KR20210095370A

KR20210095370A - 피페린을 포함하는 살충용 조성물 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20210095370A
Application number: KR1020200009138A
Authority: KR
Inventors: 이진태
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2020-01-23
Filing date: 2020-01-23
Publication date: 2021-08-02
Also published as: KR102364427B1

Abstract

본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하여 식물기생선충의 감염을 방지하는 살충용 조성물, 이를 이용한 식물기생선충의 살충 방법, 식물병의 방제 방법, 및 이를 포함하는 키트에 관한 것으로, 본 발명에 따른 조성물은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하여 식물기생선충인 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 유충 및 성충을 사멸할 뿐만 아니라, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 알의 분화를 억제하는 활성을 나타나기 때문에, 효과적인 식물기생선충에 대한 살충용 제제 및 식물병에 대한 방제 또는 치료용 제제로 제공될 수 있다.

Description

피페린을 포함하는 살충용 조성물 및 이의 용도{A pesticide composition comprising piperine, and uses thereof}

본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 포함하는 살충용 조성물 및 이를 이용한 식물병의 방제 방법에 관한 것이다.

소나무재선충병(pine wilt disease)은 아시아, 유럽 및 북아메리카의 여러 지역에서 산림 생태계에 심각한 피해를 일으키는 식물병으로, 국내에서는 1988년 부산에서 처음 보고되었으며, 소나무속(Pinus)뿐만 아니라, 전나무속(Abies), 가문비나무속(Picea), 잎갈나무속(Larix)의 일부 수종에서도 발병하는 것으로 알려졌다.

소나무재선충병은 식물기생선충인 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)이 식물에 감염하여 발병하며, 소나무재선충에 감염된 나무는 급속하게 증식된 소나무재선충에 의해 송진 분비가 멈추고 알코올, 테르펜과 같은 휘발성 물질이 분비되고 또한 수분과 양분의 흐름에 이상이 발생하여 죽게 되며, 한번 소나무재선충에 감염되면 치료가 거의 되지 않고 나무를 고사시킨다.

소나무재선충병을 일으키는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)은 분류학상으로 후생동물아계(Metazoa), 진정후생동물(Eumetazoa), 좌우대칭동물(Bilateria), 의체강동물(Pseudocoelomata), 선충문(Nematoda, Nemata)에 속하는 동물로서 실모양을 하고 있다. 길이는 1㎜도 안되지만, 번식력이 높아 한 쌍이 20일 만에 20만 마리로 늘어날 정도이다. 소나무재선충은 스스로 나무에 침입하거나 나무 사이를 이동할 수 없기 때문에, 매개충을 통해서 감염이 확산되며, 주 매개충으로는 솔수염하늘소(Monochamus alternatus) 또는 북방솔수염하늘소(M. saltuarius)가 알려져 있다.

소나무재선충병의 감염 경로는 매개충이 소나무재선충에 감염된 나무에 알을 낳게 되면, 매개충의 알이 부화하여 번데기가 될 때 주변으로 소나무재선충들이 모이게 되고, 매개충이 탈피할 때에 매개충의 체내로 소나무재선충이 침입하게 되며, 탈피한 매개충이 새로운 나무로 이동함으로써, 새로운 나무에 소나무재선충을 감염시키게 된다.

소나무재선충병을 방제하기 위해서는 나무 재료의 훈증 또는 줄기에 살충제를 주입하는 것과 같은 여러가지 접근법이 사용되었다. 가장 많이 사용되는 살충제는 에버멕틴(avermectin) 계열에 속하는 아바멕틴(abamectin)과 엠마멕틴 벤조에이트(emamectin benzoate)이다. 이러한 화학 약품이 포함된 살충제는 특정 소나무재선충병에 대해 매우 효과적이고, 환경적으로 안전한 것으로 간주되고 있으나, 가격이 비싸다는 단점이 있다. 또한, 콜로라도감자 딱정벌레, 배추좀나방 및 선충류 모양선충과 같은 몇몇 해충에 의해 입증된 바와 같이, 아바멕틴 및 에버멕틴와 같은 살충제를 반복적으로 사용하면 선별 압력이 유발되고 살충제에 대한 내성이 발생되어 결국에는 살충 또는 방제 효과가 약해지는 문제가 있다.

