KR20210043788A

KR20210043788A - 원발성 난소부전 및 조기폐경의 예방 및 치료용 약학적 조경보혈단(jbd) 조성물 및 이를 이용한 여성 난소 기능 분석방법

Info

Publication number: KR20210043788A
Application number: KR1020190126205A
Authority: KR
Inventors: 주보선; 임채학; 유정은
Original assignee: 대전대학교 산학협력단; 주보선
Priority date: 2019-10-11
Filing date: 2019-10-11
Publication date: 2021-04-22
Also published as: KR102287423B1

Abstract

본 발명은 조경보혈단(JBD) 조성물 및 이 조성물을 이용하여 여성 난소 기능분석방법에 관한 것으로서, 7종의 한약재에 증류수를 넣어 열수에서 추출하는 추출단계와; 상기 추출물을 가열한 후 원심분리하는 분리단계 및; 상기 분리단계에서 얻은 상등액을 동결 건조하여 분말화한 조성물과; 조경보혈단(JBD) 조성물의 독성을 MTT로 분석하는 단계와; 조경보혈단(JBD) 조성물을 생쥐에 투여 후 생쥐의 체중, 난소 중량 및 자궁 무게를 측정하는 단계와; 생쥐의 난소에 H & E 염색 후 난포의 수를 측정하여 조경보혈단(JBD) 투여 전과 비교하는 단계와; 난소 조직에서 mTOR/PI3K 및 Hippo 신호 전달 경로의 하류 분자의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 난소 조직에서 대표적인 다능성 줄기세포 표지자인 OCT4의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 난소 조직에서 혈관 신생과 난포 발달 유전자의 mRNA 발현을 조사하는 단계 및; NOA 및 POB 쥐 모델들에 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 과배란을 유도하고 수컷과 교배시킨 다음 수정란을 수집하여 배양하고, 수집된 수정란의 수와 발달 역량을 조사하는 단계로 이루어지는 여성 난소 기능향상에 의한 난소 노화 회복방법을 제공하고, 본 발명에 따르면, 에 의하면, 노화된 난소에서 mTOR / PI3K 및 Hippo 신호 전달 경로, 난소 줄기세포 활성화를 통해 양질의 난모 세포를 생성하여 난소 기능과 난모 세포의 질을 향상시킬 수 있는 효과가 있고 이를 이용한 여성 난소기능 분석용 키트를 제공할 수 있는 매우 유용한 발명이다.

Description

원발성 난소부전 및 조기폐경의 예방 및 치료용 약학적 조경보혈단(JBD) 조성물 및 이를 이용한 여성 난소 기능 분석방법{Pharmacentical composition of JBD composition and method of analyzing ovarian function}

본 발명은 여성 난임증 치료 및 예방용 조경보혈단(JBD) 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 조경보혈단(JBD) 조성물이 난소 기능 향상을 목적으로 하는 조경보혈단(JBD) 조성물 및 이를 이용한 여성 난소 기능 분석방법에 관한 것이다.

불임은 12개월의 정기적이고 피임을 하지 않는 성교 후에도 안정적이고 임상적인 임신이 되지 않는 상태를 정의한다(비특허문헌 1). 불임의 유병률은 가임기 연령대의 12 ∼ 15%로 추정되며, 일반적으로 여성의 수태능은 30대 초반에 감소하기 시작하고 35세 이후 가파르게 감소한다(비특허문헌 2). 최근에는 여성들이 사회ㆍ경제적 이유로 임신 시기를 늦추는 경향이 있으며, 이러한 이유로 난소의 노화로 인한 여성 불임의 빈도가 증가하고 있어 불임 치료에 있어서 난소 노화 방지가 중요한 문제로 대두되고 있다.

난소의 노화는 난자의 질과 난소 수의 감소가 특징적 변화인데(비특허문헌 4), 노화 난자는 수정률을 낮추고 배아 발생 능력을 감소시킨다(비특허문헌 5). 연령의 증가에 따라 난자의 질이 감소하는 이유로는 다음 몇 가지가 밝혀져 있는데 첫째, 난자의 염색체 이상 증가이다. 노화 난자는 난자의 염색체 이수성(aneuploi dy) 발병률을 증가시키며, 이는 30대 중반에 갑자기 상승하고 45세가 되면 80%에 이른다(비특허문헌 6). 이수성 난자(aneuploid oocytes)가 수정되고 착상되면 이수 배수체 배아가 발생하고 결과적으로 유산 또는 선천성 장애가 발생한다(비특허문헌 7). 둘째, 난모 세포의 기능 저하와 미토콘드리아 기능 장애가 산화 스트레스를 유발하여 세포 노화를 촉진하고 난소 보존력 감소, 난포 폐쇄, 과립막 세포 아포토시스 및 난모 세포의 질 저하 유발이다(비특허문헌 8). 끝으로 난소 신생 혈관에 결함의 발생이다. 난소 혈관 신생은 난포 성장 및 우성 난포의 선택과 같은 일련의 난포 형성(folliculogenesis)에 중요한 역할을 하며(비특허문헌 9 참조). 여포의 혈관계는 호르몬, 호르몬 전구체, 산소 및 영양소 전달에 필요한 요소이다. 능동적 혈액 공급은 양질의 난모 세포 생성에 필수적이며(비특허문헌 10). 난소 혈관 신생의 활성화가 난모 세포의 질과 난소 기능을 향상시키는 것으로 알려져 있는데(비특허문헌 11), 이때 난소 신생 혈관의 결함은 난자의 질과 난소 수의 감소를 유발할 수 있다.

