KR20210065684A

KR20210065684A - A Novel compound

Info

Publication number: KR20210065684A
Application number: KR1020190154724A
Authority: KR
Inventors: 이헌구; 한명관; 홍기범; 이지훈; 유지훈; 이주석; 임선영; 송화령
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2019-11-27
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-06-04
Also published as: KR102319054B1

Abstract

The present invention relates to a novel compound and uses thereof. The novel compound according to the present invention, by inducing the activation of an MKP-1 protein, has an effect of inhibiting inflammatory responses very effectively that occur in respiratory diseases by blocking cell signaling in the order of p38/CK2alpha/NF-kappaB. Accordingly, it is possible to prevent, alleviate or treat the respiratory diseases by oral administration of the novel compound of the present invention.

Description

Novel compound {A Novel compound}

본 발명은 호흡기 질환에서 염증을 억제할 수 있는 신규한 화합물에 관한 것이다.The present invention relates to novel compounds capable of inhibiting inflammation in respiratory diseases.

천식은 만성 질환 중 하나로서, 기도의 알레르기 염증에 의한 기도 과민성과 기도 평활근 수축으로 인한 기침을 동반한 호흡곤란이 주요한 증상으로 나타난다. 질환은 종종 기관지 평활근계의 경련을 야기하며, 상기도 및 하기도 모두에 영향을 미친다. 천식은 그 증상의 중증도에 따라 다양한 유형이 존재한다. 예를 들어 경증 천식은 호흡곤란 또는 기침이 있거나 또는 없는 등의 증상으로 정의되며, 중등도 천식은 천명 및 호흡곤란으로 정의되며, 기침 및 가래배출이 있거나 또는 없을 수 있으나, 일반적으로 일상 활동이나 수면을 방해한다. 마지막으로 중증 천식은 호흡곤란으로 인한 무능력을 특징으로 하며, 고통받는 환자는 통상적으로 정상적으로 음식을 섭취하거나 잠을 잘 수 없으며, 불안감에 시달리며 탈진의 증상을 보인다. 이와 같이 증상을 나타내는 천식은 전세계적으로 3억 명의 환자가 존재하며, 천식으로 인한 사망자 수는 해마다 25,000명에 이르고 있다.Asthma is one of the chronic diseases, and the main symptoms are airway hypersensitivity due to allergic inflammation of the airways and difficulty breathing with cough due to airway smooth muscle contraction. The disease often causes spasms of the bronchial smooth muscle system, affecting both the upper and lower airways. There are various types of asthma depending on the severity of the symptoms. For example, mild asthma is defined as symptoms such as shortness of breath or cough with or without coughing, moderate asthma is defined as wheezing and dyspnea, which may or may not have cough and phlegm, but generally prevents daily activities or sleep. interfere Finally, severe asthma is characterized by inability to breathe due to dyspnea, and the afflicted patient is usually unable to eat or sleep normally, suffer from anxiety, and show symptoms of exhaustion. As such, there are 300 million patients worldwide with symptomatic asthma, and the number of deaths due to asthma reaches 25,000 each year.

한편, 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD)은 기도가 좁아지는 폐 질환의 한 군으로서, 폐에 유입 및 배출되는 공기의 흐름이 제한되어 호흡곤란을 야기한다. 호흡기 질환의 일환인 천식과는 달리 기류의 제한은 가역성이 불량하며, 일반적으로 시간 경과에 따라 점진적으로 악화된다. 상기 COPD는 폐기종 및 만성 폐쇄성 기관지염과 같은 주요한 증상을 나타낸다.On the other hand, Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a group of lung diseases in which the airways are narrowed, and the flow of air flowing into and out of the lungs is restricted, causing breathing difficulties. Unlike asthma, which is part of a respiratory disease, airflow limitation is poorly reversible and usually gets progressively worse over time. The COPD presents major symptoms such as emphysema and chronic obstructive bronchitis.

상기 폐기종에서는 다수의 기낭 사이의 벽이 손상되어 그 형태의 변형이 일어나 처지게 되며, 이와 같은 손상에 의해 연속적인 기낭 사이의 손상이 유도되게 된다. 또한, 상기 만성 폐쇄성 기관지염에서는 기도의 내층이 지속적인 자극에 의해 염증이 유발되어, 내층이 두껍게 되고 이를 통해 두꺼운 점액이 기도에 형성되어 호흡 곤란에 이르게 된다.In the emphysema, the wall between a plurality of air sacs is damaged, and its shape is deformed and sagged, and damage between consecutive air sacs is induced by such damage. In addition, in chronic obstructive bronchitis, the inner layer of the airway is inflamed by continuous stimulation, and the inner layer is thickened and thick mucus is formed in the airway through this, leading to difficulty in breathing.

상기 만성 기관지염 및 폐기종은 가장 흔하게는 흡연에 의하여 야기될 수 있으며, COPD를 갖는 환자의 약 90%가 현재 흡연을 하고 있거나, 또는 과거에 흡연 경력이 있는 자들이었다. 흡연자의 약 50%가 만성 기관지염을 발생시키기는 하나, 흡연자의 15%만이 무능력 기류 폐쇄가 발생된다. 그러나, COPD는 인간에만 국한되어 발병되지 않고, 기타의 포유동물, 예를 들면 말도 마찬가지로 COPD를 앓는 것으로 알려져 있다.The chronic bronchitis and emphysema are most commonly caused by smoking, and about 90% of patients with COPD currently smoke or have smoked in the past. Although about 50% of smokers develop chronic bronchitis, only 15% of smokers develop incapacitating airflow obstruction. However, COPD is not limited to humans, and it is known that other mammals, such as horses, also suffer from COPD.

상기 COPD는 사망 및 장애의 중요한 원인으로서, 미국 및 유럽에서 4번째의 주요 사망 원인일 뿐만 아니라 아시아에서 역시 발병률이 매우 높은 실정이다. 치료 지침은 질환으로 인한 이환률 및 사망률을 감소시키는 것을 돕기 위하여 조기 발견 및 금연 프로그램의 실시를 권장하나, 상기 COPD는 조기 발견이 어려우며, 질병이 많이 진행된 단계에서 완치를 유도할 수 있는 약물이 아직까지 존재하지 않는다는 한계점이 존재한다.The COPD is an important cause of death and disability, and is the fourth leading cause of death in the United States and Europe, and also has a very high incidence in Asia. Treatment guidelines recommend early detection and implementation of a smoking cessation program to help reduce morbidity and mortality due to the disease, but early detection of the COPD is difficult, and drugs that can induce a cure at an advanced stage of the disease are still available. There is a limit that does not exist.

상기 천식의 경우 그 증상의 정도에 따라 흡입형 스테로이드 및 베타2 항진제(β2-agnoists)가 널리 사용되고 있으나, 약 20%의 환자에서는 조절되지 않으며, 3~5%의 환자에서는 고농도의 스테로이드 및 베타2 항진제에 의해 전혀 치료가 되지 않는다. 특히 이와 같은 흡입형 치료제는 고농도로 스테로이드를 장기간 투여하는 방법이기 때문에, 목소리 변형, 구강 곰팡이 감염 및 호르몬의 불군형 등과 같은 부작용이 존재한다. In the case of asthma, inhaled steroids and beta 2 agonists (β2-agnoists) are widely used depending on the severity of the symptoms, but it is not controlled in about 20% of patients, and in 3 to 5% of patients, high-concentration steroids and beta 2 It is not cured at all by agonists. In particular, since such an inhaled therapeutic agent is a method of long-term administration of a steroid at a high concentration, there are side effects such as voice deformity, oral fungal infection, and hormonal imbalance.

본 발명의 일 목적은 호흡기 질환에서 염증을 억제할 수 있는 신규 화합물을 제공하는 것이다.One object of the present invention is to provide a novel compound capable of inhibiting inflammation in respiratory diseases.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.However, the technical task to be achieved by the present invention is not limited to the tasks mentioned above, and other tasks not mentioned will be clearly understood by those of ordinary skill in the art from the following description.

본 발명의 일 구현 예에서는 하기 화학식 1로 나타내어지는 화합물, 이의 약학적으로 허용 가능한 염, 광학이성질체, 수화물 및 용매화물로부터 선택되는 신규한 화합물을 제공한다:In one embodiment of the present invention, there is provided a novel compound selected from the compound represented by the following formula (1), pharmaceutically acceptable salts, optical isomers, hydrates and solvates thereof:

[화학식 1][Formula 1]

상기 화학식 1에서,In Formula 1,

R₁ 및 R₂은 각각 독립적으로 H 또는 -C(=O)-R₁₀이나, 상기 R₁ 및 R₂는 동시에 H가 아니고; R ₁ and R ₂ are each independently H or -C(=O)-R _{10 ,} but R ₁ and R ₂ are not H at the same time;

R₃ 내지 R₆은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬기이며;R ₃ to R ₆ are each independently H or a C1-C6 alkyl group;

R₇ 및 R₈은 각각 독립적으로 H, -C(=O)-R₁₁, 또는 -C(=O)-O-L₁-R₁₂이나, 상기 R₇ 및 R₈은 동시에 H가 아니고; R ₇ and R ₈ are each independently H, -C(=O)-R ₁₁ , or -C(=O)-OL ₁ -R _{12 ,} but R ₇ and R ₈ are not H at the same time;

R₉는 C1-C6 알킬기이며;R ₉ is a C1-C6 alkyl group;

R₁₀ 및 R₁₁은 각각 독립적으로 C1-C6 알킬기이고;R ₁₀ and R ₁₁ are each independently a C1-C6 alkyl group;

R₁₂는 C1-C6 알킬기, C6-C12 아릴기 또는 핵원자수 5 내지 20개의 비-방향족 축합 다환기이며;R ₁₂ is a C1-C6 alkyl group, a C6-C12 aryl group or a non-aromatic condensed polycyclic group having 5 to 20 nuclear atoms;

L₁은 직접 결합 또는 C1-C6 알킬렌기이고;L ₁ is a direct bond or a C1-C6 alkylene group;

상기 R₉의 알킬기는 1종 이상의 C6-C12 아릴기로 치환되거나 비치환되고, 복수 개의 치환기로 치환되는 경우 이들은 서로 동일하거나 상이하며;The _{alkyl group of R 9} is unsubstituted or substituted with one or more C6-C12 aryl groups, and when substituted with a plurality of substituents, they are the same as or different from each other;

*는 카이랄 중심이다.* is the chiral center.

본 발명의 상기 "알킬기"는 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 포화 1가 탄화수소 라디칼을 의미하며, 상기 알킬은 본 발명에 기재되는 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되거나, 치환되지 않을 수 있다. 본 발명의 상기 알킬기는 탄소수는 1 내지 6인 것으로서, 예를 들면 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, t-부틸기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, 또는 헥실기 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The "alkyl group" of the present invention may be straight-chain or branched, and refers to a saturated monovalent hydrocarbon radical, wherein the alkyl may be unsubstituted or optionally substituted with one or more substituents described in the present invention. The alkyl group of the present invention has 1 to 6 carbon atoms, for example, a methyl group, an ethyl group, a propyl group, an isopropyl group, a butyl group, a t-butyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, a sec-butyl group, or a hexyl group, etc., but is not limited thereto.

