다.Male wild type (WT) C57BL/6 mice were purchased from Jackson Laboratories (Minneapolis, USA). The TAZ gene knockout cassette was transduced into embryonic stem cells, and the embryonic stem cells were injected into the blastocyst cavity of the blastocyst to obtain a chimeric mouse, and then a heterozygous mouse having a TAZ +/- genotype was obtained from the chimeric mouse. Subsequently, the heterozygous mice were intercrossed to obtain homozygous mice having a TAZ -/- genotypic, and TAZ knockout (KO) mice were prepared. All animals were bred under aseptic conditions, and were approved (2010-13-3, 2015-01-020, and 17-013) by the Animal Experimental Ethics Committee (IACUC) of Ewha Womans University and carried out according to the IACUC guidelines.
1.2 췌장에서의 TAZ 발현 여부 확인1.2 Confirmation of TAZ expression in the pancreas
췌장에서의 TAZ 발현 여부를 확인하기 위해, TAZ 넉아웃(KO) 마우스의 췌장 조직과 야생형(WT) 마우스 조직을 염색하여 비교하였다. 구체적으로, 췌장 조직을 WT, TAZ KO 마우스로부터 분리하고, 10% 중화된 포르말린으로 고정시켰다. 4 ㎛ 두께의 조직 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE; Sigma-Aldrich)으로 염색하고, Nikon Eclipse E200 현미경(Nikon, 일본)으로 관찰하였다. In order to confirm the expression of TAZ in the pancreas, pancreatic tissues of TAZ knockout (KO) mice and wild-type (WT) mouse tissues were stained and compared. Specifically, pancreatic tissue was isolated from WT and TAZ KO mice, and fixed with 10% neutralized formalin. Tissue sections having a thickness of 4 μm were stained with hematoxylin and eosin (HE; Sigma-Aldrich), and observed with a Nikon Eclipse E200 microscope (Nikon, Japan).
그 결과, 도 1A에 나타낸 바와 같이, 야생형 마우스에서는 TAZ 발현이 관찰되었으나, TAZ KO 마우스에서는 TAZ 발현이 관찰되지 않았다. As a result, as shown in Fig. 1A, TAZ expression was observed in wild-type mice, but TAZ expression was not observed in TAZ KO mice.
TAZ가 단백질의 췌장조직에서의 발현됨을 확인하기 위해, 췌장 조직에서의 면역조직화학을 수행하였다. 구체적으로, 면역조직화학은 조직 절편을 특이적 1차 항체 및 형광물질이 접합된 2차 항체(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 반응시킨 다음, 4',6'-디아미노-2-페닐인돌(4,6-DAPI: 4',6'-diamidino-2-phenylindol)으로 대비염색하였다. 공초점 현미경 및 NIS-Elements AR 소프트웨어를 이용하여 측정하였다. In order to confirm that TAZ is expressed in the pancreatic tissue of the protein, immunohistochemistry was performed in the pancreatic tissue. Specifically, in immunohistochemistry, a tissue section is reacted with a specific primary antibody and a secondary antibody conjugated with a fluorescent substance (Molecular Probes, Eugene, OR, USA), and then 4',6'-diamino-2 -Phenylindole (4,6-DAPI: 4',6'-diamidino-2-phenylindol) was counter-stained. Measurements were made using a confocal microscope and NIS-Elements AR software.
그 결과, 도 1B에 나타낸 바와 같이, 1차 항체로서 항-TAZ 항체(BD Biosciences, Sandiego, CA, USA)를 이용한 경우, WT 마우스의 췌장 조직에서 TAZ 발현을 관찰할 수 있었으나, TAZ KO 마우스의 췌장 조직에서는 관찰되지 않았다. 또한, 1차 항체로서 항-TAZ/YAP 항체(Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA)를 이용한 경우, YAP의 발현은 WT 및 TAZ KO 마우스의 췌장 조직 모두에서 관찰되었으나, TAZ 발현은 WT 마우스의 췌장 조직에서만 관찰되었다. 상기 결과로부터, TAZ는 주로 이자섬에서 발현됨을 확인할 수 있다.As a result, as shown in Fig. 1B, when an anti-TAZ antibody (BD Biosciences, Sandiego, CA, USA) was used as the primary antibody, TAZ expression could be observed in the pancreatic tissue of WT mice. It was not observed in pancreatic tissue. In addition, when an anti-TAZ/YAP antibody (Cell Signaling Technology Inc., Danvers, MA, USA) was used as the primary antibody, YAP expression was observed in both pancreatic tissues of WT and TAZ KO mice, but TAZ expression was WT. It was observed only in the pancreatic tissue of the mouse. From the above results, it can be seen that TAZ is mainly expressed in islet.
1.3 췌장의 구조 및 기능과 관련된 TAZ의 효과 확인1.3 Confirmation of the effect of TAZ on the structure and function of the pancreas
이자섬의 구조와 관련된 TAZ 역할을 확인하기 위해, TAZ 넉아웃(KO) 마우스 및 야생형(WT) 마우스의 췌장 조직을 염색하여 비교 관찰하였다. 조직 염색은 상기 실시예 1.2과 동일한 방법으로 수행하였다. 그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이, WT 마우스의 이자섬은 고밀도의 구형 형태를 유지하였으나, TAZ-결핍된 이자섬은 불규칙적인 경계를 가진 늘어진 형태로 관찰되었다. 상기 결과로부터 TAZ가 이자섬의 구조를 유지하는데 중요한 역할을 수행함을 확인할 수 있다.In order to confirm the role of TAZ related to the structure of islets, pancreatic tissues of TAZ knockout (KO) mice and wild-type (WT) mice were stained and observed for comparison. Tissue staining was performed in the same manner as in Example 1.2. As a result, as shown in FIG. 1C, the pancreatic islets of WT mice maintained a high-density spherical shape, but the TAZ-deficient pancreatic islets were observed in a sagging shape with irregular boundaries. From the above results, it can be confirmed that TAZ plays an important role in maintaining the structure of the interest island.
