KR20210057116A - 치료, 영상화 및 치료진단 적용을 위한 소형의 고도로 균일한 나노약물 조성물 - Google Patents

치료, 영상화 및 치료진단 적용을 위한 소형의 고도로 균일한 나노약물 조성물 Download PDF

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KR20210057116A
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active agent
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토마스 홉킨스
스코트 디. 스완슨
라울 코펠만
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 미시간
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Abstract

광역학적 요법을 위한 치료 플랫폼 역할 및 MR 분자 영상화제 역할을 동시에 할 수 있고, 중금속 원자가 없는, 표적화 가능한 나노구조물(nanoconstruct). 8PEGA-Ce6 NC를 포함하는, F3-cys 표적화제 나노구조물. 물 신호를 억제하기 위해 큰 확산 자기장 구배를 가진 표준 스핀-에코 영상화 시퀀스를 사용하여, MRI에 의해 직접적이고 선택적으로 영상화될 수 있는, 표지가 없는 8PEGA 나노구조물.

Description

치료, 영상화 및 치료진단 적용을 위한 소형의 고도로 균일한 나노약물 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 미국특허법 제35 U.S.C. §119(e)(1)호 하에 2018년 9월 13일자로 출원된 미국 임시 출원 번호 제62/730,882호의 출원일의 이익에 대한 우선권을 주장하며, 그 전문개시는 본원에 참조로서 포함된다.
정부 이익에 대한 진술
본 발명은 국립 보건원(National Institutes of Health)이 수여한 CA186769 하의 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명의 특정 권리를 갖는다.
기술분야
본 발명은 일반적으로 나노구조물(nanoconstruct) 및 동적 치료, 영상화, 진단, 치료진단(theranostics) 및 기타 적용에서 이들 구조물의 용도에 관한 것이다.
용어 "나노입자(nanoparticle)", "나노물질", "나노입자", 나노제품", "나노플랫폼", "나노구조물", "나노복합체", "나노", 및 유사한 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 약 1 나노미터(nm) 내지 약 100 nm의 적어도 하나의 치수를 가진 체적 형상을 가진 입자, 물질 및 조성물을 포함한다. 바람직하게는, 실시형태에서, 이러한 체적 형상은 약 1 nm 내지 약 100 nm의 가장 큰 단면을 갖는다.
용어 "나노구조물들", "나노플랫폼", "나노복합체", 및 "나노구조물" 및 유사한 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 백본 재료, 예컨대 케이지, 지지체 또는 매트릭스 재료, 및 백본과 결합되는 하나 이상의 첨가제, 예컨대 작용제(agent), 모이어티, 조성물, 생물학적 제제(biologics), 및 분자를 가진 입자를 포함한다. 일반적으로, 백본 재료는 나노입자일 수 있다. 일반적으로, 첨가제는 표적화, 치료, 영상화, 진단, 치료진단 또는 다른 기능, 및 이들의 조합 및 변형을 가진 활성 물질이다. 실시형태에서, 백본 재료는 표적화, 치료, 영상화, 진단, 치료진단 또는 다른 기능, 및 이들의 조합 및 변형을 가진 활성 물질일 수 있다. 실시형태에서, 첨가제 및 백본 재료 둘 모두는 활성 물질이다. 1, 2, 3개 이상의 상이한 유형의 백본 재료, 첨가제 및 이들의 조합 및 변형이 고려된다.
용어 "치료진단"은 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며. 영상화와 치료 능력 둘 모두, 진단과 치료 능력 둘 모두, 및 이들의 조합 및 변형 및 표적화와 같은 다른 특징을 포함하여 다중 능력 및 기능을 갖는 입자, 작용제, 구조물 또는 재료를 포함한다.
용어 "영상화", "영상화제", "영상화 장치" 및 유사한 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 구조물, 및 특히 동물, 포유류 및 인간에서의 구조물의 크기, 형상, 위치, 조성, 및 이들의 조합 및 변형뿐만 아니라 기타 특징을 검출, 분석 및 시각화하는 능력을 향상, 제공 또는 가능케 하는 장치, 작용제 및 재료를 포함한다. 영상화제는 조영제, 염료, 및 유사한 유형의 재료를 포함한다. 영상화 장치 및 방법론의 예는 다음을 포함한다: x-선; 자기 공명; 컴퓨터 축 단층 촬영(CAT 스캔); 양성자 방출 단층촬영 스캔(PET 스캔); 초음파; 형광; 및 광 음향.
용어 "진단"은 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 동물, 포유류 및 인간의 병태 및 질환을 포함하여, 병태, 질환 및 둘 모두의 식별, 결정, 정의 및 이들의 조합 및 변형을 포함한다.
용어 "치료적" 및 "치료" 및 유사한 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 동물, 포유류 및 인간의 병태 및 질환을 포함하여, 병태 및 질환의 해결, 치료, 관리, 완화, 치유, 예방, 및 이들의 조합 및 변형을 포함한다.
용어 "광역학 요법(photodynamic therapy)", "PDT", "감광제", "PS" 및 유사한 이러한 용어는 달리 명시되지 않는 한, 가장 넓은 의미를 부여해야 하며, 감광제(PS) 분자를 이용한 광-산화에 의해 생물학적 조직을 제거, 예컨대 사멸하는 방법을 포함한다. 감광제가 특정 파장의 빛에 노출되면, 근처 세포를 사멸시키는 산소 형태, 예를 들어 세포에 대해 세포-독성인 임의의 형태의 산소를 포함하는 반응성 산소 종("ROS: reactive oxygen species")을 생산한다. 모든 파장, 예를 들어 UV에서 가시광선에서 IR을 가로 지르는 빛이 일반적으로 PS의 활성화제로 사용되는 것으로 이해된다.
용어 "활성화 동적 요법", "동적 요법", "동적 요법제" 및 유사한 이러한 용어는 가장 넓은 의미를 부여해야 하며 PDT 및 PS뿐만 아니라, 활성 산소 종("ROS") 또는 기타 활성 치료 물질과 같은 활성 산소를 생성하도록 촉발되는 제제를 포함하며, 빛 이외에 다른 에너지원에 노출되는 경우 활성화제로서 사용될 수 있다. 이는 전파, 다른 전자석 방사선, 자기 및 음파(예컨대 초음파역동 요법(초음파역학 요법) 또는 SDT)와 같은 에너지원에 의해 활성화되는 재료 및 작용제를 포함한다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 실온은 25℃이다. 그리고, 표준 주위 온도 및 압력은 25℃이고 1 기압이다. 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 모든 시험, 시험 결과, 물리적 특성 및 온도 의존성, 압력 의존성 또는 둘 다인 값은 표준 주변 온도 및 압력에서 제공되며, 이는 점도를 포함한다.
일반적으로, 달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 "약" 및 기호 "~"는 ±10%의 편차 또는 범위, 명시된 값을 얻는 것과 관련된 실험 또는 기기 오차, 바람직하게는 이들 중 더 큰 것을 포함하는 것을 의미한다.
달리 명시되지 않는 한 본원에서 사용된 바와 같이, 본원에서 값의 범위를 언급하는 것은 단지 범위 내에 속하는 각각의 개별 값을 개별적으로 지칭하는 속기 방법으로서의 역할을 하는 것으로 의도된다. 본원에서 달리 지시되지 않는 한, 범위 내의 각각의 개별 값은 마치 본원에서 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 포함된다.
본 발명의 배경 섹션은 본 발명의 실시형태와 관련될 수 있는 기술의 다양한 양태를 소개하기 위한 것이다. 따라서, 본 섹션에서 전술된 논의는 본 발명을 더 잘 이해하기 위한 프레임 워크를 제공하며, 종래 기술의 인정으로 간주되어서는 안된다.
동물, 포유류 및 인간의 병태를 해결하기 위해 새롭고 혁신적인 약물, 의료 제품 및 영상화제에 대해 오랫동안 충족되지 않은 필요성이 있었다. 특히, 암 진단 및 치료, 포유류 및 인간의 기타 병태, 및 MRI 영상화제에서 중금속 사용에서 이러한 오랜 동안 미충족된 요구가 있다.
본 발명은 특히 본원에서 교시되고, 개시되고 청구된 조성물, 재료, 제조 물품, 장치, 방법 및 공정을 제공함으로써 이러한 요구를 해결한다.
치료, 영상화, 진단 또는 치료진단에 적용하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 복수의 나노입자를 가지며, 여기서, 상기 나노입자는 백본 재료; 백본에 부착된 활성제를 포함하며; 복수의 나노입자는 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 정의되는 미리 결정된 입자 크기 분포를 갖는다.
또한, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: n은 약 5 nm 내지 약 25 nm의 범위의 수이다; n은 7 nm 내지 22 nm의 범위의 수이다; n은 약 10 nm 내지 약 20 nm 범위의 수이다; n은 약 11 nm 내지 약 15 nm 범위의 수이다; 활성제는 광감각제이다; 활성제는 광음향제(photoacoustic agent)이다; 활성제는 초음파 감응제(sonosensitizer)이다; 제2 활성제를 갖는다; 제2 활성제를 가지며, 제2 활성제는 상기 활성제와 상이하다; 활성제는 메틸렌 블루, 클로린 e6(Ce6), 쿠마시 블루, 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 활성제는 테라피롤이다; 활성제는 포르피린, 클로린, 프탈로시아닌, 및 박테리오클로린으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 활성제는 HPPH, TOOKAD, LUZ 11, 및 BC19포르피린으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 활성제는 페노티아지늄 염, 벤조페노티아지늄 염, 할로겐화된 잔텐, 스쿠아레인으로 이루어진 군으로부터 선택된다; 활성제는 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루 O, PP9004, EtNBS, Rose Bengal, ASQI, 아연(II) 디피콜일아민 디-요오도-BODIPY, 및 BIMPy-BODIPY으로 이루어진 염료의 군으로부터 선택된다; 활성제는 전이 금속 공-배향 화합물이다; 활성제는 루테늄, 로듐, 백금, 금 및 이리듐, 아연, 구리, 및 팔라듐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 가진 전이 금속 공-배향 화합물이다;나노입자는 8PEGA이다; 나노입자는 BiPEG이다; 나노입자는 표적화제를 포함한다; 나노입자는 표적화제를 포함하며, 표적화제는 F3-cys이다; 그리고 나노입자는 8PEGA이며, 활성제는 Ce6이고 나노입자는 표적화제를 포함하며, 표적화제는 F3-cys이다.
또한, 치료, 영상화, 진단 및 치료진단에 적용하는 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음을 갖는다: 복수의 나노입자, 여기서 나노입자는 PEG로 구성된 백본 재료임; 당해 백본에 부착되어 복수의 나노구조물을 한정하는 활성제; 여기서, 복수의 나노구조물은 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 한정된 좁은 입자 크기 분포를 가지며, 복수의 나노구조물은 치료, 영상화, 진단 및 치료진단 적용을 수행할 수 있다.
또한 추가로, 종양 세포 파괴에서 사용하기 위한 조성물이 제공되며, 상기 조성물은 다음을 갖는다: 복수의 나노입자를 갖는 부형제; 부형제와 결합된 광감각제; 여기서, 상기 부형제는 특히 PEG로 구성된 백본을 가지며; 여기서 부형제는 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 한정된 입자 크기 분포를 갖는다.
또한, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: n은 약 5 nm 내지 약 25 nm의 범위의 수이고, 나노 입자는 8PEGA이고, 활성화제는 Ce6이고, 표적화제를 갖고; 여기서 상기 표적화제는 F3-cys이다.
또한 추가로, 치료 적용을 안내(guiding)하는데 사용하기 위한 데이터를 수득하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음의 단계들을 갖는다: 복수의 나노입자를 가진 영상화제를 대상체에 투여하는 단계; 나노입자는 중금속이 없음; 및 영상화제를 투여한 후 대상체의 핵 자기 공명 스캔을 수행하는 단계; 여기서 나노입자는 직접 영상화되고; 이로써 나노입자의 MRI 및 나노입자와 대상체와 관련된 데이터가 제공된다.
또한, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 나노입자는 PEG를 포함한다; 나노입자는 8PEGA를 포함한다; 나노입자는 치료진단적 나노구조물을 한정한다; 나노입자는 PDT 나노구조물을 한정한다; 데이터는 종양의 형상 및 위치를 식별한다; 추가로 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여, PDT를 제공하는 것; 추가로 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것; 및 PDT가 제공된 후 나노입자의 MRI가 수득되는 것; 추가로 PDT 시스템에 데이터를 제공하는 것; 및 추가로 의료 기록에 데이터를 제공하는 것을 포함한다.
또한 추가로, PDT를 제공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것; 여기서 나노입자는 실질적으로 중금속이 없다.
또한, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 나노입자는 1 ppm 미만의 중금속을 갖는다; 나노입자는 0.1 ppm 미만의 중금속을 갖는다; 나노입자는 0.01 ppm 미만의 중금속을 갖는다; 나노입자는 0.001 ppm 미만의 중금속을 갖는다.
또한, PDT를 제공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것; 여기서 나노입자는 가돌리늄이 실질적으로 없다.
또한, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 나노입자는 1 ppm 미만의 중금속을 갖는다; 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다; 나노입자는 0.1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다; 나노입자는 0.01 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다; 나노입자는 0.001 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다.
또한, 치료진단 적용의 안내에서 사용하기 위한 데이터를 수득하는 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 갖는다: 대상체에 복수의 나노입자를 가진 영상화제를 투여하는 것; 가돌리늄이 실질적으로 없는 나노입자; 및 영상화제의 투여 후에 대상체의 핵 자기 공명 스캔을 수행하는 것; 여기서 나노입자는 직접 영상화되며; 이로서 나노입자의 MRI 및 나노입자와 대상체와 관련된 데이터가 제공된다.
또한, PDT를 발달시키는(develope) 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 갖는다: 대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 발달시키는 것; 여기서 나노입자는 중금속이 실질적으로 없다.
또한 부가적으로, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: PDT의 발달은 광감각제의 평가를 갖는다; PDT의 발달은 표적화제의 평가를 갖는다; PDT의 발달은 나노구조물의 평가를 갖는다; 데이터는 나노입자의 직접적인 NMR 영상을 갖는다; 그리고 대상체는 동물, 포유류 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 치료법 개발 방법이 제공되며; 상기 방법은 다음을 갖는다: 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 치료법을 개발하는 것; 여기서 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다.
또한 부가적으로, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 치료법 개발은 약물 개발, 암 치료 개발, 심장 병태 전개, 유전 물질 분석, 반응 경로 분석 및 약리학으로 이루어진 군으로부터 선택되는 평가를 갖는다; 여기서 나노입자는 생체 내에서 영상화된다; 그리고 나노입자는 시험관 내에서 영상화된다.
또한, 다음을 포함하는, 물질 개발 방법이 제공된다: 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 물질을 개발하는 것; 여기서 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다.
또한, 대상체의 평가 방법이 제공되며, 상기 방법은 다음을 포함한다: 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 및, 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 대상체를 평가하는 것; 여기서 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다.
또한 부가적으로, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 대상체는 물질, 약물, 공정, 반응 경로 및 제조 방법으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한, 핵 자기 공명 영상화제가 제공되며, 상기 영상화제: 중금속이 실질적으로 없는 복수의 나노입자를 가지며; 상기 나노입자는 PEG를 갖고; 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있다.
또한, 핵 자기 공명 영상화제가 제공되며, 상기 영상화제는: 복수의 나노입자를 가지며; 상기 나노입자는 PEG를 갖고, 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 정적, 구배, 및 무선 주파수(RF: radio frequency) 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있으며, 이에 따라 나노입자 영상이 생성된다; 그리고 상기 영상화제는 중금속이 실질적으로 없다.
또한 추가로, 핵 자기 공명 영상화제가 제공되며, 상기 영상화제는 다음을 갖는다: 1 ppm 미만의 가돌리늄을 가진 복수의 나노입자로서; 상기 나노입자는 PEG를 갖고; 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있다.
또한 추가로, 핵 자기 공명 영상화제가 제공되며, 상기 영상화제는 다음을 갖는다: 복수의 나노입자로서, 상기 나노입자는 PEG를 갖고, 상기 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있고; 이에 따라 나노입자의 영상이 생성된다; 그리고 영상화제는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는다.
또한 추가로, 자기 공명 영상화 장치에서 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있는 나노입자를 가진 영상화제가 제공되며, 상기 나노입자는 다음을 갖는다: 백본 재료를 가진 나노구조물로서, 상기 백본 재료는 비-상자성(non-paramagnetic)이고; 나노구조물은 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있다.
또한 추가로, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 나노구조물은 약 3,600 양성자를 갖는다; 그리고 상기 나노구조물은 25 nm 미만이다; 나노구조물은 광감각제를 갖는다; 나노구조물은 표적화제를 갖는다; 나노구조물은 표적화제 및 영상화제를 갖는다; 그리고 나노구조물은 종양 열망적(tumor avid)이다.
또한, MRI에서 치료를 수행하면서 이러한 영상화제 또는 이러한 나노입자 중 적어도 하나의 영상을 직접 수득하는 방법이 제공된다.
또한 추가로, 하나 이상의 다음의 특징을 가진 이러한 나노구조물, 나노입자, 작용제, 조성물, 방법, 및 장치가 제공된다: 치료법은 수술을 포함한다; 그리고 치료법은 PDT를 포함한다.
실시형태에서, PEG를 사용한 나노입자의 MRI 영상화는 나노입자 MRI 신호를 선택적으로 시각화하고 물 또는 지방에서 발생하는 다른 양성자 신호를 억제하기 위해 추가된 구성요소와 함께 통상적인 MR 펄스 시퀀스를 사용함으로써 달성된다. 이러한 시퀀스는 비제한적으로 스핀-에코 영상화 방법, 구배-에코 영상화 방법, 자극-에코 영상화 방법, 에코 플래너 영상화(EPI: echo planer imaging) 방법, 나선형 영상화 방법, 역-투영 영상화 방법, 및 화학적 이동 영상화(CSI: chemical shift imaging) 또는 복셀-기반 분광분석 방법을 포함한다.
