KR20210071917A - 해마 성상세포의 광유전학적 또는 화학유전학적 자극을 통한 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법 - Google Patents
해마 성상세포의 광유전학적 또는 화학유전학적 자극을 통한 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 해마 성상세포의 광유전학적 또는 화학유전학적 자극을 통한 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 생체 내에서 성상세포를 조절하기 위해 세포 특이적 (GFAP) 프로모터에 의해 조절되는 빛 또는 화학물질에 반응하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 마우스의 뇌 내로 주사하여 성상세포에서 광 또는 화학반응 유전자를 발현시켰다. 본 발명을 통하여 해마영역 내의 성상세포에 대한 광 또는 화학 활성화 자극을 통해 인지기능 손상을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 억제성 화학반응을 이용한 성상세포 활성 저해는 신경염증 상황에서 보이는 인지기능 손상을 보호할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명을 통해 개발된 기술은 인지기능 손상을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 인지기능을 제어하고 관련 질환을 치료하기 위한 성상세포 중심의 예방/치료전략 개발의 가능성을 제시한다.
Description
본 발명은 해마 성상세포의 광유전학적 또는 화학유전학적 자극을 통한 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
인지기능은 지식과 정보를 효율적으로 조작하는 능력으로서, 기억력, 공간지각력, 판단력, 집행기능, 언어능력 등을 포괄하는 것이다. 의료 기술의 발전과 경제적 성장으로 인해 고령화 사회에 접어들면서 인지기능 및 인지능력을 손상시키는 신경퇴행성 질병으로 인한 물질적인 피해와 이러한 질병에 연관되는 정신적인 피해가 함께 나타나고 있다. 인지기능의 저하는 주로 기억력 등과 관계된 기능 및 능력의 쇠퇴를 의미하는 경우가 많았으나, 근래에는 기억력 저하에 국한하지 않고 뇌의 변화 과정에 따라 복합 주의력, 지각 능력, 실행 기능, 학습 및 기억력, 언어 능력, 지각-운동 기능, 및 사회 인지 등 저하되는 능력과 영역 면에서 다양한 양상으로 나타날 수 있다고 보고 있다.
신경세포의 일종인 성상세포(astrocyte)는 성상교세포라고도 하는데, 신경계에 가장 많은 수를 차지하는 세포로서 뉴런이 분비하는 신경전달물질을 적절하게 제거하거나 뇌 내의 이온 농도를 조절하면서 뉴런 활성을 보조하는 역할을 수행한다고 알려져 있다. 최근에는, 뉴런의 시냅스 형성, 시냅스 숫자 조절, 시냅스 가소성 등에 일정한 역할을 수행하고, 퇴행성 신경계 질환의 발병에도 일정한 역할을 수행하며, 신경줄기세포가 신경으로 분화할 때에도 일정한 역할을 수행함이 규명됨에 따라, 성상세포를 분화시켜서, 퇴행성 신경계 질환에 치료 또는 개선에 사용할 수 있는지에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.
본 발명의 목적은 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적 또는 화학유전학적으로 자극하는 단계를 포함하는 인지기능 손상 동물 모델 제조방법, 상기 방법으로 제조된 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학조성물과, 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명은 인간을 제외한 동물의 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적 또는 화학유전학적으로 자극하는 단계를 포함하는 인지기능 손상 동물 모델 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적 또는 화학유전학적으로 자극하여 제작된 인간을 제외한 인지기능 손상 동물 모델을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인지기능 손상 동물 모델에 인지기능 개선 약물 후보물질을 투여하는 단계; 및 대조물질을 투여한 동물군과 비교하여 인지기능 개선 효과를 나타내는 약물 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 해마 성상세포의 광유전학적 또는 화학유전학적 자극을 통한 인지기능 손상 동물 모델 및 이를 이용한 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 생체 내에서 성상세포를 조절하기 위해 세포 특이적 (GFAP) 프로모터에 의해 조절되는 빛 또는 화학물질에 반응하는 유전자를 포함하는 아데노바이러스를 마우스의 뇌 내로 주사하여 성상세포에서 광 또는 화학반응 유전자를 발현시켰다. 본 발명을 통하여 해마영역 내의 성상세포에 대한 광 또는 화학 활성화 자극을 통해 인지기능 손상을 유도할 수 있음을 확인하였으며, 억제성 화학반응을 이용한 성상세포 활성 저해는 신경염증 상황에서 보이는 인지기능 손상을 보호할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명을 통해 개발된 기술은 인지기능 손상을 연구하는데 유용하게 이용될 수 있을 뿐만 아니라 인지기능을 제어하고 관련 질환을 치료하기 위한 성상세포 중심의 예방/치료전략 개발의 가능성을 제시한다.
도 1은 바이러스에 의한 해마 CA1의 성상세포 특이적 ChR2 발현 유도 결과를 나타낸다. A, 바이러스 구성 도면을 나타낸다. B, 대조군과 ChR2 바이러스 주입 2주 후 생쥐의 해마에서 성상세포와 신경세포를 항체 (GFAP와 NeuN)를 이용하여 형광면역염색으로 시각화하였다. C, 성상세포 (GFAP)와 ChR2가 겹치는 것이 확인하였고(노란색 화살표), 신경세포에서 겹치지 않았다.
