KR20210057786A - 생체적합성 마이크로-스위머를 만드는 방법, 마이크로-스위머 그리고 이러한 마이크로-스위머를 사용하는 방법 - Google Patents

생체적합성 마이크로-스위머를 만드는 방법, 마이크로-스위머 그리고 이러한 마이크로-스위머를 사용하는 방법 Download PDF

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옹카이 위아자
이미한 체렌 위아자
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막스-플랑크-게젤샤프트 츄어 푀르더룽 데어 비쎈샤프텐 에.파우.
코치 우느베르스티
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Abstract

본 발명은 생체적합성 마이크로-스위머를 만드는 방법에 관한 것이고, 방법은 광 가교성 바이오폴리머 용액을 제공하는 단계; 자성 입자와 광 개시제를 광 가교성 바이오폴리머 용액에 첨가하여 3D 프린팅 가능한 용액을 형성하는 단계; 3D 프린팅 가능한 용액을 향하는 가변 초점으로 레이저를 적용하는 단계; 3D 프린팅 가능한 용액을 통한 레이저의 초점을 변경하여 미리 정의된 형상을 가지는 생체적합성 마이크로-스위머를 형성하는 단계; 그리고 미리 정의된 형상을 가지는 생체적합성 마이크로-스위머에 화학적 링커를 적용하는 단계를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 마이크로-스위머 및 이러한 마이크로-스위머를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

생체적합성 마이크로-스위머를 만드는 방법, 마이크로-스위머 그리고 이러한 마이크로-스위머를 사용하는 방법
본 발명은 생체적합성(biocompatible) 마이크로-스위머(micro-swimmer)를 만드는 방법에 관한 것이다. 나아가 본 발명은 이러한 마이크로-스위머 및 이러한 마이크로-스위머를 사용하는 방법에 관한 것이다.
외부 자기장에 의해 구동되는 마이크로스코픽(microscopic) 스위머들은 무선 작동, 능동적 이동 및 정확한 위치 능력으로 인해 의료 분야에서 상당한 잠재력을 가진다. 그들의 작은 크기 및 줄로 매이지 않는 제어는 깊은 조직 침투를 허용할 수 있으며 그에 따라 최소 침습적 수술 및 치료에 혁명을 일으킬 수 있다. 지금까지 외부 동력원을 사용하여 구동되는 합성 자기 마이크로-스위머는 표적 화물 수송, 물체/세포 조작 및 조직 공학 응용을 위한 다양한 플랫폼에서 사용되었다. 특히 나선형 자기 마이크로-스위머(helical magnetic micro-swimmers)는 마이크로스케일 작동을 위한 자기 그래디언트 풀링(magnetic gradient pulling)보다 마그네틱 토크의 효율성으로 인해 최근 관심을 받고 있다.
외부 회전 자기장에 의해 낮은 레이놀즈 수 영역에서 작동되는 나선형 마이크로-스위머는 이전에 나선형으로 구부러진 구리(cupper) 와이어의 헤드(head)에 통합된 작은 자석을 사용하여 밀리미터(millimeter) 스케일로 설계되었다. 그런 다음, 셀프-스크롤링(self-scrolling) 및 글랜싱(glancing) 각도 포지션을 포함하는 다양한 제조 기술들이 마이크로 스케일의 나선형 자기 스위머를 제조하기 위해 사용되었다. 그 후, 2-광자 다이렉트 레이저 라이팅(TDLW, two-photon direct laser writing) 기술의 발전이 보다 복잡한 고분자 미세구조의 3차원(3D) 제조를 실현하였고, 다양한 화학물질 모이어티(chemical moieties)를 사용하여 국부적 3D 패터닝을 용이하게 하였고, 생체적합성 초상자성 산화철 나노입자(SPIONs, superparamagnetic iron oxide particles)를 마이크로-스위머에 삽입하는 가능성을 제공했다. 지금까지 나선형 마이크로-스위머를 제조하기 위해 서로 다른 감광성 재료가 TDLW 기술에 사용되었다. 처음에는 약물이 적재된 리포솜(liposomes)으로 기능화된 나선형 마이크로-스위머가 체외적으로 단일 세포 약물 전달을 수행하도록 사용되었다.
이 분야의 최근의 발전에도 불구하고, 나선형 자기 마이크로-스위머는 잠재적인 의료적 응용에서 필수적인 생리학적으로 연관된 생분해 및 제어되는 국부적 카고(cargo) 방출 기능을 갖도록 여전히 강화되어야 할 필요가 있다.
무독성 분해 산물을 형성하여 알려진 기간 내에 체내에서 투여된 마이크로-스위머의 생분해는 의료 응용에서 중요한 측면이다. 최근에 수산화 나트륨 기반의 수산화 반응을 통한 PEG-DA/PE-TA 및 SPIONs의 다양한 비율로 구성된 나선형 마이크로-스위머의 생분해가 입증되었다. 그러나, 마이크로-스위머의 생분해를 위해 1 M 수산화나트륨(NaOH) 용액을 사용하는 것을 문제가 될 수 있으며, 따라서 새로운 자연적인 생리학적으로 관련된 생분해 메커니즘을 마이크로-스위머에 통합하는 것이 미래의 의료 응용에 필수적이다.
또한 능동적 마이크로-스위머에 의한 질병 부위에 농축 치료제의 제어 방출(controlled release)은 전반적인 치료 효율을 높일 수 있다. 나선형 마이크로-스위머는 회전 자기장을 사용하여 작용 부위에 치료제의 능동적 전달 문제를 극복한다.
그러나 치료제의 제어 방출은 여전히 문제이며, 이는 마이크로-스위머 기반의 약물 전달 시스템에서 해결되어야 한다. 원격 트리거 시스템은 원하는 시간에 원하는 부위에 치료제의 방출을 쉽게 하는 것에 항상 매력적이다.
이러한 이유로 본 발명의 목적은 독성 분해 산물이 아니고 어떠한 독성 분해 산물도 형성하지 않는 생분해성 마이크로-스위머가 활용 가능하도록 하여 마이크로-스위머가 광범위한 의료 응용에 쉽게 사용될 수 있도록 하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 카고 물질의 제어된 능동적 방출을 가능하게 하는 마이크로-스위머가 활용 가능하도록 하여 카고 물질의 주문형이고, 정확하고 효과적인 전달을 보장할 수 있도록 하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 목표 부위를 둘러싸는 조직에 과도한 해를 끼치지 않으면서 원하는 목표 부위로 안내될 수 있는 마이크로-스위머를 활용 가능하게 하는 것이다.
이 목적은 청구항 1에 따른 생체적합성 마이크로-스위머를 만드는 방법에 의해 충족된다. 본 발명의 추가적인 유리한 점 및 유리한 실시예들은 종속 청구항들, 설명 및 첨부된 도면들에 의해 명백해질 것이다.
이러한 방법은 다음 단계를 포함할 수 있다.
- 광 가교성 바이오폴리머 용액을 제공하는 단계
- 자성 입자 및 광 개시제를 광 가교성 바이오폴리머 용액에 첨가하여 3D 프린팅 가능한 용액을 형성하는 단계
- 3D 프린팅 가능한 용액을 향해 가변 초점을 갖는 레이저를 적용하는 단계
- 3D 프린팅 가능한 용액을 통한 레이저의 초점을 변경하여 미리 정해진 형상을 가지는 생체적합성 마이크로-스위머를 형성하는 단계
- 미리 정해진 형상을 가지는 생체적합성 마이크로-스위머에 화학적 링커를 적용하는 단계
광 가교성 바이오폴리머 용액으로 마이크로-스위머를 형성함으로써 마이크로-스위머가 3D 프린팅 기술을 이용하여 빠르고 효율적인 방식으로 만들어질 수 있다.
이러한 3D 프린팅 기술은 마이크로-스위머의 형성을 가능하게 하며, 마이크로-스위머는 0.0001 내지 1 mm 범위에서 선택되는 마이크로-스위머의 적어도 하나의 치수를 가지는 요소로서 정의된다.
더욱이, 마이크로-스위머를 형성하기 위해 바이오폴리머 용액을 사용할 때, 마이크로-스위머는 그 자체 및 분해 산물이 생체 환경 내에서 독성 반응을 형성하지 않도록 형성될 수 있다. 이것은 위장관에 직접 연결되지 않은 신체 부위에서 그러한 자기 마이크로-스위머를 신체의 일부로 사용할 수 있게 한다.
나아가 마이크로-스위머에 화학적 링커(chemical linker)를 제공하는 것은 다른 화학 물질 및 기타 물질이 간단한 방식으로 마이크로-스위머에 부착될 수 있고 그에 의해 카고 물질을 원하는 목표 영역으로 운반할 수 있는 마이크로-스위머를 사용할 수 있게 한다.
마이크로-스위머 내에 존재하는 자성 입자의 사용을 통해 카고 물질이 원하는 목표 영역으로 제어되고 표적화된 방식으로 운반될 수 있으며 이에 따라 목표 영역으로의 카고 물질의 주문형, 정확하고 효율적인 전달이 보장된다.
화학적 링커는 생체적합성 마이크로-스위머와 마이크로-스위머에 부착될 수 있고 운반될 수 있는 카고 사이의 링크를 형성할 수 있다. 이 방식으로 카고는 마이크로-스위머에 화학적으로 결합될 수 있다.
방법은 화학적 링커에 의해 카고를 생체적합성 마이크로-스위머에 부착하는 단계를 더 포함할 수 있다. 따라서 카고 물질은 마이크로-스위머에 화학적으로 결합될 수 있고 그에 따라 원하는 목표 영역에 카고 물질의 효과적인 방출이 가능하도록 예를 들어 마이크로-스위머의 표면에 존재할 수 있다.
화학적 링커는 바람직하게는 마이크로-스위머와 카고 사이의 링크가 자극의 존재 시 해제될 수 있도록 선택된다. 이 방식으로 카고 물질의 주문형, 정확하고 효율적인 운반을 담보할 수 있도록 카고 물질의 제어된 능동적 방출이 가능하도록 마이크로-스위머가 형성된다.
이와 관련하여 카고가 치료 또는 진단 목적을 위한 효소, 분자, 약물, 단백질, 유전 물질, 나노입자, 방사성 씨드(radioactive seeds), 및 이들의 조합으로 이루어지는 요소들의 그룹에서 선택될 수 있다는 점에 유의해야 한다.