한편, 일부 연구에서는 파이토케미컬(phytochemical), 에센설 오일(essential oil), 및 천연 에스터(natural ester)와 같은 천연 물질이 선충에 살충 작용을 한다는 것이 보고되고 있으며, 플라보노이드(flavonoid), 폴리페놀(polyphenol)과 같은 파이토케미컬(phytochemical)은 식물에 무독하고 병원체로 작용하는 해충만 선별적으로 사멸시킨다는 점에서 주목되고 있다.

본 발명자들은 이와 같은 점을 감안하여 소나무재선충에 대한 살충 또는 방제 효과를 나타내는 새로운 천연 소재의 제제를 제공하기 위해, 파이토케미컬(phytochemical)의 일종인 피페린의 살충 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허공보 제10-2018-0116627호

Rajasekharan, et al. Scientific reports 7.1 (2017): 6803.

본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 포함하여 식물기생선충의 감염을 방지하는 살충용 조성물, 이를 이용한 식물기생선충의 살충 방법, 식물병의 방제 방법, 및 이를 포함하는 키트를 제공하는 것이다.

본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 살충용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 살충 방법을 제공한다.

또한, 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 식물병에 대한 방제 또는 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살충용 키트를 제공한다.

또한, 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충병(pine wilt disease)에 대한 방제 또는 치료용 키트를 제공한다.

본 발명에 따르면, 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 식물기생선충인 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 유충 및 성충을 사멸할 뿐만 아니라, 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus) 알의 분화를 억제하는 활성을 나타내는 것이 확인됨에 따라, 상기 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물은 효과적인 식물기생선충에 대한 살충용 제제 및 식물병에 대한 방제 또는 치료용 제제로 제공될 수 있다.

도 1은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살선충 효과를 다양한 농도의 피페린에서 확인한 그래프이다. 상기 그래프는 세 번 반복 실험의 ± 평균을 보여주며, **은 비처리 대조군 대비 P<0.01, ***은 비처리 대조군 대비 P<0.001을 나타낸다.
도 2는 피페린 또는 5-아이오도인돌(5-iodoindole)의 유무에 따른 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 시간당-사멸 정도를 분석한 그래프이다.
도 3은 피페린이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 미치는 영향을 확인한 도이다. 도 3a는 피페린이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 움직임(thrashing)에 미치는 영향을 평가한 그래프이고, 도 3b는 피페린이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 알 부화율(hatching rates)에 미치는 영향을 평가한 그래프이고, 도 3c는 피페린이 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 운동성(locomotor traits)에 미치는 영향을 확인한 사진이다. 상기 그래프는 세 번 반복 실험의 평균±표준편차로 나타나며, **은 비처리 대조군 대비 P<0.01, ***은 비처리 대조군 대비 P<0.001을 나타낸다.
도 4는 피페린의 식물 독성을 평가하기 위해 피페린 처리 농도(a: 비처리, b: 25 ㎍/mL, c: 50 ㎍/mL, d: 100 ㎍/mL)에 따라 당근(Daucus carota) 및 서양무아재비(Raphanus raphanistrum)의 씨앗 발아에 미치는 영향을 평가한 사진이다.
도 5는 in silico에서 피페린, 피페린 유도체 및 이버멕틴(ivermectin)이 GluCL 수용체(glutamate gated chloride ion channel receptor; 글루탐산 개폐성 염화 이온 채널 수용체)에 분자학적으로 상호작용하는 부위를 나타내는 그림이다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

상기 "피페린"은 후추나무인 후추(Piper nigrum L.), 필발(P. longum), P. officinarum, P. chusii의 과실에 함유되어 있는 화합물이며, 구조식은 C₁₇H₁₉NO₃이고, 하기 화학식 1로 표시된다.

[화학식 1]

피페린은 항산화, 항돌연변이, 항암작용 등의 생리활성이 나타난다고 보고되어 있으며, 레스베라트롤(resveratrol) 등의 약물의 생체이용률을 강화시키는 역할을 하는 것으로 알려져 있으나, 살충제 또는 방제제로 활용할 수 있는 살충 효과에 대해서는 잘 알려져 있지 않다.