조경보혈단은 불임증에 효능이 있는 것으로 공지된 한약재 들로 구성되는데 대체로 자궁의 기혈을 보충하는 한약처방이다. 월경주기를 규칙적으로 조절하고, 생식 호르몬 조절에 영향을 미침으로써 임상에서는 월경불순, 불임, 월경통과 같은 질환에 처방한다.

조경보혈단을 구성하는 한약재는 항산화제, 항 노화 방지제, 면역 조절제, 항염증제 등 여러 가지 약리학적 특성을 지니고 있다(비특허문헌 12). 또한 일부 약재는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 발현을 조절하여 혈관 신생의 조절에 중요한 역할을 한다(비특허문헌 13, 14). 그러나 이 처방의 난소기능 개선 효능에 대한 실험적 연구는 매우 부족한 실정이며(비특허문헌 15), 사실상 불임 치료에 적용하는데 근거가 매우 부족하였다.

최근 난소 기능향상에 관한 기술로서 특허 제1796765호의 "스페로이드형 세포집합체를 함유하는 난소기능 개선용 약학조성물 및 이의 제조방법"이 등록특허공보에 개시되어 있다(특허문헌 1).

상기 특허 제1796765호의 "스페로이드형 세포집합체를 함유하는 난소기능 개선용 약학조성물 및 이의 제조방법"은 태반유래 중간엽 줄기세포(placenta derived mesenchymal stem cells)를 함유하는, 균일한 직경의 스페로이드형 세포집합체(spheroid cell aggregates)를 유효성분으로 포함하며, 상기 스페로이드형 세포집합체는 138 내지 149.4μm의 평균 직경을 갖는 것인, 조기 난소 부전, 불임, 조기 폐경, 폐경 및 갱년기 증상으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 증상의 완화 또는 치료용 약학 조성물로서, 이는 태반유래 중간엽 줄기세포( placenta derived mesenchymal stem cells)를 스페로이드형 세포집합체(spheroid cell aggregates)로 제조하여, 조기 난소 부전, 불임, 폐경, 및 갱년기 증상의 완화 또는 치료용 약학 조성물로 적용될 수 있다 하고, 특히, 단층 배양된 태반유래 중간엽 줄기세포와 비교하여 볼 때 세포집합체, 구체적으로 스페로이드형으로 삼차원 배양된 세포집합체는 이식시 세포생존능 향상, 에스트라디올 수준향상과 난포발생촉진 정도 향상 등의 난소기능 개선에 우수한 치료적 효과가 있다 하였다.

특히 상기 특허 제1796765호의 "스페로이드형 세포집합체를 함유하는 난소기능 개선용 약학조성물의 제조방법"으로 제조된 약학조성물은 줄기세포를 스페로이드라는 3차원 배양을 통해 난소기능 치료제로 개발한 것으로 첫 번째 의미는 태반유래 중간엽 줄기세포를 사용했다는 것이고, 두 번째는 2차원이 아닌 3차원 배영기술을 이용함으로써 세포의 효능을 강화했다는 것이지만, 단점은 아직까지 세포치료제를 임상에 적용하기에는 많은 제약이 따라서 임상적으로 사용하기 어렵고, 난소기능 증진을 위해 스페로이드형 줄기세포를 이식해야 되는 데 이 또한 상용적으로 사용하기 어려울 뿐만 아니라 기존의 약물과 비교시 가격 경쟁력에서도 매우 취약하다. 이런 점에서 난치성 난임을 효과적으로 치료하여 가임율을 증진할 수 있는 제재의 개발이 절실한 실정이었다.

본 발명자들의 연구결과에 따르면, 휴면 원시 난포는 생식 가임기 동안 정상 난포와 건강한 성숙 난모 세포를 지속적으로 제공할 수 있으며, PI3K/mTOR와 Hippo 신호 전달 경로에 의해 활성화되고 생존하는 것이 확인 되었다. 이 밖에도 난소 줄기세포는 적절한 환경에 노출되면 정상 난모 세포로 재생될 수 있는 것을 확인하고 난소 줄기세포를 활용하면 노화된 난소의 난소 기능 회복에 매우 유용할 것으로 생각되었다.