화학적 링커는 광 절단성 링커, 바람직하게는 NHS 및 알킨 변형된 o-니트로네질 유도체일 수 있다. 광 절단성 링커의 사용을 통해 카고 물질은 예를 들어 레이저 광, 예를 들어 적외선 또는 자외선 레이저 광에 의해 마이크로-스위머에서 방출될 수 있다.
이와 관련하여 화학적 링커는 효소적으로 절단 가능한 링커, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테이나제 인식 펩타이드 서열(matrix metalloproteinase recognition peptide sequences) 중 하나일 수 있다는 점에 유의해야 한다. 이러한 방식으로 카고 물질은 특정 효소, 예를 들어 암세포 조직에 존재하는 효소의 존재 하에 마이크로-스위머로부터 방출될 수 있으며, 즉 자극이 특정 효소의 특정 수준에 의해 제공될 수 있다.
화학적 링커는 열의 영향 하에서 카고 물질을 방출하도록 구성된 열적으로 절단 가능한 링커일 수 있음에 유의해야 하며, 즉 자극은 특정 범위 내의 온도의 적용에 의해 제공될 수 있다.
광 가교성 바이오폴리머 용액은 생체 활성, 생분해성 및 생체적합성 폴리머, 예를 들어 키토산, 젤라틴, 알기네이트, 폴리펩타이드, 핵산, 다당류 및 이들의 조합, 바람직하게는 키토산을 포함하는 용액일 수 있다. 이러한 방식으로 마이크로-스위머는 마이크로-스위머가 도입될 수 있는 숙주 내에서 독성 반응을 형성하지 않는 풍부하고 비교적 저렴한 물질로 형성될 수 있는 마이크로-스위머의 활용이 가능하게 된다.
이와 관련하여 생분해성이라는 용어는 생체적합성 마이크로-스위머가 주변 조직에 손상을 일으키지 않으면서 효소 활동에 의해 생명체 내에서 시간이 지남에 따라 분해된다는 것을 의미한다. 이것은 수산화나트륨 기반의 가수분해 반응을 통해 분해되는 선행기술로부터 알려진 마이크로-스위머의 경우가 아니다. 그러한 반응은 독성 부산물을 형성하므로 인체 또는 동물의 신체 조직에 심각한 해를 끼칠 수 있다.
자성 입자는 레이저 적용 시 마이크로-스위머를 형성하기 전에 광 가교성 바이오폴리머 용액에 균일하게 현탁되는 콜로이드 입자(colloidal particles)라는 점에 유의해야 한다.
자성 입자는 5 nm 내지 200 nm의 범위, 특히 5 내지 100 nm의 범위, 바람직하게는 40 내지 60 nm의 범위에서 선택된 크기를 갖는다. 이러한 방식으로 자성 입자의 균일한 분산이 가능한 3D 프린팅 가능한 용액이 사용될 수 있다. 마이크로-스위머 내에 존재하고 변하는 자기장 세기에 영향을 받는 크기가 200 nm를 초과하는 자성 입자 또는 자성 입자의 응집이 우연히 마이크로-스위머가 원하는 경로에서 이탈하는 것을 야기할 수 있고 그에 따라 마이크로-스위머의 진행 방향 조정 능력을 감소시킬 수 있다. 더욱이, 크기가 200 nm를 초과하는 자성 입자 또는 자성 입자의 응집은 TDWL 프린팅 기술과 호환되지 않는다. 따라서 구조적 충실도가 낮아진다.
자성 입자는 산화철 입자, 철 백금 입자, 네오디뮴 철 붕소 입자, 알루미늄 니켈 코발트 입자, 철 입자, 코발트 입자, 사마륨 코발트 입자로 구성된 요소들의 그룹에서 선택될 수 있다. 바람직하게는 산화철 입자가 사용되는데, 이 물질은 숙주내에서 생체적합적이고 무독성인 것으로 알려져 있기 때문이다.
광 개시제(photo initiator)는 2 광자 흡수(two photon absorption) 시 절반으로 분할되고 광 가교를 개시하는 라디칼(radicals)을 생성하는 분자이며, 광 개시제는 예를 들어 LAP이다. 2광자 흡수를 사용하여 반응하는 광 개시제의 사용을 통해, 예를 들어 1 내지 1000 μm 범위의 길이 및 예를 들어 0.1 내지 100 μm 범위의 폭을 갖는 3D 마이크로-스위머를 형성하는 것이 가능하다.
이와 관련하여 광 개시제는 이상적으로는 수용성이라는 점을 유의해야 한다. 3D 프린터에서 사용될 수 있으려면, 광 개시제가 3D 프린터의 파장에서 광자를 흡수하여 라디칼을 생성하고 결과적으로 원하는 형상의 마이크로-스위머를 형성할 수 있어야 한다. 이 목적을 위해 광 개시제가 2개 광자 흡수로 라디칼 생성을 허용하는 2개 광자 단면을 갖는 경우가 이상적이다.
카고는 바람직하게는 자극의 적용, 예를 들어 광의 적용, 또는 숙주 내의 병리학적 상태에 따른 특정 효소의 정해진 양의 근처에서, 예를 들어 특정 암 세포의 근처에 존재할 시, 마이크로-스위머에서 방출될 수 있다.
방법은 레이저를 적용하는 단계 동안 3D 프린팅 가능한 용액 내에서 자성 입자를 정렬하기 위해 선택되는 5 내지 30 mT 범위에서 선택되는 자기장 세기를 가지는 자기장을 적용하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이 방법으로 마이크로-스위머의 자기 방향이 미리 정의될 수 있다.
마이크로-스위머는, 나선형 또는 이중 나선형 구조와 같이, 회전 자기장의 존재 시 시간에 따라 비대칭적으로 이동되도록 구성되는 형상을 가질 수 있다. 마이크로-스위머를 이러한 방식으로 형성함으로써 마이크로-스위머가 더 정확하게 진행 방향이 조종되고 이동될 수 있다.
마이크로-스위머는 길쭉한 형상을 가질 수 있으며, 길이 대 폭의 비율이 2:1 내지 10:1의 범위에서 선택될 수 있다. 이러한 형상은 회전 자기장을 사용하여 유리한 방식으로 이동될 수 있으며 마이크로-스위머로 원하는 양의 카고를 운반하는 것을 가능하게 한다.
추가적인 측면에 따르면, 본 발명은 특히 여기서 설명되는 방법에 의해 만들어지는 생체적합성 마이크로-스위머에 관한 것이고, 마이크로-스위머는 광 가교성 바이오폴리머 용액, 자성 입자 및 광 개시제를 포함하는 3D 프린팅 가능한 용액으로 만들어지는 몸체부를 포함하고, 마이크로-스위머의 몸체부는 나선형 또는 이중 나선형 구조와 같은 회전 자기장의 존재 시 시간에 따라 비대칭적으로 이동될 수 있도록 구성되는 형상을 가지며, 몸체부는 화학적 링커(chemical linker)로 코팅된다.
마이크로-스위머는 이상적으로는 앞에서 설명된 제조 방법에 따라 추가로 개발될 수 있으며, 이에 따라 마이크로-스위머는 제조 방법과 관련하여 설명된 결과적인 장점을 가질 수 있다.
따라서 마이크로-스위머는 한 사이트에서 제조된 다음 카고가 적재되는 다른 사이트로 옮겨질 수 있다. 예를 들어, 카고 물질이 방사성 이미징 에이전트인 경우 마이크로-스위머가 카고 물질을 가지는 방사선 연구소로 옮겨지기 전 뿐만 아니라 방사선 물질이 붕괴되어 비활성화되는 것을 방지하기 위한 사용 직전이면 유용하다.
생분해성 마이크로-스위머의 제공은 이전에는 필요했던 회수 단계를 제거할 수 있게 하며, 이는 마이크로-스위머가 숙주에서 단순히 분해되고 이 분해 동안 해를 입힐 수 있는 독성 반응을 형성하지 않기 때문이다.
마이크로-스위머의 몸체부는 길이 대 폭의 비율이 2:1 내지 10:1의 범위에서 선택되는 길쭉한 형상을 가질 수 있다. 이와 관련하여 마이크로-스위머의 적어도 하나의 치수는 0.0001 내지 1 mm의 범위에서 선택될 수 있다.
유리하게는 마이크로-스위머는 0.1 미만의 레이놀즈 수로 이동되도록 구성될 수 있다. 이것이 마이크로-스위머가 숙주 내에서 제어된 방식으로 이동될 수 있도록 한다.
마이크로-스위머는 주축(major axis)에 수직인 방향, 즉 그 긴 범위에 수직인 방향으로 자화될 수 있다. 이것이 마이크로-스위머의 자화 방향이 미리 정의되도록 하는 것을 가능하게 한다.
마이크로-스위머는, 1.5 μg/ml의 리소자임 농도를 가지는 용액 내에서 210 시간 이내에, 마이크로-스위머의 길이가 최초 길이의 최대 70%, 바람직하게는 최대 65%의 길이로 분해되고 마이크로-스위머의 직경이 마이크로-스위머의 최초 직경의 최대 50%, 바람직하게는 최대 45%의 직경으로 분해되도록 분해되게 구성될 수 있다. 이것은 마이크로-스위머의 생체적합성의 추가 지표이다.
다른 태양에 따르면, 본 발명은 앞에서 언급된 바와 같이 카고 물질이 적재된 하나의 마이크로-스위머를 사용하는 방법에 관한 것이다. 방법은 다음 단계를 포함한다.
- 원하는 목표 영역과 관련된 영역에 마이크로-스위머를 제공하는 단계
- 시변 자기장을 갖는 마이크로-스위머를 원하는 목표 영역으로 향하게 하는 단계
- 카고를 방출하기 위해 원하는 목표 영역에서 마이크로-스위머를 자극하는 단계
이러한 방식으로, 작용 부위에서 치료제, 즉 카고 물질의 농도가 제어될 수 있고 종래 시스템에 비해 증가될 수 있다. 더욱이, 전체 주입 용량은 종래기술에 비해 원격 트리거 시스템을 사용하여 감소될 수 있다. 예를 들어 빛 자극을 제공함으로써, 특히 유용한 광-트리거 방출이 활용 가능하다. 다른 트리거 또는 자극 메커니즘은, 높은 시공간적 정확도로 인해, pH, 온도, 초음파 및 자기장을 포함할 수 있다.
