KR20210045878A

KR20210045878A - 지질이 접합된 유전자편집 단백질 기반 crispr 복합체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20210045878A
Application number: KR1020190129452A
Authority: KR
Inventors: 정현정; 임산해; 강유경
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-10-17
Filing date: 2019-10-17
Publication date: 2021-04-27
Also published as: KR102433471B1

Abstract

본 발명은 지질이 접합된 유전자편집 단백질 기반 CRISPR 복합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 지질을 직접 접합시켜 변형시킨 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA를 포함하는 리보핵산단백질 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 편집 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 상기 CRISPR 복합체는 종래 비특이적 편집, 유전자 변이, 생체독성 유발, 낮은 유전자 편집 효율 등의 문제점을 해결할 수 있는 효율적이고 안전한 비바이러스성 유전자 편집 수단으로써 동물모델 제작, 미생물공학, 질병 치료 등 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

지질이 접합된 유전자편집 단백질 기반 CRISPR 복합체 및 이의 제조방법{Lipid conjugated genome editing protein-based CRISPR complex and fabrication method thereof}

본 발명은 지질이 접합된 유전자편집 단백질 기반 CRISPR 복합체, 이의 제조방법, 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 지질을 직접 접합시켜 변형시킨 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA를 포함하는 리보핵산단백질 복합체, 이의 제조방법, 및 이를 이용한 유전자 편집 용도에 관한 것이다.

유전자 치료제는 타겟에 높은 특이성을 가진 약제를 설계함에 있어 간편하면서도 다양한 용도로 사용될 수 있기 때문에, 종래의 저분자 약제 또는 항체 치료제보다 혁신적인 접근방법으로 소개되어 왔다. 특히, 현재 치료법이 없는 희귀·유전 질환이나 기본 치료법에 대한 미충족 수요가 높은 퇴행성·난치성 질환에 대하여 치료를 가능하게 할 것으로 기대되며, 근본적 치료를 가능하게 하므로 질병 완치의 가능성을 제공하면서 높은 시장 잠재력을 보유하고 있다. 종래 유전자 치료는 플라스미드 DNA, mRNA, siRNA 및 단백질 복합체와 같은 외인성 뉴클레오티드의 전달을 통해 이루어져왔다. 이러한 외인성 뉴클레오티드 또는 단백질을 세포 내로 전달하는 방법은 크게 바이러스 이용 여부에 따라 바이러스성 벡터와 비바이러스성 벡터로 구분할 수 있다. 레트로바이러스 (retroviruses), 아데노-연관 바이러스 (adeno-associated viruses; AAV), 아데노바이러스 (adenoviruses), 렌티바이러스 (lentiviruses)와 같은 바이러스 벡터는 높은 전달 효율을 나타내어 외인성 뉴클레오티드를 전달하기 위한 방법으로 선호되어 왔다. 그러나 제한된 DNA 패키징 용량, 면역원성, 발암성 등의 임상적 한계를 가져 이러한 문제를 피할 수 있는 다양한 비바이러스성 전달방법이 연구되고 있다.

최근 새롭게 진보된 유전자 편집 기술은 모델 유기체의 유전자 조작뿐만 아니라 유전자 치료제의 개발에 새로운 시대를 열었다. 현재 유전자 편집 기술은 특정 유전자를 인식하거나 변이시키는 방식에 따라 ZFN(zinc finger nuclease), TALEN(transcription activator-like effector nuclease), CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat) 등이 있다. 상기 ZFN 또는 TALEN과 같은 유전자 편집 기술은 높은 비용, 복잡한 시스템 설계, 긴 시간 소요 및 힘든 조작 등 임상 적용에 많은 한계점들을 가지고 있다. 한편, CRISPR 시스템은 계통학적으로 1형, 2형, 3형으로 나누어지며, 이 중 2형인 화농성연쇄상구균(Streptococcus pyogens) 유래의 Cas9 단백질(SpCas9)은 유전자 편집에 있어 상보적인 결합을 통해 특정 유전자를 표적으로 하는 단일 가이드 RNA (single guide RNA; sgRNA)의 도움으로 DNA에서 이중 가닥 절단을 일으키는 작용을 한다. 특히, sgRNA의 표적 특이적 crRNA는 5’-NGG-3’의 서열을 지니는 PAM (protospacer-adjacent-motif) 염기서열을 인식하여 높은 표적 효율을 선보이며, 그 길이가 20 뉴클레오티드 정도로 초창기 유전자 가위인 ZFN (zinc finger nuclease) 또는 TALEN (transcription activator-like effector nuclease)에 비하여 매우 짧고, 다른 통상적인 유전자 편집법에 비해 단순화된 설계 및 제작으로 큰 이점을 제공한다. 이렇게 CRISPR 시스템은 표적 유전자 내의 특이적 절단을 유도함으로써 동물모델 제작에 널리 활용되고 있을 뿐만 아니라, 표적유전자를 억제 또는 편집하는 기능을 이용하여 치료제로 적용하고자 하는 연구가 지속적으로 시도되고 있다. 현재까지 CRISPR은 높은 형질감염 효율을 지니는 바이러스성 벡터를 이용한 편집 방법이 가장 많이 이용되고 있다. 그러나 바이러스 벡터는 독성, 세포성 면역반응 유도 및 항체 중화 반응 등의 문제로 인해 임상적 적용에 있어 한계를 가진다(Bouard, D., et al. Br. J. Pharmacol. 157, 153 (2009)).

상기와 같은 바이러스를 이용한 전달방법의 한계점을 극복하여 CRISPR 제한효소 단백질 및 sgRNA를 세포 내로 안전하게 전달할 수 있는 방법으로 다양한 비바이러스성 전달방법이 연구되고 있다. 그러나 비바이러스성 세포 내 전달은 바이러스 벡터를 이용하는 경우에 비해 전달 효율이 낮은 단점이 있다. 특히, 일반적으로 단백질 기반의 전달은 생체 내 즉각적인 효소에 의한 분해 또는 표적 부위에 대한 낮은 전달 효율로 인해 효능이 떨어지게 된다. 따라서 비바이러스성 전달방법의 낮은 전달 효율을 극복하는 것이 큰 과제이다.