본 발명의 상기 "알킬렌기"는 -CnH₂n- 알케인의 양단의 탄소원자에서 수소원자가 하나씩 빠진 형태로서, 직쇄 또는 분지쇄일 수 있고, 상기 알킬렌기는 본 발명에 기재되는 하나 이상의 치환체로 임의로 치환되거나, 치환되지 않을 수 있다. 본 발명의 상기 알킬렌기는 탄소수는 1 내지 6인 것으로서, 예를 들면 메틸렌기, 에틸렌기, 프로필렌기, 이소프로필렌기, 부틸렌기, t-부틸렌기, n-부틸렌기, 이소부틸렌기, sec-부틸렌기, 또는 헥실렌기 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The "alkylene group" of the present invention is a _{form in which one hydrogen atom is omitted from each carbon atom at both ends of -CnH 2} n- alkane, and may be straight-chain or branched, and the alkylene group is optionally substituted with one or more substituents described in the present invention. It may be substituted or unsubstituted. The alkylene group of the present invention has 1 to 6 carbon atoms, for example, a methylene group, ethylene group, propylene group, isopropylene group, butylene group, t-butylene group, n-butylene group, isobutylene group, sec- It may be a butylene group, a hexylene group, or the like, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 "아릴기"는 다른 언급이 없으면, 융합 또는 비-융합된 하나 이상의 방향족 고리를 갖는, 탄소수 6 내지 12개의 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 고리 시스템을 지칭하고, 아릴기의 예로는 페닐기, 할로페닐기, 테트라하이드로나프틸, 인데닐, 안드라세닐, 벤질기, 할로벤질기, 나프틸기 또는 바이아릴기 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The "aryl group" of the present invention refers to a mono- or poly-cyclic carbocyclic ring system having 6 to 12 carbon atoms, having one or more fused or non-fused aromatic rings, unless otherwise stated, and an aryl group Examples of the group may be a phenyl group, a halophenyl group, tetrahydronaphthyl, indenyl, andracenyl, benzyl group, halobenzyl group, naphthyl group, or biaryl group, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 "비-방향족 축합 다환기"는 2 이상의 고리가 서로 축합되어 있고, 고리 형성 원자로서 탄소수 5개 내지 20개의 탄소를 포함하고, 분자 전체가 비-방향족성(non-aromacity)를 갖는 그룹을 의미한다. 상기 비-방향족 축합 다환기의 예로는 플루오레닐 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.In the "non-aromatic condensed polycyclic group" of the present invention, two or more rings are condensed with each other, and contain 5 to 20 carbon atoms as ring forming atoms, and the entire molecule is non-aromatic. means a group with Examples of the non-aromatic condensed polycyclic group may be fluorenyl, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 "치환되거나"란, 상기 알킬기에 존재하는 1개 이상의 수소가 C1-C12 아릴기로 치환되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.The "substituted" of the present invention may mean that one or more hydrogens present in the alkyl group are substituted with a C1-C12 aryl group, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 "카이랄 중심"이란, 4개의 다른 치환기가 붙어 있는 탄소 원자를 의미하는 것으로서, 카이랄 중심을 기준으로하여 분자가 거울상과 동일하지 않아 겹쳐지지 않는 경우 카이랄성이 있는 화합물로 판별할 수 있다. 이와 같은 카이랄성은 CORN 규칙에 따라 카이랄 중심의 탄소 주변에 카복시기, 치환기, 아미노기의 순서가 시계방향인 경우 D형으로 나타낼 수 있고, 반시계 방향인 경우 L형으로 나타낼 수 있다.The "chiral center" of the present invention means a carbon atom to which four different substituents are attached, and when the molecules are not identical to the mirror image based on the chiral center and do not overlap, it is a compound having chirality. can be discerned. According to the CORN rule, such chirality may be expressed as a D-type when the order of a carboxyl group, a substituent, and an amino group around the carbon of the chiral center is clockwise according to the CORN rule, and can be expressed as an L-type when counterclockwise.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₁ 및 R₂ 중 어느 하나는 H이고, 나머지는 -C(=O)-R₁₀일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention _{, any one of R 1} and R ₂ may be H, and the rest may be -C(=O)-R ₁₀ .

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₃ 내지 R₆은 각각 독립적으로 H 또는 C1-C3 알킬기일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 R₃ 내지 R₆은 모두 H일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, R ₃ to R ₆ may each independently be H or a C1-C3 alkyl group, and more preferably, R ₃ to R ₆ may be all H.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₇ 및 R₈ 중 어느 하나는 H이고, 나머지는 -C(=O)-R₁₁ 또는 -C(=O)-O-L₁-R₁₂ 일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention _{, any one of R 7} and R ₈ may be H, and the rest may be -C(=O)-R ₁₁ or -C(=O)-OL ₁ -R ₁₂ .

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₉는 C1-C3 알킬기일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기일 수 있다. 상기 R₉의 알킬기는 1종 이상의 C6-C12 아릴기로 치환될 수 있고, 보다 바람직하게는 상기 R₉의 알킬기의 어느 일 수소가 페닐기로 치환된 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, R ₉ may be a C1-C3 alkyl group, most preferably a methyl group or an ethyl group. The _{alkyl group of R 9} may be substituted with one or more C6-C12 aryl groups, and more preferably, any one hydrogen of the alkyl group of _{R 9 may be substituted with a phenyl group.}

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₁₀은 및 R₁₁은 각각 독립적으로 C1-C3 알킬기일 수 있고, 보다 바람직하게는 메틸기 또는 에틸기일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, R ₁₀ and R ₁₁ may each independently be a C1-C3 alkyl group, more preferably a methyl group or an ethyl group.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 R₁₂는 C6-C12 아릴기 또는 핵원자수 5 내지 20개의 비-방향족 축합 다환기일 수 있고, 보다 바람직하게는 페닐기 또는 플루오렌기일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, R ₁₂ may be a C6-C12 aryl group or a non-aromatic condensed polycyclic group having 5 to 20 nuclear atoms, more preferably a phenyl group or a fluorene group.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 L₁은 C1-C6 알킬렌기일 수 있고, 보다 바람직하게는 C1-C3 알킬렌기일 수 있으며, 가장 바람직하게는 메틸렌기 또는 에틸렌기일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, L ₁ may be a C1-C6 alkylene group, more preferably a C1-C3 alkylene group, and most preferably a methylene group or an ethylene group.

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 *는 카이랄 중심으로서, 상기 화합물은 *로 표시되는 카이랄 중심을 기준으로, L 폼(L form)인 것일 수 있다.In a preferred embodiment of the present invention, the * is a chiral center, and the compound may be in L form based on the chiral center represented by *.

본 발명의 상기 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는 화합물일 수 있다:The compound of the present invention may be a compound represented by the following formula 2:

[화학식 2][Formula 2]

상기 화학식 2에서,In Formula 2,

상기 R₁, R₂, R₇ 내지 R₁₂ 및 L₁과 * 각각의 정의는 상기 화학식 1에서 정의된 바와 동일하다.The _{definitions of R 1} , R ₂ , R ₇ to R _{12 ,} and L ₁ and * are the same as those defined in Formula 1 above.

본 발명의 상기 화합물은 하기 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인 것일 수 있다:The compound of the present invention may be at least one selected from the group consisting of the following compounds:

본 발명의 바람직한 일 실시예에서, 상기 화합물은 하기 화합물 중 어느 하나인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:In a preferred embodiment of the present invention, the compound may be any one of the following compounds, but is not limited thereto:

,

,

,

,

,

,

,

.

,

.

본 발명의 상기 화합물은 MKP-1 단백질의 활성화를 유도함으로써, p38/CK2α/NF-kB 순서로 이루어지는 세포신호전달을 차단하여 호흡기 질환에서 발생되는 염증 반응을 매우 효과적으로 억제할 수 있다.The compound of the present invention can inhibit the inflammatory response occurring in respiratory diseases very effectively by inducing the activation of MKP-1 protein, thereby blocking cell signaling in the order of p38/CK2α/NF-kB.

본 발명은 또한 상기 화학식 1 또는 화학식 2로 표시되는 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염을 제공한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 인체에 독성이 낮고 모화합물의 생물학적 활성과 물리화학적 성질에 악영향을 주지 않아야 한다. 약학적으로 허용 가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산과 화학식 1 또는 화학식 2의 염기 화합물의 산부가염 등이 가능하나, 이에 제한되지는 않는다. The present invention also provides a pharmaceutically acceptable salt of the compound represented by Formula 1 or Formula 2. Pharmaceutically acceptable salts should have low toxicity to the human body and should not adversely affect the biological activity and physicochemical properties of the parent compound. The pharmaceutically acceptable salt may be an acid addition salt of a pharmaceutically acceptable free acid and a base compound of Formula 1 or Formula 2, but is not limited thereto.

본 발명의 상기 화합물의 바람직한 염의 형태로는 무기산 또는 유기산과의 염을 들 수 있다. 이때, 무기산은 염산, 황산, 질산, 인산, 과염소산, 브롬산 등이 사용될 수 있다. 또한, 유기산은 초산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, p-톨루엔설폰산, 푸마린산, 말레산, 말론산, 프탈산, 숙신산, 젖산, 구연산, 시트르산, 글루콘산, 타타르산, 살리실산, 말산, 옥살산, 벤조산, 엠본산, 아스파르트산, 글루탐산 등이 사용될 수 있다. 유기염기 부가염 제조에 사용될 수 있는 유기염기는 트리스(하이드록시메틸)메틸아민, 디사이클로헥실아민 등이다. 아미노산 부가염 제조에 사용될 수 있는 아미노산은 알라닌, 글라이신 등의 천연아미노산이다. 상기 예시된 무기산, 유기산, 유기염기 및 아미노산 외에 다른 산 또는 염기가 사용될 수 있음은 당해 기술분야에서 통상의 기술을 가진 자에게 자명할 것이다. A preferred salt form of the compound of the present invention is a salt with an inorganic acid or an organic acid. In this case, the inorganic acid may be hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, perchloric acid, hydrobromic acid, and the like. In addition, organic acids include acetic acid, methanesulfonic acid, ethanesulfonic acid, p-toluenesulfonic acid, fumaric acid, maleic acid, malonic acid, phthalic acid, succinic acid, lactic acid, citric acid, citric acid, gluconic acid, tartaric acid, salicylic acid, malic acid, Oxalic acid, benzoic acid, embonic acid, aspartic acid, glutamic acid and the like can be used. Organic bases that can be used in the preparation of the organic base addition salt are tris(hydroxymethyl)methylamine, dicyclohexylamine, and the like. Amino acids that can be used to prepare amino acid addition salts are natural amino acids such as alanine and glycine. It will be apparent to those skilled in the art that other acids or bases other than the inorganic acids, organic acids, organic bases and amino acids exemplified above may be used.

본 발명의 상기 염은 통상적인 방법으로 제조될 수 있다. 예를 들어 상기한 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 메탄올, 에탄올, 아세톤, 1,4-디옥산과 같은 물과 섞일 수 있는 용매에 녹인 다음에 유리산 또는 유리 염기를 가한 후에 결정화시켜 제조할 수 있다. The salt of the present invention can be prepared by a conventional method. For example, it can be prepared by dissolving the compound of Formula 1 or Formula 2 in a water-miscible solvent such as methanol, ethanol, acetone, and 1,4-dioxane, and then adding a free acid or a free base to crystallize it. have.

본 발명의 상기 화합물들은 비대칭 탄소 중심을 가질 수 있으므로 L 또는 D 폼 또는 라세믹 화합물로서 존재할 수 있으며 이들 모든 광학이성질체 및 혼합물은 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.The compounds of the present invention may have an asymmetric carbon center and thus may exist as L or D form or racemic compounds, and all enantiomers and mixtures thereof may be included within the scope of the present invention.

본 발명의 상기 화합물에는 그 외에도, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물의 수화물 또는 용매화물 형태도 본 발명의 범위에 포함될 수 있다.In addition to the above compound of the present invention, a hydrate or solvate form of the compound of Formula 1 or Formula 2 may be included in the scope of the present invention.

본 발명의 상기 화합물은 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료에 매우 효과적으로 사용될 수 있다.The compound of the present invention can be used very effectively for the prevention, improvement or treatment of respiratory diseases.

본 발명에 따른 신규한 화합물은 MKP-1 단백질의 활성화를 유도함으로써, p38/CK2α/NF-kB 순서로 이루어지는 세포신호전달을 차단하여 호흡기 질환에서 발생되는 염증 반응을 매우 효과적으로 억제하는 효과를 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 상기 신규한 화합물을 경구 투여하는 방식으로 호흡기 질환의 예방, 개선 또는 치료를 할 수 있다.The novel compound according to the present invention has the effect of very effectively inhibiting the inflammatory response occurring in respiratory diseases by inducing the activation of MKP-1 protein, thereby blocking cell signaling in the order of p38/CK2α/NF-kB. Therefore, it is possible to prevent, improve or treat respiratory diseases by oral administration of the novel compound according to the present invention.