도 2는 성상세포 자극 지속시간에 따른 공간 인지 기능 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포의 광자극 자극방법과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, 동물에게 하루에 5분, 10분, 그리고 20분의 광자극을 주었다. 20분 자극 3일째에서 대조군 바이러스 그룹 (eYFP)과 비교해 ChR2 그룹에서 공간인지기능이 손상되었다. 바이러스를 처리하지 않은 그룹과 대조군 그룹에서는 차이가 없었다.
도 3은 성상세포 특이적 활성화 지속 시간에 따른 공간 탐색 및 기억력 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 광자극 방법과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, 훈련 기간에 광자극 5분, 10분, 그리고 20분 자극을 3일간 반복하였다. 20분 자극 3일째 훈련에 의한 탈출구를 찾는 속도가 다른 그룹에 비하여 유의미하게 차이가 있었다. 프로브 테스트에 의한 기억력 검사에서 4일째 손상을 보였으나 6일째 다른 그룹에 비하여 차이가 없었다.
도 4는 성상세포 특이적 자극에 의한 해마 내 전염증성 물질의 발현 증가 결과를 나타낸다. 바이러스를 주입하지 않은 그룹, 대조군 바이러스 주입 그룹, 그리고 ChR2 바이러스 주입 그룹에 하루 광자극 20분씩 총 3일 동안 자극된 동물의 해마조직에서 ChR2 그룹에서 Il-1b, Lcn2, Tnf의 mRNA 발현이 증가되었지만, 광자극이 없을 경우 변화가 없었다.
도 5는 해마 CA1 영역에서의 DREADD 발현 결과를 나타낸다. 해마 CA1 영역에서 hM3D(Gq)-mCherry (A) 및 hM4Di-mCherry (B)의 발현은 성상 세포 마커 GFAP (백색)와 동일한 위치에서 나타났다(노란색 화살표). 그러나 신경 세포 마커 NeuN (빨간색)에서는 나타나지 않았다.
도 6은 hM3Dq에 의한 성상세포 활성화에 의한 해마 의존적 인지기능의 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 활성화를 위한 hM3Dq 자극과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, CNO (3 mg/kg) 복강주사 후 90분과 120분에서 유의미하게 교차 방문행동이 감소되었다. 활동성 지표로 사용한 전체 방문횟수는 차이가 없었다. C, 성상세포 활성화를 위한 hM3Dq 자극과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. D, CNO (3 mg/kg) 복강주사 후 30분 뒤 훈련과정에서 eYFP와 hM3Dq 그룹간 차이가 없었다. 24시간 후 수행된 공포학습 관련 기억력에 hM3Dq 그룹에서 유의미한 차이가 나타났다.
도 7은 hM4Di에 의한 성상세포 활성화에 의한 해마 의존적 인지기능의 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 활성화를 위한 hM4Di 자극과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, LPS 처리 30분 전 CNO (3 mg/kg) 그리고 LPS 처리 후 6시간 간격으로 추가로 CNO를 3회 복강주사 하였다. LPS 처리 24시간 후 유의미하게 hM4Di CNO+LPS 그룹에서 교차 방문 행동이 감소되었다. 활동성 지표로 사용한 전체 방문횟수는 차이가 없었다. C, 성상세포 활성화를 위한 hM4Di 자극과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. D, LPS 처리 30분 전 CNO (3 mg/kg) 그리고 LPS 처리 후 6시간 간격으로 추가로 CNO를 3회 복강주사 하였다. 훈련기간에 hM4Di LPS 그룹 대조군과 비교하여 유의미한 감소가 나타났다. 24시간 후 수행된 공포학습 관련 기억력에 hM4Di 그룹에서 유의미한 차이가 나타났다.
도 2는 성상세포 자극 지속시간에 따른 공간 인지 기능 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포의 광자극 자극방법과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, 동물에게 하루에 5분, 10분, 그리고 20분의 광자극을 주었다. 20분 자극 3일째에서 대조군 바이러스 그룹 (eYFP)과 비교해 ChR2 그룹에서 공간인지기능이 손상되었다. 바이러스를 처리하지 않은 그룹과 대조군 그룹에서는 차이가 없었다.
도 3은 성상세포 특이적 활성화 지속 시간에 따른 공간 탐색 및 기억력 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 광자극 방법과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, 훈련 기간에 광자극 5분, 10분, 그리고 20분 자극을 3일간 반복하였다. 20분 자극 3일째 훈련에 의한 탈출구를 찾는 속도가 다른 그룹에 비하여 유의미하게 차이가 있었다. 프로브 테스트에 의한 기억력 검사에서 4일째 손상을 보였으나 6일째 다른 그룹에 비하여 차이가 없었다.
도 4는 성상세포 특이적 자극에 의한 해마 내 전염증성 물질의 발현 증가 결과를 나타낸다. 바이러스를 주입하지 않은 그룹, 대조군 바이러스 주입 그룹, 그리고 ChR2 바이러스 주입 그룹에 하루 광자극 20분씩 총 3일 동안 자극된 동물의 해마조직에서 ChR2 그룹에서 Il-1b, Lcn2, Tnf의 mRNA 발현이 증가되었지만, 광자극이 없을 경우 변화가 없었다.