이자섬의 기능, 특히 인슐린 및 글루카곤 생산 기능과 관련된 TAZ 역할을 확인하기 위해, 실시예 1.2와 동일한 방법으로 면역조직화학을 수행하였다. 그 결과, 도 1D에 나타낸 바와 같이, 항-인슐린 항체(Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA) 및 항-글루카곤 항체(R&D systems, Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 조직을 염색한 경우, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ-결핍된 이자섬 조직에서 인슐린 생산이 감소한 반면, 글루카곤 생산이 증가됨을 확인하였다. Immunohistochemistry was performed in the same manner as in Example 1.2 in order to confirm the role of TAZ related to the function of islets, particularly insulin and glucagon production. As a result, as shown in FIG. 1D, when the tissue was stained using an anti-insulin antibody (Santa Cruz Biotechnology, SantaCruz, CA, USA) and an anti-glucagon antibody (R&D systems, Minneapolis, MN, USA), a control group Compared with WT mice, it was confirmed that insulin production was decreased in TAZ-deficient islet tissue, while glucagon production was increased.
추가적으로, TAZ KO 마우스의 혈청 내 인슐린 및 글루카곤 농도를 분석한 결과, 도 1E에 나타낸 바와 같이, 6시간 단식 및 하룻밤 동안의 단식 조건 모두에서, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ KO 마우스에서 인슐린 생산이 상당히 많이 감소되고, 글루카곤 생산은 유의적으로 증가됨을 확인하였다. In addition, as a result of analyzing the serum insulin and glucagon concentrations of TAZ KO mice, as shown in FIG. 1E, in both 6-hour fasting and overnight fasting conditions, compared to the control WT mice, insulin production in TAZ KO mice was It was confirmed that it was significantly reduced, and glucagon production was significantly increased.
또한, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 마우스의 연령별 인슐린에 대한 면역조직화학을 수행한 결과, WT 마우스는 연령에 따라 인슐린 생산량의 변화가 거의 없었으나, TAZ KO 마우스는 노화될수록 인슐린 생산의 감소가 유의적으로 나타남을 확인하였다. In addition, as shown in Figure 2A, as a result of performing immunohistochemistry for insulin by age of mice, WT mice showed little change in insulin production according to age, but TAZ KO mice showed a significant decrease in insulin production as they age. It was confirmed that it appeared as an enemy.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 이자섬 β-세포 마커인 PDX1와 대조군으로서 p65에 대한 면역조직화학을 수행한 결과, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ KO 마우스에서 p65 발현의 변화는 거의 없으나, PDX1의 발현은 유의적으로 감소됨을 확인하였다. As shown in Figure 2B, as a result of performing immunohistochemistry for islet β-cell marker PDX1 and p65 as a control, compared to the control WT mice, there was little change in p65 expression in TAZ KO mice, but PDX1 It was confirmed that the expression was significantly reduced.
도 2C에 나타낸 바와 같이, 췌장 조직을 트리크롬(trichrome) 및 HE로 염색하여 관찰하고, E-카데린(E-cadherin)에 대하여 면역조직화학을 수행한 결과, 대조군 WT 마우스와 비교하여 TAZ KO 마우스에서 췌장의 외분비선(exocrine gland)이 손상되며, 생체 조직 내의 상호 접착을 유지하는 E-카데린의 발현이 감소됨을 확인하였다. As shown in FIG. 2C, the pancreatic tissue was observed by staining with trichrome and HE, and immunohistochemistry was performed for E-cadherin. As a result, TAZ KO compared to control WT mice. In mice, it was confirmed that the exocrine gland of the pancreas was damaged, and the expression of E-cadherin, which maintains mutual adhesion in living tissues, was reduced.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬의 구조 및 기능, 특히 인슐린 및 글루카곤 생산을 조절하는 기능과 관련하여 중요한 역할을 수행함을 확인할 수 있다.From the above results, it can be seen that TAZ plays an important role in relation to the structure and function of islets, particularly the function of regulating insulin and glucagon production.
실시예 2. 췌장 특이적 TAZ 넉아웃(TAZ P-KO) 마우스를 이용한 TAZ 역할 확인Example 2. Confirmation of the role of TAZ using pancreatic-specific TAZ knockout (TAZ P-KO) mice
2.1 췌장 특이적 TAZ 넉아웃(TAZ P-KO) 마우스 제작2.1 Pancreas specific TAZ knockout (TAZ P-KO) mouse construction
췌장 특이적 TAZ KO 마우스 제작을 위해 loxp가 삽입된 TAZ 유전자 녹아웃 카세트를 배아줄기세포에 형질도입시켜 동형접합체 TAZ floxed 마우스를 수득한 다음, PDX1-cre transgenic 마우스 (Jackson 실험실(Minneapolis, 미국)에서 구입)와 교배하여 PDX1-cre 유전자를 발현하는 TAZ KO 동형접합체 마우스를 제작하였다. 유전형질 분석을 위한 프라이머 세트는 하기 표 1에 나타낸다. 모든 동물은 무균 조건에서 사육되었고, 이화여자대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인(2010-13-3, 2015-01-020, 및 17-013)을 받아 IACUC 지침에 따라 실시되었다.For the production of pancreatic-specific TAZ KO mice, homozygous TAZ floxed mice were obtained by transducing a TAZ gene knockout cassette into which loxp was inserted into embryonic stem cells, and then purchased from PDX1-cre transgenic mice (Jackson Laboratories (Minneapolis, USA). ) To produce a TAZ KO homozygous mouse expressing the PDX1-cre gene. Primer sets for genotyping are shown in Table 1 below. All animals were bred under aseptic conditions, and were approved (2010-13-3, 2015-01-020, and 17-013) by the Animal Experimental Ethics Committee (IACUC) of Ewha Womans University and carried out according to the IACUC guidelines.