실시형태에서, 다른 신호로부터의 필터링이 제공된다. 다른 양성자 신호로부터 PEG 나노입자 신호를 단리하기 위해, 특정 필터링 구성요소가 선택한 펄스 시퀀스에 추가될 것이다. 이러한 MRI 신호 필터링 방법은 비제한적으로 조직 물 MRI 신호를 우선적으로 감소시키기 위해 1,000 s/mm2 초과의 자기장 구배 b 값을 갖는 펄스 시퀀스, 무선 주파수(RF) 지방 억제 또는 T1 지방 억제를 사용하는 통상적인 지방 억제 방식, PEG 양성자의 긴 T2 시간을 이용하고 조직 물 및 지방 조직 신호 둘 모두를 감소시키기 위해 충분히 긴 TE 시간을 가진 펄스 시퀀스, PEG 양성자의 특정 화학적 이동에 기반하거나 이를 사용하는 펄스 시퀀스, 앞서 지시된 바와 같이 지방 억제 및 물 억제와 함께 배치되어 별도의 물 및 PEG 양성자 영상을 생성하기 위해 Dixon 유형 영상화 시퀀스를 사용하는 펄스 시퀀스, 자기화 전이(MT: magnetization transfer)를 사용하여 추가로 조직의 물을 억제하고 PEG 양성자는 억제하지 않는 펄스 시퀀스, 물, 지방 및 PEG 양성자의 특이적 화학적 이동에서 양성자의 저해상도 1D, 2D, 또는 3D 영상을 생성하는 CSI 펄스 시퀀스, 복셀 NMR 스펙트럼을 생성하기 위해 물 및 지방 억제 방법을 사용하는 단일 복셀 또는 다중 복셀 국소 분광분석 펄스 시퀀스를 포함한다.
도 1은 Ce6 전달 및 ROS 생산 효능의 실시형태의 구조적 표현의 차이를 보여주는 예시이며(축적으로 도시되지 않음), 좌측 예시는 단리 시 Ce6에 의해 ROS가 생산되는 방법을 보여주고, 우측은 캡슐화된 Ce6의 실시형태 대 본 발명에 따른 8PEGA에 고정된 실시형태를 나타낸다. ROS가 움직이는 방식의 이러한 차이는 효능의 명백한 증가를 보여준다.
도 2는 시간에 따른 ADPA 형광 켄칭에 의해 추적된 바와 같이 PAAm NP에 캡슐화된 Ce6의 k-값 플롯의 실시형태를 보여주는 예시이다. PBS 중의 660 nm OD = 0.12; 플롯의 기울기는 k-값이다.
도 3a는 본 발명에 따른 F3-cys 펩티드에 의한 8PEGA-Ce6의 변형의 실시형태의 예시이다.
도 3b는 본 발명에 따라 0.1 mg/m에서 PBS 중의 8PEGA-Ce6 및 F3-8PEGA-Ce6의 UV/VIS 스펙트럼의 실시형태의 예시이다.
도 4는 혈구측정 세포 집단 결과의 실시형태의 그래프이다. 배양 조건: 200,000 개의 세포가 접종된 웰에서 24 시간 동안 200 ug/mL F3-8PEGA-Ce6; N = 대조군 및 시험군의 경우 3 x 3(각각 3개 플레이트, 각각 3회 시험). 대조군 세포는 동일한 조건에서 F3-8PEGA-Ce6 나노구조물을 포함하지 않는다. 결과는 본 발명에 따라 거의 동일한 세포 집단을 보여준다.
도 5a 내지 5e는 HeLa 229 세포의 PDT 시험 영상의 사진이다. 도 5a) PDT 대조군 세포의 칼세인 AM 형광(F3-8PEGA-Ce6 없음). 도 5b) 조명 2시간 후 PDT 대조군 세포의 칼세인 AM 형광. 도 5c) PDT 전에 시험 세포의 칼세인 AM 형광(F3-8PEGA-Ce6 사용). 도 5d) PDT 2시간 후 시험 세포의 칼세인 AM 형광. 도 5e) PDT 2시간 후 형광. PDT 시험 플레이트를 PDT 전에 2시간 동안 200 ug/mL F3-8PEGA-Ce6와 함께 배양하였고 모든 세포를 692 +/- 20 nm 필터 및 아크 램프를 사용하여 10분 동안 50 mW/cm2의 총 플루언스로 조명하였다. 본 발명에 따른다.
도 6은 b = 108 s/m2 (A) 및 b = 1010 s/m2 (B)로 얻은 8PEGA의 실시형태의 확산-가중 스핀-에코 MR 영상의 영상이다. 110 M 물 양성자 신호는 (A)에서 볼 수 있듯이 기존 MR 영상에서 우세하지만 b = 1010 s/m2에서 영상화하면 10-10배로 억제된다. 8PEGA의 확산 상수는 25℃에서 자극된 에코 펄스 필드 구배 NMR에 의해 측정되어 3.572 10-11 m2/s이며, 초기 자성화의 70%가 b = 1010 s/m2에서 생존할 수 있게 한다. (B)의 컬러 막대는 본 발명에 따라 검출된 8PEGA의 농도를 보여준다.
도 7은 8PEGA의 실시형태의 농도 의존적 MRI 신호의 그래프이다. 관심 영역(ROI: region of interest)은 계산된 신호의 5개 바이알과 평균(원) 및 표준 편차(오차 막대) 각각에 대해 선택되었다. 본 발명에 따라, 5개의 측정된 바이알에 선형 방정식을 피팅하고 그 결과를 점선으로 표시한다.
도 8은 본 발명에 따른 나노복합체의 실시형태의 크기 분포를 나타내는 그래프이다.
도 9는 본 발명에 따른 PDT의 실시형태를 도시한 개략도이다.
도 10은 본 발명에 따른 8-암(arm)-PEG- 아민(8PEGA)의 예시적인 실시형태를 예시하는 그래프이다.
도 11 내지 18은 본 발명에 따른 실시형태의 성능 및 특성을 보여주는 차트이다.
도 19는 본 발명에 따라 8PEGA-Ce6 실험에서 사용된 것과 동일한 OD에서 PAAm-Ce6 NP의 K-값 플롯의 실시형태를 보여주는 그래프이다.
도 20은 본 발명에 따른 8PEGA상의 Ce6의 실시형태의 스펙트럼으로서, 표적화 유무에 관계없이 Ce6을 8PEGA에 첨가해도 응집을 일으키지 않고 형광이 유지되며 여전히 ROS를 생성함을 보여준다.
도 21은 인가된 구배(b-값)의 함수로서 8PEGA로부터의 신호 변화를 보여주는 그래프의 실시형태이며; 기울기는 본 발명에 따른 확산 상수 D를 제공한다.
도 22는 근세포에서 CTP 표적화된 8PEGA-Ce6의 선택적 흡수를 보여주는 이미지이다. Ce6 형광은 근세포에서만 발견된다.
도 23은 본 발명에 따른 8PEGA의 실시형태의 TEM이다. 8PEGA는 히드로겔이고 TEM은 측정을 위해 진공을 사용하므로 격자는 전위로 젖어있는 동안 삽입되지만 플레이트의 표면 장력으로 인해 일부 8PEGA가 수화된 형태로 남아있을 가능성이 있다. 평균 범위는 약 10 내지 12 nm이다.
도 24는 본 발명에 따라 표적화된 8PEGA NP를 가진 PDT의 실시형태가 혈관계에 손상을 일으키지 않음을 보여주는 이미지이다. PI 형광은 근세포에서만 발생한다.
도 25는 본 발명에 따른 Ce6를 사용한 비-표적화된 PDT의 실시형태를 보여주는 이미지이다. PI 형광은 더 이상 근세포에 국한되지 않고 관상 동맥 혈관 세포에 나타나 혈관계 손상을 나타낸다.
도 26은 본 발명에 따른 MRI 및 MRI를 사용하기 위한 절차의 실시형태의 개략적인 사시도이다.
일반적으로, 본 발명은 나노구조물, 이러한 나노구조물의 제조 방법, 및 이러한 나노구조물에 대한 치료, 영상화, 진단, 치료진단적 및 기타 적용에 관한 것이다.
일반적으로, 실시형태에서, 나노구조물(NC)은 치료적 플랫폼, 및 영상화제로서 동시에 기능할 수 있다. 이러한 나노구조물은 또한 다른 활성화 구성성분을 가질 수 있으며, 예를 들어 특정 세포 유형, 특정 구조를 선택하기 위한 표적화제와 같은 다른 능력을 제공하거나 세포막 투과성과 같은 특정 막 관련 특성을 가질 수 있다.
일반적으로, 바람직한 실시형태는 바람직한 치료, 영상화, 진단, 치료진단적, 및 이러한 특성의 조합 및 변형이 과다한 다기능, 초소형, 나노플랫폼이다. 이러한 바람직한 실시형태는 광감각제 단독 및 다른 PDT 나노구조물에 비해 우수한 광역학적 효능을 갖는다. 활용 측면에서, 이러한 바람직한 나노구조물은 암세포에 대한 이의 적용에서 우수한 광역학적 효능을 갖는다. 이의 우수한 효능 외에, 이러한 NC는 비독성이고, MRI에 대한 분자 영상화제이다.
8-암 폴리에틸렌 글리콜 아민(8PEGA)은 다양한 변형을 허용하는 생체적합성 중합체이다. 전형적으로, 아민기는 광역학적 요법(PDT)에서 다양한 광감각제(PS)의 공유 고정에 사용될 수 있다. 또한, 실시형태에서, 중합체의 다른 암은 이어서 말레이미드기로 전환되어, 다양한 시스테인 종결된 펩티드의 부착을 허용할 수 있다. 예컨대, 펩티드는 추가의 아미노산(시스테인)이 부착되어 유리 티올을 수득한 다음 이용될 수 있다. 이러한 실시형태에서, 펩티드 +1 아미노산이 존재하며, 여기서 펩티드 기능은 유지된다. 몇 가지 말하자면, 예를 들어, 암, 심장 부정맥, 및 맥락막 혈관 신생과 같은 숙주의 생물학적 환경에서 PDT를 표적화하고 적용하기 위해 유연하게 조정될 수 있는 NC로서의 8PEGA의 실시형태. 8PEGA는 또한 MRI를 위한 긴 T2 수명을 가지고 있으며, 예를 들어 높은 b-값에서 기존의 확산 가중치 영상화(DWI: diffusion weight imaging)를 통해 생체 내에서 영상화제로 사용되며, 여기서 물 신호가 여러 방법의 조합에 의해 충분히 억제되어 깨끗하고 직접적인 영상을 수득할 수 있다.
현재의 NC, 시스템 및 방법은 이전의 치료법, 영상화 시스템, 이전의 나노입자(NP), 및 치료에 비해 다수의 개선을 제공한다. 이러한 개선은 예를 들어 다음을 포함한다: 최적화된 반응성 산소 종(ROS) 생산; 임의의 원하는 생물학적 영역의 침투를 가능케 하는 작은 크기; 다양한 생물학적 시스템 표적화 및 NC 축적을 가능케 하는 변형 용이성; 8PEGA의 작은 크기 및 생분해성으로 인한 생물학적 제거율 증가; 및 기존 방법에 비해 개선된 DWI.
NMR 영상화 또는 조영제로 사용하기 위한 실시형태에서, NC의 실시형태에서, 전형적으로 108 내지 109 s/m2 사이인 b 값이 DWI에서 사용되지만, 8PEGA의 긴 T2 수명과 높은 MW(40 KDa)는 b = 1010 s/m2까지의 사용을 가능케 하여, 물/지방 신호를 충분히 억제하여, 8PEGA만 남긴다. 추가로, DWI에서 8PEGA의 사용은 지속적으로 안전 문제를 제기하는 중금속 원자 없이 MRI의 사용을 가능케 한다.
이러한 나노구조물은 다음과 같은 약물 전달 시스템으로 제형화될 수 있다: 혈류로 직접 전달, 예컨대 사전 포장된 IV 제형 또는 일회용 사전 포장된 주사기; 섭취, 예컨대 알약, 정제, 또는 액상; 흡입, 예컨대 정량 흡입기 또는 분무기를 통한 것; 국소적으로, 예컨대 경피 전달을 위한 연고 또는 액체 또는 주입 가스의 일부로서 생체 내. 이러한 약물 전달 시스템은 1, 2, 3 또는 그 이상의 상이한 나노구조물을 가질 수 있으며, 각각은 특별히 설계되거나 특별히 목적이 있다. 이러한 약물 전달 시스템은 또한 나노구조물이 아니며, 예를 들어, 추가 영상화 및 치료제로 기능하는 다른 첨가제 및 활성제를 포함할 수 있다.
일반적으로, 첨가제는 다음과 같은 방식으로 나노구조물 백본, 예컨대 나노입자와 결합될 수 있다: 화학 결합(예컨대, 공유, 이온, 반 데르 발스); 입체 장애 또는 백본 내부 또는 백본에 의한 물리적 포획을 통한 것과 같이 입체적으로 또는 기계적으로; 이들은 백본 재료; 및 이들의 조합 및 변형을 구성하는 분자 구조의 일부가 될 수 있다. 첨가제는 나노입자의 형성 전에, 나노입자의 형성 동안, 나노입자의 형성 후, 및 이들의 조합 및 변형에 첨가될 수 있다.
다수의 영상화 염료 또는 제제, 및 기타 진단 도구는 특히 인간과 함께 사용하는 데 바람직하지 않은 것으로 보일 수 있는 재료를 사용해 왔다. 이러한 염료 및 제제는 금속 기반일 수 있고, 금속, 금속 산화물, 또는 금속 화합물 또는 착화물, 예컨대 철, 철-백금, 마그네슘 및 망간을 사용하거나 포함한다. MRI 영상화제는 가돌리늄 기반 재료를 사용한다.
중금속이 없는 본 나노구조물의 실시형태, 예컨대 상기 나노구조물, 나노구조물을 위한 약물 전달 시스템 및 둘 모두는 약 10 ppm 미만의 중금속, 약 1 ppm 미만의 중금속, 및 약 0.1 ppm 미만의 중금속, 및 0 중금속을 함유한다. 중금속은 티타늄 및 모든 중금속을 포함한다. 이러한 중금속이 없는 나노구조물은 영상화 및 진단제로서 기능할 수 있다. 이러한 영상화 나노구조물의 실시형태는 가돌리늄이 없고, 예컨대 0.1 ppm 미만, 바람직하게는 0 가돌리늄인 MRI 영상화제를 제공한다. 중금속이 없는 NP, NC, 약물 전달 시스템 및 이들의 조합 및 변형은 MRI에 의해 직접적으로 영상화될 수 있으므로 직접 MRI 영상화제, 진단제 및 둘 모두로서 기능한다.
표적 가능한 NC의 실시형태는 MR 분자 영상화제뿐만 아니라, 광역학적 요법(PDT)을 위한 치료적 플랫폼으로서 동시에 작용할 수 있다. 실시형태에서, 이러한 나노구조물은 중금속 원자, 특히 가돌리늄이 없다.
실시형태에서, 부착된 클로린 e6(Ce6) PS, 및 CTP-cys(심장 표적화 펩티드) 표적화 모이어티를 가진 초소형 8-암 폴리에틸렌 글리콜 아민(8PEGA) NC는 심근세포의 세포-특이적 파괴를 위해 표적화 펩티드를 사용하는 경우, 살아있는 랫트 및 양 심장 각각의 생체 내 및 생체 외에서 심장 부정맥의 PDT에 대한 치료적 결과를 산출한다. 이러한 NC는 문어 형상(octopus-like)의 초소형이며 고도로 생체적합성 중합체인, 8-암 폴리에틸렌 글리콜 아민(8PEGA)이다. 아민 종결된 암은 조류(algae) 유래 PS, 클로린 e6(Ce6), 및 심근세포에 대한 표적화 모이어티를 고정시킨다. 이러한 나노구조물은 MRI 영상화제로서 사용될 수 있고 심장 질환 및 다른 질환을 위한 MRI 치료진단으로서 사용될 수 있다.
실시형태에서, 이러한 나노구조물은 암에 PDT를 제공하도록 구성될 수 있다. 이러한 목적을 위해, 표적화 펩티드는 F3-cys일 수 있다. 8PEGA-Ce6 NC는 기존 Ce6 캡슐화된 폴리아크릴아미드(PAAm: Polyacrylamide) NC에 비해 우수한 반응성 산소 종(ROS) 생산을 제공한다. 이는 무엇보다도 일부 적용에서 PAAm NC와 비교할 때 8PEGA NC에 대한 PDT의 이점을 제공한다.
8PEGA-Ce6 NC에 의해 입증된 우수한 반응성 산소 종은 Ce6이 일중항(singlet) 산소를 생산하기 때문에 일중항 산소이다. 생산은 ROS가 NC의 매트릭스를 항상 벗어나지 않을 수 있는 NP 캡슐화와 비교하여, 생산되는 것의 더 많은 것이 세포에서 더 널리 이용 가능하여 산화 스트레스에 효과적으로 사용될 수 있도록 우수한 것으로 정의된다. 또한, 8PEGA 또는 PAA와 같은 NC는 자유 PS가 그렇게 할 수 있는 PS의 응집을 방지하는 효과적인 도구 역할을 하여 여기 상태의 켄칭으로 인해 생산을 중단시킨다. 이러한 비교에 있어서, Ce6-8PEGA 및Ce6-PAA의 k-값을 동일한 광학 밀도에서 비교하는 것이 바람직하다.
8PEGA-Ce6 NC는 또한 세포와 호환되며 표적 펩티드의 선택의 부착성을 위한 화학적 유연성을 제공한다. 마지막으로, 이러한 표지가 없는 8PEGA NC는 물 신호를 억제하기 위해 큰 확산 자기장 구배가 있는 표준 스핀-에코 영상화 시퀀스를 사용하여, MRI에 의해 직접적이고 선택적으로 영상화될 수 있다. 특히, 이러한 NC는 이의 초소형 크기로 인해 생체 내 침투 및 생체-제거가 향상되었다.
