KR20210070349A - 중간엽 기질 세포의 증식 방법 - Google Patents

중간엽 기질 세포의 증식 방법 Download PDF

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엘리자베스 쉬팔
카타요운 레즈바니
마옐라 멘트
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보드 오브 리전츠, 더 유니버시티 오브 텍사스 시스템
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Abstract

제대 조직으로부터 유래된 MSC의 군집을 사전 활성화 사이토카인 칵테일로 처리함을 포함하는 중간엽 간질 세포(MSC) 군집의 증식 방법이 본원에서 제공된다. 면역 장애를 MSC로 치료하는 방법이 본원에서 추가로 제공된다.

Description

중간엽 기질 세포의 증식 방법
본 출원은, 2018년 10월 5일에 출원된 미국 가특허출원 제62/741,933호의 이익을 주장하며, 이의 전문이 인용에 의해 본원에 포함된다.
1. 기술분야
본 발명은 일반적으로 의학 및 면역학 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 중간엽 간질 세포의 증식 및 이의 용도에 관한 것이다.
2. 관련 기술의 설명
지난 10년 동안 골수 유래 중간엽 간질 세포(BM-MSC)는 이식편 대 숙주 질환, 허혈성/비-허혈성 심혈관 질환, 허혈성 뇌졸중을 포함하는 다양한 임상 환경에서 그리고 유전자 전달 비히클로서 치료학적으로 사용되어 왔다. BM-MSC의 한계는 기증자의 연령의 증가에 따른 세포의 수 및 분화 가능성의 감소, BM-MSC 생성물의 일관되지 않은 품질 및 필수적인 BM 흡인 절차의 침습성을 포함한다. 정상적인 영아 출산 후의 제대혈 조직(CBt)은 일반적으로 폐기되므로, 출발 물질의 수집은 비-침습적이다. CBt-MSC는 BM-MSC에 비해 더 빠르게 보다 더 많은 수로 증식할 수 있으며, 유사한 면역 억제 성질을 가지고 있다. 따라서, 임상 사용을 위한 많은 수의 CBt-MSC를 발생시키기 위한 GMP-준수 절차를 개발해야 하는 충족되지 않은 요구가 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 CBt-유래 MSC의 증식 방법으로서, 제대 조직으로부터 MSC의 군집을 얻는 단계; TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 3개의 사이토카인의 존재 하에 상기 MSC를 사전 활성화하는 단계; 및 상기 사전 활성화된 MSC를 증식시켜 증식된 MSC의 군집을 얻는 증식 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서. 본 발명의 방법은 GMP-준수이다. 일부 측면에서, 제대 조직으로부터의 MSC의 군집은 이전에 동결 보존되었거나, 또는 새로운 제대 조직 또는 이전에 동결 보존된 제대 조직으로부터 유래된다.
일부 측면에서, 얻는 단계는 제대 조직을 효소 칵테일로 처리함을 포함한다. 효소 칵테일은 히알루로니다제 및 콜라게나제를 포함할 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 콜라게나제는 콜라게나제 NB4/6이다. 추가의 측면에서, 본 발명의 효소 칵테일은 DNAse를 추가로 포함한다. 본 발명의 히알루로니다제는 농도가 0.5 내지 1.5U/mL, 예를 들면, 0.6U/mL, 0.7U/mL, 0.8U/mL, 0.9U/mL, 1.0U/mL, 1.1U/mL, 1.2U/mL, 1.3U/mL, 1.4U/mL 또는 1.5U/mL일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 콜라게나제는 농도가 0.1 내지 1U/mL, 예를 들면, 0.1U/mL, 0.2U/mL, 0.3U/mL, 0.4U/mL, 0.5U/mL, 0.6U/mL, 0.7U/mL, 0.8U/mL, 0.9U/mL 또는 1U/mL이다. 특정 측면에서, 본 발명의 DNAse는 농도가 200 내지 300U/mL, 예를 들면, 200U/mL, 225U/mL, 250U/mL, 275U/mL 또는 300U/mL이다.
MSC는 사전 활성화 전에서, 적어도 85%의 콘플루언시(confluency), 예를 들면, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 콘플루언시로 배양될 수 있다. 일부 측면에서, MSC는 사전 활성화 전 6일 내지 8일 동안, 예를 들면, 사전 활성화 전 6일, 7일 또는 8일 동안 배양된다. 특정 측면에서, 적어도 5억개, 예를 들면, 6억개, 7억개, 8억개, 9억개 또는 10억개의 MSC가 사전 활성화 전에 수득된다. 사전 활성화는 12 내지 24시간, 예를 들면, 12시간, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간, 19시간, 20시간, 21시간, 22시간, 23시간 또는 24시간 동안 수행될 수 있다.
특정 측면에서, MSC는 TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17의 존재 하에 사전 활성화된다. 일부 측면에서, TNFα, IFNγ 및/또는 IL-1β는 농도가 5 내지 15ng/mL, 예를 들면, 5ng/mL, 6ng/mL, 7ng/mL, 8ng/mL, 9ng/mL, 10ng/mL, 11ng/mL, 12ng/mL, 13ng/mL, 14ng/mL, 15ng/mL 또는 그 이상이다. 특정 측면에서, IL-17은 20 내지 40ng/mL, 예를 들면, 20ng/mL, 25ng/mL, 30ng/mL, 35ng/mL, 40ng/mL 또는 그 이상의 농도로 존재한다.
일부 측면에서, 증식은 기능적으로 폐쇄된 시스템. 예를 들면, 생물 반응기에서 수행된다. 예를 들면, 본 발명의 생물 반응기는 중공 섬유 생물 반응기이다. 특정 측면에서, 증식은 7일 미만, 예를 들면, 6일, 5일 또는 4일 동안 수행된다. MSC는 적어도 50배, 예를 들면, 적어도 55배, 60배, 65배, 70배, 75배, 80배 또는 그 이상 증식될 수 있다. 일부 측면에서, MSC는 배가 시간(doubling time)이 28시간 미만, 예를 들면, 27시간, 26시간, 25시간 또는 24시간이다. 일부 측면에서, 본 발명의 방법은 증식된 MSC를 동결 보존하는 단계를 추가로 포함한다.
특정 측면에서, 증식된 MSC의 군집은 골수 MSC에 비해 더 많은 면역 억제 표현형을 갖는다. 일부 측면에서, 증식된 MSC의 군집은 사이토카인 사전 활성화없이 증식된 CBt-유래 MSC에 비해 더 많은 면역 억제 표현형을 갖는다. 특정 측면에서, 본 발명의 면역 억제 표현형은 항-세포자멸사 인자, 예를 들면, VGEF 및/또는 TGFβ, 항염증 인자, 예를 들면, TSG-6, 면역 조절 인자 및/또는 화학 유인-귀소 인자(chemoattraction-homing factor), 예를 들면, CXCR4 및 CXCR3의 발현에 의해 계측된다. 일부 측면에서, 본 발명의 면역 조절 인자는 PD-L1, IDO, PGE2, IL-10 및 TGFβ로 이루어지는 그룹으로부터 선택된다. 특정 측면에서, 증식된 MSC의 군집은 BM-MSC에 비해 줄기 세포성 마커 및/또는 케모카인 수용체의 발현이 증가되었다. 예시적인 줄기 세포성 마커는 Nestin, Stro-1, Oct-4, Nanog 및 Cox-2를 포함하고, 케모카인 수용체는 VEGF, HLA-G, PGE, CXCR4, IL-10 및 TGFβ를 포함한다. 일부 측면에서, 증식된 MSC의 군집은 여러 면역 조절 경로, 예를 들면, T 세포 고갈, 과립구 유착 및 혈구 누출, 항원 제시 경로, 면역 반응의 음성 조절, 노치 신호 전달의 양성 조절, 림프구 세포자멸 과정의 양성 조절, 무과립구 유착 및 혈구 누출, 저산소증에 대한 세포 반응 조절, TGFβ 신호 전달, NFKβ 신호 전달, IL-6 신호 전달, iNos 및 eNos 신호 전달 1, STAT4 및 PI3K 신호 전달의 양성 조절, T 세포 세포자멸 유도와 관련된 유전자의 발현을 유도했다. 특정 측면에서, 증식된 MSC의 군집은, 유착 및 침습과 관련된 귀소 수용체 및 주요 유착 분자를 포함하는 혈구 누출 및 귀소와 관련된 유전자의 발현을 증가시켰다. 예시적인 유착 및 침습 마커는, GLG1, VCAM1, CXCR4, ICAM1, CSF3, CXCL3, CXCL8, SELPG, STAT1, IFITT3, ISG15, STAT2, MX1, OAS1, IFI6, JAK2, TAP1, IFITM3, IFITM1, PSM89, IRF1, PSM89, IRF1, PTPN2, RELA, IFNAR2, HSP90AA1, JUN, ARNT, HIF1 및 CUL2를 포함한다.
본 발명은 콜라게나제, 히알루로니다제 및 DNAse를 포함하는 제대 조직 해리용 조성물을 추가로 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명의 조성물은 MSC를 단리시키기 위해 제대 조직을 해리시킨다. 특정 측면에서, 본 발명의 조성물은 콜라게나제, 히알루로니다제 및 DNAse로 구성된다. 특정 측면에서, 본 발명의 조성물은 BSA 또는 트립신 억제제를 포함하지 않거나 또는 본질적으로 갖지 않는다. 예를 들면, 본 발명의 콜라게나제는 콜라게나제 NB4/6이다. 본 발명의 히알루로니다제는 농도가 0.5 내지 1.5U/mL, 예를 들면, 0.6U/mL, 0.7U/mL, 0.8U/mL, 0.9U/mL, 1.0U/mL, 1.1U/mL, 1.2U/mL, 1.3U/mL, 1.4U/mL 또는 1.5U/mL일 수 있다. 일부 측면에서, 본 발명의 콜라게나제는 농도가 0.1 내지 1U/mL, 예를 들면, 0.1U/mL, 0.2U/mL, 0.3U/mL, 0.4U/mL, 0.5U/mL, 0.6U/mL, 0.7U/mL, 0.8U/mL, 0.9U/mL 또는 1U/mL이다. 특정 측면에서, 본 발명의 DNAse는 농도가 200 내지 300U/mL, 예를 들면, 200U/mL, 225U/mL, 250U/mL, 275U/mL 또는 300U/mL이다. 일부 측면에서, CBt-유래 MSC는 이전에 냉동 보존되었다.
추가의 양태는, 본 발명의 양태들의 방법에 의해 생성된 증식된 MSC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 염증성 장애의 치료에 사용하기 위한, 본 발명의 양태들의 방법에 의해 생성된 증식된 MSC를 포함하는 조성물이 본원에서 추가로 제공된다. 일부 측면에서, 염증성 질환은 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 자가 면역 질환, 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 염증성 장 질환이다. 특정 측면에서, 본 발명의 MSC는 동종 유래(allogeneic)이다. 본 발명의 MSC는 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체에서 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 CBt-유래 MSC, 예를 들면, 본 발명의 양태들에 따라 생성된 CBt-MSC를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는 방법이 제공된다. 특정 측면에서, 상기 대상체는 인간이다. 일부 측면에서, 본 발명의 CBt-유래 MSC는 이전에 냉동 보존되었다.
일부 측면에서, 염증성 질환은, GVHD, 자가 면역 질환, 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, ARDS 또는 염증성 장 질환이다. 특정 측면에서, 본 발명의 MSC는 동종 유래이다. 본 발명의 MSC는 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 MSC는 직장, 비강, 협측, 질, 피하, 피내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 경로를 통해 또는 이식된 저장소를 통해 투여된다. 추가의 측면에서, 본 발명의 MSC는 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여된다. 일부 측면에서, 본 발명의 적어도 하나의 추가의 치료제는 치료 유효량의 면역 조절제 또는 면역 억제제이다. 특정 측면에서, 본 발명의 면역 억제제는, 칼시뉴린 억제제, mTOR 억제제, 항체, 화학 요법제 조사, 케모카인, 인터루킨, 또는 케모카인 또는 인터루킨의 억제제이다.
추가의 양태는, 염증성 장애를 치료하기 위한, 치료 유효량의 CBt-유래 MSC, 예를 들면, 본 발명의 양태에 따라 생성된 CBt-MSC의 용도를 제공한다. 일부 측면에서, 본 발명의 CBt-유래 MSC는 이전에 냉동 보존되어 있었다. 일부 측면에서, 염증성 질환은, GVHD, 자가 면역 질환, 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, ARDS 또는 염증성 장 질환이다. 특정 측면에서, 본 발명의 MSC는 동종 유래이다. 본 발명의 MSC는 전신적으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 MSC는 직장, 비강, 협측, 질, 피하, 피내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 경로를 통해 또는 이식된 저장소를 통해 투여된다. 추가의 측면에서, 본 발명의 MSC는 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여된다. 일부 측면에서, 본 발명의 적어도 하나의 추가의 치료제는 치료 유효량의 면역 조절제 또는 면역 억제제이다. 특정 측면에서, 본 발명의 면역 억제제는 칼시뉴린 억제제, mTOR 억제제, 항체, 화학 요법제 조사, 케모카인, 인터루킨, 또는 케모카인 또는 인터루킨의 억제제이다.