도 5는 해마 CA1 영역에서의 DREADD 발현 결과를 나타낸다. 해마 CA1 영역에서 hM3D(Gq)-mCherry (A) 및 hM4Di-mCherry (B)의 발현은 성상 세포 마커 GFAP (백색)와 동일한 위치에서 나타났다(노란색 화살표). 그러나 신경 세포 마커 NeuN (빨간색)에서는 나타나지 않았다.
도 6은 hM3Dq에 의한 성상세포 활성화에 의한 해마 의존적 인지기능의 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 활성화를 위한 hM3Dq 자극과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, CNO (3 mg/kg) 복강주사 후 90분과 120분에서 유의미하게 교차 방문행동이 감소되었다. 활동성 지표로 사용한 전체 방문횟수는 차이가 없었다. C, 성상세포 활성화를 위한 hM3Dq 자극과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. D, CNO (3 mg/kg) 복강주사 후 30분 뒤 훈련과정에서 eYFP와 hM3Dq 그룹간 차이가 없었다. 24시간 후 수행된 공포학습 관련 기억력에 hM3Dq 그룹에서 유의미한 차이가 나타났다.
도 7은 hM4Di에 의한 성상세포 활성화에 의한 해마 의존적 인지기능의 손상 결과를 나타낸다. A, 성상세포 활성화를 위한 hM4Di 자극과 Y-maze test를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. B, LPS 처리 30분 전 CNO (3 mg/kg) 그리고 LPS 처리 후 6시간 간격으로 추가로 CNO를 3회 복강주사 하였다. LPS 처리 24시간 후 유의미하게 hM4Di CNO+LPS 그룹에서 교차 방문 행동이 감소되었다. 활동성 지표로 사용한 전체 방문횟수는 차이가 없었다. C, 성상세포 활성화를 위한 hM4Di 자극과 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 위한 실험 디자인 모식도를 나타낸다. D, LPS 처리 30분 전 CNO (3 mg/kg) 그리고 LPS 처리 후 6시간 간격으로 추가로 CNO를 3회 복강주사 하였다. 훈련기간에 hM4Di LPS 그룹 대조군과 비교하여 유의미한 감소가 나타났다. 24시간 후 수행된 공포학습 관련 기억력에 hM4Di 그룹에서 유의미한 차이가 나타났다.
본 발명은 인간을 제외한 동물의 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적 또는 화학유전학적으로 자극하는 단계를 포함하는 인지기능 손상 동물 모델 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 동물은 생쥐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적으로 자극하는 단계는 1) 뇌 해마 내 성상세포를 광활성화 이온채널(light-activated ion channel) 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환하여, 상기 광활성화 이온채널을 발현시키는 단계; 및 2) 상기 뇌 해마 내 성상세포를 광자극하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 광유전학(optogenetics)은 최근 각광받고 있는 바이오 기술 분야의 하나로, 유전자를 조작해 빛으로 무엇인가를 조절한다는 뜻이다. 광유전학의 초기 연구는 빛을 이용해 신경세포의 활성을 조절하는데 응용되었고, 이는 신경세포에 빛을 쪼여주면 신경세포가 활성화되는 기술을 말한다. 이렇게 빛을 이용하여 신경세포의 활성을 조절하면 기존의 전기 자극을 이용해 신경세포를 조절하는 것보다 보다 정밀하게 신경세포의 활성을 통제할 수 있다. 전기 자극이 불특정 다수의 신경세포를 자극하는 것에 반해 광유전학 기술은 목표로 하는 특정세포를 정확하게 자극할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명에서는 상기 광자극에 의해 성상세포를 활성화시킬 수 있는 광활성화 이온 채널을 성상세포 특이적 프로모터의 조절하에서 형질전환시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 광활성화 이온채널(light-activated ion channel)은 광 자극에 의해 공극을 열고 닫는 막 투과성 단백질 그룹이다. 본 발명에서 상기 광활성화 이온채널은 광 자극에 노출이 되었을 때에 이에 반응하여 세포막의 이온 채널을 열 수 있는 단백질이라면 제한 없이 사용이 가능하며, 채널로돕신(channelrhodopsin), 할로로돕신(halorhodopsin) 또는 알키로돕신(archaerhodopsin)과 같은 단백질을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 일실시예에서는 채널로돕신-2(channelrhodopsin-2; ChR2)를 사용하였다. 한편, 본 발명에 사용한 채널로돕신-2는 genbank number EF47017(ChR2)의 401번째 염기가 구아닌으로 점 돌연변이된 변이체로서, ChR2(H134R)로도 표시하였다.
