KR20210041037A

KR20210041037A - 커큐미노이드 조성물의 용도

Info

Publication number: KR20210041037A
Application number: KR1020217006618A
Authority: KR
Inventors: 파스칼 엘리자베스 르네 팡사-베르통; 레일라 데니스 팔카오; 매튜 테농; 마릴린 비날; 시모나 비르틱
Original assignee: 나투렉스 에스아
Priority date: 2018-08-06
Filing date: 2019-08-05
Publication date: 2021-04-14
Also published as: MX2021000776A; CA3108123A1; WO2020030612A1; JP2021534105A; BR112021001403A2; US20240115519A1; US20220280448A1; CN112566630A; AU2019320488A1; EP3833337A1

Abstract

본 발명은 커큐민을 포함하는 조성물의 방법 및 용도; 특히, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성의 개선과 관련된 방법 및 용도에 관한 것이다.

Description

커큐미노이드 조성물의 용도

본 발명은 커큐민을 포함하는 조성물의 방법 및 용도, 특히, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성의 개선에 관한 방법 및 용도에 관한 것이다.

본 명세서 중 명백하게 이전에 발표된 문서의 목록 또는 검토가 반드시 상기 문서가 최신 기술의 일부이거나 통상적인 일반 지식이라고 인정하는 것으로 간주되어야 하는 것은 아니다.

강황 및 강황으로부터 단리된 화합물, 예를 들어, 커큐민을 포함한 커큐미노이드는 오랫동안 다양한 질환 및 병태를 치료하는데 사용되어 왔다.

커큐미노이드는 초본식물 울금(Curcuma longa)의 근경으로부터 유래된 천연 옐로우-오렌지색 안료이며 소수성 폴리페놀이다. 이들은 일반적으로 향신료 및 식품-착색제 강황으로부터 단리된다.

강황 추출물은 대략 75 내지 80%의 커큐민, 15 내지 20%의 디메톡시커큐민(DMC), 및 0 내지 10% 비스디메톡시커큐민(BDMC)을 함유한다. 커큐미노이드는 독특한 공액 구조, 비스-α,β-불포화 β-다이케톤(일반적으로 다이페룰로일메탄으로 불림)을 가지며, 이것은 산성 및 중성 용액중에서 우세한 케토 형태 및 알칼리성 매질중에서 안정한 엔올 형태를 갖는 케토-엔올 호변이성을 나타낸다(도 1 참조)(문헌[Hoehle SI, Pfeiffer E, Solyom AM, Metzler M. Metabolism of curcuminoids in tissue slices and subcellular fractions from rat liver. J Agric Food Chem. 2006 Feb 8;54(3):756-64]).

커큐민은 1949년에 처음 항균 활성을 나타내는 것으로 밝혀진 매우 다면발현성인 분자이다. 그 이후로, 상기 폴리페놀은 소염, 혈당저하, 항산화, 상처-치료 및 항미생물 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 지난 30년에 걸친 광대한 전임상 연구 및 임상 시험들은 광범위한 인간 질환들에 대한 커큐민의 치료 잠재력을 시사하였다(문헌[Gupta SC, Sung B, Kim JH, Prasad S, Li S, Aggarwal BB. Multitargeting by turmeric, the golden spice: From kitchen to clinic. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1510-28]).

커큐민이 많은 인간 질병들에 대해 효능을 나타냈지만, 또한 불충분한 흡수, 빠른 대사 및 빠른 전신 배출로 인해 제한된 생체이용률을 갖는 것으로 알려져 있다.

커큐민을 경구 투여한 경우에, 제한된 조직 분포 및 빠른 대사뿐 아니라 낮은 혈청 수준이 보고되었다. 예를 들어, 12 g 이하의 경구 용량 후에도, 커큐민의 혈청 수준은 낮은 마이크로몰농도 수준을 초과하지 않았음이 입증되었다. 4 내지 8 g의 커큐민을 사용한 한 임상 연구에서, 관찰된 최대 혈청 농도는 1.3 μg/mL였지만, 여러 다른 임상 및 동물 연구들은 밀리리터당 더 낮은 나노그램 범위의 혈청 수준을 보고하였다(문헌[Anand P, Kunnumakkara AB, Newman RA, Aggarwal BB. Bioavailability of curcumin: problems and promises. Mol Pharm. 2007 Nov-Dec;4(6):807-18]).

커큐민은 물에 잘 용해되지 않는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 수성 완충제(pH 5.0) 중 커큐민의 최대 용해도는 11 ng/mL 정도로 낮은 것으로 보고되었다(문헌[Tonnesen et al, 2002]).

커큐민은 산성 pH에서 비교적 안정하지만 중성보다 높은 pH에서는 신속하게 분해되어 페룰산 및 페룰로이메탄을 형성하며, 상기 페룰로이메탄은 바닐린을 생성한다(문헌[FAO 2004. CURCUMIN Chemical and Technical Assessment (CTA) First draft prepared by Ivan Stankovic. Chemical and Technical Assessment 61st JECFA]).

커큐민은 또한 매우 낮은 장 흡수를 나타낸다. 커큐민의 겉보기 투과도 계수는 시험관내 인간 장 세포 모델에서 매우 낮게 확인되어(Papp 값: 0.1 x 10^-6 cm/s), Caco-2 세포에서 시험관내로 측정된 Papp 값과 생체내 인간 흡수와의 상관성에 따라, 인간에서 낮은(0 내지 20%) 흡수를 예측할 수 있다(문헌[Dempe JS, Scheerle RK, Pfeiffer E, Metzler M. Metabolism and permeability of curcumin in cultured Caco-2 cells. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1543-9]).

커큐민은, 일단 흡수되면, 제 1 상 및 제 2 상 대사가 둘 다 일어난다(도 2 참조).

제 1 상 대사에서, 커큐민 및 이의 2개의 디메톡시 동질체는 간에서뿐 아니라 장 점막에서도 이의 다이하이드로-, 테트라하이드로-, 헥사하이드로- 및 옥타하이드로-대사산물로의 연속적인 환원이 일어난다. 제 2 상 대사에서는, 커큐민 및 이의 환원성 대사산물들 모두 글루쿠론산 및 설페이트와 공액화되어 제 2 상 대사산물을 생성한다.

환원 및 공액은 래트 및 인간의 간 및 장 조직에서 일어나는 커큐미노이드의 일반적인 대사 경로인 것으로 보인다. 따라서, 위장관 이외의 다른 조직에서 커큐민에 의해 유도되는 생물학적 효과는 여러 저자들에 의해 커큐민 대사산물로 인한 가능성이 더 큰 것으로 여겨진다.

커큐민은 또한 장 미생물들에 의해 대사되는 것으로 밝혀졌다(도 3 참조).

커큐민의 미생물 대사는 2-단계 환원을 포함하는 것으로 확인되었으며, 여기서 커큐민은 NADPH-의존성 커큐민/다이하이드로커큐민 리덕타제(CurA)에 의해 다이하이드로커큐민에 이어서 테트라하이드로커큐민으로 연속적으로 전환된다(문헌[Hassaninasab A, Hashimoto Y, Tomita-Yokotani K, Kobayashi M. Discovery of the circumin metabolic pathway involving a unique enzyme in an intestinal microorganism. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Apr 19;108(16):6615-20]).

최근의 연구는 또한, 테트라하이드록시커큐민은 래트에서 조직내에 축적될 수 있지만 커큐민은 그렇지 않음을 보고하였으며, 이는 미생물총이 또한 커큐민 대사 및 생체이용률에 있어 잠재적인 작용자로 간주될 수 있음을 시사한다(문헌[Neyrinck AM, Alligier M, Memvanga PB, N

vraumont E, Larondelle Y, Pr

at V, Cani PD, Delzenne NM. Curcuma longa extract associated with white pepper lessens high fat diet-induced inflammation in subcutaneous adipose tissue. PLoS One. 2013 Nov 19;8(11):e81252]).

신속한 대사, 불량한 수용해도, 중성 pH에서 및 빛 및/또는 산소에 노출시 불안정성, 및 조직내 불량한 흡수율은, 암과 같은 병태의 치료에서 커큐민을 비롯한 커큐미노이드의 잠재적 유용성을 급격히 제한한다.

불량한 수용해도 및 흡수 특성으로 인해, 커큐민을 용해시키기 위해 전형적으로 유기 용매, 예를 들어, 다이메틸설폭사이드(DMSO)가 사용된다. 그러나, 상기 용매의 사용이 커큐민을 가용화시키고 이용성을 개선하는 것을 촉진하지만, 비히클로서 유기 용매의 사용은, 특히 천연 성분들에 대한 소비자의 요구가 증가하는 연령에서, 논란이 되며 바람직하지 않다.

커큐민의 수용해도를 촉진하는 또 다른 가능성은 유화를 통해서이다. 그러나, 천연 유기 등급 유화제는 드물고, 폴리솔베이트 80과 같은 합성 유화제, 또는 전분-기재 유화제와 같은 천연 유화제 둘 다 전형적으로 물에 낮은 수준(<7%)의 커큐민만을 분산시킬 수 있다.

상기 단점들을 해결하고 커큐민의 치료 효능을 개선하기 위해 찾아낸 다른 방법들은 중합체 나노입자, 중합체 미셀, 및 친수성 중합체에 커큐민을 그래프팅시키는 것을 포함한다.

본 발명은 커큐미노이드와 연관된 전술한 문제(예컨대, 커큐민의 불량한 수용해도)를 처리하고, 하기 방법 및 용도를 제공함으로써 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 놀랍게도 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성이 (i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야, 및 (iii) 변성 전분 및/또는 아라비아 고무를 포함하는 조성물의 형태의 상기 커큐미노이드를 투여함으로써 개선될 수 있음이 밝혀졌다.

방법 및 용도

본 발명은 (i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 (iii) 변성 전분 및/또는 아라비아 고무를 포함하는 형태의 상기 커큐미노이드의 투여를 포함하는, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명은 (i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 (iii) 변성 전분 또는 아라비아 고무를 포함하는 조성물의 형태의 상기 커큐미노이드의 투여를 포함하는, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하는 방법을 제공한다.

이러한 방법은 이하에서 "본 발명의 방법"으로 지칭될 수 있다.

본 발명의 방법에 사용된 일부 조성물은 호로파를 포함하지 않고, 예를 들어 본 발명의 일부 조성물은 호포파 섬유(즉, 호로파로부터 수득되거나 수득가능한 섬유)를 포함하지 않는다.

본 발명의 방법에 사용된 조성물은 소량의 폴리올 및/또는 저분자량 당, 바람직하게는 1 또는 2개의 모노사카라이드 단위를 갖는 저분자량 당을, 예를 들어, 조성물의 5 중량% 미만 또는 조성물의 2.5 중량% 미만으로 포함할 수 있다. 또는, 본 발명의 조성물은 폴리올 및/또는 저분자량 당, 예를 들어, 1 또는 2개의 모노사카라이드 단위를 갖는 저분자량 당을 함유하지 않을 수 있다. 즉, 일부 조성물은 폴리올 및/또는 저분자량 당, 예를 들어, 1 또는 2개의 모노사카라이드 단위를 갖는 저분자량 당을 함유하지 않는다.

본 발명은 또한 (i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 (iii) 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하기 위한 변성 전분 및/또는 아라비아 고무를 포함하는 조성물의 용도를 제공한다.

본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물은 유화액의 형태일 수 있거나 본 발명의 조성물은 고체 형태, 예를 들어, 분말의 형태일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "유화액"은 통상적으로 섞이지 않는 2개의 액체를 혼합함으로써 생성되는 콜로이드의 한 유형을 지칭한다. 전형적으로, 2개의 액체 중 하나는 다른 액체의 분산액을 함유할 것이다.

때때로, 용어 "콜로이드" 및 "유화액"은 호환적으로 사용되지만, 본원에서 사용되는 용어 유화액은 혼합물의 두 상 모두가 액체인 경우 적용된다. 콜로이드 내 입자들은 임의의 상의 물질일 수 있다. 따라서, 유화액은 콜로이드의 한 유형이지만, 모든 콜로이드가 유화액은 아니다.

때때로 콜로이드성 현탁액으로 확인되는 콜로이드성 용액은 물질들이 유체중에 규칙적으로 현탁되어 있는 혼합물이다.

이러한 용도는 이하에서 "본 발명의 용도"로서 지칭될 수 있다.

본 발명의 방법 또는 용도에서, 조성물 내의 커큐미노이드는 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 그러나, 커큐미노이드가 천연 공급원으로부터 수득되는 것, 즉 커큐미노이드가 합성 커큐미노이드가 아니고, 식물-기반인 것이 바람직하다.

본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물에서, 조성물은 약 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm 또는 1500 nm 내지 약 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm 또는 2000 nm, 예컨대 약 1000 nm 내지 약 6000 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함할 수 있다. 입자는 또한 약 200 nm 내지 약 600 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 400 nm의 평균 직경을 가질 수 있다.

예를 들어, 본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물에서, 조성물은 약 100 nm 내지 약 700 nm, 예컨대 약 200 nm 내지 약 600 nm 또는 약 300 nm 내지 약 500 nm 또는 약 400 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함할 수 있다.

예를 들어, 조성물은 약 550 nm 내지 약 700 nm의 평균 직경을 갖는 입자, 및 약 100 nm 내지 약 250 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하여 약 400 nm의 평균 직경을 제공할 수 있다.

예를 들어, 조성물이 유화액의 형태인 경우, 상기 조성물은, 예를 들어, 약 550 nm 내지 약 700 nm의 평균 직경을 갖는 입자 및 약 100 nm 내지 약 250 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하여, 약 400 nm의 평균 직경을 제공할 수 있다.

조성물이 고체, 예를 들어, 분말의 형태인 경우, 상기 조성물은, 예를 들어, 약 1000 nm 내지 약 6000 nm, 예를 들어, 약 2000 nm 내지 약 4000 nm의 평균 직경을 갖는 입자들을 포함할 수 있다.

조성물 중 입자들은 미셀의 형태일 수 있다.

본 발명의 조성물에서, 예를 들어, 조성물이 고체의 형태인 경우, 상기 입자들은 분무 건조와 같은 당해 분야에 공지된 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

입자의 제조 후에(예를 들어, 분무 건조와 같은 건조 후에), 입자들은 보다 균일한 크기를 제공하기 위해 분쇄되고/되거나 밀링(예를 들어, 볼 밀링)될 수 있다.

부하된 커큐민 미셀의 크기 및 형태는 동적 광산란(DLS), 및 제타 전위(Z-전위), 및 주사 전자 현미경(SEM)으로 분석하였다. DLS 및 제타-전위 분석의 경우, (25 ± 0.1 ℃)의 온도에서 90°의 고정된 산란 각도에서 He/Ne 레이저(λ=633 nm)를 갖는 제타사이저 나노(Zetasizer Nano) ZS(나노(Nano)ZS90, 맬버른 인스트루먼트 리미티드(Malvern Instrument Ltd.), 영국)로 분석하였다. 예를 들어, 입자의 크기는 하기 실시예에서 정의되는 바와 같은 방법 CQ-MO-304에 의해 측정할 수 있다.

조성물에서, 커큐미노이드는 임의의 공급원으로부터 수득할 수 있다. 그러나, 커큐미노이드는 천연 공급원에서 수득되는 것이 바람직하다. 즉, 커큐미노이드는 합성이 아니고, 식물 기반이다.

조성물은 조성물의 중량을 기준으로 약 2.5% 이상의 커큐미노이드를 포함할 수 있다.

전형적으로, 본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물에서, 커큐미노이드는 조성물의 중량을 기준으로 약 2.5% 내지 약 60%, 예컨대 약 5% 내지 약 50%, 약 10% 내지 약 45%, 또는 약 15% 내지 약 40%의 양으로 존재할 수 있다.

커큐미노이드는 강황(울금)의 뿌리(근경), 올레오레진 강황 뿌리, 탈지된 올레오레진 강황 뿌리 및 이들의 혼합물로부터 추출 및 임의적으로 정제에 의해 제공될 수 있다. 즉, (i) 커큐미노이드는 추출물중 총 커큐미노이드의 %를 기준으로 약 30% 내지 약 100%의 커큐미노이드, 예를 들어, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 내지 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% 또는 45%의 커큐미노이드를 포함하는 강황의 추출물 또는 정제된 추출물의 형태일 수 있다.

커큐미노이드가 강황 추출물로서 제공되는 경우, 상기 강황은 알콜계 추출 용매, 예를 들어, 물/알콜 혼합물 또는 알콜을 사용하여 추출할 수 있다. 예를 들어, 알콜계 추출 용매는 물/메탄올(즉, 물과 메탄올의 혼합물) 또는 물/에탄올(즉, 물과 에탄올의 혼합물) 또는 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.

추출 용매가 물/알콜 혼합물을 포함하는 경우, 물 대 알콜의 비는 약 25:75 내지 약 1:99, 예를 들어, 약 20:80 내지 약 5:95 또는 약 10:90일 수 있다. 예를 들어, 추출 용매는 약 25:75 내지 약 1:99, 예를 들어, 약 20:80 내지 약 5:95 또는 약 10:90의 비의 물/에탄올일 수 있다.