본 발명의 기타 목적, 특징적인 구성 및 이점은 다음의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다. 그러나, 상세한 설명으로부터 본 발명의 사상 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정이 당업자들에게 명백할 것이기 때문에, 상세한 설명 및 특정 실시예들은, 본 발명의 바람직한 양태를 나타내는 반면, 예시로서만 주어지는 것으로 이해되어야 한다.
이하의 도면들은 본원 명세서의 일부를 형성하며, 본 발명의 특정 측면들을 추가로 입증하기 위해 포함된다. 본 발명은 이들 도면들 중 하나 이상을 참조하여 본원에 제시된 특정 양태들의 상세한 설명과 함께 보다 잘 이해될 수 있다.
도 1: 제대 조직으로부터 MSC를 단리 및 증식시키기 위한 GMP-준수 프로토콜을 도시하는 개략도.
도 2: 생물 반응기를 사용하여 제대 조직으로부터 사전 활성화된 MSC를 증식 및 발생시키기 위한 GMP-준수 프로토콜을 도시하는 개략도.
도 3: Terumo 생물 반응기에서의 골수 vs 제대 조직으로부터의 MSC의 대규모 증식 데이터.
도 4: 제대 조직으로부터의 MSC가 골수로부터의 MSC에 비해 더 높은 수준의 줄기 세포성 마커를 발현함을 도시하는 유동 세포 계측 분석.
도 5a 및 5b: 사전 활성화된 CBt-MSC는 처리되지 않은 CBt-MSC에 비해 더 높은 T 세포 증식 및 활성화에 대한 억제 효과를 나타낸다. (도 5a) CD4+ T 세포 증식의 억제 및 (도 5b) 처리되지 않은 MSC vs 사전 활성화된 MSC에 의해 매개된 활성화.
도 6a 내지 6c: CBt-MSC의 사전 활성화는 면역 억제 치료 잠재력을 향상시킨다. (도 6a) 사전 활성화된 CBt-MSC는 사전 활성화된 골수 MSC에 비해 더 높은 면역 억제 표현형을 보인다. (도 6b) MSC의 사전 활성화는 면역 조절 분자 TGS-6의 분비를 증가시킨다. (도 6c) CBt-MSC의 사전 활성화는 표면 상에서의 면역 조절 분자의 발현을 유도하고, 치료 효과를 극대화한다.
도 7: CBt-MSC의 본 발명의 사이토카인 칵테일(TNF, IFN, IL1 및 IL-17)로의 사전 활성화는 시판되는 제제보다 치료 효과가 더 컸다.
도 8a 내지 8c: 새로운 CBt-유래 MSC는 이종 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 마우스 모델에서의 생존율을 증가시켰다. (도 8a) 새로운 BM 또는 CBT-유래 MSC가 수여된 마우스의 전체 생존율의, GVHD 대조군과 비교하여 유의미한 증가가 보인다. (도 8b) GVHD 대조군과 비교하여 (BM-MSC 또는 CBT-MSC로) 치료된 마우스의 간, 비장 및 결장의 GVHD 징후에서 약간의 감소를 입증하는 조직 병리학적 샘플. (도 8c) 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입된 DiR-면역 형광 표지된 MSC를 사용하는 단기 생체 분포 실험. CBt-MSC는 72시간에 걸쳐 BM-MSC에 비해 지속성이 크게 향상되었다.
도 9a 및 9b: CBt-MSC의 활성화는 더 높은 면역 억제 성질을 갖는 독특한 프로파일을 나타냈다. (도 9a) 휴지 중인 MSC와 활성화된 MSC 간에 상이하게 발현된 유전자의 히트 맵은, 휴지 중인 CBt-MSCS와 비교하여 활성화된 CBt-MSC에서 816개 유전자의 상향 조절 및 383개 유전자의 하향 조절을 나타냈다. (도 9b) 휴지 중인 CBt-MSC 및 활성화된 CBt-MSC에서 평가된 유전자의 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)는, 세포의 활성화가 여러 면역 조절 경로, 예를 들면, T 세포 고갈, 면역 반응의 음성 조절, IL-6 신호 전달 및 T 세포의 세포자멸사 유도와 관련된 유전자의 발현을 유도함을 나타냈다.
도 10a 내지 10h: 활성화는 GVHD 이종 이식 마우스 모델에서의 CBt-MSC 귀소 및 생체 분포를 향상시켰다. (도 10a) 활성화된 CBt-MSC vs 휴지 중인 CBt-MSC로부터 추출된 RNA에 대해 수행된 IPA 분석의 히트 맵은, 활성화된 CBt MSC에 대한 유착 및 침습과 관련된 귀소 수용체 및 주요 유착 분자를 포함하는 혈구 누출 및 귀소와 관련된 여러 유전자의 활성화를 나타낸다. (도 10b) 활성화된 CBT MSC vs. 휴지 중인 MSC에 대한 귀소 수용체, 유착 분자 및 침습 단백질(메탈로프로테이나제)의 히트 맵으로서, 상기 히트 맵은 유동 세포 계측에 의해 평가되었다. (도 10c 및 10d) 72시간 형광 분석 후, 활성화된 CBT-MSC가 마우스에서 대조군 CBt-MSC에 비해 더 오래 최대 3일 동안 지속되는 것으로 관찰되었다. (도 10e) 마우스 조직을 주사 후 3시간, 48시간 및 72시간에 수확하고, 평균 복사 효율을 조직에 의해 계산했다. (도 10f) 폐의 경우, (도 10g) 간의 경우, 그리고 (도 10h) 비장의 경우에 대해 도시된 바와 같이, 대조군 MSC 그룹과 비교하여 활성화된 CBt-MSC 그룹에 대해 더 높은 형광 수준을 향하는 경향이 나타났다.
도 11a 내지 11c: 동결 보존된 활성화된 CBt-MSC는 새로운 활성화된 CBt-MSC와 비교하여 유사한 생존력, 표현형 및 T 세포 활성화를 제어하는 효능을 입증했다. (도 11a) 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 검정을 사용하는 유동 세포 계측에 의해 측정된 CBt-MSC의 생존력에 대한 대표적인 FACS 플롯. (도 11b) 모든 상이한 비의 CD3/CD28 비드로 활성화된 T 세포의 전체 억제를 입증하는 T 세포 증식 CFSE 검정의 대표적인 히스토그램. (도 11c) 면역 억제 인자의 발현 지속성을 보여주는 새로운 세포 또는 동결/해동 세포를 갖는 활성화된 MSC 표현형의 대표적인 FACS 플롯.
도 12a 내지 12g: 동결 보존된 활성화된 CBt-MSC는 전체적인 생존율을 증가시키고 GVHD 독성을 감소시켰다. 도 12a 내지 12c는 마우스 그룹(그룹당 n = 8 마우스)에 대한 생체내 실험을 요약한다. (도 12a) 처리되지 않은 수여자(GVHD 대조군), 활성화되지 않은 CBt-MSC의 수여자 및 활성화된 CBt-MSC의 수여자에 대한 생존율 곡선. 상기 데이터는 활성화된 CBT-MSC 수여자의, 활성화되지 않은 MSC 또는 대조군과 비교한 생존율 이익을 입증한다. (도 12b) 활성화된 CBt-MSC의 수여자 대 다른 2개의 그룹의 수여자에 대해 더 적은 체중 감소를 입증하는 체중 변화율. (도 12c) 평균 GVHD 스코어는 활성화된 CBT-MSC 그룹에 대해 더 적은 GVHD를 다시 보인다. (도 12d) 3개의 마우스 그룹들 사이에서 종료 시점에서 비교된 문맥 간 염증. (도 12e) 처리되지 않은 마우스(대조군), 휴지 중인 CBt-MSC로 처리된 마우스 대 활성화된 MSC로 처리된 마우스(활성화됨)로부터의 혈액 시험의 비교. 혈액 시험은 WBC 수, MCV, MCHC, 헤마토크릿, 헤모글로빈, 혈소판 수, RBC 수, MCH, RDW, 알부민, 알칼리성 포스파타제, 칼륨, LDH, AST, 포도당, ALT, 인, 총 단백질을 포함한다. 결과는 대조군 또는 활성화되지 않은 MSC 그룹과 비교하여 활성화된 MSC로 처리된 그룹에서의 혈소판 수, 포도당, WBC 수 및 간 기능(ALT, AST)의 개선을 보인다. (도 12f) 마우스의 혈액 중 사이토카인 수준의 결과는, 활성화된 CBt-MSC 및 활성화되지 않은 CBt-MSC 둘 다 대조군 마우스에 비해 염증성 사이토카인의 존재를 감소시켰음을 나타낸다. (도 12g) 24일의 마우스 혈액 중 인간 CD45의 퍼센티지. 좌측 패널은 각 그룹의 대표적인 FACS 플롯을 보여주고, 우측 패널은 대조군(처리되지 않음)과 비교한 통계적 비교가 있는 막대 플롯을 보이며, **p-값<0.01, ****p-값<0.0001은 활성화된 MSC가 있는 MSC 수여자 그룹 둘 다의 혈액 중의 더 적은 인간 CD45+ 세포가, 활성화되지 않은 MSC 수여자보다 적은 수를 나타냄을 나타낸다.
골수 유래 MSC는 난치성 이식편 대 숙주 질환(GVHD)을 치료하기 위해 수년 동안 사용되어 왔으며, 보다 최근에는 허혈성 뇌졸중, 심혈관 질환, 염증성 장 질환 및 급성 호흡 곤란 증후군을 포함하는 재생 의학 환경(setting)에서 사용되어 왔다. 태반 정맥으로부터의 제대혈은 광범위하게 평가되어 왔으며, 골수에 비해 매우 일관되지 않으며 빈약한 MSC 발생이 있는 MSC의 차선적인 공급원이다. 따라서, 본 발명의 특정 양태는 제대 조직으로부터 유래된 MSC를 증식시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 생물 반응기에서 대량의 CBt-유래 MSC를 발생시키는 강력한 우수 의약품 제조 및 품질 관리 기준(GMP: good manufacturing practice)-준수 방법을 제공한다.
특히, MSC를 증식시키기 위한 본 발명의 방법은 사전 활성화 단계를 포함하며, 이는 사전 활성화없이 발생된 MSC보다 상당히 더 억제성인 CBt-유래 MSC의 발생을 초래한다. 사전 활성화 단계는 사이토카인, 예를 들면, TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17의 존재 하에 MSC를 배양함을 포함할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 신규한 GMP-준수 시스템을 사용하여 보다 더 짧은 시간에 BM-유래 MSC에 비해 더 많은 용량으로 CBt-유래 MSC를 발생시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 CBt-MSC는 BM-유래 MSC에 비해 더 저렴하고 효율적으로 발생될 수 있다.
본 발명의 연구에서, 사전 활성화되고 증식된 MSC는 BM-유래 MSC에 비해 더 많은 "줄기 세포성" 마커를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 줄기 세포성 마커의 증가된 발현은, 사전 활성화되고 증식된 MSC의, 뇌, 심장, 위장관 및 폐를 포함하는 중요한 기관의 보다 구체적인 재생을 제공하는 능력을 허용할 수 있다. 본 발명의 사전 활성화된 MSC는 VEGF, HLA-G, PGE, CXCR4, IL-10 및 TGFβ를 포함하는 더 높은 수준의 면역 억제 인자 및 케모카인 수용체도 발현하며, 이들은 GVHD인 위장관 및 피부를 포함하는 염증 부위에 대한 그리고 급성 염증이 발생하는 재생 의학 환경의 뇌 및 심장에 대한 귀소 능력을 향상시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 생성되는 활성화된 MSC는 여러 면역 조절 경로, 예를 들면, T 세포 고갈, 과립구 유착 및 혈구 누출, 항원 제시 경로, 면역 반응의 음성 조절, 노치(notch) 신호 전달의 양성 조절, 림프구 세포자멸 과정의 양성 조절, 무과립구 유착 및 혈구 누출, 저산소증에 대한 세포 반응 조절, TGFβ 신호 전달, NFKβ 신호 전달, IL-6 신호 전달, iNos 및 eNos 신호 전달 1, STAT4 및 PI3K 신호 전달의 양성 조절 및 T 세포 세포자멸의 유도와 관련된 유전자의 발현을 유도한 것으로 밝혀졌다. 활성화된 MSC는, 활성화된 CBt MSC에 대한 유착 및 침습과 관련된 귀소 수용체 및 주요 유착 분자를 포함하는 혈구 누출 및 귀소와 관련된 유전자, 예를 들면, GLG1, VCAM1, CXCR4, ICAM1, CSF3, CXCL3, CXCL8, SELPG, STAT1, IFITT3, ISG15, STAT2, MX1, OAS1, IFI6, JAK2, TAP1, IFI35, IFITM1, PSM89, IRF1, IFITM3, PTPN2, RELA, IFNAR2, HSP90AA1, JUN, ARNT, HIF1 및 CUL2의 활성화도 나타냈다.
본 발명의 시스템은, 재생 의학으로서 환자에게 주입하기 위해 GMP-준수의 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 다수의 임상 등급 CBt-유래 MSC를 발생시키기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 염증성 상태, 예를 들면, GVHD 및 자가 면역 질환을 치료하기 위한, 그리고 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 및 염증성 장 질환을 포함하는 재생 의학 환경에서의, 본원에서 제공된 고도의 면역 억제성 MSC의 사용 방법이 추가로 제공된다.