도 1 및 도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 천식 또는 만성 폐쇄성 폐 질환 유발 동물 모델을 제작하기 위한 실험 프로토콜 모식도를 나타낸 것이다.
도 3의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 기관지 내 존재하는 면역 세포 수를 딥-퀵(Deep-Quick) 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 4의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 기관지 내 존재하는 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13의 발현 수준을 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 기관지의 과민반응 여부를 Rrs 수치로 나타낼 수 있는 방법을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 폐 조직에서 확인되는 염증 정도를 폐 조직 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질, p38 단백질 및 cPLA2 단백질의 발현 및 활성화 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, MKP-1 단백질, p38 단백질 및 cPLA2 단백질의 발현 및 활성화 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 의존적인 CK2/NF-kB 활성화 억제 여부를 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 CK2α 단백질과 p38의 상하위 관계를 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 11의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 CK2α 단백질의 억제에 의한 NF-kB 활성화 억제 효과를 웨스턴 블롯 분석 및 ELISA 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 기관지 내 존재하는 면역 세포 수를 딥-퀵(Deep-Quick) 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 기관지 내 존재하는 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현 수준을 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 기관지의 과민반응 여부를 Rrs 수치로 나타낼 수 있는 방법을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 15의 A 및 B는 본 발명의 일 실시예에 따른 MKP-1 단백질에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때, 폐 조직에서 확인되는 염증 정도를 폐 조직 염색을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른 신규한 화합물의 염증 억제와 관련된 세포신호전달 과정의 모식도를 나타낸 것이다.
도 17 및 18은 본 발명의 일 실시예에 따른 만성 폐쇄성 폐질환 마우스에서 엘라스틴(도 17), 카스파제-3 및 콜라겐(도 18) 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 신규한 화합물을 처리하였을 때, 기관지 내 존재하는 면역 세포 수를 딥-퀵(Deep-Quick) 염색을 통해 현미경으로 관찰하여 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 신규한 화합물을 처리하였을 때, 기관지 내 존재하는 사이토카인(IL-5)의 발현 수준을 ELISA를 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른 다양한 신규한 화합물을 처리하였을 때, 기관지의 과민반응 여부를 Rrs 수치로 나타낼 수 있는 방법을 통해 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른 기존의 천식 치료제와 본 발명에 따른 신규한 화합물 간의 염증 세포 억제 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른 기존의 천식 치료제와 본 발명에 따른 신규한 화합물 간의 사이토카인(IL-5) 발현 수준 억제 정도를 비교한 결과를 나타낸 것이다.1 and 2 are schematic diagrams of an experimental protocol for producing an asthma or chronic obstructive pulmonary disease-induced animal model according to an embodiment of the present invention.
3A and 3B show the results of measuring the number of immune cells present in the bronchi according to an embodiment of the present invention by observing it under a microscope through Deep-Quick staining.
4A and 4B show the results of measuring the expression levels of cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13 in the bronchus according to an embodiment of the present invention through ELISA).
5A and 5B show the results of measurements performed by a method capable of expressing the presence or absence of hypersensitivity of the bronchus according to an embodiment of the present invention by using Rrs values.
6A and 6B show the results of confirming the degree of inflammation in the lung tissue according to an embodiment of the present invention through lung tissue staining.
7 shows the results of confirming the expression and activation levels of MKP-1 protein, p38 protein, and cPLA2 protein through Western blot analysis according to an embodiment of the present invention.
8 shows the results of confirming the expression and activation levels of MKP-1 protein, p38 protein, and cPLA2 protein through western blot analysis when siRNA specific for MKP-1 protein according to an embodiment of the present invention is treated. .
9A and 9B show the results of confirming whether MKP-1 protein-dependent CK2/NF-kB activation is inhibited through Western blot analysis and ELISA analysis according to an embodiment of the present invention.
10 shows the result of confirming the upper-lower-order relationship between the CK2α protein and p38 according to an embodiment of the present invention through Western blot analysis.
11A and 11B show the results of confirming the NF-kB activation inhibitory effect by the inhibition of the CK2α protein according to an embodiment of the present invention through Western blot analysis and ELISA analysis.
12 shows the results of measuring the number of immune cells present in the bronchi under a microscope through Deep-Quick staining when siRNA specific for MKP-1 protein according to an embodiment of the present invention is treated. is shown.
13 shows the expression levels of cytokines (IL-4, IL-5, and IL-13) present in the bronchi when siRNA specific for the MKP-1 protein according to an embodiment of the present invention is treated through ELISA. The measurement results are shown.
FIG. 14 shows the results of measurements performed by a method capable of expressing bronchial hypersensitivity with Rrs values when siRNA specific for MKP-1 protein is treated according to an embodiment of the present invention.
15A and 15B show the results of confirming the degree of inflammation in lung tissue through lung tissue staining when siRNA specific for MKP-1 protein according to an embodiment of the present invention is treated.
Figure 16 shows a schematic diagram of the cell signaling process related to the inhibition of inflammation of the novel compound according to an embodiment of the present invention.
17 and 18 show the results of confirming the expression levels of elastin (FIG. 17), caspase-3 and collagen (FIG. 18) proteins in mice with chronic obstructive pulmonary disease according to an embodiment of the present invention through western blot analysis. .
19 shows the results of measurement by observing the number of immune cells present in the bronchi under a microscope through Deep-Quick staining when various novel compounds according to an embodiment of the present invention are treated.
20 shows the results of measuring the expression level of cytokine (IL-5) present in the bronchi through ELISA when various novel compounds according to an embodiment of the present invention are treated.
21 shows the results of measurement through a method capable of expressing whether or not the bronchial hypersensitivity reaction occurs with Rrs values when various novel compounds according to an embodiment of the present invention are treated.
22 shows the results of comparing the degree of inhibition of inflammatory cells between the existing asthma treatment agent according to an embodiment of the present invention and the novel compound according to the present invention.
23 shows the results of comparing the degree of inhibition of cytokine (IL-5) expression level between the existing asthma treatment agent according to an embodiment of the present invention and the novel compound according to the present invention.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. These examples are only for illustrating the present invention in more detail, and it will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited by these examples according to the gist of the present invention. .

실시예Example

[[ 제조예manufacturing example 1 내지 16] 1 to 16] 신규 화합물 합성Synthesis of new compounds

하기 제조 공정 1 내지 8에 기재된 공정에 따라, 하기 표 1에 열거된 제조예 1 내지 16을 합성하였다.Preparation Examples 1 to 16 listed in Table 1 were synthesized according to the processes described in Preparation Processes 1 to 8 below.

제조예manufacturing example 화학식chemical formula 1One

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

[제조 공정 1][Manufacturing Process 1]

[제조 공정 2][Manufacturing process 2]

[제조 공정 3][Manufacturing process 3]

[제조 공정 4][Manufacturing process 4]

[제조 공정 5][Manufacturing Process 5]

[제조 공정 6][Manufacturing process 6]

[제조 공정 7][Manufacturing process 7]

[제조 공정 8][Manufacturing process 8]

[[ 제조예manufacturing example 1] One] 벤질benzyl 2- 2- 아세트아미도acetamido -5-아미노-5--5-amino-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (Benzyl 2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoate) (Benzyl 2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoate)

100 ml의 다이메틸폼아마이드(Dimethylformamide; DMF)에 2-아세트아미도-5-아미노-5-옥소펜타노익 에시드(2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoic acid (26.6 mmol))와 벤질브로마이드(1.5 eq)를 넣고 상온에서 교반시켰다. 이후 1,8-다이아자바이사이클로[5,4,0]언덱-7-엔(1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; DBU (1.2 eq))을 넣은 뒤에, 적가 완료 후 실온(Room Temperature)에서 24시간 동안 교반 시켰다. 반응이 종결되면 물을 이용하여 반응을 종료시키고, 다이클로로메테인을 추가로 부가하여 유기층을 추출하였다. 상기 유기층을 소금물로 세척한 뒤에 아황산나트륨으로 수분을 제거하고, 용매를 감압증류하여 얻은 잔사를 헥산과 에틸아세테이트를 이용하여 재결정하여 목적 화합물인 제조예 1을 수득하였다(제조 공정 1 참고).2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoic acid (2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoic acid (26.6 mmol)) and benzyl bromide in 100 ml of dimethylformamide (DMF) (1.5 eq) was added and stirred at room temperature. After 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene (1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec-7-ene; DBU (1.2 eq)) was added, dropwise addition was completed It was stirred at room temperature for 24 hours. When the reaction was completed, the reaction was terminated using water, and dichloromethane was further added to extract the organic layer. After washing the organic layer with brine, moisture was removed with sodium sulfite, and the residue obtained by distilling the solvent under reduced pressure was recrystallized using hexane and ethyl acetate to obtain the target compound, Preparation Example 1 (refer to Preparation Step 1).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.43 - 7.27 (m, 5H), 5.19 (s, 2H), 4.46 (dd, J = 9.1, 5.1 Hz, 1H), 2.36 - 2.24 (m, 2H), 2.26 - 2.12 (m, 1H), 2.00 (s, 3H), 1.99 - 1.85 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.43 - 7.27 (m, 5H), 5.19 (s, 2H), 4.46 (dd, J = 9.1, 5.1 Hz, 1H), 2.36 - 2.24 (m, 2H), 2.26 - 2.12 (m, 1H), 2.00 (s, 3H), 1.99 - 1.85 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 2] 2] 벤질benzyl 2,5- 2,5- 다이아세트아미도diacetamido -5--5- 옥소펜타노엣oxopentanoet (benzyl 2,5-diacetamido-5-oxopentanoat)(benzyl 2,5-diacetamido-5-oxopentanoat)

마이크로웨이브 튜브에 상기 제조예 1(23.0 mmol), 아세트 알데하이드 (3.0 eq) 및 염산(0.001 eq)을 넣고, 50 W, 120℃ 조건에서 30분 동안 교반시켰다. 그런 다음, 에틸아세테이트와 물을 이용하여 유기층을 추출한 뒤, 소금물로 상기 유기층을 세척하고 아황산나트륨을 이용하여 수분을 제거하였다. 이후, 남아있는 용매를 감압증류하여 최종적으로 얻어진 잔사를 MPLC를 이용하여 분리 및 정제하는 과정을 통해 제조예 2를 수득하였다(제조 공정 1 참고).Preparation Example 1 (23.0 mmol), acetaldehyde (3.0 eq) and hydrochloric acid (0.001 eq) were put in a microwave tube, and stirred at 50 W, 120° C. for 30 minutes. Then, the organic layer was extracted using ethyl acetate and water, the organic layer was washed with brine, and moisture was removed using sodium sulfite. Thereafter, the residue finally obtained by distilling the remaining solvent under reduced pressure was separated and purified using MPLC to obtain Preparation Example 2 (refer to Preparation Process 1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 10.63 (s, 1H), 8.30 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.47 - 7.23 (m, 5H), 5.17 - 5.06 (m, 2H), 4.27 (ddd, J = 9.3, 7.5, 5.4 Hz, 1H), 2.70 - 2.38 (m, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.07 - 1.91 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.83 - 1.73 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 10.63 (s, 1H), 8.30 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.47 - 7.23 (m, 5H), 5.17 - 5.06 (m, 2H), 4.27 (ddd, J = 9.3, 7.5, 5.4 Hz, 1H), 2.70 - 2.38 (m, 2H), 2.12 (s, 3H), 2.07 - 1.91 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.83 - 1.73 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 3] 3] 2,5-2,5- 다이아세트아미도diacetamido -5--5- 옥소펜타노익oxopentanoic 에시드acid (2,5-(2,5- diacetamidodiacetamido -5-oxopentanoic acid)-5-oxopentanoic acid)

5 ml의 메탄올에 상기 제조예 2(4.06 mmol)를 녹인 뒤, Pd/C (활성화탄소에 흡착시킨 팔라듐) 0.2 g을 추가로 넣고, 상기 혼합물을 수소하에서 24시간 동안 교반시켰다. 반응이 종결된 후, 셀라이트(Cellite)에서 상기 반응액을 걸러낸 뒤에 감암증류하는 과정을 통해 제조예 3(DN204360)을 수득하였다(제조 공정 1 참고).After dissolving Preparation Example 2 (4.06 mmol) in 5 ml of methanol, 0.2 g of Pd/C (palladium adsorbed on activated carbon) was further added, and the mixture was stirred under hydrogen for 24 hours. After the reaction was completed, Preparation Example 3 (DN204360) was obtained by filtering the reaction solution from Celite and then dark-distilling (see Manufacturing Process 1).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 10.64 (s, 1H), 8.13 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.15 (td, J = 8.9, 5.1 Hz, 1H), 2.56 - 2.46 (m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.06 - 1.89 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.80 - 1.64 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 10.64 (s, 1H), 8.13 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 4.15 (td, J = 8.9, 5.1 Hz, 1H), 2.56 - 2.46 ( m, 2H), 2.13 (s, 3H), 2.06 - 1.89 (m, 1H), 1.84 (s, 3H), 1.80 - 1.64 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 4] 4] 에틸 2,5-ethyl 2,5- 다이아세트아미도diacetamido -5--5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (ethyl 2,5-diacetamido-5-oxopentanoate)(ethyl 2,5-diacetamido-5-oxopentanoate)

2,5-다이아세트아미도-5-옥소펜타노익 에시드(0.2 mmol)를 에탄올에 충분히 녹인뒤, 0 ℃에서 10분간 교반시키고, 1.2 eq의 염화티오닐(SOCl₂)을 추가로 넣었다. 이후에 상기 반응물을 20분간 상온에서 교반 시킨 뒤, 2시간 동안 60 ℃에서 교반시켰다. 반응이 종결되면 물을 첨가한 뒤, 다이클로로메테인을 추가로 넣어 유기층을 추출하였다. 상기 유기층을 소금물로 세척한 뒤에 아황산나트륨을 이용하여 수분을 제거하고, 용매를 감압증류하여 얻은 잔사를 Prep HPLC로 분리 및 정제하여 제조예 4를 얻었다(제조 공정 2 참고).2,5-diacetamido-5-oxopentanoic acid (0.2 mmol) was sufficiently dissolved in ethanol, stirred at 0 °C for 10 minutes, and 1.2 eq of thionyl chloride (SOCl ₂ ) was further added. Thereafter, the reactant was stirred at room temperature for 20 minutes, and then stirred at 60° C. for 2 hours. When the reaction was completed, water was added, and then dichloromethane was further added to extract the organic layer. After washing the organic layer with brine, moisture was removed using sodium sulfite, and the residue obtained by distilling the solvent under reduced pressure was separated and purified by Prep HPLC to obtain Preparation Example 4 (refer to Preparation Step 2).