이어서, 강황 추출물을 더 정제하여 추출물중 총 커큐미노이드의 %를 기준으로 약 30% 내지 약 100%의 커큐미노이드, 예를 들어, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 내지 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% 또는 45%의 커큐미노이드를 포함하는 커큐미노이드의 추출물을 제공할 수 있다.

추출물의 정제는 당해 분야에 공지된 기술들을 이용하여 수행할 수 있다. 전형적으로, 추출물은 알콜계 용매, 예를 들어, 100%의 메탄올 또는 100%의 에탄올을 사용하여 정제한다.

강황 추출물은 임의적으로 임의의 과량의 용매를 제거하기 위해 건조할 수 있다.

커큐미노이드가 상기 정의된 강황 추출물의 형태로 제공되는 경우, 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 약 2.5% 내지 약 50%, 예컨대 약 5% 내지 약 40%, 또는 약 35%의 강황 추출물을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 약 8% 내지 약 40%의 강황 추출물을 포함할 수 있고, 이때 강황 추출물은 강황 추출물의 중량을 기준으로 약 65% 내지 약 95%의 커큐미노이드를 포함하여, 조성물의 중량을 기준으로 약 6% 내지 약 38%의 커큐미노이드를 포함하는 조성물을 제공하거나, 조성물은 조성물의 중량을 기준으로 약 8% 내지 약 15%의 강황 추출물을 포함할 수 있고, 이때 강황 추출물은 강황 추출물의 중량을 기준으로 약 95%의 커큐미노이드를 포함하여 약 6% 내지 약 13.5%의 커큐미노이드를 포함하는 조성물을 제공한다.

커큐미노이드는 액체 또는 분말, 예를 들어, 분말, 예를 들어, 분말화된 강황 추출물로서 제공될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "커큐미노이드"는 커큐민, 디메톡시커큐민(DMC) 및 비스디메톡시커큐민(BDMC)을 포함한다. 예를 들어, 강황 추출물은 약 70% 내지 약 85%의 커큐민(예를 들어, 약 75% 내지 약 80%), 약 10% 내지 약 25%의 DMC(예를 들어, 약 15% 내지 약 20%), 및 약 0% 내지 약 10%의 BDMC를 포함할 수 있다.

존재하는 경우, 조성물 내의 변성 전분은 조성물의 중량을 기준으로 약 30% 내지 약 90%, 예컨대 약 40% 내지 약 80%의 양으로 존재할 수 있다.

본원에 사용된 용어 "변성 전분"은 물리적, 효소적 또는 화학적 처리된 전분을 포함하지만, 환형 구조를 갖는 변성 전분, 예컨대 사이클로덱스트린을 포함하지 않는다. 본원에 기술된 조성물에 사용될 수 있는 변성 전분은 비제한적으로 말토덱스트린을 포함하지 않는다.

본 발명의 조성물 중 아라비아 고무는 조성물의 중량을 기준으로 약 40% 내지 약 65%, 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 약 50 내지 약 60%, 또는 조성물의 중량을 기준으로 약 58%의 양으로 존재할 수 있다.

조성물 중 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물은 추출물의 중량을 기준으로 약 0.1% 내지 약 5%, 예를 들어, 조성물의 중량을 기준으로 약 0.5% 내지 약 3%의 양으로 존재할 수 있다.

조성물 중 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물은 퀼라야 추출물의 중량을 기준으로 50% 이상의 사포닌, 예를 들어, 60% 이상의 사포닌 또는 65% 이상의 사포닌을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물에 사용되는 퀼라야는 퀼라야 추출물의 중량을 기준으로 약 50% 내지 약 80% 또는 약 60% 내지 약 75%의 사포닌을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는, 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물은 임의의 형태, 예를 들어, 액체 또는 고체일 수 있다. 예를 들어, 퀼라야 추출물은 고체, 예를 들어, 분말의 형태로 사용될 수 있다.

조성물은 임의적으로 식물 및/또는 식물성 오일을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물은 코코넛 오일, 옥수수 오일, 올리브 오일, 팜 오일, 피넛 오일(땅콩 기름), 카놀라 오일을 포함한 유채씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 대두 오일, 해바라기 오일 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 및/또는 식물성 오일을 포함할 수 있다.

조성물에 존재하는 식물 및/또는 식물성 오일은 조성물의 중량을 기준으로 약 1% 내지 약 20%의 식물 및/또는 식물성 오일, 예를 들어, 약 2.5% 내지 약 10%, 또는 약 5%의 양으로 존재할 수 있다.

본원에서 달리 언급되지 않는 한, 열거된 중량%는 수득된 (건조) 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.

불확실함을 방지하기 위해, 본 발명의 해당 양태, 특징 또는 파라미터에 대해 나타낸 선호성, 선택권, 특별한 특징 등은, 문맥에서 달리 나타내지 않는 한, 본 발명의 같거나 다른 양태, 특징 및 파라미터들에 대해 나타낸 바와 같은 임의의 및 모든 다른 선호성, 선택된, 특별한 특징 등과 함께 개시된 것으로 간주해야 한다.

본원에서 사용되는 용어 "약"은, 예를 들어, 측정가능한 값(예를 들어, 반응 혼합물중 특정 성분의 양 또는 중량)을 지칭하는 경우에, 특정량에 대해 ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0.5%, 또는 특히, ±0.1%의 변화를 지칭한다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 중 한 성분의 %와 관련하여 ±0.5%의 변화는 해당 %에 대해 0.5%의 변화를 의미한다. 즉, 10%의 ±0.5%는 9.5% 내지 10.5%의 변화를 의미한다.

본 발명의 조성물은 고체 또는 액체 형태, 바람직하게는 고체 형태, 예를 들어, 분말로 제공될 수 있다. 고체 형태에는, 화합물이 무정형 고체로서 또는 결정성 또는 부분-결정성 고체로서 제공될 수 있음이 포함된다.

본 발명의 조성물은 전형적으로 4 이상의 pH, 예를 들어, 약 4 내지 약 7의 pH에서 매우 수용성이고 안정하다.

수용성이란 용어는 조성물의 적어도 약 50%, 예를 들어, 적어도 약 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%가 실온, 즉 약 25 ℃의 온도에서 물에 용해될 것을 의미한다.

본원에 기술된 방법 또는 용도에서, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성의 개선은 커큐미노이드의 개선된 위장 내성 및/또는 장 세포에 의한 커큐미노이드의 개선된 흡수 및/또는 개선된 혈액 순환을 제공하는 조성물에 기인할 수 있다.

따라서, 본원에 기술된 방법 또는 용도는 커큐미노이드의 위장 내성을 개선하고/거나 장 세포에 의한 커큐미노이드의 흡수를 개선하고/거나 혈액 순환을 개선하는 데 사용될 수 있다.

본원에 기술된 방법 또는 용도에서, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성의 개선은 개선된 수용해도 및/또는 약 4 내지 약 7의 pH에서의 개선된 안정성을 제공하는 조성물에 기인할 수 있다.

따라서, 본 발명은 커큐미노이드를 앞에서 정의한 바와 같은 본 발명의 조성물의 형태로 투여하는 것을 포함하는, 커큐미노이드의 수용해도 및/또는 pH 안정성을 개선하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 커큐미노이드의 수용해도 및/또는 pH 안정성을 개선하기 위한, 앞에서 정의한 바와 같은 조성물의 용도를 제공한다.

본원에 기술된 방법 또는 용도에서, 커큐미노이드는 커큐민 및 이의 제 1 상 또는 제 2 상 대사산물, 디메톡시커큐민 및 이의 제 1 상 및 제 2 상 대사산물, 비스디메톡시커큐민 및 이의 제 1 상 또는 제 2 상 대사산물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 제 1 상 및/또는 제 2 상 대사산물들은 커큐민 글루쿠로니드, 커큐민 설페이트, DMC 글루쿠로니드, DMC 설페이트, BDMC 글루쿠로니드, BDMC 설페이트, 테트라하이드로커큐민(THC), THC 글루쿠로니드, THC 설페이트, 헥사하이드로커큐민(HHC), HHC 글루쿠로니드, HHC 설페이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본원에 기술된 조성물, 방법 또는 용도에서, 커큐미노이드는 이의 대사되지 않은 형태(즉, 유리 형태), 예를 들어, 글루쿠로니드 또는 설페이트 부가가 일어나지 않은 커큐민, DMC 및 BDMC의 형태일 수 있다.

본원에 기술된 방법 및 용도에서, 포유동물은 인간일 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "생체이용률"은 정상적인 생리학적 기능들에서의 활용을 위한 작용 부위에서 이용가능한 섭취 성분의 분획으로 정의할 수 있으며, 생체내 분석을 통해 측정된다(문헌[Guerra et al 2012]). 생체이용률은 주요한 3 단계의 결과이다: 위장관에서 그 요소의 소화율 및 용해도; 장 세포에 의한 상기 요소의 흡수 및 순환계로의 운반; 및 순환계로부터 기능성 물질 또는 표적으로의 혼입(문헌[Wienk KJH, Marx JJM, Beynen AC (1999) The concept of iron bioavailability and its assessment. Eur J Nutr 38:51-75; Etcheverry P, Grusak MA, Fleige LE (2012) Application of in vitro bioaccessibility and bioavailability methods for calcium, carotenoids, folate, iron, magnesium, polyphenols, zinc, and vitamins B6, B12, D, and E. Front Physiol 3:1-21]).

본원에서 사용되는 용어 "생체접근성"은 위장관내에서 이의 식품 매트릭스로부터 방출되며, 따라서 장 흡수에 이용가능하게 되는 화합물의 분획으로 정의할 수 있다(전형적으로 시험관내 절차로부터 수립됨). 상기 용어는 식품 소화시 잠재적으로 생체접근가능한 물질로의 전환을 위해 일어나는 연속되는 반응들을 포함하지만, 상피 조직을 통한 흡수/동화 및 사전-전신 대사(장 및 간 둘다)는 배제한다(문헌[Alegria A., Garcia-Llatas G., Cilla A. (2015) Static Digestion Models: General Introduction. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham]).

본원에서 사용되는 용어 "생체활성"은 영양소 또는 생체활성 화합물이 표적 조직으로 운반되고 도달하는 방법, 상기 영양소 또는 화합물이 생체분자와 상호작용하는 방법, 상기 영양소 또는 화합물에 일어날 수 있는 대사 또는 생체전환, 및 바이오마커의 생성 및 유도된 생리학적 반응으로 정의될 수 있다(문헌[Alegria A., Garcia-Llatas G., Cilla A. (2015) Static Digestion Models: General Introduction. In: Verhoeckx K. et al. (eds) The Impact of Food Bioactives on Health. Springer, Cham]).

본원에 기술된 방법/용도에서, 조성물은 약 100 mg/일 내지 약 2000 mg/일, 또는 약 500 mg/일 내지 약 1500 mg/일, 또는 약 1000 mg/일, 예컨대 약 300 mg/일 내지 약 1000 mg/일의 양으로 투여되거나 이러한 양으로 커큐미노이드를 제공하도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 약 1 내지 약 10 mg/kg 체중, 예컨대 약 2.5 내지 약 7.5mg/kg 체중, 또는 약 5mg/kg 체중의 양으로 커큐미노이드를 제공할 수 있다.

조성물 및 투여

본 발명에 따라서, 본원에 기술된 방법 및 용도에 사용된 조성물은 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 제초제, 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 형태로 제공될 수 있거나, 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 일부를 형성할 수 있다.

예를 들어, 본 발명은, 본 발명의 조성물로 이루어지거나, 필수적으로 본 발명의 조성물로 이루어지거나[즉, 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 적어도 90%(w/w), 예를 들어, 적어도 95%, 또는 99% 또는 99.5%가 본 발명의 조성물이다], 본 발명의 조성물을 포함하는, 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형을 제공한다.

본 발명은 또한 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형에 있어서 본 발명의 조성물의 용도를 제공한다.

본 발명의 조성물이 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 제초제, 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 형태이거나 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 일부를 형성할 수 있는 경우, 본 발명의 조성물은 임의적으로 약학/수의학 성분들, 예를 들어, 부형제 또는 담체 또는 (기능) 식품 허용 성분들 및 적절하게 이들의 혼합물을 추가로 포함할 수 있다.

불확실함을 방지하기 위해, 본 명세서에서 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"를 사용하는 경우, 기술되는 추출물 또는 조성물이 열거된 성분(들)을 함유해야 하지만 임의적으로 추가의 성분들을 함유할 수도 있음을 의미한다. 용어 "필수적으로 이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지다"를 사용하는 경우, 기술되는 추출물 또는 조성물이 열거된 성분(들)을 함유해야 하고, 또한 임의의 추가의 성분들이 추출물 또는 조성물의 근본적인 성질에 영향을 미치지 않는다면 소량(예를 들어, 5 중량% 이하, 또는 1 중량% 또는 0.1 중량% 이하)의 다른 성분들을 함유할 수 있음을 의미한다. 용어 "이루어지는" 또는 "이루어지다"를 사용하는 경우, 기술되는 추출물 또는 조성물이 열거된 성분(들)만을 함유해야 함을 의미한다.

또한, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"은 필요한 대로 본원 전체에 걸쳐 "이루어지다" 또는 "이루어지는" 또는 "필수적으로 이루어지는"으로 대체될 수 있는 것으로 의도된다.

본원에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 허용되는 부형제에 대한 언급은 당해 분야의 숙련가에게 공지된 바와 같은 약학적으로 허용되는 보조제, 희석제 및/또는 담체를 지칭할 수 있다.

식품 허용 성분들은 당해 분야에 공지되어 있고(본원에서 약학적으로 허용되는 부형제로 언급된 것들도 포함) 천연 또는 비-천연일 수 있는, 즉, 그 구조가 자연에서 존재하거나 존재하지 않을 수 있는 성분들을 포함한다. 특정한 경우에서, 상기 성분들은 천연 화합물로부터 유래할 수 있으며 나중에 변형될 수 있다(예를 들어, 말토덱스트린).

"약학적으로/기능식품에 허용되는"은 조성물의 추가의 성분들이 멸균성이고 발열원이 없음을 의미한다. 상기 성분들은 또한 본 발명의 조성물과 상용가능하고 그 수용체에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야 한다. 따라서, "약학적으로 허용되는"은 단지 부형제로 작용하기 위한, 즉 자체로 생물 활성을 갖지 않는 제형의 일부를 형성하는데 사용되는 임의의 화합물(들)을 포함한다. 따라서, 약학적으로 허용되는 부형제는 일반적으로 안전하고, 무독성이고, 생물학적으로나 다르게나 불쾌하지 않다.

본 발명의 조성물이 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 일부를 형성하는 경우, 본 발명의 조성물은 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형 중에, 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 중량을 기준으로 약 1 내지 약 99%, 예를 들어, 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 중량을 기준으로 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90% 내지 약 90%, 80%, 70%, 60%, 50%, 40%, 30% 또는 20%의 양으로 존재한다.

투여

숙련가라면, 본원에 기술된 방법 및/또는 용도에서, 본 발명의 조성물이 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 형태인 경우에 또는 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형이 본 발명의 조성물을 포함하는 경우에, 본 발명의 조성물, 및 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형이 환자 또는 대상(예를 들어, 인간 또는 동물 환자 또는 대상)에게 임의의 적합한 경로에 의해, 예를 들어, 경구, 직장, 코, 폐, 구강, 설하, 경피, 뇌조내, 복강내, 및 비경구(피하, 근육내, 척추강내, 정맥내 및 피내) 경로에 의해 투여될 수 있음을 이해할 것이다.

특히, 본원에 기술된 방법 및/또는 용도에서, 본 발명의 조성물을 포함하는 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형의 형태 또는 형성 부분인 조성물은 경구로 투여할 수 있다. 그러한 경우에, 본 발명에 따른 약학 조성물은 특별히 경구 경로에 의한 투여를 위해 제형화될 수 있다.

경구 투여용 약학 제형은 경질 또는 연질 캡슐, 정제, 트로키제, 당의정, 환제, 로젠지, 분말 및 과립과 같은 고체 투여형을 포함한다. 적절한 경우, 상기 제형들은 장용 코팅과 같은 코팅을 사용하여 제조될 수 있거나, 당해 분야에 공지된 방법에 따라서, 활성 성분의 조절된 방출, 예를 들어, 지속 또는 지연된 방출을 제공하도록 제형화될 수 있다.

경구 투여를 위한 액체 투여형은 용액, 유화액, 수성 또는 유성/오일 기재 현탁액, 시럽 및 엘릭시르제를 포함한다.

본원에 기술된 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형, 예를 들어, 경구 투여를 위한 상기 제형들은 조성물의 성분들을 혼합시키는 것과 같이 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.

본원에 기술된 바와 같은 상기 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형은 식품 성분들, 예를 들어, 감미제, 향미제, 착색제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 추가의 성분들을 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제조에 적합한 무독성의 약학적으로 허용되는 부형제(또는 성분들)와 함께 활성 성분(들)을 함유할 수 있다. 상기 부형제들(또는 성분들)은, 예를 들어, 불활성 희석제, 예를 들면, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분, 말토덱스트린 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 또는 활석일 수 있다. 정제는 코팅되지 않거나, 위장관에서의 붕해 및 흡수를 지연시킴으로써 더 긴 기간에 걸쳐 지속적인 작용을 제공하기 위해 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트와 같은 시간 지연 물질을 사용할 수 있다.