2.2 이자섬의 기능을 조절하는 TAZ의 효과 확인2.2 Check the effect of TAZ to control the function of interest island
이자섬의 기능과 관련된 TAZ의 주요 역할을 확인하기 위해, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여, 췌장 조직 염색 및 면역조직화학을 수행하였다. 그 결과, 도 3A 및 4A에 나타낸 바와 같이, TAZ T-KO 마우스는 상기 실시예 1에서 확인한 TAZ KO 마우스와 동일한 결과를 나타내었다. 구체적으로, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ T-KO 마우스는 이자섬 및 외분비 시스템이 손상되고, 인슐린 생산이 감소되나, 글루카곤을 분비하는 α-세포들은 증가됨을 확인하였다. In order to confirm the main role of TAZ related to the function of islet, pancreatic tissue staining and immunohistochemistry were performed using the same method as in Example 1. As a result, as shown in Figs. 3A and 4A, the TAZ T-KO mouse showed the same results as the TAZ KO mouse confirmed in Example 1. Specifically, compared with the control WT mice, TAZ T-KO mice were found to have damage to islets and exocrine systems, and insulin production decreased, but α-cells secreting glucagon were increased.
WT 및 TAZ P-KO 마우스로부터 분리된 이자섬에서 preproinsulin, insulin, glut2, mafA, 및 glucagon의 상대적 전사 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 3B 및 4B에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ T-KO 마우스에서 preproinsulin, insulin, glut2, 및 mafA의 상대적 전사 수준은 유의적으로 감소된 반면에, glucagon의 상대적 전사 수준은 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 또한, 도 3C에 나타낸 바와 같이, 대조군과 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 인슐린 생산이 감소됨에 따라, GLUT2 및 PDX1의 단백질 발현 수준이 감소됨을 확인하였다. Relative transcription levels of preproinsulin, insulin, glut2, mafA, and glucagon were confirmed in islets isolated from WT and TAZ P-KO mice. As a result, as shown in FIGS. 3B and 4B, compared to the control WT mice, the relative transcription levels of preproinsulin, insulin, glut2 , and mafA in TAZ T-KO mice were significantly reduced, while the relative transcription of glucagon It was confirmed that the level was significantly increased. In addition, as shown in FIG. 3C, it was confirmed that the protein expression levels of GLUT2 and PDX1 decreased as insulin production decreased in TAZ T-KO mice compared to the control group.
WT 및 TAZ P-KO 마우스에서, 위의 G세포가 분비하는 가스트린(gastrin) 및 이자섬의 D세포가 분비하는 소마토스타틴(somatostatin)의 상대적 전사 수준을 확인하였다. 그 결과, 도 4C에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 가스트린 및 소마토스타틴의 생산이 증가됨을 확인하였다. In WT and KO mice TAZ-P, it was confirmed that the relative transcription levels of gastrin (gastrin) and and somatostatin (somatostatin) to D cells which secrete the secretion of the island and the above G cells. As a result, as shown in FIG. 4C, it was confirmed that the production of gastrin and somatostatin was increased in TAZ T-KO mice compared to control WT mice.
WT 및 TAZ T-KO 마우스로부터 분리된 이자섬의 유전자 발현의 정량적 분석을 수행한 결과, 도 3D 및 도 4D에 나타낸 바와 같이, WT 대조군과 비교하여 TAZ T-KO 마우스에서 α-세포 관련 마커인 insulin, glut2, 및 mafA의 발현은 감소되었으나, β-세포 관련 마커인 glucagon 및 FoxA2의 발현은 증가됨을 확인하였다. As a result of performing a quantitative analysis of the gene expression of islets isolated from WT and TAZ T-KO mice, as shown in Figs. 3D and 4D, the α-cell-related marker in TAZ T-KO mice compared to the WT control group. Insulin, glut2, and mafA expressions were decreased, but the expressions of β-cell related markers glucagon and FoxA2 were increased.
상기 결과로부터, 췌장에서 TAZ 유전자가 결여 또는 억제되는 경우, 인슐린 생산에 관여하는 α-세포의 활성을 감소시키고, 글루카곤 생산에 관여하는 β-세포의 활성을 증가됨을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that the absence or inhibition of the TAZ gene in the pancreas reduces the activity of α-cells involved in insulin production and increases the activity of β-cells involved in glucagon production.
2.3 혈당 및 대사 상태를 조절하는 TAZ의 효과 확인2.3 Checking the effect of TAZ on regulating blood sugar and metabolic status
TAZ P-KO 마우스의 혈청 내 인슐린 및 글루카곤 농도를 확인하였다. 그 결과, 도 5A에 나타낸 바와 같이, 혈청 내 인슐린 농도가 감소되는 반면, 글루카곤 농도가 증가됨을 확인하였다. Insulin and glucagon concentrations in serum of TAZ P-KO mice were checked. As a result, as shown in FIG. 5A, it was confirmed that the insulin concentration in the serum was decreased, while the glucagon concentration was increased.
