KR20210081334A - 님나무 (azadirachta indica) 조성물 및 암 치료 방법 - Google Patents

님나무 (azadirachta indica) 조성물 및 암 치료 방법 Download PDF

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KR20210081334A
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기리쉬 수드하카르 소만
마카엘 와르고비치
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
기리쉬 수드하카르 소만
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Abstract

본 개시는 한 개체에서 암을 치료하는 조성물 및 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 치료를 필요로 하는 환자에게 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 투여하는 단계를 포함한다. 본 개시는 또한 구강암 및 결장암의 치료를 위해 아자디라크타 인디카의 CO2 추출물 및 이것의 약초 조성물을 제조하는 공정에 관한 것이다. 상기 방법은 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 SCO2 추출물 및 구강에 사용하기 위한 그것의 약초 조성물을 제조하는 공정을 포함한다.

Description

님나무 (AZADIRACHTA INDICA) 조성물 및 암 치료 방법
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 8월 31일에 출원한 미국 가출원 제62/725,484호와, 2019년 9월 6일에 출원한 인도 특허출원 제201821021206호의 출원 일자의 이익을 주장한다. 앞서 출원된 특허 출원의 내용은 이로써 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
분야
본 개시는 님나무 (AZADIRACHTA INDICA, 아자디라크타 인디카)의 CO2 추출물의 제조 공정 및 구강암 및 결장암의 치료를 위한 그것의 약초 조성물에 관한 것이다. 좀 더 특별하게는, 본 개시는 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 SCO2 추출물의 제조 공정 및 구강에 사용하기 위한 동일한 것의 약초 조성물에 관한 것이다.
전세계적으로 담뱃잎 사용, 알코올 소비 및 HPV 노출의 증가가 지속되면서, 구강암 발병의 위험이 전세계적으로 증가하고 있다. 종래의 치료는 조기 질환 환자의 경우 5년 생존율을 개선해왔지만, 말기 질환 환자는 5년 생존율이 무려 34%로 낮은 수치를 나타냈고, 이 수치는 거의 40년 동안 변함이 없었다.
대장암(CRC)은 미국의 남녀를 통틀어 세 번째로 많이 진단받는 암이자 암 질환 중 사망 원인 2위를 차지하는 암이다. 항염증 차단이 대장암 예방의 유망한 방법으로 입증된 바 있다. 하지만, 비스테로이드성 항염증제(NSAID)는 CRC 발병 위험을 억제하는 데 효과적이긴 하지만, 암 예방에 장기적으로 사용할 경우 독성이 지나치게 된다.
구강암은 인도에서 상위 3가지 유형의 암에 속한다. 치료되지 않는 입 속의 혹 또는 상처로 보이는데, 여기에는 입술, 혀, 뺨, 구강저, 경구개 및 연구개, 혀, 부비강 및 인두의 암이 포함된다. 구강암의 가장 일반적인 유형은 편평세포암종이다.
통계에 따르면, 2012년 인도에서 구강암의 발병은 남성의 경우 53842건이고 여성의 경우 23161건이었다. 인도에서는 유병률이 높고(인구 100,000명당 20명) 발병율이 2030년까지 상승할 것으로 예상된다. 국제 암 연구 기구는 인도의 암 발병률이 2012년 1백만 건에서 2035년 1.7백만 건 이상에 이를 가능성이 있다고 예측해왔다. 이것은 같은 기간에 암으로 인한 사망률이 1백만에서 1~2백만으로 또한 증가할 것임을 보여준다. 구강암의 발병률은 남성에게서 더 높다. 또한 나이가 들면서 구강암의 발병률이 증가하는데, 구강암 대부분이 50세에서 70세 사이에 발생한다.
전세계적으로, 2012년 데이터에 따르면, 입술암, 구강암, 인두암이 모든 암 발생의 약 3.8%를, 암으로 인한 총 사망의 3.6%를 차지하였다. GLOBOCAN 2012에 따르면, 입술 및 구강암이 아시아에서 가장 흔한 암 12위이고, 남성의 암에서 8위를 차지했다. 아시아와 아메리카에서, 발병률은 각각 3.8% 및 1.7%이고, 사망률은 각각 2.2% 및 1%이다.
무연 담배이든 흡연이든 담뱃잎 소비 및 알코올 소비와 같은 다양한 병인학적 요인들이 인도에서의 구강암의 높은 발병률에 기여를 해왔다. 또한 구강암의 양성 가족력, HPV와 같은 바이러스 감염, 구강 위생 불량, 영양결핍 및 구강-치아 요인들이 기타 기여 요인들이다.
구강암은 목 안의 통증, 입 안에 오래 지속되는 궤양, 치아 흔들림, 목소리 변화 및 씹고 삼키기의 어려움과 같은 증상에 의해 감지될 수 있다.
대장암(CRC)(결장암 또는 장암으로도 알려짐)은 암으로 인한 사망 및 질병의 주요 요인 중 하나이다. 전세계적으로, 남성에게서 가장 일반적인 암 3위(암 사례의 10.0%)이고 여성에게서 가장 일반적인 암 2위(암 사례의 9.4%)이며, 대장암 사례의 60%가 선진국에서 발생하였다. 매년, 전세계적으로 5년 유병률이 3.2백만 건인 대장암의 신규 사례가 1.3백만 건이다. 인도의 경우, 대장암의 발병율이 미미하게 증가해왔지만, 현재 대장암은 인도 남성 및 여성에서 암으로 인한 사망의 가장 일반적인 원인 5위를 차지 하고 있다. 인도에서, 남성의 결장암 및 직장암의 연 발병률은 100000명당 각각 4.4명 및 4.1명이고, 여성의 결장암의 연 발병률은 100000명당 3.9명이다. 따라서, 남성의 경우, 결장암이 암 중 8위를, 직장암이 9위를 차지한 반면, 여성의 경우에는 직장암이 상위 10개 암 중에 포함되지 않았고 결장암이 9위를 차지하였다.
대장암의 위험 요인에는 연령(대장암의 위험은 나이가 들면서 증가한다), 성별(여성보다 남성이 25% 더 위험하다), 개인의 대장 용종 병력, 염증성 대장질환(궤양성 대장염 또는 크론병), 대장암의 가족력 및 생활습관 관련 요인들, 예컨대 비만, 알코올 소비 및 흡연이 포함된다. 몸의 움직임이 활발하지 않은 것 또한 대장암 발명의 위험을 증가시킨다.
대장암의 징후는 배변 습관의 변화, 배변 후 잔변감, 혈변, 점액변, 적게 먹은 후 헛배 부름, 복부팽만(distension), 복통, 체중감소, 변비, 설사, 빈변감, 피로, 구토, 복부 팽만(bloating) 및 통증, 철 결핍 및 장의 덩어리 등이다.
수술, 화학요법 및 방사선요법이 여전히 암의 주요한 기존 요법이다. 하지만, 환자의 50% 이상이 이러한 치료에서 미미한 효과를 보거나 또는 어떤 혜택도 얻지 못하고, 이들 대부분이 상기 요법의 독성 이상 반응으로 고통받고 있다. 대안적인 약품(예컨대 약초로 만든 생약)이 암 환자 사이에서 점점 더 인기를 얻고 있고, 그것의 사용 보급율이 무려 80%에 달한다.
아자디라크타 인디카라고도 알려진 님(Neem)은 인도를 비롯한 여러 아열대 및 열대 국가에서 흔히 발견된다. 님 식물에서 추출된 성분들이 수세기 동안 암을 비롯해 수많은 질병의 치료를 위한 전통적인 약에 사용되어 왔다. 여러 연구에서 복합적인 세포 과정의 조절을 통해 님의 항암 효과가 발생됨을 시사하는 설득력 있는 증거들이 밝혀졌다. 아자디라크타 인디카에서 단리된 활성 분자인 님볼라이드는 의약품의 여러 특성들을 보임이 보고된 바 있다. 여러 유형의 암에 대해 강한 항암 활성을 나타내 왔고, 여러 체내 및 체외 연구에서 항암 활성의 잠재력을 입증해 왔다. 님볼라이드는 반응성 산소종(ROS)을 생성함으로써, 세포자멸사를 유도하고, 전이 및 혈관신생의 억제를 유도하여 작용한다. 또 다른 성분인 님빈은, 아자디라크타 인디카에서 단리된 트리테르페노이드로, 항염증성, 해열성, 항히스타민 및 항균성 특성을 갖는다.
WO2015035199A1은 치료차원의 유효 용량의 약제학적 제형을 환자에게 투여함으로써 하나 이상의 암의 증상을 완화하거나 또는 암 세포의 수를 감소시켜 하나 이상의 암 증상을 치료하는 방법을 제공하는데, 상기 약제학적 제형은 님볼라이드; 님반디올; 2', 3'디하이드로 님볼라이드; 28 디하이드로 님볼라이드 또는 이들의 조합물을 포함한다. 상기 추출물은 생쥐에게 체중 1 kg 당 200 mg의 용량으로 경구투여된 후, 혈장 및 종양 조직에서 검출되었다. 표적 암은 전립선암, 결장암, 성상세포종 및 육종이다. 본 발명은 항종양 활성을 부여하는 초임계 님 잎 추출물에서 유래된 생활성 화합물을 제공한다. 본 특허는 암 세포의 수의 감소를 주장하지만, 암 세포의 감소가 암의 증상에 미치는 영향은 알려지지 않았고/결정되지 않았으며/입증되지 않았다. 상기 추출은 632.76 kg/cm2 의 압력 하에 50℃의 온도에서 초임계 CO2 를 사용하여 수행되었고, 건조 아이스/아세톤 수조를 사용하여 -49℃에서 포집되었다. 이와 같은 추출 온도 및 분리 온도의 큰 차이는 상기 식물구성체에 예측하지 못한 해로운 변화를 초래할 수도 있다. 또한 상기 분리 온도는 산업적 생산에 상용할 만큼 실현 가능하거나 확대축소 가능하지 않다.
CN101972246B는 유효량의 아자디라크타 인디카 트리테르페노이드 1 또는 2 또는 3(아래 참조) 및 약제학적으로 허용가능한 운반체를 함유하는 항종양 약을 제공한다. 이것은 또한 상기 화합물 1 내지 3을 함유하는 약의 제조 방법, 및 종양 질환의 예방 및 치료를 위한 약의 제조에 상기 화합물의 적용을 제공한다.　이것은 백혈병, 간암, 폐암 및 유방암을 표적으로 하기 위해 제공된다. 상기 추출 공정은 우선 약초에 메탄올 추출을 실시하고, 이어서 상기 희석된 메탄올 추출물에 석유 에테르 추출 및 에틸 아세테이트 추출을 실시함으로써 수행되었다. 일일 복용량은, 경구, 비경구, 척추강내 또는 뇌실내(intraventricular) 투여로, 체중 1 kg당 0.01~10 mg으로 다양하다.
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CN103864876A는 님 남무 열매에서 단리된 새로운 트리테르페노이드 실로카르푸스 그라나툼 및 악성 종양, 특히 폐암 및 유방암을 위한 약의 제조에서의 이것의 용도에 관한 것이다. 상기 특허출원에서 언급된 바와 같이, 약물학적 검사는 상기 화합물이 A-549 인간 폐 선암종 세포주에 억제 활성을 가짐을 보여주었다. 님 나무 잎의 메탄올 추출물이 사용되었다. 또한 항종양 활성을 확인하기 위해 인간 유방암 세포 A-549에 대해 검사하였다.
US5370873A는 배양된 내피 세포에 암 세포와 말라리아에 감염된 적혈구의 부착을 억제하는 아자디라크타 인디카 잎의 정제 추출물에 관한 것이다. 상기 정제 추출물은 또한 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 황열병 바이러스 및 모래파리 열(Sicilian) 바이러스의 체외 필수 발달을 억제하고, 인간 말라리아 원충의 유성(생식세포) 및 무성(분열체) 형태 모두의 체외 발달을 억제한다. 이것은 또한 속슬렛 추출에 의해, 다양한 용매, 예컨대 알코올, 아세톤, 피리딘, 물 등에 의해, 이어서 수동 침전 및 HPLC 분별(fractionation)에 의해, 님 잎에서 정제 추출물을 추출하는 공정에 관한 것이다. 언급된 대로 작동하는 메커니즘은 님 잎 추출물의 항점착 특성으로 인해, 상기 추출물이 암 세포 및 감염성 세포를 무력화시키고 비증식성으로 만드는 것이다.
JP2009274956A는 님 씨앗 추출물에 활성 성분인 에폭시아자디라디온, 게두닌, 17-에피-17-하이드록시아자디라디온 및 7-O-벤조일님보시놀을 함유하여 백혈병, 림프종, 피부암, 폐암, 결장암, 위암, 유방암, 전립선암, 상피 세포 암, 예컨대 갑상선암, 골 육종 등을 표적으로 하는 조성물을 제공한다. 상기 추출물은 n-헥산에 이어 메탄올을 사용하여, 그리고 컬럼 크로마토그래피를 통한 분류를 사용하여 획득되었다. 세포독성 활성은 상기 님 씨앗 추출물 중 화합물의 세포자멸사 유도 활성을 근거로 한다. 또한 이것은 항종양 활성을 갖는다. 상기 검사대상 화합물이 1 × 10-4, 1 × 10-5, 1 × 10-6 M의 농도로 DMSO에 첨가되었고, 그것의 활성이 검사되었다. 하지만, 효과가 용량 의존적인지 여부는 확인할 필요가 있다.
WO2007137389A1은 인간 면역결핍 바이러스를 앓는 환자의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 경구투여될 수 있다. 상기 조성물은 아자디라크타 인디카에서 획득된 성분의 유효량; 및 단백질 보충제를 포함한다. 상기 조성물은 분말 님을 물에 풀어 수성 추출물을 생성함으로써 생산된다.
종합해보면, 종래의 용매 추출 공정에서, 항상 분리 온도가 추출 온도보다 높음이 관찰되었다. 더 높은 온도에서 약초의 추출은 약초의 치료적 가치를 제공하는 온도에 민감한 식물구성체의 분자 및 화학 구조를 파괴하거나 또는 변형시킨다. 또한, 인간에게 해로운 발암물질로 여겨지는 용매, 예컨대 헥산, 메탄올 및 아세톤을 사용하여 상기 약초가 추출됨이 당해기술에서 관찰되었다. 따라서, 추출 과정 중에 열에 민감한 식물구성체를 보호하고, 그럼으로써 암, 특히 구강암 및 결장암의 치료를 위해 의도된 약초 제형의 치료적 가치를 보호하기 위해, 아자디라크타 인디카의 CO2 추출물의 대안적인 그러나 강력한 제조공정이 요구된다.
따라서, 본 발명의 목표는 열에 민감한 식물구성체를 손상시키지 않으면서 아자디라크타 인디카 잎 추출물을 획득하기 위한 강력한 공정을 개발하는 것이다.
개요
본원에 개체의 암을 치료하는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 (a) 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계; 및 (b) 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 혈청 중 최소한 하나의 염증성 사이토카인을 감소시키는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 염증을 감소시키는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 과증식성 장애를 치료하는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 NFkB와 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 최소한 하나의 세포에서 NFkB와 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 최소한 하나의 세포를 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 한 개체에서 표피성장인자 수용체 신호전달 활성을 변형하는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본원에 세포의 세포자멸사를 유도하는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 개시되는데, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다.
본 개시는 초임계 이산화탄소(SCO2)를 사용하여 아자디라크타 인디카 잎 추출물을 제조하는 공정을 제공한다. 상기 제조된 추출물은 캡슐(식물성 또는 경질 젤라틴 캡슐, 액체 식물성 캡슐, 또는 연질 젤라틴 캡슐)로 경구 투여되거나 또는 액체 구강세정제 또는 설하 경구용 제형으로 사용될 수 있다.
바람직한 일 양태에서, 본 개시는 이로운 식물구성체를 함유한 아자디라크타 인디카 잎 추출물을 제조하는 공정을 제공한다. 상기 공정은 하기 단계를 수반한다:
a) 깨끗하게 성숙된 아자디라크타 인디카 잎을 건조하여 수분함량을 12% 미만으로 감소시킨 후, 상기 건조된 잎을 분말화하여 입도가 0.42mm 미만인 분말을 획득하는 단계;
b) 80Bar(80 kg/cm2)에서 350Bar(350 kg/cm2) 사이로 변하는 압력 하에 31℃ 내지 45℃의 온도 범위에서; 원료 1 kg당 CO2 10 내지 40 kg의 유량으로, 상기 분말에 초임계 CO2 추출을 실시하는 단계.
c) 40Bar에서 65 Bar 사이로 변하는 압력과 10℃에서 30℃ 사이의 온도를 유지하면서, CO2 추출물을 분리하여 추출물 A를 획득하는 단계;
d) 80 Bar에서 350 Bar 사이의 범위의 압력 하에 31℃에서 45℃ 사이의 온도 범위에서, 추출물 'A'를 분리한 후 남은 잔류 분말에 CO2 와 에틸 알코올의 혼합물을 사용하여 추가 추출을 실시하는 단계;
e) 상기 용매 압력을 40 Bar에서 65 Bar 사이로 감소시키고, 온도를 10℃에서 30℃ 사이로 감소시킴으로써, 추출물이 첨가된 에틸 알코올을 수집하고, 이어서 에탄올의 진공 증류를 실시하여, 추출물 B를 획득하는 단계;
f) 추출물 A와 추출물 B를 조합하여, 아자디라크타 인디카 잎의 CO2 추출물이라 불리는 추출물 C를 획득하는 단계.
또 다른 양태에서, 상기 추출물 A가 극한의 초고속으로 마이크로젯 또는 노즐에 통과됨으로써 미세한 나노입자 추출물이 획득된다. 활성 식물구성체의 지속적이고 향상된 전달을 위해 현재 나노 크기의 전달 기술이 사용 중이다. 상기 추출물 A에 초고속 마이크로젯을 실시함으로써, 입도가 10~100 nm인 최소 10%의 추출물 A가 획득된다. 따라서, 이와 같은 공정에 의해 획득된 추출물은 '초임계 님 잎 추출물-나노 10%'로 간주된다.
아자디라크타 인디카 잎이 특정 온도 및 압력 조건 하에서 초임계 CO2 추출(SCO2)을 사용하여 추출됨으로써, 상기 추출물이 해로운 추출 용매를 함유하지 않고 이로운 성분들을 보유한다.
따라서, 혼입 에탄올의 존재 또는 부재 하에 본 개시에서 사용되는 초임계 CO2 추출(SCO2)은 어떤 해로운 용매 잔류도 남기지 않는다. 상기 추출 온도는 31℃에서 45℃로 유지되어, 온도에 민감한 성분들의 보유가 보장된다.
추출(혼입 에탄올의 존재 또는 부재 하의 SCO2 추출)을 위한, 본원에 개시된 방법에서는 분리 온도가 추출 온도보다 훨씬 낮다. 추출을 위한 전형적인 온도는 31 내지 45℃인 반면, 본 공정에서의 분리 온도는 약 10℃ 내지 30℃이다. 따라서, 식물구성체의 온전함(integrity)이 온도에 민감한 성분들의 보유와 함께 유지된다. 또한 상기 추출 압력은 종래 기술(WO'199)에 사용된 압력보다 훨씬 낮은데, 이것이 민감한 식물구성체의 보유를 추가로 보장하고, 따라서 본 발명의 SCO2 추출물은 WO'199의 개시와는 다른 활성 구성성분들을 포함한다.
추가 구현예에서, 그렇게 획득된 CO2 추출물은 C18 컬럼(4.6 mm x 250 mm x 5 μm)을 사용하는 HPLC에 의해 표준화되었고, 결과는 UV 검출을 사용하여 215 nm에서 모니터링되었다. 상기 시료는 메탄올에서 제조되었고, 상기 이동상은 메탄올과 물이었다. 1 ml/분의 유속에서 구배 프로그램 시퀀스(gradient program sequence)가 사용되었다.
이에 따라, 또 다른 양태에서, 본 개시는 님볼라이드를 최소 3 mg/gm의 양으로; 님빈을 최소 130 μg/ gm의 양으로, 그리고 살리닌을 최소 200 μg/gm의 양으로 포함하여, 약초 제형으로 투여될 때 추출물의 치료 효능을 보장하는 표준화된 SCO2 추출물을 제공한다. 상기 CO2 표준화된 추출물은 또한 이와 같은 활성에 기여할 수 있는 다양한 기타 활성 식물구성체, 예컨대 데스아세틸님빈, 아자디라디온, 아즈디론, 님볼린 및 님비넨을 함유한다. 하지만, 이들이 미량으로 존재하기 때문에 정량화되지 않는다.