적합한 약학적 담체는 불활성 고체 희석제 또는 충전제, 멸균 수용액 및 다양한 유기 용매를 포함한다. 고체 담체의 예는 락토스, 백토, 슈크로스, 사이클로덱스트린, 말토덱스트린, 활석, 젤라틴, 아가, 펙틴, 아카시아, 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 아라비아 고무, 변성 전분 및 셀룰로스의 저급 알킬 에터이다. 액체 담체의 예는 시럽, 피넛 오일, 올리브 오일, 인지질, 지방산, 지방산 아민, 폴리옥시에틸렌 및 물이다. 또한, 담체 또는 희석제는 당해 분야에 공지된 임의의 서방성 물질, 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트를 단독으로 또는 왁스와 혼합되어 포함할 수 있다.

치료될 질병 및 환자뿐 아니라, 투여 경로에 따라서, 본 발명의 조성물은 다양한 용량(즉, 그를 필요로 하는 환자에게 투여될 때 치료적으로 효과적인 용량)으로 투여될 수 있다. 이와 관련하여, 전문가라면 본 발명의 맥락에서 포유동물, 특히 인간에게 투여되는 용량이 타당한 시간대에 걸쳐 포유동물에서 치료 반응을 수행하기에 충분해야 함을 인지할 것이다. 당해 분야의 숙련가라면, 정확한 용량 및 제형 및 가장 적절한 전달 방법의 선택이 또한 무엇보다 제형의 약리학적 성질, 치료되는 병태의 성질 및 중증도, 및 수용체의 물리적 상태 및 정신력뿐 아니라, 특정 화합물의 효능, 치료될 환자의 연령, 상태, 체중, 성별 및 반응, 및 질환의 단계/중증도에 의해 영향받을 것임을 인지할 것이다.

전형적으로, 본 발명의 조성물, 또는 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형은, 약 100 내지 약 2000 mg/일, 또는 약 500 내지 약 1500 mg/일, 또는 약 1000 mg/일, 예를 들어, 약 300 내지 약 1000 mg/일의 양으로 커큐미노이드를 제공하도록 투여된다. 예를 들어, 상기 조성물, 또는 기능식품 제형, 인간 또는 동물을 위한 식이 또는 식품 제품(예를 들어, 기능성 식품 제형, 즉, 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료, 또는 식품, 음료, 사료 또는 애완동물 사료 보충제), 영양 보충제, 방향제 또는 향미료, 약학 또는 수의학 제형, 포도주양조 제형 또는 화장품 제형은, 약 1 내지 약 10 mg/체중 kg, 예를 들어, 약 2.5 내지 약 7.5 mg/체중 kg, 또는 약 5 mg/kg의 양으로 커큐미노이드를 제공할 수 있다.

아무튼, 개업의 또는 다른 전문가라면 개개 환자에게 가장 적합할 실제 투여량을 통상적으로 결정할 수 있을 것이다. 상기 언급한 투여량은 평균적인 경우의 예이며; 더 높거나 더 낮은 투여량 범위가 합당한 개별적인 경우들이 있을 수 있음은 물론이며, 이러한 경우들도 본 발명의 범위안에 포함된다.

본 발명의 조성물의 제조 방법

본 발명은 하기 단계를 포함하는, 앞에서 정의한 바와 같은 본 발명의 조성물의 제조 방법을 제공한다:

(i) 커큐미노이드의 수용액을 제조하는 단계;

(ii) (i)의 수용액을 아라비아 고무 수용액, 및 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 임의적으로 식물 및/또는 식물성 오일과 혼합하여 유화액을 제공하는 단계; 및 임의적으로

(iii) (ii)의 생성물을 건조시켜 약 100 nm 내지 약 10000 nm, 예를 들어, 약 100 nm 내지 약 700 nm, 또는 약 1000 nm 내지 약 6000 nm의 평균 직경을 갖는 입자들을 포함하는 조성물을 제공한다.

예를 들어, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 앞에서 정의한 바와 같은 본 발명의 조성물의 제조 방법을 제공한다:

(i) 커큐미노이드의 수용액을 제조하는 단계;

(ii) (i)의 수용액을 아라비아 고무 수용액, 및 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 임의적으로 식물 및/또는 식물성 오일과 혼합하여 유화액을 제공하는 단계;

(iii) (ii)의 생성물을 건조시켜 약 100 nm 내지 약 10000 nm, 예를 들어, 약 100 nm 내지 약 700 nm, 또는 약 1000 nm 내지 약 6000 nm의 평균 직경을 갖는 입자들을 포함하는 조성물을 제공하는 단계.

상기 방법들은 이하에서 본 발명의 방법으로 지칭한다.

본 발명의 방법에서, 아라비아 고무의 수용액은 식물 및/또는 식물성 오일, 및 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물과 혼합하기 전에 커큐미노이드의 수용액과 혼합할 수 있다. 즉, 본 발명의 방법은 다음을 포함할 수 있다:

(i) 커큐미노이드의 수용액을 제조하는 단계;

(ii) (i)의 수용액을 아라비아 고무 수용액과 혼합하는 단계;

(iii) (ii)의 생성물에 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물, 및 임의적으로 식물 및/또는 식물성 오일을 혼합하여 유화액을 제공하는 단계; 및 임의적으로

(iv) (iii)의 생성물을 건조시켜(예를 들어, 분무 건조에 의해) 약 100 nm 내지 약 700 nm의 평균 직경을 갖는 입자들을 포함하는 조성물을 제공한다.

건조(예를 들어, 분무 건조) 후에, 보다 균일한 크기를 제공하기 위해 입자들을 분쇄하고/하거나 밀링(예를 들어, 볼 밀링)할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 입자는 약 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm 또는 1500 nm 내지 약 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm 또는 2000 nm, 예를 들어, 약 1000 nm 내지 약 6000 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 상기 입자들은 또한 약 200 nm 내지 약 600 nm, 또는 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 400 nm의 평균 직경을 가질 수 있다.

예를 들어, 조성물은 약 550 nm 내지 약 700 nm의 평균 직경을 갖는 입자 및 약 100 nm 내지 약 250 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하여 약 400 nm의 평균 직경을 제공할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 조성물이 유화액(즉, 건조 단계 전)의 형태인 경우, 조성물은 약 550 nm 내지 약 700 nm의 평균 직경을 갖는 입자, 및 약 100 nm 내지 약 250 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함하여, 약 400 nm의 평균 직경을 제공할 수 있다.

조성물이 고체, 예를 들어, 분말(즉, 건조 단계 후)의 형태인 경우, 상기 조성물은 약 1000 nm 내지 약 6000 nm, 예를 들어 약 2000 nm 내지 약 4000 nm의 평균 직경을 갖는 입자를 포함할 수 있다.

조성물 중의 입자는 미셀의 형태일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 커큐미노이드 수용액에 존재하는 커큐미노이드는 본 발명의 조성물과 관련하여 이미 정의한 바와 같은 임의의 공급원으로부터 수득될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법에서, 커큐미노이드는 커큐미노이드 공급원의 약 5% 내지 약 100 중량%의 순도(총 커큐미노이드 기준)를 가질 수 있다. 즉, 강황 또는 커큐미노이드 추출물은 추출물 중 총 커큐미노이드의 %를 기준으로 약 30% 내지 약 100%의 커큐미노이드, 예를 들어, 약 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% 또는 90% 내지 약 95%, 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55%, 50% 또는 45%의 커큐미노이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 커큐미노이드는 약 2:1(커큐미노이드:물) 내지 약 4:1, 예를 들어, 약 3:1의 중량비로 물과 혼합하여 커큐미노이드의 수용액을 제공할 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법에서, 수용액 중 커큐미노이드의 중량 농도는 약 1% 내지 약 95%, 예를 들어, 약 5% 내지 약 80% 또는 약 7% 내지 약 40%일 수 있다.

본 발명의 방법에서, 아라비아 고무 수용액은 아라비아 고무를 물과 약 2:1 내지 약 4:1, 예를 들어, 약 3:1의 아라비아 고무:물의 비로 혼합하여 제조할 수 있다.

아라비아 고무 수용액은 약 30% 내지 약 70%, 예를 들어, 약 40% 내지 약 60%의 아라비아 고무의 중량 농도를 가질 수 있다.

전형적으로, 커큐미노이드 수용액 및 아라비아 고무 수용액은 교반을 이용하여 혼합한다.

본 발명의 방법에서, 식물 및/또는 식물성 오일은 임의의 식물 및/또는 식물성 공급원으로부터 수득할 수 있다. 예를 들어, 식물 및/또는 식물성 오일은 해바라기 오일일 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법에서, 식물 및/또는 식물성 오일은 약 1% 내지 약 10%의 식물 및/또는 식물성 오일, 예를 들어, 약 2.5% 내지 약 7.5% 또는 약 5%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물은 본 발명의 조성물과 관련하여 앞에서 정의한 바와 같을 수 있다.

본 발명의 방법에 사용되는 퀼라야로부터 수득되거나 수득가능한 추출물은 임의의 형태, 예를 들어, 액체 또는 고체일 수 있다. 예를 들어, 퀼라야 추출물은 고체, 예를 들면, 분말의 형태로 사용될 수 있다.

전형적으로, 본 발명의 방법에서, 퀼라야는 약 0.5% 내지 약 5%의 퀼라야, 예를 들어, 약 1% 내지 약 3%, 또는 약 2%의 양으로 존재할 수 있다.

본 발명의 방법에서, 식물 및/또는 식물성 오일 및 퀼라야 추출물은 교반을 이용하여 혼합할 수 있다.

상기 정의된 바와 같은 커큐미노이드 수용액, 아라비아 고무 수용액, 식물 및/또는 식물성 오일 및 퀼라야의 혼합은 유화액을 제공한다.

생성된 유화액은 약 200 nm, 300 nm, 400 nm, 500 nm, 600 nm, 700 nm, 800 nm, 900 nm, 1000 nm, 1100 nm, 1200 nm, 1300 nm, 1400 nm 또는 1500 nm 내지 약 9000 nm, 8000 nm, 7000 nm, 6000 nm, 5000 nm, 4000 nm, 3000 nm 또는 2000 nm, 예를 들어, 약 1000 nm 내지 약 6000 nm의 평균 직경을 갖는 미셀을 포함하는 조성물을 제공하기 위해 당해 분야에 공지된 바와 같은 기술을 이용하여 건조할 수 있다. 입자들은 또한 약 100 nm 내지 약 700 nm, 또는 약 200 nm 내지 약 600 nm, 예를 들어, 약 300 nm 내지 약 500 nm, 또는 약 400 nm의 평균 직경을 가질 수 있다. 전형적으로, 유화액은 분무 건조시킨다.

본 발명의 방법은 임의적으로, 실질적으로 무수 생성물, 즉, 존재하는 물의 적어도 90%, 예를 들어, 적어도 95% 또는 99%가 제거된 생성물을 제공하기 위해 필요한 대로 추가의 용매를 제거하는 단계를 포함할 수 있다.

도 1 - 강황으로부터 수득된 커큐미노이드의 화학 구조.
도 2 - 커큐민의 제 1 상 및 제 2 상 대사산물들.
도 3 - 커큐민의 세균 대사산물들.
도 4 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, 표준 커큐민 추출물로부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 5 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, TB+결장48h 샘플(100%)로 표준화된, 표준 커큐민 추출물로부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 6 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, 강황 피토좀 배합물로부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 7 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, TB+결장48h 샘플(100%)로 표준화된, 강황 피토좀 배합물로부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 8 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, 퀼라야 기재 배합물부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 9 - 4 시간의 배양후 상이한 위장관 구획들에서 수득한 샘플을 사용하여 처리된 Caco-2 세포로부터 수집한 정단부 상등액에서 측정한 LDH 활성으로, TB+결장48h 샘플(100%)로 표준화된, 퀼라야 기재 배합물로부터의 데이터. 막대들은 평균 ± SEM을 나타낸다. PP: 순수한 생성물; SI: 소장; ST: 위; TB: 운반 완충액. (*), (**) 및 (***)는 각각 TB+결장48h와 비교한 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.
도 10 - 동일한 시점에서 희생된 마우스들의 군들의 순응 및 습관화 기간 동안의 식품 섭취의 진전. 순응(J0-J7) 및 습관화(J8-J14) 기간동안 상이한 실험군들의 평균 일일 식품 섭취량(g).
도 11 - 동일한 시점에서 희생된 마우스들의 군들의 순응 및 습관화 기간 동안의 체중의 진전. 동일한 기간동안 상이한 실험군들의 평균 체중(g). 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.
도 12 - 강황 피토좀 배합물 대 300 mg/kg의 커큐미노이드를 함유하는 표준 강황 추출물의 단일 경구 용량 후 마우스 혈장에서 총 커큐미노이드 수준(커큐민, DMC, BDMC 및 이의 관련 대사산물들, 커큐민 글루쿠로니드 및 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트의 합)의 시간-추이. *, **, ***: 각각의 시점에서 표준 강황 추출물과 유의적으로 상이한(사후 t-검정) 강황 피토좀 배합물(각각 p<0.05, p<0.01, p<0.001).
도 13 - 본 발명의 방법/용도에서 사용된 조성물 대 300 mg/kg의 커큐미노이드를 함유하는 표준 강황 추출물의 단일 경구 용량 후 마우스 혈장에서 총 커큐미노이드 수준(커큐민, DMC, BDMC 및 이의 관련 대사산물들, 커큐민 글루쿠로니드 및 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트의 합)의 시간-추이. *, **, ***: 각각의 시점에서 표준 강황 추출물과 유의적으로 상이한(사후 t-검정) 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(각각 p<0.05, p<0.01, p<0.001).
도 14 - 상이한 배합물들의 섭취후(n = 배합물 당 72) 시간(h)의 함수로서 총 커큐미노이드 및 대사산물(커큐민, DMC, BDMC 및 이의 관련 대사산물들, 커큐민 글루쿠로니드 및 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트의 합) 농도(ppm). □, □□: 표준 강황 추출물과 유의적으로 상이한 강황 피토좀(각각 p< 0.05, p< 0.01); *, **, ***: 표준 강황 추출물과 유의적으로 상이한 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(각각 p<0.05, p<0.01, p<0.001).
도 15 - 상이한 배합물들의 상응하는 곡선하면적 AUC(0-8h).
도 16 - 상이한 배합물들의 상응하는 곡선하면적 AUC(0-∞).
도 17 - 상이한 배합물들의 Cmax(Tmax에서의 농도).
도 18 - 탈염수에 용해된 본 발명의 색의 조성물(0.4%)에 대한 pH의 효과.
도 19 - 본 발명의 조성물의 로딩된 DLS 프로파일.
도 20 - 상이한 pH에서 본 발명의 조성물 및 상기 조성물의 개별 성분의 Z-전위.
도 21 - x300의 본 발명의 조성물의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지.
도 22 - x1300의 본 발명의 조성물의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지.
도 23 - x9200의 본 발명의 조성물의 주사 전자 현미경(SEM) 이미지.
도 24 - ITT 집단에 대한 용량 표준화된 AUC_0-24h를 그래프로 나타낸 것.
도 25 - ITT 집단에 대한 용량 표준화된 AUC_0-8h를 그래프로 나타낸 것.
도 26 - ITT 집단에 대한 용량 표준화된 AUC_0-∞h를 그래프로 나타낸 것.
도 27 - ITT 집단에 대한 AUC_0-24h를 그래프로 나타낸 것.
도 28 - ITT 집단에 대한 AUC_0-8h를 그래프로 나타낸 것.
도 29 - ITT 집단에 대한 AUC_0-∞h를 그래프로 나타낸 것.
도 30 - ITT 집단에 대한 표준화된 Cmax를 그래프로 나타낸 것.
도 31 - ITT 집단에 대한 Cmax를 그래프로 나타낸 것.
도 32 - ITT 집단에 대한 0 내지 24 시간의 상대적 생체이용률을 그래프로 나타낸 것.
도 33 - ITT 집단에 대한 0 내지 8 시간의 상대적 생체이용률을 그래프로 나타낸 것.
도 34 - ITT 집단에 대한 0 내지 무한대의 상대적 생체이용률을 그래프로 나타낸 것.
도 35 - ITT 집단에 대한 반감기를 그래프로 나타낸 것.
도 36 - ITT 집단에 대한 최종 제거율을 그래프로 나타낸 것.
도 37 - ITT 집단에 대한 Tmax를 그래프로 나타낸 것.

실시예

본 발명을 하기의 비-제한 실시예들을 참고로 하여 더 기술할 것이다.

