KR20210060284A

KR20210060284A - 과일향이 풍부하고, 바이오제닉아민 생성을 저감하는 신규 사카로마이세스 세레비지애 afy-6 및 이를 포함하는 주류

Info

Publication number: KR20210060284A
Application number: KR1020200003707A
Authority: KR
Inventors: 이하연; 권혜정; 권순배; 박지선; 임재길; 이재형
Original assignee: 강원도
Priority date: 2019-11-18
Filing date: 2020-01-10
Publication date: 2021-05-26
Also published as: KR102346474B1

Abstract

본 명세서에는 세룰레닌(cerulenin) 저항성을 가지며, 아미노산 디카복실라제(decarboxylase) 활성이 저해된 특성을 가지며, 탄소원으로서 글리세롤을 이용하지만, α-메틸-D-글루코시드, D-셀로비오스, D-트레할로스 및 D-멜레지토스(Meleziose)는 이용하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주, 그 균주의 발효 용도, 그 균주를 포함하는 조성물, 및 그 균주를 이용하여 발효하는 방법이 개시되며, 상기 균주를 이용하면 향미가 우수하고 바이오제닉 아민이 저감된 주류를 제조할 수 있다.

Description

과일향이 풍부하고, 바이오제닉아민 생성을 저감하는 신규 사카로마이세스 세레비지애 AFY-6 및 이를 포함하는 주류{New Saccharomyces cerevisiae strain having high production ability of fruit flavor and low production ability of biogenic amines, and alcoholic beverages comprising the same}

본 명세서에는 과일향이 풍부하고, 바이오제닉아민 생성을 저감하는 신규 사카로마이세스 세레비지애 신균주 및 이를 이용한 발효방법이 개시된다.

술의 중요 향기성분인 알코올(alcohol), 알데히드(aldehyde), 에스테르(ester), 유기산류 등은 주로 효모 발효에 의해 생성된다. 동일한 원료라 할지라도 다른 균주로 발효하면 서로 다른 향과 맛이 나는 술이 제조된다.

특히 효모가 생성하는 중요 향기성분 중 하나인 에스테르는 산과 알코올의 결합된 형태로, 사람이 맡았을 때 과일향이 나는 향들이 많으며, 아세테이트 에스테르(acetate esters)와 중쇄지방산 에스테르(medium chain fatty acid esters) 두가지 그룹이 있다(Lambrechts & Pretorius. 2000. S. Afr. Enol. Vitic. 21:97-129).

아세테이트 에스테르는 고농도로 발견되며 효모에 의하여 좀더 쉽게 생성되며 감지할 수 있는 방법이 좀더 쉬운편이다. 관능학적 관점에서 가장 중요한 것은 에틸 아세테이트(ethyl acetate), 이소아밀 아세테이트(isoamyl acetate), 페닐에틸 아세테이트(phenylethyl acetate)이다.

중쇄지방산 에스테르(medium chain fatty acids ester)는 저농도로 생성되지만, 효모에 의한 이의 분비는 지방산 사슬 구성요소의 길이에 따라 강하게 영향을 받는다. 주요 물질은 에틸 카프로에이트(ethyl caproate) (ethyl hexanoate, C₈H₁₆O₂), 에틸 카프릴레이트(ethyl caprylate) (ethyl octanoate, C₁₀H₂₀O₂), 에틸 카프레이트(ethyl caprate) (ethyl decanoate, C₁₂H₂₄O₂)이다 (Saerens et al., 2006. J. Biol. Chem. 281:4446-4456).

이 물질의 합성과 축적은 전구체(에탄올, 지방산), 에스테라제(esterase)와 알코올 아실 트랜스퍼라제(alcohol acyl transferase) 효소의 존재에 따른다. 특히 지방산 생합성은 지방산 생합성 효소(Fatty acid synthase)의 작용에 좌우되며, 이는 억제제로 작용하는 세룰레닌(cerulenin)에 의해 활성이 억제되는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 지방산 고생성 균주를 선발하기 위한 수단으로서, 세룰레닌 저항성 균주를 탐색하는 것이 보고되었다(Baek et al., 2015. Microbiol. Biotechnol. Lett. 43(1): 56-64).

바이오제닉아민은 미생물, 식물, 동물의 대사과정 중 아미노산 탈탄산 작용으로 생성되는 질소화합물로서, 발효식품에서는 발효 과정 중 미생물에 의해 자연적으로 생성되지만 미량이라 할지라도 일생동안 섭취하므로 안전성에 대한 문제가 야기되고 있어 국민들의 불안감이 고조되어 있는 실정이다. 바이오제닉 아민류의 노출 기여 식품은 소주, 맥주, 다랑어/참치통조림, 라면, 막걸리, 김치(배추김치), 대두, 마늘 등으로 보고되었고, 식품의약안전처에서는 제조, 가공 중 바이오제닉 아민류의 생성을 줄이는 방법으로서 발효 및 저장 온도를 낮추는 등 최적의 발효, 숙성, 저장조건에 따른 제조와 우량 균주 선별을 통한 생성 제어, 기타 제조과정 중 첨가물 등을 이용한 바이오제닉 아민 저감화를 권고하고 있다 (2016, 식품의약품안전처, 바이오제닉 아민류 위해 평가 보고서).