앞서 언급된 바와 같이 표준화된 추출물 중 님볼라이드, 님빈 및 날리닌(nalinin)의 최소한의 농도를 기반으로, 상기 표준화된 초임계 님 추출물(SCNE)을 사용하여, 인간 구강암 및 결장암 세포주에 체외 실험이 수행되었다. 이와 같은 실험은 상기 표준화된 CO2 추출물이 항증식성 활성을 가지며, 암 성장을 억제하고, 전염증성 경로 및 NF-kB 억제를 통해 세포자멸사를 유도함을 입증하였다.
이에 따라, 또 다른 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 약제학적 운반체/부형제와 함께, 구강암 및 결장암에 대해 우수한 항종양 활성을 발휘하는, 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 SCO2 추출물의 유효량을 포함하는, 경구 적용을 위한 약초 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물 및 방법의 기타 특징 및 이점은 하기 설명, 도면 및 청구항에서 묘사된다.
도 1a~f는 SCNE와 님볼라이드가 구강 편평 암 세포 성장을 억제함을 보여준다. 도 1a는 8시간 또는 24시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 SCNE 치료(0~400 μg/ml)를 보여준다. 도 1b는 8시간 또는 24시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 SCNE 치료(0~100μM)를 보여준다. 도 1c는 48시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 님볼라이드 치료(0~400 μg/ml)를 보여준다. 도 1d는 48시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 님볼라이드 치료(0~100 μM)를 보여준다. 도 1e는 8시간 또는 24시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 셀레콕시브 치료(0~200 μM)를 보여준다. 도 1f는 48시간 동안의 SCC4, HSC3, Cal27 OSCC 세포주에 대한 셀레콕시브 치료(0~200 μM)를 보여준다.
도 2는 SCNE와 님볼라이드가 염증 매개체를 하향조절함을 보여준다. SCC4, Cal27 및 HSC3 세포가 24시간 동안 SCNE 20 μg, 60 μg 또는 님볼라이드 10 μM, 50 μM로 치료되었다. COX1, COX2, NFkBp65, STAT3, pSTAT3, EGFR, pEGFR, pERK1/2, AKT 및 Pakt에 대해 세포액 단백질 분획이 분석되었다. pERK1/2, STAT3, pSTAT3 및 NFkBp65에 대해 핵 단백질 분획이 분석되었다. GapDH와 Topo-IIα가 적재 통제군(loading controls)으로 사용되었다
도 3a~c는 SCNE와 님볼라이드가 체외 세포 이동을 억제함을 보여준다. 도 3a는 스크래치(Scratch) 검정을 사용하여, SCNE 60μg/ml와 님볼라이드 50mM가 SCC4(120시간), Cal27(72시간) 및 HSC3(8시간)에서 세포 이동을 억제함을 보여준다. 초록선은 최초 스크래치 앞면을 나타내고, 노란색 선은 각각의 치료 시간 후 스크래치 앞면이다. 도 3b는 SCNE 및 님볼라이드 치료로 SCC4, Cal27 및 HSC3에서 평균 상처 너비가 유의미하게 감소됨(n=6, *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.001)을 보여준다. 도 3c는 SCC4, Cal27 및 HSC3로 처리된 세포에서 MMP2 및 MMP9 활성을 보여주는 젤라티나아제 지모그람을 묘사한다.
도 4a~b는 SCNE와 님볼라이드가 생쥐에서 OSCC-유래 종양 성장을 억제함을 보여준다. 도 4a는 SCC4(30일 치료 - 종양 부피가 81.12% 축소), HSC3(25일 치료 - 종양 부피가 48.81% 축소) 및 Cal27(35일 치료 - 종양 부피가 49.00% 축소) 세포 성장이 식이 1kg당 SCNE 200mg를 먹인 생쥐에서 유의미하게 억제되었음을 보여준다(*p<0.005, **p<0.001). 도 4b는 님볼라이드 치료(20 mg/kg IP)가 25일 후 생쥐의 HSC3 종양 부피를 유의미하게(*p<0.05) 축소(66%)시켰음을 보여준다.
도 5a~c는 SCNE가 OSCC의 4NQO-1 생쥐 모형에서 종양 성장을 억제함을 보여준다. 도 6a는 CBA 생쥐가 12주 동안의 연구에서 200mg/kg SCNE 식이에서 체중 증가에 어떤 차이도 보이지 않았음을 보여준다. 도 5b는 상기 SCNE 식이가 SCNE가 없는 식이와 비교하여, 혀를 5배 축소(**p<0.01)시키고, 설 암종을 축소시켰음을 보여준다. 도 5c는 상기 SCNE 식이가 생쥐의 혀에서 증식 표지자인 PCNA, Ki-67, c-Met의 수치를 감소시켰음을 보여준다.
도 6은 SCNE를 먹인 생쥐에서 SCC4, Cal27 및 HSC3 이종이식편의 생쥐 순환 사이토카인 수치에 미친 영향을 보여준다.
도 7은 OSCC의 4NQO-1 발암물질-유도 모형에서 생쥐 순환 사이토카인 수치에 미친 영향을 보여준다.
도 8은 OSCC의 이종이식되고 발암물질로 유도된 생쥐 모형에서 SCNE가 혈청수치 염증성 사이토카인을 감소시킴을 보여준다.
도 9a~d는 SCNE가 CRC 세포의 생존능을 감소시켰음을 보여준다. HCT116, HT29 및 IEC6 세포가 48시간 및 72시간 동안 서로 다른 농도의 SCNE(a, b) 및 님볼라이드(c, d)로 치료되었고, MTT 검정에 의해 상기 세포 생존능이 측정되었다. 세 가지 독립적인 실험의 데이터가 평균±SD으로 표현되었다. *P<0.05는 비히클 대조군과 대조적으로 유의미한 차이를 나타낸다.
도 10a~b는 SCNE가 HCT116 및 HT29 세포의 세포자멸사를 유도하였음을 보여준다. CRC 세포가 48시간 동안 SCNE(40 및 75 μg/ml)와 님볼라이드(5와 10 μM)로 치료되었다. SCNE(a)와 님볼라이드(b)로 치료된 HCT116 및 HT29 세포에서 세포자멸사 조절 단백질의 발현이 표준물질로 사용된 GAPDH와 Bax, Bcl-2 및 사이클린 D1에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정되었다. 각 띠가 세 가지 실험을 나타낸다.
도 11a~b는 SCNE가 HT29 결장암 세포의 이동에 관여함을 보여준다. HT29 결장암 세포의 이동에서 SCNE(75 μg/ml)와 님볼라이드(10 μM)의 역할을 연구하기 위해, 이동 스크래치 검정이 활용되었다. 도 11a는 SCNE(75 μg/ml)와 님볼라이드(10 μM)가 HT29 세포의 이동을 억제하는 데 효과적이었음을 보여준다. 도 11b는 님볼라이드의 치료로 이동의 억제가 유사하게 효과적이었음을 보여준다.
도 12a~e는 결장암 세포 HCT116 및 HT29 세포에서 SCNE와 님볼라이드에 의한 전사 인자 p65 핵 위치, STAT3 인산화 및 전염증성 표지자의 억제를 보여준다. 도 12a는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 SCNE와 님볼라이드로 치료되고, p65 핵 수송에 대한 면역형광 염색에 의해 검사되었음을 보여준다. SCNE와 님볼라이드가 p65 단백질의 세포핵으로의 전좌를 차단하였다. 도 12b는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 SCNE(40과 75 μg/ml)로 치료되었고, pSTAT3, p65, IKKβ 및 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블롯 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. 도 12c는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 님볼라이드(5와 10 μM)로 치료되었고, pSTAT3, p65, IKKβ 및 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. 상기 데이터는 3가지 독립적인 실험에서 획득되었다. 도 12d는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 SCNE(40과 75 μg/ml)로 치료되었고, COX1, COX2, IL-6 및 TNF-α와 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. 도 12e는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 님볼라이드(5와 10 μM)로 치료되었고, COX1, COX2, IL-6, TNF-α 및 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. GAPDH가 세포 내부 단백질 표지자로 사용되었다. 상기 데이터는 3가지 독립적인 실험에서 획득되었다.
도 13a~b는 결장암 세포에서 SCNE와 님볼라이드에 의한 침습의 억제를 보여준다. 도 13a는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 SCNE(40과 75 μg/ml)로 치료되었고, MMP2, MMP9 및 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. 젤라틴 지모그람 검정이 SCNE 치료 시 MMP2의 단백질분해 활성의 농도-의존적 억제를 보여주었다. 도 13b는 HCT116과 HT29 세포가 48시간 동안 님볼라이드(5와 10 μM)로 치료되었고, MMP2, MMP9 및 GAPDH 단백질의 발현 수치가 웨스턴 블랏 분석에 의해 검출되었음을 보여준다. 젤라틴 지모그람 검정이 님볼라이드 치료 시 MMP2의 단백질분해 활성의 농도-의존적 억제를 보여주었다.
도 14는 정상적인 IEC6 세포에서 SCNE가 세포 생존능에 미치는 용량 및 시간-의존적 효과를 보여준다.
도 15는 HCT 116 세포에서 SCNE가 세포 생존능에 미치는 용량 및 시간 의존적 효과를 보여준다.
도 16은 HT 29 세포에서 SCNE가 세포 생존능에 미치는 용량 및 시간 의존적 효과를 보여준다.
도 17은 HCT 116 세포에서 님볼라이드가 세포 생존능에 미치는 용량 및 시간 의존적 효과를 보여준다.
도 18은 HT 29 세포에서 님볼라이드가 세포 생존능에 미치는 용량 및 시간 의존적 효과를 보여준다.
도 19는 SCNE가 인간 결장암 세포에서 세포자멸사를 유도함을 보여준다. HCT 116 세포가 72시간 동안 다양한 농도의 SCNE로 치료되었고, 알렉사488 신호 강도를 검출함으로써DNA 파편화가 분석되었다.
도 20은 SCNE가 인간 결장암 세포에서 DNA 응축을 증가시킴을 보여준다. HCT 116 세포가 48시간 및 72시간 동안 SCNE(0~18 μg/ml)로 치료되었다. DAPI로 핵이 파란색으로 염색된다.
도 21은 인간 결장암 세포에서 SCNE가 세포 주기에 미치는 영향을 보여준다.
도 22는 SCNE가 인간 결장암 세포에서 세포핵으로의 NF-kB 전좌를 억제함을 보여준다.
도 23은 SCNE가 결장암 세포에서 세포자멸사를 유도함을 보여준다. HCT116과 HT 29 세포가 48시간 및 72시간 동안 SCNE(12~18 μg/ml)로 치료되었다.
상세한 설명
본 개시는 하기의 본 발명의 상세한 설명, 수치들 및 본원에 포함된 실시예를 참조함으로써 좀 더 쉽게 이해될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법이 개시되어 설명되기 전에, 이들은 달리 명시되지 않는 한 특정 합성 방법에 국한되지 않고, 또는 달리 명시되지 않는 한, 특정 시약에 국한되지 않으며, 물론 다양하게 변할 수 있음이 이해되어야 한다. 또한 본원에 사용된 용어는 단지 특정 양태를 기술하려는 목적을 위한 것으로, 제한하기 위한 것이 아니다. 본원에 기술된 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에 사용될 수 있으나, 예시적인 방법 및 물질이 이제 기술된다.
이와 더불어, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 본원에 명시된 어떤 방법도 그것의 단계들이 특정 순서에 따라 수행되어야 한다고 요구되는 것이 아님이 이해되어야 한다. 이에 따라, 방법에 관한 청구항이 실제로 그것의 단계들이 따라야 하는 순서를 언급하지 않았거나, 또는 상기 단계들이 특정 순서에 국한되어야 한다고 구체적으로 청구항 또는 발명의 내용에서 언급되지 않은 경우, 어떤 상황이든지, 순서의 암시가 의도된 것은 결코 아니다. 이것은 단계의 배열 또는 작동 흐름과 관련한 논리의 문제를 비롯한 해석, 문법적 조직 또는 구두법에서 도출된 단순한 의미, 그리고 본원에 기술된 양태의 수나 유형에 대한 모든 가능한 표현되지 않은 근거에도 동일하게 적용된다.
본원에 언급된 모든 문헌은 상기 문헌이 언급된 것과 관련된 방법 및/또는 물질을 개시 및 기술하기 위해 본원에 참조로 편입되었다. 본원에서 논의되는 문헌은 본 출원의 출원 일자 이전에 그들의 개시를 위해서만 제공되었다. 본원의 어떤 내용도 본 발명이 사전 발명으로 인해 그와 같은 문헌에 선행할 권리가 없다는 인정으로 간주되어서는 안 된다. 더 나아가, 본원에 제공된 문헌의 일자는 실제 공개 일자와 다를 수 있기에, 독자적으로 확인할 필요가 있을 수 있다.
본 명세서 및 청구항에 사용되는 단수 형태 "하나", "하나의" 및 "상기"는 문맥에 의해 명확히 달리 지시되지 않는 한 복수의 지시대상을 포함한다.
본원에 사용된 단어 "또는"은 특정 목록의 임의의 하나의 구성원을 의미하고, 또한 그 목록의 구성원들의 임의의 조합을 포함한다.
본 명세서의 설명 및 청구항을 통틀어, 단어 "포함하다"와 그 단어의 변형들, 예컨대 "포함하는" 및 "포함하고"는 "하기를 포함하되, 제한적이지 않음"을 의미하되, 예를 들어, 기타 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것이 아니다. 특히, 하나 이상의 단계 또는 수행을 포함한다고 언급된 방법에서, 각 단계가 목록의 항목(상기 단계가 제한적인 용어, 예컨대 "~으로 이루어진"을 포함하지 않는 한)을 포함하는 것이 구체적으로 고려되는데, 이것은 각 단계가 예를 들어 해당 단계에 나열되지 않은 기타 첨가제, 구성성분, 정수 또는 단계를 배제하는 것이 아니라는 의미이다.
본원에서 범위는 "약" 또는 "대략" 특정한 하나의 값에서 및/또는 "약" 또는 "대략" 또 다른 특정한 값까지로 표현될 수 있다. 그와 같은 범위가 표현된 경우, 추가적 양태는 상기 하나의 특정한 값에서 및/또는 기타 특정한 값까지를 포함한다. 이와 유사하게, 값이 근사치로 표현된 경우, 앞서 말한 "약" 또는 "대략"을 사용함으로써, 상기의 특정 값이 추가적인 양태를 형성함이 이해될 것이다. 범위의 각 종점이 반대편 종점과 관계가 있든, 반대편 종점과 독립적이든, 유의미함이 추가적으로 이해될 것이다. 또한 본원에 개시된 수많은 값들이 존재하고, 각 값은 또한 그 값 자체 뿐만 아니라 "약" 그 특정 값으로 본원에 개시됨이 이해된다. 예를 들어, 값 "10"이 개시된다면, 또한 "약 10"도 개시된 것이다. 2개의 특정한 단위 사이의 각 단위가 또한 개시된 것임이 이해될 것이다. 예를 들어, 10과 15가 개시된다면, 11, 12, 13 및 14 역시 개시된 것이다.
본원에 사용되는 용어 "선택적" 또는 "선택적으로"는 추후에 기술된 사건 또는 상황이 일어날 수도 또는 일어나지 않을 수도 있고, 설명이 상기 사건 또는 상황이 일어난 경우 및 그것이 일어나지 않은 경우를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "개체"는 투여의 대상, 예를 들면, 인간을 가리킨다. 따라서, 본원에 개시된 방법의 개체는 척추동물, 예컨대 포유류, 어류, 조류, 파충류 또는 양서류를 포함한다. 용어 "개체"는 또한 사육 동물(예를 들면, 고양이, 개 등), 가축(예를 들면, 소떼, 말, 돼지, 돼지, 양, 염소 등) 및 실험실 동물(예를 들면, 생쥐, 토끼, 래트, 기니어피그, 초파리 등)을 포함한다. 일 양태에서, 개체는 포유류이다. 또 다른 양태에서, 상기 개체는 인간이다. 상기 용어는 특정 연령 또는 성별을 가리키지 않는다. 따라서, 여성이든 남성이든, 성인, 어린이, 청소년 및 신생아 개체, 또한 태아를 모두 아우르는 것이다.
본원에 사용되는 용어 "환자"는 질병 또는 장애를 앓고 있는 개체를 가리킨다. 용어 "환자"는 인간 및 수의학적 개체를 포함한다. 본 발명의 개시된 방법의 일부 양태에서, 상기 "환자"는 예컨대, 예를 들면, 투여 단계 이전에, 암의 치료가 필요하다고 진단 받은 바 있다.
본원에 사용되는 용어 "치료하는"은 특정 질병, 장애 및/또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 특징의 부분적 또는 완전한 완화, 개선, 경감, 시작의 지연, 진행의 억제 또는 늦어짐, 중증도의 감소 및/또는 발병의 감소를 가리킨다. 치료는, 상기 질병, 장애 및/또는 질환과 관련된 병리를 발전시킬 위험을 줄일 목적으로, 질병, 장애 및/또는 질환의 조짐을 보이지 않는 개체에 및/또는 질병, 장애 및/또는 질환의 조기 조짐만을 보이는 개체에 시행될 수 있다. 예를 들어, 상기 질병, 장애 및/또는 질환은 암 또는 과증식성 장애일 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "억제하다" 또는 "억제하는"은 종양 세포성장률을 치료 부재 하의 세포성장률보다 줄이고 및/또는 종량 질량(예를 들면, 암)의 감소를 유발하는 것을 의미한다. 억제하는 것은 또한 상기 종양(예를 들면, 암)의 완전한 퇴화를 유발하는 것을 포함한다.
도입부
지구촌에서 담뱃잎 사용, 알코올 소비 및 HPV 노출의 증가가 지속되면서, 구강암의 발병 위험이 전세계적으로 그 어느 때보다 증가하고 있다(Cancer Facts and Figures 2015). 구강 편평세포암종(OSCC)이 모든 구강암의 90%에 해당하고, 전세계에서 가장 일반적인 암 6위 및 미국에서 가장 일반적인 암 8위를 차지하고 있다(Cancer Facts and Figures 2015). 기존의 치료가 조기 질병 환자의 경우 5년 생존율을 개선해왔지만, 말기 질병(III기 및 IV기) 환자는 5년 생존율이 겨우 34%에 달한다(Cancer Facts and Figures 2015). 그 뿐만 아니라, 이러한 통계는 거의 40년 동안 변함이 없었다. 따라서, OSCC 개시 및 진행의 예방이 그와 같은 엄청난 질병의 질병률 및 사망률을 감소시키는 데 중요할 수 있다.
아자디라크타 인디카, 즉 님은 마호가니와 관련된 나무 과에 속한다; 멜리아세애(Hao F, Kumar S, Yadav N, Chandra D. Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment. Biochim Biophys Acta; 1846:247-57). 님은 인도, 미얀마, 방글라데시, 스리랑카, 말레이시아 및 파키스탄에서 토착식물로, 전세계 아열대 및 열대 지역에서 자란다(Hao F, Kumar S, Yadav N, Chandra D. Neem components as potential agents for cancer prevention and treatment. Biochim Biophys Acta; 1846:247-57). 님 나무는 항암 활성이 있는 것으로 나타난 고활성 리미노이드 테르페노이드, 즉, 종합적으로 아자디락토이드의 원료이다(Manikandan P, Ramalingam SM, Vinothini G, Ramamurthi VP, Singh IP, Anandan R, 등. Investigation of the chemopreventive potential of neem leaf subfractions in the hamster buccal pouch model and phytochemical characterization. Eur J Med Chem; 56:271-81). OSCC에서 님 추출물의 사전 연구는 일부 활성이 보여진 햄스터 볼 주머니 발암 모형에서 평가된 님 잎의 상대적으로 불순한 에탄올 유기 추출물에 제한되어 있다(Subapriya R, Kumaraguruparan R, Nagini S. Expression of PCNA, cytokeratin, Bcl-2 and p53 during chemoprevention of hamster buccal pouch carcinogenesis by ethanolic neem (Azadirachta indica) leaf extract. Clin Biochem 2006; 39: 1080-7; and Dasgupta T, Banerjee S, Yadava PK, Rao AR. Chemopreventive potential of Azadirachta indica (Neem) leaf extract in murine carcinogenesis model systems. J Ethnopharmacol 2004; 92: 23-36). 위암 및 피부암의 쥣과 모형 또한 최소한 35개의 생물학적 활성 화합물을 함유한 님 잎 에탄올 추출물의 효능(Dasgupta T, Banerjee S, Yadava PK, Rao AR. Chemopreventive potential of Azadirachta indica (Neem) leaf extract in murine carcinogenesis model systems. J Ethnopharmacol 2004; 92: 23-36)을 입증한다.