실시예 1 - 인간 위장관 및 장 흡수 세포의 생체내 모델에서 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키기 위한 본 발명의 조성물의 효과 검사

인간 위장관(GIT)은 인체로의 주요 진입문 중 하나이다. 식품, 음료 또는 약제의 경구 섭취시, 장은 섭취된 생성물과 숙주 사이의 첫번째 접촉 부위이다. 화합물들은, 이의 생물 활성을 발휘하기 위해, 산성 환경 및 소화 효소의 존재가 화학적 또는 효소적 변형을 초래할 수 있는 위를 먼저 통과해야 한다. 위를 떠난 후에는, 섭취된 화합물은 소장에 도달하고, 여기에서 숙주 대사 효소들의 대부분이 분비되어, 아마도 추가의 효소적 변형을 야기할 것이다. 원래의 형태이든 변형된 형태이든 화합물은 이어서 흡수되고 순환계에 들어갈 수 있거나, 장을 더 통과할 수 있다. 여기서, 식품 화합물은 말단 회장(소장의 끝 부분) 및 결장에 존재하는 복잡한 미생물 군집과 접촉하게 됨으로써 국소적인 생물 활성을 가질 수 있다(문헌[Alegria et al, 2015]).

인간 연구는 분명히 상이한 장내 과정을 연구하기 위한 가장 대표적인 방법들 중 하나이다. 그러나, 인간 연구는 매우 노동력 및 시간 소모적이고, 매우 비용이 많이 들고 기계론적 연구를 허용하지 않는다.

인간에서, 장은 투입량 및 배출량을 정량화하는 블랙 박스로 간주될 수 있지만, 이의 상이한 구획들에서의 근본적인 장내 과정들을 연구하는 것은 샘플링 문제로 인해 어렵다. 더욱이, 윤리적 제약이 인간 실험의 일반적인 적용을 제한한다.

그러므로, 잘-고안된 시험관내 시뮬레이션 기술은 인간 및 동물 연구에 매우 유용한 대체방안을 제공한다. 특정 과정을 대표하는 것으로, 상기 모델들은 윤리적 제약없이 이들 과정의 재현가능한 심층 연구를 가능하게 한다. 보다 용이한 구성 및 샘플링은 보다 저렴한 비용으로 중간 내지 높은 처리율의 연구를 가능하게 한다. 그럼에도 불구하고, 생리적 숙주 환경의 결여가 상기 모델들의 가장 중요한 한계이다. 그러나, 인간-유래 세포주를 사용하는 표준화된 시험관내 세포 배양물의 사용은 장 점막에 대한 화합물의 궁극적인 효과를 연구하기 위한 빠르고 재현가능한 방법을 제공한다. 또한, 광대한 시험관내 연구는 후속 동물 또는 인간 연구를 신중히 설계하게 함으로써, 시간 및 경비를 덜어준다.

신중하게 설계된 GIT-시뮬레이션 시험관내 접근방법은 상이한 농도에서 선택된 식품 성분들의 추정상의 대사 경로를 평가하는데 탁월한 고-처리율 선별 구성을 제공한다. 상기 성분들은 장에서 변형될 수 있거나 세균 군집을 변형시킬 수 있으므로, 장 점막에 온전하게 또는 변형된 부산물의 형태로 도달한다. 식이 화합물의 경구 생체이용률은 장 세포에 의해 흡수될 수 있고 사용 또는 저장에 이용가능한 투여 용량의 분획으로 정의된다.

식이 화합물의 생체이용률은 많은 요인들에 따라, 즉, 개체의 영양 및 생리적 상태, 화합물과 다른 영양소 및/또는 담즙염의 공액화, 소화 효소에 의한 화합물의 효소 분해, 및 장-관련 세균의 화합물을 대사시키는 능력에 따라 달라진다. 시험관내 위장 모델은 단기 실험에서 신속하고 비용-효과적인 방법으로 많은 분자들을 선별하는 가능성을 제공한다.

하기의 접근방법은 소화 및 결장 발효시 식이 화합물의 장내 경로를 신속하게 평가할 수 있게 한다. 이것은, 인간 장 상피를 모방한 시험관내 세포 모델과 관련하여, 온전한 화합물 및 변형된 화합물의 생체이용률을 조사할 수 있게 함으로써, 과학적 생산량 및 상업적 적합성 둘 다를 증가시킨다.

먼저, 상이한 용해도 성질을 갖는 커큐민-기재 배합물들의 소화 경로를 평가하기 위한 도구로서 단기 선별 분석을 수행하였다.

이어서, 상이한 배합물들의 생체이용가능한 분획을 이의 비변형/비소화 형태와 비교하여 연구하기 위해 상기 실험들의 결과를 시험관내에서 Caco-2 세포에 적용하였다.

또한, 상이한 소화 분획들의 추정 세포독성 효과를 비교하기 위해 세포 독성을 측정하였다.

단기 선별 분석은 대장에 대해 시뮬레이션된 조건하에서 선택된 리드 화합물들의 대표적인 용량(들)을 대표적인 세균 접종원과 함께 순차적으로 배양(위, 소장, 결장)시키는 것으로 이루어졌다.

인간 장 미생물 생태계의 시뮬레이터(SHIME)의 상행 결장 구획으로부터 수집된 장 현탁액을 사용하였다(문헌[Van de Wiele et al, 2015]).

상기 접종원은 구조 및 활성 둘다에서 근위부 결장에 존재하는 환경적 조건에 적합한 안정한 미생물 군집으로 이루어진다.

하기의 커큐민-기재 배합물/조성물을 평가하였다:

1. 표준 커큐민 추출물(울금) - 3가지 커큐미노이드(커큐민 - 75%, 디메톡시커큐민(DMC) - 15 내지 20%, 및 바이디메톡시커큐민(BDMC) - 5 내지 10%)의 혼합물 함유.

2. 대조군 배합물(배합물이 18 내지 22%의 커큐미노이드를 포함하는 메리바(Meriva)® 함유 강황 피토좀 쏜(Thorne) 제폼, 여기서는 존재하는 커큐민 및 대두 레시틴을 1:2 중량비로 배합하고(피토좀), 이어서 약 20%의 최종 제품내 커큐민의 전체 함량하에, 두 부분의 미세결정성 셀룰로스를 첨가하여 유동성을 개선시킨다).

3. 8.6%의 강황 추출물(6% 초과의 커큐미노이드 함유), 15.9%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물, 및 73.5%의 변성 전분을 포함하는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(본원에서 형식(Form) I로도 지칭됨).

단기 선별 분석은 위, 소장 및 결장 조건하에서의 3개 배합물들의 순차적 배양으로 이루어졌다.

배합물/조성물은 위 구획에서 0.5 g/L의 커큐미노이드 농도를 달성하는지를 검사하였다(mg로 나타낸 실제 양은 표 2에 나타낸 바와 같이 각각의 제품 내의 커큐미노이드의 %를 기준으로 계산하였다).

이어서, 상이한 배합물/조성물들을 펩신의 존재하에 37 ℃, pH 2.0에서 1 시간(h)동안 배양하였다.

이어서, 췌장 효소 및 담즙염을 첨가하여 소장을 시뮬레이션하고 샘플을 37 ℃에서 총 3 시간동안 배양하였다.

최종적으로, 3차 배양 단계에서, SHIME 및 풍부한 영양 배지로부터 수집된 대표적인 분변 접종원을 첨가함으로써 결장을 시뮬레이션하였다. 결장 배양은 37 ℃에서, 진탕하면서 혐기생활하에 총 48 시간에 걸쳐 수행하였다.

각각의 배합물/조성물은 생물학적 가변성을 조절하기 위해 3중으로 검사하였다.

상기 실험들은 위장관내에서의 식품 성분들의 특정 체류 시간을 지키도록 설계되었음을 유의하시오. 각 구획내의 부피를 고려하여, 검사한 커큐미노이드의 농도는 위에서 0.5 g/L, 소장에서 0.35 g/L, 및 결장에서 0.1 g/L이었다. 세포 운반 실험을 위해, 상기 샘플들을 10배 더 희석하였다.

[표 1]

검사한 커큐민-기재 배합물/조성물 및 상기 배합물/조성물 중 각각의 커큐미노이드의 %(커큐미노이드 %는 위 구획에 첨가될, mg로 나타낸 양을 산출하기 위해 고려하였다. 굵은 활자는 천연 형태를 나타낸 것이다)

각각의 배합물/조성물에 대한 샘플들을 하기의 시점에서 수집하였다:

- 위: 30 분 및 60 분

- 소장: 60, 120 및 180 분

- 결장: 2, 4, 6, 24 및 48 시간

이어서, 샘플들을 질량 분석법과 결합된 고압 액체 크로마토그래피(HPLC)를 이용하여 이의 커큐미노이드 함량(커큐민, DMC 및 BDMC)에 대해 분석하였다.

체류 시간 안정성 및 기기 보정 변화를 보장하기 위한 내부 표준물로서 54 ppb의 커큐민-d6(TLC 파마켐(TLC Pharmachem), 캐나다 온타리오 소재)을 첨가하여 각각의 3가지 커큐미노이드(피토랩(Phytolab), 독일 베스텐베르크스그레우트 소재)에 대해 2 내지 1000 ng/mL의 범위로 보정 곡선을 제작하였다. 아세토니트릴을 각 용액에 대한 희석제로 사용하였다. 유리 커큐미노이드 측정을 위해, 정확하게 450 μL의 내부 표준물 용액(60 ng/mL)을 캡티바(Captiva) 96 웰 플레이트(에이질런트(Agilent)사의 ND 지질) 내의 50 μL의 혈장 샘플위에 부하시켰다. 혼합 및 여과후, 용출액은 LC/MS 시스템내에 주입될 준비가 된다. 캡티바 ND 지질 플레이트는 혈장에서 인지질을 효과적으로 제거하기 위해 설계되었다. 총 공액화 커큐미노이드 대사산물(글루쿠로니드 및 설페이트 대사산물)의 측정을 위해, 100 μL의 혈장 샘플을 37 ℃에서 2 시간동안 100 μL의 효소 용액(글루쿠로니다제 1000 단위/mL, 시그마(Sigma) #G7017; 또는 설파타제, 시그마 #S9626, 100 단위/mL)과 혼합하였다. 상기 가수분해 단계 후에, 50 μL의 용액을 캡티바 96 웰 플레이트 상에서 450 μL의 아세토니트릴과 또한 혼합하였다. 샘플 절차는 유리 커큐미노이드, 주입전 혼합 및 여과에 대한 것과 동일하다.

이어서, LC/MS 조건은 다음과 같다. 사용된 자동샘플러(5 ℃) 및 LC 시스템은 에이질런트 인피니티 1290 통합 시스템이었다. 에이질런트 6420 3중 사중극자 질량 분석기를 전자분무 이온화와 함께 연구동안 사용하였다. 대사산물들은 HPLC 등급의 수중 0.1% 폼산(용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 폼산(용매 B)으로 이루어진 이동상하에 BEH 쉴드(Shield) RP 18 컬럼(100x2.1, 1.7 μm; 워터스(Waters))으로부터 0.5 mL/분의 유량으로 용출시켰다. 용출은 0 내지 6 분에 40 내지 80% B의 구배로 이루어졌다. 주입 부피는 표준물 및 샘플에 대해 2 μL이었다. 각각의 참조 화합물에 대해, 전구체-대-생성물 이온의 적절한 전이를 다중 반응 모니터링(MRM) 모드를 활용하여 검출하였다. 3개 분석물 각각을 MS1 완전 스캔 검사로 측정하고 생성물 이온은 MS/MS 실험으로 검사하였다. 각 분석물의 MRM 전이는 직접 주입 및 옵티마이저(Optimizer) B.08.00 워크스테이션 소프트웨어 용액(에이질런트 테크놀로지스(Agilent technologies), 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 이용하여 최적화하였다. 최적의 선택 조건에 대해서는 표 2를 참조하시오. 질량 분석기 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 음성 및 양성 모드 둘 다의 ESI 공급원; 건조 기체(N2) 유량, 10 L/분; 기체 온도, 350 ℃; 분무기, 40 psi; 및 모세관, 4.0 kV. MS 시스템은 실행전에 제조사의 지침에 따라 충분히 보정하였다. 데이터 분석은 에이질런트 매스헌터 정량/정성 분석(Agilent MassHunter Quantitative/Qualitative analysis) B.07.00(에이질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에서 수행하였다.

[표 2]

3가지 커큐미노이드 및 내부 표준물의 체류 시간(Tr), 다중 반응 모니터링(MRM) 전이, 및 최적화된 직렬 질량 분석(MS/MS) 검출 파라미터

표 3은 소화동안 위장관 구획중에서 수득된 커큐미노이드에서의 농도를 나타낸다.

놀랍게도, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에 대해 60 분후 위에서 및 120 분 및 180 분후 소장에서 소화후 농도는 표준 강황 분말 추출물에서 수득된 것보다 우수하여, 표준 추출물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경우 소화에 더 우수한 내성을 입증하였다. 또한, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에 대해 60 분후 위에서 및 120 분 및 180 분후 소장에서 소화후 농도는 비교물 강황 피토좀 배합물보다 높아서, 강황 피토좀 비교물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경우 소화에 더 우수한 내성을 입증하였다.

표 4는 초기 농도(실험 시작시에 위 구획내 0.5 g/L 또는 500 mg/L의 커큐미노이드)에 따라 소화후 장 구획에 남아있는 커큐미노이드의 %를 나타낸다. 결과는, 놀랍게도 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 비롯되는 커큐미노이드가 표준 강황 추출물로부터 비롯되는 커큐미노이드에 비해 위 및 소장에서의 소화에 대해 훨씬 더 우수한 내성을 가졌으며, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 표준 추출물 또는 강황 피토좀 배합물로부터의 커큐미노이드의 경구 섭취후 소화시 분해로부터 더 보호되고, 표준 추출물 또는 강황 피토좀 배합물의 경구 섭취후보다 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경구 섭취후에 소장 구획에서의 흡수를 위해 접근가능한 커큐미노이드가 훨씬 더 많음을 명백하게 보여준다.

[표 3]

3개 배합물들에 대한 소화 과정동안 위장관의 상이한 구획들 중 커큐미노이드의 농도

[표 4]

위장관(GIT) 소화에 대한 내성: 초기 농도에 따른 소화후 장 구획에 남아있는 커큐미노이드의 %

데이터는 초기 농도에 비해 소화후 상이한 구획 및 상이한 시간내 커큐미노이드 농도의 %의 평균 ± SD를 나타낸다.

하기의 샘플들을 또한 Caco-2 세포에 대한 운반 실험을 위해 수집하였다:

- 소장: 120 및 180 분

세포에 적용될 샘플들의 pH는 사용 전에 6.5로 조정하였다.

Caco-2 세포는 배양시 장세포-유사 세포로 자발적으로 분화될 수 있기 때문에 장 기능에 대한 세포 모델로서 널리 사용된다. 반투과성 지지체에서 배양시, 상기 세포들은 정단부 브러시-보더 효소 및 미세융모의 존재하에 장 상피와 유사한 기능성 편광 단층으로 발달한다. 그러므로, 상기 세포들은 배양시 성숙한 장세포의 형태 및 기능 특성들을 획득하기 때문에, 운반 실험을 위한 "최적 표준" 모델로 간주된다(문헌[Sambuy et al, 2002]).

Caco-2 세포(ATCC)를 1x10⁵ 세포/삽입물에 상응하게 0.9x10⁵ 세포/cm²의 밀도로 12-트랜스웰 삽입물(0.4 μm)에 접종하였다. 세포를 기능성 단층에 도달할 때까지(21 일) 분화시켰으며; 정단부(600 μL) 및 기저측부(1500 μL) 배지를 1주일에 3회 보충하였다. 실험 당일에, 단층의 상피간 전기 저항(TEER)을 측정함으로써 장벽 기능을 평가하였다. 세포를 HBSS로 세척하여 미량의 배지를 제거하고, 2 mL의 운반 완충액(TB)을 기저측부 쪽에 첨가하였다. 단기 실험으로부터 수집된 샘플들을 운반 완충액에 1:10(v/v) 비로 희석하고 정단부에서 세포(600 μL)에 제공하였다. 모든 생성물들을 또한 미가공한채 검사하고 분말을 0.025 mg/mL의 농도로 TB에 희석하였다(모든 배합물들에 대해 검사한 커큐미노이드의 최종 이론상 농도는 표 2a에서 볼 수 있다). 상기 희석물들은, 이의 불량한 용해도로 인해, DMSO에 용해된 표준 강황 추출물을 제외하고, HBSS 중에서 제조된 저장액(250 mg/mL)으로부터 제조하였다. 대조군 웰로서, 단기 실험시에 블랭크(커큐민 비함유)로 실행함으로써 수득된 TB에 1:10(v/v)으로 희석된 결장 샘플(48 시간 배양)을 사용하였다. 운반 완충액(TB)은 10 mM HEPES, 25 mM D-글루코스 및 1X 항생제-항진균제로 보충된 HBSS(pH 7.4)로 이루어졌다. 세포를 37 ℃에서 총 4 시간동안 배양하였다.

하기의 샘플들을 수집하였다:

1. 세포를 시뮬레이션하기 위해 사용된 희석된 샘플들(500 μL). 이들은 0 h 시점에 상응하는데, 상기 시점이 세포에 제공되기 전의 희석된 샘플을 함유하기 때문이며, 0.025 mg/mL의 농도에서 TB에 희석된 미가공 배합물도 또한 함유되었다.