I. 정의
본원에 사용되는 바와 같이, 특정 성분과 관련된 "본질적으로 없는"은, 특정 성분 중 어느 것도 의도적으로 조성물로 제형화되지 않았고/않았거나 오염물로서 또는 미량으로만 존재함을 의미하기 위해 본원에서 사용된다. 따라서, 조성물의 의도하지 않은 오염으로 인한 특정 성분의 총 양은 0.05% 미만, 바람직하게는 0.01% 미만이다. 특정 성분의 양이 표준 분석 방법으로 검출될 수 없는 조성물이 가장 바람직하다.
본원에 사용되는 바와 같이, "a" 또는 "an"은 하나 이상을 의미할 수 있다. 본원에서 청구항(들)에서 사용되는 바와 같이, 단어 "a" 또는 "an"은, 단어 "포함하는"과 함께 사용되는 경우, 하나 또는 하나 이상을 의미할 수 있다.
청구 범위에서의 용어 "또는"의 사용은, 대안만을 나타내거나 또는 대안이 상호 배타적인 것으로 명시적으로 나타내지 않는 한, "및/또는"을 의미하기 위해 사용되지만, 본원은 대안 및 "및/또는"만을 나타내는 정의를 지원한다. 본원에서 사용되는 "또 다른"은 적어도 두 번째 또는 그 이상을 의미할 수 있다. 용어 "약"은 5%가 더해지거나 빠진 명시된 값을 나타낸다.
본원에 사용되는 용어 "중간엽 줄기 세포", "중간엽 간질 세포" 또는 "MSC"는 중배엽으로부터 유래된 만능 체세포를 나타내며, 상기 만능 체세포는 다른 것들 중 결합 조직, 골수 간질, 지방 세포, 진피 및 근육을 포함하는 다양한 표현형을 갖는 자손 세포를 생성할 수 있는 자가 재생 및 분화 능력을 갖는다. MSC는 일반적으로, 마커 CD19, CD45, CD14 및 HLA-DR에 대해 음성이고 마커 CD105, CD106, CD90 및 CD73에 대해 양성임을 특징으로 하는 세포 마커 발현 프로파일을 가지고 있다. MSC는 모든 유형의 조직으로부터 단리될 수 있다. 일반적으로, MSC는 골수, 지방 조직, 제대 또는 말초 혈액으로부터 단리된다. 특정 양태에서, MSC는 골수 유래 줄기 세포이다.
용어 "기능적으로 폐쇄된"은, 전체 시스템을 밀봉 씰링하거나 수집 시스템에 대한 모든 연결에 멸균 차단 필터를 제공하여 유체 멸균을 보장하기 위해 씰링된 시스템을 나타낸다.
용어 "생물 반응기"는, 폐쇄된 멸균 시스템에서, 세포에 영양분을 제공하고 대사물을 제거하고 그리고 세포 성장에 도움이 되는 물리-화학적 환경을 제공하는 대규모 세포 배양 시스템을 나타낸다. 특정 측면에서, 생물학적 및/또는 생화학적 공정은, 모니터링되고 통제되는 환경 및 작동 조건, 예를 들면 pH, 온도, 압력, 영양분 공급 및 폐기물 제거 하에 개발된다. 본원 명세서에 따르면, 본 발명의 방법에 사용하기에 적합한 생물 반응기의 기본 부류는 중공 섬유 생물 반응기를 포함한다.
용어 "중공 섬유"는, 생물 반응기 내에 함유된 세포에 대한 (용액으로의) 영양분의 전달 및 생물 반응기 내에 함유된 세포로부터 (용액으로의) 폐기물의 제거에 사용하기 위한 한정된 크기, 형상 및 밀도의 공극을 함유하는 (모든 형상의) 중공 구조를 포함하고자 한다. 본 발명의 목적을 위해, 중공 섬유는 재흡수성 또는 비흡수성 재료로 구성될 수 있다. 섬유는 관형 구조를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
"면역 장애", "면역 관련 장애" 또는 "면역 매개 장애"는, 면역 반응이 질환의 발달 또는 진행에 중요한 역할을 하는 장애를 나타낸다. 면역 매개 장애는 자가 면역 장애, 동종 이식 거부, 이식편 대 숙주 질환, 염증 및 알레르기성 병태를 포함한다.
"자가 면역 질환"은, 면역계가, 정상 숙주의 일부인 항원(즉, 자가 항원)에 대한 면역 반응(예를 들면, B 세포 또는 T 세포 반응)을 생성하여 결과적으로 조직을 손상시키는 질환을 나타낸다. 자가 항원은 숙주 세포로부터 유래될 수 있거나, 또는 공생 유기체, 예를 들면, 일반적으로 점막 표면을 집락화하는 미생물(공생 유기체로 알려짐)로부터 유래될 수 있다.
용어 "이식편 대 숙주 질환(GVHD)"은, 기증받은 면역학적으로 적격인 림프구가 이식 수여자 자신의 조직에 대한 반응이 있는 골수 이식의 흔하고 심각한 합병증을 나타낸다. GVHD는 관련되거나 또는 관련없는 기증자의 줄기 세포를 사용하거나 함유하는 모든 이식의 발생 가능한 합병증이다. 일부 양태에서, GVHD는 만성 GVHD(cGVHD)이고, 일부 양태에서 GVHD는 급성 GVHD(aGVHD)이다.
"면역 반응의 파라미터"는, 사이토카인 분비(IL-6, IL-10, IFN-γ 등), 케모카인 분비, 변경된 이동 또는 세포 축적, 면역 글로불린 생성, 수지상 세포 성숙, 조절 활성, 조절 B 세포의 수 및 면역계의 모든 세포의 증식을 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 반응의 모든 특정한 계측 가능한 측면이다. 면역 반응의 또 다른 파라미터는 면역 공격으로 인한 임의의 기관의 구조적 손상 또는 기능 저하이다. 당업자는 공지된 실험실 검정을 사용하여 이들 파라미터 중 어느 하나의 증가를 쉽게 측정할 수 있다. 하나의 특정한 비제한적인 예에서, 세포 증식을 평가하기 위해, 3H-티미딘의 혼입이 평가될 수 있다. 면역 반응 파라미터의 "실질적인" 증가는 대조군과 비교한 상기 파라미터의 현저한 증가이다. 실질적인 증가의 구체적이고 비제한적인 예는, 적어도 약 50% 증가, 적어도 약 75% 증가, 적어도 약 90% 증가, 적어도 약 100% 증가, 적어도 약 200% 증가, 적어도 약 300% 증가 및 적어도 약 500% 증가이다. 유사하게는, 면역 반응의 파라미터의 억제 또는 감소는 대조군과 비교한 상기 파라미터의 현저한 감소이다. 실질적인 감소의 구체적이고 비제한적인 예는, 적어도 약 50% 감소, 적어도 약 75% 감소, 적어도 약 90% 감소, 적어도 약 100% 감소, 적어도 약 200% 감소, 적어도 약 300% 감소 및 적어도 약 500% 감소이다. 통계학적 시험, 예를 들면, 비-파라미터적 ANOVA 또는 T-시험을 사용하여, 하나의 제제에 의해 유도되는 반응의 크기와 두 번째 제제를 사용하여 반응하는 샘플의 크기의 차이를 백분율로 비교할 수 있다. 일부 예에서, p≤0.05는 유의미하고, 임의의 관찰된 파라미터의 증가 또는 감소가 무작위 변동으로 인한 가능성이 5% 미만임을 나타낸다. 당업자는 사용의 다른 통계학적 검정을 쉽게 확인할 수 있다.
질환 또는 병태를 "치료하는" 또는 이의 치료는, 질환의 징후 또는 증상을 완화하기 위한 노력으로 하나 이상의 약물을 환자에게 투여함을 포함할 수 있는 프로토콜을 실행함을 나타낸다. 치료의 바람직한 효과는 질환 진행률의 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 예후의 진정 또는 개선을 포함한다. 완화는 질환 또는 병태의 징후 또는 증상이 나타나기 전 및 출현 후에 일어날 수 있다. 따라서, "치료하는" 또는 "치료"는 질환 또는 바람직하지 않은 병태를 "방지하는" 또는 이의 "방지"를 포함할 수 있다. 또한, "치료하는" 또는 "치료"는 징후 또는 증상의 완전한 완화를 필요로 하지는 않고, 치유를 필요로 하지는 않으며, 특히 환자에게 미미한 영향만을 미치는 프로토콜을 포함한다.
본원 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "치료학적 이익" 또는 "치료학적으로 효과적인"은, 이러한 병태의 의학적 치료와 관련하여 대상체의 웰빙을 증진하거나 향상시키는 모든 것을 나타낸다. 이는 질환의 징후 또는 증상의 빈도 또는 중증도의 감소를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 암 치료는 예를 들면, 종양 크기의 감소, 종양 침습성의 감소, 암 성장 속도의 감소 또는 전이의 방지를 포함할 수 있다. 또한, 암 치료는 암에 걸린 대상체의 연장된 생존을 나타낼 수도 있다.
"대상체" 및 "환자"는 인간 또는 비인간, 예를 들면, 영장류, 포유류 및 척추 동물을 나타낸다. 특정 양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에서 일반적으로 사용되는 "약제학적으로 허용되는"은, 과도한 독성, 자극, 알레르기성 반응 또는 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 기타 문제 또는 합병증 없이, 타당한 의학적 판단 범위 내에서 인간 및 동물의 조직, 기관 및/또는 체액과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물 및/또는 투여 형태를 나타낸다.
"약제학적으로 허용되는 염"은 상기 정의된 바와 같이 약제학적으로 허용되고 원하는 약리학적 활성을 갖는 본원에 개시된 화합물의 염을 의미한다. 이러한 염은, 무기 산, 예를 들면, 염산, 염화브롬산, 황산, 질산, 인산 등으로; 또는 유기 산, 예를 들면, 1,2-에탄디설폰산, 2-하이드록시에탄설폰산, 2-나프탈렌설폰산, 3-페닐프로피온산, 4,4'-메틸렌비스(3-하이드록시-2-엔-1-카복실산), 4-메틸바이사이클록[2.2.2]옥트-2-엔-1-카복실산, 아세트산, 지방족 모노- 및 디카복실산, 지방족 황산, 방향족 황산, 벤젠설폰산, 벤조산, 캄포설폰산, 카본산, 신남산, 시트르산, 사이클록펜탄프로피온산, 에탄설폰산, 푸마르산, 글루코헵톤산, 글루콘산, 글루탐산, 글리콜산, 헵탄산, 헥산산, 하이드록시나프토산, 락트산, 라우릴황산, 말레산, 말산, 말론산, 만델산, 메탄설폰산, 뮤콘산, o-(4-하이드록시벤조일)벤조산, 옥살산, p-클로로벤젠설폰산, 페닐-치환된 알칸산, 프로피온산, p-톨루엔설폰산, 피루브산, 살리실산, 스테아르산, 석신산, 타르타르산, 3급 부틸아세트산, 트리메틸아세트산 등으로 형성된 산 부가 염을 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 존재하는 산성 양성자가 무기 염기 또는 유기 염기와 반응할 수 있는 경우에 형성될 수 있는 염기 부가 염도 포함한다. 허용되는 무기 염기는 수산화나트륨, 탄산나트륨, 수산화칼륨, 수산화알루미늄 및 수산화칼슘을 포함한다. 허용되는 유기 염기는 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 트로메타민, N-메틸글루카민 등을 포함한다. 본 발명의 임의의 염의 일부를 형성하는 특정 음이온 또는 양이온은 상기 염이 그 전체가 약리학적으로 허용되는 한 중요하지 않다는 것을 인식해야 한다. 약제학적으로 허용되는 염의 추가의 예 및 이의 제조방법 및 사용 방법은 문헌[Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties and Use (P. H. Stahl & C. G. Wermuth eds., Verlag Helvetica Chimica Acta, 2002]에 제시되어 있다.
"약제학적으로 허용되는 담체", "약물 담체" 또는 간단히 "담체"는, 화학적 제제를 운반, 전달 및/또는 수송하는 데 관여하는 활성 성분 약물과 함께 제형화된 약제학적으로 허용되는 물질이다. 약물 담체는, 예를 들면 약물의 생체 이용률을 조절하고, 약물 대사를 감소시키고/시키거나 약물 독성을 감소시키는 제어 방출 기술을 포함하여 약물의 전달 및 효과를 개선하기 위해 사용될 수 있다. 일부 약물 담체는 특정 표적 부위에 대한 약물 전달의 유효성을 증가시킬 수 있다. 담체의 예는 리포솜, 마이크로스피어(예를 들면, 폴리(락트-코-글리콜)산으로 제조됨), 알부민 마이크로스피어, 합성 중합체, 나노 섬유, 단백질-DNA 복합체, 단백질 접합체, 적혈구, 비로솜 및 덴드리머를 포함한다.
용어 "배양하는"은 세포의 적합한 배지에서의 시험관내 유지, 분화 및/또는 증식을 나타낸다. "풍부한"은 유기체에 존재하는 조직에서 발견되는 것보다 더 큰 전체 세포 중의 퍼센티지로 존재하는 세포를 포함하는 조성물을 의미한다.
"단리된" 생물학적 구성 요소(예를 들면, 혈액 구성 요소와 같은 혈액 물질의 일부)는, 자연적으로 발생하는 유기체의 다른 생물학적 구성 요소로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 구성 요소를 나타낸다. 단리된 세포는, 상기 세포가 자연적으로 발생하는 유기체의 다른 생물학적 구성 요소들로부터 실질적으로 분리되거나 정제된 세포이다.