대한민국 특허 등록 번호 제10-1599269호

일 측면에서. 본 발명은 과일향이 풍부한 주류 제조용 효모 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 발명은 알코올 또는 주류, 예컨대 맥주 발효용 신규 효모 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서. 본 발명은 바이오제닉 아민 생성 저감능을 갖는 효모 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 발명은 과일향이 풍부하면서도 바이오제닉 아민 생성 저감능을 갖는 효모 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 발명은 향미가 우수하고 바이오제닉 함량이 적은 맥주를 제조하는 것을 목적으로 한다.

일 측면에서, 본 발명은 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로서, 상기 균주는, 세룰레닌(cerulenin) 저항성을 가지며, 아미노산 디카복실라제(decarboxylase) 활성이 저해된 특성을 가지며, 탄소원으로서 글리세롤을 이용하지만, α-메틸-D-글루코시드, D-셀로비오스, D-트레할로스 및 D-멜레지토스(Meleziose)는 이용하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 알코올 발효용 효모 조성물로서, 상기 중 어느 한 균주를 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 주류로서, 상기 중 어느 한 균주를 포함하는 주류일 수 있다. 일 구현예에서, 상기 주류는 맥주일 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 알코올 발효 방법으로서, 상기 어느 한 균주를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 방법일 수 있다.

일 측면에서. 본 발명은 과일향이 풍부한 주류 제조용 효모 균주를 제공할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 알코올 또는 주류, 예컨대 맥주 발효용 신규 효모 균주를 제공할 수 있다.

일 측면에서. 본 발명은 바이오제닉 아민 생성 저감능을 갖는 효모 균주를 제공할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 과일향이 풍부하면서도 바이오제닉 아민 생성 저감능을 갖는 효모 균주를 제공할 수 있다.

일 측면에서, 본 발명은 향미가 우수하고 바이오제닉 함량이 적은 맥주를 제조할 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 효모와 양성 대조군 효모들의 세룰레닌 내성 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 효모와 양성 대조군 효모들을 아미노산 디카복실라제(Amino acid decarboxylase) 효소가 첨가된 배지에 배양한 사진을 비교한 것이다.

이하, 본 발명을 좀 더 상세히 설명한다.

일 구현예에서, 상기 균주의 세룰레닌(cerulenin) 저항성은 세룰레닌 농도 25 uM 이상에서의 저항성일 수 있다. 예컨대, 25 uM 에서의 저항성일 수 있다.

일 구현예에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) AFY-6 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 기탁번호 KACC 93329P로 기탁된 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 서열번호 3의 18S rRNA를 갖는 것인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 알코올 발효능을 갖는 것일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 맥주 발효용 균주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 맥주 발효시, 향기 성분을 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상을 충족하는 함량으로 생성하는 균주인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주일 수 있다:

(i) 0.18 ppm(w/v) 이상의 페닐에틸 알코올(Phenylethyl alcohol);

(ii) 1.67 ppm(w/v) 이상의 에틸 카프릴레이트(Ethyl caprylate); 및

(iii) 0.42 ppm(w/v) 이상의 에틸 카프레이트(Ethyl caprate).

예컨대, 상기 균주는 맥주 발효시, 페닐에틸 알코올(Phenylethyl alcohol)을 0.18 ppm(w/v) 이상, 0.19 ppm(w/v) 이상, 0.20 ppm(w/v) 이상, 0.21 ppm(w/v) 이상, 0.22 ppm(w/v) 이상, 0.23 ppm(w/v) 이상, 0.24 ppm(w/v) 이상, 0.25 ppm(w/v) 이상, 0.26 ppm(w/v) 이상, 0.27 ppm(w/v) 이상, 0.28 ppm(w/v) 이상, 0.29 ppm(w/v) 이상, 0.30 ppm(w/v) 이상 또는 0.31 ppm(w/v) 이상 생성할 수 있다. 한편, 페닐에틸 알코올(Phenylethyl alcohol)을 500ppm(w/v) 이하, 300ppm(w/v) 이하, 200ppm(w/v) 이하, 100ppm(w/v) 이하 또는 50 ppm(w/v) 이하로 생성할 수 있다.