이러한 측면에서, 양이온성 고분자, 지질 기반 캐리어 물질, 무기 나노입자, 세포 침투성 펩티드 및 덴드리머(dendrimer)와 같은 운반체 물질을 이용한 CRISPR 시스템의 전달방법들이 보고되어 왔다. 그러나 이들 물질들은 양이온성 또는 지용성을 지녀 생체 활성 분자를 응집시킬 수 있다는 한계가 있고, 상기 지질 계열 소재를 이용해 Cas 단백질과 sgRNA를 물리적, 비공유결합으로 봉입시킬 경우 낮은 봉입 효율로 인해 과량의 사용에 따른 독성 문제 등이 야기되어 실질적인 적용이 제한되는 문제가 있다. 따라서 세포 내 독성이 없이 안전하면서도 높은 효율로 CRISPR 시스템을 세포 내로 전달할 수 있는 새로운 전달방법의 개발이 필요한 실정이다.

본 발명자들은 상기와 같은 종래의 한계점을 극복하고, CRISPR 제한효소 단백질 및 sgRNA를 세포 내로 효율적으로 전달하여 효과적인 유전자 편집이 가능한 비바이러스성 유전자 편집 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 상기 CRISPR 효소 단백질에 지질을 직접 화학적으로 접합(conjugation)시킴으로써 지질이 접합된 Cas9 / sgRNA 복합체를 제조하였고, 상기 복합체의 우수한 세포 내 전달 및 유전자 편집 효율과 함께 체내 안전성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 지질이 접합된, CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 CRISPR 복합체 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR 복합체를 포함하는 유전자 편집용 조성물, 상기 조성물을 이용한 유전자 편집 방법을 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 지질이 접합된, CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 CRISPR 효소 단백질은 Cas1(CRISPR associated protein 1), Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, C2c2(Cas13a), dCas9(dead Cas9), Cas9 nickase, CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 구현예로, 상기 지질은 유기화합물 연결고리(linker) 물질을 매개로 접합된 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-snglycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate), 포스파티딜글리세롤(Phosphatidylglycerol), DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(Phosphatidylserine), DOPS(dioleoylphosphatidylserine)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인지질일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 유기화합물 연결고리는 합성 고분자 또는 저분자 유기화합물로, 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리프로필렌렌옥사이드(polypropylene oxide), 폴리락트산코글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락트산(poly-lactic acid), 폴리글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 저분자 알케인 사슬(alkane chain), 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 접합은 CRISPR 효소 단백질 상의 티올(thiol) 또는 아민(amine)과의 반응을 통해 이루어지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는, CRISPR 복합체를 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 복합체는 상동 유도 교정(homology directed repair)을 일으키는 올리고핵산(oligonucleotide DNA)을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 1:0.01 내지 1:100의 몰비로 혼합하는 단계를 포함하는, CRISPR 복합체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 CRISPR 복합체를 포함하는, 유전자 편집용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 편집용 조성물을 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는, 유전자 편집 방법을 제공한다.

본 발명의 일구현예로, 상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있다.

본 발명에 따른 지질이 접합된 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA로 구성된 CRISPR 복합체는 종래 사용되어온 전달 방법에 비하여 적은 양의 전달체 물질로도 세포 내로의 전달 효율이 매우 우수하여 효과적인 유전자 편집이 가능하며, 체내 안전성이 높은바, 상기 CRISPR 복합체는 종래 비특이적 편집, 유전자 변이, 생체독성 유발, 낮은 유전자 편집 효율 등의 문제점을 해결할 수 있는 효율적이고 안전한 비바이러스성 유전자 편집 수단으로써 동물모델 제작, 미생물공학, 질병 치료, 농수산물 개량, 분자생물학 연구 등 다양한 분야에서 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명에 따른 지질이 접합된 CRISPR 효소 단백질(spCas9-PEG-DSPE)의 제조방법에 대한 모식도를 간단히 나타낸 것이다.
도 2는 spCas9 단백질 및 sgRNA를 제조 및 정제한 결과를 나타낸 것으로, 도 2a 및 도 2b는 정제된 spCas9(Streptococcus pyogenes Cas9) 단백질의 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이고, 도 2c는 EGFR 및 mecA를 표적하는 sgRNA를 합성하기 위한 주형의 뉴클레오티드 서열을 나타낸 것이며, 도 2d는 power-pfu DNA 중합효소에 의해 합성된 dsDNA를 아가로오스 겔 전기영동으로 확인한 결과이고, 도 2e는 T7 RNA 중합효소에 의해 합성된 sgRNA를 아가로오스 겔 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에 따른 지질이 접합된 spCas9 단백질과 sgRNA 복합체의 물리화학적 특성을 분석한 결과로서, 도 3a는 spCas9 / sgRNA 복합체를 제조하고 이의 엔도뉴클레아제 활성을 확인한 전기영동 결과이고, 도 3b 및 도 3c는 인지질이 접합되거나 접합되지 않은 spCas9, 및 상기 단백질과 sgRNA의 복합체를 제조하고 각각의 크기 및 제타전위를 측정한 결과이다.
도 4는 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체의 세포 내 흡수 효율을 공초점 현미경으로 관찰한 결과로서, 도 4a는 인지질이 접합되지 않은 원래 형태의 Cas9 / sgRNA 복합체를 대조군으로 하여 세포 내로의 전달 효율을 비교분석한 결과이고, 도 4b는 spCas9 단백질과 DSPE-PEG(2000)을 단순히 혼합한 경우를 대조군으로 하여 세포 내로의 전달 효율을 비교분석한 결과이다.
도 5는 Annexin V 어세이를 통해 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체(LdCC)의 세포독성을 분석한 결과이다.
도 6은 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체(LdCC) 의 유전자 편집 기능을 확인하기 위해 in vitro 절단 분석을 실시한 후 전기영동으로 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체(LdCC)의 생체 내 분포 및 암 치료 가능성을 검증한 결과로서, 도 7a는 H1975 세포가 주입된 이종이식 누드마우스를 이용한 in vivo 실험 과정을 그림으로 간략히 도시한 것과 spCas9 및 sgRNA에 각각 Alexa Fluor 647 및 ICG 형광 염료를 접합시킨 결과를 확인한 것이며, 도 7b는 상기 Alexa Fluor 647 및 ICG가 접합된 spCas9 / sgRNA 및 LdCC를 주입한 마우스에서 각 장기를 적출한 후 형광 이미지를 관찰한 결과이고, 도 7c는 상기 이종이식 마우스에서 종양을 분리한 후 형광 이미지를 관찰한 결과 및 이를 정량적으로 분석한 결과이다.