¹H NMR (400 MHz, DMSO-d ₆) δ 8.30 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 4.26 - 4.11 (m, 1H), 4.14 - 3.94 (m, 2H), 2.34 - 2.27 (m, 2H), 1.98 - 1.88 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.82 - 1.70 (m, 4H), 1.22 - 1.12 (m, 3H) ¹ H NMR (400 MHz, DMSO- d ₆ ) δ 8.30 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 7.41 (s, 1H), 6.71 (s, 1H), 4.26 - 4.11 (m, 1H), 4.14 - 3.94 (m, 2H), 2.34 - 2.27 (m, 2H), 1.98 - 1.88 (m, 1H), 1.85 (s, 3H), 1.82 - 1.70 (m, 4H), 1.22 - 1.12 (m, 3H)

[[ 제조예manufacturing example 5] 5] 메틸methyl 2- 2- 아세트아미도acetamido -5-아미노-5--5-amino-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (methyl 2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoate) (methyl 2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoate)

25 ml의 메탄올에 2-아세트아미도-5-아미노-5-옥소펜타노익 에시드(5.31 mmol)를 녹인 뒤, 1.05 eq의 염화아세틸을 천천히 적가하고, 24시간동안 상온에서 교반시켰다. 반응이 종결되면 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 용액을 넣고, 용매를 감압증류하여 얻은 잔사를 MPLC로 분리 및 정제하여 제조예 5를 수득하였다(제조 공정 3 참고).After dissolving 2-acetamido-5-amino-5-oxopentanoic acid (5.31 mmol) in 25 ml of methanol, 1.05 eq of acetyl chloride was slowly added dropwise, followed by stirring at room temperature for 24 hours. When the reaction was completed, sodium hydrogen carbonate (NaHCO ₃ ) solution was added, and the residue obtained by distilling the solvent under reduced pressure was separated and purified by MPLC to obtain Preparation Example 5 (refer to Preparation Process 3).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.49 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.36 (s, 1H), 4.60 (td, J = 8.7, 4.4 Hz, 1H), 2.49 - 2.26 (m, 2H), 2.26 - 2.11 (m, 1H), 2.13 - 1.83 (m, 4H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 6.49 (s, 1H), 6.15 (s, 1H), 5.36 (s, 1H), 4.60 (td, J = 8.7, 4.4 Hz, 1H), 2.49 - 2.26 ( m, 2H), 2.26 - 2.11 (m, 1H), 2.13 - 1.83 (m, 4H)

[[ 제조예manufacturing example 6] 6] 메틸methyl 2,5- 2,5- 다이아세트아미도diacetamido -5-아미노-5--5-amino-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (methyl 2,5-diacetamido-5-amino-5-oxopentanoate) (methyl 2,5-diacetamido-5-amino-5-oxopentanoate)

6 ml의 아세토나이트릴과 메틸클로라이드가 1:5 비율로 혼합된 용액에 아세트알데하이드(0.3 mmol), 상기 제조예 5(1.2 eq) 및 CuBr(0.05 eq)을 넣고, 상온에서 15분동안 교반시켰다. 이후에 1.5 eq의 N-브로모석신이미드(N-Bromosuccinimide)을 넣고, 24시간동안 상온에서 교반시켰다. 반응이 종결되면 에틸아세테이트와 물을 이용하여 유기층을 추출하고, 상기 유기층을 소금물로 세척한 뒤 아황산나트륨을 이용하여 수분을 제거하였다. 그런 다음, 용매를 감압증류하여 얻은 잔사를 MPLC로 분리 및 정제하여 제조예 6(DN205890)을 수득하였다(제조 공정 3 참고).In a solution of 6 ml of acetonitrile and methyl chloride in a ratio of 1:5, acetaldehyde (0.3 mmol), Preparation Example 5 (1.2 eq) and CuBr (0.05 eq) were added, and the mixture was stirred at room temperature for 15 minutes. . Thereafter, 1.5 eq of N-bromosuccinimide was added thereto, and the mixture was stirred at room temperature for 24 hours. When the reaction was completed, the organic layer was extracted using ethyl acetate and water, and the organic layer was washed with brine, and then moisture was removed using sodium sulfite. Then, the residue obtained by distilling the solvent under reduced pressure was separated and purified by MPLC to obtain Preparation Example 6 (DN205890) (refer to Manufacturing Process 3).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.58 - 4.32 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.75 - 2.42 (m, 2H), 2.29 - 2.07 (m, 4H), 2.07 - 1.80 (m, 4H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 4.58 - 4.32 (m, 1H), 3.72 (s, 3H), 2.75 - 2.42 (m, 2H), 2.29 - 2.07 (m, 4H), 2.07 - 1.80 (m, 4H)

[[ 제조예manufacturing example 7] 7] 벤질benzyl 2-((((9H- 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노에이트(benzyl 2-((((9H-)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate (benzyl 2-((((9H- fluorenfluoren -9--9- ylyl )) methoxymethoxy )carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate))carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate)

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노익 에시드(2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoic acid)를 시작물질로 하여, 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 7을 수득하였다(제조 공정 4 참고).2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoic acid(2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy) )carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoic acid) as a starting material, and synthesized in the same manner as in Preparation Example 1 to obtain Preparation Example 7 (refer to Preparation Process 4).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 16.0 Hz, 2H), 7.43 - 7.14 (m, 9H), 5.77 (s, 1H), 5.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.19 (q, J = 12.2 Hz, 2H), 4.41 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 4.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 16.0 Hz, 2H), 7.43 - 7.14 (m, 9H), 5.77 (s, 1H) , 5.64 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 5.31 (s, 1H), 5.19 (q, J = 12.2 Hz, 2H), 4.41 (d, J = 7.0 Hz, 3H), 4.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 2.24 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.99 (d, J = 8.0 Hz, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 8] 8] 벤질benzyl 2-((((9H- 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 아세트아미도acetamido -5-옥소펜타노에이트(benzyl 2-((((9H--5-oxopentanoate (benzyl 2-(((9H- fluorenfluoren -9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)

상기 제조예 7을 이용하여, 상기 제조예 6과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 8(DN205701)을 수득하였다(제조 공정 4 참고).Using Preparation Example 7, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 6 to obtain Preparation Example 8 (DN205701) (refer to Preparation Process 4).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.99 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 16.4 Hz, 2H), 7.49 -7.19 (m, 9H), 5.50 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.19 (q, J = 12.5 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 4.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 2.54 - 2.48 (m, 1H), 2.35 - 2.27 (m, 4H), 2.05 - 1.91 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.99 (s, 1H), 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.57 (t, J = 16.4 Hz, 2H), 7.49 -7.19 (m, 9H) , 5.50 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 5.19 (q, J = 12.5 Hz, 2H), 4.42 (d, J = 6.8 Hz, 3H), 4.21 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 2.54 - 2.48 (m, 1H), 2.35 - 2.27 (m, 4H), 2.05 - 1.91 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 9] 9] 메틸methyl 2-((((9H- 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노에이트 (methyl 2-((((9H-)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate (methyl 2-((((9H- fluorenfluoren -9--9- ylyl )) methoxymethoxy )carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate))carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate)

2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노익 에시드를 시작물질로 하여, 상기 제조예 5와 동일한 방법으로 합성하여 제조예 9를 수득하였다(제조 공정 5 참고).2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoic acid as a starting material, synthesized in the same manner as in Preparation Example 5 Preparation 9 was obtained (refer to Manufacturing Process 5).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.82 - 7.75 (m, 2H), 7.72 - 7.54 (m, 2H), 7.42 - 7.24 (m, 4H), 4.45 - 4.31 (m, 2H), 4.29 - 4.21 (m, 2H), 3.81 - 3.58 (m, 4H), 2.36 - 2.29 (m, 2H), 2.22 - 2.12 (m, 1H), 1.99 - 1.84 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.82 - 7.75 (m, 2H), 7.72 - 7.54 (m, 2H), 7.42 - 7.24 (m, 4H), 4.45 - 4.31 (m, 2H), 4.29 - 4.21 ( m, 2H), 3.81 - 3.58 (m, 4H), 2.36 - 2.29 (m, 2H), 2.22 - 2.12 (m, 1H), 1.99 - 1.84 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 10] 10] 메틸methyl 2-((((9H- 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 아세트아미도acetamido -5-옥소펜타노에이트 (methyl 2-((((9H--5-oxopentanoate (methyl 2-(((9H- fluorenfluoren -9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)

상기 제조예 9를 이용하여, 상기 제조예 6과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 10(DN205807)을 수득하였다(제조 공정 5 참고).Using Preparation Example 9, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 6 to obtain Preparation Example 10 (DN205807) (refer to Preparation Step 5).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.73 (s, 1H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.30 (dd, J = 17.3, 9.9 Hz, 2H), 5.62 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 10.3 Hz, 3H), 4.21 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.76 (s, 3H), 2.61 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.37 - 2.16 (m, 4H), 1.98 (dd, J = 14.3, 7.4 Hz, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 8.73 (s, 1H), 7.76 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.58 (t, J = 9.6 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.4 Hz) , 2H), 7.30 (dd, J = 17.3, 9.9 Hz, 2H), 5.62 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 4.42 (t, J = 10.3 Hz, 3H), 4.21 (t, J = 6.8 Hz) , 1H), 3.76 (s, 3H), 2.61 (d, J = 5.5 Hz, 2H), 2.37 - 2.16 (m, 4H), 1.98 (dd, J = 14.3, 7.4 Hz, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 11] 11] 에틸 2-((((9H-ethyl 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노에이트 (ethyl 2-((((9H-)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate (ethyl 2-((((9H-) fluorenfluoren -9--9- ylyl )) methoxymethoxy )carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate))carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoate)

25 ml의 에탄올에 2-((((9H-플루오렌-9-일)메톡시)카르보닐)아미노)-5-아미노-5-옥소펜타노익 에시드(2.71 mmol)을 녹인 뒤, 1.05 eq의 염화아세틸을 천천히 적가하고, 24시간 동안 상온에서 교반시켰다. 반응이 종결되면 탄산수소나트륨(NaHCO₃) 용액을 넣고, 용매를 감압증류하여 얻은 잔사를 MPLC로 분리 및 정제하여 제조예 11을 수득하였다(제조 공정 6 참고).After dissolving 2-((((9H-fluoren-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-amino-5-oxopentanoic acid (2.71 mmol) in 25 ml of ethanol, 1.05 eq of Acetyl chloride was slowly added dropwise, and stirred at room temperature for 24 hours. Upon completion of the reaction, sodium hydrogen carbonate (NaHCO ₃ ) solution was added, and the residue obtained by distilling the solvent under reduced pressure was separated and purified by MPLC to obtain Preparation Example 11 (refer to Preparation Step 6).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.45 (m, 2H), 7.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.37 - 4.18 (m, 2H), 4.18 - 3.95 (m, 4H), 2.30 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 13.3, 7.6 Hz, 1H), 1.81 (dd, J = 14.0, 8.7 Hz, 1H), 1.28 - 1.01 (m, 3H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.70 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.63 - 7.45 (m, 2H), 7.29 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.22 (t, J = 7.4) Hz, 2H), 4.37 - 4.18 (m, 2H), 4.18 - 3.95 (m, 4H), 2.30 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 2.05 (dt, J = 13.3, 7.6 Hz, 1H), 1.81 (dd, J = 14.0, 8.7 Hz, 1H), 1.28 - 1.01 (m, 3H)

[[ 제조예manufacturing example 12] 12] 에틸 2-((((9H-ethyl 2-((((9H- 플루오렌fluorene -9-일)-9-day) 메톡시methoxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 아세트아미도acetamido -5-옥소펜타노에이트(ethyl 2-((((9H--5-oxopentanoate (ethyl 2-(((9H- fluorenfluoren -9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)-9-yl)methoxy)carbonyl)amino)-5-acetamido-5-oxopentanoate)

상기 제조예 11을 이용하여, 상기 제조예 6과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 12를 수득하였다(제조 공정 6 참고).Using Preparation Example 11, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 6 to obtain Preparation Example 12 (refer to Preparation Process 6).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.82 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.71 (dd, J = 15.2, 8.7 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.41 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.50 - 4.30 (m, 2H), 4.30 - 4.06 (m, 4H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.28 - 2.12 (m, 4H), 1.95 (dt, J = 16.0, 7.2 Hz, 1H), 1.40 - 1.15 (m, 2H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.82 (d, J = 7.5 Hz, 2H), 7.71 (dd, J = 15.2, 8.7 Hz, 2H), 7.61 (s, 1H), 7.41 (t, J = 7.4) Hz, 2H), 7.33 (t, J = 7.4 Hz, 2H), 4.50 - 4.30 (m, 2H), 4.30 - 4.06 (m, 4H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.28 - 2.12 (m, 4H), 1.95 (dt, J = 16.0, 7.2 Hz, 1H), 1.40 - 1.15 (m, 2H)

[[ 제조예manufacturing example 13] 13] 벤질benzyl 5-아미노-2-((( 5-amino-2-((( 벤질옥시benzyloxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (benzyl 5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoate) (benzyl 5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoate)

5-아미노-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-옥시펜타노익 에시드 (5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoic acid)를 시작물질로 하여, 상기 제조예 1과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 13을 수득하였다(제조 공정 7 참고).5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxypentanoic acid (5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoic acid) as a starting material Thus, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 1 to obtain Preparation Example 13 (refer to Preparation Process 7).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 7.57 - 7.06 (m, 10H), 5.95 - 5.53 (m, 2H), 5.41 (s, 1H), 5.23 - 4.99 (m, 4H), 4.41 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 2.25 (t, J = 16.1 Hz, 2H), 2.10 - 1.91 (m, 1H), 1.86 - 1.79 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 7.57 - 7.06 (m, 10H), 5.95 - 5.53 (m, 2H), 5.41 (s, 1H), 5.23 - 4.99 (m, 4H), 4.41 (d, J) = 7.2 Hz, 1H), 2.25 (t, J = 16.1 Hz, 2H), 2.10 - 1.91 (m, 1H), 1.86 - 1.79 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 14] 14] 벤질benzyl 5- 5- 아세트아미도acetamido -2-(((-2-((( 벤질옥시benzyloxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (benzyl 5- (benzyl 5- acetamidoacetamido -2-(((-2-((( benzyloxybenzyloxy )carbonyl)amino)-5-oxopentanoate))carbonyl)amino)-5-oxopentanoate)

상기 제조예 13을 이용하여, 상기 제조예 6과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 14(DN205891)를 수득하였다(제조 공정 7 참고).Using Preparation Example 13, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 6 to obtain Preparation Example 14 (DN205891) (see Manufacturing Process 7).