또한, 예컨대, 상기 균주는 맥주 발효시, 에틸 카프릴레이트(Ethyl caprylate)를 1.67 ppm(w/v) 이상, 1.68 ppm(w/v) 이상, 1.69 ppm(w/v) 이상, 1.70 ppm(w/v) 이상, 1.71 ppm(w/v) 이상, 1.72 ppm(w/v) 이상, 1.73 ppm(w/v) 이상, 1.74 ppm(w/v) 이상, 1.75 ppm(w/v) 이상, 1.76 ppm(w/v) 이상, 1.77 ppm(w/v) 이상, 1.78 ppm(w/v) 이상, 1.79 ppm(w/v) 이상, 1.80 ppm(w/v) 이상 또는 1.81 ppm(w/v) 이상 생성할 수 있다. 한편 에틸 카프릴레이트(Ethyl caprylate)를 600ppm(w/v) 이하, 300ppm(w/v) 이하, 150ppm(w/v) 이하, 100ppm(w/v) 이하 또는 60 ppm(w/v) 이하로 생성할 수 있다.

또한, 예컨대, 상기 균주는 맥주 발효시, 에틸 카프레이트(Ethyl caprate)를 0.42 ppm(w/v) 이상, 0.43 ppm(w/v) 이상, 0.44 ppm(w/v) 이상, 0.45 ppm(w/v) 이상, 또는 0.46 ppm(w/v) 이상 생성할 수 있다. 한편, 에틸 카프레이트(Ethyl caprate)를 500ppm(w/v) 이하, 300ppm(w/v) 이하, 150ppm(w/v) 이하, 100ppm(w/v) 이하, 50ppm(w/v) 이하, 30ppm(w/v) 이하, 또는 15 ppm(w/v) 이하로 생성할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 아미노산은 루신 및 트립토판을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 바이오제닉 아민은 트립타민(tryptamine), 베타-페닐에틸아민(β-phenylethylamine),푸트레신(putrescine), 카다버린(cadaverine), 히스타민(histamine), 티라민(tyramine), 스퍼미딘(spermidine) 및 스퍼민(spermine)을 포함할 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 맥주 발효 시 4종의 바이오제닉 아민인 푸트레신(putrescine), 카다버린(cadaverine), 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)을 포함할 수 있으며, 상기 4종의 바이오제닉 아민의 총 생성량이 11 ppm (w/v) 이하일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 균주는 맥주 발효 시 상기 4종의 바이오제닉 아민의 생성량이 11 ppm (w/v) 이하, 10.8 ppm (w/v) 이하, 10.6 ppm (w/v) 이하, 10.4 ppm (w/v) 이하, 10.2 ppm (w/v) 이하, 10 ppm (w/v) 이하, 9.8 ppm (w/v) 이하, 9.6ppm (w/v) 이하, 9.4 ppm (w/v) 이하, 9.2 ppm (w/v) 이하, 9.0 ppm (w/v) 이하, 8.8 ppm (w/v) 이하, 8.6 ppm (w/v) 이하, 8.4 ppm (w/v) 이하, 8.2 ppm (w/v) 이하, 8 ppm (w/v) 이하, 7.8 ppm (w/v) 이하, 7.6 ppm (w/v) 이하, 7.4 ppm (w/v) 이하, 7.2 ppm (w/v) 이하, 7 ppm (w/v) 이하, 6.9 ppm (w/v) 이하, 6.8 ppm (w/v) 이하, 6.7 ppm (w/v) 이하, 6.6 ppm (w/v) 이하, 6.5 ppm (w/v) 이하, 6.4 ppm (w/v) 이하, 6.3 ppm (w/v) 이하, 6.2 ppm (w/v) 이하, 6.1 ppm (w/v) 이하, 또는 6.09 ppm (w/v) 이하 일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 바이오제닉 아민 생성량 측정은 바이오제닉 아민류 위해평가 보고서(2016, 대한민국 식품의약품안전평가원) 방법에 따른 것일 수 있다.

일 측면에서 본 발명은 주류로서, 상기 중 어느 한 균주를 포함하는 주류일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 주류는 맥주일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법은 맥주 발효를 위한 방법일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법은, 맥아즙에 효모를 첨가하고 15 내지 25℃에서 1 내지 2주간 1차 발효시키는 단계; 및 상기 1차 발효된 발효물을 병입 후 가당하고 15 내지 25℃에서 5 내지 9일간 2차 발효시키는 단계를 포함하는 방법일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 방법은, 상기 2차 발효된 발효물을 0 내지 5℃에서 5 내지 9일간 숙성시키는 단계를 더 포함하는, 알코올 발효 방법일 수 있다.