CRISPR의 리보핵산단백질(RNP, ribonucleoprotein) 복합체 기반 전달 방법은 기존의 바이러스성 전달 방법에 비해 생체독성이 낮고, 비표적 효과(off target effect)가 낮지만, 전달 효율성이 낮은 단점이 있다. 따라서 RNP 기반 전달 방법의 전달 효율을 증가시키기 위하여 양이온성 중합체, 금 나노입자, 리포좀(liposome) 등이 사용되어 왔으나, 이러한 방법의 대부분은 Cas9과 전달체물질의 단순 혼합에 의한 비공유 결합으로 복합체를 형성시키는 것이며, 과량의 전달체 물질의 사용이 요구되어 높은 독성을 유발할 수 있다. 이에 본 발명자들은 spCas9에 지질을 직접 화학적으로 접합시키는 방법을 개발하고자 하였다.

이에, 본 발명자들은 생체 및 세포 내 독성을 최소화하여 안전하면서도 높은 효율로 CRISPR 시스템을 세포 내로 전달할 수 있는 방법을 개발하고자 연구 노력한 결과, Cas9 단백질에 지질을 직접 화학적으로 접합(conjugation)시킴으로써 지질이 접합된 Cas9 / sgRNA 복합체를 제조하였고, 상기 복합체의 우수한 세포 내 전달 및 유전자 편집 효율과 함께 체내 안전성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명은 지질이 접합된, CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질을 제공한다.

본 발명에서 사용되는 용어, “CRISPR”은 박테리아에서 외부 핵산 요소로부터 저항성을 부여하는 후천성 면역체계에서 유래한 유전자 가위 시스템을 말한다. 박테리아는 바이러스에 감염됐을 때 그 바이러스 DNA의 일부를 자신의 유전체에 저장해 놓는다. 그 후 재감염이 일어나면 저장해 놓은 정보를 바탕으로 작은 가이드 RNA(sgRNA: small guide RNA)를 만들어낸 후 Cas9이라는 엔도뉴클레아제와 함께 결합하여 외부 DNA를 절단한다. 이때 sgRNA는 원하는 표적유전자에 상보적 염기쌍을 이루어 결합하여 특이성을 결정하고 Cas9 단백질은 표적유전자를 자르는 핵산가수분해효소로서의 역할을 수행한다. 따라서 상기 sgRNA 염기서열에 따라 어떠한 DNA 염기서열도 자를 수 있기 때문에 최근 CRISPR-Cas9 유전자 가위를 이용한 활발한 연구가 진행되고 있다.

본 발명에 있어서, 상기 CRISPR 효소 단백질은 Cas1(CRISPR associated protein 1), Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, C2c2(Cas13a), dCas9(dead Cas9), Cas9 nickase, CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것 또는 이의 재조합 단백질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 Cas9일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine) DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-snglycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate), 포스파티딜글리세롤(Phosphatidylglycerol), DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(Phosphatidylserine), DOPS(dioleoylphosphatidylserine)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인지질일 수 있으며, 보다 바람직하게는 DSPE일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 지질은 단백질의 화학적 안정성, 제형의 안정성, 및 생체 내 안정성을 증가시킬 수 있는 연결고리 물질을 매개로 접합된 것일 수 있으며, 상기 연결고리는 합성 고분자 또는 저분자 유기화합물일 수 있고, 보다 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리프로필렌렌옥사이드(polypropylene oxide), 폴리락트산코글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락트산(poly-lactic acid), 폴리글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 저분자 알케인 사슬(alkane chain), 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 지질과 CRISPR 효소 단백질 간의 접합은 CRISPR 효소 단백질 상의 티올(thiol) 또는 아민(amine)과의 반응을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하며, 보다 바람직하게는 티올(thiol)과 말레이미드(maleimide), 말레이미드 유도체, 할로아세틸(haloacetyl), 피리딜 다이설파이드(pyridyl disulfide)와의 반응; 또는 아민(amine)과 N-하이드록시석신이미드(N-hydroxysuccinimide), 알데하이드(aldehyde), 이소시아네이트(isocyanate), 이소티오시아네이트(isothiocyanate), 이미도에스터(imidoester), 에폭사이드(epoxide), 카보네이트(carbonate), 아실아자이드(acyl azide), 설포닐 클로라이드(sulfonyl choloride), 안하이드라이드(anhydride), 카보다이이미드(carbodiimide)와의 반응을 통해 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명자들은 도 1에 도시된 방법에 따라 인지질이 접합된 CRISPR 효소 단백질을 제조하였으며, 실시예에서 상기 단백질과 sgRNA와의 복합체를 제조한 후 이의 물리화학적 특성, 세포 내 전달 효율, 유전자 편집 기능, 세포독성, 생체 내 분포 등을 분석하였다.