피페린과 같은 알칼로이드는 한의학에서 약제로 사용되며, 강력한 방충제(repellent)로 고려되고 있으며, 종래에는 후추 또는 이의 활성 성분인 피페린이 학질모기(Anopheles mosquitoes)에 대한 살유충제 활성을 나타낸다고 보고되었으며, 일부 피페린 유도체는 몇몇 여러 곤충에 살충 효과가 나타난다고 보고되었다.

상기 "유도체"는 어떤 화합물의 일부를 화학적으로 변화시켜서 얻어지는 유사한 화합물이며, 피페린의 유도체는 피페린의 일부를 화학적으로 변화시킨 화합물로, 하기 화학식 2로 표시되는 피퍼롱구민(piperlongumine) 또는 하기 화학식 3으로 표시되는 피퍼로날(piperonal)와 같은 화합물일 수 있다.

[화학식 2]

[화학식 3]

상기 "살충용"은 사람, 가축, 농장물 및 산림목에 해가 되는 해충을 제거하는 효과를 나타내는 살충제로 사용할 수 있음을 의미하며, 여기서 해충은 일반적으로 인간의 생활에 직접 또는 간접적으로 해를 주는 곤충, 선충, 또는 벌레를 의미하며, 다양한 위생해충, 농업해충 또는 산림해충을 포함할 수 있으며, 구체적으로는 농작물 및 산림목에 다양한 식물병을 유발하는 식물기생선충일 수 있다. 따라서 상기 살충용 조성물은 식물기생선충의 감염을 방지하는 것을 특징으로 할 수 있다.

상기 "식물기생선충"은 식물의 생장점, 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 부분에 기생하며 구침으로 세포액을 영양분으로 섭취하는 선충으로서, 가해습성에 따라 외부에서 가해하는 외부기생성, 조직내부에 들어가서 기생하는 내부기생성, 머리부분을 조직 내에 삽입하여 영양분을 섭취하는 반내부기생성으로 구분할 수 있다. 식물기생선충은 낮은 밀도에서는 식물에 미치는 피해가 경미하지만, 높은 밀도로 감염된 식물은 치명적인 손상을 받거나 고사하게 된다.

상기 식물기생선충은 바람직하게 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus), 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 쑥선충(Subanguina moxae), 벼위축선충(Amplimerlinius clavicaudatus), 담배위축선충(Tylenchorhynchus claytoni), 사과위축선충(Tylenchorhynchus nudus), 차나무뿌리썩이선충(Pratylenchus loosi), 들깨뿌리썩이선충(Pratylenchoides clavicauda), 엉겅퀴뿌리썩이선충(Pratylenchoides utahensis), 명이나선선충(Rotylenchus arsenjevi), 박하나선선충(Helicotylenchus clarkei), 수양버들가는주름선충(Criconemoides komabaensis), 옥수수비늘주름선충(Ogma insulicum), 참나무큰비늘주름선충(Ogma querci), 소나무작은껍질선충(Hemicriconemoides varionodus), 느티나무껍질선충(Hemicycliophora epicharoides), 및 호두껍질선충(Hemicycliophora juglandis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으며, 보다 더 바람직하게 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 살충용 조성물은 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제, 증기화 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 및 수지 제형물로 이루어진 군에서 선택되는 제형으로 제조될 수 있다.

상기 살충용 조성물은 통상적으로 이용되는 방제제 또는 살균제에 함유되는 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 활성성분 이외에 부형제로 약제학적으로 허용 가능한 고체 담체, 액체 담체, 액체 희석제, 액화된 기체 희석제, 고체 희석제, 또는 기타 적당한 보조제, 예를 들면 유화제, 분산제 또는 기포제 등의 계면활성제를 추가로 포함할 수 있다. 활성성분과 상기 부형제를 혼합한 방제용 조성물을 농약분야에 공지된 다양한 제형으로 제제화시켜 사용할 수 있으며, 제제화를 위해서는 농약분야에서 통상적으로 사용되는 제제화 방법을 어느 것이나 사용할 수 있다.