일 구현예에서, 상기 향기성분 또는 바이오제닉 아민은 효모 10g을 맥아즙에 첨가한 후 20℃에서 1~2주간 발효하였고, 내압페트병 500 mL에 각각 병입 후, 설탕을 5~8 g 넣은 후, 20℃에서 7일간 발효하여 탄산을 생성시키고 0~5℃에서 1주간 숙성한 후 측정되는 것일 수 있다. 구체적으로, 효모 10g을 맥아즙에 첨가한 후 20℃에서 1.5주간 발효하였고, 내압페트병 500 mL에 각각 병입 후, 설탕을 6.5 g 넣은 후, 20℃에서 7일간 발효하여 탄산을 생성시키고 2.5℃에서 1주간 숙성한 후 측정되는 것일 수 있다. 더욱 구체적으로, 67℃로 물 20~24 L (예컨대, 22L)에 필스너 몰트(Pilsner malt) 3.40 kg, 카라헬몰트(Carahell malt) 0.80 kg, 뮤닉 II 몰트(Munich II malt) 0.70 kg를 분쇄기로 분쇄하여 물에 투입하고, 67℃에서 1시간 당화를 진행한 후. 맥아즙을 받아서 곡물층에 넣고 맑아질 때 까지 반복한 다음. 미리 가온시킨 물 10~15 L (예컨대, 12.5L)를 여과층이 깨지지 않게 첨가하여 10분간 스파징하고 홉을 첨가하여 100℃에서 끓이는 공정은 1시간 동안 진행한 다음. 시트라(Citra) 10 g 60분, 시트라(citra) 28 g 20분, 모자익(Mosaic)은 마지막 0분에 투여하고, 맥아즙은 26℃까지 냉각시킨 후, 건조분말 상태의 효모를 각각 10 g을 첨가한 다음. 20℃에서 1~2주간 (예컨대, 1.5주) 발효하고, 내압페트병 500 mL에 각각 병입 후, 설탕을 5~8 g (예컨대, 6.5g) 넣은 후, 20℃에서 7일간 발효하여 탄산을 생성시킨 후 0~5℃ (예컨대, 2.5℃) 에서 1주간 숙성한 후 측정되는 것일 수 있다.

본 명세서에서 인용된 모든 문헌들은 그 전체가 참조로서 본 명세서의 일부로 통합된다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하나, 이는 예시일 뿐 권리범위가 이에 제한되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 신규 효모의 분리

춘천시 신북읍 샘밭장터에서 구입한 누룩 10 g 또는 10 mL를 증류수 90 mL에 첨가하여 1시간 동안 교반하여 추출한 다음, 추출액을 YPD broth에 접종하여 25℃, 2시간 배양한 후에 곰팡이의 생육을 억제하기 위하여 0.35 % sodium propionate가 첨가된 YPD agar 배지에서 25℃, 48시간 배양한 후, 단일 콜로니를 획득하여 분리하였다. 분리된 균주를 하기 균주 동정 후에 사카로마이세스 세레비지애 AFY-6으로 명명하고, 상기 균주를 2019년 08월 22자로 기탁기관인 국립농업과학원에 기탁하였다(기탁번호 : KACC 93329P).

< 실시예 2> AFY -6 균주의 동정

1. 분자생물학적 동정

Yeast DNA prep kit를 이용하여 DNA를 추출하였고, NS1(5'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’)(서열번호 1), NS8(5‘-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3’) (서열번호 2) 프라이머를 이용하여 18S rRNA 부위를 PCR로 증폭하였다. 증폭된 부위는 정제한 후, ㈜마크로젠에 염기서열분석을 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. AFY-6 균주는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 균주와 99% 일치하였고, 사카로마이세스 세레비지애 AFY-6으로 명명하고, 상기 균주를 2019년 8월 22자로 기탁기관인 국립농업과학원에 기탁하였다(기탁번호 : KACC 93329P). 분석된 18S rRNA 부위의 염기서열은 하기 서열번호 3에 나타내었다.