본 발명의 일실시예에서는, 대장균을 이용해 spCas9 단백질을 발현시키고 이를 정제하여 수득한 다음, 티올-말레이미드 반응을 이용해 인지질이 접합된 spCas9 단백질을 제조하기 위하여 DSPE-PEG(2000)-말레이미드를 spCas9의 두 개의 시스테인 잔기(Cys80, Cys574)의 티올기와 반응시켜 spCas9-PEG-DSPE를 제조하였다. 한편, EGFR L858R 및 mecA를 각각 표적하는 sgRNA를 합성하여 상기 DSPE-PEG-spCas9와 반응시켜 지질 개질 CRISPR 복합체(lipid derivatized CRISPR complex; 이하, LdCC)를 제조하였다(실시예 1 참조).

본 발명의 다른 실시예에서는, LdCC의 물리화학적 특성을 분석한 결과 LdCC의 유체역학적 크기는 인지질이 접합되지 않은 원래 형태의 spCas9 / sgRNA 보다 크고 제타전위 측정결과 인지질 접합에 의해 더 큰 음이온성을 나타내는 것을 확인하였다(실시예 2 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 포유류 암세포인 A549 및 U2OS 세포주를 대상으로 LdCC의 세포 내 흡수율을 분석하였으며, 그 결과 대조군으로 이용한 인지질이 접합되지 않은 spCas9 / sgRNA, 및 spCas9 / sgRNA 복합체와 DSPE-PEG의 단순 혼합물에 비하여 세포 내 흡수율이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 본 발명에 따른 LdCC는 인지질 접합에 의하여 CRISPR 복합체의 세포 내 전달 효율이 현저히 향상된 것을 알 수 있었다(실시예 3 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 LdCC의 생체 내 안전성을 검증하기 위해 세포독성 분석을 실시하였으며, 그 결과 종래 약물전달에 많이 이용되는 리포펙타민을 이용한 경우 세포독성이 유발된 반면, 본 발명에 따른 복합체는 세포독성을 유발하지 않는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 LdCC의 유전자 편집 활성을 확인하였으며, 그 결과 인지질이 접합되지 않은 spCas9 / sgRNA이 갖는 것과 동일하게 DNA 절단 기능을 갖는 것을 알 수 있었다(실시예 5 참조).

본 발명의 또 다른 실시예에서는, 본 발명에 따른 LdCC의 생체 내 분포와 암 치료 가능성을 검증하기 위해 H1975 세포를 주입한 이종이식 마우스 모델을 이용하여 실험을 진행한 결과, 상기 복합체는 간과 신장에 대부분 존재하는 것을 확인하였고 마우스에서 종양을 분리하여 관찰하였을 때 원래 형태의 spCas9 / sgRNA 복합체보다 LdCC가 더 많이 존재하는 것을 확인하였다. 이를 통해 본 발명에 따른 CRISPR 복합체의 임상시험 적용 가능성을 알 수 있었다(실시예 6 참조).

이에, 본 발명은 상기 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는 CRISPR 복합체를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 CRISPR 복합체는 인지질이 접합된 CRISPR 효소 단백질과 표적유전자에 대한 sgRNA를 혼합한 제형으로, 전술한 CRISPR 효소 단백질과 sgRNA의 물리적인 상호 작용으로 형성된 복합물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 CRISPR 복합체는 상동 유도 교정(homology directed repair)을 일으키는 올리고핵산(oligonucleotide DNA)을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 sgRNA는 효소 단백질을 유전체상의 표적 유전자의 특이적 부위로 안내하는 리보핵산이며, PAM (protospacer-adjacent motif) 서열과 근접한 표적 부위인 프로토스페이서(protospacer)에 대한 CrRNA(CRISPR RNA) 및 TracrRNA(trans-activating RNA) 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 sgRNA의 표적 유전자로는 발명자가 원하는 표적 유전자를 어느 것이든 선택할 수 있으며, 예컨대 mecA, mecR1, aph, NDM-1, KPC, oxa, ure, lrg, cap, spl, KPC, GES, IMP, VIM, KRAS, Stk11, TP53, PTEN, BRCA1, BRCA2, Akt, Stat, Stat4, JAK3,JAK2, WT1, ERBB2, ERBB3, ERBB4, NF1, NOTCH1, NOTCH3, ATM, ATR, HIF, HIF1α, HIF3 α, Met, Bcl2, FGFR1, FGFR2, CDKN2α, APC, RB, MEN1, PPAR α, PPAR γ, AR, TSG101, IGF, Igf1, Igf2, Bax, Bcl2, caspase, Kras, Apc, NF1, MTOR, Grm1, Grm5, Grm7, Grm8, mGlurR1, mGlurR5, mGlurR8, PLC, AMPK, MAPK, Raf, ERK, TLR4, BRAF, PI3K,F8, F8C, F9, HEMB, KIR3DL1, NKAT3, NKB1, AMB1I, KIR3DS1, IFNG, CXCLI2, IL2RG, SCIDX1, SCIDX, IMD4, CCR5, SCYA5, D17S136E, TCP228, CXCR2, CXCR3, CXCR4, CCR4, CCR6, CCR7, CX3CR1, CD4, CFTR, HBB, HBA2, HBD, HBA1, LCRB, SCN1A, CHD8, FMR1, VEGF, EGFR, myc, Bcl-2, survivin, SOX2, Nrgl, Erb4, Cplx1, Tph1, Tph2, GSK3, GSK3α, GSK3 β, El, UBB, PICALM, PSI, SORL1, CR1, Ubal, Uba3, CHIP, UCH,Tau, LRP, CH1P28, Uchl1, Uchl3, APP, Cx3crl, ptpn22, TNF-α, NOD2, IL-1a, IL-1b,IL-6, IL-10, IL-12, IL-1a, IL-1b IL-13, IL-17a, IL-17b, IL-17c, IL-17d, IL-17f, CT1LA4, Cx3c11J, DJ-1, PINK1, Prp, DJ-1, PINK1, LRRK2, ALAS2, ASB, ANH1, ABCB7,ABC7, ASAT, CDAN1, CDA1, DBA, PKLR, PK1, RIPS19, NT5C3, UMPH1, PSN1, RHAG,RH50A, NRAMP2, SPTB, TBXA2R, P2X1P, 2RX1, HF1, CFH, HUS, MCFD2, Drd2, Drd4, ABAT, BCL7A, BCL7,TALI, TCL5, TAL2, FLT3,NBS1, NBS, ZNEN1A1, TYR, ALDH, ALDH1A1, ADH, FASN, PI, ATT, F5, MDC1C, LAMA2, LAMM,LARGE, MDC1D, FCMD, TTID, MYOT, CAPN3, CANP3, DYSF, SGCG, DMDA1, SCG3, SGCA,ADL, DAG2, DMDA2, SGCB, LGMD2B, LGMD2C, LGMD2D, LGMD2E, LGMD2F, LGMD2G, LGMD2H, LGMD2I, SGCD, SGD, CMD1L, TCAP, CMD1N, TRIM32, HT2A, FKRP, POMT1, CAV3, LGMD1C,SEPN1, SELN, RSMD1, PLEC1, PLTN, EBS1, PPP2R1A, PPP2CA, PPP1CC, PPP2R5C, GFP, RFP, YFP, tdTomato, mCherry, luciferase 등을 표적 유전자로 할 수 있으나, 이는 예시적인 것일 뿐이며 당업자가 적절하게 선택하여 이용할 수 있다.