특허 제1796765호 등록특허공보

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따라서, 본 발명은 상기한 점들을 감안하여 난소의 노화를 방지하고자 발명한 것으로서, 원시난포 및 난소생식세포계열 줄기세포 활성을 위한 신호전달경로의 촉진을 통해 원발성 난소부전과 조기 폐경의 효과적인 치료 조성물이 될 수 있는 신규한 조경보혈단 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규한 조경보혈단 조성물의 난소줄기세포 활성 신호전달경로의 조절 기술을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 고령 여성이나 조기 폐경과 같은 난소기능 부전 및 저하 등의 난치성 여성 난임의 효과적인 치료와 가임율 증진을 도모함으로써 조경보혈단의 난소 기능향상에 의한 난소 노화 회복방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 본 발명에 따른 신규한 구성의 한약재에 증류수를 넣어 열수에서 추출하는 단계와; 상기 추출단계에서 얻은 추출물을 재가열 후 원심분리하는 유효성분의 분리단계 및; 상기 원심분리단계에서 얻어진 상등액을 동결 건조하여 분말화하는 동결 건조단계로 이루어지는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 신규한 조경보혈단(JBD) 조성물은 향부자(香附子)와 항기(黃耆), 백출(白朮), 숙지황(熟地黃), 당귀(當歸), 천궁(川芎) 및 백작약(白芍藥) 추출물의 혼합물로 구성되고, 상기 조경보혈단(JBD) 조성물은 향부자(香附子) 20 ∼ 25중량%, 항기(黃耆) 15 ∼ 20중량%, 백출(白朮) 15 ∼ 20중량%, 숙지황(熟地黃) 10 ∼ 15중량%, 당귀(當歸) 10 ∼ 15중량%, 천궁(川芎) 10 ∼ 15중량% 및, 백작약(白芍藥) 10 ∼ 15중량%가 바람직하였다. 본 발명에 따르면, 상기 7종의 어느 하나가 빠지거나 달라지는 경우 효능이 현저히 저하되는 것이다.

상기 추출단계에서 한약재와 증류수의 혼합 비율은 중량비(w/w)로 1: 60 ∼ 65 이고, 95 ∼ 105 ℃에서 9.5 ∼ 10.5시간 추출하는 것이어야 하고, 상기 원심분리단계는 추출물의 무게가 40 ∼ 45%로 줄어 들때까지 가열한 후 0.076 ∼ 0.082 MPa에서 원심분리하는 것이어야 하며, 상기 동결 건조단계는 원심분리 후 상등액을 동결 건조하여 분말화하는 것이이어야 한다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따라 제조된 조경보혈단(JBD) 조성물의 농도에 따른 세포 독성을 MTT로 분석하는 단계와; 본 발명 조경보혈단(JBD) 조성물을 노화생쥐에 투여 후 생쥐의 체중, 난소 중량 및 자궁 무게를 측정하는 단계와; 생쥐의 난소에 H & E 염색 후 난포의 수를 측정하여 본 발명 조경보혈단(JBD) 투여 전과 비교하는 단계와; 생쥐에 4주간 본 발명 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 mTOR/PI3K 및 Hippo 신호 전달 경로의 하류 분자의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 생쥐에 4주간 본 발명 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 대표적인 다능성 줄기세포 표지자인 OCT4의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 생쥐에 4주간 본 발명 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 혈관 신생과 난포 발달 유전자의 mRNA 발현을 조사하는 단계 및; NOA 및 POB 쥐 모델들에 본 발명 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 과배란을 유도하고 수컷과 교배시킨 다음 수정란을 수집하여 배양하고, 수집된 수정란의 수와 발달 역량을 조사하는 단계를 통하여 난소의 기능을 분석함으로써 이루어진다.

본 발명에 따른 조경보혈단 및 이를 이용한 난소 기능향상에 의한 난소 노화 회복방법에 의하면, 노화된 난소에서 mTOR / PI3K 및 Hippo 신호 전달 경로의 촉진을 통해 원시난포 및 난소 줄기세포 활성화를 통해 양질의 난자를 생성하여 난소 기능과 난자의 질을 향상시키는 뛰어난 효과가 있다.

도 1은 TOV21G 세포에 대한 본 발명 JBD의 세포 독성효과를 나타낸 그래프,
도 2는 난포 발달에 대한 본 발명 JBD의 영향인(난포의 조직학적 특성)을 나타낸 그래프,
도 3은 NOA 마우스에서 mTOR/PI3K 및 히포 신호 전달 경로 성분의 난소 mRNA 발현을 나타낸 그래프,
도 4는 실시간 PCR에 의해 NOA 마우스에서 난소 줄기 세포 마커, OCT4의 난소 mRNA 발현을 나타낸 그래프,
도 5는 NOA 마우스에서 혈관 형성 및 난포 발달 성분의 난소 mRNA 발현을 나타낸 그래프이다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다.

실시예1. 메틸 티아졸 테트라졸리움(MTT; Methyl Thiazolyl Tetrazolium) 분석법에 의한 세포 배양 및 세포 독성 시험

난소암 세포주 TOV21G(ATCC, VA, USA)를 본 발명 연구에 사용하였다. TOV21G를 10% 소 태아 혈청(Gibco, USA)과 100U/mL 페니실린 및 100㎍/mL 스트렙토마이신이 첨가된 1:1 비율의 Medium 199:MCDB 1056 배지에서 37℃, 5% CO₂의 가습 상태에서 배양하였다.