자외선(UV) 광-트리거 방출 시스템을 사용하면, UV 광의 작은 조직 침투 깊이가 잠재적 의료 응용 분야의 수를 인체 또는 동물 몸체 내부의 특정 영역을 피부에 가까운 영역으로 제한한다. 그러나 저에너지 광자(예를 들어 더 큰 투과 깊이를 가지는 근적외선)가 인체 내에서 고에너지 광자(예를 들어, UV 광)로 변환될 수 있는 광학 상향 변환이 이루어진다. 이러한 시스템은 UV 광을 사용하여 투과할 수 없는 인체 또는 동물 몸체의 영역에서 마이크로-스위머의 자극을 가능하게 하여 인체의 서로 다른 부분에서 가능한 의료 응용의 수를 증가시키는데 사용될 수 있다.
향하게 하는 단계는 1 Hz 내지 50 Hz의 범위에서 선택되는 주파수로 5 mT 내지 50 mT의 범위의 회전 자기장 세기의 적용을 포함할 수 있다. 인체 또는 동물 몸체의 내부 및 주위에서의 자기장의 사용은 알려진 부작용 없이 유익한 방식으로 수행될 수 있다.
원하는 목표 영역에서 카고를 방출하기 위해 마이크로-스위머를 자극하는 단계는 목표 영역에서 광 자극을 적용하는 것에 의해 수행될 수 있다. 광 자극의 적용은 원하는 목표 영역에서 카고 물질의 표적 방출을 위한 효과적인 트리거 메커니즘을 만들어내는 것이 밝혀졌다.
마이크로-스위머를 향하게 하는 단계는, 원하는 목표 영역으로의 마이크로-스위머의 경로를 추적하기 위해, 이미지 맵핑(image mapping)과 함께, 예를 들어 MRI를 사용하여 수행될 수 있다. 이것은 유리하게 마이크로-스위머의 현재 위치의 피드백을 가능하게 하고 또한 카고의 방출의 보다 정확한 표적 자극을 가능하게 한다.
본 발명은 다음과 같은 첨부된 도면을 참조로 실시예들에 의해 상세히 설명될 것이다.
도 1은 합성 및 제조 공정과 결과적인 마이크로-스위머의 개략도를 도시하고, A)는 포토 가교 솔루션의 합성의 상세 내용을 보여주고, B)는 2-광자 다이렉트 레이저 라이팅(writing) 기술을 사용한 마이크로-스위머의 3D 프린팅의 도시하고, C)는 마이크로-스위머의 3D 프린팅 된 3x3 어레이의 광학 현미경 이미지를 도시한다.
도 2는 회전 자기장을 사용하는 마이크로-스위머의 작동 및 스티어링 능력을 도시하고, A)는 자기장 여기 주파수의 함수로서 마이크로-스위머의 전진 속도를 도시하고, B)는 ω에서 점선으로 도시된 4.5 Hz에서 10 mT 회전 자기장의 적용 시 마이크로-스위머의 제어된 수영 궤적의 스냅샷(점선)을 도시한다.
도 3은 리소자임(lysozyme)을 사용한 마이크로-스위머의 효소 분해를 도시하고, A)는 15 μg·mL-1 리소자임으로 처리한 마이크로-스위머의 광학 현미경 이미지를 도시하고, Ai은 t=0 h 에서의 상태이고 Aii는 t=204 h에서의 상태이고, 이는 표면 기반의 분해 메커니즘을 보여주고, B)는 상이한 리소자임 농도에서 시간에 따른 마이크로-스위머의 길이의 변화를 도시하고, C)는 상이한 리소자임 농도에서 시간에 따른 마이크로-스위머의 직경의 변화를 도시하고, D)는 SKBR3 유방암 세포의 죽은 염색(staining)을 도시하고, Di는 처리되지 않은 상태를 도시하고, Dii는 하루 동안 마이크로-스위머의 분해 산물로 처리된 세포를 도시하고, 여기서 열린 점(open dots)은 살아 있는 세포를 나타내고 닫힌 점(solid dots)은 죽은 세포를 나타내고, E)는 분해 산물로 처리된 SKBR3 유방암 세포의 생존력(viability)의 정량화를 도시한다.
도 4는 마이크로-스위머에서 광 트리거(light-triggered) 약물 방출의 과정을 도시하고, A)는 DOX-변형된 마이크로-스위머를 얻기 위한 개략적인 반응 경로를 보여주고, 마이크로-스위머의 아미노 그룹(amino groups)은 o-니트로벤질 광절단 화학물질 링커 분자(o-nitrobenzyl photocleavable chemical linker molecules)의 NHS 그룹과 반응하고, 마이크로-스위머의 알킨(alkyne) 말단과 다음의 아지드-변형 DOX 반응이 있고, B)는 i) t=0 분의 시간에서 t=30 분의 시간에서 30 mW 광 강도에 노출된 마이크로-스위머로부터의 DOX 방출 및 마이크로-스위머로부터의 DOX 절단 및 그 방출을 지시하는 형광 강도의 감소를 도시하고, C)는 3 mW 광도(둥근 점)(light intensity) 및 30 mW 광도(정사각형 점)에 대한 마이크로-스위머로부터의 누적 DOX 방출을 도시하고, D)는 마이크로-스위머로부터의 DOX의 스마트 투여(smart dosing)를 보여주며, t=0 내지 1 분 사이 및 t=6 내지 7 분 사이의 솔리드 바(solid bars)는 365 nm 파장을 가지는 레이저의 적용을 도시하고 DOX의 대략 15%가 마이크로-스위머에서 분당 방출되었다.
도 5는 2,4,6-트리니트로 벤젠 술폰산(TNBS) 측정을 사용한 메타크릴화(methacrylation) 정도의 결정을 도시한다.
도 6은 마이크로-스위머의 2-광자 기반의 3D-프린팅에 사용되는 마이크로채널(microchannel) 셋업의 사진을 나타낸다.
도 7의 A 및 B는 15 keV에서 10 분 동안 수행된 마이크로-스위머의 에너지-분산형 x-선 분광기 원소 맵핑을 도시하고, B는 마이크로-스위머 내에 탄소 원자의 존재를 보여준다.
도 8의 i 내지 iv는 ω에서 도시된 10 mT 회전 자기장 하에서 5 Hz로 수영하는 마이크로-스위머의 도 2의 B와 유사한 제어된 수영 궤적 스냅샷 (점선)을 도시한다.
도 9는 마이크로-스위머에 약물 분자의 화학적 통합을 도시하고, A)는 o-니트로벤질 링커 변형(o-nitrobenzyl linker modification)이 없는 마이크로-스위머는 약물 분자(azide-DOX)에 의해 직접 처리된 것을 보여주고, B)는 o-니트로벤질 링커 변형을 가지는 마이크로-스위머는 약물 분자(azide-DOX)에 의해 처리되었다. 이미지는 동일한 형광 강도 및 노출 시간으로 캡쳐되었으며 마이크로-스위머 상의 아지드(azide)-DOX의 제어된 통합을 나타낸다.
도 10은 제어된 방출 실험 전에 약물 분자에 대한 광표백(photobleaching) 테스트를 보여주고, A)는 네거티브 그룹(o-니트로벤질 링커 변형이 없는 마이크로-스위머)에 대한 30 분 동안의 470 nm 파장 광의 여기(excitation)를 도시하고, B)는 네거티브 그룹에 대한 30 분 동안의 3 mW 365 nm 파장 광 노출을 도시하고, C)는 네거티브 그룹에 대한 30 분 동안의 30 mW 365 nm 파장 광 노출을 도시한다.
도 11은 마이크로-스위머로부터 제어되고 국부화된 약물 방출을 보여주는 이미지를 도시하고, A)는 마이크로-스위머 상에 초점이 맞춰진 365 nm 파장 광 노출(왼쪽 칼럼)과 광 노출 시 약물 분자의 제어된 방출(가운데 칼럼)을 도시하고, 나머지 그룹(오른쪽 칼럼)은 여전히 통합된 약물 분자를 가지고 있고, B)는 마이크로-스위머 바디의 절반으로부터 정확하고 제어된 약물 방출을 도시한다.
동일하거나 유사한 기능을 갖는 요소는 동일한 참조번호를 사용하여 이하에서 설명된다. 또한 한 실시예에서 사용된 참조번호와 관련하여 주어진 설명은 반대로 어떤 것이 언급되지 않은 다른 실시예과 관련하여 동일한 참조번호에 적용된다는 것이 이해되어야 한다.
도 1의 A 내지 C는 생체적합성 마이크로-스위머(10)를 만드는 과정의 개요 및 결과적인 마이크로-스위머(10)를 보여준다. 이 방법은 용기(container)에 광 가교성(photo cross-linkable) 바이오폴리머 용액(12)을 제공하는 단계, 및 3D-프린팅 가능한 용액(14)을 형성하기 위해 광 가교성 바이오폴리머 용액에 자성 입자(magnetic particles)(도시되지 않음) 및 광 개시제(photo initiator)(도시되지 않음)를 첨가하는 단계를 포함한다.
도 1의 A의 예에서 3D 프린팅 가능한 용액(14)은 재증류수(ddH2O)를 함유하는 8% (v/v) 아세트산에서 준비하는 것에 의해 형성되고, 30 mg·mL-1 ChMA, 20 mg·mL-1 페닐-2,4,6-트리메틸벤조일포스피네이트(LAP) 광 개시제 및 5 mg·mL-1 PEG/아민-기능화된 50 nm 생체적합성 초상자성 산화철 나노파티클(SPIONs)로 구성된다. 이어서 이 용액은 교반되고 15 시간 동안 음파 처리된다.
키토산(chitosan)은 세상에서 두 번째로 풍부한 천연 폴리머인 키틴(chitin)으로부터 얻어지는 선형(linear) 및 양이온(cationic) 폴리머이다. 생체적합성, 생분해성, 생체접착성, 그리고 항균, 항종양 및 항산화 활성과 같은 고유한 특성으로 인해 키토산은 의료 응용에서 이상적인 폴리머이다.