상기 CRISPR 복합체는 본 발명에 따른 CRISPR 효소 단백질 및 sgRNA를 1:0.01 내지 1:100의 몰비로 혼합하여 제조할 수 있으며, 보다 바람직하게는 1:1 내지 1:3의 비율로 혼합하여 제조할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 상기 CRISPR 복합체를 포함하는 유전자 편집용 조성물을 제공한다.

상기 조성물이 약제학적 조성물인 경우, 약제학적으로 허용되는 담체가 포함된다. 상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 비경구 투여가 가능하며, 예컨대 정맥 내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하투여 또는 국부투여될 수 있다. 또한, 그밖에도 경구투여, 직장투여, 흡입투여, 경비투여 등이 가능하다.

본 발명의 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태일 수 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 유전자 편집용 조성물을 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는 유전자 편집 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포일 수 있으며, 보다 바람직하게 HeLa, A549, MDAMB, SK-BR-3, OVCAR, PC3, PC12, HEK293, Jurkat, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, RAW264.7, 대식세포, 단핵구, 호중구, NK 세포(natural killer cell), 수지상세포(dendritic cell), MDSC(Myeloid-derived Suppressor Cell), 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 유도만능줄기세포(iPSC), 혈관내피세포, 표피세포, 간세포, 근육세포, 뼈세포, 섬유아세포, 연골세포, 신경세포, 신장 세포, 뇌세포, 심장 세포, 위세포, 소장 세포, 대장 세포, 췌장 세포, 암 세포, 곰팡이 세포, 및 기생충 세포 등의 진핵세포이거나, 또는 S. aureus, E. coli, P. aeruginosa, K. pneumoniae, A. baumannii, B. subtilis, S. epidermidis, E. faecalis, S. pneumoniae 등의 원핵세포일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. Cas9-지질 접합체 및 sgRNA의 제조

1-1. spCas9 단백질의 발현 및 정제

본 발명자들은 세포 내 전달 효율 및 체내 안정성이 향상된, 지질이 접합된 Cas-9 단백질 및 sgRNA로 구성된 CRISPR 복합체를 제조하기 위하여 하기와 같은 실험들을 진행하였다.

먼저, spCas9 단백질을 얻기 위해 이를 발현하는 대장균을 이용하였다. 보다 구체적으로, 각각 spCas9 및 spCas9-GFPuv(green fluorescent protein)를 발현하는 대장균 (Rosetta)을 37℃에서 16시간 동안 배양한 후 0.5 mM IPTG를 처리하였다. 상기 단백질의 발현 유도 후, 대장균을 8000g, 4℃에서 원심분리 하였으며, 모든 대장균 펠렛을 긁어낸 다음 용해 완충액 (10 mM 이미다졸(imidazole), 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0)을 처리하고 용액이 투명해질 때까지 얼음 위에서 초음파처리 하였다.

이어서 상기 방법으로 얻어진 용해물로부터 고속 단백질 액체크로마토그래피(Fast Protein Liquid Chromatography; FPLC)를 통해 spCas9 단백질을 정제하기 위하여 먼저 15000g, 4℃에서 원심분리한 다음, 상층액을 FPLC의 His-trap (GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. 또한, 세척 완충액 (34 mM 이미다졸, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0), 용출 완충액 (250 mM 이미다졸, 50 mM NaH₂PO₄, 300 mM NaCl, pH 8.0)을 FPLC에 순서대로 로딩하였다. 다음으로 His-trap 용출 샘플을 Hi-load 16/600 (GE Healthcare) 크기 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였으며, 용출 완충액을 FPLC에 로딩하였다. 이어서 His-trap 16/600 용출 샘플을 100 kDa 멤브레인, 저장 완충액 (20% 글리세롤, 50 mM tris-HCl, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.05 mM PMSF, pH 8.0)으로 투석하였다. 이후 각 단계의 용출 샘플을 이용해 SDS-PAGE 전기영동을 수행하였으며, 실험 결과 도 2a 및 도 2b의 0.8% SDS-page 겔 이미지를 통해 볼 수 있는 바와 같이 spCas9 단백질이 정제된 것을 확인하였다.

1-2. spCas9-지질 접합체 제조

다음으로, 본 발명자들은 상기 실시예 1-1의 방법으로 정제된 spCas9 단백질에 지질을 직접적으로 접합시킨 spCas9-지질 접합체를 제조하고자 하였다.