세포 독성은 MTT 분석으로 평가하였다. TOV21G 세포를 96-웰플레이트(well plates; SPL, Korea)에 1 × 10³세포로 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 그리고 배지를 신선한 배지로 교체하고 세포를 다양한 농도의 JBD(1, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000㎍/mL)로 처리하였다. 24시간 후 배지를 100㎍/mL의 MTT 용액 50μL 로 교체하고 세포 배양기에 넣어 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. DMSO를 세포 배양 웰(well)에 첨가하고 철저히 혼합하여 MTT 감소에 의해 형성된 진한 파란색 포마잔(formazan) 결정을 용해 시켰다. 흡광도는 멀티 플레이트 리더(SpectraMax M2, Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 570㎚에서 측정하였다. 실험은 3배수로 수행되었다.

실시예2. 메틸 티아졸 테트라졸리움(MTT; Methyl Thiazolyl Tetrazolium) 분석법에 의한 세포 배양 및 세포 독성 시험

이 발명에서는 인간의 60대 초반에 해당하는 자연 난소 노화(NOA) 모델로 12개월 된 근친 교배된 C57BL/6 암컷 쥐를 사용했다.

조기 난소 부전(POF) 모델은 항암제인 시스플라틴(cisplatin)을 사용하여 다음과 같은 방법으로 만들었다. 6 ∼ 8 주령의 C57BL/6 암컷 쥐에 시스플라틴(cisplatin) 2㎎/㎏ (Sigma)을 10일간 투여하였다. 대조군에는 10일간 동일한 양의 생리 식염수를 주입하였다. 시스플라틴은 식염수에서 제조하였다. 실험 쥐들의 일반적인 상태와 체중을 매일 측정했다.

실험에 사용된 모든 쥐는 Koatech Inc.(경기도, 대한민국)에서 구입하여 SPF 수준의 동물 시설에서 물과 음식에 자유롭게 접근할 수 있는 12시간의 명암 사이클 기온 21 ± 2℃, 상대 습도 55% ± 10% 에서 진행되었다.

실시예3. JBD의 제조

본 발명 조경보혈단 조성물(JBD)은 KB원외탕전시설(서울, 한국)에서 제조되었다. 이 처방은 7종의 한약재로 구성되며, 한약재의 검수는 KB원외탕전실의 한약 전문가에 의해 확인되었다(표 1). 한약재(720g)를 증류수 45L에 넣고 100℃에서 10시간 추출한 다음 계속 끓여 33L로 만들었다. 85℃에서 4시간 동안 0.076 ∼ 0.082 MPa에서 원심 분리한 후 RM 상등액을 동결 건조하여 분말 220g을 얻었다.

조경보혈단 식의 조성

번호	약초이름 (Herbal name)	생약학의 이름 (Pharmacognostic Name)	투여량 Dose amount(g)
1	향부자(香附子)	Cyperi Rhizoma	160
2	항기(黃耆)	Astragali Radix	120
3	백출(白朮)	Atractylodis Rhizoma Alba	120
4	숙지황(熟地黃)	Rehmanniae radix preparata	80
5	당귀(當歸)	Angelicae Gigantis Radix	80
6	천궁(川芎)	Cnidii Rhizoma	80
7	백작약(白芍藥)	Paeoniae Radix	80
Total			720

실시예4. 자연 난소 노화(NOA)와 조기 난소 부전(POF) 쥐 모델에 JBD 투여

12개월 된 NOA 암컷 쥐 21개체를 무작위로 3그룹(그룹당 7개체)으로 나누었다. 대조군 1그룹과 본 발명 실시예 3에서 제조된 JBD 투여 2그룹(15㎎/㎏ 및 30㎎/㎏)으로 구성하였다. 본 발명 JBD를 생리 식염수에 녹여 경구 투여 니들을 이용하여 체중 용량비율 15㎎/㎏의 0.1mL 및 30㎎/㎏의 0.1mL를 4주간 매일 경구 투여하였다. 대조군은 같은 양의 생리 식염수로 투여하였다.

NOA 쥐와 동일한 방법으로 POF 쥐를 JBD로 처리하였다. 6 ∼ 8주 된 정상 쥐를 양성 대조군으로 사용하였다.

실시예5. 조직학적 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin;H&E) 염색 및 난포 수 측정

NOA 쥐에 본 발명 실시예 3에서 제조된 JBD를 4주간 투여한 후 난소를 분리하고 4℃에서 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 고정하고 파라핀에서 탈수, 정화한 후 H&E 염색을 위해 절편 하였다. 광학 현미경으로 각 난소의 모든 절편에서 난포를 조직학적으로 계수하고 결과를 이중 계산으로 보정 하였다. 난포는 원시 난포(평평한 육아종 세포의 한 층으로 둘러싸인 난모 세포), 일차 난포(입방체 과립 막 세포의 한 층으로 둘러싸인 난모 세포), 이차 난포(공동이 없는 2~3층의 입방형 과립 막 세포), 동난포/성숙 난포(하나 이상의 독립적인 공동이 형성되었거나 난구 과립(cumulus granulosa)세포가 형성된 4개층 이상의 과립 세포)로 분류 하였다(비특허문헌 17). 퇴행성 난모 세포를 포함한 난포는 과립 막 세포층의 세포 사멸체의 존재, 퇴화 난모 세포, 난자 핵의 붕괴에 기초하여 폐쇄(atresia) 상태로 간주하였다.