일반적으로, 임의의 펩티드는 PEG 나노입자에 부착될 수 있다는 이론이 있고, 시스테인 종결된 모든 펩티드는 8PEGA에 부착될 수 있다고 믿고 있다. F3-cys 펩티드는 특이적 암 표적화 펩티드이다. 실시형태에서, 8PEGA-Ce6을 암에 적용하기 위해 사용되었다. HeLa 세포는 강력한 특성과 F3-cys 펩티드의 특이적 표적인 뉴클레올린의 공지된 과발현으로 인해 관심 모델 시스템으로서 선택되었다. 8PEGA의 작은 크기, 균일성, 및 생체적합성의 장점 외에도, 본 발명에 의해 추가로 개발된 장점은 주어진 PS로 최적화된 ROS를 생산하고, MRI를 위한 분자 영상화제로서 사용되는 것을 포함한다. 예를 들어, 폴리아크릴아미드 히드로겔 나노입자(PAAm NP)와 같은 표준 모델 매트릭스 내부에 캡슐화될 때와 달리, PS Ce6과 산소화된 환경의 직접적인 접촉으로 인해, 이러한 NC에 대한 최적화된 ROS 생산이 예측된다는 이론이 있다. 이러한 방식으로, 실시형태에서, 이전 NC와 비교할 때 표적화에서 증가된 ROS 생산 효능, 생체적합성, 및 유연성을 가진 나노구조물이 제공된다.
본 발명의 실시형태에서, 8PEGA 기반 나노입자, 및 나노구조물은 영상화 적용, 진단 적용, 치료진단 적용, 및 이들의 조합 및 변형을 위해 MRI 영상화제로서 사용된다. 이러한 8PEGA MRI 영상화제는 다른 치료, 영상화제나 조영제, 및 적용과 함께 사용될 수 있다. 고분자량(예컨대 40 kDa), 8PEGA 군의 실시형태의 유연한 사슬 역학 및 이의 특이적 구조가 부분적으로 본 발명의 고도로 선택적인 분자 영상화 MRI 제제에 유리한 조건을 생성한다는 이론이 있다. 또한, 8PEGA의 느린 확산 상수 및 횡 스핀 완화율이 결합되어 주변 물 신호를 억제하는 확산 가중치 MRI 시퀀스를 허용하여 8PEGA의 깨끗한 영상을 제공한다. 본 발명의 8PEGA MRI 영상화제 및 8PEGA MRI 영상화 적용의 실시형태에서, 8PEGA MR 신호는 선택적으로 검출되고 그 농도에 비례한다. 8PEGA MRI 영상화제 및 적용은 현재의 중금속 원자 MRI 영상화제에 비해 특히 생체적합성이라는 점에서 현재 MRI 영상화제 및 적용에 비해 우수하다. 또한, 8PEGA MRI 영상화제는 또한 치료진단제이거나 현재의 MRI 영상화제 및 적용에 비해 부가된 기능성 및 이점을 제공하는 치료진단적 능력을 갖는다.
8PEGA에 부착되었을 때와 폴리아크릴아미드(PAAm)에 캡슐화되었을 때의 Ce6의 ROS 생성을 비교하여 두 개의 경쟁 나노구조가 도 1에 도시되어있다. 도 1은 Ce6(102)가 파장 660 nm의 빛에 노출되었을 때 분자 산소(3O2)의 삼중항 기저 상태(101)로부터 ROS(100), 여기된 일중항 상태(1O2)(100)의 생성을 보여준다. Ce6(102)이 PAAm NC(Ce6/PAAm NP)(105) 내에 캡슐화된 경우 ROS(100)의 생성, 및 ROS의 경로는 Ce6(102)이 8PEGA NC(8PEGA-Ce6)(106)의 일부인 경우 ROS(100)의 생성과 비교된다.
도 2는 PAAm 캡슐화된 Ce6의 상대적 ROS 생성의 "k-값" 플롯의 실시형태의 그래프이다. k-값은 ADPA 형광의 1차 붕괴에 의해 측정된 바와 같이 Ce6에 의해 ROS가 생성되는 운동 속도의 척도이다. 비교 가능한 k-값을 생성하기 위해, PAAm-Ce6 NP의 광학 밀도(OD)를 UV/VIS에 의해 660 nm에서 8PEGA-Ce6의 OD(0.12)로 조정했다. 표 1은 문헌 OD에 대해 정규화되었을 때 두 NC에 대한 상대 결과를 보여준다.
Figure pct00001
도 23에 도시된 바와 같이 NC 8PEGA의 직경은 Stokes-Einstein 근사치에 의해 그리고 TE에 의해 계산된다.
도 3a는 표적화된 NC인 F3-8PEGA-Ce6 접합체(301) 및 비-표적화된 NC인 8PEGA-Ce6 접합체(302)의 흡수 스펙트럼을 나타낸다. 660 nm의 특징적인 피크는 두 NC 모두에 대해 보존된다.
도 3b는 F3-cys에 의한 8PEGA-Ce6의 화학적 변형을 보여주는 예시를 제공한다. 따라서, 8PEGA(311) 및 Ce6(312)을 갖는 NC(310)는 BiPEG, 예를 들어 (313)으로 변형되어 NC(310a)를 제공하고, 그 다음 F3-cys, 예를 들어 (314)로 변형되어 표적화된 NC(310b)를 제공한다.
이 F3-cys-8PEGA-Ce6 NC의 생체적합성을 시험하는 방법으로 유세포 분석을 사용하여 심각한 독성을 시험하였다. 세포는 200 ug/mL F3-8PEGA-Ce6의 농도에서 시험되었으며; 대조군 세포는 F3-8PEGA-Ce6 NC가 추가되지 않은 데이터 군을 나타낸다. 도 4로부터 알 수 있듯이, 유의한 독성이 관찰되지 않았다.
여기 광에서 단순한 세포 스트레스의 가능성을 제거하기 위한 대조군 시험으로서, F3-8PEGA-Ce6이 없는 HeLa 세포를 플레이팅하고 NC-처리된 세포(50 mW/cm2, 10분)에 대해 PDT에서 사용된 것과 동일한 시간과 전력으로 조명하였다. 조명 후(도 5a, 도 5b에 도시된 바와 같음) 세포 형태에는 미미한 변화가 있고, 세포질 염색 칼세인 AM 형광 계수에는 변화가 없었으며, 막 출혈의 징후(아폽토시스의 특징)가 없다.
F3-8PEGA-Ce6으로 세포를 광-조사한 후 칼세인 AM 형광에서 현저한 차이가 나타났다(도 5c, 도 5d에 도시된 바와 같음). 조명 이전에는 관찰 가능한 프로피듐 요오드화(PI) 형광이 없었지만(데이터는 나타내지 않음), 조명 후 세포 막 불투과성 PI는 세포의 핵을 염색하는 것으로 볼 수 있다(도 5e에 도시된 바와 같음).
8PEGA의 병진 확산 상수 D 및 이완 시간 T1 및 T2는 25 및 35℃에서 측정되었다 (표 2, 도 21에 도시됨). 8PEGA(비-변형) 용액의 영상을 수집하여 물/지방이 억제되었을 때(도 6에 도시된 바와 같음) 깨끗한 영상의 생성과 이들의 농도 의존적 반응(도 7에 도시된 바와 같음)을 입증했다. 따라서, 도 6의 영상(601)은 b = 108 s/m2로 수득된 8PEGA를 나타내고 영상(602)은 b = 1010 s/m2로 수득된 8PEGA를 보여준다. 110 M 물 양성자 신호는 영상(601)에서 볼 수 있는 기존의 MR 영상이 우세하지만; b = 1010 s/m2에서 영상화에 의해 10-10배로 억제된다. 막대(603)는 영상(602)에서 검출된 8PEGA의 농도와 관련된다. 이러한 반응은 물 억제 기술로 수집된 영상과 일치하여(도 6b에 도시된 바와 같음), 농도에 따라 선형으로 보일 수 있다(도 6의 B에 도시됨). 시험된 농도는 H2O에서 0, 2.38, 4.77, 9.54, 및 19.08 mg/mL 8PEGA이었다. 또한 Stokes-Einstein 방정식:
Figure pct00002
을 사용하여 8PEGA의 크기를 계산하여 TEM 결과를 검증하며, 직경은 35℃에서 10.96 nm로 계산되어, 13개의 측정된 NC에서 확인된 약 10 내지 12 nm 범위와 일치하였다(도 23에 도시된 바와 같음).
Figure pct00003
Ce6-8PEGA는 다른 요인들 중에서 8PEGA에서 Ce6 군이 세포의 산소화된 환경과 직접 접촉한다는 점을 기반으로 하여 히드로겔 NP와 비교하여 더욱 효율적인 ROS 생산 플랫폼이다. 이러한 형상이 도 1에 도시되어 있다. 따라서, 산소는 PS(102)를 캡슐화하는 PAAm NP 매트릭스(105) 내로 확산될 필요가 없으며 ROS(101)는 무엇보다도 매트릭스와의 반응으로 인해 확산되거나 손실될 필요가 없다. 이러한 특징은 동일한 OD로 조정했을 때 Ce6-8PEGA의 k-값이 Ce6 캡슐화된 PAAm NP보다 약 50% 더 크다는 것을 보여줌으로써 K-값 시험에 의해 확인된다(표 1).
8PEGA가 별 모양의 중합체이기 때문에, 구형 재료 형상을 가정하는 Stokes-Einstein 방정식에 의한 크기 측정이 바람직하다. 병진 확산 계수 D(표 2, 도 21)를 측정한 후, 35℃에서 중합체의 크기가 약 11 nm인 것으로 확인되었다. 2차 분석 방법으로서, 8PEGA를 우라닐 아세테이트로 염색하고 TEM을 사용하여 시각화하였다(도 23에 도시됨). 원 2301(13.1 nm), 2302(11.3 nm), 2303(10.4 nm), 2304(12.5 nm), 2305(10.8 nm), 2306(12.2 nm), 2307(10.1 nm), 2308(11.5 nm), 2309(11.9 nm), 2310(10.8 nm), 2311(10.9 nm), 2312(11.6 nm), 2313(12.5 nm) 내에서 선택된 13개의 점의 크기는 Stokes-Einstein 방정식 측정과 잘 일치하는 약 10 내지 12 nm인 것으로 밝혀졌다.
나노입자의 표면을 PEG화 하는 것과는 달리, 본 발명의 실시형태에서, 나노입자 백본 그 자체는 주로 PEG, 예컨대 적어도 약 85% PEG, 적어도 90% PEG, 적어도 95% PEG, 적어도 99% PEG, 적어도 99.9% PEG, 바람직하게는 100% PEG로 구성된다. 따라서, 표적화 벡터는 생체 내 적용뿐만 아니라 시험관 내 세포 흡수를 가속화하는데 도움이 된다. 암 표적화의 경우, 예컨대, 뉴클레올린 표적화된 펩티드 F3-cys가 8PEGA-Ce6 상에 이식을 위해 선택되었다. 특히, F3-cys의 부착 후, Ce6 분광학적 특징은 도 3b에 도시된 바와 같이 거의 영향을 받지 않으며, 이는 펩티드를 전환할 때(심장 근세포를 표적화하는 CTP에서 암 세포를 표적화하는 F3으로) 광물리학적 특성의 보존을 나타낸다. Ce6 흡수의 경미한 감소는 변형 전후와 비교했을 때 0.1 mg/mL에서 확인되었지만, BiPEG 및 F3-cys가 NC의 MW를 증가시킬 것이기 때문에 예상된다. BiPEG는 2암 이중-기능성 PEG(예컨대 2 kDa)이다. BiPEG의 실시형태는 한쪽 끝에 NHS 에스터를 갖고 다른 쪽 끝에 말레이미드를 가질 수 있다. 실시형태에서, 이는 부착될 펩티드에 대해 아민을 말레이미드로 전환시키는 기능을 한다.
본 NC의 실시형태의 중요한 양태는 이의 생체적합성이다. 실시형태에서, 전체 구축물은 PEG, Ce6, 및 귀소 펩티드 F3-cys로 구성된다. PEG는 고도로 생체적합성인 물질이며 F3-cys는 시험관 내 또는 생체 내에서 독성 영향이 없는 우수한 표적화제이다. 조류 유래 Ce6은 PDT제의 예이다. 이러한 3가지 모이어티를 가진 NC의 실시형태는 유의한 생체적합성 문제를 나타내지 않으며, 예컨대 NC는 생체적합성이다. 이는 도 4에 도시된 바와 같이 혈구측정 결과에 의해 시험관 내에서 확인된다.
F3-8PEGA-Ce6로 PDT 시험을 시작하기 전에, 선택한 레이저 조건(10분 동안 50 mW/cm2)을 시험하여 조명이 심각한 세포 스트레스의 원인이 아닌지 확인하였다. 조명 전(도 5a에 도시됨) 및 후(도 5b에 도시됨) 세포의 칼세인 AM 영상은 형태의 변화가 거의 없고 아폽토시스 징후가 없음을 보여주었다. 따라서, 광-조명 공급원은 세포에 심각한 스트레스를 부여하지 않는다. 이어서 PDT는 200 ug/mL의 농도로 F3-8PEGA-Ce6의 존재 하에 개시되었다(도 5c/도 5d/도 5e에 도시됨). PDT 후 칼세인 AM 형광이 크게 감소하여, 세포질 함량의 손실을 나타내었으며, 이는 세포 막이 파열된 조건에서만 발생하는 사건이다. 세포 불투과성 염료 PI로 핵을 염색하여 막의 파열을 나타냈다(도 5e에 도시됨). 도 4의 세포-적합성과 관련하여 PDT 시험 결과를 취하면, 세포의 사멸이 PDT-매개됨이 분명하다.
보다 효율적인 PDT(50% 더 큰 k-값) 외에도, 8PEGA NC, 요법 및 치료진단적 용도는 다음의 예를 포함하여 다수의 추가 이점을 제공한다고 여겨진다: (1) NC의 작은 크기는 더 큰 NP가 제공하지 않는 특징인, 신체에서 신속한 신장 제거 가능성을 제공한다; 그리고 (2) 종양을 투과할 수 있도록 다공성/누출 혈관계를 필요로 하는 기존의 더 큰 NP와 달리, 아직 혈관신생을 겪지 않은 종양 영역을 관통하는 능력.
본 발명 이전에, PEG는 이종핵 MR 방법을 사용하여 생체 내에서 선택적으로 영상화되기 전에 13C 태그가 필요하다고 여겨져 왔다. 본 PEG NP 및 NC의 실시형태는 NMR, MRI, 영상화제, 조영제, 및 이들의 조합 및 변형을 가능케 하는 놀라운 능력을 나타낸다. PEG 실시형태에서, 특히, 폴리에틸렌 옥시드 사슬의 본질적인 유연성 및 8PEGA의 느린 병진 확산은 1HNMR을 사용하여 8PEGA 양성자의 선택적 MR 영상화를 위한 이용 가능한 물리적 및 동적 조건 세트를 생성한다. 특히, 약 0.1 ns의 상관 시간을 가진 8PEGA의 빠른 사슬 운동은 양성자 쌍극자-쌍극자 상호작용의 충분한 평균을 제공하여, 긴 핵 스핀 횡방향 이완 시간 T2를 생성하며, 이는 각각 25 및 35℃에서 586 및 769 ms로 측정되었다. 신속한 내부 사슬 역학과 달리, 분자의 고분자량은 물 분자 보다 2자리수 느린 병진 확산 상수를 생성한다. 따라서, 물 신호는 큰 확산 구배에 의해 효과적으로 억제될 수 있으므로 에틸렌 옥시드 신호만이 긴 T2 시간과 8PEGA인 경우 느린 확산의 조합으로 인해 남게 된다. 특히, MR 신호 강도는 다음과 같이 감소한다:
Figure pct00004
상기 식에서 b 값은 자기장 구배 크기 및 지속시간에 의해 결정되며, D는 물 또는 8PEGA의 병진 확산 상수이고, TE는 에코 시간이고, T2는 횡방향 스핀 이완 시간이다. 또한, 에틸렌 옥시드 단량체의 대칭은 4개의 양성자 모두에 대해 단일 화학 이동을 일으키고 각각 40 kDa 중합체 분자는 약 3,600개의 양성자를 지니므로, NMR 또는 MRI 신호의 큰 몰 증폭을 생성한다. 높은 b 값과 긴 TE 시간을 가진 확산 가중, 스핀-에코 MR 영상화 실험을 수행하여, 빠른 확산으로 인한 물 신호, 및 짧은 T2 시간으로 인한 지방 신호를 효과적으로 억제하고 8PEGA 신호를 선택적으로 영상화한다. 생체 내에서, 높은 b 값에서 물 신호 강도의 작은 부분은 세포에서 물 분자의 제한된 확산으로 인해 남아있지만, 이러한 신호는 전통적인 1HNMR에서 물과 에틸렌 글리콜 양성자 사이의 약 1 ppm 차이로 인해 8PEGA 신호로부터 제거되거나 구별될 수 있다. 나노입자에 따라, 양성자의 수는 3,600초과 또는 미만일 수 있고, 약 2,000 내지 약 30,000, 약 4,000 초과, 약 5,000 초과, 약 2,000 내지 약 10,000, 약 3,000 내지 약 7,000 및 이러한 범위의 모든 값, 및 더 많거나 더 적은 양일 수 있음에 유의한다.
따라서, 예컨대 도 6에서 볼 수 있듯이, 8PEGA는 전술된 억제 기술과 결합할 때 MR 영상화제로서 매우 잘 기능한다. 이는 건강 문제, 안전 문제, 및 특정 환자 군에 대한 현재 건강 위험에 대한 주체인, 가돌리늄 염, 또는 킬레이트와 같이 덜 유리하거나, 문제가 있거나, 위험한 물질을 가지고 있는 다른 MRI 조영제를 대체하거나 제거할 수 있는 상당한 진보와 능력을 제공한다. 적용된 억제 기술이 없는 영상(601) 및 있는 영상(602)에는 분명한 차이가 있다. 8PEGA 영상화 신호는 또한 이의 농도와 선형적이다(도 7에 도시됨). 상기 영상화제 및 영상화 기술의 실시형태를 적용하면, 8PEGA의 깨끗하고 잘-한정된 영상이 복구되어, 생체 내 영상화제로서의 생존가능성을 분명히 보여준다. 적절한 보정 하에서, 이는 생물학적 조직(예컨대, 종양 구역 대 여과 기관)에서 8PEGA의 정량화의 가능을 포함하여, 정확한 영상화 및 진단을 제공한다.