CGGCATGACAGCTTGTCCAATTCTCCGCTCTGAGATGGAGTTGCCCCCTTCTCTAAGCAGATCCTGAGGCCTCACTAAGCCATTCAATCGGTACTAGCGACGGGCGGTGTGTACAAAGGGCAGGGACGTAATCAACGCAAGCTGATGACTTGCGCTTACTAGGAATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTACAATGCTCTATCCCCAGCACGACGGAGTTTCACAAGATTACCAAGACCTCTCGGCCAAGGTTAGACTCGCTGGCTCCGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACGTCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCTCAAACTTCCATCGGCTTGAAACCGATAGTCCCTCTAAGAAGTGGATAACCAGCAAATGCTAGCACCACTATTTAGTAGGTTAAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCACCCACAAAATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTGTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACTCCTGGTGGTGCCCTTCCGTCAATTCCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAGACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAGTGGGTCATTAAAAAAACACCACCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCATCTTCGATCCCCTAACTTTCGTTCTTGATTAATGAAAACGTCCTTGGCAAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAATAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAATTGAATACTGATGCCCCCGACCGTCCCTATTAATCATTACGATGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCAAACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATATATTCGAGCAATACGCCTGCTTTGAACACTCTAATTTTTTCAAAGTAAAAGTCCTGGTTCGCCAAGAGCCACAAGGACTCAAGGTTAGCCAGAAGGAAAGGCCCCGTTGGAAATCCAGTACACGAAAAAATCGGACCGGCCAACCGGGCCCAAAGTTCAACTACGAGCTTTTTAACTGCAACAACTTTAATATACGCTATTGGAGCTGGAATTACCGCGGCTGCTGGCACCAGACTTGCCCTCCAATTGTTCCTCGTTAAGGTATTTACATTGTACTCATTCCAATTACAAGACCCGAATGGGCCCTGTATCGTTATTTATTGTCACTACCTCCCTGAATTAGGATTGGGTAATTTGCGCGCCTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAGCCGTTTCTCAGGCTCCCTCTCCGGAATCGAACCCTTATTCCCCGTTACCCGTTGAAACCATGGTAGGCCACTATCCTACCATCGAAAGTTGATAGGGCAGAAATTTGAATGAACCATCGCCAGCACAAGGCCATGCGATTCGAAAAGTTATTATGAATCATCAAAGAGTCCGAAGACATTGATTTTTTATCTAATAAATACATCTCTTCCAAAGGGTCGAGATTTTAAGCATGTATTAGCTCTAGAATTACCACAGTTATACCATGTAGTAAAGGAACTATCAAATAAACGATAACTGATTTAATGAGCCATTCGCAGTTTCACTGTATAAATGCTATACTAGACATGCGATCCT

2. 생화학적 동정

상기 동정된 사카로마이세스 세레비지애 AFY-6 균주는 API 20C AUX 키트를 이용하여 탄소원 이용능을 평가하여 생화학적 동정을 수행하여 표 1에 나타내었다. 시판효모와 시험균주 모두 같은 Saccharomyces cerevisiae 이지만 탄소원 이용능은 서로 달라 각기 다른 균주임을 확인하였다.

구 분	상업효모		분리 효모
구 분	C1	C2	AFY-6
Control	-	-	-
Glucose	+	+	+
Glycerol	-	-	+
2-Keto-D-glucose	-	-	-
L-Arabinose	-	-	-
D-Xylose	-	-	-
Adonitol	-	-	-
Xylitol	-	-	-
D-Galactose	+	+	+
Inositol	-	-	-
D-Sorbitol	-	-	-
α-Methyl-D-Glucoside	+	+	-
N-Acetyl-D-Glucosamine	-	-	-
D-Celiobiose	+	-	-
D-Lactose	-	-	-
D-Maltose	+	+	+
D-Saccharose	+	+	+
D-Trehalose	-	+	-
D-Melezitose	-	+	-
D-Raffinose	+	+	+

< 실시예 3> 세룰레닌 내성 평가

중쇄지방산 에스테르 고생성 균주를 선발하기 위하여 세룰레닌(cerulenin) 내성을 평가하였다. 배지는 0.67 % Yeast nitrogen base, 2 % glucose, 2 % agar를 첨가하여 pH 5.3으로 조정 한 후, 25 uM 세룰레닌을 첨가하여 제조하였다. 대조구로서 상업효모 C1 (S-04, Fermentis, France), C2 (US-05, Fermentis, France)을 이용하였다. 균주는 YPD (Yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose 2%) broth 배지에 25℃에서 48시간 배양한 후, OD값이 0.2가 되게 회수한 후, 10배씩 단계별로 희석액을 제조하여 200 μL씩 도말하여 생육을 비교하였다. 그 결과는 하기 표 2와 도 1에 나타나 있다. 표 2와 도 1에 나타나 있듯이, AFY-6가 C1, C2 상업효모에 비하여 세룰레닌 내성이 더 높은 것을 확인하여 지방산 에스테르 생성량이 더 높을 것으로 예상하였다.

세룰레닌 내성 평가 (단위 : CFU/ml)

구 분	생균수
C1	1.0 x 10⁶
C2	2.0 x 10⁶
AFY-6	2.5 x 10⁶

< 실시예 4> 바이오제닉 아민 생성 평가

Decarboxylase broth base, Moeller (pH 5.0)에 1.5% agar를 넣고 멸균한 후 필터링한 1% tryptophan을 첨가하여 배지를 제조하였다. 대조구로서 상업효모 C1 (S-04, Fermentis, France), C2 (US-05, Fermentis, France)을 이용하였다. 균주는 30℃, 48시간 배양 한 후, OD(600 nm)를 측정하여 OD가 0.2가 되도록 희석하였다. 멸균 3차 증류수로 10-4까지 희석용액 제조 한 후, 배지에 각각 20 ㎕를 점적하여, 30℃, 48시간 배양하였다. 그 결과는 도 1에 나타내었다.