이와 관련하여 광 가교성 바이오폴리머 용액(12)은 키토산(chitosan), 젤라틴(gelatine), 알기네이트(alginate), 폴리펩타이드(polypeptides), 핵산(nucleic acids), 다당류(polysaccharides) 및 이들의 조합을 포함하는 생체 활성(bioactive), 생분해성 및 생체적합성 폴리머를 포함하는 용액이고, 전술한 바와 같이 바람직한 선택은 키토산이다.
키토산과 같은 감광성(photosensitive) 특성이 없는 폴리머는 화학적으로 변경될 수 있지만 다당류 골격은 변하지 않는다. 이 이유로 메타크릴아미드 키토산(methacrylamide chitosan, ChMA)인 키토산이 처음에 준비되었다. 이것은 폴리머의 아미노 그룹(amino groups)을 메타크릴산 무수물(methacrylic anhydride)과 반응시켜 수행되었다. 키토산의 아미노 그룹은 일정한 반응 시간에 메타크릴산 무수물/키토산 비율에 따라 감광성 메타크릴산아미드 그룹으로 전환되었다.
새로 형성된 폴리머 체인은, 광 개시제 및 대략 350 nm 파장을 가지는 UV 광의 존해 하에, 서로 가교될 수 있는 능력을 갖는다.
이와 관련하여, 광 개시제는 2-광자 흡수 시에 반으로 분할되고 예를 들어 전술한 LAP인 광 개시제와 함께 광-가교를 개시하는 라디칼(radicals)을 생성하는 분자인 것을 주목해야 한다. 3D 프린팅 가능한 용액(14)으로부터 고체 마이크로-스위머(10)를 형성하기 위해서는 광-가교 능력이 필요하다.
3D 폴리머 용액의 합성 후, ChMA 거대분자의 메타크릴화(methacrylation) 정도가 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS) 분석을 통해 결정되었다. 이 테스트의 결과는 도 5와 관련하여 논의된다. TNBS는 유리 아미노 그룹(free amino groups)을 결정하기 위해 사용되는 광분광 시약(photospectroscopic agent)이다. 메타크릴산 무수물/키토산 비율은 고정된 반응 시간에 변경되었으며 분석은 아미노 그룹이 메타크릴산 무수물/키토산 비율의 증가에 따라 소비되는 것을 나타냈다.
프린팅 시간을 용이하게 하기 위해 3D 프린팅을 위해 70 %의 메타크릴화 정도를 가지는 메타크릴아미드 키토산 거대분자가 선택되었다. 이를 위해 대략 70 %의 감광성 메타크릴아미드 그룹으로 구성된 근간을 가지는 ChMA 거대분자가 제조 절차를 위해 선택되었다.
도 1의 B에 나타난 바와 같이, 3D 프린팅 용액(14)의 액체 방울(14')이 페트리 접시(petri dish) 형태의 기판(16) 상에 놓인다. 6개의 마이크로-스위머(10)가 페트리 접시 위에 표시되어 있다. 또한 초점(20)에 초점을 맞춘 2개의 레이저 빔(18)이 표시되어 있다.
마이크로-스위머(10)을 형성하기 위해, 사용된 레이저(18)는 가변 초점을 가지고, 이것은 레이저(18)의 초점(20)의 위치가 예를 들어 초점(20)을 움직이기 위해 각 레이저(18)의 초점 길이 또는 기판(16)에 대한 레이저(18)의 위치를 가변시키는 것에 의해 미리 결정 가능한 방식으로 변경될 수 있음을 의미한다. 초점(20)의 위치의 이러한 변화는 도 1의 B에 표시된 세 개의 공간상 방향 x, y 및 z 모두에서 발생할 수 있다. 레이저(18)를 적용하고 3D 프린팅 가능한 용액(14)을 통한 레이저(18)의 초점을 변화시킴으로써, 생체 적합성 마이크로-스위머(10)가 미리 정해진 형상으로 형성될 수 있다.
도 1의 B 및 C에 도시된 키토산 기반의 마이크로-스위머(10)는 TDLW(two-photon direct laser writing) 기술을 사용하여 이중 나선 형상으로 제조되었다. 이러한 방식으로 미리 정해진 구조를 형성하기 위해 3D 프린팅 가능한 용액(14)의 프리폴리머(prepolymer)의 광중합(photopolymerization)가 폐쇄 채널에서 수행되었다. 일반적으로 말하면 마이크로-스위머(10)는 나선형 또는 이중 나선형 구조와 같은 회전하는 자기장의 존재 하에 시간에 따라 비대칭적으로 이동하도록 구성된 모양을 갖는다.
또한 3D 프린팅 가능한 용액(14)을 형성하기 위해 첨가된 자성 입자는 5 nm 내지 200 nm, 특히 5 내지 200 nm, 바람직하게는 40 내지 60 nm 범위에서 선택된 크기를 갖는다는 점을 유의해야 한다. 자성 입자는 생체 적합성으로 인해 바람직하게는 SPION이지만 다른 생체 적합성 자성 입자가 사용될 수도 있다.
그 이유는 마이크로-스위머(10)의 디자인에 SPION의 사용은 다음의 두 가지 장점을 가지기 때문이다. (1) SPION은 생체 적합성이고 체내(in vivo)에서 심각한 부작용을 가지는 것으로 간주되고, (2) SPION은 코발트 기반 또는 니켈 기반의 표면 코팅에 비해 약물 및 카고 방출 사이트의 활용을 크게 증가시킨다.
마이크로-스위머(10)는 2:1 내지 10:1의 범위에서 선택되는 폭에 대한 길이의 비율 및 0.0001 내지 1 mm의 범위에서 선택될 수 있는 마이크로-스위머의 적어도 하나의 치수를 가지는 긴 형태를 가질 수 있다.
자기장에서 마이크로-스위머(10)을 움직이게 할 수 있으려면, 마이크로 스위머가 자화되어야 한다. 이 목적을 위해, 도 6을 참조하면, 두 개의 영구자석(22)이 마이크로-스위머(10)가 형성되는 영역의 양 쪽에 있는 페트리 접시(petri dish)(16) 상에 배치되어 자기장(B)이 화살표 방향으로 인가된다. 자기장(B) 강도는 마이크로-스위머(10)를 형성할 때 레이저(18)를 적용하는 단계 동안 3D 프린팅 가능한 용액(14) 내의 자성 입자를 정렬하기 위해 선택된다.
영구자석(22)을 미리 정의된 방식으로 배열함으로써 SPION의 자기 방향이 정렬된다. 그리고 나서 정렬된 자기 배향을 갖는 마이크로-스위머에 존재하는 SPION이 제어되고 진행 방향이 조정될 수 있고, 따라서 회전 자기장을 사용하여 3D 수성(aqueous) 환경에서 이동될 수 있다.
평균 인쇄 속도는 개별 마이크로-스위머(10)의 경우 약 10 초였다. 형성된 마이크로-스위머에 수행된 에너지 분상 x-선 분광법(EDS) 원소 맵핑은 마이크로-스위머(10)에서 철 원자의 균일한 분산을 확인해 주었다.
도 1의 C에 추가된 나타낸 바와 같이 마이크로-스위머(10)는 6 μm 직경 및 20 μm 길이를 가지고 작은 진폭의 회전 자기장을 갖는 낮은 레이놀즈 수(Reynolds number) 영역에서 작동하는 이중 나선으로 구성된다. 도 1의 C에 도시된 마이크로-스위머(10)는 10 mT 및 4.5 Hz 회전 자기장을 사용하여 평균 속도가 3.34 ± 0.71 μm·s-1인 수성 환경에서 작동되고 제어될 수 있다. 이와 관련하여 낮은 레이놀즈 수 영역은 0.1 미만의 레이놀즈 수를 가지는 영역이라는 점을 인지해야 한다.
도 2의 A 및 B는 마이크로-스위머(10)가 회전 자기장을 사용하여 구동되고 진행 방향이 조정될 수 있음을 보여준다. 도 2의 A는 자기 여기 주파수의 함수로서 마이크로-스위머(10)의 순방향 속도를 도시한다. 설명된 바와 같이 도 1의 C에 도시된 크기를 갖는 마이크로-스위머(10)는 4.5 Hz의 스텝-아웃(step-out) 주파수를 갖는다.
이를 수행하기 위해, 마이크로-스위머(10)가 5-코일 전자기 셋업(도시되지 않음)을 사용하여 구동되고 진행 방향이 조정되었다. 5-코일 전자기 셋업은 마이크로-스위머(10)의 움직임을 추적하기 위해 도립 광학 현미경(도시되지 않음)에 장착될 수 있다. 5-코일 자기 셋업은, 예를 들어 2 cm Х 2 cm Х 2 cm 부피에 걸쳐 95 % 이상의 균일성으로 1 Hz 내지 50 Hz의 범위에서 선택된 주파수로 2 내지 50 mT의 범위에서, 원하는 회전 자기장을 생성하고 제어할 수 있도록 자체로 알려진 방식으로 제어될 수 있다.
이것은 자기장의 기울기 및 방향이 마이크로-스위머(10)를 원하는 방향으로 향하게 하기 위해 가변될 수 있다는 것을 의미한다. 자기장의 정확한 장의 세기 및 주파수는 마이크로-스위머의 크기 및 결과적으로 그 안에 존재하는 SPION의 양에 따라 일반적으로 선택될 수 있다.
도 2의 A에 도시된 결과는 10 mT 회전 자기장을 사용하여 기록되었다. 처음에는, 마이크로-스위머의 스텝-아웃 주파수가 적용된 회전 자기장의 주파수를 0.5 Hz 스텝으로 1 Hz부터 6 Hz까지 점진적으로 증가시켜 조사되었다. 제조된 마이크로-스위머가 10 mT 회전 자기장 하에서 4.5 Hz에서 최적으로 구동되고 진행 방향이 조정된다는 입증되었다. 4.5 Hz의 최적 구동 주파수에서 마이크로-스위머의 평균 전진 속도는 3.34 ± 0.71 μm·sec-1로 측정되었다.