상기 채널로돕신(channel rhodopsin)의 채널(channel)은 무엇인가가 통과한다는 뜻이고, 로돕신(rhodopsin)이라는 단어는 빛과 관련된다. 이는 빛을 받으면 채널로돕신의 채널이 열려 무엇인가가 세포 안으로 들어오고, 빛이 없으면 채널이 열리지 않는 특징이 있다. 따라서, 상기 채널로돕신-2 단백질을 성상세포에 주입하여 성상세포 세포막에서 채널의 열림을 빛으로 조절할 수 있도록 하였고, 성상세포의 채널이 열리면 세포 안으로 칼륨(K)과 같은 양이온들이 세포 안으로 들어오게 되며, 이로 인하여 세포 안과 밖의 전위차가 발생하여 성상세포가 활성화되게 된다.
본 발명에서 성상세포를 광활성화 이온 채널로 형질전환 시키는 방법은 당업계에서 공지된 형질전환 방법을 제한없이 이용할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 형질전환(transformation), 형질주입(transfection), 전기천공(electrophoresis), 형질도입(transduction), 미세주입(microinjection) 및 총알식 도입(balliatic introduction)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 광 자극은 450 내지 480 nm의 파장을 갖는 청색광을 조사하는 것이 바람직하며, 광 자극을 조사하는 시간은 5분 내지 30분으로, 1회 내지 3회 광 자극하는 것이 바람직하다. 한편, 광 자극을 조사하는 방법은 특별히 제한되지 않으며 동물을 고정시키고 외부에서 광 자극을 조사할 수도 있으며, 뇌 해마 내로 광 섬유(optic fiber)를 이식하여 해마에 직접적인 광 자극을 조사할 수도 있다. 상기 광의 파장은 형질전환하는 광활성화 이온채널의 종류에 따라 달라질 수 있으며, 최적의 광 파장은 통상의 기술자가 반복시험을 통해 용이하게 선정할 수 있다.
바람직하게는, 상기 뇌 해마 내 성상세포를 화학유전학적으로 자극하는 단계는 1) 뇌 해마 내 성상세포를 hM3Dq DREADD(designer receptors exclusively activated by designer drugs) 수용체를 포함하는 발현벡터로 형질전환하여, 상기 hM3Dq DREADD 수용체를 발현시키는 단계; 및 2) 상기 발현된 hM3Dq DREADD 수용체와 클로자핀 N-산화물(Clozapine N-oxide; CNO)을 반응시켜, 뇌 해마 내 성상세포를 활성화시키는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 화학유전학(chemogenetic)은 화학생물학 또는 화학유전체학으로도 불리며 알려지지 않은 저분자 합성물질에 반응하는 단백질을 적용해 세포의 활성을 조절하여 생리학적 기능의 이해를 돕는 응용기술이다. 인산화효소(kinase), 비인산화효소(non-kinase enzyme), GPCR (G protein-coupled receptors), 그리고 ligand-gated ion channel 등의 단백질들이 화학유전학적으로 만들어졌다. 화학유전학적으로 설계된 다양한 단백질들 중 wild type muscarinic receptor를 일부 돌연변이 시켜 아세틸콜린(acetylcholine; Ach)과의 반응성은 낮추고 새로운 합성물질(예를 들면, clozapine-N-oxide)에 반응성을 높인 DREADDs(designer receptors exclusively activated by designer drugs)가 가장 많이 사용된다.
DREADDs 중 하나인, hM3Dq는 신경세포 활성을 촉진하기 위한 수용체로 Gq 단백질을 이용한 hM3Dq와 ligand로 클로자핀 N-산화물(clozapine N-oxide; CNO)의 조합이 일반적으로 사용된다. Gq-DREADDs는 낮은 CNO의 농도(nM)에서 활성화되어 세포 내 칼슘 분비를 증가시켜 신경세포 활성을 촉진한다.
DREADDs 중 하나인, hM4Di는 신경세포 활성을 억제하기 위한 수용체로, Gi 단백질을 이용하여 개발되었다. hM4Di는 CNO, perlapine, compound 21에 의해 활성화된다.