님 니무(아자디라크타 인디카)의 지상부와 씨가 수많은 인간 질환을 치료하는 약으로 사용되어져 왔다. 님은 전통의학인 아유르베다에서 풍성하게 사용되었고, 전염증성 질환의 치료를 위한 전통의학에서의 사용은 그것의 항염증성 잠재력이 암 예방 및 치료에 유용할 수 있다는 가설에 이르렀다. 이러한 개념을 뒷받침하는 것은 인도와 아프리카에서 급성 및 만성 염증질환을 치료하는 데 전통적으로 님을 사용한 오랜 역사이다. 예를 들어, 님 나뭇가지는 오랫동안 전통적으로 구강 건강을 유지하는 데 사용되어 왔고, 님은 항세균성, 항균성 및 항궤양성 특성을 갖고 있음이 보여진 바 있다. 이러한 관측들은 님과 그것의 구성체들이 암 관련 염증을 조절할 수 있다는 생각에 신빙성을 부여한다.
님 잎의 유기 용매 추출물은 무엇보다 유방암, 전립선암 및 췌장암의 모형에서 항종양 효과를 입증한 바 있다. 초임계 추출물 기술은 활성성분의 열 또는 용매 분해에 불안정함을 피함으로써 자연 화합물에서 생-활성 원물질(principals)의 더 양호한 추출을 가능하게 한다. 일부 양태에서, 님 잎의 초임계 CO2 추출물이 본원에 개시된 실시예에서 사용되었고, 상기 추출물의 제조 방법이 본연의 휘발성분의 더 양호한 보유를 가능하게 한다. 님은 잎의 쓴 맛을 설명해주고, 하나의 분류로서, 님 잎에서 발견되는 주요한 생-활성 식물성 화학물질 중 하나인 휘발성 테르페노이드(리미노이드)가 풍부하다. 작용 기전을 검사하기에 충분한 양으로 단리된 님 리미노이드가 없었다. 좀 더 일반적인 님 리미노이드 중에서, 다수의 조사는 님볼라이드(5,7,4'-트리하이드록시-3',5'-디프레닐플라본)에 초점을 맞춰 왔다. 여러 연구에서 수많은 세포주, 예컨대 신경모세포종, 백혈병 및 흑색종에서 성장의 억제에 대해 님볼라이드를 검사해왔다. 님볼라이드는 유방 및 교모세포종 세포주의 세포 주기 변경을 유도하고 또한 세포 신호전달 경로를 조절한다는 것이 발견되었다. 초기 연구에서, VEGF 및 기타 전이-활성 인자(enabling factor)의 발현이 체외에서 억제되었음이 보고된 바 있다. 초임계 잎 추출물은 사용하기에 비교적 안전하고, 천연 살충제로 널리 사용되는 님 오일에서 발견되는 유독 화합물을 함유하지 않는다. 님 잎의 최소한 하나의 초임계 추출물이 여러 건강기능 제품의 구성체로서 시장에 진입해 왔기 때문에, 그것의 효능이 다양한 범위의 결장암 잠복기(preclinical) 모형 시스템에서 검사되었고, 그것의 작용을 님볼라이드와 비교하였다.
본원에 순도가 높은 님의 초임계 CO2 추출물(SCNE)이 기술되는데, 이것은 상기 생-활성 구성성분인 님볼라이드가 식별되었고 잠재된 용질 오염물질이 제거된 것이다(Rodriguez-Solana R, Salgado JM, Dominguez JM, Cortes-Dieguez S. Comparison of Soxhlet, accelerated solvent and supercritical fluid extraction techniques for volatile (GC-MS and GC/FID) and phenolic compounds (HPLC-ESI/MS/MS) from Lamiaceae species. Phytochem Anal; 26:61-71). SCNE는 세포기준 검정, OSCC의 4NQO-1 발암물질 모형 및 인간 OSCC의 생쥐 이종이식편 모형을 사용하여 체외 및 체내에서 항-증식 효과에 대해 평가되었다. OSCC의 90%를 유발시키는 EGFR 신호전달의 교란 뿐만 아니라, 순환 사이토카인 및 염증성 및 세포사멸적 표지자에 미치는 효과가 본원에 또한 기술되었다.
제조 방법
님이라고 알려진 아자디라크타 인디카는 멜리아세애(Meliaceae) 과에 속하는 빠르게 성장하는 상록수 나무이다. 씨앗, 잎, 꽃, 줄기, 껍질, 님의 열매의 추출물이 지속적으로 다양한 질병에 약으로 사용되어져 왔다. Andhra Pradesh, Tamil Nadu 및 Karnataka를 비롯한 인도의 열대 및 아열대 지역의 토착 식물이고, 남동 아시아에서 발견된다. 또한 서아프리카, 카리브해 연안 및 중남미에 널러 퍼져 있다.
건조된 아자디라크타 인디카 잎은 인도의 Rajastan and Madhaypradesh 주에서 공급받는다.
본 개시에서, 상기 식물의 건조된 잎에서 유래된 CO2 추출물은 치료 차원의 적용을 위해 사용된다.
이에 따라, 바람직한 일 양태에서, 본 발명은 이로운 식물구성체를 함유한 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 CO2 추출물을 제조하는 공정을 제공한다. 상기 공정은 하기 단계들을 수반한다:
a) 수분함량이 12% 미만인 깨끗하게 성숙된 건조 아자디라크타 인디카 잎을 분말화하여 미세입자의 입도가 0.42mm 미만인 분말을 획득하는 단계;
b) 80 Bar(80 kg/cm2)에서 350 Bar(350 kg/cm2) 사이의 압력 하에 31℃에서 45℃ 사이의 범위의 온도에서; 원료 1 kg 당 CO2 10 내지 40 kg의 유량으로, 상기 분말에 초임계 CO2 추출을 실시하는 단계;
c) 40 Bar에서 65 Bar 사이로 변하는 압력을 유지하면서, 추출 온도보다 더 낮은 온도에서 CO2 추출물을 분리하여 추출물 A를 획득하는 단계;
d) 80 Bar에서 350 Bar 사이의 범위의 압력 하에, 31℃에서 45℃의 범위의 온도에서 CO2 와 에틸 알코올의 혼합물을 사용하여, 추출물 'A'의 분리 후 남은 잔류 분말에 추가적인 추출을 실시하는 단계;
e) 상기 용매 압력을 40 Bar에서 65 Bar로 감소시키고 상기 추출 온도보다 낮은 온도에서, CO2 추출물이 첨가된 에틸 알코올을 분리기에서 수집하고, 이어서 에탈올의 진공 증류를 통해 추출물 B를 획득하는 단계; 및
f) 추출물 A와 추출물 B를 조합하여 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 CO2 추출물이라 불리는 추출물 C를 획득하는 단계.
추출을 위해 고려되는 아자디라크타 인디카의 성숙한 잎은 바람직하게는 모두 같은 연령이다.
상기 건조된 분말의 입자 크기는 0.42mm 미만이다.
상기 단계 c)에서의 분리 온도와 단기 e)에서의 수집 온도는 10℃에서 30℃ 사이에서 유지된다.
상기 에탄올의 진공 증류는 45℃ 미만의 온도에서 수행된다.
단계 d)에서 사용된 에틸 알코올은 CO2의 3 내지 10% 의 양으로 존재한다.
CO2 추출을 위해 필요한 시간은 추출 장치의 크기 및, 한 번에 상기 추출 장치에 적재되는 약초의 양에 따라 달라진다. 상기 약초를 통해 펌핑되는 CO2의 양은, 상기 약초에 존재하는 친유성 화합물의 용해도에 따라, 약초 1 kg 당 CO2 10 kg에서 약초 1 kg당 CO2 40 kg에 이르기까지 다양하다. CO2는, 상기 용질(추출물)과 상기 CO2를 분리하기 위해 필요한 경우 상기 CO2 의 압력이 40 Bar에서 65 Bar 사이로 달라지는 압력으로 감소되고 상기 온도가 10℃ 내지 30℃의 범위 내에 있는 분리기로, 상기 추출성 물질을 운반한다
이와 같은 추출 방법은 초임계 CO2 추출이라고 알려졌는데, 이것은 건조된 약초의 가장 안전한 추출 방법이다. 그리하여 획득된 추출물은 상기 약초에 존재하는 온도에 민감한 주요 및 미미한 성분들과 기타 친유성 용해 화합물을 함유한다. 본 발명에서, 그렇게 해서 획득된 추출물이 추출물 A라 불린다.
추출물 'A'를 분리한 후 남은 잔류 분말에, 초임계 CO2 는 90 내지 97%이고, 에틸 알코올은 3 내지 10%인 비율로 CO2와 에틸 알코올의 혼합물을 사용하여, 추가로 추출이 실시된다. 상기 추출은 80 Bar에서 350 Bar 사이의 범위에 있는 압력 하에 31℃에서 45℃ 사이의 범위의 온도에서 수행되었다. 펌핑된 용매(CO2 + 에탄올)의 양은 약초 1 kg당 10 kg에서 약초 1 kg 당 40 kg에 이르기까지 다양하다. 10℃에서 30℃ 사이의 온도에서 상기 용매의 압력을 40 Bar에서 65 Bar 사이로 감소시킬 때, 용질(추출물)과 에탄올이 상기 CO2에서 분리되었다. CO2 추출물이 첨가된 에틸 알코올의 혼합물이 상기 분리기에서 수집되었고, 이어서 상기 용질(추출물)에서 상기 에틸 알코올을 완전히 분리하기 위해 진공 증류를 실시하였다. 이와 같은 추출물은 추출물 B라고 불린다.
마침내, 두 가지 상기 추출물(추출물 A와 추출물 B)이 합쳐져서 추출물 C를 획득하였다. 이와 같이 조합된 추출물은, 하기의 실시예에서 기술된 바와 같이, 아자디라크타 인디카 잎의 SCO2 추출물이라고 불린다.
또 다른 양태에서, 상기 추출물 A에 극초고속이 실시되고, 마이크로젯 또는 노즐을 통해 통과된 후, 미세한 크기의 나노 입자 추출물이 획득된다. 나노 크기의 전달 기술이 상기 제형의 효과를 잠재적으로 개선시키는 것으로 알려져 있다. 획득된 추출물 중 최소 10%는 입자 크기가 10~100 nm이다. 따라서, 상기 양태에서 획득된 추출물은 '초임계 님 잎 추출물-나노 10%'으로 통용된다. 이에 따라, 이와 같은 '초임계 님 잎 추출물-나노 10%'는 추출물 B와 조합되어 추출물 C가 획득될 수 있다.
상기 CO2 추출물의 수율은 2.5% 내지 5% w/w 범위에 속할 수 있다.
본 개시에서 혼입 에탄올의 존재 또는 부재 하에 사용되는 초임계 CO2 추출(SCO2)은 어떠한 해로운 용매 잔류를 남기지 않는다. 상기 추출 온도는 31℃에서 45℃ 사이로 유지되는데, 이것이 온도에 민감한 성분들의 보유를 보장한다. 또한 추출 압력이 WO'199에 보고된 공정의 압력보다 훨씬 낮다.
추출(혼입 에탄올의 존재 또는 부재 하에서의 SCO2 추출)을 위해 본원에 기술된 방법은 항상 추출 온도보다 훨씬 낮은 분리 온도를 갖는다. 낮은 온도에서의 추출은 열에 불안정한 화합물에 손상을 입힐 위험을 감소시킨다. 따라서, 온도에 민감한 성분들의 보유와는 별개로, 본 개시의 식물구성체의 온전함이 유지된다. 본 발명의 SCF(초임계 유체) 추출을 위한 전형적인 온도가 31 ℃ 내지 45℃인 반면, 분리 온도는 약 10℃ 내지 30℃일 것이다.
WO2015035199에 보고된 공정과 비교하여 본 개시의 추가적인 이점은 상기 공정이 WO'199에 보고된 공정의 압력과 비교하여 훨씬 낮은 압력에서 달성될 수 있다는 점이다. 게다가, WO'199에 보고된 공정의 수율은 대략 5%이다. 상기 제형은 더 높은 추출 압력이 불순물로 남아 있었던 밀랍과 수지의 추출을 초래할 수 있으므로, 특정 양의 불순물을 함유할 수도 있다. 반면에, 본 개시처럼 더 낮은 압력 하의 추출이 활성 화합물의 선택적 추출을 허용하기에 본 개시는 더 적은 불순물을 가질 수 있다.
또 다른 구현예에서, 아자디라크타 인디카 잎의 약초 분말에 물 추출이 실시되어 페이스트 형태의 수용성 추출물질이 획득되었다. 이렇게 획득된 추출물은 트레이 건조기/진공 건조기 또는 분사 건조기에서 건조되어 자유 유동성 분말 추출물이 획득되었다. 이와 같은 추출물은 물 추출물이라 불린다(실시예 5).
또 다른 양태에서, 본 개시는 님볼라이드를 최소 3 mg/gm의 양으로; 님빈을 최소 130 μg/gm의 양으로, 살리닌을 최소 200 μg/gm의 양으로 포함하여, 약초 제형으로 투여될 경우 상기 추출물의 최대 치료적 효능을 보장하는 표준화된 SCO2 님 추출물(SCNE)을 제공한다. 상기 CO2 표준화된 추출물은 또한 이와 같은 활성에 기여할 수 있는 다양한 기타 활성 식물구성체, 예컨대 데스아세틸님빈, 아자디라디온, 아즈디론, 님볼린 및 님비넨을 함유한다. 하지만, 이들이 적은 양으로 존재하기에 정량화되지 않는다.
이에 따라, 또 다른 양태에서, 본 개시는 하나 이상의 약제학적 운반체 또는 부형제를 동반하고, 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 SCO2 추출물을 50 내지 300 mg의 유효량만큼 포함하여 구강암 및 결장암에 대한 항종양 활성을 발휘하는, 구강적용을 위한 치료적 약초 조성물을 제공한다.
상기 약제학적 부형제/운반체는 증류수, 식염수, 글루코오스 수용액, 알코올(예를 들면, 에탄올), 계면활성제, 프로필렌 글리콜, 트윈-80 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 유성 운반체, 예컨대 다양한 동물성 및 식물성 기름, 백색 소프트 파라핀, 파라핀, 밀랍, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 황색 덱스트린, 맥아 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 통기(aerated) 또는 흄드 실리카, 인산이칼슘, 미세결정질 셀룰로오스, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수시럽, 락토오스, 구연산, 주석산, 사과산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스) CO2 추출물, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리글리세린 지방 에스테르, 수크로오스 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카세인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B군, 니코틴아마이드, 판토텐산칼슘, 아미노산, 통기(aerated) 또는 흄드 실리카, 칼슘염, 안료, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택된다.
바람직한 구현예에서, 본 제형에 사용된 추출물은 혼입 용매 에탄올의 존재 또는 부재 하에 SCO2 추출을 사용하여, 하기 조건 하에서 제조된다.
추출 압력 : 72 kg/cm2 에서 550 kg/cm2 사이
바람직한 범위 : 80 kg/cm2 내지 350 kg/cm2
혼입 에탄올: 0~10%(바람직한 범위는 3 내지 7%)
일반적으로, 상기 약초는 기존 용매를 사용하는 기존 방법, 예컨대 냉압축법, 기존의 압출 압축법, 용매 추출, 증류 "변형된 대기 팩킹"(MAP)을 사용하여 추출된다.
초임계 CO2 추출은 상기 약초에 존재하는 다양한 범위의 비극성 친유성 구성 화합물, 예컨대 필수적인 온도 민감 식물영양소와 함께 오일, 지방산이 있는 추출물을 생산하는 공정이다. 상기 추출물질의 범위는 순수한 CO2와 함께 혼입 용매로서 에탄올을 최대 10% 사용함으로써 확대될 수 있다. 본 추출 공정을 사용할 때의 주요한 이점은 건강에 이롭게 기여하는 약초에 존재하는 온도민감 성분의 보유이다. 용매, 예컨대 해로운 헥산, 클로로포름, 아세톤이 사용되는 기타 용매 추출법과 달리, 본 발명의 추출물은 중금속 오염물질 뿐만 아니라 해로운 용매 잔류가 없다. CO2 가 상당히 비극성인 용매이고 중금속이 상당히 극성이기 때문에, 중금속이 CO2에 용해되지 않음으로, 본 발명의 추출물 중 중금속은 검출가능한 제한 값에 못 미친다.
에탄올이 혼입 용매로 사용될 경우, 생성되는 추출물은 진공(Hg의 27 내지 28.5 inch) 하에 온도를 45℃ 미만으로 유지하는 정도로 상기 추출물에서 에탄올을 제거함으로써 획득되기에, 잔류 용매(에탄올)는 1000 ppm 미만으로 유지되고, 따라서 상기 제형을 제조하는 데 안전하게 사용될 수 있다.
본 개시에 사용되는 추출물은 또한 극한의 초고속을 사용하고 마이크로젯 또는 노즐을 통과시킴으로써, 나노입자, 즉 10 nm~100 nm의 크기로 축소되었다. 상기 입자는 동적광산란(Dynamic Light Scattering(DLS))을 사용하여 특성이 규명되었다. DLS은 광 산란 기법이다. DLS의 기본 원칙은 레이저 빔이 샘플에 조사되고, 고속 양성자 검출기에 의해 알려진 산란 각에서 산란된 빛의 변동이 검출된다. 상기 산란된 빛의 변동의 분석이 입자에 대한 정보를 생산한다.
이렇게 획득된 SCNE에 HPLC 및 LC-MS가 실시되어, 잠재적인 암 예방 활성을 갖는 트리테르페노이드의 특징이 확인되었다. 이에 따라, 추가적인 양태에서, 이렇게 획득된 SCO2 님 추출물은 본 개시에서 제조된 상기 추출물의 효능을 보장하기 위해 최소 농도로 님볼라이드를 3 mg/gm의 양으로; 님빈을 130 μg/gm의 양으로 살리닌을 200 μg/gm 의 양으로 함유하는 특징을 갖는다.
추가 구현예에서, 상기 개시는 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 제공한다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도는 본 개시의 SCNE에서 달라질 수 있다. 하지만, 일부 양태에서, 상기 SCNE는 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 기타 양태에서, 상기 SCNE는 최소한 130μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 또 다른 양태에서, 상기 SCNE는 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양은 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양은 최소한 130 μg/g 일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌은 최소한 200 μg/g일 수 있다.
일부 기타 양태에서, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
이에 따라, 추가 구현예에서, 상기 개시는 약제학적 운반체/부형제 중에 님볼라이드; 님빈 및 살리닌을 상기 최소 농도로 함유하는 생리학적 유효량의 표준화된(SCNE) 추출물; 또는 이들의 조합물을 포함하여, 구강암 및 결장암의 증식, 세포자멸사 및 항암 활성의 표지자들 중 최소한 하나를 억제하는 약초 약제학적 조성물을 제공한다. 상기 생리학적 유효량의 추출물은 1일 50 내지 300 mg의 범위로 존재한다. 이와 같은 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 또는 이들의 조합물의 최소한의 농도는 본 출원에 개시된 공정을 사용함으로써 수득된 SCO2 추출물에서 달성된다.
상기 조성물은 경구형 고체 또는 액체 제형으로 제형화될 수 있다.
이에 따라, 치료에 유효한 경구형 제형이 본 발명을 입증하기 위해 예를 들어 세 가지 방식으로 제조된다.
하나의 예시적 구현예에서, 상기 치료에 유효한 제1 경구용 제형은 SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 75 mg(최소 님볼라이드 0.22 mg; 님빈 9.75 μg 및 살리닌 15 μg 함유); 자연발생적 항산화제, 예컨대 비타민 E(토코페롤) 또는, 최소 6% 카노스산을 함유한 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스) CO2 추출물: 10 mg 및 호마유: 415 mg; 또는 운반체로서 기타 자연발생적인 오일을 함유한다. 그 밖의 적합한 항산화제가 비타민 E 또는 로즈마리 CO2 추출물을 대신하여 사용될 수 있다. 이와 같은 제형은 500 mg의 연질 겔 캡슐로 제공되었다. 상기 캡슐은 1일 2회 환자에게 투여될 수 있다(활성 약물로서 1일 님 잎 추출물 총 150 mg).
또 다른 예시적 구현예에서, 치료에 유효한 제2 경구용 제형은 SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 50 mg(최소 님볼라이드 0.15 mg; 님빈 6.5 μg 및 살리닌 10 μg 함유), 덱스트린/말토-덱스트린 582 mg 또는 기타 자연발생적 운반체(예를 들면, 인산이칼슘 또는 기타 적합한 약제학적 등급 운반체); 및 통기 또는 흄드 실리카 18 mg을 함유한다. 자유-유동성 분말이 제조되어 시장에서 구입가능한 적합한 크기의 경질 젤라틴 또는 식물성 캡슐로 캡슐화되었다. 상기 물질은 본원에 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물 150 mg의 치료적 용량을 얻기 위해 1일 3회 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 치료에 유효한 제3 경구용 제형은 SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 50 mg(최소 님볼라이드 0.156 mg; 님빈 6.5 μg 및 살리닌 10 μg을 함유), 님 잎에서 획득된 물 추출물 582 mg 및 통기(aerated) 또는 흄드 실리카 18 mg을 함유한다. 자유-유동성 분말이 제조되어 시장에서 구입가능한 적합한 크기의 경질 젤라틴 또는 식물성 캡슐로 캡슐화되었다. 상기 물질은 본원에 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물 150~300 mg의 치료적 용량을 얻기 위해 1일 3회 투여될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 속도를 증가시키고 입자를 마이크로젯 또는 노즐에 통과시킴으로써 제조된 미세한 크기의 나노입자 CO2 추출물이, 일반적인 CO2 추출물 150 mg 대신에 님 잎 CO2 추출물 나노입자 100 mg의 치료적 용량을 얻기 위해, 1일 3회 투여될 수 있다.