TAZ P-KO 마우스의 글루코스 내성 (glucose tolerance) 및 인슐린 감수성(insulin sensitivity) 시험을 수행하였다. 인슐린 감수성은 단식 6시간 후 측정하였다. 그 결과, 도 5B에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스는 글루코스 주입 즉시 혈당이 증가하고, 기저 수준으로 다시 낮아지는 반면, TAZ P-KO 마우스는 대조군 WT 마우스에 비해 높은 혈당 수준을 유지하므로, 글루코스 불내성(glucose intolerance)임을 확인하였다. 또한, 도 5C에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스와 비교하여, TAZ P-KO 마우스의 혈당 기저 수준은 훨씬 더 높고, 인슐린 주입 후 시간이 경과함에 따라 더 오랜 기간 동안 고혈당으로 유지하므로, 인슐린 감수성이 낮음을 확인하였다. Glucose tolerance and insulin sensitivity tests of TAZ P-KO mice were performed. Insulin sensitivity was measured 6 hours after fasting. As a result, as shown in FIG. 5B, the control WT mice increased blood sugar immediately after glucose injection and lowered back to the basal level, whereas the TAZ P-KO mice maintained higher blood sugar levels compared to the control WT mice, so glucose intolerance. (glucose intolerance). In addition, as shown in Fig. 5C, compared to the control WT mice, the baseline blood glucose level of the TAZ P-KO mice is much higher, and the insulin sensitivity is maintained as hyperglycemia for a longer period of time as time elapses after insulin injection. It was confirmed that it was low.
TAZ P-KO 마우스의 연령별 체중 변화를 확인하였다. 그 결과, 도 5D에 나타낸 바와 같이, 대조군 WT 마우스는 연령이 높아짐에 따라, 체중이 점진적으로 증가되는 반면, TAZ P-KO 마우스는 4월령 이후 연령에서 체중이 급격히 증가됨을 확인하였다. Changes in body weight by age of TAZ P-KO mice were confirmed. As a result, as shown in FIG. 5D, it was confirmed that the weight of the control WT mice gradually increased as the age increased, whereas the TAZ P-KO mice increased their body weight rapidly with age after the age of April.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬 기능을 조절함으로써, 혈당 및 대사 상태를 조절하는 데 중요한 역할이 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that TAZ has an important role in regulating blood sugar and metabolic status by regulating islet function.
실시예 3. TAZ에 의한 이자섬 세포 마커의 발현 조절 확인Example 3. Confirmation of expression regulation of islet cell marker by TAZ
3.1 TAZ에 의한 α- 및 β-세포 마커의 직접적인 전사 조절 확인3.1 Confirmation of direct transcriptional regulation of α- and β-cell markers by TAZ
이자섬 세포 마커의 발현에 대한 TAZ의 직접적인 효과를 확인하기 위해, 이자 β-세포주인 NIT-1세포로부터 TAZ를 안정적으로 과발현하는 TAZ/NIT-1 세포를 제작하였다. TAZ/NIT-1 세포에 대한 면역 블롯 분석을 수행한 결과, 도 6A에 나타낸 바와 같이, TAZ의 발현 수준이 증가됨을 확인하였다. In order to confirm the direct effect of TAZ on the expression of pancreatic islet cell markers, TAZ/NIT-1 cells stably overexpressing TAZ were constructed from pancreatic β-cell line, NIT-1 cells. As a result of performing immunoblot analysis on TAZ/NIT-1 cells, it was confirmed that the expression level of TAZ was increased, as shown in FIG. 6A.
상기 제작된 TAZ/NIT-1 세포를 이용하여 TAZ의 과발현 및 넉다운에 따른 β-세포 마커 발현의 상반되는 조절 효과를 확인하였다. 구체적으로, TRIzol 시약을 이용하여 NIT-1 이자 세포주로부터 총 RNA를 분리하고, cDNA 합성 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 역전사시켰다. 실시간 PCR은 StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 상대적 발현 수준은 β-엑틴의 수준에 대하여 정규화하여 계산하였다. 사용된 프라이머 세트는 하기 표 2에 나타낸다.Using the prepared TAZ/NIT-1 cells, it was confirmed that the opposite regulatory effects of β-cell marker expression according to overexpression and knockdown of TAZ were observed. Specifically, total RNA was isolated from the NIT-1 cell line using a TRIzol reagent, and reverse transcription was performed using a cDNA synthesis kit (Thermo Fisher Scientific). Real-time PCR was performed using StepOnePlus (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Relative expression levels were calculated by normalizing to the level of β-actin. The primer sets used are shown in Table 2 below.
그 결과, 도 6B에 나타낸 바와 같이, TAZ를 안정적으로 과발현하는 TAZ/NIT-1 세포에서는 TAZ, insulin, pdx1, glut2, 및 mafA의 상대적 전사 수준이 유의적으로 증가됨을 확인하였다. 이와 반대로, 도 6C에 나타낸 바와 같이, TAZ가 넉다운된 TAZi/NIT-1 세포에서는 TAZ 및 상기 β-세포 마커의 발현이 감소됨을 확인하였다.As a result, as shown in FIG. 6B, it was confirmed that the relative transcription levels of TAZ, insulin, pdx1, glut2, and mafA were significantly increased in TAZ/NIT-1 cells stably overexpressing TAZ. On the contrary, as shown in FIG. 6C, it was confirmed that the expression of TAZ and the β-cell marker was decreased in TAZi/NIT-1 cells in which TAZ was knocked down.
상기 결과로부터, TAZ는 β-세포 마커의 발현을 직접적으로 조절하고, 특히, 전사 수준에서 조절함을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that TAZ directly regulates the expression of β-cell markers, especially at the transcription level.