실시예6. RNA 추출 및 정량 실시간 PCR

본 발명 JBD를 NOA 쥐에 최종 투여한 다음 날, 난소를 모두 수집하여 Hippo 신호 전달 경로[mammalian STE20-like protein kinase 1 (MST1), large tumor suppressor (LATS1)], PI3K/mTOR 신호 전달 [eukaryotic initiation factor 4E(eIF4E) binding protein 1 (4E-BP1), ribosomal protein S6 kinase beta-1 (S6K1), ribosomal protein S6 (RPS6)], 혈관 신생[vascular endothelial growth factor (VEGF) and visfatin] (kitL), 난포 발달[Kit ligand (KitL), bone morphogenetic protein-15 (BMP-15), and growth differentiation factor-9(GDF-9)]과 관련된 유전자의 mRNA를 정량적 실시간 PCR 측정하였다.

제조 회사의 프로토콜에 따라 Trizol 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 사용하여 총 RNA를 추출하였다. 몰로니 쥐 백혈병 바이러스(Moloney-Murine L eukaemia Virus(M-MLV)와 Reverse Transcriptase(ELPis Biotech, Daejeon, Korea)를 사용하고, 42℃에서 1시간 동안 oligo dT를 이용하여 1㎍의 total RNA로부터 Complementary DNA(cDNA)를 합성하였다. Sybr Green Q-PCR 2X Master Mix (Smartgene, SamJung Bioscience, Daejeon, Korea)를 이용하여 실시간 PCR을 수행하였다. 반응 혼합물은 Sybr Green Q-PCR 2X Master Mix, each primer 0.5p㏖/㎕, cDNA 100ng, 멸균수 (RNase free)를 사용하여 준비하였다. 반응 조건은 95℃에서 5분간 변성시킨 후 95℃에서 10초, 60℃에서 30초간 40회 반복하였다. 각 cDNA는 유전자 특이적 프라이머를 사용하여 중합 효소 연쇄 반응(PCR) 증폭시켰다(표 2).

실시간 PCR 증폭에 사용되는 프라이머 서열

유전자 (Gene)	서열(5'→3') Forward	Reverse
4EBP1	CTAGCCCTACCAGCGATGA G	CCTGGTATGAGGCCTGAATG
S6K1	GTAGTCCACGAACACCTGTC	TGAGGATTTGCCGTGCTGG
RPS6	GGACGCTAATCTCAGTGTTCTC	CCTGGGCTTCTTACCTTCTTTG
MST1	CAGCCC GAGGAAGTGTTTGA	CACGGGCACTTGCTTGATTG
LATS	AGCAGAAGCCGACAATGAGT	GGACAACTTGTACTTTGTGATGGACT
OCT4	AGCTGCTGAAGCAGAAGAGG	GGTTCTCATTGTTGTCGGCT
VEGF	AGGCTGCTGTAACGATGAAG	GTCTGCATTCACATCTGCTG
Visfatin	CTTGTTCAGTCCTGGTATCC	GCGAAGAGACTCCTCTGTAA
SDF-1α	GTCTAAGCAGCGATGGGTC	GAATAAGAAAGCACACGC
IGF-1	GGCATTGTGGATGAGTGTTG	CTGAGTCTTGGGCATTGCGTCAG
GAPDH	TCAACGGCACAGTCAAGGC	CTCCACGACATACTCAGCAC

여기서 GAPDH: glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase, 4EBP1: eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E) binding protein 1, S6K1: ribosomal protein S6 kinase beta-1, RPS6: ribosomal protein S6, MST1: mammalian STE20-like protein kinase 1, LATS: large tumor suppressor, OCT4, octamer-binding transcription factor 4, VEGF: vascular endothelial growth factor, SDF-1α: stromal cell derived factor-1α, IGF-1: insulin-like growth factor-1 를 각각 나타낸다.

실시예7. 과배란, 수정란 수집, 배아 배양

21개체 NOA 쥐와 21개체 POF 쥐에 본 발명 JBD를 마지막으로 투여하고, 다음 날 5IU 임마 혈청 성선자극 호르몬(PMSG; Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) 0.1mL를 복강 내 주사하여 과배란을 시킨 후 약 48시간 후에 5μL의 human chorionic gonadot ropin(hCG, Sigma-Aldrich)을 0.1mL 주입하였다. 이후 바로 8~12주령의 수컷 쥐와 교배하였다. 다음 날 아침 암컷 쥐를 검사하고 질 플러그(vaginal plug)가 확인된 개체를 교배 성공으로 간주하였다. hCG 주사 18시간 후, 질 플러그가 확인된 쥐를 CO2질식으로 희생시켰다. 그리고 난구 봉인된 한 개의 배아(수정란)를 난관에서 꺼내어 PBS(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에서 0.1% hyaluronidase(Sigma-Aldrich)로 1분간 배양하여 노출 시켰다. 건강한 수정란들을 모아 세 번 씻어서 처음 2일 동안 Gl-plus 배지 (Vitrolife, V. Frolunda, Sweden) 20mL로 배양한 다음 후반 2일 동안 G2-plus 배지(Vitrolife)에서 미네랄 오일(SAGE, Origio, Denmark)을 가하여 5% CO2 배양기에서 37℃로 배양하고 매일 배지를 교환하였다.