따라서, 8PEGA-Ce6 NC는 NC에 다음의 특징을 하나 이상, 바람직하게는 모두 갖도록 제공한다: 우수한 반응성 산소 종, MRI 영상화 능력, 중금속 없음, 및 암 표적화제를 가질 수 있음.
영상화제이자 PDT 제제인 표적화된 나노구조물을 갖는 능력은 현재까지 전례가 없는 병태의 치료에 효능을 창출한다. 이러한 표적화된 치료진단적 나노구조물은 표적화제를 사용하여 특이적 구조, 예컨대 세포 유형, 종양 등을 표적화한다. 이러한 방식으로 표적화된 치료진단적 나노구조물은 표적화제의 작용에 의해 표적화된 구조와 선택적으로 연관될 것이다. 표적화제 단독은 나노구조물의 약 80%, 약 90% 및 약 95%가 표적화된 구조와 연관되어 우수한 특이성을 제공할 수 있다. 그러나, 표적화제는 표적화된 구조의 절대적인 특이성을 제공할 수 없다. 따라서, 활성화 에너지가 전달되는 경우, 표적 구조를 영상화할 수 있는 것이 바람직하며, 이에 따라 활성화 에너지, 즉 빛의 전달을 위한 정밀한 패턴을 결정하는 것이 바람직하다.
이러한 방식으로, 치료진단적 방법의 실시형태에서, 표적화된 치료진단적 나노구조물은 신체로 전달되어, 혈액에 의해 운반되고, 표적화된 구조, 예컨대 종양과 연관된다. 종양의 MRI 영상이 촬영되고, 이러한 영상은 나노구조물의 존재에 의해 강화된다. 신체의 표적화된 구조의 위치 및 형태가 수득되고 저장된다. 후속 영상화 기술, 예컨대 광 음향 영상화, 모델링 기법, 예컨대 컴퓨터 향상 및 초기 MRI 영상 렌더링, 및 둘 모두가 신체의 표적화된 구조에 대한 매우 정확한 영상 및 위치 데이터를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이어서 이러한 영상 및 위치 데이터를 기반으로 조명 패턴이 개발될 수 있다. 조명 패턴은 사전 결정되고, 맞춤화될 수 있으며 표적화된 구조에 대해 특이적이다.
실시형태에서, 이러한 사전 결정된 조명 패턴은 작은 직경 레이저 스폿일 수 있다. 이러한 패턴으로 전달되는 레이저 빔의 에너지는 PS를 활성화하여 ROS를 생성하기에 충분하다. 그러나, 레이저 빔에 의해 전달된 에너지는 레이저 유도 조직의 광학적 분해(LIOB: laser induce optical break down of tissue)가 발생하는 임계 값 미만이며, 바람직하게는 조직이 가열되는 임계 값 미만이다. 실시형태에서, 레이저 빔의 특성, 예컨대 파장, 초점 거리, 스캔 시간 또는 지속 시간, 전력, 펄스, 펄스 길이 또는 연속, 및 스폿 크기는 PS가 매우 정확한 위치(z, x 및 y 좌표)에서 활성화되어 세포 및 세포 이하 수준까지 감소하고; 레이저와 직접적인 상호작용으로 인해 표적화된 구조의 조직이 거의 또는 전혀 손상이 되지 않도록 결정된다. 이러한 방식으로 PS는 세포 정밀도로 활성화될 수 있으며, 해당 구조에 인접한 세포에 손상을 주지 않고 표적화된 구조에 ROS를 제공할 수 있다. (ROS는 생성된 후 매우 제한된 지속기간을 가지며, 인접한 내포 내 또는 그 근처에서 생성되는 경우 비-인접 세포로 이동하거나 이에 영향을 미치지 않을 가능성이 높은 것으로 이해된다).
나노구조물의 실시형태에서, 공간적(레이저 집중) 및 생물학적(세포 선택적) 선택성 둘 모두는 표적 항체 또는 펩티드와 함께 나노구조물(NC)을 사용함으로써 달성되며, 이는 또한 PDT 처리를 종양 표면 아래로 확장한다. 일반적으로 NC를 사용하면 면역계를 우회하기 위해 생물 환경으로부터 PS를 보호할 수 있고 그 반대도 가능하다.
상대적으로 작은 크기(20 nm 미만)의 8PEGA 유래 NC는 근육과 같은 매우 조밀한 조직을 포함하는 표적 조직에 침투하여 특이적 세포 유형, 예컨대 근세포에 선택적으로 축적되므로, 약한 근적외선 조명 하에 이들의 광역학적 파괴를 가능케 한다. 암 치료 시, 이러한 NC의 작은 크기는 단독으로, 또는 표적화 모이어티와 함께 종양에 대해 세포-선택적인 종양 열망적 NC를 제공할 것이다.
임의의 유형의 활성 동적 치료 모이어티는 나노구조물을 형성하기 위해 나노입자 및 바람직하게는 표적화제; 및 예컨대 치료진단적 나노구조물과 함께 사용될 수 있다. 실시형태에서, 현재 공지된, 또는 이후에 개발된, 임의의 동적 요법제는 PEG, PEG 기반 물질, 및 이들의 조합 및 변형으로 적어도 부분적으로 형성된 나노입자와 조합된다. 실시형태에서, 현재 공지된, 또는 이후에 개발된, 임의의 동적 요법제는 단면적이 50 nm 미만이고, 실시형태가 40 nm 미만인 나노입자와 조합된다. 실시형태에서, 현재 공지된, 또는 이후에 개발된, 임의의 동적 요법제는 약 5 nm 내지 약 20 nm, 약 5 nm 내지 약 15 nm, 약 10 nm 내지 약 15 nm, 및 약 9 nm 내지 약 12 nm의 단면적을 가진 나노입자와 조합된다. 실시형태에서, 현재 공지된, 또는 이후에 개발된, 임의의 동적 요법제는 50 nm 미만, 40 nm 미만, 30 nm 미만, 20 nm 미만, 15 nm 미만, 및 10 nm 미만의 단면적을 가진 나노입자와 조합된다. 실시형태에서, 현재 공지된, 또는 이후에 개발된, 임의의 동적 요법제는 8PEGA인 나노입자와 조합된다. 나노구조물의 이러한 모든 실시형태는 또한 표적화 능력 또는 특징, 예컨대 종양 열망, 및 이들의 조합 및 변형을 가진 표적화제를 가질 수 있다.
나노구조에 대한 상기 실시형태의 조합 및 변형, 및 본 명세서에서 교시된 다른 것들은 의약품으로서 또는 의약품의 일부로서 사용된다. 이러한 의약품의 실시형태에서, 나노구조물은 균일한 크기, 및 매우 균일한 크기를 갖는다. 따라서, 실시형태에서, 의약품, 특히 대상체 또는 환자(동물, 포유류, 또는 인간)와 함께 사용하기 위한 의약품의 특정 투여량에서 나노구조물은 약 1% 이하, 약 5% 이하, 약 10% 이하의 크기 차이를 가진 입자를 가지고 있다. 실시형태에서, 의약품 중의 나노구조물은 다음의 입자 크기 분포를 가질 수 있다: D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5 (여기서 n = 5 내지 25 nm); D10 = n - 10, D50 = n, D90 = x + 10 (여기서 n = 5 내지 25 nm); 약 10 nm의 D50, 약 15 nm의 D50, 약 20 nm의 D50, 약 50 nm의 D50, 약 8 nm 내지 약 15 nm의 D50, 및 더 큰 값 및 더 작은 값. (도 8은 D10, D50 및 D90 값에 대한 계산, 및 분포를 보여준다. D50은 의약품의 누적량의 50%를 차지하는 나노구조물의 크기를 나타내는 값이다. D-90은 의약품의 누적량의 90%를 차지하는 나노구조물의 크기를 나타낸다. D-10은 의약품의 누적량의 10%를 차지하는 나노구조물의 크기를 나타내는 값이다.). 실시형태에서, 의약품은 약 10 nm 이하, 약 5 nm 이하, 약 1 nm 이하의 입자 크기 분포를 가진 나노구조물을 가지고 있다.
일반적으로, PDT의 경우 광원의 파장은 반응성 산소 종을 생성하기 위해 광감각제를 여기하는데 적합해야 한다. PDT를 통해 생성된 이러한 반응성 산소 종은 자유 라디칼 또는 일중항 산소로 공지된 산소의 고도로 반응성인 상태이다. 전형적으로, 실시형태에서, 광감각제는 분자 산소(3O2)의 삼중항 기저 상태를 이의 여기된 일중항 상태(1O2)로 여기시키는데 필요한 최소 에너지인 적합한 에너지의 삼중항 상태(약 0.95 eV)를 생성할 수 있다. 생성될 수 있는 다른 세포독성 종은 예컨대 다른 ROS, 유형 1 ROS, 히드록실 라디칼, 퍼독시드, 및 수퍼옥시드 음이온을 포함한다.
전형적으로, PDT가 표적 조직의 파괴, 예를 들어 종양 파괴를 매개하는 세 가지 기작이 있으며, 실시형태에서 상호 관련될 수 있다: 종양 세포에 대한 직접적인 세포독성 효과, 종양 혈관계에 대한 손상, 및 전신 면역의 발달로 이어질 수 있는 염증성 면역 반응의 유도.
더 작은 나노구조물, 예컨대 8PEGA에 광감각제를 통합하면 에너지 상태가 더 낮은 광감각제를 가질 수 있다. 다른 이유들 중에서, 광감각제가 NC의 표면에 있거나 그 근처에 있기 때문에, ROS를 형성하는데 더 많은 조직 산소를 사용할 수 있기 때문에, NC의 크기가 작을수록 NC에 대한 능력을 제공하므로 광감각제가 ROS의 영향을 받는 조직 또는 구조에 더 가까운 RO 종을 생성한다는 이론이 있다.
실시형태에서, 전형적인 광감각제는, 예컨대 일중항 산소 또는 다른 반응성 산소 종의 양자 수율이 충분히 높은 경우(0.4 초과) 효율적인 PDT 제제일 수 있다. 즉, 여기된 광감각제 분자의 적어도 40%는 형광, 인광 또는 다른 수단을 통해 에너지를 분배하는 대신 일중항 산소 또는 반응성 산소 종을 생성할 것이다. 또한, 여기된 광감각제의 삼중항 상태(l ms초과)의 수명이 길수록, 주변 분자와의 상호작용이 더 좋아져 더 많은 세포독성 종이 생성된다. 보다 작은 크기의 나노구조물, 및 나노구조물의 매우 균일한 크기 분포를 가진 의약품을 사용하는 본 발명의 실시형태는 PDT에 영향을 미치는 효과로서 덜 효율적인 광감각제 기능, 및 PDT에 사용되는 기존 광감각제의 치료 효능을 크게 증가시키는 능력을 제공한다. 보다 작은 나노구조물, 예를 들어, 8PEGA에 감광을 통합하면 더 낮은 에너지 상태로 감광을 가질 수 있는 능력을 제공한다. 다른 이유들 중에서, 광감각제가 NC의 표면에 있거나 그 근처에 있어 ROS를 형성하는데 사용할 수 있는 조직 산소가 더 많기 때문에, NC의 크기가 작을수록 NC에 대한 능력을 제공하므로 광감각제가 ROS의 영향을 받는 조직 또는 구조에 더 가까운 ROS 종을 생성한다는 이론이 있다.
PDT의 기작은 레이저 상처 치유 및 회춘 또는 강렬한 펄스 광 제모와 같은 다른 광-기반 및 레이저 요법과 구별되며, 이들은 광감각제, 형광, 인광 또는 예컨대 활성 모이어티를 생성, 예컨대 생체 내에서 생성 또는 생성을 필요로 하는 다른 수단을 필요로 하지 않는다.
실시형태에서, 전형적으로, PDT에 의해 표적화되는 구조의 예는 미토콘드리아, 리소좀 또는 소포체일 수 있다. 세포에 대한 영향, 예컨대 cyttid 영향은 예를 들어 아폽토 세포 사멸 기작, 괴사 경로 및 둘 모두를 통해 발생하는 것으로 이론화되어 있다. 아폽토시스에 필요한 효소가 파괴되고 괴사성 결과를 유발할 수 있는 충분한 세포 손상(혈장 막 손상)이 있다는 이론이 있다. 종양 파괴의 또 다른 주요 원인은 혈관 폐쇄를 통해 종양에 대한 산소와 영양분의 공급을 제한하여 조직 저산소증 및 세포 사멸을 초래하는 것으로 이론화되어 있다. 추가로 이론화된 기작은 PDT가 면역 반응을 활성화하여, 림프구, 백혈구, 및 대식세포와 같은 면역 세포가 표적화된 조직으로 침투하도록 하는 것이다. 종양 파괴의 또 다른 원인은 혈관 페쇄를 통해 종양에 대한 산소 및 영양분의 공급을 제한하여 조직 저산소 및 종양 세포 사멸을 초래하는 것이다. 종양 파괴에서 8PEGA NC의 실시형태에서, 이는 종양 세포 사멸의 주요한 수단이다.
보다 작은 크기의 나노구조물, 나노구조물의 고도로 균일한 크기 분포를 가진 의약품, 및 이들의 조합을 사용하는 본 발명의 실시형태는 새로운 광감각제, 덜 선호되는 광감각제, 및 이전에 PDT에 대해 무시되었던 광감각제를 사용할 수 있는 능력을 제공한다. 이러한 실시형태는 종양 세포 사멸의 이러한 현재 이론화된 기작뿐만 아니라, 본 발명의 영상화 능력 및 치료진단법을 포함하여 본 발명의 결과로서 발생하게 되는 또는 나중에 발견될 수 있는 다른 방법 또는 경로를 사용할 수 있다.
본 발명은 특정 광감각제로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 작용제는 메틸렌 블루(MB), 클로린 e6(Ce6), 쿠마시 블루(실시형태에서 PTT(광열 요법, photothermal therapy) 제제로서 작용함), 금, 또는 다른 적합한 광감각제이다. 일부 실시형태에서, 광감각제는 또한 영상화(예컨대, MB)에 적합하다.
본 발명의 실시형태는 광역학적 요법에 제한되지 않는다. 본 발명의 나노구조물 및 나노구조물 의약품의 일부를 형성할 수 있는 추가 치료제가 본 발명의 실시형태에서 사용될 수 있다. 예는 비제한적으로 아폽토시스를 유도하는 제제; 초음파 감응제; 폴리뉴클레오티드(예컨대, 안티-센스, 리보자임, siRNA); 폴리펩티드(예컨대, 효소 및 항체); Bcl-2 패밀리 단백질 예컨대 Bax와 결합(예컨대, 올리고머화 또는 착화)하는 제제; 알칼로이드; 알킬화제; 항생제; 항대사물질; 호르몬; 백금 화합물; 단클론 또는 다클론 항체(예컨대, 항암 약물, 독소, 디펜신과 결합된 항체), 독소; 방사성 핵종; 생물학적 반응 조절제(예컨대, 인터페론(예컨대 INF-α) 및 인터류킨(예컨대, IL-2); 적응 면역요법 제제; 조혈 성장 인자; 세포 분화 유도제(예컨대, 올-트랜스-레티논산); 유전자 요법 시약(예컨대, 안티센스 요법 시약 및 뉴클레오티드); 혈관신생 억제제; 프로테오좀 억제제: NF-KB 조절제; 항-CDK 화합물; HDAC 억제제; 중금속(예컨대, 바륨, 금, 또는 백금); 화학요법제(예컨대, 독소루비신 또는 시스플라틴) 등을 포함한다. 독소 화합물의 다수의 다른 예가 당업자에게 알려져 있으며, 더 작은 크기의 NC, 의약품에서 고도로 균일한 NC 크기 분포 및 이들의 조합을 통해 이러한 화합물을 사용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 독소 제제는 초음파 감응제이다. 초음파 감응제의 예는 비제한적으로 포르피린(예컨대, 헤마토포르피린, 디아세틸헤마토포르핀-미토마이신-C 접합체, 포토프린 II, 메조포르피린, 포토포르피린 IX, 구리 프로토포르피린, 테트라페닐포르핀 테트라설포네이트, ATX-70, ATX-S10, 페오포르바이드-a, CIA1-프탈로시아닌 테트라설포네이트, 및 클로린 PAD-S31), 테녹시캄, 피록시캄, 로즈 벵갈, 에리트로신 B, 메로시아닌 540, 디메틸포름아미드, 시토신 아라비노시드, 피리독사르바졸, 2,2′-아조비스(2-암디노프로판), 5,5′-디메틸-1-피롤린-X-옥시드, e-피리딜-1-옥시드-N-t-부틸니트론, 및 항암제(예컨대, 질소 머스타드, 사이클로포스마드미드, 블레오마이신, 아드리아마이신, FAD104, 암포테리신 B, 미토마이신 C, 다우노마이신, 시스플라틴, 에톱시드, 디아지쿠온, 디히드록시(옥스바이-구오아니도) 보론, 및 5-플루오로우라실)(예컨대, 문헌[Rosenthal et al., Ultrasonics Sonochemistry 11 (2004) 349] 참조, 그 전체가 인용되어 본원에 포함됨)을 포함한다.