또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 개시는 식이 보충제 형태의 상기 조성물, 또는 운반체의 존재 또는 부재 하의 연질 겔 캡슐, 경질 겔 캡슐, 액체 캡슐, 건강식 분말, 음료, 실질적으로 균질한 혼합물(즉, 활성 성분들이 골고루 분배됨)과 같은 기존 형태의 약초 의약품을 제공한다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 상기 개시는 표준 운반체 및 첨가제, 예컨대 소르비톨, 글리세린, 유화제, 물 및 적합한 풍미제, 예를 들면 민트, 과일 등과 함께, 4.55%의 SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물을 함유한 구강세정제용 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 액체 제형이 본원에 개시된다. 상기 물질은 본원에 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물 15 mg의 치료적 용량을 얻기 위해, 1일 3회(매회 20ml씩) 투여될 수 있다. 상기 구강세정제 제형은 예를 들어, 구강암의 경우에 사용하기 위해, 제조된다.
SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물을 함유한 상기 조성물은 본원에 기술된 임의의 제형으로 복용 시 5 mg 내지 300 mg의 용량 범위로 투여될 수 있다. 권장되는 투여 용량은 1일 2회 또는 1일 3회 또는 1일 2회(1회에 캡슐 2개씩)이다.
하지만 또 다른 구현예에서, 세포 생존능(MTT 검정 이용)을 측정함으로써 구강암 및 결장암에 대한 SCNE의 효과가 평가되었다. SCNE가 세포 주기에 미치는 영향을 연구하기 위해 DNA 파편화(TUNEL 검정 이용[말단 데옥시뉴클레오타이드 전달효소 dUTP 닉 종단 표지]), DAPI 염색으로 DNA 응축 분석, 웨스턴 블랏 분석에 의한 세포사멸적 표지자(고유 경로: Bax, Bcl-2) 단백질의 측정, 유세포 분석이 측정되었고, 하기의 결론이 도출되었다.
· SCNE는 시간 및 용량 의존적 방식으로 결장암 세포의 생존능에 영향을 미친다(도 15~16).
· SCNE는 인간 결장암 세포에서 세포자멸사를 유도한다. HCT 116 세포가 72시간 동안 다양한 농도의 SCNE로 치료되었고, 알렉사488 신호 강도를 검출함으로써 DNA 파편화가 분석되었다(도 19).
· SCNE는 DNA 파편화의 증가를 유발시켰다. 이것은 도 7에서 관측된 DNA 응축의 엄청난 증가와 일맥 상통하였다.
· 유세포 분석에 의한 세포 주기 분석이 48시간 동안 IC50에서 SCNE로 치료된 HCT 116 세포에서 사전-세포사멸적 피크를 확인해주었다(도 20).
· SCNE 치료는 세포핵으로의 NF-kB 전좌를 억제하였다(도 22).
· SCNE는 친-세포사멸적 단백질 Bax를 증가시켰고, 항-세포사멸적 단백질 Bcl2를 감소시켰다(도 23).
이에 따라, 추가적인 구현예에서, 두 가지 인간 결장암 세포주, HCT 116 및 HT 29에 대한 초임계 CO2 님 잎 추출물(SCNE) 및 님볼라이드 단독의 암 예방 효과가 조사되었다. 정상적인 래트 결장 세포 IEC-6 세포 역시 상기 SCNE 추출물의 세포독성을 검증하기 위한 연구에 포함되었다. 세포 생존능에 대한 SCNE의 효과가 님볼라이드와 비교되었고, 그 결과가 본원에 논의되었다.
상기 결과는 SCNE가 48시간 후 심지어 더 높은 농도인 50 μg/mL에서조차 정상적인 래트 결장 세포 IEC-6 세포에 무독성임을 확인시켜준다(도 14). SCNE로 치료된 대장암세포, 즉, HCT116 및 HT29는 72시간의 끝에 15 μg/mL의 농도에서 각각 62%(도 15) 및 44% 세포 생존능(도 16)을 보이고, 48시간 및 72시간 끝에 40 μg/mL의 농도(도 15) 및 75 μg/mL의 농도(도 16)에서 각각 0% 세포 생존능을 보인다. 하지만, 님볼라이드로 치료된 대장암세포, 즉 HCT116(도 17) 및 HT29(도 18)는 48시간 끝에 15μg/mL의 농도에서 각각 80% 및 75% 세포 생존능을 보인다.
본원에 기술된 실험은 결론적으로 님볼라이드, 님빈 및 살리닌의 조합물을 포함하는 초임계 CO2 님 잎 추출물(SCNE 추출물)이 님볼라이드 단독보다 치료적 효능이 더 높음을 확인시켜주었다.
조성물
본원에 개시된 임의의 방법에 사용될 수 있는 조성물이 본원에 기술된다. 본원에 기술된 상기 조성물은 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)일 수 있다. 또한 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 조성물이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같이, 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도는 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물 중 구성성분들 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 하나 이상의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 제형에 따라, 약제학적으로 허용가능한 부형제의 포함이 선택적일 수 있다. 사용될 수 있는 약제학적으로 허용가능한 부형제의 예에는, 비제한적으로 덱스트린/말토-덱스트린 또는 인산이칼슘, 증류수, 식염수, 글루코오스 수용액, 알코올(예를 들면, 에탄올), 계면활성제, 프로필렌 글리콜, 트윈-80 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 유성 운반체 예컨대 다양한 동물성 및 식물성 기름, 백색 소프트 파라핀, 파라핀, 밀랍, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 황색 덱스트린, 맥아 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 미세결정질 셀룰로오스, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수시럽, 락토오스, 구연산, 주석산, 사과산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리글리세린 지방 에스테르, 수크로오스 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카세인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B군, 니코틴아마이드, 판토텐산칼슘, 아미노산, 통기(aerated) 또는 흄드 실리카, 칼슘염, 안료, 풍미제 및 보존제가 포함된다.
일부 양태에서, SCNE가 하나 이상의 리미노이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 하나 이상의 토코페롤; 및 호마유를 포함할 수 있다. 토코페롤의 예에는, 비제한적으로, 알파-토코페롤, 감마-토코페롤, 비타민 E(토코페롤) 또는 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스), CO2 추출물 또는 약제학적으로 허용되는 임의의 항산화제가 포함된다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 하나 이상의 토코페롤; 호마유; 및 통기 또는 흄드 실리카를 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 75 mg; 항산화제, 예컨대, 예를 들면 비타민 E 또는 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스) CO2 추출물: 10 mg 및 호마유: 415 mg을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 50 mg; 덱스트린/말토-덱스트린 또는 기타 운반체(예를 들면, 인산이칼슘 또는 임의의 기타 약제학적 등급 운반체) 582mg; 및 통기 또는 흄드 실리카 18mg을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물이 아자디라크타 인디카 잎에서 획득되어, 본원에 기술된 바와 같이 초임계 CO2 추출로 획득되는 님 잎 추출물의 50 mg의 자유-유동성 분말을 제조하기 위한 운반체로 사용되는 물 추출물을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 2.28 g, 페퍼민트(멘타 피페리타) 오일: 13.81 g, 스피어민트(멘타 스피카타) 오일: 9.26 g, 클로브버드(사이지기움 아로마티쿰) CO2 오일: 3.98 g, 트인 80: 20.68 g을 포함할 수 있다. 상기 혼합물 1.25 g이 98.75 g의 염기에 희석되었다. 상기 염기는 물: 73.5 g, 알로에베라 물(200x): 10 g, 소르비톨: 10 g, 글리세린: 5.9 g, 아스코르브산: 0.5 g, 소르빈산칼륨: 0.1 g을 포함한다.
치료 방법
한 개체에서 암을 치료하는 방법이 본원에 개시되었는데, 상기 방법은 (a) 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계; 및 (b) 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 투여하는 단계를 포함한다. 일 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 또한 한 개체에서 암을 치료하는 방법이 개시되었는데, 상기 방법은 (a) 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계; 및 (b) 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 치료적 유효량의 조성물을 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물 중 구성성분들 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다.
혈청에서 최소한 하나의 염증성 사이토카인을 감소시키는 방법을 필요로 하는 개체에서 사용되는 방법이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, 상기 방법은 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 어느 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 최소한 하나의 염증성 사이토카인이 IFN-γ, IFN-β, TNF-α, IL-6 또는 IL-1일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 구강암을 앓거나, 앓는 것으로 의심되거나 또는 진단될 수 있다. 일부 양태에서, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 조성물의 개체에 투여가-이때 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함한다- 상기 개체의 혈청에서 최소한 하나의 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있되, 상기 개체는 구강암을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되거나 또는 진단된 바 있다. 일부 양태에서, 상기 최소한 하나의 염증성 사이토카인이 IL-6 또는 TNF-α일 수 있다. 일부 양태에서, IFN-γ, IFN-β, TNF-α, IL-6 또는 IL-1이, 본원에 기술된 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 구강암을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되거나 또는 진단된 바 있는 개체에 투여한 후, 감소될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체의 혈청이 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 상기 조성물의 투여 이전에 기준 시료와 비교할 때, 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치가 더 높을 수 있다. 일부 양태에서, 상기 방법이 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 상기 조성물의 투여 이전에 한 개체의 하나 이상의 세포에서 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치를 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치가 기준 시료와 비교하여 더 높을 수 있다.
염증을 감소시키는 방법을 필요로 하는 개체에서 사용되는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법이 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 구강암 또는 결장암으로 진단 받은 바 있다. 일부 양태에서, IFN-γ, IFN-β, TNF-α, IL-6, IL-1, NF-KB, STAT3, COX1 또는 COX2 중 하나 이상의 발현을 감소시킴으로써 염증이 감소될 수 있다.
과증식성 장애를 치료하는 방법을 필요로 하는 개체에 사용되는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법이 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 과증식성 장애의 치료를 필요로 한다고 진단 받은 바 있다. 일 양태에서, 과증식성 장애는 암일 수 있다. 일부 양태에서, 과증식성 장애는 구강암 또는 결장암일 수 있다.
NFkB 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법을 필요로 하는 개체에서 사용되는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법이 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 NFkB 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제할 필요가 있다는 진단을 받은 바 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식의 장애의 치료가 필요하다고 진단된 바 있다. 일부 양태에서, 상기 방법이 추가로 무제한 세포증식의 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 무제한 세포증식의 장애가 암일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암이 구강암일 수 있다.
최소한 하나의 세포에서 NFkB 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, 상기 방법이 최소한 하나의 세포를 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)과 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 최소한 하나의 세포가 인간 세포일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 접촉 단계가 개체에 투여를 통해 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식의 장애의 치료가 필요하다고 진단되었다. 일부 양태에서, 상기 개체가 구강암을 앓거나 또는 앓는 것으로 의심되거나 또는 진단된 바 있다. 일부 양태에서, 무제한 세포증식이 구강암일 수 있다.
개체에서 표피성장인자 수용체 신호전달(EGFR) 활성을 변형하는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법이 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 EGFR 신호전달 활성을 변형할 필요가 있다고 진단받은 바 있다. 일부 양태에서, 상기 변형이 억제하는 것일 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 EGFR 신호전달 활성을 억제할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식의 장애의 치료를 필요로 하는 것으로 진단된 바 있다. 일부 양태에서, 상기 방법이 무제한 세포증식의 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 양태에서, 무제한 세포증식의 장애가 구강암일 수 있다.
세포의 세포자멸사를 유도하는 방법을 필요로 하는 개체에서 사용되는 방법이 본원에 개시된다. 상기 방법이 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 추가로 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함할 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 인간일 수 있다. 일부 양태에서, 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식의 장애의 치료를 필요로 하는 것으로 진단된 바 있다. 일부 양태에서, 상기 방법이 무제한 세포증식의 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 무제한 세포증식의 장애가 암일 수 있다. 일부 양태에서, 상기 암이 결장암일 수 있다.
본원에 기술된 상기 조성물이 본원에 기술된 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하도록 제형화될 수 있다. 일 양태에서, 상기 초임계 CO2 님 추출물이 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 님볼라이드, 님빈 및 살리닌 중 임의의 것의 농도가 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 치료차원의 투여가 예방차원의 적용을 아우른다. 유전적 검사와 기타 예후적 방법을 기반으로, 의사는 환자가 어떤 유형의 암에 임상적으로 결정된 소인 또는 증가된 민감성(일부 경우에, 상당히 증가된 민감성)을 갖는 경우 환자와 상의하여 예방차원의 투여를 선택할 수 있다.
님볼라이드, 님빈 및 살리닌 각각의 농도 또는 양이 단일 조성물에서 달라질 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 각 구성성분의 농도 또는 양이 여러 요인들, 예를 들어 제형의 유형 뿐만 아니라 암의 특정 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다.
일부 양태에서, SCNE가 하나 이상의 리미노이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 아자디라크틴 A, 아자디라크틴 B 및 데아세틸살리닌을 추가로 포함한다. 일부 양태에서, SCNE가 추가로 아자디라크틴 A, 아자디라크틴 B 및 데아세틸살리닌 중 하나 이상을 적은 양으로 포함한다. 일 양태에서, '적은 양'은 검출의 한계일 수 있는 양을 가리킬 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 하나 이상의 토코페롤; 및 호마유를 추가로 포함할 수 있다. 토코페롤의 예에는, 비제한적으로, 알파-토코페롤, 감마-토코페롤, 비타민 E(토코페롤) 또는 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스), CO2 추출물 또는 약제학적으로 허용되는 임의의 기타 자연발생적 항산화제가 포함된다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 하나 이상의 토코페롤; 호마유; 및 통기 또는 흄드 실리카를 추가로 포함한다.
본원에 기술된 상기 조성물이 임상 질환의 시작을 늦추거나, 감소시키거나 또는 바람직하게는 방지하기에 충분한 양으로 상기 개체(예를 들면, 인간 환자)에 투여될 수 있다. 이에 따라, 일부 양태에서, 상기 환자가 인간 환자일 수 있다. 치료 차원의 적용에서, 조성물이 이미 암을 앓고 있거나 암으로 진단된 개체(예를 들면, 인간 환자)에게 최소한 조짐 또는 증상을 부분적으로 개선하거나 또는 질환의 증상, 그것의 합병증 및 결과의 진행을 억제(및 바람직하게는 저지)하기에 충분한 양으로 투여된다. 이를 달성하기에 적합한 양이 "치료적 유효량"이라 정의된다. 조성물(예를 들면, 약제학적 조성물)의 치료적 유효량이 치료를 달성하는 양일 수 있으나, 그와 같은 결과는 달성될 수 있는 여러 경우 중 하나일 뿐이다. 언급된 바와 같이, 치료적 유효량에는 암의 시작 또는 진행이 지연되거나, 방해되거나 또는 방지되고, 또는 암 또는 암의 증상이 완화되는 치료를 제공하는 양이 포함된다. 증상들 중 하나 이상이 덜 심각할 수 있다. 치료 받은 개인에게서 회복이 가속화될 수 있다.
암 환자를 치료하는 방법이 본원에 개시된다. 암은 임의의 암일 수 있다. 일부 양태에서, 암이 구강암 또는 결장암일 수 있다. 일부 양태에서, 암이 원발성 종양 또는 이차종양일 수 있다. 일 양태에서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 암으로 진단받은 바 있다.
본원에 기술된 상기 조성물이 본원에 기술된 바와 같이 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 단독으로 또는 하나 이상의 치료적 제제 또는 요법 또는 치료 방식(regimens)과 병행하여 포함하도록 제형화될 수 있다. 일 양태에서, 하나 이상의 치료적 제제 또는 요법 또는 치료 방식이 화학요법 또는 방사선요법일 수 있다. 일 양태에서, SCNE가 약제학적 제형 내에 함유될 수 있다. 일 양태에서, 상기 약제학적 제형이 단위용량 제형일 수 있다. 본원에 기술된 상기 조성물이 다양한 조합으로 제형화될 수 있다. SCNE와 하나 이상의 화학요법 제제 또는 방사선 요법과의 특정한 조합이 여러 요인들, 예를 들면, 암의 특정 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있다.
본원에 개시된 바와 같이 포유류(예를 들면, 인간)에 적용된 방법에 사용된 본원에 기술된 초임계 CO2 님 추출물의 치료적 유효량 또는 용량이 연령, 체중, 성별, 기타 투여된 약물 및 임상주치의의 판단에서의 개인 차를 고려하여 당해기술의 숙련가에 의해 결정될 수 있다. 필요 용량의 변경이 예상될 수 있다. 복용량 수치의 변경이 최적화를 위한 표준 경험 경로를 사용하여 조절될 수 있다. 환자에게 투여되는 약제학적 조성물의 특정 복용량은 다양한 고려 사항(예를 들면, 암 증상의 중증도), 개체의 연령 및 신체적 특징 및 당해기술의 숙련가에게 공지된 기타 고려사항에 따라 달라질 것이다. 복용량은 당해기술의 숙련가에게 공지된 임상적 접근법을 사용하여 설정될 것이다.
본원에 제공된 임의의 조성물을 사용한 치료의 기간이 짧게는 하루에서 길게는 호스트의 수명(예를 들면, 수년)만큼의 시간 길이일 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물이 1일 1회; 1주 1회(예를 들어 4주에서 몇 개월 또는 몇 년 동안); 한 달 1회(예를 들어, 3~12개월 동안 또는 몇 년 동안); 또는 5년, 10년 또는 그 이상의 기간 동안 1년 1회 투여될 수 있다. 치료의 회수가 달라질 수 있음이 또한 언급된다. 예를 들어, 본 발명의 조성물이 매일, 매주, 매월 또는 매년 1회(또는 2회, 3회 등) 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 하루에 2회 내지 3회 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 2주 내지 3주 내지 4주(또는 그보다 더 오랜 동안) 동안 하루에 2 내지 3회 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 하루에 2 내지 3회 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 2, 3 또는 4주 동안 하루에 2 내지 3회 투여될 수 있다.
SCNE의 복용량이 하루에 50 mg 내지 1000 mg의 범위일 수 있다. 일 양태에서, SCNE가 하루에 약 50 mg 내지 1000 mg의 범위에 속하는 복용량으로 투여될 수 있다. 일 양태에서, SCNE의 복용량이 하루에 25, 50, 75, 100, 125 또는 150 mg 또는 그들 사이의 임의의 양일 수 있다. 일부 양태에서, SCNE의 복용량이 하루에 150 mg을 초과할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE의 복용량이 하루에 160, 170, 180, 190, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 또는 1000 mg 또는 그 사이의 임의의 양일 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 캡슐의 형태로 존재할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 캡슐이 하루에 1, 2 또는 3회 경구 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 21일 또는 28일 동안 하루에 2 내지 3회 경구 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 21일 또는 28일 동안 하루에 2 또는 3회 경구 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월 또는 6개월 그 이상 동안 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물이 6개월 동안 하루에 2~3회 경구 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 바와 같이, 본원에 개시된 상기 조성물의 총 유효량이 상대적으로 짧은 기간에 걸쳐 단일 용량으로, 또는 1회분 용량으로 투여될 수 있고, 또는 다중 용량이 좀 더 장기적인 기간에 걸쳐 투여되는 분획된 치료 연구 계획서를 사용하여 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 치료를 필요로 하는 개체에 기타 치료적 방식들과 결합되어 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물이 기타 제제 또는 치료 방식을 사용한 치료에 앞서, 동시에 또는 그 후에 주어질 수 있다. 예를 들어, 본원에 기술된 바와 같이, 초임계 CO2 님 추출물이 암 치료에 사용되는 표준 요법과 함께 투여될 수 있다. 일 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물 중 임의의 것이 화학요법 또는 방사선요법과 함께 투여되거나 또는 사용될 수 있다.
약제학적 조성물
본원에 기술된 초임계 CO2 님 추출물과 본원에 기술된 약제학적 허용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, SCNE가 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 상기 조성물이 임의의 다양한 투여 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있고, 하나 이상의 생리학적으로 허용가능한 부형제를 포함하되, 이것은 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 본원에 사용된 용어 '부형제'는 '운반체' 또는 '희석제'로 일컬어질 수 있는 것을 비롯하여, 임의의 화합물 또는 물질을 의미한다. 약제학적 및 생리학적으로 허용가능한 조성물을 제조하는 것은 당해기술에서 정례적인 것으로 간주되기 때문에, 당해기술의 숙련가가 필요한 경우 지침을 얻기 위해 수많은 관계자에게 문의할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 상기 조성물이 개체에 직접적으로 투여될 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물이 전달을 용이하게 하기 위해 약제학적으로 허용가능한 운반체(예를 들면, 생리학적 식염수 또는 완충액 첨가 식염수 용액)에 현탁될 수 있다. 적절한 전달 비히클(예를 들면, 중합체성 미세입자 또는 삽입형 장치) 에 상기 조성물의 캡슐화가 전달의 효율을 증가시킬 수 있다.