본 발명에서는 종양으로 약물을 전달하는데 사용되는 인지질 중 하나인 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine; DSPE)을 사용하였다. DSPE는 포스파티딜에탄올아민 (phosphatidylethanolamine; PE)의 종류 중 하나로 매우 우수한 생체 적합성과 양친매성을 갖는다. 종래 연구된 spCas9의 구조 분석 논문에서, spCas9는 오직 2개의 시스테인 잔기 (Cys80, Cys574)를 가지며 상기 잔기의 아미노산을 변형시키는 것은 spCas9의 기능에 영향을 미치지 않는다고 보고되어 있다. 따라서 본 발명자들은 티올-말레이미드 (thiol-maleimide) 반응을 통해 spCas9에 존재하는 상기 두 개의 시스테인 잔기에 인지질인 DSPE를 접합시키고자 하였다. 이에 더하여 해당 기술 분야에서 생체에 적합하고 생체 내 순환 시간을 증가시키는 것으로 보고되어 있는 PEG 고분자가 연결된 DSPE-PEG(2000)를 이용하였다. 구체적으로 말레이미드-티올 (maleimide-thiol) 반응을 통해 PEG-말레이미드 (MW 2000) (Avanti Polar Lipids), DSPE-PEG(2000)-말레이미드 (Avanti Polar Lipids)를 Cas9-GFPuv 단백질에 접합시켜 DSPE-PEG(2000)가 접합된 spCas9 단백질(spCas9-PEG-DSPE)을 제조하였다.

1-3. sgRNA 설계 및 합성

sgRNA 합성 방법으로 널리 사용되는 것 중 하나는 dsDNA 주형 및 T7 RNA 중합효소를 이용하는 것이다. 본 발명자들은 EGFR L858R 및 mecA를 각각 표적하는 sgRNA를 합성하기 위하여, 도 2c에 나타낸 바와 같이 T7 RNA 중합효소 프로모터, 상기 EGFR L858R 또는 mecA에 대한 표적 서열, 및 tracrRNA 서열을 포함하는 dsDNA 주형을 디자인하였다. 이후 power-pfu 중합효소 (NEB)를 이용해 dsDNA를 합성하였으며, 도 2d의 1% TBE-아가로오스 겔 전기영동 결과를 통해 EGFR L858R를 표적하기 위한 두 종류의 합성된 dsDNA (EGFR(1), EGFR(2))를 확인하였다. 다음으로, T7 RNA 중합효소 (NEB)를 이용해 상기 합성한 각 dsDNA를 주형으로 하여 sgRNA 전사체를 생성하였고 PCR 정제 키트 (GeneAll)로 정제하였다. 이후 도 2e에 나타낸 바와 같이 포름알데히드 변성된 1% 아가로오스 겔 전기영동을 통해 EGFR L858R을 표적하는 각 sgRNA가 합성된 것을 확인하였다.

실시예 2. 지질 접합 CRISPR 복합체(LdCC) 형성 및 특성 분석

다음으로, 본 발명자들은 상기 실시예 1을 통해 각각 제조한 spCas9-PEG-DSPE와 sgRNA의 복합체(lipid derivatized CRISPR complex; 이하, LdCC)를 형성하고 상기 복합체의 특성을 분석하고자 하였다. 이를 위해, 대조군으로써 인지질이 접합되지 않은 원래 형태의 spCas9-GFP 단백질과 DSPE 인지질이 접합된 spCas9-GFP 단백질 각각을 sgRNA와 함께 15분 동안 배양하여 복합체가 형성되도록 한 후, 하기와 같은 실험들을 진행하였다.

먼저, 상기 방법으로 복합체가 잘 형성되었는지 확인하기 위해 아무 처리도 하지 않은 경우 (No tx), spCas9 단백질 (spCas9 only), spCas9 / sgRNA 복합체　(complex) 및 LdCC의 엔도뉴클레아제 활성 (Endonuclease activity)을 분석하였다. 그 결과, 도 3a에 나타낸 바와 같이 LdCC의 경우 지질을 접합하지 않은 원래 spCas9 / sgRNA 복합체와 유사한 활성을 갖는 것으로 나타났으며 이를 통해 spCas9에 지질을 접합하여도 엔도뉴클레아제 활성을 저해하지 않음을 알 수 있었다.

또한, spCas9 단백질, 원래 형태의 spCas9 / sgRNA(EGFR) 복합체, spCas9-PEG-DSPE 및 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA(EGFR) 복합체의 유체역학적 직경과 제타 전위를 ELSZ-2000 (Otsuka electronics)을 이용해 측정하였다. 유체역학적 크기 측정을 위한 동적 광산란 분석 결과, 도 3b에 나타낸 바와 같이 인지질 접합과 sgRNA와의 복합체 형성을 통해 본 발명에 따른 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA(EGFR) 복합체(LdCC)의 입도 크기가 약 45 nm, 지질을 접합하지 않은 spCas9 / sgRNA의 크기는 40 nm에 비해 약간 증가하는 것으로 나타났다. 또한, 도 3c에 나타난 바와 같이 제타 전위 측정 결과, 모두 단백질 표면에 결합된 sgRNA의 존재로 인해 음의 값을 보였으나 LdCC의 경우 -14.81 mV로 -10.01 mV로 측정된 지질이 접합되지 않은 spCas9 / sgRNA 보다 약간 더 큰 음이온성을 나타내는 것으로 측정되었다. 이는 원래의 spCas9 / sgRNA 복합체상에서 spCas9 단백질에 약한 음전하를 띠는 DSPE-PEG(2000)이 접합된 결과임을 알 수 있었다.

실시예 3. LdCC의 세포 내 흡수율 분석

본 발명자들은 Cas9 단백질에 DSPE-PEG(2000)을 접합시킨 결과 Cas9 / sgRNA 복합체의 세포 내 흡수율이 향상되는지 여부를 알아보기 위하여, 포유동물의 암세포인 A549 (ATCC) 및 U2OS (ATCC)를 대상으로 spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체(LdCC)의 세포 내 흡수율을 대조군과 비교분석하였다.