3.2 TAZ에 의한 β-세포 마커 발현 조절의 메커니즘 확인3.2 Confirmation of the mechanism of β-cell marker expression regulation by TAZ
TAZ에 의한 β-세포 마커 발현 조절의 분자적 메커니즘, 특히 인슐린 유전자 프로모터에 존재하는 PDX1과의 관계를 확인하고자 하였다. 인슐린 유전자 프로모터는 PDX1-결합 요소를 포함하고 있으므로, HEK293T 세포에서 인슐린 프로모터 리포터 유전자를 이용하여 PDX1을 발현시키고, 단백질-단백질 상호작용 및 DNA 풀다운(pulldown) 분석을 수행하였다. 구체적으로, 인산칼슘 형질주입 방법(calcium phosphate transfection method)을 이용하여 HEK293T 세포에 Flag-PDX1 및/또는 Myc-tagged TAZ 및 이의 끝이 절단된 형태를 형질주입하였다. 총 세포 용해물을 수득하고, Flag-M2 아가로스 비드(Sigma-Aldrich)와 반응하고 침전물을 SDS-PAGE 및 면역블롯 방법으로 분석하였다. DNA 풀다운 분석의 경우, 세포 용해물은 비오틴화된 이중 가닥의 인슐린 프로모터 DNA를 이용하여 반응시킨 다음, 스트렙타비딘-아가로스 비드로 다시 1시간 동안 반응시켰다. 인슐린 프로모터 DNA는 하기 표 3에 기재된 프라이머 세트를 이용한 PCR에 의해 제조하였다. PCR 산물을 정제하여 단백질 용해물과 함께 반응시키고, 스트렙타비딘 아가로스 비드로 1시간 동안 추가 반응시킨 후, SDS-PAGE 및 면역 블록 분석을 수행하였다.The purpose of this study was to confirm the molecular mechanism of the regulation of β-cell marker expression by TAZ, particularly the relationship with PDX1 present in the insulin gene promoter. Since the insulin gene promoter contains the PDX1-binding element, PDX1 was expressed using the insulin promoter reporter gene in HEK293T cells, and protein-protein interaction and DNA pulldown analysis were performed. Specifically, using a calcium phosphate transfection method (calcium phosphate transfection method) HEK293T cells were transfected with Flag-PDX1 and/or Myc-tagged TAZ and its truncated form. Total cell lysate was obtained, reacted with Flag-M2 agarose beads (Sigma-Aldrich), and the precipitate was analyzed by SDS-PAGE and immunoblot method. In the case of DNA pull-down analysis, cell lysates were reacted using biotinylated double stranded insulin promoter DNA, and then reacted with streptavidin-agarose beads for 1 hour again. Insulin promoter DNA was prepared by PCR using the primer set shown in Table 3 below. The PCR product was purified and reacted with the protein lysate, and further reacted with streptavidin agarose beads for 1 hour, followed by SDS-PAGE and immunoblock analysis.
그 결과, 도 7A에 나타낸 바와 같이, PDX1 단독으로는 발현 수준과 관계 없이 인슐린 프로모터 활성에 영향을 미치지 않았으나, TAZ의 발현이 동반되는 경우, TAZ 용량-의존적인 방식으로 인슐린 프로모터 활성을 증가시킴을 확인하였다. 도 7B에 나타낸 바와 같이, TAZ 과발현에 의해, PDX1의 DNA-결합 활성이 유의적으로 증가됨을 확인하였다. As a result, as shown in Figure 7A, PDX1 alone did not affect the insulin promoter activity regardless of the expression level, but when the expression of TAZ was accompanied, it was found that the insulin promoter activity was increased in a TAZ dose-dependent manner. Confirmed. As shown in Fig. 7B, it was confirmed that the DNA-binding activity of PDX1 was significantly increased by TAZ overexpression.
DNA 풀다운 분석 결과, 도 7C에 나타낸 바와 같이, TAZ 전장(1-395) 또는 이의 C-말단 도메인(164-395)의 존재 여부에 따라 PDX1의 DNA-결합 활성이 증가하므로, TAZ의 C-말단 도메인은 PDX1-DNA 상호작용에 필수적임을 확인하였다. 보다 구체적으로, 도 7D에 나타낸 바와 같이, PDX1 및 전장 TAZ의 존재 하에 인슐린 프로모터 활성이 촉진되고, 특히, PDX1 및 TAZ의 C-말단 도메인(164-395)의 발현에 의해 인슐린 프로모터 활성이 유의적으로 증가할 수 있는 반면, TAZ의 N-말단 도메인(1-163)의 발현에 의해서는 인슐린 프로모터 활성을 증가시킬 수 없음을 확인하였다. 또한, 단백질-단백질 상호작용 분석 결과, 도 7E에 나타낸 바와 같이, TAZ는 PDX1과 물리적으로 연관됨을 확인하였다.As a result of DNA pull-down analysis, as shown in FIG. 7C, the DNA-binding activity of PDX1 increases depending on the presence or absence of the TAZ full length (1-395) or its C-terminal domain (164-395), so the C-terminal of TAZ It was confirmed that the domain is essential for the PDX1-DNA interaction. More specifically, as shown in Fig. 7D, insulin promoter activity is promoted in the presence of PDX1 and full-length TAZ, and in particular, insulin promoter activity is significant by expression of the C-terminal domain (164-395) of PDX1 and TAZ. On the other hand, it was confirmed that the insulin promoter activity could not be increased by the expression of the N-terminal domain (1-163) of TAZ. In addition, as a result of protein-protein interaction analysis, as shown in Fig. 7E, it was confirmed that TAZ is physically associated with PDX1.