2. 배양 2 시간 및 4 시간 후에 수집된 정단부 쪽에서 수득한 샘플(각각 250 μL).

3. 배양 2 시간(800 μL) 및 4 시간(1000 μL) 후에 수집된 기저측부 쪽에서 수득한 샘플.

4. 배양 4 시간 후의 세포로부터 수득한 샘플. 이들은 세포 내부에서 흡수된 분획에 상응한다. 간략하게, 빙냉 PBS 1X를 세포에 첨가하여 운반을 종료시켰다. 이어서, 세포를 PBS 1X로 1회 이상 세척하여 내재화되지 않은 미량의 생성물을 제거하고, 세포를 20%의 에탄올 및 0.1% 트윈-20을 함유하는 PBS 1X의 용액(600 μL)으로 투과시켰다; 상기 용액중에서 20 분후에, 세포를 1.5 mL 튜브에 수집하고 주사기 및 21G 바늘을 사용하여 파괴하고 균질화시켰다. 상기 튜브를 원심분리하고 상등액을 새로운 튜브로 옮겼다(450 μL).

모든 샘플들은 HPLC 분석까지 -20 ℃에서 저장하였다.

Caco-2 세포에 적용된 상이한 샘플들의 세포독성을 평가하기 위해, 정단부쪽(배양 4 시간후) 위에서 Caco-2 세포에 의해 방출된 락테이트 디하이드로게나제(LDH)를 LDH-활성 키트를 사용하여 평가하였다. LDH는 막 손상시 세포에 의해 상등액 내로 방출되므로, 세포 사멸의 마커이다.

1원 ANOVA에 이어 던네트(Dunnett's) 사후 다중 비교 검정을 이용하여 통계 분석을 수행하였다. (*), (**) 및 (***)는 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001에서의 유의성에 상응한다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군 웰(TB + 결장 48 h)은 약 1.0의 LDH 활성을 나타낸다. 볼 수 있듯이, 모든 생성물에서, 소화되지 않은 형태뿐 아니라 60 분후에 수집된 위 샘플 둘 다 대조군에 비해 최고 LDH 활성을 나타내었다.

대조적으로, 소장 및 결장 샘플은 둘 다 대조군에 필적하거나 그보다 낮은 수준을 나타낸다. 이러한 결과들은, 위에서 수득된 샘플을 제외하고 모든 샘플이 Caco-2 세포에 독성을 나타내지 않았음을 입증하였으며, Caco-2 세포에서 샘플들로부터의 커큐미노이드의 운반 및 생체이용률을 검사하는 분석들의 결과는 살아있는 세포에서 수득되었기 때문에 유효한 것으로 이용 및 판단될 수 있다.

소화되지 않은 생성물과 함께 또는 소장에서 수득된 샘플들(120 분 또는 180 분)과 함께 배양한 Caco-2 세포의 정단부, 기저측부 및 세포내 구획들로부터의 샘플들을 그들의 커큐미노이드 함량(커큐민, DMC 및 BDMC) 및 이의 관련 대사산물 함량(커큐민 설페이트, 커큐민 글루쿠로니드, DMC 설페이트 및 DMC 글루쿠로니드, BDMC 설페이트 및 BDMC 글루쿠로니드)에 대해 더 분석하였는데, 이는 Caco-2 세포가 UDP-글루쿠로노실트랜스퍼라제 및 설포트랜스퍼라제를 발현하는 것으로 알려져 있기 때문이다(문헌[Siissalo S, Zhang H, Stilgenbauer E, Kaukonen AM, Hirvonen J, Finel M. The expression of most UDP-glucuronosyltransferases (UGTs) is increased significantly during Caco-2 cell differentiation, whereas UGT1A6 is highly expressed also in undifferentiated cells. Drug Metab Dispos. 2008 Nov;36(11):2331-6) therefore being able to metabolize curcumin, DMC and BDMC in their glucuronide or sulfate metabolites (Dempe JS, Scheerle RK, Pfeiffer E, Metzler M. Metabolism and permeability of curcumin in cultured Caco-2 cells. Mol Nutr Food Res. 2013 Sep;57(9):1543-9]).

정단부에서 기저측부 전이에 대한 겉보기 투과도 계수(P _app ) 값은 하기 식을 사용하여 아터슨(Artursson) 및 칼슨(Karlsson)에 따라 산출하였다:

P _app [cm/s] =

여기서, Vapi는 정단부 구획의 부피이고(0.6 mL), A는 단층의 표면적이고(1.131 cm²), t는 시간이고(초), Cbaso는 기저측부 구획 중 총 커큐미노이드 및 이의 대사산물의 농도(ppm)(모 화합물 및 대사산물의 합)이고, Capi는 정단부 구획 중 총 커큐미노이드의 초기 농도(ppm)이다.

표 5는 표준 추출물 또는 2개의 상이한 배합물(강황 피토좀 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물)에 Caco-2 세포의 정단부 노출후 상이한 시간 간격에 대한 P _app 값을 나타낸다.

[표 5]

표준 추출물 또는 2개의 상이한 배합물에 Caco-2 세포의 정단부 노출후 상이한 시간 간격에 대해 산출된 총 커큐미노이드 및 이의 대사산물들의 P _app 값(10^-7cm/s로 나타냄)

데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 표준 추출물에 대한 P _app 의 증가 배수는 괄호( ) 안에 나타내었다. 강황 피토좀 배합물에 대한 P _app 의 증가 배수는 대괄호[ ] 안에 나타내었다.

표 5에 나타낸 바와 같이, 정단부에서 기저측부 전이에 대한 겉보기 투과도 계수(P _app ) 값은 놀랍게도, 2 시간 및 4 시간에서 표준 강황 추출물에 대한 P _app 값에 각각 19.3 및 20.3의 증가 배수하에, 표준 강황 추출물에 대한 것보다 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 더 높았다.

정단부에서 기저측부 전이에 대한 겉보기 투과도 계수(P _app ) 값은, 2 시간 및 4 시간에서 표준 강황 추출물에 대한 P _app 값에 각각 4.7 및 4.8의 증가 배수하에, 표준 강황 추출물에 대한 것보다 증대된 생체이용률 배합물에 양성 대조군으로 사용된 강황 피토좀 배합물에서 또한 더 높았다. 그러나, 상기 결과는 Caco-2 흡수성 세포에 의한 커큐미노이드의 흡수가 비교물 강황 피토좀 배합물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 더 컸음(2 시간 및 4 시간에서 각각 4.1배 및 4.2배 더 우수한 P _app 값)을 보여준다.

표 6은 Capi로서 120 분 또는 180 분에서 소장 구획 중 커큐미노이드의 정량화된 농도를 이용한, 표준 추출물 또는 2개의 상이한 배합물(강황 피토좀 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물)의 소장 소화 샘플들(120 또는 180 분)에 Caco-2 세포의 정단부 노출후 P _app 값을 나타낸다. 상기 값은 세포에 의한 소화된 배합물로부터의 커큐미노이드의 흡수 능력을 반영한다. 표준 추출물 또는 배합물이 위 및 소장 구획에서 소화되었으므로 소장에서 수득된 샘플(120 분 또는 180 분)을 사용하여 Caco-2 세포에 의한 커큐미노이드의 흡수를 측정할 때, Caco-2 흡수성 세포에 의한 커큐미노이드의 흡수가 강황 피토좀 배합물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 더 컸음(120 분 또는 180 분에서 소장 샘플에 대해 각각 1.8배 및 16.4배 더 높은 P _app 값)을 입증하였다.

표 7은 세포의 흡수 능력뿐 아니라 소화 과정에 대한 내성도 고려하기 위해 Capi로서 120 분 또는 180 분에서 소장 구획 중 커큐미노이드의 이론상 농도를 이용한, 표준 추출물 또는 2개의 상이한 배합물(강황 피토좀 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물)의 소장 소화 샘플들(120 또는 180 분)에 Caco-2 세포의 정단부 노출후 P _app 값을 나타낸다. 상기 데이터로부터, 120 분 및 180 분동안 위장 소화 및 Caco-2 세포에 의한 흡수 후에 기저측부 구획(혈액 순환을 모방)에 도달할 수 있는 커큐미노이드의 수준이 표준 강황 추출물에 비해서(120 분 또는 180 분에서 소장 샘플에 대해 각각 2.0배 및 1.8배 더 높은 P _app 값) 및 피토좀 배합물에 비해서(120 분 또는 180 분에서 소장 샘플에 대해 각각 3.4배 및 7.1배 더 높은 P _app 값) 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 훨씬 더 높았음을 입증하였다.

[표 6]

표준 추출물 또는 2개의 상이한 배합물의 소장 소화 샘플들(120 또는 180 분)에 Caco-2 세포의 정단부 노출후 총 커큐미노이드 및 이의 대사산물들의 P _app 값

데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 강황 피토좀 배합물에 대한 P _app 의 증가 배수는 괄호( ) 안에 나타내었다. P _app 값은 Capi로서 120 분 또는 180 분에 소장 구획중 커큐미노이드의 정량화된 농도를 이용하여 산출한다.

[표 7]

데이터는 평균 ± SD를 나타낸다. 표준 추출물에 대한 P _app 의 증가 배수는 괄호( ) 안에 나타내었다. 강황 피토좀 배합물에 대한 P _app 의 증가 배수는 대괄호[ ] 안에 나타내었다. P _app 값은 Capi로서 120 분 또는 180 분에 소장 구획중 커큐미노이드의 이론상 농도를 이용하여 산출한다.

실시예 2 - 마우스에서 생체내 비교 약동학 연구를 통한 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키는 본 발명의 조성물의 효과 검사

본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 위장 소화에 대한 더 우수한 내성 및 장 세포를 통한 더 우수한 흡수를 나타냈음을 보여준 시험관내 모델에서 수득된 결과에 비추어, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(즉, 8.6%의 강황 추출물(6% 초과의 커큐미노이드를 포함), 15.9%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물 및 73.5%의 변성 전분을 포함하는 조성물)은 마우스에서 표준 강황 추출물에 비해 커큐미노이드의 생체이용률을 개선할 것으로 상정된다.

그러므로, 비교 약동학 연구를 마우스에서 수행하였다.

잔비어 랩스(Janvier Labs)(프랑스 생-베르테방 소재)로부터 수득한, 수령시 5주령의 성체 수컷 C57Bl/6J Rj 마우스를 집단으로 표준 플라스틱 케이지에 수용하였다(n=4/케이지). 모든 동물들은 물 및 표준 펠릿 사료(펠릿 AO4; SAFE, 프랑스 빌레므와송-쉬르-오르쥬 소재)가 자유롭게 허용되었으며, 12 시간 명(07:00 AM-07:00 PM)/12 시간 암 주기로 온도(24.0 내지 26.0 ℃) 및 습도(40.0 내지 50.0%) 조절된 방에 유지시켰다.

모든 동물들은 수령후 1 주일동안 새로운 환경에 순응시켰다. 적절한 순응 및 표준 성장 곡선을 둘 다 보장하기 위해, 동물들의 전체 사료 섭취량 및 체중을 일주일에 2회 평가하였다. 상기 순응 기간후에, 마우스들을 처리전 6 일동안 매일 비히클(실온에서 증류수에 용해시킨 카복시메틸셀룰로스 나트륨염 1%(w/v), CMC; Ref# C4888, 배치 번호: SLBB5612V, 시그마 앨드리치(SIGMA ALDRICH), 프랑스 생캉탱 팔라비에 소재)의 경구 투여에 익숙하게 하였다. 상기 습관화 기간동안, 동물들의 전체 사료 섭취량 및 체중을 매일 측정하였다. 상기 측정으로 인해 실험에 의한 주입 절차 및 조작 둘 다에 대한 동물들의 최적 습관화를 확실히 할 수 있었다.

순응 및 습관화 기간동안, 마우스들은 미리계량된 양의 신선한 사료 펠릿(펠릿 AO4; SAFE, 프랑스 빌레므와송-쉬르-오르쥬 소재)에 자유롭게 접근할 수 있었다. 측정 다음날 남은 사료를 계량하였다. 정밀 저울(THB-600G, PMC 밀로(PMC Millot); 정밀도 ± 0.01 g)을 사용하여, 사료의 미리계량된 양에 남은 사료를 감하여서 케이지 당 전체 사료 섭취량(08:40-09:20 AM)을 측정하였다. 상기 값을 2회의 측정을 가르는 일 수 및 각 케이지의 동물의 수로 나누어서 평균 일일 사료 섭취량을 수득하였다. 각각의 체중 측정시, 마우스들은 아침에(08:40-09:20 AM) 계량하였다.

처리 전날(습관화 기간 마지막날)에, 120 마리의 마우스를 저녁을 굶겼다(17:40-18:20 PM). 다음날, 마우스(배합물 당 n=40)에게 아침에(08:00-09:50 AM) 표준 강황 분말 추출물, 비교물로서 강황 피토좀 배합물, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(즉, 8.6%의 강황 추출물(6% 초과의 커큐미노이드를 포함), 15.9%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물 및 73.5%의 변성 전분을 포함하는 조성물)을 경구 위관영양법으로(30 mL/kg) 단기간 처리를 수행하였다.

적절한 부피의 비히클(증류수에 용해시킨 CMC 1%)을 교반하면서 적합한 용기에 첨가하고 pH를 5.5로 조정하였다. 적절한 양의 미리계량된 배합물을 일정하게 교반하면서 비히클에 서서히 첨가하였다. 일단 균질해지면, 수득된 현탁액의 pH를 측정하고 필요한 경우 5.5로 조정하였다. 커큐미노이드의 임의의 분해를 방지하기 위해, 최종 현탁액을 제조후 1 시간내에 전신 투여하였다. 동물들에게 총 300 mg/kg의 커큐미노이드를 공급하도록 용량을 계산하였다(표 8 참조). 마우스에서의 상기 투여량은 인간에서 21.37 mg/kg에 해당하며, 60 kg의 인간이라고 하면 1282 mg에 해당한다 - (미국 보건복지부, 식품의약국, 의약품 평가 및 연구 센터(CDER). 건강한 성인 지원자에서 치료 목적의 초기 임상 시험에서 산업 평가 및 최대 안전 개시 용량을 위한 지침(Guidance for Industry Estimating the Maximum Safe Starting Dose in Initial Clinical Trials for Therapeutics in Adult Healthy Volunteers. 2005)으로부터의 식; 인간 등가 용량(mg/kg) = 동물 용량(mg/kg) x (동물 체중(kg)/인간 체중(kg))^0.33. 용량은 금식 직전에 측정된 체중에 맞춰 조정하였다. 배합물을 경구 위관영양법으로 투여후 장 흡수에 섭식 행위의 영향을 배제시키기 위해, 동물들은 처리후 처음 12 시간동안 물 및 사료를 허용하지 않았다.

[표 8]

표준 강황 추출물 및 2개 배합물들의 커큐미노이드 함량, 및 1차 생체내 연구에서 300 mg/kg 체중의 커큐미노이드로 마우스에게 제품 투여에 사용된 현탁액의 각각의 농도

투약 후 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 8 시간, 12 시간 또는 24 시간 후에 마취된 마우스(n=5/시점/배합물)에서 심장 천자에 의해 혈액을 채취하였다. 마취는 케타민/자일라진(각각 100 mg/kg 및 15 mg/kg)의 혼합물의 복강내 주사로 수행하였다. 심장 천자를 위해, 26G 주사기를, 좌심실을 직접 관통하기 위해, 동물의 몸체에 의해 형성된 세로축과 45°의 각도로 8번째와 10번째 흉골 늑골 사이에 삽입하였다. 이어서, 혈액을 서서히 뽑아 0.6 내지 1 mL의 최종 부피를 수득하였다. 생체분석 방법의 이익을 위해, 그 후에 혈액을 에펜도르프 튜브로 옮기고, 헤파린 설페이트(200 U.I/혈액 mL)와 혼합하고 약하게 교반하였다. 모든 샘플들을 채혈후 30 분이내에 3000 g 및 4 ℃에서 15 분동안 원심분리하여 혈장을 단리하였다. 혈장(상등액)을 새 0.5 mL 에펜도르프 튜브에 분취하였다. 혈장 분취액을 원심분리 후 1 시간 이내에 -80 ℃에서 냉동시켰다.