상기 살충용 조성물은 상기 식물기생선충의 유충 또는 성충을 사멸시킬 수 있다. 상기 "유충"은 알에서 부화하여 성충이 되기 이전까지의 선충을 의미하며, 발생 단계에 따라 여러 유충 단계를 거쳐 알을 낳을 수 있는 상태가 된 선충을 "성충"이라고 한다.

상기 살충용 조성물에 함유된 피페린 또는 이의 유도체가 상기 식물기생선충의 GluCL 수용체(glutamate gated chloride ion channel receptor; 글루탐산 개폐성 염화 이온 채널 수용체)와 결합할 수 있다.

상기 살충용 조성물은 상기 식물기생선충의 알 부화를 방지할 수 있으며, 이에 따라 식물기생선충이 매개충에 감염되는 것을 방제할 수 있다.

구체적으로 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)의 경우, 알, 4단계의 유충기(J1~J4 단계), 4회의 탈피를 거쳐 암수 성충으로 성장하는 생활사를 가지며, 유충 단계에서 매개충의 체내에 침입하게 된다. 따라서 본 발명의 살충용 조성물은 수목에서 식물기생선충의 감염을 억제할 뿐만 아니라, 식물기생선충의 유충단계를 차단하기 때문에 식물기생선충에 의해 고사된 식물에서 매개충을 통한 식물기생선충의 확산을 방지하는 효과가 있다.

상기 살충용 조성물은 상기 피페린 또는 이의 유도체를 10 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL으로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 피페린 또는 이의 유도체를 30 ㎍/mL 내지 80 ㎍/mL로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 대상체는 식물기생선충이 감염되거나 감염되지 않은 식물로, 바람직하게는 소나무, 곰솔, 잣나무, 해안송, 유럽 곰솔 및 라타에타 소나무로 이루어진 군에서 하나 이상 선택될 수 있으며, 보다 더 바람직하게는 소나무일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

상기 살충 방법은 살충용 조성물을 상기 식물기생선충의 알, 이의 유충, 이의 성충, 또는 이의 서식처에 처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 식물병에 대한 방제 또는 치료 방법을 제공한다.

상기 "방제"는 본 발명에 따른 조성물을 대상체에 처리함으로써, 식물병의 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다. 상기 "치료"는 본 발명에 따른 조성물을 대상체에 처리함으로써, 식물병의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 말한다.

또한, 본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살충용 키트가 제공된다. 또한, 본 발명은 피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충병(pine wilt disease)에 대한 방제 또는 치료용 키트가 제공된다.

상기 "키트"는 예를 들어, 입자, 과립물 또는 펠렛의 형태로서 살충용 조성물을 독립적으로 형성하고, 동시에 사용 가능한 형태로 제조하는 것을 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

하기 실시예는 반복 수행되었으며, 결과는 평균 ± 표준편차로 나타나며, SPSS version 23 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) Dunnett 테스트에 따른 one-way ANOVA을 이용한 통계분석이 수행되었으며, p 값이 <0.05, <0.01, 또는 <0.0001 일때 유의한 것으로 간주하였다.

실시예 1. 피페린이 소나무재선충의 생존율에 미치는 영향 평가

천연 살충제로서 피페린이 소나무재선충에 대한 살충 효과를 평가하기 위해, 피페린 및 피페린 유도체의 처리에 따른 소나무재선충의 생존율을 확인하였다.

96-웰 플레이트에 살충 효과에 평가될 소나무재선충 유충을 플레이트 웰당 200마리씩 준비하고, 피페린, 피페린 유도체인 피퍼롱구민(piperlongumine) 또는 피퍼로날(piperonal)를 각각 0 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 30 ㎍/mL, 및 50 ㎍/mL 의 농도로 처리하여 22℃에서 24 시간 배양한 후, 자외선 LED 조명 및 iRiS™ 디지털 셀 이미징 시스템(iRiS™ Digital Cell Imaging System; Logos Bio Systems, Korea)이 장착된 광학 현미경으로 살아 있는 소나무재선충 유충의 수를 계수하여 비처리군 대비 백분율로 환산하였다(도 1).