상기 결과로부터, TAZ는 PDX1과 직접적으로 결합하여 PDX1 단백질의 DNA-결합을 촉진하여 PDX1의 전사 활성을 증가시킴으로써, 인슐린 발현에 영향을 미칠 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that TAZ directly binds to PDX1 and promotes DNA-binding of PDX1 protein to increase the transcriptional activity of PDX1, thereby affecting insulin expression.
3.3 PDX1 및 TAZ의 인슐린 발현에 대한 선택적인 조절 효과 확인3.3 Confirmation of selective modulating effect of PDX1 and TAZ on insulin expression
β-세포에서 인슐린 유전자 발현에 대한 내인성 PDX1 및 TAZ의 역할을 확인하기 위해, NIT-1 세포에 외인성 TAZ의 존재 또는 부재 하에 인슐린 프로모터 리포터 유전자를 형질주입하였다. 구체적으로, HEK293T 세포 또는 NIT-1 세포에 일시적으로 리포터 유전자(인슐린 프로모터-luc 또는 글루카곤-luc) 및 발현 벡터(PDX1, TAZ 전장, 및 끝이 절단된 형태)를 형질주입하였다. 형질주입 효능의 표준화를 위해 pCMVβ 벡터를 또한 형질주입하였다. 세포 용해물은 루시퍼라제 분석 키트(Promega, Madison, WI, USA) 및 β-갈락토시다아제 분석 키트(Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 분석하였다. 상대적 루시퍼라제 활성을 측정하여, 대조군 대비 배수 변화로 표현하였다.To confirm the role of endogenous PDX1 and TAZ on insulin gene expression in β-cells, NIT-1 cells were transfected with an insulin promoter reporter gene in the presence or absence of exogenous TAZ. Specifically, a reporter gene (insulin promoter-luc or glucagon-luc) and an expression vector (PDX1, TAZ full length, and truncated form) were transiently transfected into HEK293T cells or NIT-1 cells. The pCMVβ vector was also transfected for standardization of transfection efficacy. Cell lysates were analyzed using a luciferase assay kit (Promega, Madison, WI, USA) and a β-galactosidase assay kit (Thermo Fisher Scientific). Relative luciferase activity was measured and expressed as a fold change compared to the control group.
그 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 외인성 TAZ 발현만으로 인슐린 프로모터 활성을 상당히 증가시킬 수 있고, PDX1이 함께 발현되는 경우에는 더욱 인슐린 발현을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. 반면에, PDX1 및 TAZ는 글루카곤 프로모터 활성에 대해서 영향을 미치지 않음을 확인하였다. 또한, 도 8B에 나타낸 바와 같이, PDX1의 C-말단에 DNA-결합 도메인을 포함하므로, PDX1의 DNA-결합 도메인을 포함하는 단편(140-283)은 TAZ와 협력하여 인슐린 프로모터 활성을 증가시킬 수 있음을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 8A, it was confirmed that insulin promoter activity can be significantly increased only by exogenous TAZ expression, and when PDX1 is expressed together, insulin expression can be further increased. On the other hand, it was confirmed that PDX1 and TAZ did not affect the glucagon promoter activity. In addition, as shown in Fig. 8B, since the C-terminus of PDX1 contains a DNA-binding domain, fragments 140-283 containing the DNA-binding domain of PDX1 can increase insulin promoter activity in cooperation with TAZ. Confirmed that there is.
또한, TAZ가 비-β-세포에서도 β-세포 마커 발현을 충분히 유도할 수 있는지 시험하기 위해, 중간엽 줄기세포 C3H10T1/2 클론에서 TAZ를 안정적으로 발현하는 세포주를 제작하고, PDX1을 추가로 도입하고 분화배지에서 10일간 배양하였다. 그 결과, 도 8C에 나타낸 바와 같이, TAZ 과발현 세포주에서 PDX1 도입 유무에 상관없이 TAZ 전사발현이 동일함을 확인하였고, 대조군에서 PDX1 도입에 따라 PDX1 발현이 50배 증가한 것에 비해, TAZ 세포주에서는 PDX1 유전자 도입에 의해 세포 내 PDX1 전사 발현이 150배 증가함을 확인하였다.In addition, in order to test whether TAZ can sufficiently induce β-cell marker expression even in non-β-cells, a cell line stably expressing TAZ in the C3H10T1/2 clone of mesenchymal stem cells was prepared, and PDX1 was additionally introduced. And cultured for 10 days in differentiation medium. As a result, as shown in Fig. 8C, it was confirmed that TAZ transcriptional expression was the same regardless of the introduction of PDX1 in the TAZ overexpressing cell line, compared to a 50-fold increase in PDX1 expression according to the introduction of PDX1 in the control group, whereas the PDX1 gene in the TAZ cell line By introduction, it was confirmed that the intracellular PDX1 transcriptional expression was increased by 150-fold.
상기 결과로부터, TAZ는 인슐린 발현만을 특이적으로 조절하고, PDX1이 발현되지 않는 비-β-세포에서도 TAZ는 PDX1과의 상호작용을 통해 β-세포 마커 발현을 충분히 유도할 수 있음을 확인하였다.From the above results, it was confirmed that TAZ specifically regulates only insulin expression, and even in non-β-cells in which PDX1 is not expressed, TAZ can sufficiently induce β-cell marker expression through interaction with PDX1.