도립 광학 현미경(inverted optical microscope)에 5-코일 전자기 셋업을 배치함으로써 마이크로-스위머를 다른 경로로 진행 방향을 조종하고 현미경에 의해 이들 경로에서 진행 상황을 기록하여 마이크로시스템의 제어 가능성을 입증하고 기록할 수 있다. 10 mT 회전 자기장 하에서 4.5 Hz 및 5 Hz모두(도 2의 B의 i 내지 iv, 도 8)에서 마이크로-스위머의 진행 방향을 조종할 수 있음이 나타났고, 이와 관련하여 도 8의 i 내지 iv는 도 2의 B의 i 내지 iv와 유사한 이미지를 보여주고 차이는 인가된 자기장의 주파수라는 것을 인지해야 한다.
도 3의 A 내지 E는 리소자임(lysozyme)을 사용하는 마이크로-스위머(10)의 효소 분해(enzymatic degradation)을 보여준다. 위에서 언급한 바와 같이 생분해성 물질은 그 기능을 수행한 후에는 자연적으로 분해되어 체내에서 사라질 수 있기 때문에 의학계에서 주목받고 있다. 생분해성 물질인 키토산은 대략 1-15 μg·mL-1의 농도 범위로 다양한 조직 및 체액에 존재하는 리소자임 효소에 의해 주로 분해된다. 이 효과는 폴리머 백본(polymer backbone)에 있는 단량체(monomers) 사이의 글리코시드 결합(glycosidic bonds)을 절단하는 리소자임 효소에 기인하고 결과적인 작은 체인은 자연적으로 제거된다.
도 3의 A의 i 및 ii는 3D 프린팅 된 마이크로-스위머(10)의 어레이의 광학 현미경 이미지를 도시하고, 도 3의 A의 i는 마이크로-스위머(10)에 수행된 생분해 실험의 시작을 도시하고, 도 3의 A의 ii는 발생한 표면 부식을 보여주며 여기서 물과 효소가 가교된 구조 내부로 침투할 수 없고 그에 따라 마이크로-스위머(10)의 외부 표면이 분해되기 시작했다. 마이크로-스위머(10)의 나선 및 날카로운 모서리가 리소자임 효소에 의해 먼저 분해되는 것으로 나타났다. 마이크로-스위머(10)는 15 μg·mL-1의 리소자임 농도에서 분해를 보여주는 도 3의 A의 ii에 표시된 바와 같이 204 시간 후에 부분적으로 분해되었다.
마이크로-스위머(10)의 분해를 시험하기 위해 세 가지의 서로 다른 리소자임 효소 농도(도 3의 B 및 C에 삼각형 점으로 표시된 1.5, 도 3의 B 및 C에 둥근 점으로 표시된 15, 그리고 도 3의 B 및 C에 삼각형 점으로 표시된 150 μg·mL-1)가 선택되었고, 여기서 150 μg·mL-1는 비현실적으로 높은 상태를 나타낸다.
도 3의 B는 서로 다른 리소자임 농도에 대한 시간에 따른 마이크로-스위머(10)의 길이 변화를 나타내고, 도 3의 C는 서로 다른 리소자임 농도에 대한 시간에 따른 마이크로-스위머의 직경의 변화를 나타낸다. 모든 농도에 210 시간의 기간 이내에 대해 마이크로-스위머(10)의 길이는 초기 길이의 최대 70 %의 길이로 줄어들고 마이크로-스위머(10)의 직경은 마이크로-스위머(10)의 초기 직경의 최대 50 %의 직경으로 줄어드는 것이 밝혀졌다.
예상대로, 비현실적으로 높은 리소자임 효소 농도 그룹(150 μg·mL-1)은 가장 작은 직경과 길이의 마이크로-스위머(10)가 남아 있도록 하는 가장 빠른 분해를 초래한다. 1.5 μg·mL-1 리소자임 농도 그룹은 204 시간 후에 남아 있는 가장 큰 마이크로-스위머(10)를 가졌다(도 3의 B 및 C). 표면 침식으로 나선과 모서리가 먼저 분해되었기 때문에 모든 그룹에서 빠른 직경 및 길이 변화가 있었다. 마이크로-스위머(10)의 전체 바디에 비해 더 작은 부피를 가지는 나선 및 모서리의 생분해 후에, 직경 및 길이 변화 비율은 예상대로 급격히 감소했다.
리소자임 효소가 나선에 비해 더 낮은 표면적 대 부피 비율을 가지는 원통형 마이크로-스위머 몸체(10')를 분해하려고 했기 때문에, 이것은 반드시 생분해 속도의 감소를 의미하지 않는다. 표면 침식 현상으로 인해, 일정 시점 후에 생분해, 길이 및 직경 변화를 관찰하기가 더 어려워졌다. 204 시간 내에 마이크로-스위머의 부분적 생분해는 대부분의 연구에서 몇 주(weeks) 후에 완전한 분해가 관찰되지 않은 문헌과 일치한다.
생분해에 더하여, 분해 산물의 체외(in vitro) 생체 적합성이 SKBR3 유방 암 세포를 이용하여 조사되었다. SKBR3 세포는 하루 동안 분해된 마이크로-스위머(10)의 분해 산물로 처리한 다음 독성 분석을 위해 라이브-데드(live-dead) 약물로 착색되었다. 결과는 마이크로-스위머(10)의 분해된 산물은 SKBR3 세포에 대한 독성 영향을 갖지 않았으며 대조군과 처리군 모두에 대해 라이브/데드 세포 비율은 유사했고 전체 세포 집단의 약 90 %를 나타낸다는 것을 보여줬다(도 3의 D 및 E).
이와 관련하여 도 3의 D는 SKBR3 유방암 세포의 라이브-데드 염색(live-dead staining)의 광학 현미경 이미지의 개략도를 보여주며, 도 3의 D i는 미처리된 것을 보여주고 도 3의 D ii는 하루 동안 마이크로-스위머(10)의 분해 산물로 처리된 암세포를 보여준다. 속이 빈 점은 살아 있는 세포를 나타내고 채워진 점은 죽은 세포를 나타낸다. 도 3의 E는 분해 산물로 처리된 SKBR3 유방암 세포의 생존성을 정량화 결과를 보여준다. 분해 산물로 처리된 세포에서 생존성이 변경되지 않았다(p > 0.05). 오차 막대는 표준 편차를 나타내며 이것은 유의하지 않다(n.s.). 따라서 마이크로-스위머(10)나 그 분해 산물은 예를 들어 인체 내에서 해를 끼칠 수 있는 독성 반응을 형성하지 않는다는 것을 보여준다.
도 4의 A는 DOX 변형된 마이크로-스위머(10)를 얻기 위한 반응 경로를 개략적으로 보여준다. DOX는 간암(liver cancers) 치료에 사용되는 물질이다. DOX는 마이크로-스위머(10)에 의해 운반될 수 있는 카고 물질(cargo material)(24)이다. 카고 물질(24)을 부착하기 위해, 화학적 링커(chemical linker)(26)가 예를 들어 코팅(coating)에 의해 마이크로-스위머(10)의 몸체부(10')에 초기에 부착된다.
화학적 링커(26)의 기능은, 생체적합성 마이크로-스위머(10)에의 화학적 결합(28) 및 마이크로-스위머(10)에 부착될 수 있고 마이크로-스위머(10)에 의해 운반될 수 있는 카고 물질(24)에의 화학적 결합(30)을 형성함으로써, 카고(24)와 마이크로-스위머(10) 사이의 해제 가능한(releasable) 링크를 형성하는 것이다. 화학적 링커(26)의 추가 기능은, 자극의 인가 시에, 예를 들어 “병리학적 조건에 의해” 특정 효소의 정해진 크기의 근처에 광(light) 및/또는 열(heat)의 인가 시에, 마이크로-스위머(10)로부터 카고 물질(24)의 방출(release)을 가능하게 하는 것이다.
이와 관련하여 카고 물질(24)은 치료 또는 진단 목적을 위한 효소, 분자, 약물, 단백질, 유전 물질, 나노 입자, 방사성 종자(radioactive seeds) 및 전술한 것의 조합으로 이루어지는 요소의 그룹에서 선택될 수 있다.
이와 관련하여 화학적 링커(26)는 광 절단 가능한 링커, 바람직하게는 NHS 및 알킨 변형된 o-니트로네질 유도체, 효소적으로 절단 가능한 링커, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로데이나제 인식 펩타이드 서열(matrix metalloproteinase recognition peptide sequences), 열적으로 절단 가능한 링커, 즉 체온보다 높은 녹는 점을 갖고 카고(24)를 방출하기 위해 열이 국부적으로 인가되면 녹는 화학적 링커, 및/또는 전술한 것의 조합으로 이루어지는 요소의 그룹으로부터 선택될 수 있다.
도 4의 A에서 마이크로-스위머(10)에 존재하는 아미노 그룹(NH2)은 o-니트로벤질 광 절단성 링커 분자(26)의 NHS 그룹과 반응하여 화학적 결합(28)을 형성한다. 그리고, 아지드-변형된(azide-modified) DOX(24)는 마이크로-스위머(10)의 알킨 말단(alkyne ends)와 반응하여 화학적 결합(30)을 형성한다.
도 4의 B는 30분 동안 30 mW 광 강도의 회부 광 자극에 노출된 마이크로-스위머(10)로부터 방출되는 것을 보여준다. 도 4의 B i는 광 인가 전의 형광 강도를 보여주고 도 4의 B ii는 30분 후의 형광 강도를 보여준다. 형광 강도의감소는 마이크로-스위머(10)로부터의 DOX의 절단 및 방출을 나타낸다.
도 4의 C는 3 mW (둥근 점) 및 30 mW(사각형 점)의 광 강도에 대해 두 개의 서로 다른 레이저 강도를 사용한 마이크로-스위머(10)로부터의 DOX의 방출을 보여준다. 30 mW 광 강도의 사용 시 DOX의 60 내지 70 %가 노출 후 30 분 동안 방출되는 반면에 3 mW 광 강도에서는 DOX의 30 내지 40 %가 노출 후 30 분 동안 방출된다. 도 4의 C에서 또한 표시된 바와 같이 DOX의 대략 60 %가 30 mW 광 강도에서 노출 후 최초 5 분 이내에 방출된다.
365 nm 파장에서 3 mW 및 30 mW의 서로 다른 두 개의 광 강도가 주문형 광-트리거 약물 방출을 입증하기 위해 선택되었다. 30 mW에서, 30 분 후에 형광 강도가 크게 감소했으며 이는 도 4의 B에 표시된 바와 같이 DOX(24)가 마이크로-스위머(10)로부터 방출된다는 것을 의미한다. 결합된 DOX의 대략 60 %가 30 mW 광 강도에서 5 분 이내에 방출되었다(도 4의 C).