일부 실시형태에서, 독성 제제는 아폽토시스를 유도하거나 자극하는 제제를 포함한다. 아폽토시스를 유도하는 제제는 비제한적으로 방사선(예컨대, X-선, 감마 선, UV); 종양-유도 성장 인자 리간드, 수용체, 및 유사체; 키나제 억제제(예컨대, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 키나제 억제제, 혈관 성장 인자 수용체(VGFR) 키나제 억제제, 섬유아세포 성장 인자 수용체(FGFR) 키나제 억제제, 혈소판-유래 성장 인자 수용체(PDGFR) 키나제 억제제, 및 Bcr-Abl 키나제 억제제(예컨대, GLEEVEC)); 안티센스 분자; 항체(예컨대 HERCEPTIN, RITUXAN, ZEVALIN, BEXXAR, 및 AVASTIN); 항-에스트로겐(예컨대 랄록시펜 및 타목시펜); 항-안드로겐(예컨대, 플루타미드, 비칼루타미드, 피나스테리드, 아미노글루테타미드, 케토코나졸, 및 코르티코스테로이드); 사이클로옥시게나제 2(COX-2) 억제제 (예컨대, 셀렉콕시브, 멜록시캄, NS-398, 및 비-스테로이드성 항-염증 약물); 항-염증 약물(예컨대 부타졸리딘, DECADRON, DELTASONE, 덱사메타손, 덱사메타손 인텐솔, DEXONE, HEXADROL, 히드록시클로로퀸, METICORTEN, ORADEXON, ORASONE, 옥시펜부타존, PEDIAPRED, 페닐부타존, PLAQUENIL, 프레드니솔론, 프리드니손, PRELONE, 및 TANDEARIL); 및 암 화학요법 약물(예컨대, 이리노테칸(CAMPTOSAR), CPT-11, 플루다라빈(FLUDARA), 다카르바진, 덱사메타손, 미톡산트론, MYLOTARG, VP-16, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 5-FU, 독소루비신, 젬시타빈, 보르테조밉, 게피니팁, 베바시주맙, TAXOTERE 또는 TAXOL); 세포 신호전달 분자; 세라미드 및 사이토카인; 스타우로스포린, 등을 포함한다.
본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 알킬화제는, 비제한적으로 다음을 포함한다: 1) 질소 머스터드(예컨대, 메클로레타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란(L-사르콜리신); 및 클로람부실); 2) 에틸렌이민 및 메틸멜라민(예컨대 헥사메틸멜라민 및 티오테파); 3) 알킬 설포네이트(예컨대, 부설판); 4) 니트로사우레아스(예컨대, 카르머스틴(BCNU);로무스틴(CCNU); 세무스틴(메틸-CCNU); 및 스트렙토조신(스트렙토조토신); 및 5) 트리아제네스(예컨대, 다카르바진(디메틸트리아제노이미드-아졸카복사미드).
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 항대사물질은 비제한적으로 다음을 포함한다: 1) 엽산 유사체(예컨대, 메토트렉세이트(아메토프테린)); 2) 피리미딘 유사체(예컨대, 플루오로우라실(5-플루오로우라실), 플록수리딘(플루오로-옥시우리딘), 및 시타라빈(시토신 아라비노시드)); 및 3) 퓨린 유사체(예컨대, 머캅토퓨린(6-머캅토퓨린), 티오구아닌(6-티오구아닌), 및 펜토스타틴(2'-디옥시코포마이신)).
또 다른 실시형태에서, 본 발명의 조성물 및 방법에서 사용하기에 적합한 화학요법제는 비제한적으로 다음을 포함한다: 1) 빈카 알칼로이드(예컨대, 빈블라스틴, 빈크리스틴); 2) 에피포도필로톡신(예컨대, 에토포시드 및 테니포시드); 3) 항생제(예컨대 닥티노마이신(악티노마이신 D), 다우노루비신(다우노마이신; 루비도마이신), 독소루비신, 블레오마이신, 플리카마이신(미트라마이신), 및 미토마이신(미토마이신 C)); 4) 효소(예컨대, L-아스파라기나제); 5) 생물학적 반응 변형제(예컨대, 인터페론-알파); 6) 백금 배위 착화물(예컨대, 시스플라틴 및 카보플라틴); 7) 안트라센디온(예컨대, 미톡산트론); 8) 치환된 우레아(예컨대, 히드록시우레아); 9) 메틸히드라진 유도체(예컨대, 프로카바진(N-메틸히드라진)); 10) 부신피질 억제제(예컨대 미토탄(o,p′-DDD) 및 아미노글루테티미드); 11) 아드레노코르티코스테로이드(예컨대, 프레드니손); 12) 프로게스틴(예컨대, 히드록시프로게스테론 카프로에이트, 메드록시프로게스테론 아세테이트, 및 메게스트롤 아세테이트); 13) 에스트로겐(예컨대 디이텔스틸베스트롤 및 에티닐 에스트라디올); 14) 안티에스트로겐(예컨대, 타목시펜); 15) 안드로겐(예컨대, 테스토스테론 프로피오네이트 및 플루옥시메스테론); 16) 안티안드로겐(예컨대, 플루타미드): 및 17) 고나도트로핀-방출 호르몬 유사체(예컨대, 류프롤라이드).
일부 대안적인 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 영상화 목적으로 추가 제제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 영상화제는 예컨대 자기 물질(예컨대, MRI용 철), 발광 반응을 촉매하는 단백질(예컨대, 루시페린 예컨대 생물발광 영상화용 루시퍼라제); 형광 염료(예컨대 형광 영상화용 로다민 또는 플루오레신 이소티오시아네이트); 형광 단백질(예컨대 녹색 형광 단백질); 및 방사성 반응 원소(예컨대 자가방사선촬영용)으로부터 선택된다.
일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 X-선/CT를 위한 조영제로서 사용되는 나노물질을 포함하거나, MRI는 광활성 특성, X-선에 대한 흡광도 또는 T1 자기 공명 영상화에 대한 상자성 특성을 사용한다. 예시적인 조영제는 비제한적으로 가돌리늄 조영제, 형광제(예컨대, Alizarin Red S), 및 미국특허 제7,412,279호 또는 제6,540,981호에 기술된 조영제를 포함하며, 상기 특허 전체는 인용되어 본원에 포함된다.
본 발명의 실시형태는 독성제를 활성화시켜 세포 특이적인 방식으로 세포 국소화 및 표적 세포에서 조직 손상을 유발하는 활성화제를 제공한다. 본 발명은 특정 활성화제로 제한되지 않는다. 독성제를 활성화하는 모든 활성화제가 본 발명의 실시형태에서 사용된다. 일반적으로, 활성화제는 독성제가 세포 사멸 또는 파괴로 이어지는 에너지(예컨대, 자유 라디칼 형태)를 방출하는 에너지원을 제공한다. 예시적인 활성화제는 비제한적으로 광, 열, 방사선, 소리 등을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 광역학적 요법을 사용하여 예시된다. 그러나, 본 발명은 광역학적 요법의 사용으로 제한되지 않는다. 다양한 독성제 및 활성화 시스템이 본 발명의 실시형태에서 사용된다.
도 9를 주목하면, 광역학적 요법(PDT)의 일반적인 실시형태에서 광감각제가 빛 에너지에 의해 활성화되어 반응성 산소 종을 방출하는 화학 반응의 사용을 포함한다. PDT는 2개의 단계를 포함한다. 먼저, 광감각제가 투여되어 능동 또는 수동적 표적화에 의해 조직 상에 또는 조직 내에 축적된다. 이어서, 감광된 조직은 조명 시 여기되는 광감각제의 흡수 스펙트럼과 일치하는 파장의 빛에 노출된다. 광역학적으로 효율적인 광감각제를 사용하면, 분자 산소(세포에서 사용 가능함)로 에너지가 전달되고 주로 일중항 산소(O2)인 반응성 산소 종(ROS)이 생성된다. 세포 지질, 아미노산 및 단백질의 후속 산화는 조직의 괴사 및/또는 아폽토시스와 같은 세포 손상을 유도한다. ROS는 극도로 제한된 수명과 확산 길이로 인해 훨씬 국부적인 독성을 가지고 있으므로, 이러한 방출은 비가역적이지만 절묘하게 제한된 세포 손상 및 조직 괴사를 야기한다. 따라서, PDT에 의해 유도된 손상은 감광된 세포에만 국한되는 반면, 인접한 비-감광된 세포는 영향을 받지 않는다.
본 발명의 나노플랫폼 실시형태는 접합체 광감각제 및 표적화된 세포-특이적 PDT가 효능 및 제어성을 크게 증가시키는 다양한 적용에 이용 가능하도록 하는 방식으로 히드로겔을 사용한 표적화 모이어티이다. 예컨대, 둘 모두 생분해성 나노입자와 접합된 2개의 제제의 상승작용 구현을 포함하는 세포- 및 공간-특이적 세포 사멸 방법론: 근세포-표적화 펩티드(예컨대 CTP), 및 광감각제를 가능케 하는 광역학적 요법(예컨대, 클로린 e6).
일부 실시형태에서, 활성화제는 소리이다(예컨대, 초음파역학 요법). 초음파역학 요법은 특정 화합물(초음파 감응제)의 세포독성 활성에 대한 초음파 의존적 향상이다. 초음파는 20 kHz 이상의 주파수에서 연속적인 탄성 매체에서 입자의 주기적인 진동을 갖는 기계적 파동이다. 액체에서, 약 1000 내지 1600 m/s의 속도는 마이크로미터에서 센티미터까지의 파장 범위로 변환된다. 결과적으로, 음향 장은 분자 수준의 생물학적 환경을 포함하여, 분자의 에너지 수준과 직접 결합할 수 없다. 따라서, 이러한 방사선은 안전한 것으로 인지될 뿐만 아니라, 에너지의 주요 약화 없이 매우 우수한 조직 투과 능력을 가지고 있다. 일부 실시형태에서, 소리는 신체 외부에서 생성되고 조직을 통해 원하는 치료 영역으로 표적화된다.
초음파역학 요법은 초음파와 "초음파 감응제"로 지칭되는 화학적 화합물의 상승작용 효과를 기반으로 한다. 이러한 효과는 한정된 영역(예컨대, 표적 조직 영역)에 초음파를 집중시킴으로써 국소화될 수 있다. 일부 실시형태에서, 초음파는 표적 조직의 특이적 영역에 경피적으로 전달된다.
일부 실시형태에서, 활성화제는 치료제(예컨대, 화학요법제)를 활성화시키는 약학 제제이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 베라파밀은 화학요법제(예컨대, 독소루비신)의 효능을 활성화하거나 개선하기 위해 사용된다.
본 발명의 실시형태는 본원에 기술된 나노구조물 및 나노구조물 의약품을 포함하는 조성물, 키트, 및 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두와 활성화제(예컨대, 레이저, 초음파 기구, 방사선 전달 기구 등) 전달용 기기 또는 기구를 포함한다. 일부 실시형태에서, 시스템은 활성화제의 전달, 영상화, 데이터 분석, 및 데이터 디스플레이를 제어하기 위해 표적화된 조직 및 컴퓨터 시스템에서 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두를 영상화하기 위한 기기를 추가로 포함한다.
이어서, 활성화제(예컨대, 레이저 또는 소리) 전달(예컨대 나노입자에 삽입되어 있거나 이의 표면 상에 있는 독성 제제를 통해)의 국소 전달 시 세포-특이적 사멸이 유도되고, 이어서 ROS가 국소 방출된다. 실시형태에서, 특이적으로 표적화된 세포 유형은 활성화제가 전달되는 영역에서만 사멸되는 반면, 비표적화된 세포의 수는 활성화제의 전달 후 일정하게 유지된다.
본 발명은 활성화제의 특정 전달 방법에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 활성화제는 수술, 예컨대 내시경 또는 개복을 통해 치료가 필요한 표적 조직의 영역에 직접 전달된다. 일부 실시형태에서, 활성화제는 자동화된 시스템(예컨대, 컴퓨터 제어)을 사용하여 표적화되고 제어된다.
일부 실시형태에서, 활성화제는 카테터를 사용하여 또는 다른 정맥 내 또는 동맥 내 전달 또는 경피적(예컨대, 초음파를 통해) 치료를 필요로 하는 표적화된 영역으로 국소적으로 전달된다. 이러한 방법은 개복 수술의 필요성을 피한다.
일부 실시형태에서, 요법은 초음파역학 요법이다. 초음파역학 요법은 경피 전달의 이점을 가지고 있으므로 침습적 수단 없이 전체 수술을 수행할 수 있다. 독성 제제(예컨대, 초음파 감응제)가 전달되고(예컨대 정맥 내로) 이어서 조직의 표적화된 영역이 초음파로 치료된다.
일부 실시형태에서, 요법은 광역학적 요법이다. 광역학적 요법은 조명된 영역만 치료를 받는 반면 다른 영역은 비처리 상태로 유지되므로 공간 특이성을 가져올 수 있다.
일부 실시형태에서, 요법은 근세포를 표적화하고 절제하거나 사멸시킨다. 그러나, 본 발명은 근세포의 표적화에 제한되지 않는다. 치료적 나노플랫폼을 구현하는 이점은 별개의 표적 조직 적용을 위해, 다양한 선택적 표적화제에 접합되는 이러한 담체의 높은 다양성이다. 사실, 임의의 다른 표적화 모이어티(예컨대, 항체, 펩티드 등), 기능성 염료 또는 생물활성제는 이러한 나노플랫폼으로 쉽게 구현될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기술된 치료적 용도는 기존 요법과 함께 또는 기존 요법의 대체물로서 사용된다. 일부 실시형태에서, 나노입자-기반 요법은 실패하거나 불완전한 요법(예컨대 비-나노입자 요법)에 대한 후속 조치로서 사용된다.
일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 영상화(예컨대 생체 내 영상화) 적용에서 사용된다. 일부 실시형태에서, 광감각제(예컨대, 클로린 e6) 또는 형광이거나 달리 영상화 가능한 입자가 사용된다. 본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 중요한 실시형태는 그 자체가 다른 제제 또는 물질의 첨가로 MRI 영상화제로서 기능하는 나노입자, 나노구조물, 및 둘 모두이다. 다른 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 추가로 별도의 영상화제를 포함한다. 예컨대, 본원에 기술된 바와 같이, 일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 영상화(예컨대, X-선, 컴퓨터 단층활영(CT) 영상화, PET 영상화, 초음파, 광-음향 영상화, 또는 MRI 영상화)를 위한 조영제를 포함한다. 예컨대, 일부 실시형태에서, 157Gd, 금, 요오딘, 철-산화물, 또는 영상화에서 사용하기에 적합한 다른 제제가 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두를 코팅한다.
일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물, 및 둘 모두는 생체발광 영상화에 의해 생체 내 또는 시험관 내 생물학적 표적을 검출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 생물발광 반응을 촉매하는 효소를 포함한다. 생물발광 반응을 촉매하는 효소는 비제한적으로 다음의 루시퍼라제를 포함한다: 박테리아 루시퍼라제(미국특허 제4,548,994호), 포티너스 피랄리스 루시퍼라제(Photinus pyralis)(미국특허 제5,670,356호 및 제5,674,713호), 레닐라 레니포무스(Renilla reniformus) 루시퍼라제, 피로포루스 플라지오프탈라무스(Pyrophorus plagiophthalamus) 루시퍼라제, 루시올라 크루시아타(Luciola cruciata) 루시퍼라제(문헌[Masuda et al., Gene 77:265-70 [1989]]), 루시올라 라테랄리스(Luciola lateralis) 루시퍼라제(문헌[Tatsumi et al., Biochim. Biophys Acta 1131:161-65 [1992]]), 및 라티아 네리토이데스(Latia neritoides) 루시퍼라제. 전술한 간행물 및 특허는 구체적으로 본원에 인용되어 포함된다.
일부 실시형태에서, 영상화는 제자리(in situ)에서 수행된다. 생물발광 효소를 포함하는 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 동물에게 정맥 내로 제공되어 분자 인식 요소가 생물학적 표적에 결합할 수 있도록 시간이 허용된다. 일부 실시형태에서, 생물발광 효소에 대한 기질(예컨대, 박테리아 또는 곤충 루시페린)이 이어서 동물에게 제공된다(예컨대, 정맥 내, 복강 내, 방광 내, 또는 뇌혈관 전달을 통해). 일부 실시형태에서, 기질에 대한 효소의 작용에 의한 생물발광의 생성은 생물발광 검출 시스템에 의해 이어서 검출된다. 일부 실시형태에서, 생물발광 검출 시스템은 하마마츠(Hamamatsu) 강화 CCD(ICCD, 모델 C2400-32)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 생물발광 검출 시스템은 약한 신호를 강화하기 위한 다른 장치를 추가로 포함한다(예컨대, 마이크로채널 플레이트 강화기 및 검출기 및/또는 강화기의 펠티에 또는 액체 질소 냉각을 위한 장치). 일부 실시형태에서, 동물의 그레이 스케일 영상이 동물이 배치된 어두운 챔버의 문을 개방하여 수득된다. 이어서 문이 닫히고 강화기 상의 수득이 최대로 조정되어 생물발광 신호가 감지된다. 이어서 신호는 의사색체(pseudocolor)의 그레이스케일 영상으로 오버랩된다.
다른 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 자기 공명 영상화(MRI)에 의해 생물학적 표적을 검출하는데 사용된다. 일부 실시형태에서, 영상화된 생물학적 표적은 제자리에 있다. 자성 물질을 포함하는 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두가 동물에게 제공되어(예컨대, 정맥 내로) 분자 인식 요소가 생물학적 표적에 결합하도록 시간이 허용된다. 일부 실시형태에서, 생물학적 표적은 이어서 자기 공명 시스템(예컨대 7-Tesla 자기 공명 시스템)으로 영상화된다. 일부 실시형태에서, T1-가중 또는 T2-가중 영상이 수득된다.
일부 실시형태에서, 진단 및 영상화 적용은 치료적 적용과 조합되어 수행된다. 예컨대, 일부 실시형태에서, 영상화제는 세포 사멸을 모니터링하기 위해 광역학적 요법 전후에 표적 조직을 시각화하기 위해 사용된다. 예컨대, 일부 실시형태에서, 영상화는 임상의가 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두가 결합된 위치를 볼 수 있도록 한다(예컨대, 활성화 전, 동안 또는 후에). 일부 실시형태에서, 영상화는 세포 사멸의 정도 또는 국소화를 결정하기 위해 치료 후 표적 조직을 시각화하는데 사용된다. 따라서, 영상화는 동적 요법의 진행 상황을 실시간으로 모니터링할 수 있다.
일부 실시형태에서, 영상화 방법은 활성화의 치료 과정을 결정하기 위해 사용된다. 예컨대, 일부 실시형태에서, 영상화는 예컨대 동일하거나 상이한 영역에서 추가 활성화제의 형태로 추가 처리가 필요한지 또는 추가 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두의 전달이 필요한지 여부를 결정하기 위해 치료 후에 사용된다.