기작의 원리는 아미노산 디카복실라제(Amino acid decarboxylase) 효소가 있는 균주는 아미노산을 아민으로 전환시켜 배지의 pH가 상승됨으로써 지시약의 색깔이 노란색(산성)에서 보라색(염기성)으로 변하는 것이다.

도 2를 보면 루신(Leucine)이 첨가된 배지에서 상업효모 C1와 C2는 콜로니가보라색으로 변하였고, AFY-6 균주는 콜로니가 보라색으로 변하지 않고 노란색인 것을 확인하였다.

이를 통하여 AFY-6 균주는 류신 디카복실라제(Leucine decarboxyalse) 의 활성이 낮아 류신(leucine)의 아민형태인 카다버린(cadaverine)과 생성이 저감될 것으로 예상하였다.

< 실시예 5> AFY -6 효모를 이용한 맥주 발효

1. 맥주 제조

67℃로 미리 가온한 물 20~24 L에 필스너 몰트(Pilsner malt) 3.40 kg, 카라헬몰트(Carahell malt) 0.80 kg, 뮤닉 II 몰트(Munich II malt) 0.70 kg를 분쇄기로 분쇄하여 물에 투입하였고, 당화온도는 67℃에서 1시간 진행하였다. 맥아즙을 받아서 곡물층에 넣고 맑아질 때 까지 반복하였다. 미리 가온시킨 물 10~15 L를 여과층이 깨지지 않게 첨가하여 10분간 스파징하였다. 홉을 첨가하여 100℃에서 끓이는 공정은 1시간 동안 진행하였으며, 홉의 종류마다 투여하는 시간은 다르다. 시트라(Citra) 10 g 60분, 시트라(citra) 28 g 20분, 모자익(Mosaic)은 마지막 0분에 투여하였다. 맥아즙은 하여 26℃까지 냉각시킨 후, 건조분말 상태의 수입산 시판효모와 분리효모를 각각 10 g을 첨가하였다. 20℃에서 7일간 발효하였고, 내압페트병 500 mL에 각각 병입 후, 설탕을 5~8 g 넣은 후, 20℃에서 7일간 발효하여 탄산을 생성시켰다. 발효가 끝난 맥주는 0~5℃에서 1주간 숙성하였다. 대조구로서 상업효모 C1 (S-04, Fermentis, France), C2 (US-05, Fermentis, France)을 이용하였다.

2. 향기성분 분석

10 mL SPME vial에 맥주 시료 4.0 mL와 NaCl 1.0 g을 첨가하였다. HS-SPME 분석조건은 50/30 DVB/CAR/PDMS fiber (Supelco, Bellefonte, PA, USA)를 이용하였다. 향기성분을 포집하기 위하여 인큐베이터에서 60℃에서 30분, 400 rpm 조건으로 진탕하여 얻은 headspace로부터 향기성분을 포집한 후, 100 rpm에서 15분간 fiber에 향기성분을 흡착하였다. 시료 주입은 250℃에서 5분간 수행하였다. 분석기기는 GC (Agilent 7890A, USA)와 Pegasus HT TOF-MS (Leco, USA)를 이용하였다. 컬럼은 Rxi-5MS (30 m x 0.25 mm, I.d x 0.25 ㎛ coating, Resteck)를 사용하였다. 운반기체는 고순도(99.999%) 헬륨가스를 유속 1.0 mL/min로 사용하였고, 주입구 온도는 220℃로 하여 Splitless mode 방법으로 컬럼온도는 40℃에서 2분간 유지시킨 후, 10℃/min로 250℃까지 승온시킨 후, 마지막 2분간 유지하였다. 매스 스펙트라(Mass spectra) 범위는 33-51 m/z로 하였으며, Acquisition rate는 10 spectra/s로 하였다. 이온 소스와 전송라인 온도는 200℃로 설정하였다. Electron impact는 70 eV로 하여 분석하였고, Pegasus CT 소프트웨어와, NIST (National Institute of Standards and Technology, USA) 라이브러리로 비교하여 유효성분을 동정을 실시하였다. 대조구로서 상업효모 C1 (S-04, Fermentis, France), C2 (US-05, Fermentis, France)을 이용하였다. Phenylethyl alcohol, ethyl cprylate, ethyl caprate 와 같은 향기성분이 맥아즙과 비교하여 효모에 의한 발효과정 중 생성된 것으로 확인되었고, AFY-6 효모는 상업효모인 C1, C2에 비하여 Phenylethyl alcohol, ethyl cprylate, ethyl caprate의 생성량을 현저히 증가시키는 것을 확인하였다.