방출(release) 속도는 5 분 후에 극적으로 감소했다. 불완전한 방출은 니트로벤질(nitrobenzyl) 그룹에서 관찰되는 낮은 광화학적 전환 때문이다. 5 분 후의 느린 방출은 마이크로-스위머(10)의 중심에서 절단된 DOX 분자(24)의 더 느린 확산으로 인해 관찰되었을 수 있다. 더 느린 약물 방출은 30 mW 광 강도에 비해 3 mW 광 강도의 경우에 관찰되었다. 누적 약물(24)의 방출은 감소하고 약 40 %로 수렴했다(도 4의 C). 더 낮은 약물 방출은 더 낮은 광 강도로 인한 더 느린 반응 역학으로 설명될 수 있다.
따라서 광 강도를 변경함으로써 방출되는 DOX의 양을 제어할 수 있으며 그에 따라 자극의 강도 및 자극이 가해지는 시간에 따라 자극 적용 시 방출 타입을 조정할 수 있다.
도 4의 D는 마이크로-스위머(10)로부터 DOX(24)의 이러한 스마트 투여(smart dosing)가 어떻게 일어날 수 있는지의 예를 보여준다. t=0에서 1 분 및 t=6에서 7 분의 실선 막대는 365 nm 파장의 레이저의 형태의 자극을 도시한다. 자극의 인가 동안 DOX의 대략 15 %가 마이크로-스위머(10)로부터 분당(per minute) 방출된다.
광이 30 mW 광 강도일 때 1 분 동안 마이크로-스위머(10)로부터의 급격한 약물 방출이 관찰되었고, 그 후 광이 5 분 동안 꺼졌을 때 마이크로-스위머로부터의 방출이 없었거나 작았다(도 4의 D). 전체 약물의 대략 15 %가 투여 당 방출되었다. 이것은 마이크로-스위머(10)로부터의 주문형 약물 방출 프로파일을 제어할 수 있다. 또한 투여되는 약물(24)의 양은 광 강도 또는 노출 시간을 변경함으로써 조정될 수 있다.
따라서 서로 다른 약물 분자의 다양한 속도를 방출하도록 제어될 수 있는 광 절단 기반의 광-트리거 전달 시스템(10)이 도시된다. 이들 시스템에서, 약물 분자(24)는 광 절단성 링커 분자(26)에 화학적으로 결합된다. 광 절단성 링커 분자(26)는 예를 들어 광 조사 시 두 개의 부분으로 분할되고 약물 분자(24)는 부착된 구조로부터 방출된다. o-니트로벤질은 광 절단성 그룹(24)이고 기능성 o-니트로벤질 유도체는 다양한 생체 분자의 운반에 사용되었다. N-하이드록시숙신아미드 에스터(N-Hydroxysuccinimide ester, NHS) 및 알킨(alkyne)을 가지는 o-니트로벤질 유도체는 그 화학적 작용 때문에 분자(24)의 방출에 매우 효과적이다.
NHS 그룹은 아미노 그룹과 선택적으로 반응(NHS-아민 커플링으로 알려짐)하여 화학적 결합(28)을 형성하고 알킨 그룹은 아지드(azide) 그룹과 반응(구리 (I) 촉매된 클릭(Click) 반응으로 알려짐)하여 화학적 결합(30)을 형성한다. 광 절단성 링커 분자(26)의 NHS 말단은 마이크로-스위머(10)의 자유 아미노 그룹에 접합되었다. 그런 다음, 모델 약물로 활용된 아지드-변형된 DOX가 부착된 광 절단성 링커 분자(26)의 알킨 말단에 연결되어 화학적 결합(30)을 형성한다.
따라서 두 개의 다른 화학적 반응을 수행하여 DOX-기능화된 마이크로-스위머(10)를 얻었다(도 4의 A). 첫 번째 단계에서, 마이크로-스위머(10)가 o-니트로벤질 광 절단성 링커 분자(26)를 함유하는 용액으로 처리되었다. 알킨-말단 마이크로-스위머(10)가 소위 이 NHS-아민 커플링 반응 후에 얻어졌다. 두 번째 단계로서, 알킨 말단 마이크로-스위머(10)가 아지드-DOX 함유 반응 혼합물(24)로 처리되었다.
많은 약물(24)이 심각한 표적 외 부작용을 갖기 때문에, 치료제(24)의 스마트 투약(smart dosing)이 다양한 전달 시스템(10)의 중요한 고려 사항이다. 제시된 바와 같이, 마이크로-스위머(10)로부터의 제어된 약물 방출(24)은 주문형 레이저 광의 온/오프 스위칭에 의해 가능하다.
도 5는 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS) 분석을 사용한 메타크릴화(methacrylation) 정도의 측정을 예시한다. ChMA 거대분자의 메타크릴화 정도는 변형되지 않는 자유 아미노 그룹의 정량화를 기초로 하는 2,4,6-트리니트로벤젠 술폰산(TNBS) 분석으로 분석되었다.
대조군으로서의 비 변형 키토산 및 0.05 %(w/v) ChMA 거대분자가 0.2 %(v/v) 아세트산 용액에서 용해되었다. 80 μL의 용액을 40 μL의 2% (w/v) NaHCO3 및 60 μL의 0.1% (v/v) TNBS 시약(Thermo Fisher Scientific)과 함께 37°C에서 2 시간 동안 배양되었다.
배양 기간 후에, 60 μL의 1 N HCl을 용액에 추가하였고, 그런 다음 샘플의 흡광도(absorbance)가 플레이트 리더(BioTek Gen5 Synergy 2, Bad Friedrichshall, Germany)를 사용하여 345 nm에서 측정되었다. 메타크릴화 정도는 다음 방정식에 의해 계산되었다.
Figure pct00001
도 5에 도시된 바와 같이, 반응하지 않은 키토산은 345 nm 파장 광에서 가장 높은 흡광도를 제공한다(아미노 그룹 기준). 더욱이, 아미노 그룹이 키토산과 메타크릴산 무수물(methacrylic anhydride) 사이의 반응 중 아미노 그룹이 소모되고, 이것은 345 nm 파장 광에서 흡광도의 점진적 감소로 이어진다.
앞에서 설명한 3D 프린팅 공정에서 키토산을 사용할 수 있게 하기 위해 흡광도가 미반응 키토산보다 낮아야 한다. 70 %의 메타크릴아미드와 반응한 키토산은 3D 프린팅 공정을 위해 요구되는 범위 내에 있는 흡광도를 가지며 이것이 이 산물이 사용되는 이유이다.
도 6은 마이크로-스위머(10)의 2광자-기반 3D 프린팅에 사용되는 마이크로채널 셋업을 보여준다. 영구자석(20)은 수영 실험 중 최적의 자기 구동 효율을 얻기 위해 프리폴리머 용액(prepolymer solution)(14) 내에서 SPION을 정렬하는데 사용된다. 마이크로-스위머(10)는 자기장 (B)에 수직으로 세로로 인쇄되었다.
도 7의 A 및 B는 각각의 마이크로-스위머(10)의 에너지-분산성 x-선 분광 원소 맵핑을 보여준다. 마이크로-스위머(10)의 원소 맵핑은 15 keV에서 10 분 동안 수행되었다. 이중 나선 구조는 두 이미지 모두에서 볼 수 있으며, 아래의 이미지는 마이크로-스위머(10) 내부에 탄소 원자(해시(hashed) 영역)을 보여준다.
도 9의 A 및 B는 약물 분자, 즉 카고 물질(24)의 마이크로-스위머(10)로의 화학적 통합의 광학 현미경 이미지를 보여준다. 도 9의 A는 화학적 링커(24)로 처리되지 않은 마이크로-스위머(10)를 보여주며, 즉 이들은 o-니트로벤질 링커 변형이 없으며 오히려 약물 분자(아지드-DOX)로 직접 처리된다.
도 9의 B는 카고 물질(24)로 이들을 투여하기 전에 화학적 링커(26)가 적용되는 마이크로-스위머(10)를 도시한다. O-니트로벤질 링커 변형은 약물 분자(아지드-DOX)(24)로 처리된다. 이미지는 동일한 형광 강도 및 노출 시간으로 캡처되었고, 마이크로-스위머(10) 상의 아지드-DOX(24)의 제어된 통합을 나타낸다.
아지드-DOX(24)가 클릭(Click) 반응에 의해 마이크로-스위머(10)에 결합되었는지를 확인하기 위해, 도 9의 A에 표시된 바와 같은 네거티브 대조군으로서 마이크로-스위머(10)의 다른 그룹을 사용하여 두 번째 단계만 수행되었다. 네거티브 대조군에서, 아지드-변형된 DOX(24)는 아미노와 아지드 그룹 사이의 반응이 없기 때문에 마이크로-스위머(10)에 결합될 수 없다. DOX-변형 및 네거티브 대조군은 형광 현미경을 사용하여 비교되었다.
도 9의 B에 표시된 바와 같이 DOX-변형된 그룹은 동일한 노출 강도 및 시간에서 네거티브 그룹에 비해 상당히 더 높고 균일한 형광 방출을 가졌다(도 9의 A). 한편, 네거티브 그룹으로부터의 낮은 형광 방출은 마이크로-스위머(10) 내로의 약물 분자(24)의 확산에 기인하다. 이러한 결과들은 o-니트로벤질 링커 및 아지드-변형된 DOX가 마이크로-스위머(10)에 화학적으로 결합된 것을 확인해 주었다.
따라서 카고(24)를 마이크로-스위머(10)로 결합시키기 위해 화학적 링커(26)를 사용하는 것이 일반적으로 권고될 수 있다.
도 10의 A 내지 C는 제어된 방출 실험에 앞서 약물 분자에 대한 광표백 테스트(photobleaching tests)를 보여준다. 도 10의 A는 30 분 동안 470 nm 파장의 레이저 광으로 여기된 네거티브 그룹을 보여주고, 여기서 네거티브 그룹은 화학적 링커(26)가 없는, 즉 o-니트로벤질 링커 변형이 없는 마이크로-스위머(10)를 포함한다. 도 10의 B는 3 mW 365 nm 파장 레이저 광에의 네거티브 그룹의 노출을 보여준다. 도 10의 C는 30 mW 365 nm 파장 광에의 네거티브 그룹의 노출을 보여준다.