모 커큐미노이드(커큐민, DMC 또는 BDMC) 및 이의 관련 대사산물들(커큐민 글루쿠로니드 및 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트)의 혈장 투여량들을 LC-MS-MS 방법으로 수행하였다. 체류 시간 안정성 및 기기 보정 변화를 확실히 하기 위해 내부 표준물로서 54 ppb의 커큐민-d6(TLC 파마켐, 캐나다 온타리오 소재)을 첨가하여 5개 커큐미노이드(피토랩, 독일 베스텐베르크스그레우트 소재) 각각에 대해 2 내지 1000 ng/mL의 범위로 보정 곡선을 제작하였다. 아세토니트릴을 각 용액에 대한 희석제로 사용하였다. 유리 커큐미노이드 측정을 위해, 정확하게 450 μL의 내부 표준물 용액(60 ng/mL)을 캡티바 96 웰 플레이트(에이질런트로부터의 ND 지질)내에 50 μL의 혈장 샘플 위로 부하하였다. 혼합 및 여과 후에, 용출액을 LC/MS 시스템 내에 주입하도록 준비시켰다. 캡티바 ND 지질 플레이트는 혈장에서 인지질을 효과적으로 제거하도록 설계되었다. 총 공액화 커큐미노이드 대사산물(글루쿠로니드 및 설페이트 대사산물)의 측정을 위해, 100 μL의 혈장 샘플을 37 ℃에서 100 μL의 효소 용액(글루쿠로니다제 1000 단위/mL, 시그마 #G7017; 또는 설파타제, 시그마 #S9626, 100 단위/mL)과 2 시간동안 혼합하였다. 상기 가수분해 단계 후에, 50 μL의 용액을 또한 캡티바 96 웰 플레이트 상에서 450 μL의 아세토니트릴과 혼합하였다. 상기 샘플 절차는 유리 커큐미노이드, 주입전 혼합 및 여과에 대한 것과 동일하다.

다음으로, LC/MS 조건은 다음과 같았다. 사용된 자동샘플러(5 ℃) 및 LC 시스템은 에이질런트 인피니티 1290 통합 시스템이었다. 에이질런트 6420 3중 사중극자 질량 분석기를 전자분무 이온화와 함께 연구동안 사용하였다. 대사산물을 HPLC 등급의 수중 0.1% 폼산(용매 A) 및 아세토니트릴 중 0.1% 폼산(용매 B)으로 이루어진 이동상하에 BEH 쉴드 RP 18 컬럼(100x2.1, 1.7 μm; 워터스)으로부터 0.5 mL/분의 유량으로 용출시켰다. 용출은 0 내지 6 분에 40 내지 80% B의 구배로 이루어졌다. 주입 부피는 표준물 및 샘플에 대해 2 μL이었다. 각각의 참조 화합물에 대해, 전구체-대-생성물 이온의 적절한 전이를 다중 반응 모니터링(MRM) 모드를 활용하여 검출하였다. 5개 분석물 각각을 MS1 완전 스캔 검사로 측정하고 생성물 이온은 MS/MS 실험으로 검사하였다. 각 분석물의 MRM 전이는 직접 주입 및 옵티마이저 B.08.00 워크스테이션 소프트웨어 용액(에이질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)을 이용하여 최적화하였다. 최적의 선택 조건에 대해서는 표 9를 참조하시오. 질량 분석기 파라미터는 다음과 같이 설정하였다: 음성 및 양성 모드 둘 다의 ESI 공급원; 건조 기체(N2) 유량, 10 L/분; 기체 온도, 350 ℃; 분무기, 40 psi; 및 모세관, 4.0 kV. MS 시스템은 실행전에 제조사의 지침에 따라 충분히 보정하였다. 데이터 분석은 에이질런트 매스헌터 정량/정성 분석 B.07.00(에이질런트 테크놀로지스, 미국 캘리포니아주 산타클라라 소재)에서 수행하였다.

검사한 3개의 배합물/조성물에 대해, 각각의 커큐미노이드 화합물의 혈장 농도의 동역학을, 각각의 채혈 시점에서 평균 ± SEM 혈장 농도를 산출함으로써 처리후 0.5 내지 12 시간에 측정하였다. 약동학 파라미터 T1/2(반감기), Cmax, Tmax, AUC(0-12h) 및 AUC(0-∞)를 PKSolver를 사용하여 비-구획 분석에 의해 0 내지 12 시간 동역학으로부터 측정하였다. PKSolver는 약동학에서 문제를 해결하기 위한, VBA(Visual Basic for Applications)에 기록된 마이크로소프트 엑셀에 대한 메뉴-구동형 애드인 프로그램이다(문헌[Zhang et al., 2010]).

전체 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다. 통계 분석은 Statview 5.0.1(스태트뷰(Statview) 소프트웨어, 미국 노스캐롤라이나주 케리 소재) 및 엑셀 2013 프로그램으로 수행하였다. 데이터는 각 시점에서 스튜던트 t-검정으로 분석하였다. 위험률 α는 0.05에 고정시켰다.

[표 9]

커큐미노이드, 테트라하이드로커큐민 및 헥사하이드로커큐민 및 내부 표준물의 체류 시간(Tr), 다장 반응 모니터링(MRM) 전이, 및 최적화 직렬 질량 분석(MS/MS) 검출 파라미터

순응(J1 내지 J7) 및 습관화(J8 내지 J14)의 연속되는 두 기간동안, 처리 전 적절한 순응 및 표준 성장 곡선을 둘 다 보장하기 위해 마우스의 24 시간 사료 섭취량 및 체중을 규칙적으로 측정하였다. 본 연구를 위해, 마우스들은 케이지 당 4 마리로 수용하였고, 이들 각각은 3개 배합물 중 하나로 처리 후 동일한 시점에서 채혈에 사용되었다. 결과로서, 사료 섭취량 및 체중 데이터를 동일한 시점에 희생된 15마리 마우스들의 군(8개 군; 5마리 마우스/시점/배합물) 당 먼저 분석하였다. 도 10 및 11은 각각 치료제 투여전 순응 및 습관화 기간동안 마우스들의 사료 섭취량 및 체중을 나타내고; 상이한 군들은 처리전 전형적인 체중 곡선 및 사료 섭취량을 나타내었다. J15에서 모든 군들에서 관찰된 체중의 강한 감소(도 11)는 처리전 밤에 수행된 밤새 금식으로부터 비롯되었음을 유의해야 한다. 이러한 결과들은 본 실험에 사용된 모든 마우스들이 동일한 양상을 나타내었고 예상한 바와 같이 비교될 수 있음을 확인시켰다.

도 12는 강황 피토좀 배합물 및 표준 추출물 배합물의 경구 투여(300 mg/kg bw의 커큐미노이드) 후 마우스에서 각각의 시점에서 수득된 총 커큐미노이드(커큐민, DMC, BDMC 및 이의 관련 대사산물들 커큐민 글루쿠로니드 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트의 합)의 농도에 따른 약동학 프로필을 나타낸다. 강황 피토좀 배합물이 30 분후에 총 커큐미노이드의 혈장 농도를 41.5 ppm(μg/mL)에 이르게 할 수 있었고 24 시간을 제외하고 각 시점에서 표준에 대해 수득된 것보다 훨씬 우수하였지만, 표준 강황 추출물에 대한 총 커큐미노이드의 혈장 농도만이 1 시간에 최대 12.9 ppm에 이르렀고, 다른 모든 시점에서는 10 ppm 미만이었다. 강황 피토좀은 표준 강황 추출물에 비해 총 커큐미노이드 Cmax에서 3.2배 증가, AUC에서 3.9배 증가를 나타내었다. 이러한 결과들은 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키고 양성 대조군으로서 강황 피티좀 배합물의 용도를 입증하였으며, 표준 강황 추출물에 비해 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키는 상이한 배합물들의 능력을 검사하기 위한 본 발명자들의 생체내 모델의 적절성을 입증하였다.

각 시점에 대해 평균 값 ± SEM을 포함하는 표를 표 10에 나타내었다. 상기 값들 옆에 위치한 괄호안의 숫자들은 샘플들의 총 수에 양성 값을 나타낸 샘플의 수를 나타낸다. 통계 비교의 결과도 또한 같은 표에 나타내었다. 표 11은 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석으로부터 수득된 PK 파라미터를 포함한다. 군들 사이의 변화 %도 또한 나타내었다(%Var°). 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.

표 10 및 11은 도 12에 나타낸 각각의 시점에 대해 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석으로부터 수득된 평균 값 ± SEM 및 PK 파라미터를 나타낸다.

[표 10]

[표 11]

도 13은 커큐민, 퀼라야, 오일 및 변성 전분을 포함하는 혼합물(실시예 2 형식 1) 및 표준 추출물 배합물의 경구 투여(300 mg/kg bw의 커큐미노이드) 후 마우스에서 각각의 시점에 수득된 총 커큐미노이드(커큐민, DMC, BDMC 및 이의 관련 대사산물 커큐민 글루쿠로니드 설페이트, DMC 글루쿠로니드 및 설페이트, BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트, THC, THC 글루쿠로니드 및 설페이트, HHC, HHC 글루쿠로니드 및 설페이트의 합)의 농도에 따른 약동학 프로필을 나타낸다. 결과는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 표준 강황 추출물에 비해 0.5 시간부터 24 시간까지 총 커큐미노이드 농도를 유의적으로 증가시킬 수 있음을 보여주었다. 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 총 커큐미노이드 Cmax에서 1.8배 증가 및 AUC에서 2.2배 증가를 나타내었다.

각 시점에 대해 평균 값 ± SEM을 포함하는 표를 표 12에 나타내었다. 상기 값들 옆에 위치한 괄호안의 숫자들은 샘플들의 총 수에 양성 값을 나타낸 샘플의 수를 나타낸다. 통계 비교의 결과도 또한 같은 표에 나타내었다. PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석으로부터 수득된 PK 파라미터를 포함한 표를 표 13에 나타내었다. 군들 사이의 변화 %도 또한 나타내었다(%Var°). 데이터는 평균 ± SEM으로 나타내었다.

표 12 및 13은 도 13에 나타낸 각각의 시점에 대해 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석으로부터 수득된 평균 값 ± SEM 및 PK 파라미터를 나타낸다.

[표 12]

[표 13]

특별히 모 화합물(천연 형태의, 즉, 대사되지 않은 커큐민, DMC 및 BDMC)을 살펴볼 때, 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 각 시점에 대한 모 커큐미노이드의 혈장 농도를 제공하는 표 14에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 투여후 처음 4 시간동안 검출가능한 양의 모 커큐미노이드를 정량화할 수 있고, 따라서 AUC(0-12h) 및 AUC(0-∞)를 산출할 수 있는 유일한 것이었다(표 15). 표준 강황 추출물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경우 모 커큐미노이드에 대한 Cmax에 10.9배 증가가 달성되었다.

특별히 모 커큐민(천연 형태의, 즉, 대사되지 않은 커큐민)을 살펴볼 때, 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 각 시점에 대한 모 커큐민의 혈장 농도를 제공하는 표 16에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 투여후 처음 4 시간동안 검출가능한 양의 모 커큐민을 정량화할 수 있고, 따라서 AUC(0-12h) 및 AUC(0-∞)를 산출할 수 있는 유일한 것이었다(표 16). 표준 강황 추출물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경우 모 커큐민에 대한 Cmax에 521.8배 증가가 달성되었다. 더욱이, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 강황 피토좀 배합물보다 모 커큐민의 더 높은 혈장 수준을 유도하였다(Cmax의 1.8배 증가).

상기 1차 생체내 실험으로부터, 8.6%의 강황 추출물, 15.9%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물 및 73.5%의 변성 전분으로부터 수득되고 형식 1에 따라 제조된, 6% 초과의 커큐미노이드를 함유하는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 표준 강황 추출물에 비해 총 커큐미노이드 및 이의 대사산물의 생체이용률뿐 아니라 모 화합물의 생체이용률을 증대시킬 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

또한, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 강황 피토좀 배합물보다 천연 커큐민의 생체이용률을 더 우수하게 개선할 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

그러므로, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은, 강황 피토좀 배합물과는 대조적으로 배합물에 대두-유래 레시틴을 사용하지 않고 모 커큐민 생체이용률을 증대시키는 매력적인 방법을 나타낸다. 또한, 커큐민은 DMC 및 BDMC 및 이의 관련된 환원된 글루쿠로니드 또는 설페이트 대사산물에 비해 가장 강력하게 활성인 강황 중 하나로 간주되기 때문에(문헌[Ireson C, Orr S, Jones DJ, Verschoyle R, Lim CK, Luo JL, Howells L, Plummer S, Jukes R, Williams M, Steward WP, Gescher A. Characterization of metabolites of the chemopreventive agent curcumin in human and rat hepatocytes and in the rat in vivo, and evaluation of their ability to inhibit phorbol ester-induced prostaglandin E2 production. Cancer Res. 2001 Feb 1;61(3):1058-64]; 문헌[Anand P, Thomas SG, Kunnumakkara AB, Sundaram C, Harikumar KB, Sung B, Tharakan ST, Misra K, Priyadarsini IK, Rajasekharan KN, Aggarwal BB. Biological activities of curcumin and its analogues (Congeners) made by man and Mother Nature. Biochem Pharmacol. 2008 Dec 1;76(11):1590-611]; 문헌[Pal A, Sung B, Bhanu Prasad BA, Schuber PT Jr, Prasad S, Aggarwal BB, Bornmann WG. Curcumin glucuronides: assessing the proliferative activity against human cell lines. Bioorg Med Chem. 2014 Jan 1;22(1):435-9]), 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 관절 건강, 염증, 관졀염, 죽상동맥경화증, 간 지방증, 간 섬유화증, 당뇨, 인지, 경도 인지 장애, 과민성 대장 증후군과 같은 다양한 건강 상태들에 대한 커큐민의 생물학적 효능을 개선하기 위한 우수한 해결책을 나타낸다.

[표 14]

1차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 각 시점에 대한 모 커큐미노이드(커큐민, DMC 및 BDMC의 합)의 농도

상기 값들 옆에 위치한 괄호안의 숫자들은 샘플들의 총 수에 양성 값을 나타낸 샘플의 수를 나타낸다.

[표 15]

1차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 모 커큐미노이드에 대한 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석에서 수득된 PK 파라미터

[표 16]

1차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 각 시점에 대한 모 커큐민의 농도

[표 17]

1차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 커큐민에 대한 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석에서 수득된 PK 파라미터

총 커큐미노이드 및 모 커큐미노이드 및 커큐민의 보다 우수한 생체이용률을 보여주는, 마우스에서의 1차 생체내 연구에서 수득된 결과를 고려하여, 14.4%의 강황 추출물, 26.8%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물, 및 56.8%의 변성 전분으로 형식 2에 따라 제조된 더 높은 커큐미노이드 함량(12%의 커큐미노이드)을 갖는 최적화된 배합물을, 마우스에서의 2차 비교 약동학 연구에서 표준 강황 추출물과 비교하여 커큐미노이드의 생체이용률을 개선하는 이의 능력에 대해 시험하기로 결정하였다.

군 및 시간 당 더 높은 동물 수(n=12/시점/배합물)를 사용하는 것을 제외하고 본 실시예에서 전술한 바와 동일한 방법(마우스 수용, 순응 기간, 습관화 기간, LC/MS 방법을 이용한 커큐미노이드 및 그 대사산물 정량화)을 이용하였으며, 표준 강황 추출물(각각 79.5, 15.0 및 3.0 g/100 g의 커큐민, DMC 및 BDMC, 및 총 97.5 g의 커큐미노이드/100 g 함유), 강황 피토좀 배합물(각각 18.6, 2.6 및 0.2 g/100 g의 커큐민, DMC 및 BDMC, 및 총 21.5 g의 커큐미노이드/100 g 함유) 또는 형식 2에 따라 제조된 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물(각각 9.8, 1.6 및 0.2 g/100 g의 커큐민, DMC 및 BDMC, 및 총 11.6 g의 커큐미노이드/100 g 함유)로부터 수득되는 커큐미노이드의 경구 섭취(300 mg/kg bw) 후 제일 초기 단계동안의 동역학 프로필을 명시하기 위해 투여후 0.25 시간, 0.5 시간, 0.75 시간, 1 시간, 2 시간, 또는 8 시간 후에 혈액을 채취하였다.

도 14는 다양한 배합물들의 섭취후 시간의 함수로서 총 커큐미노이드 및 대사산물 농도를 나타낸다(배합물 당 n=72). 결과는 표준 강황 추출물에 비해 강황 피토좀 및 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에 있어서 커큐미노이드 및 대사산물 농도의 유의적인 증가를 분명하게 보여주었다. 총 커큐미노이드 농도는 강황 피토좀 배합물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 섭취후 0.5 시간 및 0.75 시간에서 더 높아서, 놀랍게도 총 커큐미노이드 및 대사산물 생체이용률의 개선 면에서 강황 피토좀 배합물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 보다 우수한 성능을 보여주었다.

상기 결과는 표준 추출물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 각각 280% 더 높고, 300% 더 높고, 337% 더 높으며, 강황 피토좀 배합물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물에서 각각 6.5% 더 높고, 30% 더 높고 63% 더 높은 상응하는 곡선하 면적 AUC(0-8h), AUC(0-∞) 및 Cmax(각각 도 15, 16 및 17)를 산출하면서 확인되었다(표 18). 또한, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터의 커큐미노이드 및 대사산물들이 각각 표준 추출물에 비해 Tmax에 1.5배 감소(0.5 시간 대 0.75 시간) 및 강황 피토좀 배합물에 비해 Tmax에 2배 감소(0.5 시간 대 1 시간) 하에 보다 신속하게 흡수되었음을 밝혀내었다(표 18). 결과는 또한 놀랍게도 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터의 커큐미노이드 및 대사산물들이 강황 피토좀 배합물에 비해 더 긴 반감기(3.8 시간 대 2.8 시간)하에 덜 신속하게 배출되었음을 보여주었다.