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.39 (s, 1H), 7.68 - 6.90 (m, 10H), 5.56 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.27 - 4.96 (m, 4H), 4.46 (d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.73 - 2.40 (m, 2H), 2.35 - 2.11 (m, 4H), 2.07 - 1.83 (m, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, CDCl ₃ ) δ 8.39 (s, 1H), 7.68 - 6.90 (m, 10H), 5.56 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 5.27 - 4.96 (m, 4H), 4.46 ( d, J = 4.6 Hz, 1H), 2.73 - 2.40 (m, 2H), 2.35 - 2.11 (m, 4H), 2.07 - 1.83 (m, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 15] 15] 메틸methyl 5-아미노-2-((( 5-amino-2-((( 벤질옥시benzyloxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (methyl 5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoate) (methyl 5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoate)

5-아미노-2-(((벤질옥시)카르보닐)아미노)-5-옥시펜타노익 에시드(5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoic acid)를 시작물질로 하여, 상기 제조예 5와 동일한 방법으로 합성하여 제조예 15를 수득하였다(제조 공정 8 참고).5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxypentanoic acid (5-amino-2-(((benzyloxy)carbonyl)amino)-5-oxopentanoic acid) as a starting material Thus, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 5 to obtain Preparation Example 15 (refer to Preparation Step 8).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.58 - 6.99 (m, 5H), 5.20 - 5.00 (m, 2H), 4.22 (dd, J = 9.1, 5.0 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.16 (dt, J = 13.0, 7.6 Hz, 1H), 1.93 (dt, J = 22.1, 7.8 Hz, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.58 - 6.99 (m, 5H), 5.20 - 5.00 (m, 2H), 4.22 (dd, J = 9.1, 5.0 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.33 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.16 (dt, J = 13.0, 7.6 Hz, 1H), 1.93 (dt, J = 22.1, 7.8 Hz, 1H)

[[ 제조예manufacturing example 16] 16] 메틸methyl 5- 5- 아세트아미도acetamido -2-(((-2-((( 벤질옥시benzyloxy )카르보닐)아미노)-5-)carbonyl)amino)-5- 옥소펜타노에이트oxopentanoate (methyl 5- (methyl 5- acetamidoacetamido -2-(((-2-((( benzyloxybenzyloxy )carbonyl)amino)-5-oxopentanoate))carbonyl)amino)-5-oxopentanoate)

상기 제조예 15를 이용하여, 상기 제조예 6과 동일한 방법으로 합성하여 제조예 16을 수득하였다(제조 공정 8 참고).Using Preparation Example 15, it was synthesized in the same manner as in Preparation Example 6 to obtain Preparation Example 16 (refer to Preparation Process 8).

¹H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.65 - 7.16 (m, 5H), 5.20 - 4.98 (m, 2H), 4.26 (dd, J = 9.3, 5.1 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 - 2.07 (m, 4H), 1.94 (dd, J = 15.1, 8.1 Hz, 1H) ¹ H NMR (400 MHz, MeOD) δ 7.65 - 7.16 (m, 5H), 5.20 - 4.98 (m, 2H), 4.26 (dd, J = 9.3, 5.1 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 2.63 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.29 - 2.07 (m, 4H), 1.94 (dd, J = 15.1, 8.1 Hz, 1H)

[준비예 1] [Preparation Example 1] 실험 동물의 사육breeding of laboratory animals

특정 병원체가 없는 8 주된 암컷 C56BL/6 마우스(Orient Bio Korea Inc., 대한민국)를 기류식 무균 실험대에 수용하고, 표준 고형사료를 원하는 대로(ad libitum) 공급하는 조건에서 사육하였다. 아래의 실험이 수행될 때 상기 마우스는 7-8주령에 해당하도록 하였으며, 모든 실험 동물은 전북대학교 의과대학의 실험동물의 관리 및 이용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of the Chonbuk National University Medical School)에 의하여 승인된 프로토콜에 따라 관리될 수 있도록 하였다.8-week-old female C56BL/6 mice without specific pathogens (Orient Bio Korea Inc., Korea) were housed in an airflow aseptic laboratory and bred under conditions of supplying standard solid feed as desired (ad libitum). When the experiment below was performed, the mice were 7-8 weeks old, and all experimental animals were Institutional Animal Care and Use Committee of the Chonbuk National University Medical School. to be managed according to the protocol approved by

[실험 방법 1] [Test Method 1] 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환 유발 동물 모델 제작Asthma and Chronic Obstructive Pulmonary Disease Inducing Animal Model Production

천식 유발 동물 모델 제작: 도 1에 개시된 바와 같이, 20 ㎍의 난황(ovalbumin; OVA, grade V, 시그마알드리치, 미국)을 1.0 mg의 알루미늄 하이드록사이드 어쥬번트(aluminum hydroxide adjuvant, Imject Alum; Pierce 미국)와 혼합하여 실험 개시일(0일)과, 실험 개시일로부터 14일 째(14일)에 복강 내 주사하는 과정을 통해 1차 챌린지를 수행하였다. 또한, 실험 개시일로부터 21일 및 28일에, 마우스를 플라스틱 상자(Plexiglas (Rohm & Haas, Philadelphia, Pa) exposure chamber; 24.5 cm × 40.5 cm × 15.0 cm)에 넣고, 울트라소닉 네뷸라이저(ultrasonic nebulizer, NE-U12; output 0.8 mL/min; Omron, 일본)을 이용하여 1.5%의 난황을 기화시켜 30분 동안 상기 상자에 주입하는 과정을 통해 마우스가 기화된 난황을 흡입할 수 있도록 하였다(2차 챌린지). Asthma-induced animal model preparation: As described in FIG. 1 , 20 μg of egg yolk (ovalbumin; OVA, grade V, Sigma-Aldrich, USA) was mixed with 1.0 mg of aluminum hydroxide adjuvant (Imject Alum; Pierce USA). ) and the first challenge was performed through intraperitoneal injection on the test start date (day 0) and on the 14th day (14th day) from the start date of the experiment. In addition, on days 21 and 28 from the start of the experiment, the mice were placed in a plastic box (Plexiglas (Rohm & Haas, Philadelphia, Pa) exposure chamber; 24.5 cm × 40.5 cm × 15.0 cm), and an ultrasonic nebulizer (ultrasonic nebulizer, NE-U12; output 0.8 mL/min; Omron, Japan) was used to vaporize 1.5% of egg yolk and inject it into the box for 30 minutes so that the mouse could inhale the vaporized yolk (second challenge) ).

만성 폐쇄성 폐 질환 유발 동물 모델 제작: 도 2에 개시된 바와 같이, 10% DMSO 용액 50 ㎕에 5 ㎍의 담배 추출물(전라북도 정읍시 호흡기 독성시험센터) 및 0.25㎍의 LPS를 혼합한 혼합액을 제조하였다. 그런 다음, 상기 혼합액을 실험 개시일로부터 30일 또는 60일 동안 하루에 1회씩 상기 준비예 1의 마우스에 비강투여하였다. 여기서, 대조군은 생리식염수만을 비강내 투여한 군과, 10%의 DMSO 용액 50 ㎕에 0.25 ㎍의 LPS만을 혼합한 용액을 투여한 군으로 설정하였다. Production of chronic obstructive pulmonary disease- inducing animal model : As shown in FIG. 2 , a mixture was prepared in which 5 μg of tobacco extract (Respiratory Toxicity Test Center, Jeongeup, Jeollabuk-do) and 0.25 μg of LPS were mixed in 50 μl of 10% DMSO. Then, the mixed solution was intranasally administered to the mice of Preparation Example 1 once a day for 30 or 60 days from the start date of the experiment. Here, the control group was set to a group administered with only physiological saline intranasally and a group administered with only 0.25 μg of LPS mixed in 50 μl of a 10% DMSO solution.

[실험 방법 2] [Test Method 2] 기관지 세척액 수집Collection of bronchial lavage fluid

마우스를 마취시킨 뒤, 기도에 가느다란 관을 삽입하고, 0.2 ml의 생리식염수가 채워진 주사기를 이용하여 피스톤 과정을 반복하여 기관지 세척액을 수득하였다. 실험에 바로 사용되지 않는 경우에는 -70 ℃에서 상기 과정을 통해 수득된 기관지 세척액을 보관하였다.After anesthetizing the mouse, a thin tube was inserted into the airway, and the piston procedure was repeated using a syringe filled with 0.2 ml of physiological saline to obtain a bronchial lavage solution. When not immediately used in the experiment, the bronchial lavage solution obtained through the above procedure was stored at -70 °C.

[실험 방법 3] [Experimental method 3] 기관지 세척액 내에 존재하는 염증 세포 관찰Observation of inflammatory cells present in bronchial lavage fluid

상기 실험 방법 2에서 수득된 기관지 세척액 50 ㎕를 사이토스핀(cytospin)에 사용되는 슬라이드에 넣고, 30분 동안 원심분리하였다. 그런 다음, 딥-퀵(Deep-quick) 염색을 수행하고 현미경을 이용하여 염증 세포(중성구(neutrophils) 및 호산구(eosinophils))를 관찰하였다.50 μl of the bronchial lavage solution obtained in Experimental Method 2 was placed on a slide used for cytospin, and centrifuged for 30 minutes. Then, deep-quick staining was performed and inflammatory cells (neutrophils and eosinophils) were observed using a microscope.

[실험 방법 4] [Test Method 4] 기관지 세척액 내에 존재하는 사이토카인(cytokine) 측정Measurement of cytokines present in bronchial lavage fluid

상기 실험 방법 2에서 수득된 기관지 세척액 내의 사이토카인이 존재하는 수준은 ELISA 키트를 이용하여 측정하였다. 여기서 TNF-a, IL-4, IL-5 및 IL-13 각각에 특이적으로 제작된 ELISA 키트를 사용하였다.The level of cytokines present in the bronchial lavage fluid obtained in Experimental Method 2 was measured using an ELISA kit. Here, an ELISA kit specifically prepared for each of TNF-a, IL-4, IL-5 and IL-13 was used.

[실험 방법 5] [Test Method 5] 기관지의 과민반응 확인 방법How to check for bronchial hypersensitivity

상기 실험 방법 1에서 제작된 마우스에 45 mg/kg의 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)을 복강에 주사하여 마취시킨 뒤, 기도를 절개하여 18 게이지의 바늘을 삽입하였다. 그런 다음, 상기 바늘을 컴퓨터와 연결된 작은 사이즈의 동물용 호흡기에 연결한 뒤, 분당 150 번의 호흡수로 컴퓨터 시스템을 조절하였다. 이후, 에어로졸 형태의 메타콜린(methacholine)을 5.0 내지 50 mg/ml의 농도로 점차 증가시키면서 마우스가 흡입할 수 있도록 하면서 기도 반응을 측정하고 Rrs 수치로 나타내었다.After anesthesia by injecting 45 mg/kg of sodium pentobarbital into the abdominal cavity, the mouse prepared in Experimental Method 1 was anesthetized, and an 18-gauge needle was inserted through an airway incision. Then, the needle was connected to a small-sized animal respirator connected to a computer, and the computer system was controlled at a rate of 150 breaths per minute. Thereafter, the airway response was measured and expressed as Rrs while allowing the mouse to inhale while gradually increasing the aerosol form of methacholine to a concentration of 5.0 to 50 mg/ml.