먼저, 인지질이 접합되지 않은 형태의 spCas9 / sgRNA 복합체를 대조군으로 하여, 본 발명에 따른 LdCC와 대조군 복합체 각각을 상기 세포들에 처리한 후 공초점 현미경으로 관찰하였다. 보다 상세하게, 상기 세포들을 2.05 mM L-글루타민, 25 mM HEPES가 보충된 RPMI1640 배지 (Hyclone)를 사용하여 T75 플라스크에서 배양한 후, 0.5 x 10⁴ 세포/웰을 8 챔버 슬라이드 (SPL) 상에서 37℃, 16시간 동안 하위 배양하였다. 한편, Cas9-GFP, Cas9-GFP-PEG-DSPE (최종 몰농도: 200 nM) 각각을 15분 동안 sgRNA와 혼합 (1:3 비율)하여 복합체를 형성시킨 다음, 형성된 복합체를 상기 세포들에 처리하고 37℃에서 5시간 동안 배양하였다. 복합체 처리 후에는, 세포를 1% PFA 용액 (Sigma-Aldrich)으로 고정시키고 팔로이딘 (phalloidin) (Thermofisher) 및 DAPI (Sigma-Aldrich)로 염색하였으며, LSM 780, 800 (Carl Zeiss)으로 공초점 이미지를 관찰하였다.

그 결과, 도 4a에 나타낸 바와 같이 상기 두 가지 세포 모두에서 LdCC를 처리한 경우 spCas9 단백질에 표지된 EGFP 단백질의 녹색 형광이 핵 염색(DAPI)과 인접하여 현저히 많이 관찰되었다. 이러한 결과를 통해 DSPE-PEG(2000)이 접합된 Cas9 / sgRNA 복합체의 세포 내 흡수율이 상기 인지질이 접합되지 않은 원래 형태의 spCas9 / sgRNA 복합체에 비하여 현저히 향상되었음을 알 수 있었다.

한편, DSPE-PEG(2000)은 최초로 FDA 승인을 받은 나노 약물인 Doxil®의 구성성분으로, 원하는 약물과 단순 혼합하여 약물 전달체로 많이 이용되고 있는 물질이다. 따라서 종래 단순 혼합하는 방법에 비해 spCas9 단백질에 직접 접합시킨 본 발명에 따른 기술이 세포 내 전달 효율을 더욱 증진시키는지 그 차이를 직접적으로 비교하고자 하였다. 이를 위해, 상기와 동일한 방법으로 EGFP가 표지된 spCas9 단백질을 이용하여 원래의 spCas9 단백질과 sgRNA 복합체에 DSPE-PEG를 혼합하여 제조한 혼합물(spCas9 + DSPE (mix)) 및 DSPE-PEG가 직접 접합된 spCas9 단백질과 sgRNA의 복합체 (spCas9-DSPE) 각각을 A549 세포에 처리하고 팔로이딘 및 DAPI 염색을 실시한 후 공초점 현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 도 4b에 나타낸 바와 같이 spCas9 단백질과 DSPE-PEG를 혼합한 경우에 비해 sgRNA에 DSPE-PEG를 직접 접합시킨 경우 녹색 형광이 현저히 많이 강하게 관찰되었으며, 이를 통해 세포 내 흡수율이 현저히 증가된 것을 알 수 있었다. 또한 이러한 결과는 형광 세기를 정량적으로 분석한 결과를 통해서도 확인할 수 있었다.

실시예 4. LdCC의 세포독성 분석

다음으로, 본 발명에 따른 LdCC가 세포독성을 유발하는지 검증하기 위하여 Annexin V 어세이로 분석하였다. 이때, 대조군으로 DSPE 인지질이 접합되지 않은 원래 형태의 spCas9-GFP와 sgRNA의 복합체(spCas9GFP / sgRNA), 및 약물전달에 많이 이용되는 리포펙타민을 이용하여 spCas9GFP / sgRNA 복합체를 전달하는 경우를 함께 비교하였다.

각각의 복합체를 농도별 (10, 20, 40, 80, 169 nM)로 세포에 처리하고 Annexin V 분석을 실시한 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 리포펙타민을 이용한 군(CRISPRMAX (spCas9GFPuv / sgRNA))에서만 아폽토시스 및 세포괴사(necrosis)가 유발되었으며, spCas9GFPuv / sgRNA 및 spCas9GFPuv-PEG-DSPE / sgRNA를 처리한 군에서는 세포독성이 나타나지 않은 것을 확인하였다. 이러한 결과로부터 인지질을 spCas9 단백질에 접합하는 기술이 세포독성을 유발하지 않으며, 따라서 본 발명에 따른 LdCC는 체내 안전성이 높은 비바이러스성 유전자 편집 CRISPR 시스템으로 이용될 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5. LdCC의 유전자 편집 활성 분석

본 발명자들은 DSPE 인지질이 접합된 spCas9 단백질의 DNA 절단 기능을 확인하기 위해, 하기 방법에 따라 시험관 내 절단 분석(in vitro cleavage assay)을 실시하였다. 보다 구체적으로, H1975 세포주로부터 유전체 DNA를 분리하고 표적 서열을 포함하는 982 bp의 DNA 부분을 증폭시켰다. 다음으로 spCas9 또는 spCas9-GFP 단백질 단독, 또는 spCas9-GFP 및 spCas9-PEG-DSPE-GFP 단백질과 EGFR을 표적하는 sgRNA의 복합체를 각각 37℃에서 2시간 동안 유전체 DNA에 처리하고 상기 복합체가 처리된 샘플을 PCR 정제 키트 (GeneAll)로 정제한 후 정제물을 이용해 2% TBE-아가로오스 겔 전기영동을 실시하였다.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이 예상대로 spCas9 / sgRNA 및 spCas9-GFP / sgRNA 복합체의 경우 시험관 내에서 절단 기능을 갖는 것으로 나타났다. 또한 DSPE-PEG(2000)가 접합된 spCas9-GFP / sgRNA 복합체 (LdCC) 역시 상기 복합체와 동일하게 절단 기능을 가지는 것을 알 수 있었다.