휘발성 향기성분 분석 (단위 : ppm(w/v) )

구 분	향기 특징	R.T.	맥아즙	C1	C2	AFY-6
Phenylethyl alcohol	sweet,　floral,　bready,　rose,　honey	10:07.8	0.02	0.16	0.17	0.31
Ethyl caprylate	Fruity, sweet apricot banana brandy pear	11:20.7	0.02	1.37	1.66	1.81
Ethyl caprate	Fruity, apple, grape, brandy	14:06.4	0.04	0.41	0.34	0.46

3. 바이오제닉 아민 분석

맥주 5.0 mL에 0.4 M 과염소산을 첨가한 후, 4℃에서 4시간 추출한 후, 여과지로 시료를 여과하였다. 4℃, 3,000 rpm 조건에서 10분간 원심분리한 후, 상등액 1 mL를 취하여 포화 탄화수소나트륨 300 μL와 2 M 수산화나트륨 200 μL을 첨가하고 댄실염화물 2 mL을 첨가 후 40℃ dry oven에 45분간 반응시켰다. 25% 수산화암모늄 100 μL을 첨가하고 실온에서 30 분간 반응시키고 댄실염화물을 제거하였다. 아세토나트릴로 첨가하여 최종 부피를 5 mL로 정용 후 원심분리한 후, 상층액을 0.45 μm membrane filter에 여과하고 분석시료로 사용하였다. 바이오제닉 아민류 위해평가 보고서(2016, 식품의약품안전평가원) 방법을 참고하여 전처리한 시료를 HPLC로 분석하였다. 표준물질은 바이오제닉 아민 4종(putrescine, cadaverine, histamine, tyramine)을 이용하였다. 분석기기는 NASKA2 (Shiseido, Japan)을 이용하였고, 컬럼은 UK-C18 (150*3 mm, 3 um)을 사용하였다. 컬럼온도는 25℃로 맞추고, 이동상 A는 0.1 M ammonium acetate, 이동상 B는 acetonitrile, 러닝타임은 30분, 감지파장은 254 nm, 유속은 500 uL/min, 시료 주입부피는 5 uL를 주입하였다. 기기 분석 시 용매는 gradient elution 조건으로(0 min, 50% B/ 19 min, 90% B/ 25 min, 50% B)으로 수행하였다. 대조구로서 상업효모 C1 (S-04, Fermentis, France), C2 (US-05, Fermentis, France)을 이용하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타나 있다. 맥아즙과 비교하여 효모로 발효한 맥주는 바이오제닉 아민이 생성되어 발효에 의하여 바이오제닉 아민이 생성되는 것을 확인할 수 있었고, C1, C2, AFY-6 균주로 발효한 맥주의 바이오제닉 아민은 각각 11.61ppm (w/v), 13.60ppm (w/v), 6.09 ppm (w/v)로 측정되어 AFY-6 균주가 상업효모 보다 바이오제닉 아민 생성량이 낮은 것을 확인하였다.

바이오제닉 아민 분석 (단위 :ppm (w/v))

	Putrescine	Cadaverine	Histamine	Tyramine	합 계
C1	0.96	10.16	0.18	0.31	11.61
C2	1.18	11.71	0.24	0.47	13.60
AFY-6	0.60	5.21	0.02	0.26	6.09