일부 양태에서, 상기 조성물이 비경구용 또는 비경구 이외의 방식의 투여를 위해 다양한 방식으로 제형화될 수 있다. 적합한 경우, 경구 제형이 정제, 알약, 캡슐, 또는 분말의 형태를 띌 수 는데, 이들은 장용제로 코팅되거나 또는 달리 보호될 수 있다. 지효성 제형, 현탁액, 엘릭시르제, 에어로졸 등 또한 사용될 수 있다. 일 양태에서, 상기 조성물이 캡슐을 포함하는 형태일 수 있다.
약제학적으로 허용가능한 운반체와 부형제가 통합될 수 있다(예를 들면, 물, 식염수, 수성 덱스트로오스, 및 글리콜, 오일(석유, 동물성, 식물성 또는 합성 원료에서 유래된 것을 포함), 전분, 셀룰로오스, 활석, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루, 백악, 실리카겔, 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 나트륨, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화나트륨, 건조된 탈지유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 에탄올 등). 일부 양태에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제가 덱스트린/말토-덱스트린 또는 인산이칼슘일 수 있다. 일부 양태에서, 부형제가 제형에 따라 달라질 수 있다. 일부 양태에서, 부형제가 선택적일 수 있다. 일부 양태에서, 약제학적으로 허용가능한 부형제와 운반체가 증류수, 식염수, 글루코오스 수용액, 알코올(예를 들면, 에탄올), 계면활성제, 프로필렌 글리콜, 트윈-80 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 유성 운반체 예컨대 다양한 동물성 및 식물성 기름, 백색 소프트 파라핀, 파라핀, 밀랍, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 황색 덱스트린, 맥아 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 미세결정질 셀룰로오스, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수시럽, 락토오스, 구연산, 주석산, 사과산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리글리세린 지방 에스테르, 수크로오스 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카세인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B군, 니코틴아마이드, 판토텐산칼슘, 아미노산, 통기 또는 흄드 실리카, 칼슘염, 안료, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 조성물에 종래의 약제학적 방편, 예컨대 멸균이 실시될 수 있고, 상기 조성물이 종래의 약제학적 첨가제, 예컨대 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 삼투압 조절용 염, 완충용액 등을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 운반체와 그것의 제형이 E.W. Martin의 "Remington's Pharmaceutical Sciences"에 기술되었고, 이 내용이 본원에 참조로 편입되었다. 이와 같은 조성물이, 환자에게 적절한 투여를 하기 위한 적절한 제형을 제조하기 위해, 어떤 경우라도, 적합한 양의 운반체와 함께 유효량의 상기 조성물을 함유할 것이다.
본원에 개시된 약제학적 조성물이 경구용 투여를 위해 제조될 수 있다. 일 양태에서, 상기 조성물이 경구 투여될 수 있다. 비경구 투여를 위해 제조된 약제학적 조성물에는 정맥(또는 동맥내), 근육내, 피하, 복강내, 점막 경유(예를 들면, 비강내, 질내, 또는 직장내), 또는 경피(예를 들면, 국소) 투여용으로 제조된 것들이 포함된다. 에어로졸 흡입이 또한 사용될 수 있다. 따라서, 조성물이 허용가능한 운반체, 예컨대 비제한적으로 수성 운반체, 예컨대 물, 완충된 물, 식염수, 완충된 식염수(예를 들면, PBS) 등에 용해되거나 또는 현탁된 SCNE를 포함하는 비경구 투여용으로 제조될 수 있다. 상기에 포함된 부형제 중 하나 이상, 예컨대 pH 조절제 및 완충제제, 강직성 조절제, 습윤제, 세제 등이 생리학적 조건을 최적화하는 데 도움을 줄 수 있다. 상기 조성물에 고체 구성성분이 포함될 경우(경구 투여용으로서), 부형제 중 하나 이상이 결합제 또는 충진재(예를 들면, 정제, 캡슐 등의 제형을 위해) 역할을 할 수 있다. 일 양태에서, 상기 조성물이 액체(예를 들면, 구강세정제)의 제형을 위해 존재할 수 있다. 약제학적 조성물이 살균 상태일 수 있고, 종래의 살균 기법에 의해 살균되거나 또는 살균 여과될 수 있다. 수용액이 있는 그대로 사용되도록 패키징될 수 있고, 또는 냉동건조될 수 있는데, 냉동건조된 제제는 본 개시에 의해 포함되는 것으로, 투여에 앞서 살균된 수성 운반체와 조합될 수 있다. 약제학적 조성물의 pH가 전형적으로 3과 11 사이(예를 들면, 약 5와 9 사이) 또는 6과 8 사이(예를 들면, 약 7과 8 사이)일 것이다. 고체 형태로 생성된 조성물이 여러 개 단일 용량단위로, 예컨대 정제 또는 캡슐의 밀봉된 포장재에 포장될 수 있고, 각각은 앞서 언급된 제제 또는 여러 제제를 고정된 양만큼 함유한다. 일 양태에서, 상기 조성물이 액체 형태로 여러 용량을 포함하는 용기에 포장될 수 있다.
일 양태에서, 약제학적 조성물이 SCNE를 포함하고; 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함한다. SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 3 mg/g의 님볼라이드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 130 μg/g의 님빈을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, SCNE가 최소한 200 μg/g의 살리닌을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g일 수 있고; 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g의 님빈일 수 있고; 그리고 상기 조성물에 존재하는 살리닌이 최소한 200 μg/g일 수 있다. 일 양태에서, 약제학적 조성물이 경구 투여를 위해 제형화될 수 있다. 일 양태에서, 상기 조성물이 캡슐 또는 액체로 제형화될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 75 mg; 항산화제 예컨대, 예를 들어, 비타민 E(토코페롤) 또는 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스) CO2 추출물: 10 mg 및 호마유: 415 mg를 포함하는 치료적으로 유효한 경구 투여용 제형으로 제공될 수 있다. 상기 조성물이 500 mg의 연질 겔 캡슐에 투입될 수 있다. 일부 양태에서, 상기 캡슐이 활성 약물로서 하루에 님 잎 추출물 총 50~1000 mg을 얻기 위해 하루에 2회 내지 총 1000 mg을 얻기 위해 하루에 4회 환자에게 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 50 mg; 덱스트린/말토-덱스트린 또는 기타 운반체(예를 들면, 인산이칼슘 또는 임의의 기타 약제학적 등급 운반체) 582 mg; 및 18 mg의 통기(aerated) 또는 흄드 실리카를 포함하는 치료차원에서 유효한 경구투여용 제형으로 제공될 수 있다. 자유-유동성 분말이 제조되어, "00"크기의 경질 젤라틴 또는 식물성 캡슐에 캡슐화될 수 있다. 일 양태에서, 치료 방식이 21일 또는 28일 주기로 6주기 동안 하루에 두 번 1캡슐씩 내지 하루에 3회 3캡슐씩일 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 아자디라크타 인디카 잎에서 획득되고, 본원에 기술된 바와 같이 초임계 CO2 추출로 획득된 50 mg 님 잎 추출물의 자유-유동성 분말을 제조하기 위한 운반체로 사용되는 물 추출물을 포함하는 치료차원으로 유효한 경구투여용 제형으로 제공된다. 상기 조성물이 본원에 기술된 바와 같이 치료차원의 용량인 님 잎 CO2 추출물 150 mg을 달성하기 위해 하루에 2회 내지 님 잎 CO2 추출물 총 1000 mg을 얻기 위해 하루에 4회 투여될 수 있다.　
일부 양태에서, 본원에 기술된 상기 조성물이 SNCO2 추출물: 2.28 g, 페퍼민트(멘타 피페리타) 오일: 13.81 g, 스피어민트(멘타 스피카타) 오일: 9.26 g, 클로브버드(사이지기움 아로마티쿰) CO2 오일: 3.98 g, 트윈 80: 20.68 g을 포함하는 구강세정제로서 치료차원으로 유효한 제형으로 제공된다. 상기 혼합물 1.25 g이 염기(Base) 98.75 g에 희석되었다. 상기 염기가 물: 73.5 g, 알로에베라 물(200x): 10 g, 소르비톨: 10 g, 글리세린: 5.9 g, 아스코르브산: 0.5 g, 소르빈산칼륨: 0.1 g을 포함한다. 본원에 기술된 제형이, 앞서 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물의 치료차원의 용량인 150~1000 mg을 달성하기 위해, 하루에 1~3회, 매회 20 ml씩 투여될 수 있다. 구강세정제 제형이 구강암을 치료하거나 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 최소한 상기 추출물의 10%가 나노입자인 미세크기의 나노입자 CO2가 속도를 늘리고 입자를 마이크로젯 또는 노즐에 통과시킴으로써 제조될 수 있고, 앞서 기술된 바와 같이, 일반적인 CO2 추출물 1000 mg 대신에 치료적 유효량인 님 잎 CO2 추출물 100~500 mg을 달성하기 위해 하루에 2 또는 3회 경구투여될 수 있다.
본원에 개시된 제형이 본원에 기술된 나노입자 추출물을 사용하여 제조될 수 있다.
제조 품목
본원에 기술된 상기 조성물이 예를 들어, 암을 치료하는 요법으로 사용하기 위해 또는 본원에 개시된 임의의 방법을 위해 적합하게 표지된 용기에 패키징될 수 있다. 이에 따라, 패키징된 제품(예를 들면, 본원에 기술된 상기 조성물을 함유하고, 농축된 또는 그대로 사용할 수 있는(ready-to-use) 농도로 보관, 선적 또는 판매되도록 패키징된 살균 용기) 및 키트는, 본원에 기술된 바와 같이 최소한 SCNE와 사용을 위한 지침서를 포함하는데, 이들 역시 본 개시의 범위에 속한다. 제품이 본원에 기술된 상기 조성물을 함유하는 용기(예를 들면, 유리병, 단지, 병, 봉지 등)를 포함할 수 있다. 더불어, 제조 품목에는 추가적으로 예를 들어, 포장재료, 사용지침서, 주사기, 완충용액 또는 예방이나 치료가 요구되는 질환을 치료 또는 모니터링하기 위한 기타 통제 시약이 포함될 수 있다. 상기 제품에는 또한 범례(예를 들면, 인쇄된 표 또는 삽입물 또는 상기 제품의 사용을 설명하는 기타 매체(예를 들면, 오디오테이프 또는 비디오테이프))가 포함될 수 있다. 상기 범례는 용기와 연관될 수 있고(예를 들면, 상기 용기에 부착됨), 안에 들어 있는 화합물이 투여되어야 하는 방식(예를 들면, 투여의 회수 및 경로), 이를 위한 지시사항 및 기타 용도를 설명할 수 있다. 상기 화합물은 투여하기에 알맞게 준비되어 있을 수 있고(예를 들면, 복용량으로 적합한 단위로), 약제학적으로 허용가능한 보조제, 운반체 또는 기타 희석제를 포함할 수 있다. 대안적으로, 상기 화합물이 희석제와 희석을 위한 지침서와 함께 농축된 형태로 제공될 수 있다.
실시예
실시예 1: 님(아자디라크타 인디카) 추출물에 의한 체내에서의 구강 편평세포암종 성장 억제: 천연 님 잎 추출물로 치료함으로써 구강 편평세포암종에서 염증 케스케이드의 방해, 종양 발생 및 종양 부피의 감소.
님 나무(아자디라크타 인디카)의 잎과 껍질이 구강 질병을 치료하기 위해 수세기 동안 전통적인 아유르베다 의술에 사용되어 왔다. 본원에 기술된 실험이 이와 같은 님 잎 추출물의 사용이 OSCC의 발병 및/또는 진행을 방지할 수 있다는 가설을 검증하였다. 님 잎 추출물의 항암 잠재성을 체외 및 체내 플랫폼에서 검증하였다. 염증, 침습 및 증식의 표지자를 분석하면서, OSCC 세포주(SCC4, Cal27, HSC3)를 다양한 시점에 상기 잎 추출물로 치료하였다. SCNE의 예방효과 또한 구강암의 이소성 이종이식편 생쥐 모형과 발암물질-유도 생쥐 모형에서 평가하였다. 님 잎 추출물을 사용한 치료가 OSCC 세포 증식을 억제하였고, OSCC 세포에서 염증의 표지자의 수치를 감소시켰다. 님 잎 추출물이 상처 폐쇄를 감소시켰는데, 이는 전이의 억제를 보여주는 것이다. 이종이식된 누드마우스가 OSCC 종양 발생의 유의미한 감소와 종양 성장의 감소를 보여주었다. 님 잎 추출물은 또한 4NQO-1 생쥐 구강 발암물질 모형에서 종양과 혀 형성 이상을 유의미하게 감소시켰다. 양쪽 동물 모형 모두에서, 님 잎 추출물이 순환하는 염증성 사이토카인을 침체시켰다. 체외 및 체내 양쪽에서 OSCC의 억제 및 예방 미치는 SCNE의 화학적 예방 효과 또한 살펴보았다. 결과는 종양 증식의 눈에 띄는 감소, 염증성 표지자 및 순환하는 사이토카인의 감소를 보이는데, 이는 SCNE가 독자적인 방식으로 또는 표준 최전선 요법과 병행하여 환자의 결과를 개선시키는 예방 제제로서의 잠재력를 가졌음을 강력히 뒷받침한다.
재료 및 방법
시약. 초임계 CO2 님 추출물은 인도 사르타라의 Nisarga Ltd에 의해 제공받았다. 유기농으로 재배한 님 나무의 잎을 초임계 CO2로 가공하였다. 초임계 추출물이 용해능력이 뛰어난 유기 용매를 대체하는 이점을 가짐으로써, 유기 잔류가 전혀 남지 않아 상당히 순수한 님 추출물(SCNE)을 생산한다(Lindskog MA, Nelander H, Jonson AC, Halvarsson T. Delivering the promise of SFC: a case study. Drug Discov Today;19: 1607-12). 100% DMSO 중 50 mg/ml의 저장 용액을 체외에 사용하였다. 님볼라이드를 Biovision(#2356)에서 구입하여 100%DMSO에 용해시켜 1mg/ml의 저장용액을 제조하였다. 200mg/kg의 SCNE를 전달하기 위해 Harlan Teklad가 SCNE 식이를 제조하였다 - SNCE를 옥수수 기름에 용해시키고 남아 있는 식이 성분들과 균질하게 혼합한 후 펠릿으로 형성하였다. 셀레콕시브(PZ0008, Sigma, USA)를 100% DMSO에 용해시켜 1 mg/ml의 저장용액을 제조하였다.
인간 OSCC 세포주와 MTT 검정. SCC4와 Cal27 구강암 세포를 ATCC에서 획득하여 37℃에서 5% CO2 하에 10% 소태아혈청과 1% 페니실린/스트렙토마이신으로 보충한 DMEM에 보관하였다. SCC4 세포의 경우, 완성된 배지에 히드로코르티손을 400 ng/ml 제공하였다. 세포 치료를 위해, SCNE(Nisarga Ltd.)를 사용하여 8시간, 24시간 또는 48시간 동안 상이한 농도(1~400 μg/m)로 75% 충만 세포에 적용하였다. 실험 대상 용량은 각 세포주에 대해 IC50s를 고정시킬 것이다. 대조군 세포는 DMSO를 투여받았다. 님볼라이드를 8시간, 24시간 또는 48시간 동안 상이한 농도(1~100 μM)로 50% 충만 세포에 적용하였다. 셀레콕시브 치료의 경우, 8시간, 24시간 또는 48시간 동안 상이한 농도(1-200 ug/ml)로 세포를 치료하였다. 완전한 배지에서 밤새 세포를 배양하고, 24시간 동안 혈청을 공급하지 않은 후, 본원에 기술된 바와 같이, 비히클, SCNE, 님볼라이드 또는 셀레콕시브로 치료하였다. 추후에, 12 mM MTT(Life Technologies; Carlsbad, CA) 용액 10 μl를 각 웰에 첨가하였고, 37℃에서 4시간 동안 배양하고 DMSO로 중성화하였다. 540 nm에서 흡광도를 측정하고, 생존능 백분율을 계산하였다.
젤라티나아제 지모그람. 젤라티나아제 지모그래피를 비환원 상태에서 0.1% 젤라틴의 존재 하에 10 % SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 수행하였다. 결장암 세포를 96웰 플레이트에서 성장시켰다. 각 웰에서 배지 200 μl를 수집하고(3X의 풀) 최종부피가 20 μl가 되도록 농축시켰다. 배지(20 μl)를 시료 완충용액과 혼합하고, SDS- PAGE를 위해 끓이지 않고 적재하였다. 전기영동 이후, SDS를 제거하기 위해 실온에서 1시간 동안 겔을 트리톤 X-100(Thermo Scientific, MA)을 함유한 1X 지모그람 재생 완충용액에서 2회 세정하였다. 이어서 37℃에서 48시간 동안 상기 겔을 기질(Thermo Scientific, MA)을 함유한 1X 지모그람 현상 완충용액에서 배양한 후, 60분 동안 50% 메탄올과 10 % 빙초산 중 0.5% 쿠마시 블루 R250으로 염색하고, 오염물질을 제거하였다. 효소의 재생 시, 젤라티나아제가 상기 겔에 있는 젤라틴을 소화시키고, 진하게 염색된 배경에 선명한 띠를 제공한다. 단백질 표준과 2% 소태아 혈청(양성 대조군)을 동시에 가동하여, 알려진 단백질(PMID 28440509)의 상대적 움직임을 플롯팅하여, 적절한 분자량을 결정하였다.
세포 이동 검정. SCC4, Cal27 및 HSC3 세포를 완전한 성장 배지를 함유한 96-웰 플레이트에서 배양하였다. WoundMaker를 하용하여 스크래치를 내고 IncuCyte ZOOM 실시간 이미징 장치(Essen BioScience, MI, USA)를 사용하여 시각화하였다. 20 또는 60 μg/ml의 SCNE로 또는 10 또는 50 μM의 님볼라이드로 세포를 치료하고, 72~120시간 동안 3시간 간격으로 이미지화하여 세포 이동과 상처 치료를 모니터링하였다.
단백질 발현. 세포 단백질 추출물을 제조하고 앞서 기술된 바와 같이 단백질을 정량화하였다. 요약하면, 세포를 1x PBS로 2회 세정하고, 긁기 작업을 통해 수집하여 4℃에서 300 g로 6분 동안 원심분리하였다. 상기 펠릿을 완충용액 A(10 mM Tris-HCl pH 7.8, 10 mM KCl, 1.5 mMmgCl2, 단백질 분해효소 억제제(정제1개) 및 물) 250 μl에 재현탁하고, 얼음에서 10분 동안 배양하였다. 그러고 나서, 시료를 15,000 rpm으로 45초 동안 얼음 위에서 균질화하고, 4℃에서 4,600 g로 5분 동안 원심분리하였다. 상청액을 제거하여 세포액 단백질 분획으로서 -80℃에 저장하였다. 수집한 펠릿을 완충용액 B(210mM Tris-HCl pH 7.8, 420mM KCl, 1.5mMmgCl2, 20% 글리세롤, 단백질 분해효소 억제제(정제 1개) 및 물) 100μl에 재현탁하고, 이어서 4℃에서 30분 동안 부드럽게 교반하고 4℃에서 10,000 g으로 10분 동안 원심분리하였다. 상청액을 수집하여 핵 단백질 분획으로서 -80℃에 저장하였다. 세포액 또는 핵 단백질 분획 50마이크로그램을 SDS-PAGE(12% 겔)로 분리하고, PVDF 막(Bio-Rad, USA)으로 이동시켰다. 상기 막을 원발성 항체(Cell Signalling, USA) NFkB p65(8242S), STAT3(8768S) pSTAT3(9131S), COX1(9896S), COX2(12282S), EGFR(4267S), pEGFR(4404S), ERK1/2(T202/Y204 - 9101S), AKT(9272S), pAKT(9271S)로 탐침하고, 이어서 겨자무 과산화효소-접합 항-토끼(7074S)로 탐침하였다. GAPDH(2118S) 또는 Topo IIα(12286S)를 사용하여 동등한 단백질 적재를 보장하였다. 화학발광 기질(Clarity ECL, Bio-Rad)을 사용하여 ChemiDoc Touch(Bio-Rad, USA) 상에 면역반응 띠를 시각화하여다. 띠는 ChemiDoc 소프트웨어(Bio-Rad)로 수량화하였다.
동물. 병원체가 없는 조건 하의 공기경계층(laminar air-flow) 캐비닛에서 6주령의 가슴샘 없는 암컷 누드 마우스(Harlan, Indianapolis, IN)를 사용하였다. 온도와 습도를 조절하고 임의로 먹이와 물을 제공하며 12 시간 밤낮의 일정을 제공하였다. 연구 시작에 앞서 1주일 동안 마우스를 적응시켰다.
OSCC 생쥐 이종이식편 모형. 앞서 기술된 바와 같이 살균 PBS 0.2 ml 중 3×106 HSC3 또는 10x106 SCC4 또는 6 x 106 Cal27 세포를 피하주사로 생쥐 오른쪽 옆구리에 주입하였다. 생쥐에게 24시간 동안 AIN76A 합성 식이를 제공하였다. 이어서 SCNE 식이(200 mg/kg)를 님 치료군에 제공하고, 이어서 대조군은 AIN76A 식이를 유지하였다. HSC3 동물군의 경우, 5일 연속으로 님볼라이드를 장관내로 주입하고, 10일차에 생쥐 체중 1kg 당 5 mg 또는 20 mg의 님볼라이드로 종양후 주사를 시작하였다. 타원형 공식1/2(길이 x 너비2)(Jensen MM, Jorgensen JT, Binderup T, Kjaer A)로 종양 부피를 계산하였다. microCT로 측정한 생쥐 피하 이종이식편에서의 종양 부피가 18F-FDG-microPET 또는 외부 캘리퍼로 측정한 것보다 더 정확하고 재현가능했다. BMC Med Imaging 2008; 8:16). 사이토카인 분석을 위해 종료 시 혈액을 뽑고 혈청을 단리하였다.
CBA 발암물질에 유도된 구강암 모형. CBA 생쥐 20마리에 AIN76A 또는 200mg/kg SCNE 식이를 실시하고, 식수에 100 μg/ml의 4-NQO-1(Sigma)를 주었다. 상기 생쥐에게 8주 동안 4NQO-1 물을 계속 마시게 했고, 이어서 4주 동안 일반 물을 마시게 했다. 12주차에 혈청 사이토카인 분석을 위해 종료 시 혈액을 뽑았고, 혀를 잘라내어 포르말린에 고정시켰다.
면역조직화학. 포르말린에 고정된 혀에 파라핀을 내장시킨 후 1 마이크론으로 얇게 잘랐다. 하기 항체(Abcam: PCNA ab18197; Ki-67 ab16667; c-Met ab51067)를 사용하여 앞서 공개된 방법(PMID 27167203)에 따라 면역염색을 실시하였다.
사이토카인 및 케모카인 검정. 종료 시 혈청 사이토카인/케모카인 프로파일을 취하고, Bio-Plex Pro 그룹 1 생쥐 사이토카인 23-plex 검정 키트를 사용하여 분석할 때까지 -80℃ 에서 저장하고, 이어서 Bio-Plex 200 Luminex-기반 다중 분석장치(Bio-Rad, Hercules, CA)로 분석하였다.
통계적 분석. GraphPad Prism4(San Diego, California)를 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다. 일방향 ANOVA 및 Bonferroni's 사후 검증에 의해 세포 생존능과 이동 검정을 분석하였다. 종양 성장의 통계적 분석을 반복된 측정으로 변동 분석을 사용하여 Bonferroni 사후 검증으로 수행하였다. 0.05 미만의 p 값이 통계학적으로 유의미하다고 판단하였다.
결과
SCNE와 님볼라이드는 구강 편평암 세포 성장을 억제한다. 님 잎 추출물 중 단일 화합물인 님볼라이드의 효과 뿐만 아니라 주로 알코올로 유도된 님 추출물의 일부 항암효과에 대한 사전 보고서가 존재했다. 하지만, 오늘날까지 님 잎의 초임계 CO2 추출물을 함유한 무용매 소수성 및 친수성 구성 성분의 항암 잠재력을 조사한 보고서는 없었다. SCNE와 님볼라이드를 활용하여, 다양한 용량과 세 시점(8시간, 24시간, 48시간)에서 세 가지 상이한 OSCC 인간 세포주를 치료하여 세포독성 농도 및 IC50을 결정하였다(도 1a~d). 상기 SCNE가 검정에 사용된 세 시점에 50 μg/ml의 SNCE(도 1a, 1c) 및 세 시점 동안 15 μM의 님볼라이드(도 1b, 1d)의 IC50에서 용량 및 시간 의존적 방식으로 세포 성장을 감소시켰다. 이어서 상기 SCNE 및 님볼라이드 세포독성 효과를 표준 비스테로이드 항염증성, 셀레콕시브와 비교하였다(도 1e~f). 8시간 및 24시간 치료에서, 셀레콕시브의 IC50은 75 μM이었고, 48시간에 유사한 IC50은 님볼라이드에 비해 눈에 띄게 낮았다. 이러한 결과는 SCNE와 님볼라이드가 표준 NSAID와 유사한 또는 그것보다 약간 높은 OSCC 세포에 대한 세포독성 효과를 가짐을 보여준다. 이와 같은 데이터로부터, 작용기전을 좀 더 이해하기 위해 20 및 60 μg/ml의 SCNE와 10 및 50 μM을 선택하였다.
SCNE와 님볼라이드는 염증 매개체를 하향조절하였다. SCNE와 님볼라이드의 작용기전을 설명하기 위해, OSCC 세포주 3개를 SCNE 20 μg, 60 μg/ml과 님볼라이드 10 mM, 50 mM로 치료한 후, 세포액 및 핵 단백질 분획에 대해 분석하였다(PMID 27167203). 보고서는 세포 증식자 STAT3, AKT 및 ERK1/2 뿐만 아니라 염증 표지자, 예컨대 NFkB, 사이클로옥시게나아제가 OSCC에서 상승됨을 보여주고 있다. SCNE 또는 님볼라이드로의 치료가 COX1에 최소한의 영향을 미치면서 COX2의 수치를 적절히 감소시키지만(도 2) SCNE와 님볼라이드의 더 높은 용량에서는 NFkBp65에 약간의 영향을 미침을 관측하였다. SNCE와 님볼라이드 모두 pSTAT3, pAKT 및 pERK1/2의 급격한 하향조절을 보여주었다. 하지만, 치료에 대한 반응으로 EGFR와 pEGFR에는 어떤 변화도 관측되지 않았다. 핵산분해효소에서는, SCNE와 님볼라이드가 NFkBp65 및 pERK1/2에 대해 더 강력한 감소를 보여주었다. SCNE와 님볼라이드에 대한 반응으로, STAT3과 pSTAT3 감소에서 유사한 추세가 또한 관측되었다. 이와 같은 결과는 OSCC에서 SCNE와 님볼라이드의 항염증성 및 항증식성 효능을 확인시켜준다.
SCNE와 님볼라이드는 체외 세포 이동을 억제한다. 체외 검증 결과는 염증 매개체와 세포증식 표지자의 하향조절을 통한 OSCC에 강한 세포독성 효과를 시사한다. SCNE와 님볼라이드의 항암 잠재성을 좀 더 잘 이해하기 위해, 이들의 항전이성 효과를 평가하였다. 상처 치유 검정을 활용하여, SCNE와 님볼라이드 모두 유의미하게 세포 이동을 감소시킴(도 3a~b)을 관측하였다. 상기 고이동성 세포주 HSC3가 8시간 후 상처를 축소시켰으나(90%), SCNE와 님볼라이드는 폐쇄의 10% 미만으로 이와 같은 폐쇄(closure)을 억제하였다. 이동성이 낮은 세포주 SCC4에서, SCNE와 님볼라이드는 상처를 가로지르는 세포 이동을 유사한 방식으로 중지시켰는데, 이것은 120시간 후에 발생하였다(도 3a~b). Cal27 세포는 이동성이 있는 세포는 아니지만, SNCE와 님볼라이드가 치료받지 않은 군과 비교할 때 세포 이동을 약간 억제하였다. 세포 이동의 동요에서 이와 같은 강력한 결과가 보인다는 점을 고려하여, 2가지 금속 단백질 분해효소 단백질인 MMP2와 MMP9에 대한 SCNE와 님볼라이드의 효과를 평가하였다. 이동성이 높은 HSC3 OSCC 세포주에서, SNCE와 님볼라이드는 MMP9에서 약간의 감소와 함께 MMP2 활성을 감소시켰다. SCC4 세포주에서는, SCNE와 님볼라이드에 의해 MMP9가 급격하게 감소하였고, MMP2에는 변화가 거의 없었다. 비이동성 Cal27 세포주의 경우, SCNE 치료로 인해 MMP2 활성이 님볼라이드 치료로 인해 MMP9이 약간 감소하였다. 종합해보건대, 체외 결과는 증식성 표지자의 하향조절, 염증성 표지자의 감소 및 세포 이동의 감소를 통해 SCNE와 님볼라이드의 강력한 항-종양 효과를 시사한다.
SNCE와 님볼라이드는 생쥐에서 OSCC-유래 종양 성장을 억제한다. OSCC 실험의 결과를 입증하기 위해, 이종이식된 생쥐 모형에서 동일한 3개 세포주(도 4)를 사용하였다. 치료차원의 님 추출물을 전달하기 위해 200mg/kg의 SCNE를 식이에 포함시켰고, 합성 AIN73A 식이를 대조군으로 사용하였다. 하나의 세포주 HSC3에서, 5일 연속 5 mg 또는 20 mg의 님볼라이드를 복강내로 주입하였다. 종료 시에, 치료받지 않은 대조군과 비교하여, SCNE 식이가 SCC4 종양 부피(81%) 및 Cal27 부피(49%)를 유의미하게 감소시켰다(도 4a). SCNE가 HSC3 종양 부피(49%)를 감소시켰으나, 높은 변동은 유의미한 결과를 생산하지 못했다. 20 mg/kg 님볼라이드 치료는 종양 부피를 유의미하게 감소시켰고(69%), 5 mg/kg은 부피의 약간의 감소(40%)를 보여주었다(도 4b). 실험 팔 사이에 체중 데이터는 비교할 만 하였다(데이터 명시되지 않음). 이와 같은 데이터가 SCNE와 님볼라이드 양쪽 모두 체내에서 엄청난 항-종양 활성을 가짐을 확인해 준다.
SCNE와 님볼라이드가 이종이식된 생쥐에서 혈청 수치 염증성 사이토카인을 감소시킨다. 순환하는 염증성 사이토카인 집단에 SCNE가 미치는 영향을 조사하기 위해 사용한 상기 생쥐의 혈청(도 8)을 분석하였다. 상기 추출물은 IL-1b, TNFα, IFNγ 및 IL-6 혈청 수치를 강하게 감소시켰다. IL-1α의 경우, 이종이식된 생쥐에서 식별된 IL-1α의 수치에 약간의 감소가 있었다. IL-10의 경우에도 유사한 패턴이 관측되었으나, HSC3 종양을 품은 생쥐에서는 더 강력한 감소가 발생하였다. 이들 동물들의 수많은 기타 사이토카인을 살펴보았고(도 6), 전반적인 SCNE 치료가 대조군과 비교하여 상이한 프로파일을 생산하였다. 종양 부피 감소와 함께, 상기 데이터는 SCNE가 종양 부담 및 유해한 염증성 사이토카인을 감소시킬 수 있음을 시사한다.
SCNE가 OSCC의 4NQO-1 생쥐 모형에서 종양 성장을 억제한다. SCNE의 체내 항암 잠재력을 추가로 검증하기 위해, CBA 균주 중 4-NQO-1 유도 혀 OSCC 모형을 설립하였다. 8주 동안 식수를 통해 4NQO-1(50 μg/ml)을 투여하였고, 이어서 이후 4주 동안 일반 물로 그것을 대체하였다. 대조군 생쥐에 임의로 AIN73A 식이를 먹이고, 치료군에는 총 12주 연구기간 동안 동일한 200 mg/kg의 SCNE 식이를 먹였다. 상기 식이의 기호성을 평가하기 위해, 2주마다 생쥐 체중을 측정하였고, 생쥐는 체중 증가에 차이를 전혀 보이지 않았다(도 5a). 종료 시, 어떤 형성 이상 및/또는 종양의 유무를 확인하기 위해 혀의 병리생리학을 검사하였다. 대조군과 비교하여, SCNE가 조기 형성 이상을 유의미하게 감소시켰고, OSCC 종양에 66% 감소를 야기하였다(도 5b). 혀에서 증식성 표지자의 발현 수치는 또한 면역조직화학에 의해 특징이 규명되었고, SCNE가 PCNA, Ki-67 및 c-Met 단백질 수치(도 5c)를 감소시킴이 발견되었다.
SCNE가 OSCC의 발암물질 유도 생쥐 모형에서 혈청 염증성 사이토카인을 감소시킨다. 이들 생쥐의 병리생리학과 더불어, 혈청 순환 사이토카인 염증성 집단을 검사하였다. SCNE가 이들 동물에서 IFNγ, IL-1β 및 TNFα 수치를 유의미하게 감소시켰다(도 8). 12 주의 SCNE 식이 소비 후, 기타 2개의 사이토카인인 IL-6(30%)와 IL-1α(25%) 수치가 감소되었다. 이들 동물들의 수많은 기타 사이토카인을 검사하였고(도 7), 전반적으로 SCNE와 님볼라이드 치료가 대조군과 비교하여 상이한 프로파일을 생산하였다. 이와 같은 패턴은 이종이식편 동물 연구에서 유사한 감소를 따르는데, 이는 SCNE의 항암 및 항염증성 효과를 추가로 시사한다.
논의
OSCC에서 SCNE의 항암 효과의 발생이 주요 종양 증식 표지자의 하향조절 및 염증 조절제의 감소를 통해 드러났다. 님 잎 추출물은 상처 폐쇄를 감소시키며, 전이의 억제를 보여주었다. 이종이식된 누드마우스는 OSCC 종양 발생의 유의미한 감소 및 종양 성장의 감소를 보여주었다. 님 잎 추출물은 또한 4NQO-1 생쥐 구강 발암물질 모형에서 종양 및 혀 형성 이상을 유의미하게 감소시켰다. 2가지 암 동물 모형에서, 님 잎 추출물은 순환 염증성 사이토카인을 침체시켰다.
현재, OSCC 암이 증가하고 있고, 임상에서 대부분의 화학요법은 제2의 선택안이 전혀 없이 표준화된 다양성을 보여주고 있다. 이와 같은 상황을 개선하기 위해, 신규 제제 및 병행 요법을 갖는 새로운 치료법이 이와 같은 문제를 극복할 수 있을 것이다. 예를 들어, COX2 발현이 OSCC 경우에 상승되어 방사성 저항성에 기여함이 보여진 바 있다.
생물의학적 특성으로 유명한 SCNE가 체외 및 체내에서의 OSCC의 억제 및 예방에 미치는 화학적 예방 효과를 검사하였다. 본원에 기술된 데이터가 종양 증식의 괄목할 만한 감소, 염증성 표지자의 감소, 그리고 순환 사이토카인을 보여준다. OSCC 최전선을 위한 임상 치료 선택안 및 제2의 요법의 부족으로, 이와 같은 추출물이 환자의 결과 및 재발한 환자에게서 저항성 있는 재발된 종양을 개선시키기 위해 단독 방식으로 또는 표준 최전선 요법과 병행하여 예방 제제로서 사용될 수 있을 것이다.
실시예 2: 님 잎( 아자디라크타 인디카 )의 초임계 CO 2 추출물과 그것의 생-활성 리미노이드인 님볼라이드가 전염증성 경로를 조절함으로써 임상전(preclinical) 모형에서 결장암을 억제한다.
CRC에서 님의 역할을 탐구하기 위해, 인간 결장암 세포주인 HCT116과 HT29 세포를 정제 초임계 님 추출물(SCNE) 또는 님볼라이드로 치료하였다. SCNE 치료가 CRC 세포 증식의 용량의존적 억제 및 세포자멸사의 증가를 보여주었다. SCNE와 님볼라이드 둘 다의 치료가 p65의 불량한 핵 위치, CRC 세포에서 전사 인자 포스포릴레이트 STAT3과 친염증성 사이토카인 COX1, COX2, IL-6 및 TNF-α의 단백질 발현의 감소에 의해 항염증성 효과를 보였다. 웨스턴 블랏과 지모그람 결과가 SCNE로의 치료에서 CRC 세포 중 MMP2와 MMP9 단백질의 발현 감소에 의해 항침습성 효과를 보여주었다. 전반적으로, 이와 같은 데이터가 세포 증식, 염증, 이동 및 침습을 감소시키고, 인간 결장암 세포에서 세포자멸사를 유도하는, SCNE의 잠재적 항암효과를 확인시켜준다.
재료 및 방법
세포주와 세포 배양액. 인간 결장암 세포주 HCT116과 HT29를 American Type Culture Collection(ATCC)에서 획득하였다. 이들 세포주 모두 피루베이트, 비타민, 아미노산, 항생제 및 10% 소태아 혈청으로 보충한 McCoy's 5A 배지에서 배양하였다. 래트 결장 정상 상피 세포주 IEC6는 American Type Culture Collection [IEC6](ATCC®　CRL­1592™)에서 획득하였다. IEC6 세포를 4　mM　L-글루타민,　1.5　g/L의 중탄산나트륨, 4.5 g/L의 글루코오스, 0.1 Unit/ml 소 인슐린 및 10% 소태아 혈청을 함유한 Dulbecco's 변형된 Eagle's 배지 (DMEM)에서 배양하였다. 상기 배양액을 5% CO2하의 가습 배양기에서 37℃로 유지하였다. 단백질 및 유전자 발현에서 용량의존적 변화를 결정하기 위해, 상이한 농도의 초임계 추출물 님 추출물, SCNE(Nisarga, India)와 님볼라이드(Biovision, USA) 또는, 필요한 경우 상이한 시점에 비히클로서 같은 부피의 디메틸 술폭사이드(DMSO)로 세포를 치료하였다.
세포 생존능 검정. 정상적인 래트 결장 세포 IEC-6 세포 뿐만 아니라 대장암세포, HCT116과 HT29를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음 날 24시간 동안 상기 세포에 혈청을 공급하지 않고, 48시간 및 72시간 동안 SCNE(0~150 μg/mL)와 님볼라이드(1~100 μM)으로 치료하였다. 치료 후, 제조사의 지침에 따라, MTT [3-(4, 5-디메틸티아졸-2-yl)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드] 검정(Sigma Aldrich, MO)으로 세포 생존능을 측정하였다. 요약하면, MTT(5mg/mL)을 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 각 웰에 디메틸 술폭사이드를 첨가하였다. 마침내, 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 540 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. 이와 같은 결과를 치료 받지 않은 세포 대비 생존 세포의 백분율로 표현하였다.
이동 스크래치 검정. IncuCyte ZOOM 시스템 (Essen BioScience, Inc., MI)을 사용하여 이동 검정을 수행하여 함으로써 SCNE와 님볼라이드 치료를 받은 그리고 상기 치료를 받지 않은 결장암 세포의 이동을 측정하였다. 각 웰에서 충만된 세포에 상처를 만들고(10회 복제), 제한된 시기 동안 0시간에 치료받지 않은 세포를 배경으로 상처 경계를 피복함으로써, 세포의 내성장(ingrowth)을 계산하여 상처 폐쇄를 측정하였다.
웨스턴 블랏 분석. HCT-116과 HT-29 세포를 100 mm 배양접시에서 충만하게 성장시켰다. 24시간 동안 세포에 혈청을 공급하지 않았다. 다음 날, 48시간 동안 37℃에서, 상기 세포를 비히클(DMSO) 대비 상이한 용량의 SCNE와 님볼라이드로 치료하였다. 전체 세포 용해물을 RIPA 용해 완충용액으로 준비시켰다. 핵 단백질 추출: 치료받지 않은 및 치료 받은 HCT-116과 HT-29 세포를 저염 용해 완충용액(10 mM HEPES, 10 mM KCl, 1 mM EDTA)와 함께 10분 동안 얼음 위에서 유지시키고, 이어서 긁어 낸 후 원심분리로 세포를 가라앉혔다. 펠릿을 수집하고, 50~100 μl의 고염 용해 완충용액을 첨가하여 30분 동안 중간에 교반하면서 얼음 위에서 배양하였다. 시험관을 원심분리하여 세포를 가라앉히고, 상청액에서 핵 단백질을 수집하였다. Pierce BCA 단백질 검정 키트(Thermo Scientific, MA)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다.
단백질을 동일한 양으로 7.5%, 10% 및 12% SDS_PAGE 상에 분리하였다. 이어서, 단백질을 단백질 블롯팅(Bio Rad, CA)을 위해 면역-블롯 PVDF 막으로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 0.1% 트윈-20(TBST)을 함유한 트리스-완충된 식염수 중 5% 무지방 우유로 차단하였다. COX1(Cell Signaling Technology, MA), COX2(Cell Signaling Technology, MA), Bcl-2(Abcam, MA), Bax1(Abcam, MA), TNF-α COX2(1:500; Cell Signaling Technology, MA), IL-6(Cell Signaling Technology, MA), 사이클린 D1(Cell Signaling Technology, MA), p65(Abcam, MA), IKKβ(Abcam, MA), MMP2(Abcam, MA), MMP9(Abcam, MA), pSTAT3(Y705)(Cell Signaling Technology, MA), 토포이소머라아제(Abcam, MA) 및 GAPDH(Sigma-Aldrich, MO)에 대한 항체를 5% 탈지유에 희석시켰다. 겨자무 과산화효소-접합 염소 항-토끼(Abcam, MA) 항체를 2차 항체로 사용하였다.