표백 테스트 및 마이크로-스위머(10)로부터의 제어된 약물 방출
마이크로-스위머(10)와 DOX(24) 사이의 o-니트로벤질 링커 분자(26)는 365 nm 파장 및 3-30 mW 강도에서 광 조사에 의해 선택적 결합 절단을 경험했다.
약물 방출 실험을 위해, 주된 가정은 마이크로-스위머(10)의 초기 형광 강도는 마이크로-스위머(10)에 부가되는 100 %의 약물(24)에 대응한다는 것이다. 마이크로-스위머(10)로부터의 약물(24) 방출은 시간에 따른 형광 강도의 감소에 기초하여 특성화된다.
표백 테스트(bleaching tests)는 마이크로-스위머(10)에 광표백 및 확산 관련 형광 강도의 변화가 없음을 확인하기 위해 수행되었다. 따라서 네거티브 그룹은, 링커 분자(26)의 절단을 위해 사용되는 365 nm에서 광에 노출되었고, DOX(24)의 여기 및 광 강도 변화 분석 및 파장에 사용된 470 nm에서 광에 노출되었다.
365 nm (도 10의 A) 및 470 nm 파장 (도 10의 B 및 C) 모두에서 여기에 대해 형광 강도의 감소가 관찰되지 않았으며, 이것은 약물 분자(24)가 광 노출 시 형광을 잃지 않았음을 의미하나, 전체 마이크로시스템의 형광 변화는 제어된 약물(24) 방출 때문이다.
도 11의 A 및 B는 마이크로-스위머(10)로부터 약물(24)의 제어되고 국부화된 방출을 나타내는 광학 현미경 이미지를 보여준다. 도 11의 A는 좌측 칼럼의 마이크로-스위머(10) 상에 집속된 365 nm 파장 레이저 광을 보여준다(도 11의 A i). 약물 분자(24)는 광에 노출될 때 방출되도록 제어되는 반면, 오른쪽 열에 있는 다른 그룹(도 11의 A iii)은 여전히 통합된 약물 분자(24)를 가졌다.
도 11의 A에 표시된 바와 같이 약물(24)은 마이크로-스위머(10)의 특정 그룹으로부터 방출될 수 있는 반면, 다른 것들은 내부에 약물을 보유하고 있다(도 11의 A). 더욱이, 도 11의 B는 마이크로-스위머(10)의 절반으로부터 약물(24)을 방출할 수 있는 방법을 보여주며, 적용되는 레이저 광(도시되지 않음)의 초점의 위치를 변경함으로써 카고 물질(24)의 방출에 대해 가질 수 있는 국소적 제어를 추가로 나타낸다.
앞에서 설명된 마이크로-스위머(10)는 원하는 목표 영역에, 예를 들어 인체 또는 동물의 간 또는 신장(도시되지 않음) 내에 카고 물질(24)의 표적 전달을 위해 사용될 수 있다. 예를 들어 마이크로-스위머(10)가 예를 들어 위장관(gastrointestinal tract)에 사용되는 경우, 이는 삼키는 것에 의해 섭취할 수 있으며 인체 전체의 자연적인 진행을 모니터링 하면 마이크로-스위머(10)를 능동적으로 진행 방향을 조종할 수 있으며 예를 들어 내장 또는 위장 내에 있으면 마이크로-스위머(10)가 예를 들어 간 등으로 카고 물질(24)의 운반을 위해 사용될 수 있고, 그리고 나서 마이크로-스위머(10)는 원하는 목표 영역과 연관된 영역, 예를 들어 혈관으로 주입된다.
예를 들어 마이크로-스위머(10)가 목표 사이트, 예를 들어 간 종양의 1 내지 2 mm 내에 있으며, 마이크로-스위머(10)는 앞에서 설명된 시간 가변 자기장으로 원하는 목표 영역을 향하게 된다. 일단 마이크로-스위머(10)가 원하는 목표 영역에 있으면, 이것은 원하는 목표 영역에서 카고(24)를 방출하기 위해 자극된다.
논의된 바와 같이 카고(24)를 방출하기 위해 원하는 목표 영역에서 마이크로-스위머(10)를 자극하는 단계는 목표 영역에 광 자극을 적용하는 것에 의해 수행된다.
마이크로-스위머(10)를 원하는 목표 영역으로 향하게 하는 단계가 원하는 목표 영역으로의 마이크로-스위머(10)의 경로를 추적하기 위해 이미지 맵핑과 함께, 예를 들어 MRI를 사용하여 수행된다면 더욱 유리하다.
앞에서 설명된 바와 같이 카고(24), 즉 약물은 마이크로-스위머(10)에 광을 집속하는 것에 의해 국부화된 방식으로 방출될 수 있다.
요약하면, 자기 구동식 생체적합성 및 생분해성의 키토산 기반의 마이크로-스위머(10)가 개발되었고, 이는 주문형 광-트리거 약물 방출의 기능을 갖는다. 이 목적을 위해 감광성 메타크릴아미드 키토산 거대분자가 합성된 후 SPION이 그에 임베드된다. 마이크로-스위머(10)는 TDLW 기술을 사용하여 3D 폴리머 용액으로부터 제조되었다. 더욱이, 마이크로-스위머는 10 mT 회전 자기장 하에서 다른 주파수로 구동되고 진행 방향이 조종될 수 있다.
마이크로-스위머(10)가 체외에서도 사용될 수 있음을 보여주기 위해, 인체에서 발견되는 천연 효소를 사용하여 어떠한 체외 독성 분해 산물도 생성하지 않는 마이크로-스위머(10)의 생분해가 보여진다.
합성 마이크로-스위머(10) 내에서의 주문형 광-트리거 약물 방출의 조합이 보여지며, 이것은 마이크로시스템을 다양한 질병 치료를 위한 치료제(24)의 능동적이고 제어된 전달과 관련된 도전을 위해 유망하게 만든다.
여기에서 논의된 모든 자료는 달리 명시되지 않는 한 Sigma-Aldrich에서 구입되었다.
이하에서 마이크로-스위머(10)를 제조하기 위해 수행되는 특정 방법 단계들은 발명자의 용어를 사용하여 논의될 것이다.
메타크릴아미드 키토산(methacrylamide chitosan)의 합성
메타크릴아미드 키토산(ChMa)은 앞서 설명된 프로토콜에 따라 몇 가지 변형을 통해 합성되었다. 처음에, 3 %(w/v) 저 분자량 키토산 분말이 24 시간동안 실온(RT)에서 3 %(v/v) 아세트산 용액에서 용해되었다. 메타크릴산 무수물(methacrylic anhydride)이 ~70% 메타크릴화 정도를 얻기 위해 3.5:1 (w/w) 비율로 키토산 용액에 첨가되었고, 반응은 실온에서 볼텍스 믹서(vortex mixer)로 3 시간 동안 수행되었다. 반응을 수행한 후, 반응 혼합물이 물로 희석되었고 4일 동안 물에 대해 투석되었다(14 kDa 컷-오프). 생성된 혼합물이 동결 건조되었고 추가 사용을 위해 -20°C에서 보관되었다.
마이크로-스위머의 3D 프린팅
ChMA (30 mg·mL-1), LAP 개시제 (20 mg·mL-1) (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd.) 그리고 초상자성 산화철 나노입자 (5 mg·mL-1) (50 nm fluidMAG-PEG/Amine from chemicell GmbH)가 8% (v/v) 아세트산 용액에 용해되었다. 생성된 프리폴리머 용액이 트리클로로(trichloro)(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl) 실란 처리된 유리 슬라이드에 방울로 떨어뜨리고 시판되는 직접 레이저 기록 시스템(Photonic Professional, Nanoscribe GmbH)으로 인쇄가 수행되었다. 제작 후 유리 슬라이드는 로 ddH2O로 철저하게 세척되었고 그런 다음 샘플은 추가 사용을 위해 4°C에서 보관되었다.
광 절단성 링커 및 약물 분자의 마이크로-스위머에의 통합
처음에, 광 절단성 o-니트로벤질 링커(1-(5-methoxy-2-nitro-4-prop-2-ynyloxyphenyl) 에틸 N-숙신이미딜 카보네이트, LifeTein LLC)가 NHS-아민 커플링 반응을 통해서 마이크로-스위머의 표면에 결합되었다. 간단히 말해서, 500 μM의 링커가 무수 디메틸 설폭사이드(anhydrous dimethyl sulfoxide)에 용해되었고 마이크로-스위머가 실온에서 4 시간 동안 링커 용액으로 처리하였다. 그 후, 마이크로-스위머에 결합된 링커 분자의 알킨 말단에 아지드-변형 DOX(LifeTein LLC)를 결합하기 위해, 앞서 설명된 프로토콜이 일부가 수정되어 적용되었다. 마이크로-스위머는 50 μM 아지드 변형된DOX, 100 μM CuSO4, 5 mM 나트륨 아스코르베이트(sodium ascorbate), 500 μM 트리스(3-hydroxypropyltriazolylmethyl) 아민을 함유하는 용액으로 실온에서 3 시간 동안 처리되었다. 마지막으로, 마이크로-스위머가 결합되지 않은 약물 분자를 제거하기 위해 ddH2O로 여러 번 세척되었고 추가 사용을 위해 어둠 속에서 보관되었다.
표백 테스트 및 마이크로-스위머로부터의 제어된 약물 방출
약물이 통합된 마이크로-스위머가 실온으로 평형화되었고, ddH2O로 여러 번 세척되었고, ddH2O에서 밤새 보관되었다. 365 nm에서 빛에 노출되었을 때 마이크로-스위머로부터의 제어된 약물 방출이 형광 도립 현미경(DMi8, Leica Microsystems)을 사용하여 조사되었다. 시간-경과 형광 이미지는 30 분 동안 매 10 초마다 획득되었다. 광 강도는 3 mW 또는 30 mW로 조정되었고 노출 시간은 1 초로 설정되었다. 마이크로-스위머의 형광 강도는 LASX 분석 툴박스(Leica Microsystems)를 사용하여 분석되었다. 주문형 제어된 약물 방출 실험이 1 분의 광 노출 및 이어지는 5 분의 불응 기간(refractory period)으로 수행되었다. 두 경우 모두에서, 배경 형광은 측정된 값에서 차감되었다.