[실험 방법 6] [Test Method 6] 폐 조직 염색lung tissue staining

상기 실험 방법 1에서 제작된 마우스의 조직을 적출하여 10%의 포르말린 용액에 넣고, 24시간 동안 반응시켜 파라핀 블록을 제조하였다. 그런 다음, 상기 파라핀 블록을 3 ㎛의 크기로 절편화 하고, 슬라이드에 부착시킨 뒤, 헤마톡실린-에오신 IHE(heamatoxylin-eosin IHE) 염색을 수행하고 현미경을 통해 관찰하였다. 여기서, 염증의 정도는 기도 및 혈관 주위의 염증정도를 0-3의 점수로 나타내었다.The tissue of the mouse prepared in Experimental Method 1 was extracted, put in a 10% formalin solution, and reacted for 24 hours to prepare a paraffin block. Then, the paraffin block was sectioned to a size of 3 μm, attached to a slide, and then stained with hematoxylin-eosin IHE and observed through a microscope. Here, the degree of inflammation was expressed as a score of 0-3 for the degree of inflammation around the airways and blood vessels.

0: 염증세포가 없는 경우0: No inflammatory cells

1: 기도 및 혈관주위에 염증세포가 가끔 관찰되는 경우1: When inflammatory cells are occasionally observed around airways and blood vessels

2: 대부분의 기도 및 혈관주위에 얇은 1 내지 5개 정도의 염증세포 띠에 둘러 쌓여 있는 경우2: When surrounded by 1 to 5 thin bands of inflammatory cells around most airways and blood vessels

3: 대부분의 기도 및 혈관주위에 두꺼운 염증세포 (5개 이상) 띠에 둘러 쌓여 있는 경우3: When most of the airways and blood vessels are surrounded by thick bands of inflammatory cells (more than 5)

[실험 방법 7] [Test Method 7] 단백질의 발현 수준 측정 방법Method for measuring protein expression level

상기 실험 방법 1에서 제작된 마우스의 조직을 적출한 뒤, 세포 수준으로 잘게 갈아주었다. 그런 다음, 상기 세포들에서 단백질 분해 억제제가 포함된 세포 용해 버퍼를 통해 세포 용해물을 수득하였다. 상기 세포 용해물을 원심분리하여 단백질을 수득한 뒤, 상기 세포들로부터 얻어진 동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE에 각각 로딩하고 전기영동 하였다. 전기영동이 완료된 상기 겔에 존재하는 단백질을 PVDF 막에 옮겼다. 상기 PVDF 막을 세척 뒤에, TBS-T 완충액에 5%의 탈지 분유가 포함된 블로킹 완충액에 넣고 상온에서 배양하였다. 그런 다음, 3%의 BSA가 포함된 TBS-T 완충액에 1:1,000 희석된 항체와 상기 PVDF 막을 실온에서 배양하였다. 이후, PVDF 막을 TBS-T 완충액으로 세척하고, HRP가 결합된 IgG가 포함된 희석액과 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. TBS-T 완충액을 이용하여 상기 PVDF 막을 3회 세척하고, ECL 웨스턴 블롯팅 검출 시약을 이용하여 시각화 및 정량화 하였다.After extracting the mouse tissue prepared in Experimental Method 1, it was finely ground to the cell level. Then, a cell lysate was obtained from the cells through a cell lysis buffer containing a proteolysis inhibitor. The cell lysate was centrifuged to obtain protein, and then the same amount of protein obtained from the cells was loaded onto SDS-PAGE, respectively, and electrophoresed. After the electrophoresis was completed, the protein present in the gel was transferred to the PVDF membrane. After washing the PVDF membrane, it was placed in a blocking buffer containing 5% skim milk powder in TBS-T buffer and incubated at room temperature. Then, the antibody diluted 1:1,000 in TBS-T buffer containing 3% BSA and the PVDF membrane were incubated at room temperature. Thereafter, the PVDF membrane was washed with TBS-T buffer and incubated for 1 hour at room temperature with a diluent containing HRP-conjugated IgG. The PVDF membrane was washed 3 times using TBS-T buffer, and visualized and quantified using ECL western blotting detection reagent.

여기서, 상기 웨스턴블롯에서는 엘라스틴(elastin), 카스파제-3(caspase-3), 콜라겐(collagen), MKP-1, p-cPLA, p-p38, NF-kB(p65), CK2α, GAPDH 또는 β-액틴에 특이적인 항체를 사용하였다.Here, in the Western blot, elastin, caspase-3, collagen, MKP-1, p-cPLA, p-p38, NF-kB(p65), CK2α, GAPDH or β -An antibody specific for actin was used.

[실험 방법 8] RNA 간섭(interference) 실시[Experimental Method 8] RNA interference

MKP-1 단백질을 암호화하는 RNA에 대한 siRNA(small interfering RNA) (이하, 'MKP-1 siRNA'라고 함)및 대조 siRNA 스트랜드(strands)를 산타 크루즈 (미국)에서 구입하였다. 제조사에서 제공하는 지침에 따라 in vivo-젯 폴리에틸렌 이민(in vivo-jet polyethylene imine; PEI, Polyplus-transfection)을 이용하여 마우스에 siRNA를 전달(delivery) 하였다. 구체적으로, 5% 글루코스 용액에 MKP-1 siRNA를 첨가시킨 200 ㎕의 혼합 용액을 실온에서 20분 동안 반응시켰다. 그런 다음, 마우스를 희생시키기 24시간 전에 꼬리 정맥에 주사하였다. MKP-1 siRNA의 간섭에 대한 효과는 폐 조직에서 MKP-1 단백질의 발현 수준을 웨스턴 블롯 분석을 통해 확인하였다.Small interfering RNA (siRNA) against RNA encoding MKP-1 protein (hereinafter referred to as 'MKP-1 siRNA') and control siRNA strands were purchased from Santa Cruz (USA). According to the instructions provided by the manufacturer in vivo - jet polyethyleneimine (in vivo -jet polyethylene imine; PEI , Polyplus-transfection) was delivered using a (delivery) the siRNA in mouse. Specifically, 200 μl of a mixed solution in which MKP-1 siRNA was added to a 5% glucose solution was reacted at room temperature for 20 minutes. The mice were then injected into the tail vein 24 hours before sacrifice. The effect of MKP-1 siRNA on interference was confirmed by Western blot analysis of the expression level of MKP-1 protein in lung tissue.

[실험 방법 9] [Test Method 9] 통계 처리Statistical processing

상기 기재된 실험 방법의 모든 실험은 최소 3회 실시하였으며, 한 그룹당 마우스는 3 내지 5 마리를 사용하였다. 통계적 분석 자료는 평균 표준편차로 표현되었으며, 통계적 비교는 one-way ANOVA와 피셔 테스트(Fisher test)를 이용하여 수행하였다. 각 군 사이의 유의한 차이는 unpaired Student's t-테스트를 이용하여 결정하였으며, P 값의 유의수준은 0.05 미만으로 하였다.All experiments of the above-described experimental method were performed at least 3 times, and 3 to 5 mice were used per group. Statistical analysis data were expressed as mean standard deviation, and statistical comparison was performed using one-way ANOVA and Fisher test. Significant differences between each group were determined using the unpaired Student's t-test, and the significance level of the P value was less than 0.05.

[실험 결과 1] [Experiment Result 1] 천식에서 기도에 유입된 염증세포 억제 효과 확인Confirmation of the inhibitory effect of inflammatory cells introduced into the airways in asthma

상기 실험 방법 1에서 천식이 유발된 마우스에 제조예 3(α,δ-NA-L-G) 또는 α,δ N-아세틸-D-글루타민(α,δ-NA-D-G)을 실험 개시일로부터 매일 50, 100, 또는 200 ㎍/kg/일의 농도로 경구투여한 뒤, 상기 실험 방법 3의 방법을 통해 기도에 유입된 중성구(neutrophils) 및 호산구(eosinophils) 세포 수를 측정하여 그 결과를 도 3의 A 및 B에 나타내었다. 이때, 중성구 및 호산구는 각각 2차 챌린지 후 10시간(중성구) 또는 48시간(호산구)에 측정하였다.Preparation Example 3 (α, δ-NA-LG) or α, δ N-acetyl-D-glutamine (α, δ-NA-DG) was administered to the asthma-induced mice in Experimental Method 1 every day from the start date of the experiment 50, After oral administration at a concentration of 100, or 200 μg/kg/day, the number of neutrophils and eosinophils introduced into the airways through the method of Experimental Method 3 was measured, and the results are shown in FIG. 3A and B. At this time, neutrophils and eosinophils were measured at 10 hours (neutrophils) or 48 hours (eosinophils) after the second challenge, respectively.

여기서, 상기 α,δ N-아세틸-D-글루타민은 하기 [화학식 3]에 표시된 바와 같다:Here, the α,δ N-acetyl-D-glutamine is as shown in the following [Formula 3]:

[화학식 3][Formula 3]

도 3의 A에서 보는 바와 같이, 50 내지 200 ㎍/kg/일의 농도로 제조예 3을 상기 마우스에 주입하였을 때, 중성구 및 호산구가 기도 내에 유입되는 것을 매우 효과적으로 억제하였다. 특히, 제조예 3은 호산구와 비교하여 중성구를 50㎍/kg/일의 농도에서부터 매우 효과적으로 억제하였다.As shown in FIG. 3A , when Preparation Example 3 was injected into the mice at a concentration of 50 to 200 μg/kg/day, the inflow of neutrophils and eosinophils into the airways was very effectively inhibited. In particular, Preparation Example 3 inhibited neutrophils very effectively from a concentration of 50 μg/kg/day compared to eosinophils.

그러나, 도 3의 B에서 보는 바와 같이, α,δ N-아세틸-D-글루타민을 투여한 경우에는 농도와 무관하게 기도에 중성구 및 호산구가 유입되는 것을 억제하지 못하였다.However, as shown in FIG. 3B, when α,δ N-acetyl-D-glutamine was administered, the inflow of neutrophils and eosinophils into the airway could not be inhibited regardless of the concentration.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예 화합물은 중성구 및 호산구가 기도 내 유입되는 것을 매우 효과적으로 억제하여 천식을 치료할 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 제조예 화합물이 "D" 폼(D form)인 경우에는 중성구 및 호산구의 기도 내 유입을 억제할 수 없음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the preparation compound according to the present invention can treat asthma by very effectively inhibiting the inflow of neutrophils and eosinophils into the airways. Furthermore, it can be seen that when the preparation compound is "D" form (D form), the inflow of neutrophils and eosinophils into the airways cannot be suppressed.

[실험 결과 2] [Experiment Result 2] 천식에서 기도에 존재하는 사이토카인의 발현 수준 억제 효과 확인Confirmation of the effect of suppressing the expression level of cytokines present in the airways in asthma

상기 실험 방법 1에서 천식이 유발된 마우스에 제조예 3(α,δ-NA-L-G) 또는 α,δ N-아세틸-D-글루타민을 2차 에어웨이 챌린지 30분 이전에 100, 200, 400 또는 800 ㎍/kg/일의 농도로 경구투여하고, 2차 챌린지 24시간 이후에 상기 실험 방법 4에 기재된 방법을 통해 IL-4, IL-5 및 IL-13이 존재하는 수준을 측정하여, 그 결과를 도 4의 A 및 B에 나타내었다.Preparation Example 3 (α,δ-NA-LG) or α,δ N-acetyl-D-glutamine was administered to the asthma-induced mouse in Experimental Method 1 30 minutes before the second airway challenge 100, 200, 400 or 800 Oral administration at a concentration of μg/kg/day, and measuring the level of IL-4, IL-5 and IL-13 present through the method described in Experimental Method 4 above 24 hours after the second challenge, and the result 4 are shown in A and B.

도 4의 A에서 보는 바와 같이, 200 ㎍/kg/일의 농도로 제조예 3을 투여하였을 때부터 제조예 3의 투여에 의해 IL-4, IL-5 및 IL-13이 존재하는 수준이 현저하게 억제되었다.As shown in FIG. 4A , when Preparation Example 3 was administered at a concentration of 200 μg/kg/day, the level of presence of IL-4, IL-5 and IL-13 by the administration of Preparation Example 3 was significant. was restrained

그러나, 도 4의 B에서 보는 바와 같이, α,δ N-아세틸-D-글루타민을 투여한 경우에는 농도와 무관하게 사이토카인이 존재하는 수준을 억제하지 못하였다.However, as shown in FIG. 4B, when α,δ N-acetyl-D-glutamine was administered, the level of cytokines present could not be suppressed regardless of the concentration.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예 화합물을 경구투여하는 경우, Th2 사이토카인에 해당하는 IL-4, IL-5 및 IL-13이 존재하는 수준을 현저하게 억제함으로써 호산구를 통한 기도 염증, 기관지 과민 반응 및 IgE 항체의 생산을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 제조예 화합물이 "D" 폼인 경우에는 염증성 사이토카인을 억제할 수 없음을 알 수 있다.According to the above results, when the preparation compound according to the present invention is orally administered, the levels of IL-4, IL-5 and IL-13 corresponding to Th2 cytokines are significantly suppressed, thereby causing airway inflammation through eosinophils, bronchial It can be seen that hypersensitivity reactions and production of IgE antibodies can be inhibited very effectively. Furthermore, it can be seen that when the preparation compound is "D" form, it is not possible to inhibit inflammatory cytokines.