실시예 6. LdCC의 생체 내 분포 분석

본 발명자들은 LdCC의 생체 내 분포를 분석하고 암 치료에 대한 가능성을 알아보고자 하였다. 이를 위해, 먼저 상기 복합체의 생체 내 시각화를 위하여 spCas9에 Alexa Fluor 647 NHS 에스터(ester) 염료를 접합시키고 sgRNA를 포함하는 아미노알릴(aminoallyl) UTP에 ICG NHS 에스터를 접합시켰다. 다음으로 도 7a의 그림으로 도시된 과정에 따라 5 x 10⁶ 개의 H1975 세포를 BALB/c-nu/nu 마우스에 이종이식 하였고, 이후 상기와 같이 염료를 접합시켜 제조한 spCas9 / sgRNA 및 LdCC 각각 20 ug을 9주령의 상기 누드마우스에 주입하였다. 이어서 주입한지 각각 3시간, 24시간 후에 IVIS® Lumina™ S5 (Perkinelmer)로 체내 전체와 각 기관 내 분포 이미지를 촬영하였다.

그 결과, 도 7b에 나타낸 바와 같이 spCas9 / sgRNA, spCas9-PEG-DSPE / sgRNA 복합체의 대부분은 간과 신장에 분포하는 것을 확인하였다. 또한, 종양 내에서 상기 복합체들의 존재 여부를 관찰한 결과 도 7c에서 볼 수 있는 바와 같이 spCas9와 sgRNA의 경우 모두 spCas9 / sgRNA에 비해 LdCC가 통계적으로 유의하게 종양에 더 많이 존재하는 것으로 나타났으며, 결과적으로 LdCC가 spCas9 / sgRNA 복합체보다 종양에 더 많이 분포하는 것을 알 수 있었다. 이러한 결과는 LdCC가 원래의 Cas9 / sgRNA 복합체에 비해 임상시험 적용에 있어 중요한 체내 안정성이 향상됨을 의미하는 것이다.

상기 진술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims

지질이 접합된, CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질.
제1항에 있어서,
상기 CRISPR 효소 단백질은 Cas1(CRISPR associated protein 1), Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas9, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cas5d, Cas5e, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cpf1, Csn1, Csn2, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Cas5t, Csh1, Csh2, Cas5h, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, Cas5a, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Cmr1, Cmr2, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, C2c2(Cas13a), dCas9(dead Cas9), Cas9 nickase, CDA(cytidine deaminase enzyme), APOBEC(apolipoprotein B editing complex)14, UGI(uracil glycosylase inhibitor), 및 AID(activation-induced deaminase)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제1항에 있어서,
상기 지질은 유기화합물 연결고리(linker)를 매개로 접합된 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제1항에 있어서,
상기 지질은 포스파티딜에탄올아민(phosphatidylethanolamine), DMPE(bis (1, 2-dimethylphosphino) ethane), DPPE(1,2-Bis(diphenylphosphino)ethane), DSPE(1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine), DOPE(dioleoylphosphatidylethanolamine), 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine), DDPC(l,2-dimyristoylamido-l,2-deoxyphosphatidylcholine), DLPC(dilauroylphosphatidylcholine), DMPC(dimyristoylphosphatidylcholine), DPPC(dipalmitoyl phosphatidylcholine), DSPC(Distearoylphosphatidylcholine), DOPC(1, 2-di-oleoyl-snglycero-3-phosphocholine), POPC(1-palmitoyl-2-oleoylphosphatidylcholine), DEPC(diethyl phosphorocyanidate), 포스파티딜글리세롤(Phosphatidylglycerol), DMPG(dimyristoyl phosphatidylglycerol), DPPG(dipalmitoyl-phosphatidylglycerol), DSPG(dermatan sulfate proteoglycan), POPG(1-palmitoyl-2-oleoyl-phosphatidylglycerol), 포스파티딜세린(Phosphatidylserine), 및 DOPS(dioleoylphosphatidylserine)로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나의 인지질인 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제3항에 있어서,
상기 유기화합물 연결고리는 합성 고분자 또는 저분자 유기화합물인 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제5항에 있어서,
상기 합성 고분자 또는 저분자 유기화합물은 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 폴리프로필렌렌옥사이드(polypropylene oxide), 폴리락트산코글리콜산(poly(lactic-co-glycolic acid)), 폴리락트산(poly-lactic acid), 폴리글리콜산(poly-glycolic acid), 폴리카프로락톤(polycaprolactone), 저분자 알케인 사슬(alkane chain), 및 이의 유도체로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제1항에 있어서,
상기 접합은 CRISPR 효소 단백질 상의 티올(thiol) 또는 아민(amine)과의 반응을 통해 이루어지는 것을 특징으로 하는, CRISPR 효소 단백질.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질, 및 sgRNA(single guide RNA)를 포함하는, CRISPR 복합체.
제8항에 있어서,
상기 CRISPR 복합체는 상동 유도 교정(homology directed repair)을 일으키는 올리고핵산(oligonucleotide DNA)을 포함하는 것을 특징으로 하는, CRISPR 복합체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 효소 단백질 및 sgRNA(single guide RNA)를 1:0.01 내지 1:100의 몰비로 혼합하는 단계를 포함하는, CRISPR 복합체의 제조방법.
제8항의 CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) 복합체를 포함하는, 유전자 편집용 조성물.
제11항의 유전자 편집용 조성물을 세포 내로 전달하는 단계를 포함하는, 유전자 편집 방법.
제12항에 있어서,
상기 세포는 진핵세포 또는 원핵세포인 것을 특징으로 하는, 방법.