수동 확산을 통해 약물 분자가 로딩된 마이크로-스위머의 형광 표백이 제어된 형광 방출 실험에서와 같이 365 nm 또는 470 nm의 빛에의 노출 및 이미지 획득에 의해 수행되었다. 365 nm에서 3 mW 및 30 mW광 출력 및 470 nm에서의 광 출력 양자에 대한 표백 테스트가 30분 동안 테스트되었고, 형광 이미지가 매 10 초마다 획득되었다. 방출 실험과 유사하게, 개별 마이크로-스위머의 형광 강도는 LASX 분석 툴박스(Leica Microsystems)를 통해 측정되었고 배경이 측정된 값에서 차감되었다.
마이크로-스위머의 분해 및 분해 산물의 세포 독성 조사
3D 프린팅 된 마이크로-스위머가 37°C에서 1x 인산염 완충 식염수에 준비된 다양한 농도의 리소자임 용액(1.5, 15 및 150 μg·mL-1)으로 처리되었다. 마이크로-스위머의 길이 및 직경은 DIC 모드에서 20배 확대되는 Nikon Eclipse Ti-E 도립 현미경으로 증가하는 시간 간격(3, 6, 12, 24, 48 시간)으로 측정되었다. 효소의 불활성화를 방지하기 위해 12 시간마다 효소 용액을 새롭게 했다. 분해 산물이 마이크로-스위머의 생체적합성 및 세포 독성을 조사하기 위해 사용되었다. 간단히 말해, SKBR3 유방암 세포(패시지 #8)가 5000 세포/웰(cells/well)로서 96-웰 플레이트에 식재되었다. 그런 다음, 그것들은 ~80% 합류(confluence)에 도달했을 때 1일 동안 수 천개의 3D 프린팅된 마이크로-스위머 또는 성장 배지(대조군)의 분해 산물로 처리되었다. 마지막으로, 세포가 라이브-데드 이미징 용액(Life Technologies)으로 실온에서 20 분 동안 염색되었고, 형광 도립 현미경으로 영상화되었고, 정량 분석을 위해 ImageJ를 사용하여 계수되었다.

Claims (26)

  1. 생체적합성 마이크로-스위머(10)를 만드는 방법에 있어서,
    광 가교성 바이오폴리머 용액(12)을 제공하는 단계;
    3D 프린팅 가능한 용액(14)을 형성하기 위해 상기 광 가교성 바이오폴리머 용액에 자성 입자와 광 개시제를 첨가하는 단계;
    상기 3D 프린팅 가능한 용액(14)을 향해 가변 초점을 갖는 레이저(18)를 적용하는 단계;
    미리 정의된 형상을 가지는 상기 생체적합성 마이크로-스위머(10)를 형성하기 위해 상기 3D 프린팅 가능한 용액(14)을 통하는 상기 레이저(18)의 초점을 변경하는 단계; 및
    상기 미리 정의된 형상을 가지는 상기 생체적합성 마이크로-스위머(10)에 화학적 링커(chemical linker)(26)를 적용하는 단계
    를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 화학적 링커(26)는 상기 생체적합성 마이크로-스위머(10)와 상기 마이크로-스위머(10)에 부착될 수 있고 상기 마이크로-스위머(10)에 의해 운반 가능한 카고(cargo)(24) 사이의 링크(link)를 형성하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 화학적 링커(26)를 통해 카고(24)를 상기 생체적합성 마이크로-스위머(10)에 부착하는 단계를 더 포함하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 카고는 치료 또는 진단 목적을 위한 효소, 분자, 약물, 단백질, 유전 물질, 나노입자, 방사선 종자(radioactive seeds), 및 이들의 조합으로 이루어진 요소들의 그룹에서 선택되는 방법.
  5. 제2항 내지 제4항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 화학적 링커(26)는 상기 마이크로-스위머(10)와 상기 카고(24) 사이의 링크가 자극의 존재 시 해제될 수 있도록 선택되는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 적어도 한 항에서,
    상기 화학적 링커(26)는 광 절단 가능한 링커, 바람직하게는 NHS 및 알킨 변형된 o-니트로네질 유도체인 방법.
  7. 제1항 내지 제5항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 화학적 링커(26)는 효소적으로 절단 가능한 링커, 예를 들어 매트릭스 메탈로프로테이나제 인식 펩타이드 서열들 중 하나이거나, 상기 화학적 링커(26)는 열적으로 절단 가능한 링커인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 광 가교성 바이오폴리머 용액(12)은, 예를 들어, 키토산, 젤라틴, 알기네이트, 폴리펩타이드, 핵산, 다당류 및 이들의 조합이거나, 바람직하게는 키토산인, 생체 활성, 생분해성 및 생체적합성 폴리머를 포함하는 용액인 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 자성 입자는 5 nm 내지 200 nm의 범위, 특히 5 내지 200 nm의 범위, 바람직하게는 40 내지 60 nm의 범위에서 선택되는 크기를 갖는 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 자성 입자는 산화철 입자, 철 백금 입자, 네오디뮴 철 붕소 입자, 알루미늄 니켈 코발트 입자, 철 입자, 코발트 입자, 사마륨 코발트 입자, 그리고 바람직하게는 산화철 입자로 이루어지는 요소들의 그룹에서 선택되는 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 적어도 한 항에서,
    상기 광 개시제는 2광자 흡수 시 반으로 분할되고 상기 광-가교를 개시하는 라디칼을 생성하는 분자이고, 상기 광 개시제는 예를 들어 페닐-2,4,6,트리메틸벤조일포스피네이트(LAP)인 방법.
  12. 제1항 내지 제11항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 카고(24)는, 자극의 적용 시, 예를 들어 광 적용 시, 또는 특정 효소의 미리 정해진 양의 근처에서, 상기 마이크로-스위머(10)로부터 방출될 수 있는 방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 레이저(18)를 적용하는 단계 동안 상기 3D 프린팅 가능한 용액(14) 내의 상기 자성 입자를 정렬하도록 자기장 세기가 선택된 자기장(B)을 적용하는 단계를 더 포함하는 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)는, 나선형 또는 이중 나선형 구조와 같은, 회전 자기장의 존재 하에 시간에 따라 비대칭적으로 움직이도록 구성된 형상을 갖는 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)는, 2:1 내지 10:1의 범위에서 선택되는 길이 대 폭의 비율을 갖는 길쭉한 형상을 갖는 방법.
  16. 제1항 내지 제3항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)의 적어도 하나의 치수는 0.0001 내지 1 mm의 범위에서 선택되는 방법.
  17. 특히 제1항 내지 제16항 중 적어도 한 항에 따른 방법을 사용하여 만들어진, 생체적합성 마이크로-스위머(10)에 있어서,
    광 가교성 바이오폴리머 용액(12), 자성 입자 및 광 개시제를 포함하는 3D 프린팅 가능한 용액(14)으로 형성된 바디부(10')를 포함하고,
    상기 마이크로-스위머(10)의 상기 바디부(10')는, 나선형 또는 이중 나선형 구조와 같은, 회전 자기장의 존재 하에 시간에 따라 비대칭적으로 이동되도록 구성되는 형상을 갖고,
    상기 바디부(10')는 화학적 링커(26)로 코팅되는
    생체적합성 마이크로-스위머(10).
  18. 제17항에서,
    상기 마이크로-스위머(10)의 상기 바디부(10')는 2:1 내지 10:1의 범위에서 선택되는 길이 대 폭의 비율을 갖는 길쭉한 형상을 갖는 생체적합성 마이크로-스위머(10).
  19. 제17항 또는 제18항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)의 적어도 하나의 치수는 0.0001 내지 1 mm의 범위에서 선택되는 생체적합성 마이크로-스위머(10).
  20. 제17항 내지 제19항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)는 0.1 보다 작은 레이놀즈 수(Reynold's number)로 이동되도록 구성되는 생체적합성 마이크로-스위머(10).
  21. 제17항 내지 제20항 중 적어도 한 항에 있어서,
    상기 마이크로-스위머(10)는 그 주축(major axis)에 수직인 방향으로 자화되는 생체적합성 마이크로-스위머(10).
  22. 제17항 내지 제21항 중 적어도 한 항에 있어서,
    1.5 μg/ml 리소자임 농도에서, 210 시간의 기간 내에, 상기 마이크로-스위머(10)의 길이는 초기 길이의 최대 70 %의 길이로 줄어들고 상기 마이크로-스위머(10)의 직경은 상기 마이크로-스위머(10)의 초기 직경의 최대 50 %의 직경으로 줄어드는 생체적합성 마이크로-스위머(10).
  23. 제17항 내지 제22항 중 적어도 한 항에 따르고/따르거나 제1항 내지 제16항 중 적어도 한 항에 따라 만들어지고, 카고(24)가 적재된, 마이크로-스위머(10)를 사용하는 방법에 있어서,
    원하는 목표 영역과 관련된 영역에 상기 마이크로-스위머(10)를 제공하는 단계;
    시간 가변 자기장에 의해 상기 마이크로-스위머(10)를 상기 원하는 목표 영역을 향하게 하는 단계;
    상기 원하는 목표 영역에서 상기 카고(24)를 방출하도록 상기 마이크로-스위머(10)를 자극하는 단계
    를 포함하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 향하게 하는 단계는 1 Hz 내지 50 Hz의 범위에서 선택되는 주파수를 가지는 5 mT 내지 50 mT의 범위의 자기장 세기를 가지는 회전 자기장의 적용을 포함하는 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 카고(24)를 방출하도록 상기 원하는 목표 영역에서 상기 마이크로-스위머(10)를 자극하는 단계는 상기 목표 영역에서 광 자극(light stimulus)을 인가하는 것에 의해 수행되는 방법.
  26. 제23항 내지 제25항 중 어느 한 항에서,
    상기 마이크로-스위머(10)를 향하게 하는 단계는, 상기 원하는 목표 영역까지의 상기 마이크로-스위머(10)의 경로를 추적하기 위해, 이미지 맵핑과 함께, 예를 들어 MRI를 사용하여 수행되는 방법.
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