본원에서 사용되는 용어 "실질적으로"는 적어도 80%의 원하는 구성 요소, 보다 바람직하게는 90%의 원하는 구성 요소, 가장 바람직하게는 95%의 원하는 구성 요소를 포함하는 조성물을 나타내기 위해 사용된다. 일부 양태에서, 본 발명의 조성물은 적어도 80%, 82%, 84%, 86%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% 또는 98%의 원하는 구성 요소를 포함한다.
II. 중간엽 기질 세포
본 발명은 MSC의 증식에 관한 것이다. 배양에 사용되는 MSC는 임의의 줄기 세포 공급원, 예를 들면, 제대, 제대혈, 태반, 배아 줄기 세포, 지방 조직, 골수 또는 기타 조직 특이적 중간엽으로부터 유래되는 세포를 포함할 수 있다. 이러한 샘플은 새로운 것일 수 있거나, 냉동 또는 냉장될 수 있다. 특정 측면에서, 본 발명의 MSC는 제대 조직 및 이러한 CBt-유래 MSC의 증식 방법으로부터 유래된다. 특정 측면에서, MSC는 자가 유래 또는 동종 유래일 수 있는 인간 MSC이다.
A. 제대 조직으로부터 MSC의 단리
일 양태에서, MSC는 하나 이상의 효소 활성의 존재 하에 단리된다. 조직으로부터의 세포 단리에 사용하기 위한 광범위한 소화 효소는 당업계에 공지되어 있으며, 약한 소화성으로 간주되는 효소(예를 들면, 데옥시리보뉴클레아제 및 중성 프로테아제, 디스파제)부터 강한 소화성으로 간주되는 효소(예를 들면, 파파인 및 트립신)에 이르는 효소를 포함한다. 점액 용해 효소 활성, 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제, 세린 프로테아제(예를 들면, 트립신, 키모트립신 또는 엘라스타제) 및 데옥시리보뉴클레아제가 본 발명에서 바람직하다. 메탈로프로테아제, 중성 프로테아제 및 점액 용해 활성으로부터 선택되는 효소 활성이 보다 바람직하다. 세포는 콜라게나제, 히알루로니다제 및 디스파제의 하나 이상의 활성의 존재 하에 단리될 수 있다.
제대 조직은 인간과 같은 포유 동물로부터 얻을 수 있다. 특히, 제대 조직은 만삭 신생아로부터 선택적 제왕 절개 후에 얻는다. 제대 조직은 예를 들면 페니실린/스트렙토마이신이 있는 plasmalyte 중에서 운반될 수 있다. 이후, 제대 조직은 분획들로 절단되어, 예를 들면, 30 내지 90분, 특히 70분, 71분, 72분, 73분, 74분, 75분, 76분, 77분, 78분, 79분 또는 80분 동안 30 내지 40℃, 특히 37℃에서 항온 배양될 수 있다.
제대 조직은, 콜라게나제, 히알루로니다제 및/또는 DNAse를 포함하는 본원에서 제공된 효소 칵테일에서 해리될 수 있다. 특히, 콜라게나제는 콜라게나제-NB4/6(Serva)이다. 제대 조직은 해리기, 예를 들면, GentleMACS Octo 해리기(Miltenyi)에서 해리될 수 있다. 이후, 세포 현탁액을 여과하고 세척하고, 배지, 예를 들면, 10% 혈소판 용해물, L-글루타민, 헤파린(완전 배지)을 펜-스트렙과 함께 포함하는 알파-MEM 배지에 재현탁하고, T175 플라스크에 씨딩한 다음 MSC가 약 80% 콘플루언트(confluent)가 될 때까지 배양한다. 이후, 세포를 수확하고 항생제없는 완전 배지를 사용하여 약 80% 콘플루언시로 증식시킨다. 배양은 약 6 내지 8일, 특히 약 7일 동안일 수 있다.
MSC 배양을 위한 세포 배양 표면은, 시트, 슬라이드, 배양 접시, 배양 플라스크, 백, 배양 병 또는 멀티웰 접시를 포함하는 표준 조직 배양 용기 및 2차원 표면을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
성장 조건을 제공하면, 세포에 대한 배양 배지, 보충제, 대기 조건 및 상대 습도에 대한 광범위한 옵션이 사용 가능해진다. 바람직한 온도는 37℃이지만, 온도는 다른 배양 조건 및 원하는 세포 또는 배양의 용도에 따라 약 35 내지 39℃ 범위일 수 있다.
당업자는, 성장 배지가 당업계에 공지된 임의의 방식으로 다양하게 보충 및 변경될 수 있으며, 특정한 이유로 최적화될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 세포는 추가의 혈청이 없는 경우, 화학적으로 한정된 배지를 포함하여 다른 많은 배양 배지에서 성장될 수 있다. 이러한 몇 가지 배지가 이하에 예시된다. 세포의 일상적인 배양 및 유지 이외에, 이러한 강력한 세포의 특정 유형의 세포 또는 특정 세포의 전구 세포로의 분화에 영향을 미치는 많은 다른 배지가 당업계에 공지되어 있다. 숙련가는 이러한 배지가 많은 목적에 유용하고 본 발명의 범위 내에 포함되지만, 일상적인 배양 및 증식에 반드시 바람직한 것은 아니라는 것을 인식할 것이다.
배양 배지와 관련된 세포의 유연성 이외에, 세포는 다양한 환경 조건 하에 성장할 수 있다. 특히, 세포는 광범위한 대기 조건 하에 성장할 수 있다. 약 5%의 O2 내지 약 20% 또는 그 이상의 O2 범위의 분위기가 본 발명에서 바람직하다. 세포는, 일반적으로 약 5%의 CO2 및 분위기의 균형이 질소로 존재하는 조건 하의 성장 배지에서 잘 성장하고 증식한다. 숙련가는 세포가 상이한 배지에서 보다 더 넓은 범위의 조건을 견딜 수 있고, 특정 목적에 대한 최적화가 적절할 수 있음을 인식할 것이다.
배양 전 세포의 동결 보존 또는 본원에 개시된 증식된 세포의 동결 보존은 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포는 "냉동 배지", 예를 들면, 5 내지 10%의 글리세롤이 있거나 없는 10% 디메틸설폭사이드(DMSO)를 추가로 포함하는 배양 배지에 예를 들면 약 1 내지 2x106cell/ml의 밀도로 현탁될 수 있다. 세포는 유리 또는 플라스틱 바이알에 분배될 수 있으며, 이후, 씰링되어 프로그래밍 가능한 또는 수동 냉동고의 냉동 챔버로 옮겨진다. 최적의 냉동 속도는 경험적으로 측정될 수 있다. 예를 들면, 융해열을 통해 약 -1℃/min의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램을 사용할 수 있다. 세포를 함유하는 바이알이 -80℃에 도달하면, 액체 질소 저장 영역으로 옮겨질 수 있다.
일부 양태에서, 임의의 줄기 세포 공급원으로부터 새로 단리되는 세포는 동결 보존되어 세포 뱅크를 구성할 수 있으며, 이의 일부는 해동에 의해 회수된 다음 필요에 따라 본 발명의 증식된 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 해동은 예를 들면, 바이알을 액체 질소로부터 37℃의 수욕으로 옮겨 신속하게 수행할 수 있다. 해동된 바이알의 내용물은 무균 상태 하에 영양 배지와 같은 적절한 배지를 함유하는 배양 용기로 즉시 옮겨질 수 있다. 배양되면, 세포를, 예를 들면 도립 현미경으로 매일 검사하여 세포 증식을 감지하여, 적절한 밀도에 도달하자마자 계대 배양할 수 있다.
세포는 필요에 따라 세포 뱅크로부터 회수할 수 있으며, 시험관내, 예를 들면, 3차원 스캐폴드 배지로서 또는 생체내, 예를 들면, 조직 재구성 또는 복구가 필요한 부위에 대한 세포의 직접 투여에 의한 새로운 줄기 세포 또는 조직의 생성에 사용할 수 있다. 본원에 기술되는 본 발명의 증식된 MSC는, 세포가 본래 대상체 자신의 조직(즉, 자가 세포)으로부터 단리되는 대상체의 조직을 재구성 또는 복구하기 위해 사용될 수 있다. 다르게는, 본원에 개시되는 증식된 MSC는 임의의 대상체(즉, 이종 세포)에서 조직을 재구성 또는 복구하기 위해 유비쿼터스 기증자 세포로서 사용될 수 있다.
B. MSC의 사전 활성화
제대 조직으로부터 단리된 MSC는 사전 활성화를 위해 사이토카인의 존재 하에 배양될 수 있다. 사이토카인은 TNFα, IFNγ, IL-1β 및/또는 IL-17일 수 있고, 특히 TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17일 수 있다. 사전 활성화 단계는 약 12 내지 24시간, 예를 들면, 13시간, 14시간, 15시간, 16시간, 17시간, 18시간 또는 19시간, 특히 16시간 동안일 수 있다. TNFα, IFNγ 및/또는 IL-1β는 농도가 5 내지 15ng/mL, 예를 들면, 6ng/mL, 7ng/mL, 8ng/mL, 9ng/mL, 10ng/mL, 11ng/mL, 12ng/mL, 13ng/mL 또는 14ng/mL, 특히 약 10ng/mL일 수 있다. IL-17은 농도가 20 내지 40ng/mL, 예를 들면, 25ng/mL, 30ng/mL 또는 35ng/mL, 특히 약 30ng/mL일 수 있다.
C. 생물 반응기에서의 MSC의 증식
이후, MSC는 생물 반응기와 같은 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 증식될 수 있다. 증식은 Quantum 생물 반응기(Terumo)에서 예를 들면, 4 내지 10일, 특히 5 내지 6일 동안 수행될 수 있다.
생물 반응기는 정적 생물 반응기, 교반 플라스크 생물 반응기, 회전 벽 용기 생물 반응기, 중공 섬유 생물 반응기 및 직접 관류 생물 반응기를 포함하여 일반적인 범주에 따라 그룹화될 수 있다. 생물 반응기 내에서, 세포는 유리될 수 있거나 또는 다공성 3차원 스캐폴드(하이드로겔)에 씨딩될 수 있다.
중공 섬유 생물 반응기를 사용하여 배양 동안 물질 전달을 향상시킬 수 있다. 중공 섬유 생물 반응기는, 10 내지 30kDa 범위의 일반적인 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 평행한 배열로 배열되는 소형 반투과성 모세관 막인 중공 섬유를 기반으로 하는 3D 세포 배양 시스템이다. 이러한 중공 섬유 막은 종종 관형 폴리카보네이트 쉘 내에 번들화 및 하우징되어 중공 섬유 생물 반응기 카트리지를 생성한다. 유입구 및 유출구 포트도 장착된 카트리지 내부에는, 중공 섬유 내부의 모세관내(IC) 공간 및 중공 섬유를 둘러싼 모세관외(EC) 공간의 두 구획이 있다.
따라서, 본 발명의 경우, 생물 반응기는 중공 섬유 생물 반응기일 수 있다. 중공 섬유 생물 반응기는, 세포를 섬유의 내강 내에 매립할 수 있으며, 배지로는 내강외 공간을 관류하거나 다르게는 중공 섬유를 통해 가스 및 배지 관류를 제공할 수 있으며, 세포는 내강외 공간 내에서 성장한다. 본 발명에 적합한 중공 섬유 생물 반응기는 당업계에 공지되어 있으며, Caridian(Terumo) BCT Quantum 세포 증식 시스템을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다.
중공 섬유는 생물 반응기에서 영양분의 전달 및 폐기물의 제거에 적합해야 한다. 중공 섬유는 임의의 형상일 수 있으며, 예를 들면, 원형 및 관형일 수 있거나 동심원 환들의 형태일 수 있다. 중공 섬유는 재흡수성 또는 비흡수성 막으로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 중공 섬유의 적합한 성분은 폴리디옥사논, 폴리락타이드, 폴리글락틴, 폴리글리콜산, 폴리락트산, 폴리글리콜산/트리메틸렌 카보네이트, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 셀룰로스성 중합체, 셀룰로스 에스테르, 재생 셀룰로스, 플루로닉, 콜라겐, 엘라스틴 및 이들의 혼합물을 포함한다.
생물 반응기는 세포를 씨딩하기 전에 프라이밍될 수 있다. 프라이밍은 PBS와 같은 완충액으로 플러싱함을 포함할 수 있다. 프라이밍은 생물 반응기를 피브로넥틴과 같은 세포외 기질 단백질로 코팅함을 포함할 수도 있다. 이후, 생물 반응기는 알파 MEM과 같은 배지로 세척할 수 있다.
MSC는 약 100 내지 1,000cell/cm2, 예를 들면 약 150cell/cm2, 약 200cell/cm2, 약 250cell/cm2, 약 300cell/cm2, 약 350cell/cm2, 예를 들면 약 400cell/cm2, 예를 들면 약 450cell/cm2, 예를 들면 약 500cell/cm2, 예를 들면 약 550cell/cm2, 예를 들면 약 600cell/cm2, 예를 들면 약 650cell/cm2, 예를 들면 약 700cell/cm2, 예를 들면 약 750cell/cm2, 예를 들면 약 800cell/cm2, 예를 들면 약 850cell/cm2, 예를 들면 약 900cell/cm2, 예를 들면 약 950cell/cm2 또는 약 1,000cell/cm2의 밀도로 생물 반응기에 씨딩될 수 있다. 특히, 세포는 약 400 내지 500cell/cm2, 예를 들면 약 450cell/cm2의 밀도로 씨딩될 수 있다.
생물 반응기에 씨딩되는 세포의 총 수는 약 1.0x106 내지 약 1.0x108개의 세포, 예를 들면 약 1.0x106 내지 5.0.0x106개, 5.0x106 내지 1.0x107개, 1.0x107 내지 5.0x107개, 5.0x107 내지 1.0x108개의 세포일 수 있다. 특정 측면에서, 생물 반응기에 씨딩되는 세포의 총 수는 약 1.0x107 내지 약 3.0x107개, 예를 들면, 약 2.0x107개의 세포이다.
세포는 임의의 적합한 세포 배양 배지에 씨딩될 수 있으며, 배지들 중 다수는 상업적으로 입수 가능하다. 예시적인 배지는 DMEM, RPMI, MEM, Media 199, HAMS 등을 포함한다. 일 양태에서, 배지는 알파 MEM 배지, 특히 L-글루타민이 보충된 알파 MEM이다. 배지는, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬 또는 B27, 항생제, 비타민 및/또는 소분자 약물 중 하나 이상으로 보충될 수 있다. 특히, 배지는 혈청이 없을 수 있다.
일부 양태에서, 세포는 실온에서 항온 배양될 수 있다. 항온 배양기는 가습될 수 있으며, 약 5%의 CO2 및 약 1%의 O2 분위기를 가질 수 있다. 일부 양태에서, CO2 농도는 약 1 내지 20%, 2 내지 10% 또는 3 내지 5% 범위일 수 있다. 일부 양태에서, O2 농도는 약 1 내지 20%, 2 내지 10% 또는 3 내지 5% 범위일 수 있다.
III. 사용 방법
본 발명의 증식된 MSC는 질환 및 손상의 치료 및 개선에 광범위하게 적용된다. 본 발명의 증식된 MSC는, 조직의 복구, 재구성 및 재생, 및 유전자 전달을 포함하는 많은 치료학적 적용에 유용하다. 본 발명의 MSC는 계통-예탁된(lineage-committed) 세포 및 계통-예탁되지 않은 세포 둘 다를 포함할 수 있고, 따라서, 세포 유형 둘 다를 함께 사용하여 심지어 일부 양태에서는 동시에 사용하여 여러 치료 목표를 달성할 수 있다. 예를 들면, 일부 양태에서, 본 발명의 증식된 MSC는 줄기 세포 이식물로서 직접 사용될 수 있거나, 본원에서 상기에 언급된 바와 같이 현탁액 또는 세포 배양 지지 스캐폴드에서 줄기 세포 이식편으로 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태는 염증성 또는 면역-매개 장애를 치료 또는 방지하기 위한, 본원에서 제공되는 MSC의 사용 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 치료 유효량의 MSC를 대상체에게 투여함으로써, 상기 대상체에서 염증성 또는 면역-매개 장애를 치료 또는 방지함을 포함한다.
본 발명의 방법에 따라 발생되는 MSC는 실험적 용도 및 치료학적 용도를 포함하여 많은 잠재적인 용도를 갖는다. 특히, 이러한 세포의 군집은 바람직하지 않거나 또는 부적절한 면역 반응을 억제하는데 매우 유용할 것으로 예상된다.
일 양태에서, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환을 앓고 있는 대상체는 본원에서 제공되는 MSC가 투여된다. 일 양태에서, 대상체는 자가 면역 질환을 갖는다. 자가 면역 질환의 비제한적인 예는, 원형 탈모증, 강직성 척추염, 항인지질 증후군, 자가 면역 애디슨병, 부신의 자가 면역 질환, 자가 면역 용혈성 빈혈, 자가 면역 간염, 자가 면역성 난소염 및 고환염, 자가 면역 혈소판 감소증, 베체트병, 물집 유사 천포창, 심근병증, 복강 스페이트-피부염(celiac spate-dematitis), 만성 피로 면역 기능 장애 증후군(CFIDS), 만성 염증성 탈수초성 다발 신경병증, 처그-스트라우스 증후군(Churg-Strauss syndrome), 반흔성 유사 천포창, CREST 증후군, 한랭 응집소 질환, 크론병, 원판성 루푸스, 원반성 혼합 한랭 글로불린혈증, 섬유근통-섬유근염, 사구체신염, 그레이브스병, 길랭-바레, 하시모토 갑상선염, 특발성 폐 섬유증, 특발성 혈소판 감소성 자반증(ITP), IgA 신경병증, 소아 관절염, 편평태선, 홍반성 루푸스, 메니에르병, 혼합 결합 조직 질환, 다발성 경화증, 1형 또는 면역-매개성 진성 당뇨병, 중증 근무력증, 신증후군(예를 들면, 적어도 변화 질환, 병소 사구체경화증 또는 막성 신장병증), 심상성 천포창, 악성 빈혈, 결절성 다발동맥염, 다발연골염, 다선성 증후군, 류마티스성 다발근통, 다발근염 및 피부근염, 1차 무감마글로불린혈증, 1차 담즙성 경변증, 건선, 건선성 관절염, 레이노드 현상(Raynaud's phenomenon), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 류마티스성 관절염, 사르코이드증, 경피증, 쇼그렌 증후군, 강직 사람 증후군, 전신 홍반성 루푸스, 홍반성 루푸스, 궤양성 대장염, 포도막염, 맥관염(예를 들면, 결절성 다발관절염, 타카야스 관절염, 측두 동맥염/거대 세포 관절염 또는 피부염 포진 혈관염), 백반증 및 베게너 육아종증을 포함한다. 따라서, 본원에 개시된 방법을 사용하여 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 일부 예는, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 전신 홍반성 루푸스, I형 진성 백혈병, 크론병, 궤양성 대장염, 중증 근무력증, 사구체신염, 강직성 척추염, 혈관염 또는 건선을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 대상체는 천식과 같은 알레르기성 장애를 가질 수도 있다.
또 다른 양태에서, 대상체는 이식된 기관 또는 줄기 세포의 수여자이고, 증식된 MSC는 거부 반응을 방지 및/또는 치료하기 위해 사용된다. 특정 양태에서, 대상체는 이식편 대 숙주 질환을 갖거나 발병할 위험이 있다. GVHD는 관련되거나 또는 관련없는 기증자의 줄기 세포를 사용하거나 함유하는 모든 이식의 발병 가능한 합병증이다. GVHD에는 급성 및 만성 두 종류가 있다. 급성 GVHD는 이식 후 첫 3개월 이내에 나타난다. 급성 GVHD의 징후는 피부가 벗겨지거나 수포가 생기며 퍼질 수 있고 더 심해질 수 있는 손 및 발의 붉은 피부 발진이 있다. 급성 GVHD는 위 및 장에 영향을 미칠 수도 있으며, 이 경우 경련, 메스꺼움 및 설사가 나타난다. 피부 및 눈의 황변(황달)은 급성 GVHD가 간에 영향을 미쳤음을 나타낸다. 만성 GVHD는 중증도에 따라 순위가 매겨진다: 1단계/등급은 경증이고, 4단계/등급은 중증이다. 만성 GVHD는 이식 3개월 후에 또는 그 이후에 발생한다. 만성 GVHD의 증상은 급성 GVHD의 증상과 유사하지만, 그 이외에, 만성 GVHD는 눈의 점액선, 입의 타액선, 및 위 내벽 및 내장을 윤활하는 선에도 영향을 미칠 수 있다. 이식된 장기의 예는 고형 장기 이식, 예를 들면, 신장, 간, 피부, 췌장, 폐 및/또는 심장, 또는 세포 이식, 예를 들면, 섬, 간세포, 근모세포, 골수, 조혈 세포 또는 기타 줄기 세포를 포함한다. 이식은 안면 조직과 같은 복합 이식일 수 있다. 본 발명의 MSC는 이식 전에, 이식과 동시에 또는 이식 후에 투여될 수 있다. 일부 양태에서, 본 발명의 MSC는 이식 전에, 예를 들면 이식 적어도 1시간 전, 적어도 12시간 전, 적어도 1일 전, 적어도 2일 전, 적어도 3일 전, 적어도 4일 전, 적어도 5일 전, 적어도 6일 전, 적어도 1주 전, 적어도 2주 전, 적어도 3주 전, 적어도 4주 전 또는 적어도 1개월 전에 투여될 수 있다. 하나의 구체적이고 비제한적인 예에서, 치료 유효량의 MSC의 투여는 이식 3 내지 5일 전에 일어난다.
추가의 양태에서, 대상체에 대한 치료 유효량의 MSC의 투여는 대상체에서 염증을 치료하거나 억제한다. 따라서, 본 발명의 방법은 치료 유효량의 MSC를 대상체에게 투여하여 염증 과정을 억제함을 포함한다. 염증성 장애의 예는 천식, 뇌염, 염증성 장 질환, 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 알레르기성 장애, 패혈성 쇼크, 폐 섬유증, 미분화 척추 관절병증, 미분화 관절병증, 관절염, 염증성 골 용해 및 만성 바이러스 또는 세균 감염으로 인한 만성 염증을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다. 본원에 개시된 방법은 알레르기성 장애를 치료하기 위해 사용될 수도 있다.
MSC의 투여는 면역 억제 또는 염증 억제가 필요할 때마다, 예를 들면 질환 또는 염증의 첫 번째 징후 또는 증상시에 사용될 수 있다. 이는 통증, 부종, 온도 상승과 같은 일반적인 증상일 수 있거나, 또는 영향을 받는 기관(들)의 기능 장애와 관련된 특정 징후 또는 증상일 수 있다. 예를 들면, 신장 이식 거부에서는 혈청 크레아티닌 수치가 상승할 수 있는 반면, GVHD에서는 발진이 있을 수 있고, 천식에서는 숨가쁨(shortness of breath) 및 쌕쌕거림(wheezing)이 있을 수 있다.
MSC의 투여는 관심 대상체에서 면역 매개 질환을 방지하기 위해 사용될 수도 있다. 예를 들면, MSC는 이식 전에 이식 수여자가 될 대상체에게 투여될 수 있다. 또 다른 예에서, MSC는 T 세포 고갈 없이 동종 골수 이식을 받는 대상체에게 투여된다. 추가의 예에서, MSC는 당뇨병의 가족력이 있는 대상체에게 투여될 수 있다. 다른 예에서, MSC는 천식 발작을 방지하기 위해 천식이 있는 대상체에게 투여된다. 일부 양태에서, 치료 유효량의 MSC가 증상 전에 대상체에게 투여된다. MSC의 투여는, 조절 세포를 포함하지 않는 다른 요법을 받은 환자에 비해, 후속 면역학적 사건 또는 증상(예를 들면, 천식 발작)의 발생률 또는 중증도를 감소시킬 수 있거나 환자 생존율을 개선할 수 있다.
치료의 유효성은 당업자에게 공지된 많은 방법에 의해 계측될 수 있다. 일 양태에서, 백혈구 수(WBC)를 사용하여 대상체의 면역계의 반응성을 측정한다. WBC는 대상체의 백혈구 수를 계측한다. 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 대상체의 혈액 샘플 중의 백혈구를 다른 혈액 세포와 분리하여 계수한다. 백혈구의 정상 값은 약 4,500 내지 약 10,000개 백혈구/μl이다. 백혈구의 수가 적으면 대상체가 면역 억제 상태라는 표시일 수 있다.
또 다른 양태에서, 대상체에서의 면역 억제는 T-림프구 수를 사용하여 측정될 수 있다. 당업계에 널리 공지된 방법을 사용하여, 대상체의 혈액 샘플에서 백혈구를 다른 혈액 세포와 분리한다. T-림프구를 당업계의 표준 방법, 예를 들면 면역 형광 또는 FACS를 사용하여 다른 백혈구로부터 분화시킨다. 감소된 수의 T-세포 또는 특정 T-세포 군집을 면역 억제의 척도로 사용할 수 있다. 치료 전 T-세포의 수(또는 특정 군집의 세포 수)와 비교시 T-세포 또는 특정 T-세포 군집의 수의 감소는, 면역 억제가 유도되었음을 나타내기 위해 사용될 수 있다.
다른 예에서, 염증을 평가하기 위해, 염증 부위에서의 호중구 침윤이 계측될 수 있다. 호중구 침윤을 평가하기 위해, 미엘로페록시다제 활성을 계측할 수 있다. 미엘로페록시다제는 다형 핵 백혈구 및 단핵구의 무친화성 과립에 존재하는 헴단백질이다. 헴단백질은 할라이드 이온의 각각의 하이포할로스산으로의 산화를 촉매하며, 하이포할로스산은 포식 세포에 의한 미생물 살해에 사용된다. 따라서, 조직에서의 미엘로페록시다제 활성의 감소는 감소된 호중구 침윤을 반영하며, 염증 억제의 척도의 역할을 할 수 있다.
또 다른 예에서, 대상체의 효과적인 치료는 대상체의 사이토카인 수준을 계측함으로써 검정될 수 있다. 체액 또는 세포 샘플의 사이토카인 수준은 기존 방법으로 측정된다. 예를 들면, 면역 스팟 검정, 예를 들면, 효소-결합 면역 스팟 또는 "ELISPOT" 검정을 사용할 수 있다. 면역 스팟 검정은 단일 세포 수준에서 사이토카인 분비를 검출하기 위한 매우 민감하고 정량적인 검정이다. 면역 스팟 방법 및 적용은 당업계에 널리 공지되어 있으며, 예를 들면 EP 957359에 기재되어 있다. 표준 면역 스팟 검정의 변형은 당업계에 널리 공지되어 있으며(예를 들면, 미국 특허 제5,939,281호 및 미국 특허 제6,218,132호 참조), 본 발명의 방법에서 사이토카인 생성의 변경을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
치료 유효량의 MSC는 비경구 투여, 예를 들면 정맥내, 복강내, 근육내, 흉골내, 심장내 또는 관절내 주사 또는 주입을 포함하는 여러 경로에 의해 투여될 수 있다.
면역 억제의 유도 또는 염증의 치료 또는 억제에 사용하기 위한 MSC의 치료 유효량은, 치료되는 대상체에서 원하는 효과를 달성하는 양이다. 예를 들면, 치료 유효량은 진행을 억제하거나 또는 자가 면역 또는 동종 면역 질환의 퇴행을 유발하기 위해 필요한, 또는 자가 면역 질환으로 인한 증상, 예를 들면 통증 및 염증을 완화할 수 있는 MSC의 양일 수 있다. 치료 유효량은 통증, 부종 및 온도 상승과 같은 염증과 관련된 증상을 완화하는 데 필요한 양일 수 있다. 치료 유효량은 이식된 장기의 거부 반응을 줄이거나 방지하는 데 필요한 양일 수도 있다.
MSC는 질환과 일치하는 치료 레지멘(regimen), 예를 들면 질환 상태를 개선하기 위해 1일 내지 수 일에 걸쳐 단일 회 또는 수 회 투여될 수 있거나, 또는 질환 진행을 억제하고 질환 재발을 방지하기 위해 연장된 시간에 걸친 주기적 투여량으로 투여될 수 있다. 제형화에 사용되는 정확한 용량은 투여 경로, 질환 또는 장애의 심각성에도 따르며, 의사의 판단 및 각 환자의 상황에 따라 결정되어야 한다. MSC의 치료 유효량은 치료되는 대상체, 질환의 중증도 및 유형, 및 투여 방식에 따른다. 일부 양태에서, 인간 대상체의 치료에 사용될 수 있는 용량은 적어도 3.8x104개 조절 세포/m2, 적어도 3.8x105개 조절 세포/m2, 적어도 3.8x106개 조절 세포/m2, 적어도 3.8x107개 조절 세포/m2, 적어도 3.8x108개 조절 세포/m2, 적어도 3.8x109개 조절 세포/m2 또는 적어도 3.8x1010개 조절 세포/m2의 범위이다. 특정 양태에서, 인간 대상체의 치료에 사용되는 용량은 약 3.8x109 내지 약 3.8x1010개 조절 세포/m2 범위이다. 추가의 양태에서, 치료 유효량의 MSC는 체중 1kg당 약 5x106 내지 약 7.5x108개 세포, 예를 들면, 체중 1kg당 약 2x107 내지 약 5x108개 세포 또는 체중 1kg당 약 5x107 내지 약 2x108개 세포로 다양할 수 있다. MSC의 정확한 양은 대상체의 연령, 체중, 성별 및 생리학적 상태에 따라 당업자에 의해 쉽게 측정된다. 유효량은 생체내 또는 동물 모델 시험 시스템에서 유도되는 용량-반응 곡선으로부터 외삽할 수 있다.
본 발명의 증식된 MSC는 투여 전에 담체 배지에 배치될 수 있다. 주입을 위해, 본 발명의 증식된 MSC는 임의의 생리학적으로 허용되는 배지로 정맥내를 포함하여 혈관내로 투여될 수 있지만, 세포가 재생 및 분화를 위한 적절한 부위를 찾을 수 있는 골수와 같은 다른 편리한 부위 내로 도입될 수도 있다. 일반적으로, 적어도 약 1x105cell/kg, 적어도 약 5x105cell/kg, 적어도 약 1x106cell/kg, 적어도 약 2x106cell/kg, 적어도 약 3x106cell/kg, 적어도 약 4x106cell/kg, 적어도 약 5x106cell/kg, 적어도 약 6x106cell/kg, 적어도 약 7x106cell/kg, 적어도 약 8x106cell/kg, 적어도 약 9x106cell/kg, 적어도 약 10x106cell/kg 또는 그 이상이 투여될 것이다. 예를 들면, 문헌[Ballen et al. (2001) Transplantation 7: 635-645] 참조. MSC는 주사, 카테터 삽입 등을 포함하는 임의의 방법에 의해 도입될 수 있다. 필요에 따라, 추가의 약물 또는 성장 인자를 함께 투여할 수 있다. 관심 약물은 5-플루오로우라실, 및 사이토카인, 예를 들면 IL-2, IL-3, G-CSF, M-CSF, GM-CSF, IFNγ 및 에리스로포이에틴을 포함하는 성장 인자를 포함한다. 또한, MSC는 콜라겐, Matrigel과 함께, 단독으로 또는 다른 하이드로겔과 함께 주사될 수 있다.
일 양태에서, 본 발명의 증식된 MSC의 군집이 사용되어, 손상되거나 병든 중간엽 조직, 예를 들면, 심장, 췌장, 간, 지방 조직, 뼈, 연골, 내피, 신경, 성상 세포, 진피 등을 복구 또는 재구성할 수 있다. 증식된 MSC가 손상 부위로 이동하거나 손상 부위에 배치되면, 분화하여 새로운 조직을 형성하고 장기 기능을 보충할 수 있다. 일부 양태에서, 세포는 혈관화를 촉진하고 따라서 조직으로부터의 산소화 및 폐기물 제거를 개선하기 위해 사용된다. 이러한 양태에서, 본 발명의 증식된 MSC가 사용되어, 분화된 조직 및 기관, 예를 들면, 심부전에서의 허혈성 심장 또는 뇌졸중에서의 허혈성 신경의 기능을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 증식된 MSC는 유전자 치료를 필요로 하는 환자에서 유전자 치료를 위해 사용될 수도 있다. 일부 양태에서, 특히 일시적인 유전자 발현이 필요하거나 또는 세포의 성숙 및 분열에 의해 유전자 전달이 촉진되는 경우, 보다 성숙한 계통-수탁된 세포가 유용할 것이다. 예를 들면, 일부 레트로바이러스 벡터는 유전자가 통합되기 위해 세포가 순환될 것을 필요로 한다. 새로운 치료 유전자를 전달하기 위해 줄기 세포 및 전구 세포를 형질 도입하는 방법이 당업계에 공지되어 있다.
투여되는 MSC는 본원에 기재된 세포 및 추가의 관심 세포의 혼합물을 포함할 수도 있다. 추가의 관심 세포는 분화된 간 세포, 분화된 심장 근육, 분화된 췌장 세포 등을 제한 없이 포함한다.
증식된 MSC는 면역-매개 장애의 치료를 위해 하나 이상의 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 요법은, 하나 이상의 항미생물제(예를 들면, 항생제, 항바이러스제 및 항진균제), 항종양제(예를 들면, 플루오로우라실, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 플루다라빈, 에토포사이드, 독소루비신 또는 빈크리스틴), 면역 결핍제(예를 들면, 플루다라빈, 에토포사이드, 독소루비신 또는 빈크리스틴), 면역 억제제(예를 들면, 아자티오프린 또는 덱사메타손 또는 프레드니손과 같은 글루코 코르티코이드), 항염증제(예를 들면, 글루코코르티코이드, 예를 들면, 하이드로코르티손, 덱사메타손 또는 프레드니손, 또는 비스테로이드성 항염증제, 예를 들면, 아세틸살리실산, 이부프로펜 또는 나프록센 나트륨), 사이토카인(예를 들면, 인터루킨-10 또는 변형 성장 인자-베타), 호르몬(예를 들면, 에스트로겐) 또는 백신을 포함할 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 또한, 칼시뉴린 억제제(예를 들면, 사이클로스포린 및 타크롤리무스); mTOR 억제제(예를 들면, 라파마이신); 마이코페놀레이트 모페틸, (예를 들면, CD3, CD4, CD40, CD154, CD45, IVIG 또는 B 세포를 인식하는) 항체; 화학 요법제(예를 들면, 메토트렉세이트, 트레오설판, 부설판); 조사; 또는 케모카인, 인터루킨 또는 이들의 억제제(예를 들면, BAFF, IL-2, 항-IL-2R, IL-4, JAK 키나제 억제제)를 포함하지만 이에 제한되지 않는 면역 억제제 또는 관용제(tolerogenic agent)가 투여될 수 있다. 이러한 추가의 약제학적 제제는 원하는 효과에 따라 조절 B 세포의 투여 전에, 투여 동안 또는 투여 후에 투여될 수 있다. 이러한 세포 및 제제의 투여는 동일한 경로 또는 상이한 경로에 의해, 그리고 동일한 부위 또는 상이한 부위에서 이루어질 수 있다.
IV. 키트
일부 양태에서, 예를 들면 MSC를 생성하기 위한 하나 이상의 배지 및 구성 요소를 포함할 수 있는 키트가 제공된다. 이러한 제형은 MSC와 병용하기에 적합한 형태의 인자들의 칵테일을 포함할 수 있다. 시약 시스템은 적절한 경우 수성 배지 또는 동결 건조된 형태로 패키징될 수 있다. 키트의 용기 수단은 일반적으로 적어도 하나의 바이알, 시험관, 플라스크, 병, 시린지 또는 다른 용기 수단을 포함하며, 여기에 구성 요소가 배치될 수 있고 바람직하게는 적절하게 분취될 수 있다. 키트에 하나 이상의 구성 요소가 있는 경우, 키트는 일반적으로 추가의 구성 요소가 별도로 배치될 수 있는 제2, 제3 또는 다른 추가의 용기를 포함한다. 그러나, 구성 요소들의 다양한 조합이 바이알에 포함될 수 있다. 키트의 구성 요소는 건조 분말(들)로 제공될 수 있다. 시약 및/또는 구성 요소가 건조 분말로 제공되는 경우, 적절한 용매를 추가하여 분말이 재구성될 수 있다. 용매는 또 다른 용기 수단에 제공될 수도 있는 것으로 생각된다. 키트는 또한 전형적으로, 상업적 판매를 위해 키트 구성 요소(들)를 밀폐하여 포함하기 위한 수단을 포함한다. 이러한 용기는 원하는 바이알이 보유되는 사출 또는 취입 성형 플라스틱 용기를 포함할 수 있다. 키트는 예를 들면 인쇄된 형식 또는 전자 형식, 예를 들면 디지털 형식의 사용 지침을 포함할 수도 있다.
V. 실시예
이하의 실시예들은 본 발명의 바람직한 양태를 입증하기 위해 포함된다. 이하의 실시예에 개시된 기술은 본 발명의 실행에서 잘 기능하기 위한 본 발명의 발명자에 의해 발견된 기술을 나타내며, 따라서 본 발명의 실행을 위한 바람직한 모드를 구성하는 것으로 간주될 수 있다는 것을 당업자는 이해해야 한다. 그러나, 당업자는 본원에 비추어 볼 때, 개시되는 특정 양태들에서 많은 변경이 이루어질 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 비슷하거나 유사한 결과를 얻을 수 있음을 인식해야 한다.
실시예 1 - 중간엽 기질 세포의 증식
Terumo Quantum 세포 증식 시스템(사용되는 생물 반응기)은 세포의 GMP-준수 생성을 위해 디자인된 자동화된 중공 섬유 세포 배양 플랫폼이다. 간단히 말해서, 정상적인 유아 분만으로부터 제대 조직을 얻고, 히알루로니다제 함유 효소 칵테일(콜라게나제 NB6 0.5U/ml, 히알루로니다제 1U/ml 및 DNAse 250U/ml)을 사용하여 조직을 소화시켰다. 소화 후 세포를 플라스크에 배치하고 며칠 동안 배양했다. 세포가 ~85% 콘플루언트일 때 이를 트립신 처리하고, 재배치하고 다시 배양했고, 콘플루언트를 제거할 때 계대 1(P1)로서 냉동했다(도 1).
이후 P1 세포를 해동하고 Quantum 생물 반응기에서 4 내지 6일 동안 (콘플루언시에 도달할 때까지) 증식시켰다. 생물 반응기의 포도당 및 락트산 수준에 기초하여 이상적인 콘플루언시가 확인되면, 세포를, TNF, IFN-γ, IL-1β 및 IL-17을 포함하는 본 발명의 사이토카인 조합으로 16시간 동안 사전 활성화하고, 세척하고, 수확하여 다양한 검정에서 평가하거나 임상 사용을 위해 냉동했다(도 2).
2천만개의 제대 조직 대 골수 유래 MSC를 생물 반응기에 첨가했을 때, 제대 조직으로 발생된 MSC의 수는 보다 더 짧은 시간 기간에 골수 유래 MSCS의 거의 2배였다(도 3). CBt-MSC는 훨씬 더 많은 수의 "줄기 세포성" 마커인 Nestin, Stro-1, Oct-4, Nanog 및 Cox-2를 발현시켰다(도 5). 중요하게는, 사전 활성화된 CBt-MSC가 기저선(활성화되지 않음) CBt-MSC 또는 BM-MSC에 비해 더 억제성이었다(도 5). 이들은 더 높은 수준의 항-세포자멸사 인자(VGEF, TGFβ), 항염증/항증식 인자(TSG-6), 면역 조절 인자(PD-L1, IDO, PGE2, IL-10, TGFβ) 및 화학 유인-귀소 인자(CXCR4, CXCR3)를 발현시켰다(도 6). 따라서, 사전 활성화되고 증식된 CBt-MSC는 매우 임상적으로 관련된 용량으로 효율적으로 발생되었으며, 다른 MSC 제제보다 더 큰 치료 효과를 가졌다(도 7).
실시예 2 - 물질 및 방법
동의된 만삭 신생아의 건강한 산모로부터 선택적 제왕 절개 후에 CBt를 얻었다. CBt를 페니실린/스트렙토마이신이 있는 plasmalyte 중에서 운반했다. CBt를 7개의 동일한 분획들로 절단하고, GentleMACS Octo 해리기(Miltenyi)에서 DNAse(Genentech)와 함께 또는 상기 효소 없이 콜라게나제-NB4/6(Serva) 및 히알루로니다제(Sigma Aldrich)를 포함하는 다양한 효소 조합과 함께 C-Tubes(Miltenyi)에서 37℃에서 76분 동안 항온 배양했다. 세포 현탁액을 여과하고, 세척하고, 10% 혈소판 용해물, L-글루타민, 헤파린을 함유하는 알파-MEM 배지(완전 배지)에 펜-스트렙과 함께 재현탁하고 T175 플라스크 내로 씨딩한 다음, MSC가 80% 콘플루언트가 될 때까지 배양했다. 세포를 수확하고, 항생제 없는 완전 배지를 사용하여 T175 플라스크에서 80% 콘플루언시로 P1로 증식시켰다.
P1의 수확 후, MSC를 유동 세포 계측법에 의해 전형적인 MSC 표면 마커의 발현에 대해 분석하고 동결 보존했다. 후속적으로 5 내지 6일 동안 Quantum 생물 반응기(Terumo)에서 증식을 수행했다. CBt-MSC의 면역 억제 잠재력은 CD4+ T 세포 증식 검정(CFSE) 및 CD4+ T 세포 사이토카인 분비 검정에 의해 시험관내에서 시험했다. CBt-MSC의 절반을 인터페론 감마로 사전 활성화한 다음, 96웰 플레이트에 씨딩하고 나머지는 처리하지 않고 씨딩했다. 다음 날, MSC를 1:1, 1:2, 1:10 및 1:20의 비의 105개의 단리된 CD4+ T 세포와 함께 항온 배양했다. CD3/28 비드(ThermoFisher Scientific)를 음성 대조군을 제외한 모든 웰에 추가했다. 단리된 T 세포를 CFSE로 10분 동안 염색한 다음, 10% 소 태아 혈청(FBS)과 함께 항온 배양한 후, MSC와 공동 배양했다.
72시간 후, 웰을 BFA(10X), PMA(100X) 및 이오노마이신(10X)으로 처리했다. 웰의 절반을 수확하고 세척하고 항-CD4(Biolegend) 및 Live-Dead 염료(ThermoFisher Scientific)로 염색했다. Cytofix/Cytoperm 고정화 및 투과화 용액(BD Biosciences)에 이어 1X 완충액을 추가하고, 세포를 IL-2(BD), TNF-alpha(BD) 및 인터페론 감마(BD Biosciences)로 염색했다. 5일에, 나머지 웰을 수확하고 항-CD4-APC(Biolegend) 및 Live-Dead(ThermoFisher Scientific)로 염색했다. Fortessa X20(BD Biosciences)을 사용하여 모든 샘플에서 유동 세포 계측을 수행한 다음, FlowJo 소프트웨어로 분석했다.
효소 소화 후, DNAse가 없는 샘플은 P0에서 P1로의 성장이 불량(10일까지 80% 미만의 콘플루언트)했기에 제거했다. NB4, 히알루로니다제 및 DNAse가 표준 효소 조합이 되었다. 51x10e6 CBt-MSC(45 내지 62x10e6cell의 범위)의 중앙값으로 생물 반응기를 씨딩한 후 5 내지 6일 동안 생물 반응기에서 증식하면, 1,495x10e6 CBt-MSC(1,245 내지 1,935x10e6의 범위)의 중앙값이 산출되었다. CBt-MSC의 중앙값 배가 시간(MSCS가 증식하여 2배로 증가하는 데 필요한 시간)은 28.2시간(24.5 내지 29.7시간의 범위)(n = 3)이었다. 면역 억제 검정은 CBt MSC가 용량 의존적 방식으로 CD4+ T 세포의 증식을 억제한다는 것을 입증했다. 또한, CBt-MSC는 CD4+ T 세포가 연속적으로 발생될 때마다 자극된 CD4+ T 세포(IFNγ, TNFα, IL-2)에서의 사이토카인 발현을 감소시켰다. 따라서, 본 발명의 방법은 전체 CBt로부터 MSC를 단리하기 위한 신규한 표준화된 GMP-준수 프로토콜을 제공한다. 면역 억제 성질을 가진 CBt-MSC의 대규모 증식은 Terumo 생물 반응기에서 빠르고 효율적으로 발생될 수 있다.
실시예 3 - 중간엽 줄기 세포의 특성 확인
실시예 1에서 유래된 MSC는 기능성을 측정하기 위해 생체내에서 특성 확인했다. 새로운 CBt-유래 MSC가 이종 이식편 대 숙주 질환(GVHD) 마우스 모델에서 생존률을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(도 8).
NSG(NOD.Cg-Prkdcscid IL2rgtm1Wjl/SzJ) 7주령 수컷 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME, USA)에서 구입하여 실험 1주일 전에 적응시켰다. 마우스(11주령)는 실험 0일에 2x106 G-이동된 말초 혈액 전구 세포(PBPC)를 이식하기 24시간 전에 치사량 미만으로 조사(300cGy)했다. 이후, 마우스는 +8, +11, +14, +18 및 +21일에 꼬리 정맥 주사를 통해 주입당 2x106의 용량으로 BM 또는 CBt-유래 MSC를 5회 투여했다. 생존율, 체중 감소, 털의 질감(fur texture), 신체 활동, 피부 무결성 및 구부러진 등을 매일 기록했다. GVHD의 중증도는 쿠케(Cooke) 등이 기술한 임상 점수 시스템을 통해 평가했다. 그룹당 5마리의 마우스를 사용하고 실험을 3회 수행했다. 결과는 GVHD 대조군과 비교하여 새로운 BM 또는 CBT 유래 MSC를 수여받은 마우스의 전체 생존율에서 상당한 증가를 보였다(도 8a).
일부 실험에서, BM-MSC 또는 CBt-MSC를 782nm에서 방출 피크로 750nm에서 여기된 NIR 친유성 카보시아닌 염료인 Xenolight DiR(Perkin Elmer, Rodgau, Germany)을 사용하여 표지했다. 세포를 PBS(1x106cell/ml)에 재현탁하고 DiR(10μg DiR/ml)로 37℃에서 30분 동안 항온 배양했다. 이후 세포를 배양 배지로 2회 세척하여 혼입되지 않은 염료를 제거했다. 도 8b는, (BM-MSC 또는 CBT-MSC로) 처리된 마우스의 간, 비장 및 결장의 GVHD 징후를 GVHD 대조군과 비교하여 약간의 감소를 나타내는 조직 병리학적 샘플을 도시한다. 도 8c 및 8d는, 꼬리 정맥을 통해 마우스에 주입된 DiR-면역 형광 표지된 MSC를 사용하는 단기 생체 분포 실험을 도시한다. CBt-MSC는 72시간 동안 BM-MSC에 비해 상당히 향상된 지속성을 나타냈다.
다음으로, CBt-MSC의 활성화가 보다 더 높은 면역 억제 성질을 갖는 독특한 프로파일을 나타내는 것을 확인했다(도 9). CBt-MSC는 85%의 콘플루언시까지 1% L-글루타민 및 5% 인간 혈소판 용해물이 보충된 알파 MEM 배지를 사용하여 배양했다. 이후, 24 내지 36시간 동안 배지를 활성화 배지(1% L-글루타민, IFN 감마(10ng/ml), TNF 알파(10ng/ml), IL-1B(10ng/ml) 및 IL-17(10 ng/ml)로 보충된 알파 MEM 배지)로 교체했다. 이후, 제조 지침에 따라 세포를 수확하고 RNA를 추출하고 정제(RNeasy Plus Mini Kit, Qiagen)했다. 배양 조건당 12개의 샘플을 분석했다. RNA 추출, cDNA 예비 증폭 및 서열 분석 품질 관리 후, cDNA 라이브러리를 준비하고 상기 세포의 전사체를 Illumina HiSeq 2500 시스템에서 서열 분석했다. RNAseq 데이터 분석은 MD Anderson Bioinformatics 부서에서 수행했다. 서열 분석 판독은 TOPHAT2 v2.0.1346을 사용하여 인간 참조 게놈(hg38)에 정렬시켰다. 유전자 발현 수준은 hg38 GENCODE v25 유전자 모델에 기반한 HTSEQ47,48을 사용하여 매핑된 판독값을 계수하여 계측했다. EdgeR package48를 사용하여 FDR(false discovery rate) 컷오프<0.01 및 배 변화(fold change)>2로 상이하게 발현된 유전자를 확인했다. 네트워크 분석은 Ingenuity Pathway Analysis®(IPA®, Qiagen)를 사용하여 발생시켰다.
도 9a에 요약된 바와 같이, 휴지 중인 MSC와 활성화된 MSC 사이에 상이하게 발현된 유전자의 히트 맵은, 휴지 중인 CBt-MSCS와 비교하여 활성화된 CBt-MSC에서 816개 유전자의 상향 조절 및 383개 유전자의 하향 조절을 보여주었다. 휴지 중인 UC-MSC 및 활성화된 UC-MSC에서 평가된 유전자의 Ingenuity Pathway Analysis(IPA)는, 세포의 활성화가 여러 면역 조절 경로, 예를 들면, T 세포 고갈, 면역 반응의 음성 조절, IL-6 신호 전달 및 T 세포 세포자멸사의 유도와 관련된 유전자의 발현을 유도한 것을 나타낸다(도 9b).
활성화가 GVHD 이종 이식 마우스 모델에서 CBt-MSC 귀소 및 생체 분포를 향상시키는 것도 관찰되었다(도 10). 활성화된 CBt-MSC vs 휴지 중인 CBt-MSC에서 추출된 RNA에 대해 수행된 IPA 분석은, 활성화된 CBt MSC에 대한 유착 및 침습과 관련된 귀환 수용체 및 주요 유착 분자를 포함하는 혈구 누출 및 귀소와 관련된 여러 유전자의 활성화를 보여주며, 히트 맵에 제시되어 있다(도 10a). 활성화된 CBT MSC vs. 휴지 중인 MSC에 대한 귀소 수용체, 유착 분자 및 침습 단백질(메탈로프로테이나제)의 히트 맵은 유동 세포 계측법에 의해 평가되었다(도 10b). 생체 분포 실험의 경우, 휴지 중인 CBt-MSC 또는 DiR로 사전 표지된 활성화된 CBt-MSC를 GvHD 유도(0일에 PBPC 주입) +8일 후에 꼬리 정맥 주사를 통해 NSG 마우스에 투여했다(마우스당 2x106 MSC).
도 10c 및 10d에서, 72시간 형광 분석 후, 활성화된 CBT-MSC가 대조군 CBt-MSC보다 마우스에서 최대 3일 동안 더 오래 지속되는 것으로 관찰되었다. 도 10e에 도시된 바와 같이, 마우스 조직을 주사 3시간 후, 48시간 후 및 72시간 후에 수확하고 평균 복사 효율을 조직에 의해 계산했다. 폐의 경우 도 10f에, 간의 경우 도 10g에, 그리고 비장의 경우 도 10h에 도시된 바와 같이, 대조군 MSC 그룹과 비교하여 활성화된 CBt-MSC 그룹에 대해 더 높은 형광 수준을 향하는 경향이 나타났다.
다음으로, 동결 보존된 활성화된 UCMSC가 새로운 활성화된 UCMSC와 비교하여 T 세포 활성화를 제어하는 유사한 생존력, 표현형 및 효능을 입증하는 것이 관찰되었다(도 11). 활성화된 세포를 수확하고 2주 동안 냉동시켰다. 이후, 세포를 해동하고 유동 세포 계측을 사용하여 표현형을 분석했다. 도 11a는 아넥신 V 및 프로피듐 요오다이드 검정을 사용하여 유동 세포 계측에 의해 측정된 CBt-MSC의 생존력의 대표적인 FACS 플롯을 도시한다. CBt MSCS(휴지 중인 및 활성화됨)에 의해 매개된 T 세포 면역 억제를 CFSE 검정에 의해 평가했다. 간단히 말해서, 건강한 지원자의 PBMNC에서 림프구를 얻고 피콜(ficoll)에 의해 단리했다. Pant T 세포 마이크로비드(Miltenic)를 사용하여 T 세포를 딘리하고 5(6)-카복시플루오레세인 디아세테이트 N-석신이미딜 에스테르(CFSE; Sigma-Aldrich)로 염색했다. 이후, 이를 림프구 배지인, 10% FBS, 1% L-글루타민, 페니실린(100unit/ml) 및 스트렙토마이신(100μg/ml)을 함유하는 RPMI 1640 배지(Gibco, Grand Island, NY, USA)에 현탁했다. 공동 배양 검정을 위해, 100ul의 MSC를 96웰 플레이트에 상이한 농도(1x106/ml, 0.5x106/ml, 1x105/ml)로 씨딩하고 1시간 동안 항온 배양했다. 검정을 위해, CD3/CD28 비드(Invitrogen)로 자극된 105개의 림프구를 4일 동안 MSC 단층에 씨딩했다. 이후, 세포를 수확하고 세척하고 생존력(Live/Dead Aquia Fluorescence), CD3, CD8, CD4에 대해 염색했다. T 세포의 증식은 유동 세포 계측으로 평가했다. 나이브(자극되지 않음) 림프구(음성 대조군) 및 MSC 없이 자극된 T 세포(양성 대조군)를 대조군으로서 사용했다. 도 11b는 모든 상이한 비의 CD3/CD28 비드로 활성화된 T 세포의 전체 억제를 입증하는 T 세포 증식 CFSE 검정의 대표적인 히스토그램을 도시한다. 도 11c는 면역 억제 인자의 발현 지속성을 보여주는 새로운 세포 또는 동결/해동된 세포로 활성화된 MSC 표현형의 대표적인 FACS 플롯을 도시한다.