젤라티나아제 지모그람: 젤라티나아제 지모그래피를 비환원 상태 하에서 0.1% 젤라틴의 존재 하에 10 % SDS 폴리아크릴아마이드 겔에서 수행하였다. 결장암 세포를 96-웰 플레이트에서 성장시켰다. 각 웰에서 배지 200 μl씩을 수집하고(3X의 풀), 최종 부피 20 μl로 농축하였다. 배지(20 μl)를 샘플 완충용액과 혼합하여 끓이지 않고 SDS- PAGE 를 위해 적재하였다. 전기 영동 후, 실온에서 1시간 동안 겔을 트리톤 X-100(Thermo Scientific, MA)을 함유한 1X 지모그람 재생 완충용액으로 2회 세정하여 SDS를 제거하였다. 그러고 나서, 겔을 37℃에서 48시간 동안 기질(Thermo Scientific, MA)을 함유한 1X 지모그람 현상 완충용액에서 배양하고, 60분 동안 50% 메탄올과 10% 빙초산에서 0.5% 쿠마시 블루 R250으로 염색 후 염색을 제거하였다. 효소의 재생 시, 젤라티나아제가 상기 겔 중 젤라틴을 소화시키고, 강하게 염색된 배경에 선명한 띠를 제공한다. 단백질 표준 및 2% 소태아 혈청(양성 대조군)을 동시에 구동하여, 알려진 단백질(25997494)의 상대적 움직임을 플롯팅함으로써 적합한 분자량을 결정하였다.
면역형광 현미경 검사: 휴지기 인간 CRC 세포를 다중웰 플라스틱 챔버 슬라이드에서 성장시키고, 48시간 동안 SCNE 또는 님볼라이드로 치료하였다. 연구 종료 시, 세포를 얼음처럼 차가운 PBS로 2회 세정하고, -20℃에서 5분 동안 메탄올에 고정시켰다. 간단히 세정한 후, 세포를 PBS 중 0.1% BSA로 차단한 후, 간접적 면역형광을 사용하여 p65로 염색하였다. 알렉사 플루오르 594 당나귀 항토끼 항체가 2차 항체 (Thermo Fisher Scientific, MA)로 기능했다. 염색한 세포를 PBS로 세정하고, DAPI(Thermo Fisher Scientific, MA)를 함유한 prolong Gold antifade 시약을 위에 첨가하고, 그 위에 유리 덮개를 씌운 후, Zeiss LSM710 공초점 현미경(Carl Zeiss Microscopy, LLC, NY)을 사용하여 관찰하고 사진을 찍었다.
결과
SCNE와 님볼라이드가 인간 CRC 세포에서의 증식을 억제하였다. 인간 CRC 세포에 대한 SCNE의 효과를 평가하기 위해, MTT 검정을 사용하여 세포 생존능을 분석하였다. SCNE와 님볼라이드가 CRC 세포에 직접적인 효과가 있는지 여부를 조사하기 위해, SCNE와 님볼라이드에 의해 유발되는 증식 억제를 정상적인 설치류 결장 세포주 IEC-6 뿐만 아니라 HCT-116과 HT-29 인간 CRC 세포주에서 MTT 검정을 통해 검사하였다. 상이한 농도의 SCNE와 님볼라이드로 48시간 및 72h시간 동안 HCT-116과 HT29를 치료하자, 세포 생존능의 감소라는 결과가 나왔다(도 9). 정상적인 설치류 결장 세포주 성장(IEC6)은 SCNE나 님볼라이드의 영향을 받지 않았다. 이와 같은 결과는 SCNE가 농도 및 시간 의존적 방식으로 CRC 세포 생존능을 억제할 수 있음을 보여준다. SCNE와 님볼라이드에 대한 IC50을 각각 <75 μg/ml 및 <10 μM이라고 결정하였다. 추가적인 실험에서, 48시간 동안 CRC 세포를 SCNE 용량 40 μg/ml 및 75 μg/ml으로, 그리고 님볼라이드 용량 5 μM 및 10 μM으로 치료하였다.
SCNE가 CRC 세포에서 세포자멸사를 유도하였다. 암의 유발 중에 세포자멸사의 억제가 일부 암의 발달 및 진행에 중심 역할을 하는 것으로 여겨진다. 종양 세포는 항-세포사멸적 단백질, 예컨대 Bcl-2의 발현에 의해 또는 친-세포사멸적 단백질, 예컨대 Bax의 하향조절에 의해 세포자멸사에 대한 저항을 획득할 수 있다. SCNE 치료로 인한 세포자멸사의 유도와 그것의 조절 단백질의 발현 사이의 관계를 밝히기 위해, 세포자멸사 조절 단백질의 발현을 조사하였다. SCNE가 HCT116과 HT29 세포 모두에서 항-세포사멸적 표지자 Bcl-2 단백질의 발현 및 친-세포사멸적 표지자 Bax 단백질의 상향조절의 감소를 초래하였고(도 10a), 이것은 HCT116과 HT29 세포에서의 님볼라이드 치료(도 10b)와도 유사했다.
사이클린 D1은 세포 주기의 G1 단계를 통한 진행에 필요한 단백질이다. 사이클린 D1의 과발현이 조기암 발병 및 종양 진행과 상관관계가 있음이 밝혀진 바 있다. CRC 세포주가 사이클린 D1 단백질의 높은 발현을 보여주었는데, 이 발현이 48시간 동안 SCNE와 님볼라이드로 치료 시 유의미하게 감소되었다(도 10).
SCNE가 인간 CRC 세포의 이동을 억제하였다. 이어서 SCNE와 님볼라이드의 세포 항증식 및 세포사멸적 활성이 세포 이동의 억제 가능성으로 해석되어, 침습의 잠재적 억제를 예상할 수 있는지 여부를 결정하였다. 이것을 검사하기 위해, IncuCyte ZOOM 시스템을 사용하여 이동 검정을 수행함으로써 SCNE와 님볼라이드 치료의 존재 또는 부재 하에 CRC 세포의 이동을 측정하였다. SCNE와 님볼라이드는 둘 다 HT-29 인간 결장암 세포에서 용량의존적 방식으로 72시간 치료 후 상처 폐쇄를 억제하였다(도 11).
SCNE는 CRC 세포에서 항염증성 활성- NF-κB/ IL-6/ STAT3 발현을 보인다. NF-κB 및 STAT3은 염증과 관련된 수많은 유전자의 발현을 조절한다. CRC 세포주 HCT-116과 HT-29에 대한 SCNE와 님볼라이드 치료가 항염증성 효과를 보이는지 여부를 결정하기 위해, CRC 세포주에 대한 SCNE와 님볼라이드 치료의 영향을 평가하였다. 여기서 HCT-116과 HT-29 세포를 IC50의 SCNE와 님볼라이드로 48시간 치료한 결과, 세포질에서 세포핵으로의 p65의 전좌가 감소하였고(도 12a, 12b, 12c) pSTAT3 단백질 발현이 감소하였는데, 이것은 세포핵에서 사용가능한 NF-κB와 STAT3 전사 인자의 손실을 보여준다.
IL-6과 TNF-α는 친-염증성 사이토카인으로 암의 경우 고발현된다. 본원에 기술된 실험의 결과에 따르면, SCNE와 님볼라이드로의 CRC 세포주의 치료가 IL-6 및 TNF-α 단백질의 발현을 눈에 띄게 감소시켰다(도 12d, 12e).
COX1이 인간 결장 조직에서 본질적으로 발현되는 반면, 종양유전자 인자, 예컨대 COX2는 결장 종양생성에 관여해 왔다. 실험 결과는 SCNE와 님볼라이드 치료가 CRC 세포주에서 OX1과 COX2 모두의 단백질 발현을 감소시켰음을 보여주었다(도 12d, 12e). 종합해보건대, 이러한 데이터는 SCNE와 님볼라이드가 CRC 세포주에 대해 항염증성 효과가 있음을 보여주었다.
SCNE가 인간 CRC 세포에서 침습을 억제하였다. MMP가 침습, 이동, 전이 및 종양생성에 관여해왔다. 식별된 바 있는 여러 MMP 중에서, 젤라티나아제, 특별히 MMP-2(젤라티나아제 A)와 MMP-9(젤라티나아제 B)가 ECM의 2가지 주요 구성성분인 IV 유형 콜라겐과 젤라틴의 분해에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 금속단백질분해효소가 역할을 했음을 검토하기 위해, 비히클 대비 SCNE와 님볼라이드로 치료된 HCT116과 HT29 세포의 젤라티나아제 지모그래피를 수행하였다. HCT116과 HT29 세포가 무혈청 배지에서 MMP2의 강력한 분비를 입증하였는데, 이것이 48시간 치료 후 SCNE와 님볼라이드에 의해 억제되었다(도 13a, 13b). 상기 배지에서 더 많은 MMP2 발현은 겔에서 젤라틴의 더 많은 소화와 직접적으로 상관관계가 있는데, 이것이 치료받지 않은 세포에서 선명한 띠를 초래하였다. 인간 CRC 세포주의 웨스턴 블랏 분석은 치료받지 않은 세포에서 MMP2와 MMP9의 높은 발현을 보여주었다. SCNE와 님볼라이드로의 대장암 세포의 치료가 MMP의 발현을 유의미하게 감소시켰다.
논의
결장암으로 인한 높은 사망률과, 현재 화학요법 방식의 유의미한 질병률, 명백한 독성 및 저조한 반응률을 고려할 때, 독성 프로파일이 없는 신규한 치료 방식을 찾고자 하는 강력한 요구가 존재해 왔다. VEGF에 대한 표적 치료법(베바시주맙) 또는 EGFR에 대한 표적 치료법(세툭시맙)이 현재 CRC에 대한 치료로 널리 사용된다. 하지만, 환자가 그와 같은 치료에 내성을 갖게 되고; 따라서 새로운 치료법이 현재의 치료법을 대체하거나 또는 보완할 필요가 있다. 식이 변경이 여러 유형의 암의 위험 및 발병률에 폭넓은 차이를 야기할 수 있다. 추가적으로 안정성이 입증된 과일 및 향신료에 존재하는 자연 생성물의 장기적인 소비가 암의 화학적 예방에 효용성을 갖는다. 안전하고 무독성인 신규식물 유래 제제를 사용한 종양 예방 접근법이 여러 과학자들에 의해 강화되어져 왔다. 수많은 자연 생성물들이 항암제제로서 잠재적 용도에 대한 연구 대상이 된 바 있다. 님은 그와 같이 입증가능한 항암 특성을 갖는 천연 약초 중 하나이고, 테트라노르테르페노이드라고 불리는 산소화된 트리테르펜 부류인, 여러 리모노이드의 원료이다. 이와 같은 리모노이드가 님 잎 추출물(NLE)의 항-종양 효과에 역할을 한다. 하지만, 대장암세포 증식과 전이의 억제에 대한 근본 기전은 여전히 해명되어야 한다.
본원에 기술된 바와 같이, CRC 세포 및 동물 모형에서 친염증성 경로의 조절을 통해 SCNE가 CRC에 대한 항암 활성을 발휘할 수 있는지 여부를 조사하였다. 다양한 농도의 SCNE의 부재 또는 존재 하에 MTT 검정을 사용하여 세포 생존능을 평가하였다. SCNE가 CRC 세포에서 증식, 이동을 억제하고 세포자멸사를 유도하였음이 밝혀졌다. 따라서, 본 연구에서 관측된 SCNE의 항-증식 및 항-이동 효과는 그것의 암 예방 효과에 의존했다. 님볼라이드가 G1/S 단계에서 세포 주기 멈춤을 유발시켰다. 명백하게, 님볼라이드가 사이클린 A 수치를 감소시키는 것으로 밝혀졌는데, 이것이 결장암 세포가 S 단계로 진행하기 위해 요구되는 것이고, 그럼으로써, 세포 주기 멈춤을 유도하였고 세포 성장의 억제를 초래하였다. 항-세포사멸적 단백질과 친- 세포사멸적 단백질이 caspase3의 활성의 수준을 조절한다. 전립선암 세포에서 님볼라이드 치료가 항-세포사멸적 단백질(Bcl-xL, Bcl-2, 수르비빈, caspase 억제 분자)의 발현을 감소시키고, 친-세포사멸적 단백질(사이토크롬 c, Bax, Bad, Bid, 쪼개진 caspases) 의 발현을 증가시켰으며, 이것은 본원에 개시된 CRC 세포에서 SCNE 치료의 결과와 유사하다. 세포 생존 및 세포 증식과 연관된 단백질의 과발현이 종양 발달에 기여함이 밝혀진 바 있다. 세포 생존과 증식에 관련된 단백질의 발현의 하향조절이 결장암 세포의 성장 감소에 기여할 수도 있다. 이와 같이 결장암에서 관측된 SCNE의 항증식성 및 세포자멸사 유도 특성은 백혈병에서 다른 이들이 관찰한 것과 일치한다.
본 연구에서, 본원에 기술된 결과는 SCNE가 종양 침습, 전이, 및 혈관신생(MMP-9, MMP-2)에 관여된 단백질의 발현을 억제할 수 있음을 보여주는데, 이것이 CRC에 대한 SCNE의 역할을 추가로 뒷받침한다. 푸코이단이 PI3K/Akt/mTOR 경로를 억제하고 인간 HT-29 결장암 세포에서 MMP-2의 발현을 감소시킴으로써 세포 성장, 이동 및 구 형성을 억제하였다. 마그놀롤이 종양 침습에 대단히 중요한 효소인 기질금속단백질 분해효소-9(MMP9)의 발현을 유의미하게 하향조절하였고, 또한 핵 인자-kB(NF-kB) 전사 활성을 억제하였는데, 인간 유방암에서 NF-kB 경로를 통해 MMP-9를 억제함으로써 종양 침습을 억제하는 그것의 역할을 보여준다(24226295). 님볼라이드가 CRC 세포에서 증식을 억제하고, 세포자멸사를 유도하고, NF-κB 활성 및 NF-κB-조절 종양유전자 단백질을 억눌렀다. 종양 예방접종 후 복강내로 주입된 님볼라이드가 CRC 이종이식편의 부피를 유의미하게 감소시켰다. 리모노이드로 치료받은 이종이식편은 종양 세포 생존에 관여된 단백질(Bcl-2, Bcl-xL, c-IAP-1, 수르비빈, Mcl-1), 증식에 관여된 단백질(cMyc, 사이클린 D1), 침습에 관여된 단백질(MMP-9, ICAM-1), 전이에 관여된 단백질(CXCR4) 및 혈관신생에 관여된 단백질(VEGF)의 발현의 유의미한 하향조절을 보였다.
HCT-116과 HT-29 결장암 세포가 필수구성요소인 NF-κB를 나타냈고, SCNE가 그것의 활성을 억눌렀음이 밝혀졌다. 님볼라이드가 백혈병과 다발성 골수종 세포에서 유도가능하고 필수구성성분인 NF-κB 활성을 억제하였음이 관측되었다. 필수구성요소인 NF-κB가 종양 발달에 관여된 단백질의 발현을 조절함으로써 다양한 종양 세포의 생존과 증식에 중요함이 밝혀진 바 있다. 따라서, 님볼라이드가 NF-κB를 불활성화시킴으로써 종양 생존 및 성장에 억제 효과를 발휘할 가능성이 있다. 종양 세포에서 NF-κB의 필수적인 활성화에 대한 가능한 기전 중 하나는 IKK 활성을 통한 것이다. 애비신이 TNF-α 유도 NF-κB의 강력한 억제제이고, 세포핵에서 NF-κB의 p65 하위단위의 축적을 느리게 만드는 것으로 밝혀졌다. 애비신 G 치료가 NF-κB 조절 단백질, 예컨대 iNOS와 COX-2의 발현을 감소시켰다. 기타 연구는 세포를 24시간 동안 트리테르페노이드로 사전치료하는 것이 TNF-α를 통해 매개된 NF-κB의 유도를 유의미하게 감소시켰음을 보여주었다. 시미시푸가 다후리카(Cimicifuga dahurica)에서 유래된 사이클로아르탄 트리테르페노이드가 cdc2와 COX-2 단백질의 발현을 억눌렀다. 이와 같은 결과는 트리테르페노이드가 잠재적인 항-종양 활성을 갖고 있고, 세포자멸사 및 G2/M 세포 주기 멈춤을 통해 그것의 세포독성을 발휘함을 시사한다. 님볼라이드가 IκB 분해를 억제하고 NF-κB의 핵 전좌를 방지하는 것이 밝혀졌다. 이것은 추후에 세포증식에 관여된 수많은 유전자를 하향조절함으로써 세포주기 멈춤을 유발하였다. 님볼라이드가 NF-κB의 불활성화를 통해 세포자멸사를 유도할 수 있다. 이것이 Bax, 사이토크롬 C 및 Smac/DIABLO(Kavitha 2012)의 발현의 증가와 동시에 Bcl-2의 유의미한 억제를 야기했다.
하지만 본원에 기술된 결과는 CRC 세포의 성장을 억제하는 것에서 그리고 이종이식편 누드 마우스 모형에서 SCNE의 잠재성을 입증하는 첫 번째 결과이다. SCNE가 수많은 종양생성-관련 단백질의 발현을 조절함으로써 체내에서 항종양 활성을 매개할 수 있음이 밝혀졌다. 우선, SCNE가 종양 생존을 촉진하는 것으로 알려진 Bcl-2의 발현을 하향조절하였다. 둘째, SCNE가 CRC에서 과발현되고 종양 성장을 촉진하는 것으로 알려진 사이클린 D1의 발현을 하향조절하였다. 셋째, SCNE가 종양 침습, 전이, 및 혈관신생과 관련된 단백질, 예컨대 MMP-9와 MMP2의 발현을 하향조절하였다. 넷째, 이들 단백질 모두의 발현을 조절하는 것으로 알려진, 본질적으로 활성인 NF-κB와 STAT3 역시 SCNE 치료에 의해 억제되었다.
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실시예 3: 아자디라크타 인디카의 CO 2 잎 추출물
깨끗하게 씻은 성숙한 아자디라크타 인디카 잎 1 KG을 취해 수분함량이 12%. 미만으로 감소되도록 그늘에서 건조하였다. 분말이 12% 미만의 수분을 함유하도록 제조하였다. 이와 같이 건조된 약초를 입자 크기가 0.42 mm보다 작게 분말화하고, 이어서 80 Bar(80 kg/cm2)에서 350 Bar(350 kg/cm2) 사이의 변하는 압력 하에 31℃에서 45℃ 사이의 온도에서 SCO2 추출을 실시하였다. 추출 장치의 크기에 따라 2~3시간 동안 상기 약초에 CO2 를 통과시키고, 한 번에 일정 양의 약초를 추출 장치에 적재하였다. 약초를 통과하도록 펌핑된 CO2의 양은 약초에 존재하는 친유성 화합물에 따라 약초 1kg당 CO2 10 kg에서 약초 1kg당 CO2 40 kg 사이로 달라진다. CO2 의 압력이 40 Bar에서 65 Bar 사이로 변하는 압력으로 감압되고 온도가 10℃에서 30℃ 사이로 감소되어 용질(추출물)과 CO2를 분리하는 분리기에서 CO2가 운반하는 추출물질을 수집하였다. 이렇게 획득된 추출물은 약초에 존재하는 온도에 민감한 성분들과 기타 친유성 용해 화합물을 포함한다. 이렇게 획득한 추출물이 추출물 A이다.
추출물 'A'를 단리한 후 잔류 분말에 90 내지 97%의 초임계 CO2와 3 내지 10%의 에틸 알코올의 비율로 CO2와 에틸 알코올의 혼합물을 사용하여 추출을 실시하였다. 80 Bar에서 300 Bar 사이의 압력 및 31℃에서 45℃ 사이의 온도에서 추출을 수행하였다. 펌핑된 용매(CO2 + 에탄올)의 양이 약초 1 kg당 10 kg에서 약초 1 kg당 40 kg 사이로 달라진다. 용매 압력을 40 Bar에서 65 Bar 사이로 감압하고 온도를 10℃에서 30℃ 사이로 감소시키면서, 용질(추출물)과 에탄올을 CO2에서 분리하였다. 추출물이 첨가된 에틸 알코올을 분리기에서 수집하였다. 이어서 온도를 45℃ 아래로 유지하면서, 상기 혼합물에 진공 증류(Hg 27 내지 28.5 inch)를 실시하여 상기 용질(추출물)에서 에틸 알코올을 분리하였고, 남은 용질은 추출물 B로 명명했다.