특별히 모 화합물(천연 형태의, 즉, 대사되지 않은 커큐민, DMC 및 BDMC)을 살펴볼 때, 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 모 커큐미노이드의 PK 파라미터를 제공하는 표 19에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은 놀랍게도 모 커큐민에 대한 AUC(0-8h)를 산출할 수 있는 유일한 것이었다. 표준 강황 추출물에 비해 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물의 경우 모 커큐민에 대한 Cmax에 3.2배 증가가 달성되었다. 강황 피토좀 배합물의 섭취후 혈장 샘플에서는 모 커큐민을 찾을 수 없었기 때문에 Cmax는 산출할 수 없었다.

상기 2차 생체내 실험으로부터, 14.4%의 강황 추출물, 26.8%의 해바라기 오일, 2%의 퀼라야 추출물 및 56.8%의 변성 전분으로 형식 2에 따라 제조된, 더 높은 커큐미노이드 함량(12%의 커큐미노이드)을 갖는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물이 예기치 않게 표준 강황 추출물에 비해서 및 강황 피토좀 배합물에 비해 총 커큐미노이드 및 이의 대사산물뿐 아니라 모 커큐민의 생체이용률을 증대시킬 수 있는 것으로 결론지을 수 있다.

그러므로, 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물은, 강황 피토좀 배합물과는 대조적으로 배합물에 대두-유래 레시틴을 사용하지 않고 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키는 매력적인 방법을 나타낸다.

[표 18]

2차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 총 커큐미노이드 및 대사산물에 대한 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석에서 수득된 PK 파라미터

표준 추출물에 대한 AUC 또는 Cmax의 증가 배수는 괄호( ) 안에 나타내었다. 강황 피토좀 배합물에 대한 AUC 또는 Cmax의 증가 배수는 대괄호[ ] 안에 나타내었다.

[표 19]

2차 생체내 연구에서 표준 강황 추출물, 강황 피토좀, 또는 본 발명의 방법/용도에 사용된 조성물로부터 300 mg/kg의 커큐미노이드의 섭취후 모 커큐미노이드에 대한 PKSolver 소프트웨어를 사용한 비-구획 분석에서 수득된 PK 파라미터

실시예 3 - 커큐미노이드의 생체이용률을 증대시키는 본 발명의 조성물의 능력을 평가하기 위한 건강한 지원자에서의 비교 약동학 연구

본 연구는 2가지 목적을 가졌다:

1. 1차 목적

1500 mg 표준 강황 분말 추출물 95%의 커큐미노이드에 비해 본 발명의 조성물(터미퓨어 골드(Turmipure GOLD)™ 30%의 커큐미노이드 배합물)의 300 mg의 단일 용량의 섭취 후 24 시간에 대한 총 커큐미노이드(커큐민, 디메톡시커큐민(DMC), 비스디메톡시커큐민(DBMC) 및 이의 대사산물들)의 혈장 농도 프로필을 평가하기 위한 것.

2. 2차 목적

1425 mg(표준 강황 분말 추출물 95%의 커큐미노이드, 커큐민 C3 복합체 캘리포니아 골드 뉴트리션(California Gold Nutrition)), 200 mg(커큐마 플래티넘 만나바이탈(Curcuma Platinum MannaVital)), 90 mg(본 발명의 조성물(터미퓨어 골드^TM 30%의 커큐미노이드)) 또는 60 mg(커큐민 셀인노브(Curcumin Cell'Innov))의 활성 물질을 함유하는 5개의 연구 제품들의 단일 용량의 섭취후, 하기의 파라미터들의 혈장 농도 프로필을 평가하기 위한 것:

* 총 커큐미노이드;

* 모 화합물(커큐민, DMC, BDMC) 및 이의 대사산물들: 커큐민, 글루쿠로니드 및 설페이트; DMC 글루쿠로니드 및 설페이트; BDMC 글루쿠로니드 및 설페이트; 천연 테트라하이드로커큐민(THC), 글루쿠로니드 및 설페이트; 천연 헥사하이드로커큐민(HHC), 글루쿠로니드 및 설페이트.

연구는 단일중심 무작위 교차 및 개방 임상 시험이었다.

연구는 선별/선정 방문(V0)으로 시작하여, 연구 제품들을 대상들이 섭취하는(각각의 무작위배정된 대상에 대해 각 기간에서 1개의 상이한 제품) 5회의 실험 기간(V1 내지 V5)이 이어졌다. V1 방문은 V0 후 최대 3 주에 이루어졌으며, 또한 무작위 방문을 이룰 수 있다.

각각의 실험 기간(V1 내지 V5)은 최소 1 주일 및 최대 2 주일 만큼 떨어졌다. 각각의 실험 기간동안, 대상들은 8 시간동안 동역학 채혈을 하였다. 마지막 동역학 혈액 샘플은 각각의 실험 기간 다음날, 동역학 개시 24 시간후에 취하였다. 바이오뱅킹에 상기 방문 동안 소변 수거도 또한 수행하였다.

대상들의 첫 배뇨는 각각의 실험 방문일 아침에 수거하였으며(상기 첫 배뇨 전체), 현장에서 동역학 채혈시 0 내지 8 시간에 및 귀가시 8 내지 24 시간에 추가로 수거하였다. 마지막 소변 수거는 실험 방문 다음날 다시 이루어졌다(동역학 채혈의 마지막 혈액 샘플을 위해 다시 왔을 때, T24H).

각각의 실험 기간 전의 저녁 및 각 동역학의 모든 기간동안(아침, 점심 및 오후 간식) 지원자들에게 표준 식사가 제공되었다.

연구의 끝은 마지막 실험 기간 V5 다음날(V5-24H)이었다.

* 30 명의 대상들이 하기의 주요 선정 및 배제 기준에 따라서 본 연구에 동원되었다 :

- I1: 18 내지 45세의 연령(선정 한계);

- I2: 19 내지 25 kg/m²의 BMI(선정 한계);

- I3: 마지막 3개월 중 ± 3 kg 이내의 안정한 체중;

- I4: 정상 범위 이내의 일상적인 혈액 화학검사 값 보유;

- I5: 여성의 경우: 연구 시작전 적어도 3 주기 이래로 동일한 믿을만한 피임중이고 전체 연구 기간동안 상기 피임을 유지하는데 동의하는(살정자 겔 함유 콘돔 및 에스트로겐/프로게스틴 복합 피임이 허용됨) 비-폐경기, 또는 호르몬 대체 요법을 받거나 받지 않는(3개월 미만에 시작된 에스트로겐 대체 요법은 배제됨) 폐경기;

- I6: 비-흡연 또는 ≤5개비/일의 담배 소비 및 모든 실험 기간(V1 내지 V5) 동안 흡연하지 않을 것에 동의함;

- I7: 모든 연구 기간동안 커큐민 또는 다른 커큐미노이드(DMC, BDMC)를 함유하는 식품, 음료 및 조미료를 섭취하지 않을 것에 동의함;

- I8: 조사자의 의견하에 양호한 일반 및 정신 건강: 병력 또는 신체 검사의 임상적으로 유의적이고 타당한 이상이 없을 것;

- E1: 당뇨와 같은 대사 또는 내분비 질환, 통제되지 않거나 통제되는 갑상선 문제 또는 다른 대사 질환을 앓고 있음;

- E2: 조사자에 의해 연구 수행과 상반되는 것으로 밝혀진 중증의 만성 질환(예를 들어, 암, HIV, 신부전, 진행중인 간 또는 담관 질환, 만성 염증성 소화 질환, 관절염, 또는 다른 만성 호흡기 문제 등) 또는 위장 질환을 앓고 있음(예를 들어, 셀리악병);

- E3: 간 질환을 앓고 있음;

- E4: 식이 보충으로 대상에게 사용금지되어 있는 현재 질환 상태: 만성 설사, 변비 또는 복통, 염증성 장 질환(크론병 또는 궤양성 대장염), 간경변, 만성 완화제 사용...;

- E5: 의사에 의해 진단되고 장기간 약물로 치료되는 과민성 대장 증후군(IBS)을 앓고 있음;

- E6: 조사자에 따라 연구 결과에 영향을 미칠 수 있거나 대상을 추가 위험에 노출시킬 수 있는 현재 병력을 갖고 있음;

- E7: 확인된 식중독과 같은 최근의 위장염 또는 식품 매개 질병(1 개월 미만);

- E8: V0 방문 3 개월 전에 헌혈을 하였거나, 앞으로 3 개월 이내에 헌혈을 하려고 하는 사람;

- E9: 조사자의 의견에 따라 혈액 샘플의 동역학을 수행할 수 없게 하는 낮은 정맥 능력을 가짐;

- E10: 임의의 연구 제품의 성분 및/또는 표준 식사에 음식 알러지 또는 불내증 또는 민감성을 갖는 것으로 알려져 있거나 의심됨(글루텐 불내증, 셀리악병 등);

- E11: 임산부 또는 수유중의 여성 또는 앞으로 3 개월 이내에 임신하고자 하는 여성;

- E12: 알콜 또는 약물 의존성을 나타냄;

- E13: 경구 및 국소 피임약을 제외하고 임의의 만성 약물 치료중(예를 들어, 항응고제, 항고혈압 치료제, 갑상선 치료제, 천식 치료제, 불안완화제, 항우울제, 지질-저하 치료제, 코르티코스테로이드, 치질약, 정맥강화제, 혈액 순환에 영향을 미치는 약물...);

- E14: 현재 식물 유래의 임의의 보충제 섭취중(및 지난 3 개월동안);

- E15: 1 주일에 적어도 3회 및 검사전 2 주동안 한정된 커큐민-함유 식품 보충제(커큐민, 강황 및 카레) 또는 식품(커큐민, 강황, E100 및 카레) 섭취;

- E27: 조사자에 따라 임상적으로 유의적인 이상을 갖는 조절 기록(혈당증, GGT, ASAT, ALAT, 우레아, 크레아티닌 및 전체혈구수).

캡슐 형태의 식이 보충제인 5개 제품들을 본 연구의 일부로서 검사하였다:

1. 캡슐로 섭취되는 표준 강황 분말 추출물 95%의 커큐미노이드 1500 mg(4개 캡슐; 캡슐 당 375 mg 분말)(STE),

2. 상업적 제품 커큐민 C3 복합체 캘리포니아 골드 뉴트리션으로 섭취되는 C3 복합체® 95%의 커큐미노이드(1500 mg) + 바이오페린(BioPerine)® 95% 피페린(15 mg)(3개 캡슐; 캡슐 당 500 mg C3 복합체 분말 + 5 mg 바이오페린 분말)(TEP),

3. 상업적 제품 커큐마 플래티넘 만나바이탈 20%의 커큐미노이드로 섭취되는 메리바®(1000 mg)(2개 캡슐; 캡슐 당 500 mg 분말)(PHYT),

4. 상업적 제품 커큐민 셀인노브 6%의 커큐미노이드로 섭취되는 노바솔(Novasol)®(1000 mg)(2개 캡슐; 캡슐 당 500 mg 액체)(NOV),

5. 캡슐로 섭취되는, 강황 추출물, 해바라기 오일, 퀼라야 추출물 및 아라비아 고무를 포함하는 본원에 정의된 조성물(1개 캡슐; 캡슐 당 300 mg 분말)(터미퓨어 골드).

대상들의 건강한 상태를 보장하고 적격성 기준을 점검하기 위해, 조절 기록 분석 및 비-폐경기 여성에 대한 임신 검사를 위해 V0 방문시 혈액 샘플을 취하였다(βhCG 투여량).

샘플은 신체 검사 및 적격성 기준 확인 후에 취하였다. 최대 10 mL를 수거하였다.

각각의 방문에서 신체 검사시 전자 혈압 모니터(케어스케이프 디나맵(Carescape Dinamap)®V100)를 사용하여 혈압 측정을 수행하였다. 심박수(HR, bpm), 수축기 혈압(SBP, mmHg) 및 이완기 혈압(DBP, mmHg)도 또한 평가하였다.

모든 대상들은 12 시간 금식 상태로 참석하였다.

V1 내지 V5 방문을 위한 준비시, 임상 검사 후에, 정맥 카테터를 대상의 팔꿈치 주름위에 두었다. 상기 카테터는 어떤 추가의 찌름없이 동역학을 위한 채혈을 가능하게 하였다.

동역학 샘플은, 모든 대상들이 임상 연구 센터에 머물면서 대략 8 시간동안 지속하였다. 하기의 스케줄에 따라서 열(10)개의 혈액 샘플을 취하였다:

- T-10(기준치),

- T15>T30>T45>T60>T90>T120>T240>T360>T480,

T15에 대해 ±30초의 여지가 인정되었고, T30 및 T45에 대해 ±1분, T60 및 T90에 대해 ±2분, T120 내지 T480에 대해서는 ±5분의 여지가 인정되었다.

T0 시점은 연구 제품 섭취에 해당한다.

지원자는 연구 제품 섭취 4 시간후에(T240 시점 직후) 그/그녀의 일반 점심 및 연구 제품 섭취 약 8 시간후에 일반 점심 식사를 섭취하게 하였다. 점심은 최대 30 분 이내에 섭취하였다. 물은 제품 투여 1 시간 전 및 1 시간 후에는 허용되지 않았다. 카테터는 마지막 시점, T480 후에 제거하였다.

이어서, 지원자들에게 동역학의 마지막 채혈을 위한 방문 다음날, T24H에 12 시간 금식 상태로 임상 조사 장소에 다시 오도록 요청하였다. 전형적인 정맥 혈액 샘플 물질을 사용하였다(단일 찌름). 혈장에서 분석된 상기 샘플들을 가지고 생물학적 파라미터들을 평가하였고; 따라서, EDTA 튜브만을 사용하였다(채혈 당 5 mL).

분석 집단

* ITT 집단: 제품의 적어도 1개 용량을 섭취한, 연구에서 무작위배정된 모든 대상(n=30)

* PP 집단: 큰 프로토콜 편차를 제공하지 않고 연구를 종료한 ITT 집단에 포함된 대상들(n=30). 하기의 대상들은 PP 집단에서 배제되었다:

- 대상 SN01-040 - 모든 파라미터들에 대해 V5

* 안전성 집단: 제품의 적어도 1개 용량을 섭취한, 연구에서 무작위배정된 모든 대상(n=30)

[표 20]

평균 및 표준 편차를 나타내는 기준치에서의 연구 집단에 대한 설명

소프트웨어 환경

* 통계 분석은 SAS® 소프트웨어 버전 9.3(SAS 인스티튜트 인코포레이티드, 미국 노스캐롤라이나주 케리 소재)을 사용하여 바이오포르티스(Biofortis)에 의해 수행하였다.

* 유의적 수준

* 모든 통계 검점(양측)에 대해, 통계적으로 유의적인 효과의 주장을 정당화하기 위해 0.05 수준의 유의성을 이용하였다.

* 동역학을 위한 누락 데이터 처리 방법

* 2개보다 많은 값 또는 2개의 연속되는 값이 동역학에서 누락된 경우, AUC 보정을 수행할 수 없으며, 동역학은 통계 분석에서 누락으로 간주하였다(누락 데이터 대체는 수행하지 않았다);

* 데이터가 T-10 시점에서 누락된 경우, AUC 보정은 수행할 수 없으며, 동역학은 통계 분석에서 누락으로 간주하였다(누락 데이터 대체는 수행하지 않았다);

* 값(기준치 값 및 마지막 시점의 값 제외)이 동역학에서 누락된 경우, 상기 값은 제놀리니(문헌[Genolini, 2013])에 의해 개발된 카피민(CopyMean) 방법을 이용하여 수득된 값으로 대체하였다;

* 동역학의 마지막 시점(T1440 = T24h)의 값이 누락된 경우, 누락 데이터 대체는 수행하지 않았다.

* 누락 데이터 처리후 미완성 동역학의 경우에, AUC는 산출할 수 없다.

→ 상기 방법은 ITT 및 PP 집단에 적용하였다.

유도된 변수들

* 총 커큐미노이드 = 커큐민 + DMC + BDMC + THC + HHC + 커큐민 글루쿠로니드 + DMC 글루쿠로니드 + BDMC 글루쿠로니드 + THC 글루쿠로니드 + HHC 글루쿠로니드 + 커큐민 설페이트 + DMC 설페이트 + BDMC 설페이트 + THC 설페이트 + HHC 설페이트

상기 15개 요소가 모두 누락되는 경우, 총 커큐미노이드는 산출할 수 없다. 상기 15개 요소들 중 적어도 하나가 정량화되는 경우, 총 커큐미노이드를 산출하였다.