본 발명에서 상기 발현벡터는 선형 DNA 벡터, 플라스미드 DNA 벡터 및 재조합 바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며 당업계에서 형질전환을 위해 사용되는 통상적인 벡터들은 모두 본 발명의 방법에 사용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 일실시예에서 사용한 발현벡터는 아데노바이러스 벡터(adenoviral vector) 또는 아데노-관련 바이러스 벡터(adeno-associated viral vector)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 내 성상세포를 광유전학적 또는 화학유전학적으로 자극하여 제작된 인간을 제외한 인지기능 손상 동물 모델을 제공한다. 바람직하게는, 상기 동물은 생쥐일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 광유전학적 자극은 뇌 해마 내 성상세포를 광활성화 이온채널 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환하여, 상기 광활성화 이온채널을 발현시키고, 상기 뇌 해마 내 성상세포를 광자극하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게는, 상기 화학유전학적 자극은 뇌 해마 내 성상세포를 hM3Dq DREADD 수용체를 포함하는 발현벡터로 형질전환하여, 상기 hM3Dq DREADD 수용체를 발현시키고, 상기 발현된 hM3Dq DREADD 수용체와 클로자핀 N-산화물(Clozapine N-oxide; CNO)을 반응시켜, 뇌 해마 내 성상세포를 활성화시킨 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 인지기능 손상 동물 모델에 인지기능 개선 약물 후보물질을 투여하는 단계; 및 대조물질을 투여한 동물군과 비교하여 인지기능 개선 효과를 나타내는 약물 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 인지기능 개선 약물의 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 인지기능 개선 약물 후보물질은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 천연물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 박테리아 또는 진균의 대사물 및 생활성 분자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 인지기능 개선 약물 후보물질을 동물에 투여하는 방법은 당업계에서 동물에 약물을 투여하는 방법은 제한 없이 이용될 수 있으며, 예를 들어 복강투여, 경구투여, 정맥투여, 음수투여, 척수강 내 투여 등이 이용될 수 있다. 후보물질의 투여 시기는 광유전학적 또는 화학유전학적 자극 직후 내지 1일 이내일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 후보물질의 종류에 따라서는 광유전학적 또는 화학유전학적 자극 이전에 미리 약물을 투여하여 인지기능 개선 효과를 평가할 수도 있다. 약물의 투여 시기, 투여 경로, 투여 간격 및 투여 용량은 후보물질의 종류, 성상, 작용기전 등에 따라 통상의 기술자가 예비 실험을 통해 최적의 조건을 용이하게 선정하여 적용할 수 있다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 약학 조성물은 화학물질, 뉴클레오타이드, 안티센스, siRNA 올리고뉴클레오타이드 및 천연물 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 또는 복합 제제는 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 약학 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제, 좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 유효성분의 유효량은 질환의 예방 또는 치료 요구되는 양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, 예컨대, 성인의 경우, 1일 1회 내지 수회 투여시, 본 발명의 조성물은 1일 1회 내지 수회 투여시, 화합물일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 폴리펩타이드, 단백질 또는 항체일 경우 0.1ng/kg~10g/kg, 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA, shRNAi, miRNA일 경우 0.01ng/kg~10g/kg의 용량으로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강기능식품 조성물은 유효성분 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강기능식품 조성물에 함유된 유효성분의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<
실험예
>
하기의 실험예들은 본 발명에 따른 각각의 실시예에 공통적으로 적용되는 실험예를 제공하기 위한 것이다.
1. 실험동물
실험동물은 코아텍에서 구입한 18-20g 수컷 C57BL/6 생쥐를 사용하였다. 실험 동물의 사육과 처치는 경북대학교 실험동물윤리위원회의 방침과 동물실험관련 규정을 따랐으며, 실험에 사용한 생쥐는 온도 (21-23℃), 습도 (40-60%)와 조명(12시간 명/암)이 자동적으로 유지되는 사육실에서 음수와 사료를 자유롭게 공급하며 사육되었고, 실험실 환경에 1주 이상 적응시킨 후 사용하였다.
2. 동물의 해마 CA1 조직으로 바이러스 전달 및 광섬유 이식
생쥐를 케타민(Ketamine) (100 mg/ kg)과 자일라진(Xylazine) (20 mg/ kg)의 혼합물로 마취시키고 Stereotaxic 뇌수술 기구 (Harvard Apparatus)에 위치시켰다. 두개골은 두피를 조금 절개하여 노출되었고 바이러스의 주사 및 캐뉼러 설치를 위해 작은 구멍을 뚫었다. 뇌에 주사 바늘을 삽입하고 AAV5/GFAP-ChR2-eYFP virus (titer: 2.0 × 1012 particles per ml); AAV5/GFAP-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE (titer: 1.0 × 1012 particles per ml); AAV5/GFAP-hM4D(Gi)-mCherry-WPRE (titer: 4.0 × 1012 particles per ml) 바이러스 및 대조군 AAV5/GFAP-eYFP virus (titer: 2.5 × 1012 particles per ml) 바이러스를 해마 CA1에 (좌표, bregma: -2 mm; midline: ±1.8 mm; skull surface: -2.5 mm) 분당 0.1 μl의 속도로 총 0.5 μl를 주입하고 10분뒤 주사바늘을 꺼냈다. 바이러스 주입 후 동일한 위치에 26 게이지 스테인레스 스틸 캐뉼러를 삽입하였다. 치과용 시멘트를 사용하여 가이드 캐뉼러를 두개골에 고정하고 광유전학적 자극(Optogenetic stimulation)을 위해 단일 광섬유 (Doric Lenses Inc, Quebec, Canada)를 이식하고 팁을 해마 CA1보다 0.5 mm 위에 위치한 뒤 치과용 시멘트로 고정하였다. 생쥐를 외과적 수술 후 바이러스 발현과 수술회복을 위해 적어도 2주 동안 생쥐를 각각 단독으로 케이지에서 회복하였다.
3.
광자극
바이러스 주입 및 수술 회복 후, 광자극은 자극기에 의해 20 Hz의 주파수에서 구동되는 청색 레이져 (473 nm; SDL-473-100MFL, Shanghai Dream Laser Technology Co., Shanghai, China)를 사용하여 일방적으로 적용되었다 (Model S-88, Grass medical Inc., Quincy, MA). 광섬유 정맥의 끝 부분에서 광 강도는 1.7mW/ mm2이 었다 (PM204, Tholabs Co., Ann Arbor, MI).
4. 행동 실험
본 발명에 사용된 생쥐는 행동 실험을 시작하기 전에 새 환경에 순응하기 위해 적어도 일주일 동안 개체별로 단독 케이지에서 사육되었다. 각각의 행동 실험은 관련 도면에 대략적으로 그림으로 설명되고 서로 다른 실험 요구 사항에 따라 서로 다른 시간 간격으로 측정되었다.
(1) Y-maze test
공간인지기능은 Y-maze에서 자발적 교대 작업을 통해 조사되었다. Y-maze는 세개의 팔이 수평으로 (40 cm long and 3 cm wide with 12 cm high walls) 존재하는 미로이다. 생쥐는 처음에 중앙에 놓았으며, 시퀀스 (ABCCAB) 및 수평 팔에 방문한 수를 측정하였고 각 개체에 대해 7분 동안 수동으로 기록하였다. 자발 선택은 연속적으로 방문 (즉 ABC, CAB 또는 BCA이며, BAB는 제외)에서 모든 3개의 팔에 대한 순차적 방문으로 정의된다. 동물의 연속적인 측정을 위해 실험 종료 후 미로의 팔은 70% 에탄올을 사용하여 동물의 잔류 냄새를 제거하였다. 교대 비율은 다음 방정식에 따라 정의되었다. % alternation = [(number of alternations) / (total arm entries)] × 100. 전체 미로 팔의 출입 수는 운동 활동의 지표로 사용된다.
(2) 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)
수동 회피 테스트의 훈련을 위해 생쥐는 처음 밝은 챔버에 위치되었다. 생쥐가 어두운 챔버로 넘어갔을 때 발에 가벼운 충격을 (0.25 mA/1 sec) 가하였다. 어두운 챔버로 들어가기 위해 대기한 시간은 기준 측정 값으로 사용되었다. 훈련 24시간 후 프로브 시험 동안, 마우스를 다시 밝은 챔버에 넣고 어두운 챔버로 들어갈 때까지의 대기 시간을 수동적인 두려움 회피 지수로 측정하였다.
(3) Barnes maze test
Barnes maze는 탈출 구멍 (직격 5 cm)이 있는 (90 cm 높이의) 원형 플랫폼 (직경 100 cm)으로 플랫폼 아래에 작은 챔버가 연결되어 있다. 진짜 구멍을 쉽게 찾지 못하게 하기 위해 미로 주위에 19개의 다른 가짜 구멍이 플랫폼에 만들었다. 가짜 구멍은 탈출구처럼 보이지만 탈출구로 이어지지는 않는다. 미로 주변은 100 W 전구로 빛을 주었다. 첫째 날, 생쥐는 미로의 중심에 있는 불투명한 상자에 놓았다. 10초가 경과한 후에, 불투명한 박스를 제거하고 마우스를 손으로 탈출 구멍으로 유도하였다. 첫 번째 탈출 시도는 15분 뒤에 시작하였다. 첫 번째 시도에서 생쥐를 불투명 상자에 10초 동안 두었다. 불투명 상자에서 풀려난 생쥐는 탈출구를 찾기 위해 3분이 걸렸고 구멍을 발견하는 순간 불이 꺼졌다. 생쥐는 탈출구의 챔버에서 1분을 머문 다음 원래의 케이지로 돌려 보내졌다. 이 절차는 비디오 카메라 및 추적 소프트웨어로 기록되었으며 탈출구를 찾기 위한 대기 시간과 이동 거리가 기록되었다. 생쥐는 하루 15분 간격으로 네 번의 학습훈련을 받았다. 3일간 학습 후 4일과 6일째 생쥐를 미로에 놓은 뒤 프로브 시험이 수행되었다. 이번에는 탈출구가 덮여 다른 모든 구멍처럼 보이게 하였다. 생쥐의 탐색이 행동이 기록되었고 탈출구 주변에서 보낸 시간이 기록되었다. 또한 가짜구멍을 탐색한 양도 기록되었다. 테스트가 끝나고 90초 후에 원래 케이지로 돌려 보내졌다.
5. 약물 및 투여
본 발명에 사용한 클로자핀 N-산화물(Clozapine N-oxide; CNO)는 Enzo Life Sciences (Postfach, Lausen, Switzerland)에서 구입하여 3 mg/kg을 생리식염수에 녹여 복강투여 하였고, 리포폴리사카라이드(Lipopolysaccharide; LPS)는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 개체별 1회 2 μg을 생리식염수에 녹여 뇌실 내 주입하였다.
6. 뇌조직의 처리
실험동물을 틸레타민(tiletamine)과 졸라제팜(zolazepam)으로 마취한 상태에서 RT-PCR 실험용 생쥐를 단두로 희생시키고 뇌를 적출한 다음, 해마 조직을 분리하였다. 조직 염색용 생쥐는 개흉하고, 심장을 통하여 0.05 M phosphate buffered saline (PBS)과 4% paraformaldehyde로 충분히 관류하였다. 이후 뇌를 적출하여 24시간 정도 post-fixation하고, sucrose 용액에 담궈 침전 시킨 다음 뇌조직을 -40℃ dry ice-isopentane 용액으로 동결시켰다. 동결조직은 cryo-cut (Leica, 2800N, Germany)으로 30 μm 두께의 절편으로 제작하여 면역조직염색에 사용하였다.
7. 면역조직염색
생쥐로부터 얻은 뇌절편에 이용하여 이중 또는 삼중 면역조직염색을 위해 mouse anti-GFAP antibody (1:500 dilution; BD Biosciences), rabbit anti-GFAP (1:1000 dilution; Dako), rabbit anti-Iba-1 (1:1000 dilution; Wako), and mouse anti-NeuN (1:500 dilution; Millipore) 항체를 반응시키고 시각화를 위해 Cy3-, Cy5-, and FITC-conjugated anti-mouse, rabbit, or goat IgG antibody (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, Cy3-mouse, Cy3-rabbit, Cy-goat, Cy5-rabbit, FITC-mouse, FITC-rabbit, FITC-goat)를 사용하였다. 이미지 획득 또는 분석에 형광 또는 공초점 현미경을 이용하였다.
8. 염증성 사이토카인
mRNA의
RT-
PCR
측정
생쥐의 뇌로부터 분리한 해마 조직으로부터 Trizol (Quagen, Germany)을 사용하여 total RNA를 추출하였다. 이후 1 μg의 total RNA와 Script cDNA synthesis Kit (Bio-Rad, USA)를 사용하여 DNA로 역전사하였다. PCR 증폭은 DNA Engine Tetrad Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Waltham, MA)로 특정 프라이머 세트를 사용하였다. Il -1b (forward, 5'-AGT TGC CTT CTT GGG ACT GA-3'; reverse, 5'-TCC ACG ATT TCC CAG AGA AC-3'); Lcn2 (forward, 5'- ATG TCA ACC TCC ACC TGG TC-3'; reverse, 5'-CAC ACT CAC CAC CCA TTC AG-3'); Tnf (forward, 5'-CAT CTT CTC AAA ATT CGA GTG ACA A-3'; reverse, 5'-ACT TGG GCA GAT TGA CCT CAG-3'); Gapdh (forward, 5'-TGG GCT ACA CTG AGC ACC AG-3'; reverse, 5'-GGG TGT CGC TGT TGA AGT CA-3').
9. 통계처리
다양한 실험으로부터 얻은 결과는 mean ± standard error로 표시되었다. 각 자료의 통계적 유의성 검증은 student's t-test를 사용하여 p < 0.05 이상의 유의수준으로 검정하였다.
<
실시예
1>
광유전학적
접근을 위한
ChR2의
성상세포
특이적 발현 유도
인지기능 조절에 중요한 뇌영역으로 알려진 해마에서 성상세포의 잠재적인 역할을 조사하기 위해, 광유전학 접근법을 이용하여 성상세포에 ChR2의 세포 특이적 발현을 바이러스를 이용하여 유도하였다(도 1). 사용한 바이러스는 GFAP 프로모터를 이용하여 성상세포에 특이적인 ChR2 발현을 유도하였고, 신경세포에서는 ChR2의 발현이 나타나지 않는 것을 면역형광염색을 이용하여 확인하였다. 이후 실험에서 동일한 바이러스를 이용하여 성상세포를 특이적으로 활성화하는 실험을 진행하였다.
<
실시예
2>
성상세포
지속적인
광자극에
의한 인지기능의 손상
성상세포의 활성화를 지속적으로 유도하였을 때 인지기능에 미치는 영향을 확인하기 위해 ChR2가 발현된 동물에게 하루에 5분, 10분, 그리고 20분 광자극을 처리하고 Y-maze test를 진행하여 공간인지기능을 검사하였다. 이를 모든 그룹과 자극 조건을 3일간 반복하였다. 광자극 첫째 날과 둘째 날에서는 모든 자극 시간에서 유의미한 차이는 없었고 삼일째에 공간인지기능이 감소된 것을 확인하였다(도 2). 이러한 결과는 성상세포의 지속적인 활성화가 공간인지기능을 손상킬수 있음을 알수있다. 공간 탐색 능력 및 기억력을 검사할 수 있는 Barnes maze test를 이용하여 인지기능의 손상이 유도됨을 한 번 더 검증하였다(도 3).
<
실시예
3>
광자극으로
유도된
성상세포
특이적 활성화에 의한 해마 내
신경염증유도
성상세포는 정상적인 상황에서 항상성을 유지하는 역할을 하지만 질환 또는 손상에 의해 염증반응을 매개하는 것으로 알려져있다. 본 발명의 결과에서 성상세포의 특이적 활성화에 의한 인지기능 손상에 신경염증의 가능성을 확인하기 위해 ChR2 발현된 동물에 하루에 20분의 광자극을 처리하고 이를 3일간 반복한 뒤 전염증성 사이토카인의 발현을 확인하였다. 그 결과 하루에 20분 광자극을 3일간 반복한 ChR2 발현 동물의 해마 조직에서 Il -1b, Lcn2, 그리고 Tnf의 발현이 유의미하게 증가되었다(도 4). 이러한 결과는 20분 광자극에 의해 나타난 인지기능의 손상과 신경염증이 상관관계가 있음을 나타낸다.
<
실시예
4> 화학유전학적 방법을 이용한
성상세포
선택적 활성화에 의한 인지기능 조절
인지기능을 조절하는 해마 영역의 성상세포의 잠재적인 역할을 조사하기 위해, 화학유전학적 DREADD 접근법을 인지기능분석과 함께 사용하였다. DREADD는 GPCR에 선택적으로 결합하는 리간드에 의해 활성화되는 조작된 G-단백질-결합 수용체 (GPCR)를 사용한다. 예를 들어, 조작된 사람의 무스카린계 3형 GPCR (hM3D(Gq)와 hM4D(Gi)은 내인성 리간드에 반응하지 않지만 대신에 약리학적으로 불활성인 클로자핀-N-산화물 (CNO)에 의해 활성화된다. 적색 형광 단백질 mCherry에 융합된 무스카린성 수용체 변이체 hM3D(Gq)와 hM4D(Gi)는 GFAP 프로모터를 포함하는 바이러스를 사용하여 해마 CA1 영역의 성상 세포에서 코딩되었다. hM3Dq-와 hM4Di-mCherry 단백질을 발현하는 세포 유형을 특성화하기 위해, 우리는 바이러스가 주입된 동물의 뇌 절편에서 GFAP를 면역 염색 했고 hM3Dq-와 hM4Di-mCherry를 발현하는 세포가 GFAP를 발현한다는 것을 확인하였다(도 5). 인지 기능의 영향을 조사하기 위하여 Y-maze와 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 시행하였다. 먼저 Y-maze test를 진행하기 위해 hM3Dq에 의한 성상세포의 활성화의 유도를 위해 시작전 30분 CNO (3 mg/kg)를 복강으로 주사하였다. 이후 90분과 120분에서 대조군과 비교하여 유의미하게 감소되었다(도 6B). 동물에게 전기자극을 부여하여 공포학습과 관련된 기억력을 테스트하는 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)를 수행하였다. 처음 훈련단계에서 동물은 먼저 밝은 챔버에 위치하여 어두운 챔버로 이동하는 속도를 측정하였으며 양 그룹간 차이가 없었다. 훈련단계에서 동물이 어두운 챔버로 들어간 순간 발에 전기자극을 부여하여 공포를 학습하였다. 그리고 24시간후 전기자극의 기억 테스트에서 hM3Dq 그룹에서 밝은 챔버에서 어두운 챔버로 이동하는 속도가 유의미하게 감소되었다. 이러한 결과는 기본적으로 생쥐가 좋아하는 어두운 공간의 심리를 이용한 것으로 어두운 챔버로 이동하면 해로운 자극이 주어진다는 것을 잘 기억하지 못한다는 것을 의미한다(도 6D). 다음 실험으로 hM4Di에 의해 활성화된 성상세포가 인지기능에 미치는 영향을 확인하였다. CNO를 복강으로 투여하고 Y-maze 및 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)에서 인지기능에 영향이 없는 것으로 나타났다(도 7B 및 도 7D).
광유전학적 성상세포 활성화 및 hM3Dq를 이용한 화학유전학적 방법에서 인지기능의 손상이 확인되었다. 하지만 hM4Di를 이용한 성상세포의 활성화에는 인지기능 손상 반응이 나타나지 않았다. 이러한 결과는 기본적으로 ChR2에 의한 활성화 및 hM3Dq에 의한 활성화는 신경염증을 증가시키고 인지기능을 손상시킬 수 있으며 hM4Di에 의한 활성화에서는 이러한 반응이 나타나지 않았다. 본 발명자들은 hM4Di에 의한 활성화가 신경염증에 의한 인지기능의 조절에 대한 영향을 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 실험에 사용한 LPS 농도 (2 μg/ mouse)는 행동에는 영향을 주지 않을 정도의 낮은 농도가 사용되었고 약한 인지기능의 손상을 유발하는 것으로 확인되었다. Y-maze와 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)에서 LPS의 효과를 억제하기 위해 CNO를 전처리하고, 30분 뒤 LPS를 뇌실 내로 주사하였고 지속적인 hM4Di의 활성을 유도하기 위해 6시간 간격으로 3번 추가로 주사하였다(도 7A 및 도 7C). 그 결과 Y-maze test에서 대조군 바이러스 그룹에 LPS를 처리하였을 때 인지기능의 손상이 나타났고 이는 hM4Di 바이러스 그룹에서 인지기능 손상이 완화되는 결과를 나타냈다(도 7B). 수동 회피 테스트(Passive avoidance test)에서도 마찬가지로 인지기능의 손상이 hM4Di 바이러스 그룹에서 유의미하게 인지기능의 손상이 감소됨을 확인하였다(도 7D). 이러한 결과는 hM4Di를 통한 성상세포의 활성이 신경염증에 의한 인지기능을 완화할 수 있음을 나타낸다.
Claims (2)
- 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 뇌질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 뇌 해마 성상세포 활성화 억제제를 유효성분으로 포함하는 인지기능 개선용 건강기능식품 조성물.
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