실시예 4. TAZ P-KO 마우스에서 고지방 식이에 의한 글루코스 내성 악화 및 인슐린 저항성 확인Example 4. Deterioration of glucose tolerance and confirmation of insulin resistance by high fat diet in TAZ P-KO mice
글루코스 항상성에 있어 TAZ의 중요성을 확인하기 위해, WT 및 TAZ P-KO 마우스에 최대 8주까지 고지방 식이(HFD: high-fat diet)를 공급하였다. In order to confirm the importance of TAZ in glucose homeostasis, WT and TAZ P-KO mice were fed a high-fat diet (HFD) for up to 8 weeks.
그 결과, 도 9A에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해 대조군 WT 마우스의 체중이 증가되었으나, TAZ P-KO 마우스에서는 대조군에 비해 보다 유의적으로 체중이 증가하였다. 또한, 도 9B에 나타낸 바와 같이, WT 마우스와 비교하여, TAZ P-KO 마우스의 단식 혈당 수치(fasting blood glucose level)는 현저히 더 높고, 고지방 식이에 의해 글루코스 내성이 악화됨을 확인하였다. 또한, 도 9C에 나타낸 바와 같이, 인슐린이 주입된 TAZ P-KO 마우스에서 지속적인 고혈당(hyperglycemia)을 나타내므로, TAZ P-KO 마우스에서 인슐린 저항성이 현저하게 증가됨을 확인하였다. 또한, 조직학적 분석 결과에 따르면, 도 9D에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이에 의해, TAZ P-KO 마우스의 지방 및 간 조직에 지방의 축적을 증가시키고, 비정상적인 이자섬을 형성함을 확인하였다. 구체적으로, TAZ P-KO 마우스의 이자섬은 불규칙적인 모양의 세포를 나타내며, 주변의 외분비 조직 및 세포 간에 분명한 경계가 없으며, 인슐린 및 글루카곤의 발현의 변화, 즉, β-세포 질량을 감소시키고, α-세포 질량을 증가시킴을 확인하였다. 또한, 도 9E에 나타낸 바와 같이, 고지방 식이가 공급된 TAZ P-KO 마우스는 혈청 내 인슐린 농도는 감소되고, 글루카곤의 농도는 증가됨을 확인하였다. 나아가, 도 9F에 나타낸 바와 같이, mafA , Nkx6 .1, glut2, 및 pdx1를 포함한 β-세포 마커의 상대적인 mRNA 발현 수준은 TAZ 결핍에 따라 유의적으로 감소됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 9A, the weight of the control WT mice was increased by the high fat diet, but the weight of the TAZ P-KO mice was significantly increased compared to the control group. In addition, as shown in FIG. 9B, compared to WT mice, the fasting blood glucose level of TAZ P-KO mice was significantly higher, and it was confirmed that glucose tolerance was deteriorated by a high fat diet. In addition, as shown in Fig. 9C, since insulin-injected TAZ P-KO mice showed persistent hyperglycemia, it was confirmed that insulin resistance was remarkably increased in TAZ P-KO mice. In addition, according to the histological analysis results, as shown in Fig. 9D, it was confirmed that the accumulation of fat in the fat and liver tissues of TAZ P-KO mice was increased and abnormal islets were formed by a high fat diet. Specifically, islets of TAZ P-KO mice represent irregularly shaped cells, there are no clear boundaries between exocrine tissues and cells around them, changes in the expression of insulin and glucagon, that is, decrease the β-cell mass, It was confirmed that the α-cell mass increased. In addition, as shown in Figure 9E, it was confirmed that the TAZ P-KO mice fed a high fat diet decreased the serum insulin concentration and increased the glucagon concentration. Furthermore, as shown in FIG. 9F, it was confirmed that the relative mRNA expression levels of β-cell markers including mafA , Nkx6 .1, glut2, and pdx1 were significantly reduced according to TAZ deficiency.
상기 결과로부터, TAZ는 이자섬의 인슐린 및 글루카곤 생산을 조절할 수 있으므로, 인슐린 저항성을 나타내는 상황에서도 혈당의 항상성 조절에 중요한 물질임을 확인하였다.From the above results, since TAZ can regulate the production of insulin and glucagon in islets, it was confirmed that it is an important substance for regulating the homeostasis of blood sugar even in the situation of insulin resistance.
따라서, TAZ 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 조절함으로써, 췌장조직 또는 세포에서의 인슐린 생성, 글루카곤 생성, 혈당 및 지방 축적 등을 조절할 수 있으므로, 대사성 질환, 특히 췌장 기능 장애로부터 기인한 대사성 질환의 예방 또는 치료할 수 있다.Therefore, by controlling the expression or activity of the TAZ gene or protein, it is possible to regulate insulin production, glucagon production, blood sugar and fat accumulation in pancreatic tissues or cells, and thus prevent metabolic diseases, especially metabolic diseases caused by pancreatic dysfunction. Or it can be cured.