일부 실시형태에서, 나노입자, 나노구조물 및 둘 모두는 수술 동안, 또는 약물 스크리닝 적용 동안 연구(예컨대, 동물 모델에서의 영상화, 구조적 연구, DNA-단백질 결합 상호작용, 단백질 포획 등)에서 사용된다.
다양한 연대기 및 모니터링 기술 및 장비를 사용하여 본 발명의 NC, 이러한 NC의 제조 방법, 및 이러한 NC의 사용 방법을 평가할 수 있다. 예컨대, Shimadzu UV-1601 UV/Visible 분광분석기가 NP의 광학 밀도(OD)를 기록하고 조정하는데 사용될 수 있다. Fluoromax-3을 사용하여 형광 스펙트럼을 수득할 수 있다.
본 발명의 NC를 제조하는데 사용되는 출발 물질, 시약 및 구성요소는 이용 가능한 상업적 공급원으로부터 수득할 수 있으며, 바람직하게는 의료 제품에 사용하기 위한 FDA 승인 물질이다. 예컨대, 다음은 실시예의 실시형태에서 사용될 수 있는 물질의 공급원이다. 클로린 e6(Ce6) 및 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC)는 Frontier Scientific에서 공급한다. 8PEGA(40 kDa) 및 Bi-PEG(말레이미드-PEG-숙신이미달 에스터, 2 kDA)는 Creative PEG Works에서 공급한다. F3-Cys 펩티드(KDEPQRRSARLSAKPAPPKPEPKPKKAPAKKC)는 Decon Labs의 SynBioSci. 190 증명 천연 에탄올에서 공급된다. Amicon Cells용 10 kDa 및 300 kDa 필터 및 10 kDa 원심분리 필터는 Amicon에서 공급된다. DMEM [(+) 글루타민, 당, 소듐 피루베이트), 페니실린 스트렙토마이신, 및 우 태아 혈청은 Life Technologies에서 공급된다. 다른 모든 화학물질은 Sigma Aldrich에서 공급된다. 아크릴아미드, 3-(아크릴로일옥시)-2-히드록시프로필 메타크릴레이트(AHM), 아미노프로필 메틸아크릴아미드 히드로겐 클로라이드 염(APMA), N-히드록시 숙신이미드(NHS), N,N'-디사이클로헥실카보다이이미드(DCC), Brij L4, 디옥틸 설포숙시네이트 소듐 염(AOT), 디메틸 설폭시드(DMSO), 디메틸 포름아미드(DMF), 암모늄 퍼설페이트(APS), 테트라메틸 에틸렌 디아민(TEMED), 포스페이트 완충 염수(0.01 M, PBS), 헥산, 시스테인, 안트라센 디프로피온산(ADPA), 칼세인 AM, 프로피듐 요오다이드(PI).
실시형태에서, NMR은 깨끗한 PEG 영상을 제공하기에 충분한 물 및 지방 억제를 제공하도록 작동되고 분석된다. 예컨대, 조직 수분의 95%가 제거되는 확산-기반 방법이 사용될 수 있다. 잔류 물은 당업자에게 공지된 다른 수분 억제 방법에 의해 제거될 수 있다. 예컨대, 추가 물 억제를 위해, 각각의 복셀이 물, PEG, 및 지방을 포함하는 NMR 스펙트럼으로 구성되는 분광 영상화가 사용될 수 있다. 이러한 억제 방법은 또한 조직 분포 연구에서 적용될 수 있다.
실시형태에서 8PEGA의 MRI는 에톡시 양성자의 신호를 직접 포착하여 측정한다. 이는 상호작용하는 물 양성자의 이완 시간을 변경하여 스캔 동안 보이는 콘트라스트를 생성하는 가돌리늄과 같은 금속과는 다르다. 따라서, 본 발명의 실시형태는 NP에서 양성자의 직접 측정에 기초한 영상을 제공하며, 물 양성자의 이완 시간의 변화에 의존하지 않으며 이를 사용하지 않는다.
NC, 특히 PEG 기반 NC의 실시형태는 다양한 상이한 크기 및 중량일 수 있으며, 예컨대 단량체(예컨대, 다중 PEG로 구성되지 않은 단일의 큰 거대분자), 다중-암 PEG(예컨대, 2, 4, 6, 8, 10 또는 그 이상의 암), 및 이들의 조합 및 변형을 포함한다. NC는 1 MDa 미만, 약 10 kDA 내지 약 1,000 kDa, 약 20 kDa 내지 약 500 kDa, 약 30 kDa 내지 약 200 kDa, 약 40 kDa 내지 약 750 kDa, 약 35 kDa 내지 약 75 kDa, 약 50 kDa 내지 약 800 kDa, 및 이러한 범위 이내의 모든 값, 및 더 큰 및 더 작은 양의 총 MW를 가질 수 있다.
도 10을 주목하면, 치료진단을 위해 보편적으로 적용 가능한 초소형 나노플랫폼인 8-암-PEG-아민(8PEGA)(1010)의 실시형태를 보여주는 차트가 제공된다: 예컨대 광역학요법(PDT, "thera"), 및 분자 MR 제제("nostic")로서. 이미지(1011)의 좌측은 상이한 작용기를 통해 광감각제(PS)를 부착한 다음 세포-특이적 표적화 방법론을 위해 말레이미드-티올 반응과 같은 이중-기능성 PEG와의 간단한 "클릭" 화학 반응을 통해 표적화제(예컨대 펩티드)를 부착할 수 있는 유연성을 보여준다. 우측은 8PEGA(1010)가 MRI 영상화에 이상적인 다양한 물리적 특성을 포함하는 방법을 보여준다. 이러한 특성은 긴 T2 수명 및 40 kDa의 높은 MW로 인한 느린 확산 상수를 포함하며, 확산 가중치 MRI에 이상적인 특성이다.
도 11을 주목하면, Ce6(PS) 및 CTP(TA)와 함께 8PEGA를 조립하는 일반적인 흐름도가 도시되어 있다. 이는 일반적으로 임의의 적합한 TA 및 PS를 사용하여 적용될 수 있다. 상단 차트(1101)는 PDT가 기능하는 방법에 대한 일반적인 경로를 기술한다: 나노플랫폼은 빛을 수신하고, 이를 흡수하여 국소 산소로 전달되어 ROS를 생성한다. 이러한 ROS는 이어서 세포를 손상시킨다. 하단 차트(1102)는 표적화된 NC를 제조하기 위한 개략적인 반응 경로이다.
도 12를 주목하면, 랫트 및 인간 세포 배양에 대한 시험관 내 CTP-8PEGA-Ce6 NP의 성능의 슬라이드를 나타낸다; 배양물은 섬유아세포 및 심장 근세포 둘 모두를 포함한다. 랫트의 경우 섬유아세포와 직접 접촉하는 경우에도 근세포만을 사멸시킴을 알 수 있다. 사멸된 세포는 칼세인 AM 형광이 감소하고 프로피듐 요오다이드가 증가할 것이다. 인간 세포 시험은 플랫폼을 변경하지 않고도 인간에서 동일한 선택성을 달성할 수 있음을 보여준다(표적화 및 비-표적화된 시험을 수행하였으며, 표적화가 바람직하고 효과적임을 보여준다).
도 13을 주목하면, NP 주사 후(주사 후 1시간) 단리된 랫트 심장의 조직이 도시되어 있다. DAPI는 모든 세포의 핵을 염색한다. Ce6의 형광은 근세포에 대한 극도의 선택성으로 국소화되어 시험관 내 선택성 결과가 생체 내로 직접 옮긴다는 것을 알 수 있다.
도 14를 주목하면, 수술 설정 대상체(1401), 심장(1402), 및 PDT로부터의 결과적인 전기곡선도의 입증이 도시되어 있다(표적화, 비-표적화, 및 무처리). 전기곡선도 진폭의 감소는 신호 차단을 나타내며; 잔류 신호는 원거리 장 활성에 기인하였다. 표적화 및 비-표적화 둘 모두 효과가 있었지만, 레이저 단독은 효과가 없었다. 이는 일반적으로 PDT가 변화를 일으킬 수 있음을 나타낸다.
도 15를 주목하면, PI(사멸된 세포에 대한 핵 염색)가 근세포에만 존재함을 보여준다(3개의 상이한 확대 영역). D 및 E는 검사된 영역이 치료 영역에서 멀어짐에 따라 PI 형광이 감소함을 보여줌으로써 조명된 영역에서만 PDT가 발생했음을 보여준다.
도 16을 주목하면, 도 15와 유사한 조직 샘플링 시험이지만 비-표적화된 PDT를 사용한 것을 보여준다. 막대에서 사진(및 그래프에서 정량화됨)을 보면, 오직 근세포만을 사멸시키는 표적화에 비해, 표적화되지 않은 Ce6 PDT가 모든 것을 사멸시킨다는 것을 알 수 있다.
도 17을 주목하면, 표적화된 PDT 또는 레이저 단독을 받은 마우스의 심전도가 도시되어 있다. 표적화된 PDT에서만 심장 박동이 정상으로 돌아오는데 차이가 있다.
도 18을 주목하면, PDT가 조직에 얼마나 깊이 침투했는지가 도시되어 있다(조직을 통한 PI 형광에 의해 추적됨). 또한, 레이저 단독만으로는 효과가 없는 것으로 나타났다.
실시형태에서, 중금속 원자가 없는 MR 분자 영상화제뿐만 아니라 광역학적 요법(PDT)을 위한 치료적 플랫폼으로서 동시에 작용할 수 있는 신규한 표적화 가능한 나노구조물(NC)이 제공된다. 실시형태에서 암에 대한 NC 기반 PDT가 제공된다. 실시형태에서 F3-cys 표적화제 NC가 제공된다. 실시형태에서, 8PEGA-Ce6 NC는 전통적인 Ce6 캡슐화된 폴리아크릴아미드(PAAm) NC에 비해 우수한 반응성 산소 종(ROS) 생산을 갖는다. NC의 이러한 실시형태는 또한 세포에 적합하며 표적화 펩티드의 선택의 부착성을 위한 화학적 유연성을 제공한다. 또한, 물 신호를 억제하기 위해 큰 확산 자기장 구배가 있는 표준 스핀-에코 영상화 시퀀스를 사용하여, MRI로 직접적이고 선택적으로 영상화될 수 있는, 표지가 없는 8PEGA NC가 제공된다. 특히, 초소형 크기로 인해, 이러한 NC는 생체 내 침투 및 생체-제거를 개선할 수 있다.
도 26을 주목하면, MRI 시스템(2501)의 실시형태의 개략도가 도시되어 있다. 시스템(2501)은 자석(2502), 구배 코일(2503), 무선 주파수 코일(2504), 보어(2505) 및 테이블(2506)을 갖는다. 이러한 도면은 MRI 시스템의 다른 구성요소 및 다른 형태 및 유형이 사용될 수 있다는 것을 개략적으로 나타낸 것으로 이해된다. 실시형태에서, 시스템(2501)은 3개의 자기장을 생성하도록 구성된다. 제1 장은 스핀 각 운동량으로 핵에 에너지 수준 차이를 생성하고 벌크 핵 자성화를 일으키는 강력한 정적 자기장이다. 제2 장은 무선 주파수 장이며 생성된 핵 자성화를 기울이는데 사용되어 RF 코일(2504)에 의해 검출될 수 있다. 제3 장은 핵 자성화 맵을 생성하기 위해 신호를 공간적으로 인코딩하는데 사용되는 자기장 구배의 세트이다. 따라서, 실시형태에서, 자기장은 영상화될 대상체에 배치된 첨가제에 존재하는 물이 아닌 양성자의 영상을 생성하도록 구성되며; 여기서, 자기장 구배는 유동 또는 확산으로 인한 움직임에 대해 핵을 민감하게 하기 위해 특정 방식으로 펄스화될 수 있다.
실시형태에서, 본 발명의 나노구조물, 예컨대 PEG 기반 나노입자로 구성된 영상화제가 환자에게 투여된다. 영상화제를 투여한 환자는 이어서 테이블(2506)에 배치되고, 테이블은 보어(2505)로 이동되고, 시스템(2501)은 스캔을 수행하여, 예컨대 본 명세서에 개시된 유형의 MR 영상이 수득된다. 나노입자는 환자의 위치에 관한 상세한 영상, 및 데이터를 제공하는 직접적으로 영상화된다. 이러한 정보로부터, 치료법이 설계, 정제 및 시행될 수 있다. 예컨대, 나노구조물이 표적화된 PDT 나노구조물인 경우, 외과적, 외과적 및 PDT, 또는 PDT 단독, 요법은 치료법을 개발하고 수행하여 표적화된 조직을 제거할 수 있다.
MRI 시스템(2501)은 조작자 입력 및 기타 제어 특징, 및 컴퓨터 코드와 같은 조작 지시를 포함하는 제어 시스템(2507)을 갖는다. 제어 시스템(2597)은 점선(2508)으로 표시된 바와 같이, 장치(2510)와 제어 통신한다. 제어 통신은 데이터, 정보 및 제어 명령뿐만 아니라 다른 명령이 제어 시스템(2507) 및 장치(2510) 사이에서 통신된다는 것을 의미한다. 제어 시스템(2507)은 장치(2510)로부터 분리될 수 있거나, 예를 들어 장치(2510)의 구조 내에서 장치(2510)의 일부일 수 있다. 실시형태에서, PEG 기반 나노입자를 영상화하기 위한 작동 매개변수를 제공하기 위해 MRI를 작동하는 명령이 시스템(2501)에 제공된다. 이는 예를 들어 소프트웨어 업그레이드의 방법일 수 있다. 이러한 방식으로 기존의 MRI 시스템을 쉽게 업그레이드하여 본 발명의 PEG 기반 나노입자 영상화제의 이점을 최대한 활용할 수 있다.
실시예
다음의 실시예는 본 발명의 시스템, 요법, 과정, 조성물, 적용 및 재료의 다양한 실시형태를 설명하기 위해 제공된다. 이러한 실시예는 설명적인 목적이며, 예지적일 수 있으며, 본 발명의 범주를 제한하지 않으며 그렇게 보아서는 안된다. 달리 명시적으로 제공되지 않는 한, 실시예에서 사용된 백분율은 달리 구체적으로 언급되지 않는 한 총계, 예컨대, 제형, 조성물, 혼합물, 생성물, 또는 구조물의 중량 퍼센트이다.
실시예 1
Ce6-8PEGA NC의 실시형태는 캡슐화된 PAAm-Ce6 NP에 비해 초소형이고 우수한 ROS 생산을 갖는다. CTP에서 F3-cys로의 표적화 펩티드를 성공적으로 교환하는 것은 표적의 변경에서 이러한 NC의 화학적 유연성을 입증한다. F3-8PEGA-Ce6 NC는 시험관 내 및 생체 내에서 우수한 생체적합성을 갖는다.
실시예 2
8PEGA NP 및 NC의 실시형태는 MRI에서 분자 영상화제이다. 이러한 영상화제는 물 및 지방 신호를 억제하는 기술과 추가로 결합하여, 더욱 개선된 영상화 기능을 제공할 수 있다.
실시예 3
F3-8PEGA-Ce6은 심장 부정맥에서 암, 및 다른 가능한 병리에 이르기까지 치료진단(영상화 및 PDT)을 위한 매력적인 범용 NC를 제시한다. 이점은 무엇보다도 빠른 신장 제거 및 MRI 결과와 함께 혈관신생 이전에도 조기 종양 축적을 포함한다.
실시예 4
8PEGA-Ce6 접합체: Ce6은 DMF에서 DCC/NHS 커플링을 통해 8PEGA와 접합된다. 간단히, 448 uL의 Ce6 용액(20 mg/mL, DMF)을 교반(20 mg/mL, DMF) 하에 30분 동안 154.8 uL DCC 및 172.8 uL NHS와 함께 활성화한다. 초음파처리를 사용하여 50 mg/mL의 농도로 500 mg의 8PEGA를 DMF 중에서 용매화한다. 용매화 시, Ce6 용액을 8PEGA 용액에 첨가하고 밤새 교반한다. 다음 날, 10 kDa 막을 사용하여 Amicon Cell 여과 시스템에서 50% 에탄올/PBS 혼합물을 사용하여 비접합된 Ce6을 제거한다. 정제 후, 용매를 Millipore 초순수 물로 교환하고, 0.45 um 시린지 필터를 사용하여 물질을 여과하고 저장을 위해 동결 건조한다.
실시예 5
F3-8PEGA-Ce6 접합체: 수 년 동안 우리 실험실에서 보고된 동일한 방법을 통해 8PEGA-Ce6을 F3으로 변형하였다. F3-cys로 변형한 후, 이어서 UV/VIS를 사용하여 Ce6이 공정에서 응집되지 않았는지를 확인하였다. 간단하게, 20 mg의 Bi-PEG를 1 mL의 8PEGA-Ce6(20 mg/mL, PBS)에 첨가하고 30분 동안 교반한다. 상기 용액을 이어서 10 kDa 원심분리 필터를 사용하여 PBS 중에 4 x 15분 세척한다. 생성된 용액을 20 mg/mL(원래 질량 기준)로 농축하고, 22 mg의 F3-cys를 첨가하고(220 uL, 11 mg/110 uL DMSO), 밤새 교반하였다. 다음 날, 과량의 시스테인을 첨가하고 2시간 동안 교반하여 임의의 미반응 말레이미드기를 캡핑한다. 이어서 상기 용액을 10 kDa 원심분리 필터 및 Millipore 초순수 물을 사용하여 다시 여과하고, 저장을 위해 동결 건조한다.