도 1에 나타난 바와 같이, 피페린에서는 소나무재선충에 대한 살충 효과가 나타났으며, 피페린 30 ㎍/mL 처리군에서는 40%의 소나무재선충 유충이 사멸하였고, 피페린 50 ㎍/mL 처리군에서는 90%의 소나무재선충 유충이 사멸한 것으로 나타났으며, 이를 통해 피페린이 소나무재선충에 대한 우수한 살충 효과가 있다는 것을 확인하였다.

또한, 피페린 50 ㎍/mL 처리군에서는 모든 일정 유충(J2 단계)이 피페린을 처리한지 1 시간 이내에 소나무재선충 유충(J2 단계)의 활동성이 사라지고, 6 시간 이내에 완전히 사멸되는 것을 확인하였다(도 2).

도 2에 나타난 바와 같이, 양성 대조군인 5-아이오도인돌(5-iodoindole) 처리군에서는 소나무재선충의 일반적인 사멸 패턴을 나타낸 반면, 피페린 처리군에서는 컬링 반응(curling reaction) 및 집합 현상(aggregation)과 같은 독특한 살충 패턴이 나타났다. 종래의 연구들을 참고해 볼 때, 상기와 같은 소나무재선충에 대한 피페린의 독특한 살충 패턴은 선충이 단기간에 사멸하는 우수한 살충제로 활용될 수 있음을 시사한다.

실시예 2. 피페린이 소나무재선충의 알 부화율에 미치는 영향 평가

강력한 살충제 또는 방제제는 대상 해충을 사멸시킬 뿐만 아니라 해충의 알 부화를 억제하는 효과가 동반된다. 종래의 연구에서 5-아이오도인돌(5-iodoindole)과 같은 할로겐화 화합물에서 선충의 알 부화를 억제하고 살충 효과가 나타났다.

살충제 또는 방제제로서 피페린이 소나무재선충의 알 부화를 억제하는지 평가하기 위해, 소나무재선충 알에 피페린을 처리하여 알 부화율을 확인하였다.

96-웰 플레이트에 소나무재선충의 알을 알 침전법(egg settling method)을 사용하여 플레이트 웰에 밀집시킨 후, 멸균수로 반복 세척하여, 카운팅하였다. 피페린을 0 ㎍/mL, 30 ㎍/mL 및 50 ㎍/mL으로 처리하고, 소나무재선충의 알 부화를 촉진하기 위해서 처리된 플레이트를 22℃에서 24 시간 배양 후, 광학 현미경을 이용하여 부화한 유충 및 부화하지 못한 알의 수를 계수하였다. 모든 실험은 두 번 반복되었으며, 결과는 평균 ± 표준 오차로 제시되었고, 소나무재선충 알의 부화율(Percent hatch rates; HR)은 다음과 같이 계산되었다:

HR(%) = [유충 / (알 + 유충) Х 100].

도 3b에 나타난 바와 같이, 피페린을 30 ㎍/mL 또는 50 ㎍/mL로 24시간 처리된 소나무재선충 알은 부화하지 못하였다. 특히, 피페린 50 ㎍/mL 처리군에서는 J1 및 J2 난에서 배 발생이 손상되어 약 90% 알의 부화가 억제되었으며, 소나무재선충의 알 부화율은 피페린 처리 농도의 의존적으로 감소하는 경향으로 나타났다.

실시예 3. 피페린이 소나무재선충의 운동성에 미치는 영향 평가

액상 배지에서 선충의 운동성은 정형화된 유연한 동작으로 움직이며, 머리를 한 방향에서 다른 방향으로 이동시키는 것으로 정의되는 스래싱(thrashing) 행동은 선충의 유충에서 나타나는 운동성을 평가하는 특징이다.

피페린이 소나무재선충의 운동성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 피페린이 노출된 소나무재선충 유충에서 스래싱(thrashing) 행동 횟수 및 운동 형태를 평가하였다.

피페린이 포함된 액상 배지에 소나무재선충 유충을 24 시간 노출한 후, 20X 배율에서 iRiS™ 디지털 셀 이미징 시스템(iRiS™ Digital Cell Imaging System; Logos Bio Systems, Korea)이 장착된 광학 현미경으로 1분 동안 스래싱(thrashing) 행동을 계수하고, 20X 배율에서 운동 형태를 이미지로 모니터링하였다. 소나무재선충 유충이 비정상적으로 감겨있거나, 움직임을 보이지 않으면, 분석에 사용하지 않았다.

도 3a에 나타난 바와 같이, 소나무재선충 유충의 스래싱(thrashing) 행동 빈도는 피페린 처리에 따라 감소하였다. 피페린 50 ㎍/mL 처리군에서는 스래싱 빈도가 현저히 감소하였으며, 생존한 소나무재선충의 스래싱 행동이 느리게 나타났다. 도 3c는 피페린 50 ㎍/mL 처리군과 대조군에서 소나무재선충 유충의 스래싱(thrashing) 행동을 광학 현미경 20X 배율에서 20초 단위로 촬영한 사진이며, 피페린을 미처리한 대조군에서는 소나무재선충 유충이 유연하게 스래싱 행동을 하는 반면, 피페린 처리군에서는 소나무재선충 유충의 스래싱 행동이 억제된 것으로 나타났다.

상기 결과를 고려해볼 때 피페린은 전반적으로 소나무재선충의 운동 및 근육 기능을 억제하는 효과가 있음을 시사한다.

실시예 4. 피페린이 식물에 미치는 독성 평가

피페린이 식물에 독성을 나타내는지 확인하기 위해, 종자 발아 실험으로 피페린이 식물 종자 발아에 미치는 영향을 평가하였다.

당근(Daucus carota) 및 서양무아재비(Raphanus raphanistrum)의 씨앗을 멸균수에 하루 동안 담근 후, 1 mL의 100% 에탄올로 세척하고, 3% 치아 염소산 나트륨액(sodium hypochlorite solution)에 15분 동안 멸균하였다. 이후 씨앗을 멸균 처리하여 여러 번 세척하고, 0.7% 박토-아가와 0 ㎍/mL, 25 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 또는 100 ㎍/mL 농도의 피페린이 보충된 Murashige & Skoog 배지(0.86 g/L)에 멸균된 씨앗을 25℃에서 2일 동안 배양하여 발아 정도를 평가하였다.

도 4 에 나타난 바와 같이, 2일 이후에 피페린 처리군에서 당근(Daucus carota) 및 서양무아재비(Raphanus raphanistrum)의 씨앗이 모두 발아되었으며, 피페린이 식물에 독성이 없는 것으로 확인되었다.

실시예 5. 분자학적으로 피페린이 선충에 미치는 영향( in silico )

선충에 대한 살충제인 이버멕틴(ivermectin)은 선충의 신경신호전달에 관여하는 GluCL 수용체(glutamate gated chloride ion channel receptor; 글루탐산 개폐성 염화 이온 채널 수용체)에 작용하여 신경 마비를 유도함으로써 살충 효과를 나타낸다. 피페린이 이버멕틴과 유사한 메커니즘으로 살충효과가 나타나는지 여부를 확인하기 위해서, 분자 도킹 기술을 이용하여 피페린과 GluCL 수용체의 상호작용을 분자학적으로 분석하였다.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegan)의 GluCL 수용체를 사용하여 피페린과 결합 형태를 분석하였고, GluCL 수용체 활성 부위를 식별하기 위해서, 이버멕틴 또는 피페린의 유도체인 피퍼롱구민의 GluCL 수용체 결합 형태와 비교하였다.

GluCL 수용체는 Schrodinger 소프트웨어 패키지의 단백질 준비 마법사(the Protein Preparation Wizard of Schrodinger software package)로 준비하고, 리간드는 LigPrep 소프트웨어를 사용하여 제조하였다. 도킹은 초정밀(XP) 유연성 모드에서 Schrodinger 소프트웨어 11.4 (Schrodinger Software Solutions, USA)를 사용하여 수행되었다.

이버멕틴은 GluCL 수용체의 Chain D/E 인터페이스의 막 관통 도메인 즉, 활성 부위에 결합하는 것으로 나타났으며, 이버멕틴을 GluCL 수용체-리간드 복합체에서 제거하면, 18Å x 18Å x 18Å 입방 크기를 갖는 그리드가 형성되었다. 도 5에 나타난 바와 같이, 이버멕틴은 GluCL 수용체의 219번째 Glu에 상호작용 하였다. GluCL 수용체의 219번째 Glu는 리간드와 상호작용하여 GluCL 수용체의 활성화에 주요 부위이다.

도 5를 참조하면, 피페린도 이버멕티과 유사하게 GluCL 수용체의 219번째 Glu과 상호작용하는 것으로 나타났다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 살충용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 살충용 조성물은 식물기생선충의 감염을 방지하는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus), 고구마뿌리혹선충(Meloidogyne incognita), 당근뿌리혹선충(Meloidogyne hapla), 땅콩뿌리혹선충(Meloidogyne arenaria), 쑥선충(Subanguina moxae), 벼위축선충(Amplimerlinius clavicaudatus), 담배위축선충(Tylenchorhynchus claytoni), 사과위축선충(Tylenchorhynchus nudus), 차나무뿌리썩이선충(Pratylenchus loosi), 들깨뿌리썩이선충(Pratylenchoides clavicauda), 엉겅퀴뿌리썩이선충(Pratylenchoides utahensis), 명이나선선충(Rotylenchus arsenjevi), 박하나선선충(Helicotylenchus clarkei), 수양버들가는주름선충(Criconemoides komabaensis), 옥수수비늘주름선충(Ogma insulicum), 참나무큰비늘주름선충(Ogma querci), 소나무작은껍질선충(Hemicriconemoides varionodus), 느티나무껍질선충(Hemicycliophora epicharoides), 및 호두껍질선충(Hemicycliophora juglandis)로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제2항에 있어서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)인 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 살충용 조성물은 오일 스프레이, 유화 가능한 농축물, 습윤성 분말, 유동물, 과립, 더스트, 에어로졸, 훈연제, 증기화 가능한 제형물, 스모킹 제형물, 독성 유인물, 진드기방지용 시이트 및 수지 제형물로 이루어진 군에서 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 살충용 조성물은 상기 식물기생선충의 유충 또는 성충을 사멸시키는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제6항에 있어서, 상기 살충용 조성물에 함유된 피페린 또는 이의 유도체가 상기 식물기생선충의 GluCL 수용체(glutamate gated chloride ion channel receptor; 글루탐산 개폐성 염화 이온 채널 수용체)와 결합하는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제3항에 있어서, 상기 살충용 조성물은 상기 식물기생선충의 알 부화를 방지하는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 살충용 조성물은 상기 피페린 또는 이의 유도체를 10 ㎍/mL 내지 100 ㎍/mL으로 포함하는 것을 특징으로 하는 살충용 조성물.
피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 살충 방법.
제10항에 있어서, 상기 대상체는 식물기생선충이 감염된 식물인 살충 방법.
제11항에 있어서, 상기 식물은 소나무, 곰솔, 잣나무, 해안송, 유럽 곰솔 및 라타에타 소나무로 이루어진 군에서 하나 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 살충 방법.
제11항에 있어서, 상기 살충 방법은 살충용 조성물을 상기 식물기생선충의 알, 이의 유충, 이의 성충, 또는 이의 서식처에 처리하는 단계를 더 포함하는 살충 방법.
제11항에 있어서, 상기 식물기생선충은 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)인 살충 방법.
피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에 처리하는 단계를 포함하는 식물병에 대한 방제 또는 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 대상체는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus 에 감염된 식물인 것을 특징으로 하는 식물병에 대한 방제 또는 치료 방법.
제15항에 있어서, 상기 식물병은 소나무재선충병(pine wilt disease)인 것을 특징으로 하는 식물병에 대한 방제 또는 치료 방법.
피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충(Bursaphelenchus xylophilus)에 대한 살충용 키트.
피페린 또는 이의 유도체를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 소나무재선충병(pine wilt disease)에 대한 방제 또는 치료용 키트.