농업생명공학연구원

KACC93329

20190822

<110> KANGWON PROVINCE <120> New Saccharomyces cerevisiae strain having high production ability of fruit flavor and low production ability of biogenic amines, and alcoholic beverages comprising the same <130> 19p409/ind <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS1 primer <400> 1 gtagtcatat gcttgtctc 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NS8 primer <400> 2 tccgcaggtt cacctacgga 20 <210> 3 <211> 1693 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 3 cggcatgaca gcttgtccaa ttctccgctc tgagatggag ttgccccctt ctctaagcag 60 atcctgaggc ctcactaagc cattcaatcg gtactagcga cgggcggtgt gtacaaaggg 120 cagggacgta atcaacgcaa gctgatgact tgcgcttact aggaattcct cgttgaagag 180 caataattac aatgctctat ccccagcacg acggagtttc acaagattac caagacctct 240 cggccaaggt tagactcgct ggctccgtca gtgtagcgcg cgtgcggccc agaacgtcta 300 agggcatcac agacctgtta ttgcctcaaa cttccatcgg cttgaaaccg atagtccctc 360 taagaagtgg ataaccagca aatgctagca ccactattta gtaggttaag gtctcgttcg 420 ttatcgcaat taagcagaca aatcactcca ccaactaaga acggccatgc accaccaccc 480 acaaaatcaa gaaagagctc tcaatctgtc aatccttatt gtgtctggac ctggtgagtt 540 tccccgtgtt gagtcaaatt aagccgcagg ctccactcct ggtggtgccc ttccgtcaat 600 tcctttaagt ttcagccttg cgaccatact ccccccagaa cccaaagact ttgatttctc 660 gtaaggtgcc gagtgggtca ttaaaaaaac accacccgat ccctagtcgg catagtttat 720 ggttaagact acgacggtat ctgatcatct tcgatcccct aactttcgtt cttgattaat 780 gaaaacgtcc ttggcaaatg ctttcgcagt agttagtctt caataaatcc aagaatttca 840 cctctgacaa ttgaatactg atgcccccga ccgtccctat taatcattac gatggtccta 900 gaaaccaaca aaatagaacc aaacgtccta ttctattatt ccatgctaat atattcgagc 960 aatacgcctg ctttgaacac tctaattttt tcaaagtaaa agtcctggtt cgccaagagc 1020 cacaaggact caaggttagc cagaaggaaa ggccccgttg gaaatccagt acacgaaaaa 1080 atcggaccgg ccaaccgggc ccaaagttca actacgagct ttttaactgc aacaacttta 1140 atatacgcta ttggagctgg aattaccgcg gctgctggca ccagacttgc cctccaattg 1200 ttcctcgtta aggtatttac attgtactca ttccaattac aagacccgaa tgggccctgt 1260 atcgttattt attgtcacta cctccctgaa ttaggattgg gtaatttgcg cgcctgctgc 1320 cttccttgga tgtggtagcc gtttctcagg ctccctctcc ggaatcgaac ccttattccc 1380 cgttacccgt tgaaaccatg gtaggccact atcctaccat cgaaagttga tagggcagaa 1440 atttgaatga accatcgcca gcacaaggcc atgcgattcg aaaagttatt atgaatcatc 1500 aaagagtccg aagacattga ttttttatct aataaataca tctcttccaa agggtcgaga 1560 ttttaagcat gtattagctc tagaattacc acagttatac catgtagtaa aggaactatc 1620 aaataaacga taactgattt aatgagccat tcgcagtttc actgtataaa tgctatacta 1680 gacatgcgat cct 1693

Claims

사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주로서,
상기 균주는,
세룰레닌(cerulenin) 저항성을 가지며,
아미노산 디카복실라제(decarboxylase) 활성이 저해된 특성을 가지며,
탄소원으로서 글리세롤을 이용하지만, α-메틸-D-글루코시드, D-셀로비오스, D-트레할로스 및 D-멜레지토스(Meleziose)는 이용하지 않는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) AFY-6 균주인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제2항에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KACC 93329P로 기탁된 균주인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 3의 18S rRNA를 갖는 것인 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 알코올 발효능을 갖는 것인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제5항에 있어서, 상기 균주는 맥주 발효용인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제6항에 있어서, 상기 균주는 맥주 발효시, 향기 성분을 하기 (i) 내지 (iii) 중 하나 이상을 충족하는 함량으로 생성하는 균주인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주:
(i) 0.18 ppm(w/v)이상의 페닐에틸 알코올(Phenylethyl alcohol);
(ii) 1.67 ppm(w/v)이상의 에틸 카프릴레이트(Ethyl caprylate); 및
(iii) 0.42 ppm(w/v)이상의 에틸 카프레이트(Ethyl caprate).
제1항에 있어서, 상기 아미노산은 루신 및 트립토판을 포함하는, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제1항에 있어서, 상기 균주는 맥주 발효 시 바이오제닉 아민인 푸트레신(putrescine), 카다버린(cadaverine), 히스타민(histamine) 및 티라민(tyramine)의 생성량이 11 ppm (w/v) 이하인, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae) 균주.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주를 유효성분으로 포함하는 알코올 발효용 효모 조성물.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주를 포함하는 주류.
제11항에 있어서, 상기 주류는 맥주인, 주류.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 균주를 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 알코올 발효 방법.
제13항에 있어서, 상기 방법은 맥주 발효를 위한 것인, 알코올 발효 방법.
제14항에 있어서, 상기 방법은,
맥아즙에 효모를 첨가하고 15 내지 25℃에서 1 내지 2주간 1차 발효시키는 단계; 및
상기 1차 발효된 발효물을 병입 후 가당하고 15 내지 25℃에서 5 내지 9일간 2차 발효시키는 단계를 포함하는, 알코올 발효 방법.
제15항에서, 상기 방법은,
상기 2차 발효된 발효물을 0 내지 5℃에서 5 내지 9일간 숙성시키는 단계를 더 포함하는, 알코올 발효 방법.