[실험 결과 3] [Experimental Result 3] 천식에서 기관지 과민 반응 억제 효과 확인Confirmation of inhibitory effect on bronchial hypersensitivity reaction in asthma

상기 실험 방법 1에서 천식이 유발된 마우스에 제조예 3(α,δ-NA-L-G) 또는 α,δ N-아세틸-D-글루타민을 2차 에어웨이 챌린지 30분 이전에 200 또는 400 ㎍/kg/일의 농도로 경구투여하고, 2차 챌린지 48시간 이후에 상기 실험 방법 5에 기재된 방법으로 기관지 과민 반응을 측정하여, 그 결과를 도 5의 A 및 B에 나타내었다.Preparation Example 3 (α,δ-NA-LG) or α,δ N-acetyl-D-glutamine was administered to the asthma-induced mouse in Experimental Method 1 30 minutes before the second airway challenge at 200 or 400 μg/kg/ After oral administration at a concentration of one day, the bronchial hypersensitivity reaction was measured by the method described in Experimental Method 5 above 48 hours after the second challenge, and the results are shown in A and B of FIG. 5 .

도 5의 A에서 보는 바와 같이, 제조예 3을 200 또는 400 ㎍/kg/일의 농도로 경구 투여하였을 때, 메타콜린의 농도가 증가됨에도 불구하고 Rrs 값이 현저하게 억제되는 것을 알 수 있다.As shown in FIG. 5A , when Preparation Example 3 was orally administered at a concentration of 200 or 400 μg/kg/day, it can be seen that the Rrs value was significantly suppressed despite the increase in the concentration of methacholine.

그러나, 도 5의 B에서 보는 바와 같이, α,δ N-아세틸-D-글루타민을 투여한 경우에는 제조예 3에서 나타난 Rrs가 억제되는 효과가 나타나지 않음을 확인하였다.However, as shown in FIG. 5B, when α,δ N-acetyl-D-glutamine was administered, it was confirmed that the inhibitory effect of Rrs shown in Preparation Example 3 did not appear.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예 화합물을 경구투여하는 경우, 천식에 의한 기관지 과민 반응을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다. 나아가, 제조예 화합물이 "D" 폼인 경우에는 기관지 과민 반응을 억제할 수 없음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the preparation compound according to the present invention is orally administered, the bronchial hypersensitivity reaction caused by asthma can be very effectively suppressed. Furthermore, it can be seen that when the preparation compound is "D" form, it is not possible to inhibit bronchial hypersensitivity reaction.

[실험 결과 4] [Experimental Result 4] 천식에서 폐조직 염증 억제 효과 확인Confirmation of the effect of inhibiting lung tissue inflammation in asthma

상기 실험 방법 1에서 천식이 유발된 마우스에 제조예 3(α,δ-NA-L-G)을 2차 챌린지 30분 이전에 200 또는 400 ㎍/kg/일의 농도로 경구투여하고, 2차 챌린지 48시간 이후에 상기 실험 방법 6에 기재된 방법으로 폐조직을 염색한 뒤 그 염증 정도 점수를 측정하여, 그 결과를 도 6의 A 및 B에 나타내었다.Preparation Example 3 (α,δ-NA-LG) was orally administered to the asthma-induced mice in Experimental Method 1 at a concentration of 200 or 400 μg/kg/day 30 minutes before the second challenge, and the second challenge 48 After time, the lung tissue was stained by the method described in Experimental Method 6, and then the inflammation degree score was measured, and the results are shown in FIGS. 6A and 6B.

도 6의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 2차 챌린지를 난황을 투여한 군(OVA)에서는 기도 주위에 많은 염증세포가 모여있고, 기관지도 좁아져 기관지 주위에 혈관이 형성되어 염증 점수(inflammation score)가 3이었다. 그러나, 200 ㎍/kg/일의 제조예 3을 투여한 군(OVA+ α,δ-NA-L-G(200 ㎍/kg/일)) 및 400 ㎍/kg/일의 제조예 3을 투여한 군(OVA+ α,δ-NA-L-G(400 ㎍/kg/일))에서는 염증 정도가 현저하게 억제되어 점수가 각각 2점 또는 1점으로 낮아졌다.As shown in A and B of Figure 6, in the group (OVA) administered with the egg yolk to the second challenge, many inflammatory cells are gathered around the airways, and the bronchi are narrowed and blood vessels are formed around the bronchi, so that the inflammation score (inflammation score) ) was 3. However, the group administered with Preparation Example 3 at 200 μg/kg/day (OVA+ α,δ-NA-LG (200 μg/kg/day)) and the group administered with Preparation Example 3 at 400 μg/kg/day ( In OVA+α,δ-NA-LG (400 μg/kg/day)), the degree of inflammation was significantly suppressed, and the score was lowered to 2 points or 1 point, respectively.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 제조예 화합물을 경구투여하는 경우, 천식에 의한 폐 조직에 발생되는 염증을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that when the preparation compound according to the present invention is orally administered, inflammation occurring in the lung tissue due to asthma can be very effectively suppressed.

[실험 결과 5] [Experiment Result 5] 천식 반응 억제와 관련된 세포신호전달 확인Confirmation of Cell Signaling Related to Asthma Response Inhibition

[5-1] [5-1] MKPMKP -1 단백질, p38 단백질 및 -1 protein, p38 protein and cPLA2cPLA2 단백질의 발현 및 활성화 수준 확인 Confirmation of protein expression and activation level

상기 실험 방법 1에 기재된 방법에 따라 2차 챌린지(난황 주사) 이후, 10분 및 30분에 MKP-1, p-cPLA, p-p38 및 GAPDH 단백질이 존재하는 수준을 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 측정하여, 그 결과를 도 7에 나타내었다. 여기서, 200, 500 또는 1000 ㎍/kg/일의 농도로 제조예 3을 매일 경구 투여하였다.According to the method described in Experimental Method 1, the level of MKP-1, p-cPLA, p-p38 and GAPDH proteins present at 10 and 30 minutes after the second challenge (egg yolk injection) was measured by the method described in Experimental Method 7 above. was measured, and the results are shown in FIG. 7 . Here, Preparation Example 3 was orally administered daily at a concentration of 200, 500 or 1000 μg/kg/day.

도 7에서 보는 바와 같이, 천식이 유도된 마우스의 폐 조직에서 2차 챌린지를 한지 10분 후부터 MKP-1 단백질이 존재하는 수준이 증가되었으며, 이와 같은 MKP-1 단백질의 증가는 제조예 3의 농도에 의존적으로 더욱 현저하게 증가되었다. 반면, p-cPLA 및 p-p38 단백질이 존재하는 수준은 제조예 3의 농도에 의존적으로 감소되었다.As shown in FIG. 7 , the level of the MKP-1 protein was increased from 10 minutes after the second challenge in the lung tissue of the asthma-induced mouse, and this increase in the MKP-1 protein was the concentration of Preparation Example 3 increased significantly more depending on the On the other hand, the levels of p-cPLA and p-p38 proteins were decreased depending on the concentration of Preparation Example 3.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규한 화합물은 MKP-1 단백질이 존재하는 수준을 증가시키며, cPLA 및 p38 단백질의 인산화를 억제하는 것을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the novel compound according to the present invention increases the level of MKP-1 protein and inhibits phosphorylation of cPLA and p38 proteins.

[5-2] MKP-1 억제에 의한 인산화 억제 효과 확인[5-2] Confirmation of phosphorylation inhibition effect by MKP-1 inhibition

상기 [5-1]에서 확인된 제조예 3의 cPLA 및 p38의 인산화 억제 효과가 MKP-1에 의존적인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 [5-1]과 동일한 조건에서, 상기 실험 방법 8에 기재된 바와 같이 MKP-1 siRNA를 처리하고 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 단백질이 존재하는 수준을 측정하여, 그 결과를 도 8에 나타내었다. 여기서, 대조군으로 상기 실험 방법 8에 기재된 바와 같이 MKP-1 siRNA를 대신하여, 대조 siRNA 스트랜드를 처리하였다.In order to determine whether the phosphorylation inhibitory effect of cPLA and p38 of Preparation Example 3 confirmed in [5-1] is dependent on MKP-1, under the same conditions as in Example [5-1], Experimental Method 8 MKP-1 siRNA was treated as described in , and the level of protein present was measured according to the method described in Experimental Method 7, and the results are shown in FIG. 8 . Here, as a control, a control siRNA strand was treated instead of MKP-1 siRNA as described in Experimental Method 8 above.

도 8에서 보는 바와 같이, MKP-1 단백질은 siRNA를 처리하였을 때 제조예 3을 투여하였음에도 불구하고, MKP-1 단백질이 존재하는 수준이 증가되지 않았으며, cPLA2 및 p38의 인산화 수준이 증가되었다.As shown in FIG. 8 , the level of MKP-1 protein was not increased, and phosphorylation levels of cPLA2 and p38 were increased even though Preparation Example 3 was administered when MKP-1 protein was treated with siRNA.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규한 화합물은 MKP-1 단백질의 발현 수준을 증가시키며, 나아가 p38 및 cPLA2의 인산화를 매우 효과적으로 억제하는 것을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the novel compound according to the present invention increases the expression level of MKP-1 protein, and further inhibits phosphorylation of p38 and cPLA2 very effectively.

[5-3] MKP-1 단백질에 의존적인 CK2/NF-kB 활성화 억제 여부 확인[5-3] Confirmation of inhibition of MKP-1 protein-dependent CK2/NF-kB activation

본 발명의 신규 화합물이 MKP-1 단백질이 p38의 인산화를 억제함으로써, CK2α 단백질이 NK-kB 단백질을 인산화하여 활성화시키는 기작을 통해 기관지 내에 염증이 유발되는 현상을 억제할 수 있는지 여부에 대해 확인하였다.By inhibiting phosphorylation of p38 by MKP-1 protein of the novel compound of the present invention, it was confirmed whether or not the CK2α protein could inhibit the induction of inflammation in the bronchi through the mechanism of phosphorylation and activation of NK-kB protein. .

구체적으로, 상기 실험 방법 1에 기재된 방법에 따라 2차 챌린지(난황 주사)하고, 1시간이 지난 후 폐를 적출하여 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 측정하고, 그 결과를 도 9의 A에 나타내었다. 또한, NK-kB에 의존적인 사이토카인에 해당하는 TNF-α가 존재하는 수준을 상기 실험 방법 4에 기재된 방법에 따라 ELISA를 수행하여, 그 결과를 도 9의 B에 나타내었다. 여기서, 400 ㎍/kg/일의 농도로 제조예 3을 매일 경구 투여하였다.Specifically, the second challenge (egg yolk injection) was performed according to the method described in Experimental Method 1, and after 1 hour, the lungs were removed and measured according to the method described in Experimental Method 7, and the results are shown in A of FIG. indicated. In addition, ELISA was performed according to the method described in Experimental Method 4 to determine the level of TNF-α corresponding to the NK-kB-dependent cytokine, and the results are shown in B of FIG. 9 . Here, Preparation Example 3 was orally administered daily at a concentration of 400 μg/kg/day.

도 9의 A 및 B에서 보는 바와 같이, 난황 주사를 통해 CK2α 단백질이 존재하는 수준이 증가되었으며, 이를 통해 NF-kB 단백질과 TNF-α가 존재하는 수준 역시 현저하게 증가되었다(도 9의 A 및 B의 좌측에서 두번째 컬럼). 그러나, 제조예 3을 투여한 경우 CK2α 단백질이 존재하는 수준이 감소되었으며, 이에 따라 NF-kB 및 TNF-α가 존재하는 수준이 감소되었다(도 9의 A 및 B의 좌측에서 5번째 컬럼). 이와 같이 CK2α, NF-kB 및 TNF-α가 존재하는 수준을 감소시키는 제조예 3의 효과는 MKP-1에 특이적인 siRNA를 처리하였을 때에는 나타내지 않았다.As shown in FIGS. 9 A and B, the level of CK2α protein was increased through egg yolk injection, and the level of NF-kB protein and TNF-α was also significantly increased (FIG. 9 A and second column from the left of B). However, when Preparation Example 3 was administered, the level of the CK2α protein was reduced, and accordingly, the level of NF-kB and TNF-α was decreased (the fifth column from the left of A and B in FIG. 9 ). As such, the effect of Preparation Example 3 for reducing the level of CK2α, NF-kB and TNF-α was not shown when MKP-1 specific siRNA was treated.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규 화합물은 MKP-1 단백질을 통해 CK2α 단백질의 발현 수준을 억제하고, 이에 따라 NF-kB 및 TNF-α가 존재하는 수준을 매우 효과적으로 억제함으로써 호흡기 질환을 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, the novel compound according to the present invention suppresses the expression level of CK2α protein through the MKP-1 protein, and accordingly, the level of NF-kB and TNF-α present is very effectively suppressed to treat respiratory diseases very effectively. it can be seen that

[5-4] CK2α 단백질과 p38의 상하위 관계 확인[5-4] Confirmation of the relationship between CK2α protein and p38

상기 실험 방법 1에 기재된 방법에 따라 2차 챌린지(난황 주사)하고, 1시간 또는 2시간이 지난 후 폐를 적출하여 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 측정하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다. 여기서, p38 억제제인 SB202190를 매일 투여하였다. The second challenge (egg yolk injection) was performed according to the method described in Experimental Method 1, and after 1 hour or 2 hours had elapsed, the lungs were removed and measured according to the method described in Experimental Method 7, and the results are shown in FIG. 10 . Here, SB202190, a p38 inhibitor, was administered daily.