실시예 6
Ce6 캡슐화된 폴리아크릴아미드 나노입자(PAAm NP): Ce6은 이전에 보고된 방법을 약간 변형하여 PAA NP에 캡슐화한다. 간단하게, 5 mg의 Ce6을 28 mg APMA, 19 mg NHS, 및 16 mg EDC가 포함된 930 uL의 PBS 및 100 uL DMSO에 첨가한다. 상이 용액을 37℃에서 2시간 동안 교반한다. 이어서 아크릴아미드 및 AHM을 상기 용액에 첨가하고(각각 368 mg 및 52.6 uL) 초음파처리하여 균질한 용액을 생성한다. 상기 용액을 교반 하에 31 mL 헥산, 2.2 mL Brij L4, 및 1.07 g AOT가 포함된 100 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가한다. 교반을 생성된 와류가 교반 막대(약 500 RPM)에 거의 닿지 않는 위치로 조정한다. 플라스크의 내용물을 이어서 15분 동안 질소로 퍼징한다. 질소 흐름을 플라스크 내용물과의 접촉으로부터 제거하고 플라스크 내부에 유지한다. 100 uL의 물 중의 15 mg의 APS를 적가 방식으로 첨가하여 중합을 개시하고 100 uL의 TEMED를 적가 방식으로 첨가하여 공정을 촉매한다. 중합이 2시간 동안 진행되도록 한다. 이어서 회전 증발을 통해 헥산을 제거한다. 결과 내용물을 에탄올에 재-분산하고 300 kDa 필터를 사용하여 Amicon Cell에서 10 x 150 mL 에탄올 및 5 x 150 mL Millipore 초순수 물을 사용하여 세척한다. 정제된 물질을 0.45 um 필터를 사용하여 주사기 여과하고 저장을 위해 동결 건조한다.
실시예 7
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 10 nm 내지 15 nm의 평균 입자 크기를 가지며, 약 5% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 8
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 D10 = 10 nm, D50 = 12 nm, D90 = 15 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 9
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 10 nm 내지 15 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 9A
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 8 nm 내지 18 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 9B
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 8 nm 내지 10 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 9C
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 10 nm 내지 12 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 9D
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 11 nm 내지 14 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 9E
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 약 15 nm 내지 18 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 10
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 8 nm, D50 = 약 10 nm, D90 = 약 12 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 11
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 5 내지 12 nm, D50 = 약 8 내지 15 nm, D90 = 약 12 내지 22 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 11A
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 6 내지 10 nm, D50 = 약 8 내지 15 nm, D90 = 약 12 내지 20 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 11B
의약품은 F3-8PEGA-Ce6 NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 10 내지 12 nm, D50 = 약 11 내지 13 nm, D90 = 약 10 내지 15 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 12
실시예 7 내지 12의 의약품은 NMR 또는 MRI에 대한 영상화제, 조영제 또는 둘 모두로 사용된다.
실시예 13
다른 NC, 영상화제, 또는 다른 치료제가 실시예 7 내지 12의 의약품에 포함된다.
실시예 14
실시예 7 내지 12의 의약품은 다른 NC, 영상화제, 또는 다른 치료제와 같은 다른 의약품과 함께 사용될 수 있다.
실시예 15
의약품은 TA(표적화제)-8PEGA-AA(활성제) NC를 포함한다. NC는 약 10 nm의 평균 입자 크기를 갖고, 약 5% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 16
의약품은 TA-8PEGA-AA NC를 포함한다. NC는 D10 = 10 nm, D50 = 12 nm, D90 = 15 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 17
의약품은 TA-8PEGA-AA NC를 포함한다. NC는 약 10 nm 내지 15 nm 범위 이내의 평균 입자 크기를 가지며, 약 10% 미만의 평균 거리의 매우 좁은 입자 크기 분포를 가져 균일하다.
실시예 18
의약품은 TA-8PEGA-AA NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 8 nm, D50 = 약 10 nm, D90 = 약 12 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 19
의약품은 TA-8PEGA-AA NC를 포함한다. NC는 D10 = 약 6 내지 10 nm, D50 = 약 8 내지 15 nm, D90 = 약 12 내지 20 nm의 입자 크기 분포를 갖는다.
실시예 20
실시예 15 내지 19의 의약품은 NMR 또는 MRI에 대한 영상화제, 조영제 또는 둘 모두로 사용된다.
실시예 21
다른 NC, 영상화제, 또는 다른 치료제가 실시예 15 내지 19의 의약품에 포함된다.
실시예 22
실시예 15 내지 19의 의약품은 다른 NC, 영상화제, 또는 다른 치료제와 같은 다른 의약품과 함께 사용될 수 있다.
실시예 23
TA가 예컨대 다음 중 하나 이상인 실시예 15 내지 22의 의약품: 시스테인으로 종결되고 추가 유리 티올기를 포함하지 않는 임의의 펩티드는 8PEG에 부착되어 예컨대 RGD, cRGD, iRGD, F3, 및 CTP를 사용할 수 있다. 추가 실시예는 공개적으로 이용 가능한 파지 라이브러리에 포함되어 있다. 일반적으로, 그 안에 선택적으로 축적되는 소분자 또는 펩티드가 있는 임의의 세포는 NC에 부착되거나 이의 일부가 될 수 있으므로 따라서 8PEGA에 대한 TA를 포함하여 TA로서 기능할 수 있다.
실시예 24
AA가 다음 중 하나 이상인 실시예 15 내지 22의 의약품: 본 명세서에 개시된 광감각제, 초음파 감응제, 광음향제, 및 기타의 것들이 당업자에게 공지되어 있거나 나중에 개발됨.
실시예 25
약 8 내지 15 nm의 입자 크기를 갖고, 실시예 24의 군으로부터의 AA를 가진 NC.
실시예 26
약 8 내지 15 nm의 입자 크기를 갖고, 실시예 23의 군으로부터의 TA를 가진 NC.
실시예 27
약 10 내지 20 nm의 입자 크기를 갖고, 실시예 24의 군으로부터의 AA를 가진 NC.
실시예 28
약 10 내지 20 nm의 입자 크기를 갖고, 실시예 23의 군으로부터의 TA를 가진 NC.
실시예 29
실시예 25, 26, 27 및 28의 NC를 가진 의약품으로서, 입자 크기 분포는 D50 값의 5 nm 이내에서 D10 및 D90 값을 갖는다.
실시예 30
실시예 25, 26, 27 및 28의 NC를 가진 의약품으로서, 입자 크기 분포는 D50 값의 10 nm 이내에서 D10 및 D90 값을 갖는다.
실시예 31
실시예 25, 26, 27 및 28의 NC를 가진 의약품으로서, 입자 크기 분포는 D50 값의 2 nm 이내에서 D10 및 D90 값을 갖는다.
실시예 32
본 발명의 영상화제의 실시형태의 정량적 영상화를 개선하기 위한 MRI 보정. 선택적인 8PEGA NMR 영상화 및 분광분석 시퀀스 및 프로토콜에 의해 생성된 영상 및 스펙트럼은 PEG 나노구조물의 국소 농도에 비례하는 신호 강도를 갖게 된다. mg/ml 또는 몰 농도 단위의 PEG 나노구조물의 절대 농도를 정량적으로 측정하는 것이 바람직한 경우, 공지된 PEG 농도의 팬텀을 이용하여 특정 MRI 스캐너에서 선택적인 PEG 펄스 시퀀스를 수행하거나 환자 및 환자와 동시에 공지된 PEG의 팬텀을 영상화하여 MRI 시스템을 보정할 수 있다. 또한, PEG 선택적 MRI에 의해 생성된 신호 강도가 8PEGA의 농도에 비례함을 보여주는 농도 보정 곡선을 도 6 및 도 7에서와 같이 구성할 수 있다.
실시예 32A
MRI는 PEG 기반 영상화제에서 양성자를 영상화 하도록 구성된다. MRI는 환자 치료 관리를 돕기 위해 의사에게 진단 의료 정보를 제공하는데 일반적으로 적용되는 영상화 도구이다. MRI는 3개의 자기장을 사용한다. 첫째, 강력한 정적 자기장은 스핀 각 운동량으로 핵에 에너지 수준 차이를 생성하고 벌크 핵 자성화를 발생시킨다. 둘째, 무선 주파수(RF) 장은 생성된 핵 자성화를 기울이는데 사용하여 RF 코일에 의해 검출될 수 있다. 마지막으로, 자기장 구배 세트를 사용하여 신호를 공간적으로 인코딩하여 핵 자성화 맵을 생성한다. 또한, 자기장 구배는 유동 또는 확산으로 인한 움직임에 대해 핵을 민감하게 만들기 위해 특이적 방식으로 펄스화 될 수 있다. MRI 펄스 시퀀스는 일련의 RF 및 구배 펄스로 구성되어 T1, T2, 확산 및 기타 매개변수에 민감하게 반응하는 MR 영상을 생성한다.
실시예 32B
8PEGA 특이적 영상의 생성을 위한 MRI 펄스 시퀀스의 일 실시형태를 도 6 및 7에서 볼 수 있다. 이와 같이 특정 경우에, 반복 시간 TR = 500 ms, 에코 시간 TE = 200 ms, 진폭
Figure pct00005
, 지속 시간
Figure pct00006
, 및 분리
Figure pct00007
를 가진 확산 인코딩 구배 쌍을 가진 확산 가중치 스핀-에코 영상화 시퀀스를 사용하여 1010 s/m2의 확산 b 값을 생성하였다. 자기장 구배는 식
Figure pct00008
에 의해 MR 신호 강도를 약화시고, 상기 식에서
Figure pct00009
이다.
물의 확산 상수 D는 25℃에서 2.2 10-9 m2s-1이고 8PEGA는 3.5 10-11 m2s-1로 물보다 2자리수 더 느리다. 이러한 특정 매개변수를 사용하면, 순수한 물 신호는 exp(-bD) = 2.7 10-10만큼 감소하여 물 신호를 노이즈 플로어에 효과적으로 넣는다. 반대로, PEG8A 신호의 60%는 b =1010 s/m2로 유지된다. PEG8A와 물의 배경 영상은 구배 강도가 12.5 mT/m으로 감소하여 108 s/m2의 b 값을 생성한다는 점을 제외하고는 동일한 매개변수로 얻었다. 이러한 매개변수를 사용하면, 물은 초기 값의 80%로 감쇠되고 PEG8A는 99%로 감쇠되지만 물의 양성자 농도는 훨씬 더 높고 MRI 신호를 지배한다.
생체 내에서, 물 분자 확산은 세포 벽에 의해 제한되며 물 신호의 약 5%가 b =1010 s/m2로 유지될 것으로 추정된다. 물 양성자 T2 시간은 일반적으로 80 ms 미만인 반면 8PEGA T2 시간은 500 ms초과이다. 따라서 긴 TE 시간에서 영상화하여 추가 물 억제를 달성할 수 있다. 신호 감쇠는
Figure pct00010
로 진행되므로 긴 TE 시간에서 영상화하여 추가적인 물 감쇠를 달성할 수 있다. 또한, 화학적 이동 또는 물 양성자 이완 시간에 기반한 기존의 물 억제 방법을 구배 억제 방법과 동시에 사용하여 더 많은 물 신호 감쇠를 제공할 수 있다.
임상 MRI 시스템에서, 자기장 구배의 진폭은 약 40 mT/m의 값으로 제한된다. 1010 s/m2의 b 값을 생성하려면
Figure pct00011
의 값을 조정해야 한다. 예를 들어, 구배 진폭이 40 mT/m인 경우,
Figure pct00012
은 8PEGA의 선택적인 영상화에 충분한 7 x 1010 s/m2의 b 값이 된다.
일반적으로, 높은 b 값과 100 ms 초과의 TE 시간을 제공하는 임의의 MRI 펄스 시퀀스는 물 및 지방 신호를 충분히 감쇠시킨다.
실시예 33
광-음향 영상화 - 광음향 영상화(PAI: Photoacoustic imaging)는 해상도를 높이면서 다른 광학 영상화 시스템보다 더 큰 깊이 제한을 제공한다. PAI는 펄스 레이저 광의 흡수에 반응하여 생성된 음파를 사용하고, 예를 들어 약 100 μm 및 가능하게는 그 이상의 해상도로 수 센티미터 깊이에서 흡수된 광학 에너지 밀도의 비 침습적 영상을 제공한다.
8PEGA 광-음향 영상화 NC(PAI-NC)는 활성제를 갖는다. PAI-NC의 입자 크기는 약 10 nm 내지 20 nm이다. PAI-NC는 또한 실시예 23의 표적화제 중 하나를 포함하는 표적화제를 가질 수 있다.
PAI-NC에 대한 활성제, 예컨대 영상화제, 조영제는 예를 들어 소분자 염료, 금, 탄소, 리포좀 캡슐화, 헵타메틴 시아닌 염료(예: 인도시아닌 그린), 아조 염료(예: 메틸렌 블루), 및 나프탈롤시아닌 염료일 수 있다.
일반적으로, 활성제를 선택할 때, 화합물 구조에 친수성 R기가 있는 경우 PEG에 태그를 지정할 수 있어야 한다(가장 일반적인 기는 술폰산 및 카복실레이트임). 시아닌 염료는 보통 PEG의 아민에 대해 높은 반응성을 보이는 클로린화된 중간체로 유도체화 될 수 있는 술폰산기(SO3-)를 포함한다. ICG(인도시아닌 그린, 상표명 CARDIOGREEN으로 이용 가능함)는 8PEGA PAI-NC에 사용하기 위한 FDA 승인된 스펙트럼 흡수(780 nm) 제제의 예이다. PAI-NC에서 사용할 수 있는 다른 것에는 예를 들어 쿠마시 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue), (abs max = 595 내지 610 nm), 알렉사 플루오르(alexa fluor) 750, IR780 및 IRDye 800, Ce6, 메틸렌 블루 및 SiNc를 포함한다.
실시예 34
고해상도 및 정밀 치료진단을 위한 시스템 및 방법. 시스템은 표적 조직, 예컨대 종양에 위치한 NC의 MRI, 및 이러한 방식으로 표적화된 조직의 영상뿐만 아니라 위치, 농도, 표적화된 조직에서 NC의 양, 이들의 조합 및 변이의 영상을 얻기 위해 표적화된 8PEGA NC를 가진 의약품을 사용한다. 영상은 표적화된 조직 및 NC의 모양, 지점(position) 및 위치(location), 및 이들의 조합 및 변형에 대한 데이터 및 정보와, 기타 정보를 제공한다. 그런 다음 영상이 저장되고 MRI의 해상도가 향상되는 광음향 영상화 장치로 전송된다. NC 및 표적화된 조직의 향상된 PAI 영상에 적어도 부분적으로 기초하거나 이를 사용하여, NC에서 활성제를 활성화하기 위한 에너지를 전달하기 위한 맞춤형 레이저 전달 패턴이 발달된다. 그런 다음 맞춤형 레이저 전달 패턴이 표적화된 조직으로 전달된다. 이러한 방식으로 병태의 매우 정확한 치료가 수행될 수 있다. 개선된 영상화, 표적화된 NC 및 사전 결정된 레이저 전달 패턴의 조합은 세포 수준을 포함하여 조직을 매우 정밀하게 제거하는 기능을 제공한다. 이러한 시스템 및 방법은 본질적으로 세포 메스(cellular scalpel)를 제공한다.
이러한 시스템은 통합 유닛에 있을 수 있다. 각각의 데이터가 다른 유닛으로 전송되는 여러 상이한 유닛일 수 있다. 이러한 방식으로 유닛을 네트워크에서 구성할 수 있다.
또한, 시스템은 특정 병태, 병태 또는 조직 유형에 대한 과거 데이터를 기반으로 레이저 전달 패턴의 효과를 모니터링하고 사전 결정된 레이저 전달 패턴을 개선하고 향상시킬 수 있다.
또한, 상기 시스템은 다양한 시간에 다양한 작업을 수행할 수 있는 능력을 제공한다. 8PEG NC는 표적화된 조직에 남아있을 수 있으며, 12시간 내지 약 1주, 약 1일 내지 약 4일, 약 12시간 내지 약 3일, 및 이러한 범위 이내의 모든 값, 및 더 길고 더 짧은 시간 동안 치료진단적 물질로서 활성 및 생존이 유지될 수 있다.
실시예 35
초음파 에너지에 노출 시 활성화되는 동적 요법제, 예컨대 활성화제를 가진 8PEGA 요법 NC.
실시예 35A
초음파 에너지에 노출 시 활성화되는 초음파역학 요법제, 예컨대 활성화제를 가진 8PEGA 요법 NC.
실시예 36
에너지원에 노출 시 활성화되는 동적 요법제를 가진 8PEGA 치료진단 NC. 상기 제제는 초음파 에너지, 광 에너지, 또는 임의의 전자기 에너지 공급원에 의해 활성화되도록 선택될 수 있다.
실시예 37
실시예 32, 32A, 32B, 33 및 34의 시스템 및 방법은 영상의 해상도, 표적 조직 및 NC의 지점, 모양 및 위치, 및 레이저 전달 패턴을 더욱 향상시키기 위해 모델 및 알고리즘을 추가로 사용할 수 있다.
실시예 38
실시예 32, 32A, 32B, 33 및 34의 시스템은 데이터의 영상 증가 계층화 및 모델링을 제공하는데 사용된다. 이러한 계층화되고 모델링된 영상은 진단, 치료 및 치료진단적 목적에 가치가 있다. 이러한 데이터, 계층화된 영상 및 둘 모두는 기계 학습과 함께 추가로 사용되어 이러한 실시예의 향상된 시스템을 제공할 수 있다.
실시예 39
실시예 32, 32A, 32B, 33 및 34의 시스템은 생물학적 조직(예: 종양 면적 대 여과 기관)에서 8PEGA NC의 정량화를 제공한다.
실시예 40
적용을 위한 8PEGA의 실시형태는 다음을 수반할 것이다: DMF에서 DCC/NHS 커플링 반응을 통해 PS를 첨가하여 8PEGA 당 약 1.5 PS를 생성함; NHS-PEG-MAL(2 kDa)을 사용하여 아민 암을 말레이미드로 전환; 잘 이해된 티올-말레이미드 반응을 통해 8PEGA에 고정하기 위한 시스테인 종결된 펩티드의 첨가; 및 8PEGA를 사용하는 DWI에 대한 추가 수정이 필요하지 않은 경우.
표제 및 실시형태
본 명세서에서 표제의 사용은 명확성을 위한 것이며 어떠한 방식으로도 제한하지 않는다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 표제 아래에 설명된 공정 및 개시내용은 다양한 실시예를 포함하여 본 명세서 전체와 관련하여 읽어야 한다. 본 명세서에서 표제의 사용은 본 발명이 제공하는 보호 범위를 제한하지 않아야 한다.