실시예8. 통계분석

SPSS 프로그램 (ver. 12.0)을 통계분석에 사용하였다. 수집된 수정란의 수와 배반포에 대한 배아 발달률을 편도 분석으로 분석하였다. 각 발달 단계에서 난포 수의 비교, 각 구성 요소의 난소 mRNA 발현 수준을 Student t-test로 분석하였다. 0.05 미만의 P값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

실험예 1. 본 발명 JBD가 세포 독성에 미치는 영향

본 발명 JBD의 농도에 따라 세포 독성이 있는지를 확인하기 위해 TOV21G 세포를 96- 웰 플레이트(well plates)에서 1 × 10³cells/well로 배양하고 지시된 다양한 농도의 JBD(1, 10, 50, 100, 500, 1000, 5000㎍/㎖)로 처리하여 MTT 분석을 통해 JBD 처리 24 시간 후에 추정되는 세포 생존율을 분석하고 그 결과를 도 1에 나타냈다.

도 1에서 데이터는 3 개의 독립적인 측정의 평균 ±SD를 나타내고, 도 1로부터 MTT 분석에서 JBD는 1㎍/mL에서 5000㎍/mL까지 세포 독성을 나타내지 않았음을 확인하였다.

실험예 2. 본 발명 JBD가 세포 독성에 미치는 영향

12개월 된 NOA 쥐의 체중과 생식 기관 무게에 대한 본 발명 JBD의 영향을 조사하기 위해 JBD 구강 투여 후 몇 주 동안 신체, 난소 및 자궁의 무게를 분석하고 그 결과를 하기 표 3에 나타냈다.

JBD 투여 후에 무게 변화는 없었고, 표 3으로부터 확인할 수 있는 바와 같이 JBD 투여 전과 후에 체중은 약 30g, 난소 중량은 약 0.003g, 자궁 무게는 약 0.09g이었다.

체중, 난소 체중 및 자궁 무게에 미치는 JBD 치료의 효과

JBD (mg/kg)	No. of mice	중량(평균 ± SD)
JBD (mg/kg)	No. of mice	몸체(g)	난소(g)	자궁(g)
0	7	30.28(± 1.71)	0.00348(± 0.00077)	0.0912(± 0.0177)
(control)
15	7	30.51(± 2.90)	0.00322(± 0.00064)	0.0929(± 0.0207)
30	7	30.74(± 3.70)	0.00297(± 0.00080)	0.0946(± 0.0305)

실험예 3. 본 발명 JBD가 난소 기능 및 난모 세포의 질에 미치는 영향

본 발명 JBD의 경구 투여가 12개월된 자연 노화 암컷 쥐의 난소 기능을 향상시키는지를 조사하기 위해 난소에 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 시행했다. 각 발달 단계에서 난포의 조직학적 특성을 도 2에 나타냈다[*P ＜ 0.05(대조군 대비)]. JBD 투여결과 15㎎/㎏(도 2 B) 및 30㎎/㎏(도 2 C)의 난포에서 1차, 2차, 동난포/성숙 난포의 발달을 대조군(도 2 A)과 비교하였다. 1차, 2차, 동난포/성숙 난포의 평균 수는 15㎎/㎏ JBD에서 각각 47 ± 3.0, 19 ± 1.2, 13 ± 1.2 이었고, 30㎎/㎏ JBD에서 51 ± 3.4, 29 ± 2.1, 11 ± 0.8 로 대조군(29 ± 1.8, 15 ± 1.4, 5 ± 0.8)에 비해 약 2배의 증가가 있었다. 반면에 폐쇄 난포의 수는 JBD 투여군이 대조군과 비교하여 절반 정도 감소한 것을 확인하였다(도 2 D).

실험예 4. 본 발명 JBD가 PI3K/mTOR 및 Hippo 신호 전달 경로에 미치는 영향

본 발명 JBD의 효과가 원시 난포의 활성화와 관련이 있는지를 알아보기 위해, JBD를 4주 동안 처리한 후 난소 조직에서 (A) mTOR/PI3K 신호 전달 경로의 하류 분자의 mRNA 발현을 조사하여 4EBP1, S6K1 및 RPS6에 대한 실시간 PCR을 분석하고 (B)Hippo 신호 전달 경로의 하류 분자의 mRNA 발현을 조사하여 MST1 및 LATS에 대한 실시간 PCR을 분석하고 그 결과를 도 3에 나타냈다[*P ＜ 0.05(대조군 대비)].각각의 PCR을 각각의 샘플에 대해 이중으로 수행 하였다. GAPDH에 대한 상대 유전자 발현 수준을 계산 하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 제시하였다. mTOR/PI3K 신호 전달 경로의 대표적인 하류 분자는 진핵세포개시 인자(eukaryotic initiation factor) 4E binding protein 1 (4EBP1), ribosomal protein S6 (RPS6), ribosomal protein S6 kinase beta-1 (S6K1)이며, Hippo 신호 전달 경로의 전형적인 하류 분자는 mammalian Sterile 20-like protein kinase 1 (MST1), large tumor suppressor 1 mRNA (LATS)이다. 4EBP1, RPS6 및 S6K1의 난소 mRNA 발현이 JBD 투여 시 용량 의존적으로 증가하였고, 30㎎/㎏ JBD 투여군에서 모두 유의하게 (P<0.05), 15㎎/㎏ JBD 투여군에서는 RPS6, S6K1의 난소 mRNA 발현을 유의하게 (P<0.05) 증가시켰다(도 3 A). 한편, MST1과 LATS의 경우 30㎎/㎏ JBD 투여군에서만 유의하게 (P<0.05) 증가하였다(도 3 B).