도 10에서 보는 바와 같이, p38 억제제인 SB202190를 투여한 경우에 2차 챌린지하고 1시간 및 2시간이 지난 후에서 모두 CK2α 단백질이 존재하는 수준이 감소되었다.As shown in FIG. 10 , when SB202190, a p38 inhibitor, was administered, the level of the CK2α protein was decreased in both 1 and 2 hours after the second challenge.

상기 결과를 통해 CK2α 단백질은 p38의 상위에 존재하는 단백질임을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the CK2α protein is a protein that exists above p38.

[5-5] CK2α 단백질의 억제에 의한 NF-kB 활성화 억제 효과 확인[5-5] Confirmation of NF-kB activation inhibitory effect by inhibition of CK2α protein

상기 실험 방법 1에 기재된 방법에 따라 2차 챌린지(난황 주사)하고, 30분 또는 60분이 지난 후 폐를 적출하여 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 측정하고, 그 결과를 도 11의 A 및 B에 나타내었다. 또한, NK-kB에 의존적인 사이토카인에 해당하는 TNF-α가 존재하는 수준을 상기 실험 방법 4에 기재된 방법에 따라 ELISA를 수행하여, 그 결과를 도 11의 B에 나타내었다. 여기서, CK2α 단백질의 억제제인 TBBt를 매일 투여하였다.A second challenge (egg yolk injection) was performed according to the method described in Experimental Method 1, and after 30 or 60 minutes, the lungs were removed and measured according to the method described in Experimental Method 7, and the results are shown in FIGS. 11A and B shown in In addition, ELISA was performed according to the method described in Experimental Method 4 for the level of TNF-α corresponding to the NK-kB-dependent cytokine, and the results are shown in B of FIG. 11 . Here, TBBt, an inhibitor of CK2α protein, was administered daily.

도 11의 A 및 B에서 보는 바와 같이, CK2α 단백질의 억제제를 투여하는 경우 NF-kB 단백질이 존재하는 수준이 30분 및 60분에서 감소되었다. 나아가, NF-kB에 의해 조절되는 TNF-α 단백질이 존재하는 수준 역시 감소되었다.11A and B, when an inhibitor of CK2α protein was administered, the level of the NF-kB protein was decreased at 30 minutes and 60 minutes. Furthermore, the level of the presence of TNF-α protein regulated by NF-kB was also reduced.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규한 화합물은 MKP-1 단백질의 활성화를 유도함으로써, p38/CK2α/NF-kB 순서로 이루어지는 세포신호전달을 차단하여 호흡기 질환에서 발생되는 염증 반응을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, the novel compound according to the present invention induces the activation of MKP-1 protein, thereby blocking the cell signaling in the order of p38/CK2α/NF-kB, thereby very effectively inhibiting the inflammatory response occurring in respiratory diseases. It can be seen that

[5-6] MKP-1 단백질의 억제에 따른 천식 억제 효과 소멸 확인[5-6] Confirmation of disappearance of asthma inhibitory effect by inhibition of MKP-1 protein

상기 [5-2]에 기재된 방법에 따라 MKP-1에 특이적인 siRNA를 처리하고, 상기 실험 결과 1 내지 3에 기재된 방법과 동일하게 염증 세포 수, 사이토카인 발현 수준, 기관지 내 과민 반응 정도 및 폐조직의 염증 정도를 확인하여, 그 결과를 도 12 내지 15에 나타내었다.siRNA specific for MKP-1 was treated according to the method described in [5-2], and the number of inflammatory cells, cytokine expression level, degree of hypersensitivity in the bronchus, and lungs were treated in the same manner as in the methods described in 1 to 3 above. The degree of tissue inflammation was confirmed, and the results are shown in FIGS. 12 to 15 .

도 12 내지 15에서 보는 바와 같이, 제조예 3를 투여한 경우에는 중성구 및 호산구의 세포수가 감소되었으며, 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현 수준이 감소되었고, 폐조직의 염증 정도가 억제되었다. 그러나, 제조예 3에 추가로 MKP-1에 특이적인 siRNA를 처리한 경우에는 감소된 중성구 및 호산구의 세포수가 증가되었고, 사이토카인의 발현 수준 역시 증가되었으며, 폐조직의 염증 완화 효과도 사라졌다.12 to 15, when Preparation Example 3 was administered, the cell number of neutrophils and eosinophils was reduced, and the expression level of cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13) was reduced, and lung tissue The degree of inflammation was suppressed. However, when MKP-1 specific siRNA was additionally treated in Preparation Example 3, the decreased cell numbers of neutrophils and eosinophils were increased, the expression level of cytokines was also increased, and the inflammatory effect of the lung tissue disappeared.

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규한 화합물의 천식 억제 효과는 MKP-1 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 유도되는 것임을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the asthma inhibitory effect of the novel compound according to the present invention is induced by increasing the expression level of the MKP-1 protein.

정리하면, 도 16에 도시된 바와 같이, 본 발명에 따른 신규한 화합물은 MKP-1 단백질의 발현 수준을 증가시킴으로써 p38 단백질의 활성과, PLA2 단백질의 활성을 억제하여, p38/CK2α/NF-kB 순서에 의해 진행되는 세포신호전달을 통해 발현되는 사이토카인(TNF-α, IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현 수준을 억제하고, 에코사노이드에 의해 유도되는 염증 반응을 억제함으로써 기관지 내 발생되는 염증 반응을 매우 효과적으로 억제할 수 있다. In summary, as shown in FIG. 16 , the novel compound according to the present invention increases the expression level of MKP-1 protein, thereby inhibiting the activity of p38 protein and PLA2 protein, and thus p38/CK2α/NF-kB By suppressing the expression level of cytokines (TNF-α, IL-4, IL-5 and IL-13) expressed through cell signaling that proceeds in sequence, and suppressing the inflammatory response induced by ecosanoids It can very effectively suppress the inflammatory response that occurs in the bronchi.

[실험 결과 6] [Experiment result 6] 만성 폐쇄성 chronic obstructive 폐 질환에서in lung disease 증가되는increased 단백질의 발현 수준 억제 효과 확인 Confirmation of the effect of suppressing protein expression level

상기 실험 방법 1에 기재된 방법에 따라 마우스에서 만성 폐쇄성 폐 질환(Chronic Obstructive Pulmonary Disease; COPD)을 30일 동안 유도하면서, 250 ㎍/kg/일의 제조예 3(α,δ-NA-L-G)을 후반 15일 동안 경구 투여한 군(30); 또는 COPD를 60일 동안 유도하면서 250 ㎍/kg/일의 제조예 3을 후반 30일 동안 경구 투여한 군(60)에서, 상기 실험 방법 7에 기재된 방법에 따라 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 엘라스틴, 콜라겐 및 카스파제-3 단백질이 존재하는 수준을 측정하여 그 결과를 도 17 및 도 18에 나타내었다.While inducing Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) in mice according to the method described in Experimental Method 1 for 30 days, 250 μg/kg/day of Preparation Example 3 (α,δ-NA-LG) group administered orally for the last 15 days (30); Alternatively, in the group (60) in which 250 μg/kg/day of Preparation Example 3 was orally administered for the latter 30 days while inducing COPD for 60 days (60), Western blot analysis was performed according to the method described in Experimental Method 7 above to perform elastin, collagen And the level of the caspase-3 protein present was measured, and the results are shown in FIGS. 17 and 18 .

도 17 및 도 18에서 보는 바와 같이, COPD를 30일 및 60일 유도하였을 때 엘라스틴, 콜라겐 및 카스파제-3 단백질이 존재하는 수준이 증가되었으나(COPD), 이는 제조예 3을 투여하였을 때(COPD+ α,δ-NA-L-G) 그 단백질들이 존재하는 수준이 음성 대조군(saline) 수준으로 감소되었다.As shown in FIGS. 17 and 18 , when COPD was induced for 30 days and 60 days, the levels of elastin, collagen and caspase-3 proteins were increased (COPD), but when Preparation Example 3 was administered (COPD+ α,δ-NA-LG) the level of the proteins present was reduced to the level of the negative control (saline).

상기 결과를 통해 본 발명에 따른 신규한 화합물은 경구투여하였을 때 COPD에서 증가되는 엘라스틴, 콜라겐 및 카스파제-3 단백질의 발현 수준을 현저하게 억제하므로, 천식뿐만 아니라, COPD를 매우 효과적으로 치료할 수 있음을 알 수 있다.Through the above results, the novel compound according to the present invention remarkably inhibits the expression levels of elastin, collagen and caspase-3 proteins that are increased in COPD when orally administered, so that not only asthma but also COPD can be treated very effectively. Able to know.

[실험 결과 7] [Experiment result 7] 신규 화합물의 호흡기 내 염증 반응 억제 효과 확인Confirmation of the inhibitory effect of the novel compound on inflammatory responses in the respiratory

상기 실험 결과 1 내지 3에 기재된 방법과 동일하게 염증 세포 수, 사이토카인 발현 수준 및 기관지 내 과민 반응 정도를 확인하여, 그 결과를 도 19 내지 21에 나타내었다. 여기서, 본 발명의에서 제조된 다른 화합물들의 동등한 효과를 확인하기 위해 제조예 3을 대신하여 제조예 2(α,δ-NA-L-G-Bn) , 제조예 4(α,δ-NA-L-G-Et) 또는 제조예 6(α,δ-NA-L-G-Me)을 매일 경구투여하였다.In the same manner as in the experimental results 1 to 3, the number of inflammatory cells, the cytokine expression level, and the degree of hypersensitivity in the bronchus were checked, and the results are shown in FIGS. 19 to 21 . Here, in place of Preparation Example 3 to confirm the equivalent effect of other compounds prepared in the present invention, Preparation Example 2 (α, δ-NA-LG-Bn), Preparation Example 4 (α, δ-NA-LG- Et) or Preparation 6 (α,δ-NA-LG-Me) was orally administered daily.

도 19 내지 21에서 보는 바와 같이, 제조예 2, 제조예 4 및 제조예 6 역시 제조예 3과 마찬가지로, 중성구 및 호산구의 세포수가 감소되었으며, 사이토카인(IL-4, IL-5 및 IL-13)의 발현 수준이 감소되었고, 폐조직에서 발생되는 기관지 내 과민 반응 역히 억제되었다.19 to 21, Preparation Example 2, Preparation Example 4 and Preparation Example 6 also, as in Preparation Example 3, the cell number of neutrophils and eosinophils was reduced, cytokines (IL-4, IL-5 and IL-13 ) was reduced, and the bronchial hypersensitivity reaction occurring in the lung tissue was also suppressed.

상기 결과를 통해 동일한 골격을 코어로 공유하고 있는 제조예들은 제조예 3과 동일하게 호흡기 내 염증 반응을 매우 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that the preparation examples sharing the same skeleton as the core can very effectively suppress the inflammatory reaction in the respiratory tract in the same way as in Preparation Example 3.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.As the specific parts of the present invention have been described in detail above, for those of ordinary skill in the art, these specific techniques are only preferred embodiments, and it is clear that the scope of the present invention is not limited thereto. Accordingly, the substantial scope of the present invention will be defined by the appended claims and their equivalents.

Claims

A compound represented by the following formula (1), a compound selected from pharmaceutically acceptable salts, optical isomers, hydrates and solvates thereof:
[Formula 1]

R ₁ and R ₂ are each independently H or -C(=O)-R _{10 ,} but R ₁ and R ₂ are not H at the same time;
R ₃ to R ₆ are each independently H or a C1-C6 alkyl group;
R ₇ and R ₈ are each independently H, -C(=O)-R ₁₁ , or -C(=O)-OL ₁ -R _{12 ,} but R ₇ and R ₈ are not H at the same time;
R ₉ to R ₁₁ are each independently a C1-C6 alkyl group;
R ₁₂ is a C1-C6 alkyl group, a C6-C12 aryl group or a non-aromatic condensed polycyclic group having 5 to 20 nuclear atoms;
L ₁ is a direct bond or a C1-C6 alkylene group;
The _{alkyl group of R 9} is unsubstituted or substituted with one or more C6-C12 aryl groups, and when substituted with a plurality of substituents, they are the same or different from each other;
* is the chiral center.

The method of claim 1,
The compound is based on the chiral center represented by *, L form (L form), the compound.

The method of claim 1,
The compound is at least one selected from the group consisting of the following compounds, the compound: