KR20210083966A - 형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법 - Google Patents

형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 용해 버퍼(lysis buffer), 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질을 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하기 위한 키트 및 상기 키트를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균의 검출 방법에 관한 것이다.

Description

형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법{Kit for detecting carbapenemase-producing enterobacteriaceae comprising fluorescent probe and method for detecting carbapenemase-producing enterobacteriaceae using the same}
본 발명은 형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법에 관한 것이다.
카바페넴(Carbapenem)은 항균 영역이 넓은 항생제로, 광범위 베타-락탐 분해효소(extended spectrum beta-lactamase)를 생성하는 그람음성 세균 감염을 치료하는데 사용되는 항생제이다. 최근 항생제 내성이 증가하면서 카바페넴 항균제 사용이 증가함에 따라 카바페넴에 내성을 갖는 장내세균속균종(carbapenem-resistant enterobacteriaceae, CRE)이 등장하였고, 전세계적으로 빠른 속도로 증가하는 양상을 보이고 있다. 특히, CRE에 의한 감염증은 항생제 내성이 없는 장내세균속 감염증과 비교하여 사망률이 높은 것으로 알려져 있다.
장내세균속균종은 카바페넴 분해효소를 직접 가지고 있거나, 어타페넴(ertapenem), 이미페넴(imipenem), 메로페넴(meropenem) 및 도리페넴(doripenem) 중 어느 한가지 이상의 항균제에 내성을 보이는 경우로 정의한다. 장내세균속균종은 카바페넴의 내성 기전에 따라 카바페넴 분해효소 생성 유전자를 가지고 있어 카바페넴 분해효소를 형성하는 경우(carbapenemase-producing enterobacteriaceae, CPE)와 카바페넴 분해효소 생성 없이 여러가지 내성 기전에 복합되어 카파베넴에 내성(Non-CPE)을 보이는 경우로 분류할 수 있다. 카바페넴을 직접 분해하는 CPE 내성기준은 Ambler class에 따라서 A, B 및 D 타입으로 구분할 수 있다. 카바페넴 분해효소를 생성하지 않고 카바페넴에 내성을 보이는 장내세균속(Non-CPE)의 경우 광범위 베타락탐 분해효소, 포린(porin) 변화를 통한 막 투과성 변화, 유출 펌프(efflux pump) 활성화 등 여러 내성기전의 복합으로 카바페넴에 대해 내성을 보인다.
카바페넴 분해효소 생성균인 CPE는 항생제 감수성 시험만으로는 Non-CPE와 감별할 수 없어 카바페넴 분해효소 선별시험 및 확정시험이 필요하다. 항생제 감수성에서 카바페넴에 내성을 보이는 경우 CRE로 분류한다. 이후에 CPE 여부를 확인하기 위해서 modified-Hodge 시험(MHT) 및 카바페넴아제 억제시험(CIT)을 통한 표현형 시험 또는 유전자 증폭을 통한 유전형 시험(PCR 혹은 DNA 염기서열 분석)을 시행한다. 그러나, 표현형 시험은 비교적 확인이 빠르나 판단이 주관적일 수 있고 내성 유전자 종류를 확인할 수 없으며 위양성(false positive)의 가능성을 배제하기 어려운 단점이 있다. 또한 유전형 시험은 비용이 고가이고 검출할 수 있는 유전자의 종류가 한정되어 있는 단점이 있다. 따라서, 보다 신속하고 정확하게 다양한 카바페넴 분해효소 생성균들을 검출할 수 있는 검사에 대한 요구가 증가되고 있다.
한편, 한국등록특허 제1317263호에는 "리얼타임 PCR을 이용한 카바페넴 내성 장내균 검사 방법 및 키트"가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1995622호에는 "ADK 단백질을 유효성분으로 포함하는 카바페넴 내성 그람음성균에 대한 항균용 조성물"이 개시되어 있으나, 본 발명의 형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 카바페넴 분해효소(carbapenemase)를 생성하는 내성 미생물을 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 키트 및 방법을 제공하기 위해, 카바페넴 골격(backbone)에 벤질 알코올 링커 및 움벨리페론(umbelliferone) 형광체가 결합된 신규한 형광 프로브(fluorescent probe)를 기질로 포함하는 키트를 제조한 후, 제조된 키트를 사용하여 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균(CPE) 65종 및 카바페넴 분해효소 유전자를 갖지 않은 장내세균 156종에 대한 분석을 수행한 결과, 본 발명의 키트가 카바페넴 분해효소 생성 장내세균에 대한 민감도 및 특이도가 우수함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 용해 버퍼(lysis buffer), 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질을 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼로 전처리하는 단계; 상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및 상기 수득한 상층액을 반응 버퍼 및 형광 프로브 기질과 혼합하여 반응시킨 후 형광값을 측정하는 단계;를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 카바페넴 형광 프로브 기질을 포함하는 키트는 IMP(active on imipenem), VIM(verona integron-encoded metallo-β-lactamasea), NDM(new delhi metallo-β-lactamase), KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase) 등과 같은 다양한 카바페넴 분해효소를 생산하는 카바페넴 내성 장내세균(CRE)들을 간단하고 신속·정확하게 검출할 수 있으므로, 카바페넴 내성 장내세균의 감염 여부를 조기에 진단하여 CRE 감염 질환의 초기에 신속한 대응·관리에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae) 검출용 키트 제품의 구성 요소를 보여주는 사진이다.
도 2는 본 발명의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트를 이용하여 카바페넴 내성 장내세균의 감염 여부 진단을 위한 ROC(receiver operating characteristic curve) 곡선 분석을 수행한 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 용해 버퍼(lysis buffer), 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질을 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트에서, 상기 용해 버퍼는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균으로부터 단백질(효소)을 추출하기 위함으로 바람직하게는, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 프로테아제 억제제(Protease inhibitor), CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate), 라이소자임(lysozyme), DNase(deoxyribonuclease) 및 PBS(phosphate buffered saline)로 이루어진 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.01~0.6mM의 EDTA, 3~5%(w/v)의 프로테아제 억제제, 0.5~2%(w/v)의 CHAPS, 0.05~1mg/㎖의 라이소자임, 4~6U/㎖의 DNaseⅠ 및 9~11mM의 PBS로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.012mM의 EDTA, 4%(w/v)의 프로테아제 억제제, 1%(w/v)의 CHAPS, 0.1mg/㎖의 라이소자임, 5U/㎖의 DNaseⅠ 및 10mM의 PBS로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 반응 버퍼는 본 발명에 따른 형광 프로브 기질과 카바페넴 분해효소가 반응할 수 있는 환경을 제공하는 효소 반응 용액으로 바람직하게는, NaCl(sodium chloride), Na2HPO4(sodium phosphate dibasic), KCl(potassium chloride) 및 KH2PO4(potassium phosphate monobasic)로 이루어진 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 0.1~0.2M의 NaCl, 1~3mM의 Na2HPO4, 2~4mM의 KCl 및 10~12mM의 KH2PO4로 이루어진 것일 수 있으며, 가장 바람직하게는 0.14M의 NaCl, 1.7mM의 Na2HPO4, 2.7mM의 KCl 및 10.6mM의 KH2PO4로 이루어진 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 키트에서, 상기 형광 프로브 기질은 카바페넴 골격에 벤질 알코올(benzyl alcohol) 링커와 움벨리페론(umbelliferone) 형광체가 결합된 화합물로, 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid 화합물이다.
Figure pat00001
상기 카바페넴 골격, 링커 및 형광체가 순차적으로 결합된 형광 프로브 기질은 카바페넴 분해효소, 예컨대 KPC(Klebsiella pneumoniae carbapenemase), GES(guiana extended-spectrum β-lactamase), IMP(active on imipenem), VIM(verona integron-encoded metallo-β-lactamasea), NDM(new delhi metallo-β-lactamase) 또는 OXA(oxacillinase)에 의해 카바페넴 골격과 형광체를 연결하는 링커 부분이 절담됨으로써 형광체가 발광하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한,
카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼(lysis buffer)로 전처리하는 단계;
상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
상기 수득한 상층액을 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질과 혼합하여 반응시킨 후 형광값을 측정하는 단계;를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 용해 버퍼 및 반응 버퍼는 상기 전술한 것과 같다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 형광 프로브 기질은 바람직하게는 하기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산[(4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid] 화합물이다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란, 세포, 조직, 혈액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포, 파라핀조직, 소변, 타액, 땀, 세포내 체액 및 세균 발현계 등을 들 수 있고, 혈액은 전혈, 혈장, 혈청이나 소정의 처리(예를 들면 응고 방지)가 이루어진 혈액, 혈장, 혈청 등이 이에 해당될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 키트와 반응시켜 카바페넴 분해효소 생성 장내세균의 감염 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료는 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 배지에 접종하여 시료 내 미생물을 증균한 후 배지에서 증식된 미생물 일부를 채취한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하는 방법은 구체적으로는,
카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료 0.5~12㎕를 용해 버퍼 140~160㎕에 넣고 0.5~2분 동안 볼텍싱한 후 20~40분 동안 실온에서 반응시켜 전처리하는 단계;
상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 9,000~11,000rpm 조건으로 4~6분간 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
상기 수득한 상층액 25~35㎕를 반응 버퍼 90~110㎕ 및 형광 프로브 기질 11~14㎕와 혼합하여 반응시킨 후 형광값을 측정하는 단계;를 포함할 수 있고,
더욱 구체적으로는,
카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 배지에 접종하여 시료 내 미생물을 증균하고 원심분리한 후 침전된 검체 1~10㎕를 용해 버퍼 150㎕에 넣고 1분 동안 볼텍싱한 후 30분 동안 실온에서 반응시켜 전처리하는 단계;
상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 10,000rpm 조건으로 5분간 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
상기 수득한 상층액 30㎕를 반응 버퍼 100㎕ 및 형광 프로브 기질 13㎕와 혼합하여 반응시킨 후 여기 파장 260nm, 방출 파장 465nm로 형광값을 측정하는 단계;를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 원심분리하여 수득한 상층액에는 카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료에 포함되어 있던 카바페넴 분해효소가 포함되어 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 형광값은 여기(excitation) 파장 250~270nm, 방출(emission) 파장 455~475nm로 측정하였고, 바람직하게는 여기 파장을 260nm로, 방출 파장을 465nm로, Gain 값을 50으로 설정한 후 형광값을 5분 간격으로 총 50분 동안 측정한 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 방법에서 CRE에 대한 양성 또는 음성의 판정은, 50분에서 측정된 형광값과 0분에서 측정된 형광값의 차이가 컷 오프(cut-off) 값보다 클 경우 양성 반응, 작을 경우 음성 반응으로 판정할 수 있으며, 컷 오프 값은 3,188로 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선을 통해 결정되었다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(CPE) 검출용 키트
본 발명의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트의 구성 요소는 표 1 및 도 1과 같으며, 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트의 제작을 위해 용해 버퍼, 반응 버퍼 및 형광 프로브 기질을 제조하였다.
우선, 용해 버퍼는 총 1L 부피 기준으로 2.5mM의 EDTA(SAMCHUN, Cat No. E0060) 4.8㎖, 프로테아제 억제제(1 tablet/10㎖; Roche, Cat No. 4693132001) 200㎖, 1X CHAPS(Sigma, Cat No. 19899) 10㎖, 50mg/㎖의 라이소자임(Sigma, Cat No. L-6876) 2㎖, 2,500U/㎖의 DNaseⅠ(Thermo, Cat No. 90083) 2㎖, 30mM의 PBS(Sigma, Cat No. P3813) 333㎖ 및 증류수 448.2㎖을 혼합한 후 필터링하여(pore size 0.22㎛) 제조하였다(표 2).
또한, 반응 버퍼는 염화나트륨(sodium chloride, NaCl; DAEJUNG, Cat No. 7548-4100) 8g, 인산이나트륨(sodium phosphate dibasic, Na2HPO4; DAEJUNG, Cat No. 7613-4400) 0.24g, 염화칼륨(potassium chloride, KCl; YAKURI, Cat No. 28514) 0.2g 및 제일인산칼륨(potassium phosphate monobasic, KH2PO4; JUNSEI, Cat No. 84185A1250) 1.44g을 혼합하고 총 용량이 1L가 되도록 증류수를 첨가한 후 필터링하고(pore size 0.22㎛), 121℃에서 15분 동안 고압멸균하여 제조하였다(표 3).
또한, 형광 프로브 기질은 상기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid 화합물을 한양대학교 민선준 교수로부터 제공받아 사용하였다(표 4).
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
Figure pat00005
실시예 1. 본 발명의 키트를 사용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출능 분석
1-1. 종래의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 사용
기존에 카바페넴 분해효소를 생성하는 장내세균의 검출에 사용되어온 키트(bioMerieux, Inc., 프랑스)를 이용하여 하기 표 5의 CPE를 대상으로 실험을 수행하였으며, 키트의 지침서에 따라 실험을 수행하여 밝은 주황색(light orange)까지 양성 반응으로 판단한 결과(2019 CLSI GUIDE LINE(29th)참고), 하기 표 6에 나타난 바와 같이 민감도(sensitivity)는 67.7%이고, 특이도(specificity)는 100%임을 확인하였다.
Figure pat00006
Figure pat00007
1-2. 본 발명의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 사용
본 발명의 키트를 사용하여 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하였다. 구체적으로, 임상검체를 채취하여 BAP(Blood Agar Plate) 배지에서 배양하고 원심분리한 후 검체 채취용 도구인 면봉이나 루프를 사용하여 검체 약 1㎕를 채취하여 용해 버퍼 150㎕이 들어있는 튜브에 풀어준 후 1분간 볼텍싱하고 30분 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝나고 10,000rpm 조건으로 5분간 원심분리하여 잔여물을 침전시키고 카바페넴 분해효소가 존재하는 상층액을 수득하였다. 96웰 플레이트에 상기 수득한 상층액 30㎕, 반응 버퍼 100㎕ 및 형광 프로브 기질 13㎕를 넣고 형광 측정기(Infinite F200 Pro, Tecan coup Ltd.)를 이용하여 여기 파장 260nm, 방출 파장 465nm로 형광값을 측정하였다. 형광값이 컷 오프 값(cut-off) 3,188 보다 크면 양성 반응, 컷 오프 값 3,188 보다 작으면 음성 반응으로 판정하였고, 컷 오프 값(3,188)은 ROC(receiver-operating characteristic) 곡선을 분석하여 확인하였다(도 2).
본 발명의 키트를 사용하여 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균(CPE) 65종 및 카바페넴 분해효소 유전자를 갖지 않은 장내세균 156종에 대한 분석을 수행한 결과, 하기 표 7에 나타난 바와 같이 민감도(sensitivity)는 75.4%이고, 특이도(specificity)는 99.3%임을 확인하였다.
Figure pat00008
1-3. 재현성 분석
본 발명의 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트의 재현성을 분석하기 위해, 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균 10종과 카바페넴 분해효소 유전자를 갖지 않는 장내세균 10종을 대상으로 총 3배치 수행하였다. 상기 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균 10개는 Class A 3개(KPC 2개, GES 1개), Class B 4개(IMP 1개, VIM 2개, NDM 1개), Class D 2개(OXA), 2개 이상의 카바페넴 분해효소 유전자를 갖는 장내세균 1개로 구성되어 있으며, 이 중 5개(IMP, VIM, KPC, NDM, OXA 각 1개씩)는 기존 검사에서 양성으로 판별되었던 균주이고, 나머지 5개(VIM, KPC, GES, OXA, 2개 이상의 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균, 각 1개씩)는 음성으로 판별되었던 균주이다. 또한, 상기 카바페넴 분해효소 유전자를 갖지 않는 장내세균 10개는 카바페넴 내성 장내세균(CRE) 3개, 광범위 베타-락탐 생성 장내세균(ESBL) 4개, 모든 항생제에 감수성인 장내세균(Non-ESBL) 3개로 구성되어 있으며, 이 중 ESBL 1개는 기존 검사에서 음성으로 판별되었던 균주이다.
우선, 배치간 재현성을 분석한 결과 배치 1과 배치 2, 및 배치 2와 배치 3에서의 재현성은 모두 95%이고, 배치 1과 배치 3에서의 재현성은 100%이었다. 배치 1에서 양성으로 판별되었던 KPC 1개 균주가 배치 2에서는 음성으로 판별되어 95%의 배치간 재현성을 보였고, 배치 2에서 음성으로 판별되었던 KPC 1개 균주가 배치 3에서는 양성으로 판별되어 95%의 배치간 재현성을 보였다.
또한, 배치내 재현성을 분석한 결과, 배치 1은 95%, 배치 2 및 배치 3은 100%의 재현성을 보였다. 배치 1의 경우 기존에 양성으로 판별되었던 ESBL 1개가 음성으로 판별되어 95%의 배치내 재현성을 보였다.
게다가, 사용자간 재현성을 분석한 결과, 배치 1은 100%, 배치 2 및 배치 3은 모두 95%의 재현성을 보였다. 배치 2의 경우 사용자 A에서 음성으로 판별되었던 KPC 1개 균주가 사용자 B에서는 양성으로 판별되어 95%의 사용자간 재현성을 보였으며, 배치 3의 경우 사용자 A에서 양성으로 판별되었던 2개 이상의 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균 1개가 사용자 B에서는 음성으로 판별되어 95%의 사용자간 재현성을 보였다.
진단의 관점에서 민감도는 질병이 있는 사람을 얼마나 잘 찾아 내는가에 대한 값이고 특이도는 정상을 얼마나 잘 찾아 내는가에 대한 값으로, 검사의 신뢰도를 평가하는 중요한 항목이다.
종래 키트는 카바페넴 유전자를 가진 장내세균 검출에 대한 민감도와 특이도를 단순히 색 비교를 통해 확인한 것이라면, 본 발명의 키트는 ROS 곡선에 대한 데이터를 기반으로 카바페넴 내성 카바페넴 분해효소 유전자를 가진 장내세균의 검출에 대한 민감도 및 특이도를 보다 정확하게 확인할 수 있고 재현성도 우수하므로, 종래의 방법에 비해 항생제 내성 장내세균의 감염 여부에 대한 진단이 신속 정확하게 이루어질 수 있을 것으로 사료되었다.

Claims (7)

  1. 용해 버퍼(lysis buffer), 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질을 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하기 위한 키트.
  2. 제1항에 있어서, 상기 용해 버퍼는 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 프로테아제 억제제(Protease inhibitor), CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate), 라이소자임(lysozyme), DNase(deoxyribonuclease) 및 PBS(phosphate buffered saline)로 이루어진 것을 특징으로 하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하기 위한 키트.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반응 버퍼는 NaCl(sodium chloride), Na2HPO4(sodium phosphate dibasic), KCl(potassium chloride) 및 KH2PO4(potassium phosphate monobasic)로 이루어진 것을 특징으로 하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하기 위한 키트.
  4. 제1항에 있어서, 상기 형광 프로브 기질은 하기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산[(4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid] 화합물인 것을 특징으로 하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하기 위한 키트.
    [화학식 1]
    Figure pat00009
  5. 제1항에 있어서, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 프로테아제 억제제(Protease inhibitor), CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate), 라이소자임(lysozyme), DNase(deoxyribonuclease) 및 PBS(phosphate buffered saline)로 이루어진 용해 버퍼; NaCl(sodium chloride), Na2HPO4(sodium phosphate dibasic), KCl(potassium chloride) 및 KH2PO4(potassium phosphate monobasic)로 이루어진 반응 버퍼; 및 하기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산[(4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid] 화합물을 형광 프로브 기질로 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균을 검출하기 위한 키트.
    [화학식 1]
    Figure pat00010
  6. 카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 용해 버퍼(lysis buffer)로 전처리하는 단계;
    상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
    상기 수득한 상층액을 반응 버퍼(reaction buffer) 및 형광 프로브(fluorescent probe) 기질과 혼합하여 반응시킨 후 형광값을 측정하는 단계;를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    카바페넴 내성균 감염 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid), 프로테아제 억제제(Protease inhibitor), CHAPS(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate hydrate), 라이소자임(lysozyme), DNase(deoxyribonuclease) 및 PBS(phosphate buffered saline)로 이루어진 용해 버퍼(lysis buffer)로 전처리하는 단계;
    상기 용해 버퍼로 전처리된 시료를 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계; 및
    상기 수득한 상층액을 NaCl(sodium chloride), Na2HPO4(sodium phosphate dibasic), KCl(potassium chloride) 및 KH2PO4(potassium phosphate monobasic)로 이루어진 반응 버퍼(reaction buffer) 및 하기 화학식 1로 표시되는 (4S,5R,6S)-6-((R)-1-하이드록시에틸-4-메틸-7-옥소-3-((4-(((2-옥소-2H-크로멘-7-일)옥시)메틸)페녹시)메틸)-1-아자바이사이클로[3.2.0]헵트-2-엔-2-카복실산[(4S,5R,6S)-6-((R)-1-Hydroxyethyl)-4-methyl-7-oxo-3-((4-(((2-oxo-2H-chromen-7-yl)oxy)methyl)phenoxy)methyl)-1-azabicyclo[3.2.0]hept-2-ene-2-carboxylic acid] 화합물인 형광 프로브(fluorescent probe) 기질과 혼합하여 반응시킨 후, 여기(excitation) 파장 250~270 nm 및 방출(emission) 파장 455~475 nm로 형광값을 측정하는 단계;를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균(carbapenemase-producing enterobacteriaceae)을 검출하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure pat00011
KR1020190176796A 2019-12-27 2019-12-27 형광 프로브를 포함하는 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출용 키트 및 이를 이용한 카바페넴 분해효소 생성 장내세균 검출 방법 KR102365852B1 (ko)

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