본 명세서에 기재된 시스템, 요법, 공정, 조성물, 적용 및 재료의 다양한 실시형태는 다양한 다른 분야 및 다양한 다른 활성, 용도 및 실시형태를 위해 사용될 수 있다. 추가적으로, 예를 들어, 이러한 실시형태는 기존 시스템, 요법, 공정, 조성물, 적용 및 물질과 함께 사용될 수 있으며; 향후 개발될 수 있는 시스템, 요법, 공정, 조성물, 적용 및 물질과 함께 사용될 수 있으며; 본 명세서의 교시에 기초하여 부분적으로 수정될 수 있는 시스템, 요법, 공정, 조성물, 적용 및 물질과 함께 사용될 수 있다. 또한, 본 명세서에 제시된 다양한 실시형태 및 실시예는 전체적으로 또는 부분적으로, 그리고 상이하고 다양한 조합으로 서로 함께 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 본 명세서의 다양한 실시형태 및 실시예에서 제공되는 구성은 서로 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, A, A' 및 B를 갖는 실시형태의 구성요소와 A'', C 및 D를 갖는 실시형태의 구성 요소는 본 명세서의 교시에 따라 다양한 조합, 예컨대 A, C, D, 및 A. A'' C 및 D 등으로 서로 함께 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명이 제공하는 보호범위는 특정 실시형태, 실시예, 또는 특정 실시형태, 실시예 또는 특정 도면의 실시형태에 기재된 구성 또는 배열로 제한되지 않아야 한다.
본 발명은 그 사상 또는 본질적인 특성에서 벗어나지 않고 본 명세서에 구체적으로 개시된 것 이외의 다른 형태로 구체화될 수 있다. 설명된 실시형태는 모든 측면에서 제한적이지 않고 단지 예시적인 것으로 간주되어야 한다.

Claims (109)

  1. 치료, 영상화, 진단 또는 치료진단에 적용하는 조성물로서, 상기 조성물은
    복수의 나노입자, 상기 나노입자는 백본 재료를 포함함;
    상기 백본에 부착된 활성제;
    를 포함하며,
    복수의 나노입자는 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 한정된 미리 결정된 입자 크기 분포를 갖는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, n이 약 5 nm 내지 약 25 nm의 범위의 수인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, n이 7 nm 내지 22 nm의 범위의 수인, 조성물.
  4. 제1항에 있어서, n이 약 10 nm 내지 약 20 nm의 범위의 수인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, n이 약 11 nm 내지 약 15 nm의 범위의 수인, 조성물.
  6. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 광감각제인, 조성물.
  7. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 광음향제인, 조성물.
  8. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 초음파 감응제인, 조성물.
  9. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 제2 활성제를 포함하는 조성물.
  10. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 제2 활성제를 포함하며, 상기 제2 활성제는 상기 활성제와 상이한, 조성물.
  11. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 메틸렌 블루, 클로린 e6(Ce6), 쿠마시 블루, 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  12. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 테라피롤인, 조성물.
  13. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 포르피린, 클로린, 프탈로시아닌, 및 박테리오클로린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  14. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 HPPH, TOOKAD, LUZ 11, 및 BC19포르피린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  15. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 페노티아지늄 염, 벤조페노티아지늄 염, 할로겐화된 잔텐, 스쿠아레인으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  16. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 메틸렌 블루, 톨루이딘 블루 O, PP9004, EtNBS, Rose Bengal, ASQI, 아연(II) 디피콜일아민 디-요오도-BODIPY, 및 BIMPy-BODIPY로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  17. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 전이 금속 공-배향 화합물인, 조성물.
  18. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 활성제가 루테늄, 로듐, 백금, 금 및 이리듐으로 이루어진 군으로부터 선택되는 금속을 포함하는 전이 금속 공-배향 화합물인, 조성물.
  19. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 나노입자가 8PEGA인, 조성물.
  20. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 나노입자가 BiPEG인, 조성물.
  21. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 나노입자가 표적화제를 포함하는, 조성물.
  22. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 나노입자가 표적화제를 포함하고, 상기 표적화제가 F3-cys인, 조성물.
  23. 제1항, 제2항, 및 제4항에 있어서, 나노입자가 8PEGA이고, 상기 활성제는 Ce6이고, 나노입자가 표적화제를 포함하며, 상기 표적화제가 F3-cys인, 조성물.
  24. 치료, 영상화, 진단 및 치료진단에 적용하는 조성물로서, 상기 조성물은
    복수의 나노입자, 상기 나노입자는 PEG로 구성된 백본 재료를 포함함;
    상기 백본에 부착되어 복수의 나노구조물(nanoconstruct)을 한정하는 활성제;
    를 포함하고,
    복수의 나노구조물은 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 한정된 좁은 입자 크기 분포를 갖고; 그리고
    복수의 나노구조물은 치료, 영상화, 진단 및 치료진단 적용의 수행을 가능케 하는, 조성물.
  25. 제24항에 있어서, n이 약 5 nm 내지 약 25 nm의 범위의 수인, 조성물.
  26. 제24항에 있어서, n이 약 10 nm 내지 약 20 nm의 범위의 수인, 조성물.
  27. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 광감각제를 포함하는, 조성물.
  28. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 광음향제를 포함하는, 조성물.
  29. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 초음파 감응제를 포함하는, 조성물.
  30. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 제2 활성제를 포함하며, 상기 제2 활성제는 상기 활성제와 상이한, 조성물.
  31. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 제2 활성제를 포함하며, 상기 제2 활성제는 상기 활성제와 상이하고, 제2 활성제는 나노입자에 부착된, 조성물.
  32. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 나노구조물이 제2 활성제를 포함하며, 상기 제2 활성제는 상기 활성제와 상이한, 조성물.
  33. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 메틸렌 블루, 클로린 e6(Ce6), 쿠마시 블루, 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  34. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 테라피롤인, 조성물.
  35. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 포르피린, 클로린, 프탈로시아닌, 및 박테리오클로린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  36. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 활성제가 HPPH, TOOKAD, LUZ 11, 및 BC19포르피린으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
  37. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 나노입자가 8PEGA인, 조성물.
  38. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 나노구조물이 표적화제를 포함하는, 조성물.
  39. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 구조물이 표적화제를 포함하고, 상기 표적화제가 F3-cys인, 조성물.
  40. 제24항, 제25항, 및 제26항에 있어서, 나노입자가 8PEGA이고, 활성제는 Ce6이고, 나노구조물이 표적화제를 포함하고, 상기 표적화제가 F3-cys인, 조성물.
  41. 종양 세포 파괴에 사용하기 위한 조성물로서, 상기 조성물은
    복수의 나노입자를 포함하는 부형제;
    상기 부형제와 결합된 광감각제;
    를 포함하고,
    상기 부형제는 필수적으로 PEG로 이루어진 백본을 포함하고; 그리고
    상기 부형제는 D10 = n - 5, D50 = n, D90 = x + 5로 한정된 입자 크기 분포를 갖는, 조성물.
  42. 제41항에 있어서, n이 약 5 nm 내지 약 25 nm의 범위의 수이고, 나노입자는 8PEGA이고, 활성화제가 Ce6인, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 표적화제를 포함하는 조성물.
  44. 제43항에 있어서, 표적화제가 F3-cys인, 조성물.
  45. 치료 적용 가이드에 사용하기 위한 데이터 수득 방법으로서, 상기 방법은
    복수의 나노입자를 포함하는 영상화제를 대상체에 투여하는 것;
    상기 나노입자는 중금속이 없는 것; 그리고
    영상화제 투여 후 대상체의 핵 자기 공명 스캔을 수행하는 것;
    을 포함하고,
    상기 나노입자는 직접적으로 영상화되며; 이에 따라 나노입자의 MRI 및 나노입자와 대상체와 관련된 데이터가 제공되는, 방법.
  46. 제45항에 있어서, 나노입자가 PEG를 포함하는, 방법.
  47. 제45항에 있어서, 나노입자가 8PEGA를 포함하는, 방법.
  48. 제45항에 있어서, 나노입자가 치료진단적 나노구조물을 한정하는, 방법.
  49. 제45항에 있어서, 나노입자가 PDT 나노구조물을 한정하는, 방법.
  50. 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 및 제49항에 있어서, 데이터가 종양의 모양 및 위치를 식별하는, 방법.
  51. 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 및 제49항에 있어서, 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  52. 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 및 제49항에 있어서, 적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것; 및 PDT가 제공된 후 나노입자의 MRI를 수득하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  53. 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 및 제49항에 있어서, 데이터를 PDT 시스템에 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  54. 제45항, 제46항, 제47항, 제48항, 및 제49항에 있어서, 데이터를 의료 기록에 제공하는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  55. PDT 제공 방법으로서, 상기 방법은
    대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것;
    을 포함하며,
    상기 나노입자는 중금속이 실질적으로 없는, 방법.
  56. 제55항에 있어서, 나노입자가 1 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  57. 제55항에 있어서, 나노입자가 0.1 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  58. 제55항에 있어서, 나노입자가 0.01 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  59. 제55항에 있어서, 나노입자가 0.001 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  60. PDT 제공 방법으로서, 상기 방법은
    대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 제공하는 것;
    을 포함하며,
    상기 나노입자는 가돌리늄이 실질적으로 없는, 방법.
  61. 제60항에 있어서, 나노입자가 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  62. 제60항에 있어서, 나노입자가 0.1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  63. 제60항에 있어서, 나노입자가 0.01 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  64. 제60항에 있어서, 나노입자가 0.001 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  65. 치료 적용 가이드에 사용하기 위한 데이터 수득 방법으로서, 상기 방법은
    복수의 나노입자를 포함하는 영상화제를 대상체에 투여하는 것;
    상기 나노입자는 가돌리늄이 실질적으로 없는 것; 그리고
    영상화제 투여 후 대상체의 핵 자기 공명 스캔을 수행하는 것;
    을 포함하고,
    상기 나노입자는 직접적으로 영상화되며; 이에 따라 나노입자의 MRI 및 나노입자와 대상체와 관련된 데이터가 제공되는, 방법.
  66. 제66항에 있어서, 나노입자가 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  67. 제66항에 있어서, 나노입자가 0.1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  68. 제66항에 있어서, 나노입자가 0.01 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  69. 제66항에 있어서, 나노입자가 0.001 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  70. PDT를 발달시키는(develope) 방법으로서, 상기 방법은
    대상체에서 나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 PDT를 발달시키는 것;
    을 포함하고,
    상기 나노입자는 중금속이 실질적으로 없는, 방법.
  71. 제70항에 있어서, 나노입자가 1 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  72. 제70항에 있어서, 나노입자가 0.1 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  73. 제70항에 있어서, 나노입자가 0.01 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  74. 제70항에 있어서, 나노입자가 0.001 ppm 미만의 중금속을 갖는, 방법.
  75. 제71항, 제72항, 제73항 및 제74항에 있어서, PDT의 발달이 광감각제의 평가를 포함하는, 방법.
  76. 제71항, 제72항, 제73항 및 제74항에 있어서, PDT의 발달이 표적화제의 평가를 포함하는, 방법.
  77. 제71항, 제72항, 제73항 및 제74항에 있어서, PDT의 발달이 나노구조물의 평가를 포함하는, 방법.
  78. 제71항, 제72항, 제73항 및 제74항에 있어서, 데이터가 나노입자의 직접적인 NMR 영상을 포함하는, 방법.
  79. 제71항, 제72항, 제73항 및 제74항에 있어서, 대상체가 동물, 포유류 및 인간으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  80. 치료법 개발 방법으로서, 상기 방법은
    나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 치료법을 개발하는 것;
    을 포함하고,
    나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  81. 제80항에 있어서, 치료법 개발이 약물 개발, 암 치료 개발, 심장 조건 개발, 유전 물질 분석, 반응 경로 분석 및 약동학으로 이루어진 군으로부터 선택되는 평가를 포함하는, 방법.
  82. 제80항 및 제81항에 있어서, 나노입자가 생체 내에서 영상화되는, 방법.
  83. 제80항 및 제81항에 있어서, 나노입자가 시험관 내에서 영상화되는, 방법.
  84. 물질 개발 방법으로서, 상기 방법은
    나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 물질을 개발하는 것;
    을 포함하고,
    상기 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 방법.
  85. 대상체의 평가 방법으로서, 상기 방법은
    나노입자의 MRI로부터 데이터를 수득하는 것; 그리고
    적어도 부분적으로 데이터를 사용하여 대상을 평가하는 것;
    을 포함하고,
    상기 나노입자는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는 것인, 방법.
  86. 제88항에 있어서, 대상은 물질, 약물, 공정, 반응 경로 및 제조 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  87. 핵 자기 공명 영상화제로서, 상기 영상화제는
    실질적으로 중금속이 없는 복수의 나노입자;
    PEG를 포함하는 나노입자;
    를 포함하고,
    상기 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있는, 영상화제.
  88. 핵 자기 공명 영상화제로서, 상기 영상화제는
    복수의 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자는 PEG를 포함함;
    상기 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화되어, 나노입자의 영상을 생성하고; 그리고
    상기 영상화제는 실질적으로 중금속이 없는, 영상화제.
  89. 핵 자기 공명 영상화제로서, 상기 영상화제는
    1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는 복수의 나노입자;
    PEG를 포함하는 나노입자;
    를 포함하고,
    상기 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있는, 영상화제.
  90. 핵 자기 공명 영상화제로서, 상기 영상화제는
    복수의 나노입자를 포함하고, 상기 나노입자는 PEG를 포함함;
    상기 나노입자는 자기 공명 영상화 시스템에 의해 생성된 자기장에 의해 직접적으로 영상화되어, 나노입자의 영상을 생성하고; 그리고
    상기 영상화제는 1 ppm 미만의 가돌리늄을 갖는, 영상화제.
  91. 자기 공명 영상화 장치에서 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있는 나노입자를 포함하는 영상화제로서, 상기 나노입자는
    백본 물질을 포함하는 나노구조물을 포함하고, 상기 백본 물질은 비-상자성임; 그리고
    상기 나노구조물은 자기장에 의해 직접적으로 영상화될 수 있는, 영상화제.
  92. 제91항에 있어서, 나노구조물이 약 2,000 내지 약 5,000개의 양성자를 포함하고; 상기 나노구조물은 25 nm 미만인, 영상화제.
  93. 제91항에 있어서, 나노구조물이 약 3,600개의 양성자를 포함하고; 상기 나노구조물은 25 nm 미만인, 영상화제.
  94. 제91항에 있어서, 나노구조물이 약 3,000 내지 약 5,000개의 양성자를 포함하고; 상기 나노구조물은 20 nm 미만인, 영상화제.
  95. 제91항에 있어서, 나노구조물이 약 5,000 내지 약 15,000개의 양성자를 포함하고; 상기 나노구조물은 50 nm 미만인, 영상화제.
  96. 제91항에 있어서, 나노구조물이 광감각제를 포함하는, 영상화제.
  97. 제91항에 있어서, 나노구조물이 표적화제를 포함하는, 영상화제.
  98. 제91항에 있어서, 나노구조물이 표적화제 및 영상화제를 포함하는, 영상화제.
  99. 제91항에 있어서, 나노구조물이 종양 열망적(tumor avid)인, 영상화제.
  100. 제87항 내지 제99항의 영상화제 또는 나노입자 중 적어도 하나의 영상을 직접적으로 수득하면서 MRI에서 치료법을 수행하는 방법.
  101. 제100항에 있어서, 치료법이 수술을 포함하는, 방법.
  102. 제100항에 있어서, 치료법이 PDT를 포함하는, 방법.
  103. 3개의 자기장을 생성하도록 구성된 MRI 시스템으로서; 제1의, 강력한 정적 자기장은 스핀 각 운동량으로 핵에 에너지 수준 차이를 생성하고 벌크 핵 자성화를 일으키고; 제2의, 무선 주파수 장은 생성된 핵 자성화를 기울이는데 사용되어 RF 코일에 의해 검출될 수 있고; 제3 자기장 구배 세트는 신호를 공간적으로 인코딩하여 핵 자성화의 맵을 생성하고; 상기 자기장들은 영상화될 대상체에 배치된 첨가제에 존재하는 물이 아닌 양성자의 영상을 생성하기 위해 구성되며; 상기 자기장 구배는 유동 또는 확산으로 인한 움직임에 대해 핵을 민감하게 하기 위해 특이적인 방식으로 펄스될 수 있는, MRI 시스템.
  104. 8PEGA 영상화제를 영상화하는 방법으로서, 상기 방법은 반복 시간 TR = 500 ms, 에코 시간 TE = 200 ms, 진폭
    Figure pct00013
    을 가진 구배를 인코딩하는 한 쌍의 확산, 지속시간
    Figure pct00014
    , 및 분리
    Figure pct00015
    를 가진 확산 가중치 스핀-에코 영상화 시퀀스를 제공하여 1010 s/m2의 확산 b 값을 생성하는 것을 포함하는, 방법.
  105. 제104항에 있어서, 자기장 구배는
    Figure pct00016
    에 의해 MR 신호 강도를 감소시키는, 상기 식에서
    Figure pct00017
    임, 방법.
  106. 대상체에서 PEG 기반 영상화제에서 양성자를 영상화하도록 구성된 MRI 시스템.
  107. MRI 업그레이드 방법으로서, 상기 방법은 MRI에서 제어 시스템에 작동 명령을 추가하는 것을 포함하며, 상기 추가된 작동 명령은 PEG 기반 영상화제에서 양성자를 영상화하기 위해 MRI에 대한 작동 매개변수를 제공하는, 방법.
  108. 대상체에서 MRI 영상을 수득하는 방법으로서, 상기 방법은 대상체에 영상화제를 투여하는 것; 및 대상체의 MRI 영상을 수득하는 것을 포함하며, MRI 영상은 영상화제에 포함된 비-물 기반 양성자의 직접적인 영상을 포함하는, 방법.
  109. 제108항에 있어서, 영상화제가 PEG 기반 영상화제인, 방법.
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