실험예 5. 본 발명 JBD가 난소 줄기 세포 (OSCs)에 미치는 영향

본 발명에 따른 JBD가 난소 다능성 줄기세포의 활성화에 영향을 미치는지를 확인하기 위해 JBD를 4주 동안 투여한 후, 각각의 PCR을 각각의 샘플에 대해 이중으로 수행하여 난소 조직에서 대표적인 다능성 줄기세포 표지자인 OCT4(octamer-binding transcription factor 4)의 mRNA 발현을 조사하고 그 결과를 도 4에 나타냈다. GAPDH에 대한 상대 유전자 발현 수준을 계산 하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 제시하였다. 도 4로부터 OCT4의 난소 mRNA 발현은 용량 의존적으로 JBD 투여군에서 증가하는 것을 확이 하였다(*P<0.05). 특히 이 효과는 30㎎/㎏ JBD 투여군(**P <0.01)에서 더욱 현저하였다.

실험예 6. 본 발명 JBD가 난소 혈관 신생 및 난포의 발달 활성화에 미치는 영향

본 발명에 따른 JBD가 난소에서 혈관 형성과 난포 발달 활성화에 미치는 영향을 확인하기 위해 JBD를 4주간 투여한 후 난소 조직에서 혈관 신생과 난포 발달 관련 유전자의 mRNA 발현을 조사하였다. 대표적인 혈관 신생 조절 인자로서 VEGF, visfatin 및 간질 세포 유도 인자(stromal cell derived factor-1α : SDF-1α)에 대한 실시간 PCR을 분석하고, 난포의 발달과 스테로이드 생성의 중요한 중재 인자 중 하나로서 인슐린 유사 성장 인자(insulin-like growth factor-1 : IGF1)에 대한 실시간 PCR 을 분석하여 그 결과를 도 5에 나타냈다. 각각의 PCR을 각각의 샘플에 대해 이중으로 수행 하고, GAPDH에 대한 상대 유전자 발현 수준을 계산 하였으며, 데이터는 평균 ± SD로 제시하였다.

도 5로부터 Visfatin을 제외한 VEGF, SDF-1α 및 IGF-1의 난소 mRNA 발현은 JDB 투여 후 유의하게 증가하였고, VEGF 발현은 JBD의 두 농도 간에 유사하였다. 또한 SDF-1α 발현은 JBD의 농도에 비례하여 증가하였고, IGF-1 발현은 JBD 30㎎/㎏ 농도에서만 유의하게 증가하였음을 확인하였다(*P<0.05)(**P <0.01).

실험예 7. 본 발명 JBD가 NOA 및 POF 쥐 모델에서 난모 세포의 질 및 배아 발달에 미치는 영향

본 발명에 따른 JBD의 경구 투여가 난소 기능을 활성화하고 난모 세포의 질을 증가시키는지 NOA 및 POF 쥐 모델을 활용하여 실험하였다. NOA 및 POF 쥐 모델들에 JBD를 투여 후 과배란을 유도하고 수컷과 교배시켰다. 그 다음 수정란을 수집하여 배양하고, 수집된 수정란의 수와 발달 역량을 조사하고 그 결과를 하기 표 4 및 표 5에 나타냈다.

표 4로부터 확인되는 바와 같이 NOA 쥐 모델에서 1마리당 추출된 평균 수정란의 수 및 배아 발달률은 대조군에서 6.0 및 8.8%에 비해 JBD 15㎎/㎏ 투여군에서 14.0 및 37.8%, JBD 30㎎/㎏ 투여군에서 16.3 및 41.4%로 유의하게 증가하였다(*P<0.05). JBD의 이러한 효과는 투여 농도 15㎎/㎏과 30㎎/㎏ 사이에서 유사했다. 반면 수집된 수정란의 분열률은 JBD 15㎎/㎏ 투여군에서 약간 높았으나 대조군과 JBD 30㎎/㎏ 투여군과 유의한 차이는 없었다.