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation <120> Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity <130> PN122017 <150> KR 10-2018-0045749 <151> 2018-04-19 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg forward <400> 1 ctggactaca tcttgagttg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg reverse <400> 2 tgggcataca ggaggcagga a 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP2 <400> 3 atgggacagt ccgggag 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP3 <400> 4 gtgcaagtca gaggagg 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-ks-Neo R <400> 5 ggagaacctg cgtgcaatcc a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 6 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 7 caatagtgat gacctggccg t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ forward <400> 8 gtcaccaaca gtagctcaga tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ reverse <400> 9 agtgattaca gccaggttag aaag 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward <400> 10 tcagagacca tcagcaagca g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin reverse <400> 11 gtctgaaggt ccccggggct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 forward <400> 12 agagcccaac cgcgtccagc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 reverse <400> 13 aacatcactg ccagctccac c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 forward <400> 14 ggctaatttc aggactggtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 reverse <400> 15 tttctttgcc ctgacttcct 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 forward <400> 16 ttggaggagc gcttctcc 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 reverse <400> 17 tctccagaat gtgccgctg 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter forward <400> 18 ccaagggaca tcaatattag g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter reverse <400> 19 ctggtcacta agggctgggg g 21 <110> Ewha University-Industry Collaboration Foundation <120> Use of TAZ to control blood sugar by controlling PDX1 activity <130> PN122017 <150> KR 10-2018-0045749 <151> 2018-04-19 <160> 19 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg forward <400> 1 ctggactaca tcttgagttg c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 tg reverse <400> 2 tgggcataca ggaggcagga a 21 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP2 <400> 3 atgggacagt ccgggag 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-GP3 <400> 4 gtgcaagtca gaggagg 17 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ-ks-Neo R <400> 5 ggagaacctg cgtgcaatcc a 21 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward <400> 6 agagggaaat cgtgcgtgac 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin reverse <400> 7 caatagtgat gacctggccg t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ forward <400> 8 gtcaccaaca gtagctcaga tc 22 <210> 9 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TAZ reverse <400> 9 agtgattaca gccaggttag aaag 24 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin forward <400> 10 tcagagacca tcagcaagca g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin reverse <400> 11 gtctgaaggt ccccggggct 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 forward <400> 12 agagcccaac cgcgtccagc 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pdx1 reverse <400> 13 aacatcactg ccagctccac c 21 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 forward <400> 14 ggctaatttc aggactggtt 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> glut2 reverse <400> 15 tttctttgcc ctgacttcct 20 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 forward <400> 16 ttggaggagc gcttctcc 18 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Maf2 reverse <400> 17 tctccagaat gtgccgctg 19 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter forward <400> 18 ccaagggaca tcaatattag g 21 <210> 19 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> insulin promoter reverse <400> 19 ctggtcacta agggctgggg g 21
Claims (13)
상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 발현을 조절하는 제제는 췌장 베타세포(β-세포)에서의 인슐린 발현 증가능을 갖는 것이며,
상기 TAZ 유전자의 발현을 조절하는 제제는 TAZ 인핸서(enhancer)에 결합하는 전사활성화인자(activator), TAZ 사일렌서(silencer)에 결합하는 억제자(repressor), TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
상기 TAZ 단백질의 발현을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 혈당 조절용 조성물.A composition for regulating blood sugar comprising an agent that regulates the expression of a gene or protein in the C-terminal domain of TAZ (Transcriptional coactivator with PDZ-binding motif),
The agent that regulates the expression of the TAZ gene or protein has the ability to increase insulin expression in pancreatic beta cells (β-cells),
Agents that regulate the expression of the TAZ gene include a transcriptional activator that binds to a TAZ enhancer, a repressor that binds to a TAZ silencer, and an antisense nucleotide that complementarily binds to TAZ mRNA, siRNA, shRNA, and any one selected from the group consisting of a combination thereof,
The agent for controlling the expression of the TAZ protein is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antigen-binding fragments, antibodies, natural products, and combinations thereof that specifically bind to the TAZ protein. What is, a composition for controlling blood sugar.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 활성을 조절하는 제제는 췌장 베타세포(β-세포)에서의 인슐린 발현 증가능을 갖는 것이며,
상기 TAZ 유전자의 활성을 조절하는 제제는 TAZ 인핸서(enhancer)에 결합하는 전사활성화인자(activator), TAZ 사일렌서(silencer)에 결합하는 억제자(repressor), TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
상기 TAZ 단백질의 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 약학적 조성물.As a pharmaceutical composition for preventing or treating metabolic diseases comprising an agent that modulates the activity of a gene or protein of the C-terminal domain of TAZ,
The agent that regulates the activity of the TAZ gene or protein has the ability to increase insulin expression in pancreatic beta cells (β-cells),
Agents that regulate the activity of the TAZ gene include a transcriptional activator that binds to a TAZ enhancer, a repressor that binds to a TAZ silencer, an antisense nucleotide that complementarily binds to TAZ mRNA, siRNA, shRNA, and any one selected from the group consisting of a combination thereof,
The agent that modulates the activity of the TAZ protein is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antigen-binding fragments, antibodies, natural products, and combinations thereof that specifically bind to the TAZ protein. That is, the pharmaceutical composition.
상기 TAZ 유전자 또는 단백질의 활성을 조절하는 제제는 췌장 베타세포(β-세포)에서의 인슐린 발현 증가능을 갖는 것이며,
상기 TAZ 유전자의 활성을 조절하는 제제는 TAZ 인핸서(enhancer)에 결합하는 전사활성화인자(activator), TAZ 사일렌서(silencer)에 결합하는 억제자(repressor), TAZ mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA, shRNA, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나이고,
상기 TAZ 단백질의 활성을 조절하는 제제는 TAZ 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항원-결합 단편, 항체, 천연물, 및 이의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 식품 조성물.As a food composition for preventing or improving metabolic diseases comprising an agent that modulates the activity of a gene or protein of the C-terminal domain of TAZ,
The agent that regulates the activity of the TAZ gene or protein has the ability to increase insulin expression in pancreatic beta cells (β-cells),
Agents that regulate the activity of the TAZ gene include a transcriptional activator that binds to a TAZ enhancer, a repressor that binds to a TAZ silencer, an antisense nucleotide that complementarily binds to TAZ mRNA, siRNA, shRNA, and any one selected from the group consisting of a combination thereof,
The agent that modulates the activity of the TAZ protein is any one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antigen-binding fragments, antibodies, natural products, and combinations thereof that specifically bind to the TAZ protein. Which, food composition.
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| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) |