잔류 용매(에탄올): 1000 ppm 미만
두 가지 추출물, 추출물 'A'와 추출물 'B'를 혼합하여 추출물 C를 획득하였다.
수율: 2.5~5%
실시예 4: 아자디라크타 인디카의 물 추출물
아자디라크타 인디카 잎(1 KG)의 약초 분말에 물 추출을 실시하여 페이스트 형태로 수용성 추출물질을 획득하였다. 이렇게 해서 획득한 추출물을 트레이 건조기/진공 건조기 또는 분사 건조기에서 건조시켜서 자유 유동성 분말 추출물을 획득하였다. 이와 같은 추출물을 물 추출물이라고 일컫는다.
수율: 5:1%.
실시예 5: CO 2 추출물의 표준화
HPLC를 사용하여 CO2 추출물의 표준화를 수행하였다. C18 컬럼(4 mm x 250 mm x 5μm)을 사용하였다. 시료를 메탄올에서 준비시켰고, 이동상은 메탄올과 물이었다. 구동시간이 60분이고 유속이 1 ml/분인 구배 프로그램 시퀀스를 사용하였다. 이렇게 획득한 추출물이 님볼라이드를 최소한 3 mg/gm의 양으로, 님빈을 130 μg/ gm의 양으로 살리닌을 200 μg/gm의 양으로 갖는다.
실시예 6: 경구용으로 치료차원에서 유효한 제형
제형 1. SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 75 mg(님볼라이드 최소 0.22mg; 님빈 9.75 μg 및 살리닌 15μg 함유); 항산화제 예컨대 비타민 E(토코페롤) 또는, 최소 6% 카노스산: 10 mg 및 호마유: 415 mg을 함유한 로즈마리(로제마리누스 오피시날리스) CO2 추출물; 본 제형은 500 mg의 연질 겔 캡슐에 채워졌다.
상기 캡슐은 환자에게 하루에 2~4회 투여될 수 있다(활성 약물로서 님 잎 추출물을 매일 총 150~300 mg).
제형 2. SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 50 mg(최소한 님볼라이드 0.15 mg; 님빈 6.5 μg 및 살리닌 10 μg), 덱스트린/말토-덱스트린 또는 기타 운반체(예를 들면, 인산이칼슘 또는 임의의 기타 등급 운반체) 582 mg; 및 통기 또는 흄드 실리카 18 mg.
자유-유동성 분말을 제조하고 시장에서 구입가능한 적합한 크기의 경질 젤라틴 또는 식물성 캡슐에 캡슐화하였다. 이와 같은 제형은 님 잎 CO2 추출물 150~300 mg의 치료차원의 용량을 얻기 위해 하루에 3~4회 투여할 수 있다
제형 3. SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 50 mg(최소한 님볼라이드 0.15 mg; 님빈 6.5 μg 및 살리닌 10 μg 함유), 님 잎에서 획득한 물 추출물 582 mg 및 통기 또는 흄드 실리카 18 mg.
자유-유동성 분말을 제조하여 시장에서 구입가능한 적합한 크기의 경질 젤라틴 또는 식물성 캡슐에 캡슐화하였다. 이와 같은 제형은 님 잎 CO2 추출물 150~300 mg의 치료차원의 용량을 얻기 위해 하루에 3~4회 투여할 수 있다.
제형 4. SCO2 아자디라크타 인디카 잎 추출물: 2.28 g(최소 님볼라이드: 7.2 mg; 님빈: 296.4 μg 및 살리닌 456 μg 함유), 페퍼민트(멘타 피페리타) 오일: 13.81 g, 스피어민트(멘타 스피카타) 오일: 9.26 g, 클로브버드(사이지기움 아로마티쿰) CO2 오일: 3.98 g, 트윈 80: 20.68 g을 함유한 구강세정제 제형. 상기 혼합물 1.25 g을 염기 중 98.75 g에 희석시켰다. 염기는 물: 73.5 g, 알로에베라 물 (200x): 10 g, 소르비톨: 10 g, 글리세린: 5.9 g, 아스코르브산: 0.5 g, 포르베이트칼륨: 0.1 g을 함유한다.
액체 제형을 제조하였다. 상기 제형을 하루 3회, 매 20 ml씩 투여하여 본원에 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물의 치료차원의 용량 15 mg을 획득할 수 있다. 상기 제형을 하루 3회, 20 ml 씩 투여하여 본원에 기술된 바와 같이 님 잎 CO2 추출물의 치료차원의 용량 150 mg을 획득할 수 있다.
대안적으로, 페퍼민트 오일 2 gm과 로즈마리 CO2 추출물 0.2 gm을 함유한 탈염수 95.6 gm을 갖는 상기와 같은 SCO2 추출물 2 gm을 사용하여 리포솜 물-기반 제형을 제조하고 고속 균질기를 사용해 표준 약제학적 등급 유화제, 예컨대 "폴리소르베이트 80" 0.2 gm을 함유한 최소한의 첨가제가 포함된 구강세정제 제형 100 gm을 획득하였다.
실시예 7: 초임계 CO 2 님 잎 추출물(SCNE)의 암 예방 효과.
세포 생존능 검정: 정상적인 래트 결장 세포 IEC-6 세포 뿐만 아니라 대장암세포, HCT116과 HT29를 96-웰 플레이트에 플레이팅하고, 다음날 24시간 동안 세포에 혈청을 공급하지 않고, 48시간과 72시간 동안 SCNE(0~75 μg/mL)과 님볼라이드(1~15 μM)로 세포를 치료하였다. 치료 후, 제조사의 지침에 따라 MTT [3-(4, 5-디메틸티아졸-2-yl)-2, 5-디페닐테트라졸리움 브로마이드] 검정(Sigma Aldrich, MO)에 의해 세포 생존능을 측정하였다. 요약하면, MTT(5mg/mL)를 첨가하고, 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 디메틸 술폭사이드를 각 웰에 첨가하였다. 마침내 플레이트 판독기(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 540 nm의 파장에서 각 웰의 흡광도를 판독하였다. 결과를 치료 받지 않은 세포와 비교하여 생존 세포의 백분율로 표현하였다.
결과는 48시간 후 50 μg/mL라는 고농도에서도 SCNE가 정상적인 래트 결장 세포 IEC-6 세포에 무독성임을 확인시켜준다(도 14). SCNE로 치료받은 대장암세포, 즉, HCT116과 HT29가 72시간의 끝에 15 μg/mL의 농도에서 각각 62% 세포생존능(도 15)과 44% 세포 생존능(도 16)을 보이고, 72시간의 끝에 40 μg/mL의 농도(도 15)와 75 μg/mL의 농도(도 16)에서 0% 세포 생존능을 보인다. 님볼라이드로 치료받은 대장암세포, 즉 HCT116(도 17)와 HT29(도 18)가 48시간 끝에 15 μg/mL의 농도에서 각각 80% 및 75% 세포 생존능을 보인다.
본원에 기술된 실험은 결론적으로 님볼라이드, 님빈 및 살리닌의 조합물을 포함하는 초임계 CO2 님 잎 추출물(SCNE 추출물)이 님볼라이드 단독일 때보다 더 높은 치료 효능을 가지고 있음을 확인해주었다.
전체적으로, 상기 데이터는 SCNE가 전염증성 경로를 통한 세포자멸사의 유도 및 NF-kB 억제를 통해 인간 대장암의 성장을 효과적으로 억누름을 시사한다.

Claims (83)

  1. 개체에서 암을 치료하는 방법으로,
    (a) 치료가 필요한 개체를 식별하는 단계; 및
    (b) 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 약제학적으로 허용가능한 부형제가 인산이칼슘, 증류수, 식염수, 글루코오스 수용액, 알코올(예를 들면, 에탄올), 계면활성제, 프로필렌 글리콜, 트윈-80 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 유성 운반체 예컨대 다양한 동물성 및 식물성 기름, 백색 소프트 파라핀, 파라핀, 밀랍, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 황색 덱스트린, 맥아 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 미세결정질 셀룰로오스, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수시럽, 락토오스, 구연산, 주석산, 사과산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리글리세린 지방 에스테르, 수크로오스 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카세인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B군, 니코틴아마이드, 판토텐산칼슘, 아미노산, 통기(aerated) 또는 흄드 실리카, 칼슘염, 안료, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는, 방법.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 SCNE가 1일 50 mg내지 1000 mg 범위의 용량으로 투여되는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, SCNE의 양이 1일 약 50 mg 내지 1000 mg인, 방법.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g이고, 상기 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g 님빈이고; 상기 살리닌의 양이 최소한 200 μg/g인, 방법.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 SCNE가 하나 이상의 리미노이드를 포함하는, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 추가로 하나 이상의 토코페롤; 및 호마유를 포함하는, 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 하나 이상의 토코페롤이 알파-토코페롤, 감마-토코페롤, 비타민 E 또는 로제마리누스 오피시날리스인, 방법.
  11. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 토코페롤; 호마유; 및 통기 또는 흄드 실리카를 추가로 포함하는, 방법.
  12. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 캡슐을 포함하는 형태인, 방법.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 조성물이 경구투여되는, 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 상기 캡슐이 1일 2~3회 경구투여되는, 방법.
  15. 청구항 1에 있어서, 상기 암이 원발성 또는 이차 종양인, 방법.
  16. 청구항 1에 있어서, 상기 암이 구강암 또는 결장암인, 방법.
  17. 적어도 하나의 염증성 사이토카인의 감소가 필요한 혈청을 갖는 개체에서 혈청내 적어도 하나의 염증성 사이토카인을 감소시키는 방법으로, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 SCNE의 양이 약 50 mg 내지 75 mg인, 방법.
  19. 청구항 17에 있어서, 상기 SCNE가 1일 50 mg 내지 1000 mg의 범위의 용량으로 투여되는 것인 방법.
  20. 청구항 17에 있어서, 조성물에 존재하는 님볼라이드의 양이 최소한 3 mg/g이고; 조성물에 존재하는 님빈의 양이 최소한 130 μg/g이고; 살리닌의 양이 최소한 200 μg/g인, 방법.
  21. 청구항 17에 있어서, 상기 SCNE가 하나 이상의 리미노이드를 포함하는, 방법.
  22. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 토코페롤; 및 호마유를 추가로 포함하는, 방법.
  23. 청구항 22에 있어서, 상기 하나 이상의 토코페롤이 알파-토코페롤, 감마-토코페롤, 비타민 E 또는 로제마리누스 오피시날리스인, 방법.
  24. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물이 하나 이상의 토코페롤; 호마유; 및 통기 또는 흄드 실리카를 추가로 포함하는, 방법.
  25. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물이 캡슐을 포함하는 형태인, 방법.
  26. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물이 경구 투여되는, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 상기 캡슐이 1일 2~3회 경구투여되는, 방법.
  28. 청구항 17에 있어서, 상기 조성물이 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는, 방법.
  29. 청구항 17에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  30. 청구항 17에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 구강암 또는 결장암이 있다고 진단된 바 있는, 방법.
  31. 청구항 17에 있어서, 상기 최소한 하나의 염증성 사이토카인이 IFN-γ, IFN-β, TNF-α, IL-6 또는 IL-1인, 방법.
  32. 청구항 31에 있어서, 상기 최소한 하나의 염증성 사이토카인이 IL-6 또는 TNF-α인, 방법.
  33. 청구항 17에 있어서, 상기 개체의 혈청이, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 상기 조성물의 투여 전에, 기준 시료와 비교할 때 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치가 높아진, 방법.
  34. 청구항 17에 있어서, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물을 포함하는 상기 조성물의 투여 이전에 개체의 하나 이상의 세포 중 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치를 결정하는 단계를 추가로 포함하되, 최소한 하나의 염증성 사이토카인의 수치가 기준 시료와 비교할 때 더 높은, 방법.
  35. 염증 감소가 필요한 개체에서 염증을 줄이는 방법으로, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  36. 청구항 35에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  37. 청구항 35에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 구강암 또는 결장암이 있다고 진단받은 바 있는, 방법.
  38. 청구항 35에 있어서, IFN-γ, IFN-β, TNF-α, IL-6, IL-1, NF-KB, STAT3, COX1 또는 COX2 중 하나 이상의 발현을 줄임으로써 상기 염증이 감소되는, 방법.
  39. 과증식성 장애의 치료를 필요로 하는 개체에서 과증식성 장애를 치료하는 방법으로, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  40. 청구항 39에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  41. 청구항 39에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  42. 청구항 39에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 상기 장애를 치료할 필요가 있다는 진단을 받은 바 있는, 방법.
  43. 청구항 39에 있어서, 상기 과증식성 장애가 암인, 방법.
  44. 청구항 43에 있어서, 상기 암이 구강암 또는 결장암인, 방법.
  45. NFkB와 사이클로옥시게나아제의 발현 억제를 필요로 하는 개체에서 NFkB와 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법으로, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  46. 청구항 45에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  47. 청구항 45에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 NFkB 및 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제할 필요가 있다고 진단된 바 있는 것인 방법.
  48. 청구항 45에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식 장애의 치료가 필요한 것으로 진단된 바 있는 것인 방법.
  49. 청구항 45에 있어서, 무제한 세포증식 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  50. 청구항 49에 있어서, 상기 무제한 세포증식 장애가 암인, 방법.
  51. 청구항 50에 있어서, 상기 암이 구강암인, 방법.
  52. 최소한 하나의 세포에서 NFkB와 사이클로옥시게나아제의 발현을 억제하는 방법으로, 최소한 하나의 세포를 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)과 접촉시키는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  53. 청구항 52에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  54. 청구항 52에 있어서, 상기 최소한 하나의 세포가 인간 세포인, 방법.
  55. 청구항 52에 있어서, 상기 접촉 단계가 개체에 투여를 통해 이루어지는, 방법.
  56. 청구항 55에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식 장애의 치료를 필요로 하는 것으로 진단된 바 있는, 방법.
  57. 개체에서 활성을 시사하는 표피성장인자 수용체(EGFR)를 변형하는 방법으로, 상기 개체에 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는 것인 방법.
  58. 청구항 57에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  59. 청구항 57에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  60. 청구항 57에 있어서, 상기 개체가 EFGR 신호화 활성을 변형할 필요가 있음이 진단된 바 있는, 방법.
  61. 청구항 57에 있어서, 상기 변형이 억제하는 것인 방법.
  62. 청구항 57에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식 장애의 치료가 필요하다고 진단된 바 있는, 방법.
  63. 청구항 62에 있어서, 무제한 세포증식 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  64. 청구항 63에 있어서, 상기 무제한 세포증식 장애가 구강암인, 방법.
  65. 세포의 세포자멸사 유도가 필요한 개체에서 세포의 세포자멸사를 유도하는 방법으로, 치료적 유효량의 초임계 CO2 님 추출물(SCNE)을 포함하는 조성물을 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하되, 상기 SCNE가 님볼라이드, 님빈 및 살리닌을 포함하는, 방법.
  66. 청구항 65에 있어서, 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가로 포함하는 방법.
  67. 청구항 65에 있어서, 상기 개체가 인간인, 방법.
  68. 청구항 65에 있어서, 상기 개체가 상기 투여 단계에 앞서 무제한 세포증식 장애의 치료를 필요로 한다고 진단받은 바 있는, 방법.
  69. 청구항 68에 있어서, 무제한 세포증식 장애의 치료를 필요로 하는 개체를 식별하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  70. 청구항 69에 있어서, 상기 무제한 세포증식 장애가 암인, 방법.
  71. 청구항 70에 있어서, 상기 암이 결장암인, 방법.
  72. 아자디라크타 인디카 잎의 표준화된 CO2 추출물을 제조하는 공정으로,
    a) 수분함량이 12% 미만인 깨끗하게 성숙된 건조 아자디라크타 인디카 잎들을 분말화하여 크기가 0.42mm 미만인 미세입자를 갖는 분말을 획득하는 단계;
    b) 80 Bar(80 kg/cm2)와 350 Bar(350 kg/cm2) 사이에서 달라지는 압력 하에, 31℃ 내지 45℃의 온도 범위에서 원재료 1 kg당 CO2 10 내지 40 kg의 유량으로 단계 a)의 분말에 초임계 CO2 추출을 실시하는 단계;
    c) 40 Bar와 65 Bar 사이에서 달라지는 압력 하에 상기 추출 온도보다 낮은 온도에서 상기 CO2 추출물들을 분리하여 추출물 A를 획득하는 단계;
    d) 80 Bar 내지 350 Bar 사이의 압력 하에 31℃ 내지 45℃의 온도 범위에서, 추출물 'A'를 분리한 후 남은 잔여 분말에 CO2 와 에틸 알코올의 혼합물을 사용하여 추가 추출을 실시하는 단계;
    e) 상기 추출 온도보다 낮은 온도에서 상기 용매 압력을 40 Bar와 65 Bar 사이로 감소시킴으로써 분리기에서 추출물이 첨가된 상기 에틸 알코올을 수집한 후, 이어서 에탄올의 진공 증류를 통해 추출물 B를 획득하는 단계; 및
    f) 추출물 A와 추출물 B를 병합하여 아자디라크타 인디카 입의 표준화된 CO2 추출물을 획득하는 단계를 포함하는, 공정.
  73. 청구항 72에 있어서, 상기 추출물 A가 선택적으로 초고속 마이크로-젯 또는 노즐에 노출되어 10 nm~100 nm의 입도를 얻는, 공정.
  74. 청구항 72에 있어서, 상기 에틸 알코올이 CO2의 3 내지 10% 의 양으로 사용되는, 공정.
  75. 청구항 72에 있어서, 단계 c)에서의 상기 분리 온도와 단계 e)에서의 수집 온도가 10℃와 30℃ 사이에서 유지되는, 공정.
  76. 청구항 72에 있어서, 에탄올의 상기 진공 증류가 45℃ 아래의 온도에서 수행되는, 공정.
  77. 청구항 72에 있어서, 단계 f)에서 획득된 상기 표준화된 추출물이 최소 3 mg/gm의 양의 님볼라이드; 최소 130 μg/gm 의 양의 님빈 및 최소 200 μg/gm의 양의 살리닌을 포함하는, 공정.
  78. 최소 3 mg/gm의 양의 님볼라이드; 최소 130 μg/gm의 양의 님빈 및 최소 200 μg/gm의 양의 살리닌을 포함하는 아자디라크타 인디카의 표준화된 CO2 추출물.
  79. 청구항 78에 있어서, 상기 추출물이 추가로 다양한 기타 활성 식물구성체, 예컨대 데스아세틸님빈, 아자디라디온, 아즈디론, 님볼린 및 님비넨을 미량으로 함유하는, 표준화된 추출물.
  80. 하나 이상의 약제학적 운반체/부형제와 함께, 청구항 78 또는 청구항 79에 따른 아자디라크타 인디카의 표준화된 CO2 추출물을 50 내지 300 mg의 유효량만큼 포함하는 치료적 약초 조성물.
  81. 청구항 80에 있어서, 상기 추출물이 미량의 기타 활성 식물구성체, 데스아세틸님빈, 아자디라디온, 아즈디론, 님볼린 및 님비넨과 함께, 최소 3 mg/gm의 양의 님볼라이드, 최소 130 μg/gm의 양의 님빈 및 최소 200 μg/gm의 양의 살리닌을 포함하는, 약초 조성물.
  82. 청구항 80에 있어서, 상기 약제학적 부형제/운반체가 증류수, 식염수, 글루코오스 수용액, 알코올(예를 들면, 에탄올), 계면활성제, 프로필렌 글리콜, 트윈-80 및 폴리에틸렌 글리콜; 및 유성 운반체 예컨대 다양한 동물성 및 식물성 기름, 백색 소프트 파라핀, 파라핀, 밀랍, 글루코오스, 프룩토오스, 수크로오스, 말토오스, 황색 덱스트린, 맥아 덱스트린, 백색 덱스트린, 에어로졸, 미세결정질 셀룰로오스, 스테아린산 칼슘, 스테아린산 마그네슘, 소르비톨, 스테비오사이드, 옥수수시럽, 락토오스, 구연산, 주석산, 사과산, 숙신산, 젖산, L-아스코르브산, dl-알파-토코페롤, 글리세린, 프로필렌 글리콜, 글리세린 지방 에스테르, 폴리글리세린 지방 에스테르, 수크로오스 지방 에스테르, 소르비탄 지방 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방 에스테르, 아카시아, 카라기난, 카세인, 젤라틴, 펙틴, 한천, 비타민 B군, 니코틴아마이드, 판토텐산칼슘, 아미노산, 통기 또는 흄드 실리카, 칼슘염, 안료, 풍미제 및 보존제로 이루어진 군에서 선택되는, 약초 조성물.
  83. 청구항 80에 있어서, 상기 조성물이 경구 고체 또는 액체 제형으로 제형화될 수 있는, 약초 조성물.
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