NOA 마우스(쥐)에서 회수된 수정란의 수 및 배아 발생에 대한 본 발명 JBD 처리의 효과

JBD (mg/kg)	제공된 쥐모델의 번호	회수된 수정란의 수	수정란의 수			2-세포 배아의 발생율 (%)	배반포의 형성비율 (%)
			회수된 /마우스(쥐)	분열율 (%)	배양된 수정란의 수
			회수된 /마우스(쥐)	분열율 (%)	배양된 수정란의 수			0	7	42	6.0	8(19.0)	34	7(23.5)	3(8.8)
15	7	98	14.0*	24(24.5)	74	45(60.8)*	28(37.8)*
30	7	114	16.3*	15(13.2)	99	58(58.6)*	41(41.4)*

*P ＜ 0.05 (대조군 대비)

상기 표 4로부터 확인되는 바와 같이 POF 쥐(음성 대조군)에서 수정란의 수와 배아 발달률은 각각 9.7 및 0%로 정상 쥐(양성 대조군)의 25.0 및 68.9%와 비교하여 유의하게 감소하였다(*P<0.05). JBD 투여는 양성 대조군과 비슷한 수준까지 두 농도(15㎎/㎏ 및 30㎎/㎏)에서 POF 쥐의 수정란 수 및 배아 발생률을 POF 쥐(음성 대조군)에 비해 유의하게 증가시켰다(*P<0.05; POF, 음성 대조군 대비). 수집된 수정란 수와 배반포 형성 비율은 15㎎/㎏ JBD 투여군에서 14.0 및 68.9%, 30㎎/㎏ JBD 투여군에서 20.4 및 65.9%로 나타났다.

POF 마우스(쥐)에서 회수된 수정란의 수와 배아 발생에 대한 본 발명 JBD 처리의 영향

JBD (mg/kg)	제공된 쥐모델의 번호	수정란의 수				2-세포 배아의 발생율 (%)	배반포의 형성비율 (%)
		회수된 수정란의 수	회수된 /쥐	분열율 (%)	배양된 수정란의 수
		회수된 수정란의 수	회수된 /쥐	분열율 (%)	배양된 수정란의 수			0	7	175	25a	30(17.1)	145	122(84.1)*	100(69.9)*
(Nomal)
0(POF)	7	68	9.7	23(33.8)	45	8(17.8)	0(0)
15(POF)	7	98	14.0*	8(8.2)	90	74(82.2)*	62(68.9)*
30(POF)	7	143	20.4*	17(11.9)	126	102(80.9)*	83(65.9)*

이상에서 본 발명을 바람직한 실시 예로서 설명하였으나, 본 발명은 이에 한정되지 않고 발명의 요지를 이탈하지 않는 범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있음은 물론이다. 예컨대 여성 난소기능 분석방법에 있어서, 실시예와 청구범위에 기재된 어느 하나 이상의 단계를 생략하거나 변경하는 경우와 이를 포함하여 실시할 수 있도록 제조된 여성 난소기능 분석용 키트(kit)이다. 이같은 변경은 본원 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims

향부자(香附子) 20 ∼ 25중량%, 항기(黃耆) 15 ∼ 20중량%, 백출(白朮) 15 ∼ 20중량%, 숙지황(熟地黃) 10 ∼ 15중량%, 당귀(當歸) 10 ∼ 15중량%, 천궁(川芎) 10 ∼ 15중량% 및, 백작약(白芍藥) 10 ∼ 15중량%로 조성된 원료를 증류수를 넣어 열수 추출하는 추출단계와; 상기 추출단계에어 얻은 추출물을 가열한 후 원심분리하는 분리단계 및; 상기 분리단계에서 얻어진 상등액을 동결 건조하여 분말화하는 건조단계로 구성된 것을 특징으로 하는 조경보혈단(JBD) 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 추출단계는 한약재와 증류수의 비율이 1: 60 ∼ 65 이고, 95 ∼ 105 ℃에서 9.5 ∼ 10.5시간 추출하는 것이고, 상기 원심분리단계는 추출물의 무게가 40 ∼ 45%로 줄어들 때 까지 가열한 후 0.076 ∼ 0.082 MPa에서 원심분리하는 것이며, 상기 동결 건조단계는 추출물을 동결 건조하여 분말화하는 것을 특징으로 하는 조경보혈단(JBD) 조성물의 제조방법.
제 1항의 방법으로 제조된 조경보혈단(JBD) 조성물.
제 3항의 조경보혈단(JBD) 조성물을 유효성분으로 함유하는 원발성 난소부전 및 조기폐경 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 4항의 조경보혈단(JBD) 조성물의 농도에 따른 세포 독성을 MTT로 분석하는 단계와; 조경보혈단(JBD) 조성물을 생쥐에 투여 후 생쥐의 체중, 난소 중량 및 자궁 무게를 측정하는 단계와; 생쥐의 난소에 H & E 염색 후 난포의 수를 측정하여 조경보혈단(JBD) 투여 전과 비교하는 단계와; 생쥐에 4주간 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 mTOR/PI3K 및 Hippo 신호 전달 경로의 하류 분자의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 생쥐에 4주간 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 대표적인 다능성 줄기세포 표지자인 OCT4의 mRNA 발현을 조사하는 단계와; 생쥐에 4주간 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 난소 조직에서 혈관 신생과 난포 발달 유전자의 mRNA 발현을 조사하는 단계 및; NOA 및 POB 쥐 모델들에 조경보혈단(JBD) 조성물을 투여한 후 과배란을 유도하고 수컷과 교배시킨 다음 수정란을 수집하여 배양하고, 수집된 수정란의 수와 발달 역량을 조사하는 단계로 이루어진 조경보혈단(JBD) 조성물을 이용하여 여성 난소 기능의 분석방법.
제 5항의 분석방법을 사용할 수 있는 조경보혈단(JBD) 조성물이 포함된 여성 난소기능 분석용 키트(kit).