동결 보존된 활성화된 CBt-MSC가 전체 생존율을 증가시키고 GVHD 독성을 감소시키는 것 또한 관찰되었다(도 12). 마우스에 300cGy를 조사한 다음, 상기 기재한 바와 같이 24시간 이내에 2x106 G-이동된 PBPC를 주입했다. CBt-MSC를 해동하고 DPBS에서 2회 세척하고 식염수 중 2x106cell/0.1mL의 농도로 재현탁했다. CBt-MSC는 모든 실험에서 해동 후 3시간 이내에 주사했다. GVHD 대조군 마우스에 0.1mL 식염수 용액을 주사했다. 본 실험을 위해 각각의 그룹으로부터 11마리의 마우스를 사용했다. 각각의 그룹의 3마리의 마우스를 조직학적 분석을 위해 24일에 안락사시켰다. 마우스를 마취시키고 혈액을 수집하고 처리했다. 인간 림프구 군락은 유동 세포 계측에 의해 측정했다. 마이크로어레이 검정을 사용하여 사이토카인을 측정하기 위해 혈장 샘플을 분석했다. 검정은 삼중으로 수행했다.
도 12a 내지 12c는 마우스 그룹(그룹당 n = 8 마우스)으로의 생체내 실험을 요약한다. 도 12a는 처리되지 않은 수여자(GVHD 대조군), 활성화되지 않은 CBt-MSC의 수여자 및 활성화된 CBt-MSC의 수여자에 대한 생존 곡선을 도시한다. 데이터는 활성화되지 않은 MSC 또는 대조군과 비교하여 활성화된 CBT-MScs의 수여자에 대한 생존 이익을 입증했다. 도 12b는 활성화된 CBt-MSC의 수여자 대 다른 두 그룹에 대해 더 적은 체중 감소를 입증하는 퍼센트 중량 변화를 도시한다. 도 12c는 평균 GVHD 점수를 도시하며, 활성화된 CBT-MSC 그룹에 대해 더 적은 GVHD를 다시 도시한다. 도 12d는 종료 시점의 3개 그룹의 마우스 사이에서 비교된 문맥 간 염증을 도시한다. 도 12e는 치료되지 않은 마우스(대조군), 휴지 중인 CBt-MSC로 처리된 마우스 대 활성화된 MSC로 처리된 마우스(활성화됨)의 혈액 시험의 비교를 도시한다. 혈액 시험은 WBC 수, MCV, MCHC, 헤마토크릿, 헤모글로빈, 혈소판 수, RBC 수, MCH, RDW, 알부민, 알칼리성 포스파타제, 칼륨, LDH, AST, 포도당, ALT, 인, 총 단백질이 포함된다. 결과는 대조군 또는 활성화되지 않은 MSC로 처리된 그룹과 비교하여 활성화된 MSC로 처리된 그룹에서의 혈소판 수, 포도당, WBC 수 및 간 기능(ALT, AST)의 개선을 보인다.
도 12f는 마우스의 혈액 중 사이토카인 수준의 결과를 도시하며, 이는 활성화된 CBt-MSC 및 활성화되지 않은 CBt-MSC 둘 다 대조군 마우스에 비해 염증성 사이토카인의 존재를 감소시켰음을 보인다. 도 12g는 24일의 마우스의 혈액 중 인간 CD45의 퍼센티지를 도시한다. 좌측 패널은 각각의 그룹의 대표적인 FACS 플롯을 보여주는 반면, 우측 패널은 대조군(처리되지 않음)과 비교한 통계적 비교가 있는 막대 플롯을 보여주며, **p-값<0.01, ****p-값<0.0001은 활성화된 MSC가 있는 MSC 수여자 그룹 둘 다의 혈액 중의 더 적은 인간 CD45+ 세포가, 활성화되지 않은 MSC 수여자보다 적은 수를 나타냄을 나타낸다.
* * *
본 발명에 개시되고 청구되는 모든 방법은 본원의 개시 내용에 비추어 과도한 실험 없이 제조되고 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법이 바람직한 양태의 관점에서 설명되었지만, 본 발명의 개념, 정신 및 범위를 벗어나지 않고 본원 명세서에서 기술되는 방법 및 방법의 단계 또는 단계들의 순서에 변형이 적용될 수 있음은 당업자에게 명백할 것이다. 보다 구체적으로는, 화학적 및 생리학적으로 관련된 특정 제제가 본원에 기재된 제제로 대체될 수 있는 동시에 동일하거나 유사한 결과가 달성될 수 있음이 명백할 것이다. 당업자에게 명백한 이러한 모든 유사한 대체물 및 수정물은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 사상, 범위 및 개념 내에 있는 것으로 간주된다.
참고 문헌
다음의 참고 문헌들은 이들이 본원 명세서에 언급되는 것들에 대해 보충적인 예시적인 절차 또는 기타 세부 사항을 제공하는 정도로 인용에 의해 구체적으로 본원에 포함된다.
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Claims (70)

  1. 제대 조직 유래 중간엽 기질 세포(mesenchymal stromal cell: MSC)의 증식 방법으로서,
    (a) 제대 조직으로부터 MSC의 군집을 얻는 단계;
    (b) TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 적어도 3개의 사이토카인의 존재 하에 상기 MSC를 사전 활성화하는 단계; 및
    (c) 상기 사전 활성화된 MSC를 증식시켜 증식된 MSC의 군집을 얻는 증식 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제대 조직으로부터의 MSC의 군집이 이전에 동결 보존된, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 얻는 단계가 상기 제대 조직을 효소 칵테일로 처리함을 포함하는, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 효소 칵테일이 히알루로니다제 및 콜라게나제를 포함하는, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 NB4/6인, 방법.
  6. 제3항에 있어서, 상기 효소 칵테일이 DNAse를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제4항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 농도가 0.5 내지 1.5U/mL인, 방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 농도가 1U/mL인, 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제의 농도가 0.1 내지 1U/mL인, 방법.
  10. 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제의 농도가 0.5U/mL인, 방법.
  11. 제6항에 있어서, 상기 DNAse의 농도가 200 내지 300U/mL인, 방법.
  12. 제6항에 있어서, 상기 DNAse의 농도가 250U/mL인, 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 사전 활성화 전에 적어도 85%의 콘플루언시(confluency)로 배양되는, 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 사전 활성화 전에 6 내지 8일 동안 배양되는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 5억개의 MSC가 사전 활성화 전에 얻어지는, 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전 활성화가 12 내지 24시간 동안인, 방법.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 사전 활성화가 16시간 동안인, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 TNFα, IFNγ, IL-1β 및 IL-17의 존재 하에 사전 활성화되는, 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, TNFα, IFNγ 및/또는 IL-1β의 농도가 5 내지 15ng/mL인, 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, TNFα, IFNγ 및/또는 IL-1β의 농도가 10ng/mL인, 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-17이 20 내지 40ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IL-17이 30ng/mL의 농도로 존재하는, 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식 단계가 기능적으로 폐쇄된 시스템에서 수행되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 상기 기능적으로 폐쇄된 시스템이 생물 반응기(bioreactor)인, 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 생물 반응기가 중공 섬유 생물 반응기인, 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 증식 단계가 7일 미만 동안 수행되는, 방법.
  27. 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 증식 단계가 5 내지 6일 동안 수행되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 적어도 50배 증식되는, 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 적어도 70배 증식되는, 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC의 배가 시간(doubling time)이 28시간 미만인, 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 MSC의 군집이 골수 MSC에 비해 더 많은 면역 억제 표현형을 갖는, 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 MSC의 군집이 사이토카인 사전 활성화없이 증식된 제대 조직 유래 MSC에 비해 더 많은 면역 억제 표현형을 갖는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서, 상기 면역 억제 표현형이 항-세포자멸사 인자, 항염증 인자, 면역 조절 인자 및/또는 화학 유인-귀소 인자(chemoattraction-homing factor)의 발현에 의해 계측되는, 방법.
  34. 제33항에 있어서, 항-세포자멸사 인자가 VGEF 및/또는 TGFβ인, 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 항염증 인자가 TSG-6인, 방법.
  36. 제33항에 있어서, 상기 화학 유인-귀소 인자가 CXCR4 및 CXCR3인, 방법.
  37. 제33항에 있어서, 상기 면역 조절 인자가 PD-L1, IDO, PGE2, IL-10 및 TGFβ로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 MSC의 군집이 골수 유래 MSC에 비해 증가된 줄기 세포성 마커 및/또는 케모카인 수용체의 발현을 갖는, 방법.
  39. 제38항에 있어서, 상기 줄기 세포성 마커가 Nestin, Stro-1, Oct-4, Nanog 및 Cox-2로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  40. 제38항에 있어서, 상기 케모카인 수용체가 VEGF, HLA-G, PGE, CXCR4, IL-10 및 TGFβ로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 MSC의 군집이 골수 유래 MSC에 비해 증가된 유착 및 침습 관련 유전자의 발현을 갖는, 방법.
  42. 제41항에 있어서, 상기 유착 및 침습 관련 유전자가, GLG1, VCAM1, CXCR4, ICAM1, CSF3, CXCL3, CXCL8, SELPG, STAT1, IFITT3, ISG15, STAT2, MX1, OAS1, IFI6, JAK2, TAP1, IFI35, IFITM1, PSM89, IRF1, IFITM3, PTPN2, RELA, IFNAR2, HSP90AA1, JUN, ARNT, HIF1 및 CUL2로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  43. 제1항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법이 GMP-준수인, 방법.
  44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증식된 MSC를 동결 보존하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  45. 콜라게나제, 히알루로니다제 및 DNAse를 포함하는, 제대 조직 해리용 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 조성물이 MSC를 단리시키기 위해 제대 조직을 해리시키는, 방법.
  47. 제45항 또는 제46항에 있어서, 상기 조성물이 콜라게나제, 히알루로니다제 및 DNAse로 구성되는, 방법.
  48. 제45항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 BSA 또는 트립신 억제제를 포함하지 않는, 방법.
  49. 제45항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제가 콜라게나제 NB4/6인, 방법.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 농도가 0.5 내지 1.5U/mL인, 방법.
  51. 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 히알루로니다제의 농도가 1U/mL인, 방법.
  52. 제45항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제의 농도가 0.1 내지 1U/mL인, 방법.
  53. 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 콜라게나제의 농도가 0.5U/mL인, 방법.
  54. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNAse의 농도가 200 내지 300U/mL인, 방법.
  55. 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 DNAse의 농도가 250U/mL인, 방법.
  56. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생성된 증식된 MSC 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, 조성물.
  58. 대상체에서 염증성 질환을 치료하는 방법으로서, 치료 유효량의 제대 조직 유래 MSC를 상기 대상체에게 투여함을 포함하는, 방법.
  59. 제58항에 있어서, 상기 대상체가 인간인, 방법.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 제대 조직 유래 MSC가 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 따라 생성된, 방법.
  61. 제58항에 있어서, 상기 제대 조직 유래 MSC가 이전에 동결 보존된, 방법.
  62. 제58항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 염증성 질환이 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 자가 면역 질환, 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 염증성 장 질환인, 방법.
  63. 제58항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 동종 유래(allogeneic)인, 방법.
  64. 제58항 내지 제63항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 전신적으로 또는 국소적으로 투여되는, 방법.
  65. 제58항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가, 직장, 비강, 협측, 질, 피하, 피내, 정맥내, 복강내, 근육내, 관절내, 활액내, 흉골내, 척수강내, 병변내 또는 두개내 경로를 통해, 또는 이식된 저장소를 통해 투여되는, 방법.
  66. 제58항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 MSC가 적어도 하나의 추가의 치료제와 함께 투여되는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 상기 적어도 하나의 추가의 치료제가 치료 유효량의 면역 조절제 또는 면역 억제제인, 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 면역 억제제가, 칼시뉴린 억제제, mTOR 억제제, 항체, 화학 요법제 조사, 케모카인, 인터루킨, 또는 케모카인 또는 인터루킨의 억제제인, 방법.
  69. 염증성 장애를 치료하기 위한, 치료 유효량의, 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 생성된 증식된 MSC의, 용도.
  70. 제69항에 있어서, 상기 염증성 질환이, 이식편 대 숙주 질환(GVHD), 자가 면역 질환, 급성 허혈성 뇌졸중, 심근 손상, 급성 호흡 곤란 증후군(ARDS) 또는 염증성 장 질환인, 용도.
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