* 총 모 화합물 = 커큐민 + DMC + BDMC의 합

* 총 모 화합물 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물 = 커큐민 + 커큐민 글루쿠로니드 + 커큐민 설페이트 + DMC + DMC 글루쿠로니드 + DMC 설페이트 + BDMC + BDMC 글루쿠로니드 + BDMC 설페이트

* 커큐민 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물 = 커큐민 + 커큐민 글루쿠로니드 + 커큐민 설페이트

* DMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물 = DMC + DMC 글루쿠로니드 + DMC 설페이트

* BDMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물 = BDMC + BDMC 글루쿠로니드 + BDMC 설페이트

* 커큐민 및 모든 이의 관련 대사산물 = 커큐민 + 커큐민 글루쿠로니드 + 커큐민 설페이트 + THC + THC 글루쿠로니드 + THC 설페이트 + HHC + HHC 글루쿠로니드 + HHC 설페이트

* 0 내지 24 시간의 상대적 생체이용률 = 상이한 검사한 배합물에 대한 용량-표준화된 AUC0-24h 대 참조 제품(강황 추출물 95%의 커큐미노이드)에 대해 수득된 용량-표준화된 AUC0-24h의 비

* 0 내지 8 시간의 상대적 생체이용률 = 상이한 검사한 배합물에 대한 용량-표준화된 AUC0-8h 대 참조 제품(강황 추출물 95%의 커큐미노이드)에 대해 수득된 용량-표준화된 AUC0-8h의 비

* 0 내지 무한대의 상대적 생체이용률 = 상이한 검사한 배합물에 대한 용량-표준화된 AUC0-∞ 대 참조 제품(강황 추출물 95%의 커큐미노이드)에 대해 수득된 용량-표준화된 AUC0-∞의 비

검출한계(LOD) 미만의 값들의 데이터 처리

* 검출한계(LOD) 미만의 몇몇 값이 데이터베이스에서 <<0.62>>로 나타낸 커큐민(천연, 글루쿠로니드 및 설페이트)에 대해 확인되었다. → LOD 이하의 값들의 수 및 %를 각각의 파라미터 및 방문에 대해 나타내었다.

그래프적 표현의 제시

* 관찰된 평균에 대한 정량적 변수: AUC 파라미터들에 대한 상자-수염 도표(하기 도면에 예시됨)

통계 검정 가정의 점검

* 정규성 및 등분산성의 가정을 통계 모델에 의해 생성된 잔사를 그래프로 표현하여 조사하였다. 정규성 및/또는 등분산성으로부터 강한 편향의 경우, 연구 평가변수의 로그 변환(log10)을 고려하였다.

결과 작성에 대한 주석:

* STE = 표준 강황 분말 추출물 95%의 커큐미노이드 1500 mg

* TEP = 커큐민 C3 복합체 캘리포니아 골드 뉴트리션(1500 mg C3 복합체®)

* NOV = 커큐민 셀인노브(1000 mg 노바솔®)

* PHYT = 커큐민 플래티넘 만나바이탈(1000 mg 메리바®)

* 터미퓨어 골드™ = 터미퓨어 골드 30%의 커큐미노이드 300 mg

통계적 방법

* 1차 평가변수: 0 내지 24 시간의 용량-표준화된 AUC를 반복 측정에 대한 하기의 혼합 모델을 이용하여 분석하였다(SAS® PROC MIXED, 통계 모델 n°1):

Y = 제품 + 방문 + 기준치 + 대상_무작위

이때:

* Y: 분석물 혈장 농도의 0 내지 24 시간의 용량-표준화된 AUC;

* 제품: 터미퓨어 골드™, STE, TEP, NOV, PHYT;

* 방문: 방문 V1 내지 V5;

* 기준치: T-10 시점에서 파라미터의 값(AUC 산출을 위한 T0);

* 대상_무작위: 무작위 요인.

* 유의적 방문 효과(p<0.05): 제품 효과를 평가하기 위해 1차 기간(방문)에 실현된 2차 분석.

* 관심 제품들 간의 비교 → STE와 비교된 터미퓨어 골드™

추가 분석: 성 영향에 대한 조사

* 본 연구에서 반복 측정을 위해 하기의 혼합 모델을 이용하여 성 영향을 조사하였다((SAS® PROC MIXED, 통계 모델 n°2):

Y = 제품 + 방문 + 성 + 제품*성 + 기준치 + 대상_무작위

이때:

* Y: 평가변수;

* 제품: 터미퓨어 골드™, STE, TEP, NOV, PHYT;

* 방문: 방문 V1 내지 V5;

* 성: 여성 또는 남성;

* 제품*성: 제품과 성 간의 상호작용;

* 기준치: T-10 시점에서 파라미터의 값(AUC 산출을 위한 T0);

* 대상_무작위: 무작위 요인.

* 관심 제품들 간의 비교;

* STE와 비교한 터미퓨어 골드™

* STE와 비교한 TEP;

* STE와 비교한 NOV;

* STE와 비교한 PHYT;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 TEP;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 NOV;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 PHYT;

* 유의적 제품*성 상호작용 효과(p<0.05): 남성 및 여성에서 별개로 조사된 치료 효과(기술 통계 및 그래프 표현 제시에 의해)

* 유의적 제품*성 상호작용 효과(p>0.05): 전체적으로(여성 및 남성 함께) 조사된 치료 효과

2차 평가변수(상대적 생체이용률 제외)에 대한 통계적 방법

* 반복 측정을 위해 하기의 혼합 모델을 이용하여 2차 평가변수를 분석하였다((SAS® PROC MIXED, 통계 모델 n°1):

Y = 제품 + 방문 + 기준치 + 대상_무작위

* 관심 제품들 간의 비교;

* STE와 비교한 터미퓨어 골드™;

* STE와 비교한 TEP;

* STE와 비교한 NOV;

* STE와 비교한 PHYT;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 TEP;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 NOV;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 PHYT.

* 상대적 생체이용률에 대한 통계적 방법

Y = 제품 + 방문 + 대상_무작위

* 관심 제품들 간의 비교;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 TEP;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 NOV;

* 터미퓨어 골드™와 비교한 PHYT.

1차 평가변수들의 결과 요약

표 21 및 22는 ITT 및 PP 집단의 초기 분석을 나타낸다.

[표 21]

[표 22]

표 23 및 24는 ITT 및 PP 집단의 추가 분석(성 영향의 조사)을 나타낸다.

[표 23]

[표 24]

● p-값<0.05(통계상 유의적); ○ p-값>0.05(통계상 비-유의적)

[표 25]

총 커큐미노이드의 용량-표준화된 AUC_0-24h

상기 분석으로부터, ITT 집단에 대해 다음으로 결론지었다:

군들간 분석(모든 성별 합쳐)

* 유의적 방문이 확인되지 않음(p=0.2245) → 결과적으로, 모든 방문시에 분석을 수행하였다.

* 유의적 제품 효과(p<0.0001):

- 1차 평가변수: 터미퓨어 골드™와 STE 사이에 통계적으로 유의적인 차이가 있다(보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=1.32 [1.18;1.46]).

- 다른 비교:

- TEP 대 STE (보정 p=0.6948)

- NOV 대 STE (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=1.62 [1.48;1.76]) → NOV > STE

- PHYT 대 STE (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=0.48 [0.34;0.62]) → PHYT > STE

- TEP 대 터미퓨어 골드™ (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=-1.39 [-1.53;-1.25]) → TEP < 터미퓨어 골드™

- NOV 대 터미퓨어 골드™ (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=0.29 [0.15;0.43]) → NOV > 터미퓨어 골드™

- PHYT 대 터미퓨어 골드™ (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=-0.84 [-0.99;-0.70]) → PHYT < 터미퓨어 골드™

추가 분석: 성 영향의 조사

* 유의적인 방문 (p=0.2456) 및 제품*성 상호작용(p=0.3804) 효과 없음: 모든 성을 합쳐서 및 모든 방문시에 분석을 수행하였다.

* 유의적 제품 효과 (p<0.0001):

- TEP 대 STE (보정 p=0.7091)

- NOV 대 STE (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=1.61 [1.47;1.75]) → NOV > STE

- 터미퓨어 골드™ 대 STE (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=1.32 [1.18;1.46]) → 터미퓨어 골드™ > STE

- TEP 대 터미퓨어 골드™ (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=-1.39 [-1.52;-1.25]) → TEP < 터미퓨어 골드™

- PHYT 대 터미퓨어 골드™ (보정 p<0.0001; 차이[보정 CI95%]=-0.84 [-0.98;-0.70]) → PHYT < 터미퓨어 골드™

PP 집단에 대해:

* 군들간 분석(모든 성별 합쳐)

- 결과는 ITT 집단에서 관찰된 결과와 유사하다.

- 추가 분석: 성 영향의 조사

- 결과는 ITT 집단에서 관찰된 결과와 유사하다.

2차 평가변수들의 결과 요약

2차 평가변수의 결과는 ITT(표 26 내지 42) 및 PP(표 43 내지 59) 집단 둘 다에 대해 각각 하기의 표에 나타내었다. 결과를 도 24 내지 37에 그래프로 표현한다.

각 결과의 통계적 유의성을 나타내는, 하기의 핵심을 각각의 표에 적용한다.

□ p-값 < 0.05 (통계적으로 유의적); ■ p-값 ≥ 0.10 (통계적으로 비-유의적); * V1 방문시에만 수행된 분석(n=30)

[표 26]

ITT 집단에서 제품들간 총 커큐미노이드(ng/mL)의 분석

[표 27]

ITT 집단에서 제품들간 커큐민(ng/mL)의 분석

[표 28]

ITT 집단에서 제품들간 커큐민 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 29]

ITT 집단에서 제품들간 커큐민 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 30]

ITT 집단에서 제품들간 커큐민 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 31]

ITT 집단에서 제품들간 DMC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 32]

ITT 집단에서 제품들간 DMC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 33]

ITT 집단에서 제품들간 DMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 34]

ITT 집단에서 제품들간 BDMC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 35]

ITT 집단에서 제품들간 BDMC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 36]

ITT 집단에서 제품들간 BDMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 37]

ITT 집단에서 제품들간 THC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 38]

ITT 집단에서 제품들간 THC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 39]

ITT 집단에서 제품들간 HHC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 40]

ITT 집단에서 제품들간 HHC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 41]

ITT 집단에서 제품들간 커큐민 및 모든 이의 관련 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 42]

ITT 집단에서 제품들간 총 모 화합물 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 43]

PP 집단에서 제품들간 총 커큐미노이드(ng/mL)의 분석

[표 44]

PP 집단에서 제품들간 커큐민(ng/mL)의 분석

[표 45]

PP 집단에서 제품들간 커큐민 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 46]

PP 집단에서 제품들간 커큐민 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 47]

PP 집단에서 제품들간 커큐민 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 48]

PP 집단에서 제품들간 DMC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 49]

PP 집단에서 제품들간 DMC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 50]

PP 집단에서 제품들간 DMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 51]

PP 집단에서 제품들간 BDMC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 52]

PP 집단에서 제품들간 BDMC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 53]

PP 집단에서 제품들간 BDMC 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 54]

PP 집단에서 제품들간 THC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 55]

PP 집단에서 제품들간 THC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 56]

PP 집단에서 제품들간 HHC 글루쿠로니드(ng/mL)의 분석

[표 57]

PP 집단에서 제품들간 HHC 설페이트(ng/mL)의 분석

[표 58]

PP 집단에서 제품들간 커큐민 및 모든 이의 관련 대사산물들(ng/mL)의 분석

[표 59]

PP 집단에서 제품들간 총 모 화합물 및 이의 관련 설페이트 및 글루쿠로니드 대사산물들(ng/mL)의 분석

심각한 이상 반응 :

* 대상 SN01-009: V0와 V1 방문 사이에 목 통증/도로 사고(연구 제품 적용하지 않음)(운동력/류마티스력이 있는 신체 체계, 병력과 관련되지 않은 경우, 중등 강도, 연구 제품에 조치하지 않음, 조사 및 연구 제품에 관련되지 않은 경우, 교정 치료와 연관되지 않은 경우, 후유증없이 회복).

* 중증 강도의 치료 긴급 AE:

* 대상 SN01-007: V2와 V3 방문 사이에 요통(터미퓨어 골드™ 제품 적용)(운동력/류마티스력이 있는 신체 체계, 병력과 관련되지 않은 경우, 중증 강도, 연구 제품에 조치하지 않음, 조사 및 연구 제품에 관련되지 않은 경우, 교정 치료와 연관되지 않은 경우, 후유증없이 회복).

* 연구 제품들에 관련된 AE:

* 대상 SN01-008: V3 방문 당일 두통(터미퓨어 골드™ 제품 적용)(신경학/정신의학적 신체 체계, 병력과 관련되지 않은 경우, 중등 강도, 연구 제품에 조치하지 않음, 조사 및 연구 제품에 관련된 가능한 경우, 교정 치료와 연관된 경우(파라세타몰), 후유증없이 회복).

* 대상 SN01-030: V1 방문 당일 두통(터미퓨어 골드™ 제품 적용)(신경학/정신의학적 신체 체계, 병력과 관련되지 않은 경우, 경도 강도, 연구 제품에 조치하지 않음, 조사 및 연구 제품에 관련된 가능한 경우, 교정 치료와 연관된 경우(파라세타몰), 후유증없이 회복).

* 대상 SN01-032: V2 방문 당일 두통(NOV 제품 적용)(신경학/정신의학적 신체 체계, 병력과 관련되지 않은 경우, 경도 강도, 연구 제품에 조치하지 않음, 조사 및 연구 제품에 관련된 가능한 경우, 교정 치료와 연관되지 않은 경우, 후유증없이 회복).

PP 집단에서 관찰된 결과는 ITT 집단에서의 결과와 유사하다.

총 커큐미노이드에 대한 평균±SD(ITT 집단)를 하기에 나타내었다.

[표 60]

총 커큐미노이드에 대한 평균±SD(ITT 집단)

결론

결과는 TEP 및 STE에서 확인된 화합물들의 생체이용률 사이에 약간의 차이가 있음(단지 5개 차이)을 보여준다.

본 발명의 범위에 속하는 조성물(터미퓨어 골드™)은 STE, TEP 및 PHYT보다 더 우수한 화합물들의 생체이용률을 제공하는 것으로 확인되었으며, 더 낮은 용량(1000 mg에 비해 300 mg)으로 투여되고 커큐미노이드 화합물의 천연 공급원을 사용하였음에도 불구하고 NOV와 유사한 생체이용률을 제공할 수 있었다.

보다 특히, 노바솔은 1000 mg으로 사용된 반면, 본 발명의 조성물(터미퓨어 골드™)은 300 mg로 사용되었다. 터미퓨어가 300 mg에서 6520의 효과를 제공하기 때문에, 노바솔과 동일한 투여량(1000 mg)으로 사용된다면, 21733의 효과를 제공할 것이며, 이는 동일 투여량에서의 노바솔의 효과(8539)보다 훨씬 더 높다.

실시예 4 - 본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물의 일반적인 제조

증류수에 유기 정제 커큐미노이드 추출물(적어도 10%, 바람직하게는 95%의 순도(총 커큐미노이드))을 사용하여 수중 커큐미노이드의 혼합물을 제조하였다(3개 부피 분말 중량/물).

증류수를 사용하여 58%의 아라비아 고무 혼합물(기질)을 제조하였다(3개 부피 분말 중량/물). 500 mL의 아라비아 고무 수용액을 교반하에(5000 rpm) 실시예 1에서 제조된 500 mL의 커큐미노이드 용액에 첨가하고, 여기에 5%의 유기 해바라기 오일 및 사포닌중에 표준화된 2%의 유기 퀼라야를 첨가하였다.

생성된 혼합물을 10 분동안 5000 rpm에서 교반하였다. 이어서, 생성된 유화액을 분무 건조시켰다.

실시예 5 - 본원에 기술된 방법/용도에 사용된 조성물의 특성화

본 발명의 조성물의 크기 및 형태를 동적 광산란(DLS) 및 제타 전위(Z-전위) 및 주사 전자 현미경(SEM)으로 분석하였다. DLS 및 제타-전위 분석을 위해, (25 ± 0.1 ℃)의 온도에서 90°의 고정된 산란 각도에서 He/Ne 레이저(λ=633 nm)를 갖는 제타사이저 나노 ZS(나노ZS90, 맬버른 인스트루먼트 리미티드, 영국)를 사용하였다.

사용된 샘플은 액체 유화액 형태였다(건조전 마지막 단계). 샘플들을 0.4%의 부피 농도에서 탈염수에 현탁시키고 1 분의 초음파처리를 적용하였다. 상기 샘플들에서 DLS 분석을 즉시 수행하였다(측정 시간 = 60 초). 제타-전위의 분석은 큰 pH 범위(2에서 11까지)에서 수행하였다.

샘플들을 제조하고, 0.1 M HCl 및 0.1 M NaOH 용액을 사용하여 다음과 같이 상이한 pH에서 분석하였다. 수득된 10개 샘플(pH = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 및 11)을 실온(23 ℃)에서 저장하였다(도 4).

도 18에 나타낸 바와 같이, 수중 본 발명의 조성물의 색은 pH에 의해 유도된다. 케토 형태(황색)는 pH 범위가 산성에서 중성으로(2에서 7로) 변할 때 용액중에 존재하는 우세한 형태이다. pH 8 및 9에서 용액의 색은 오렌지색이 되고, pH 10 및 11에서는 반투명한 붉은 빛의 색이 우세하다. 상기 색 변화는 pH 증가에 의해 유도된 커큐민 분자의 하이드록실기의 순차적 탈양자화에 기인하며, 이것은 커큐민에 더 높은 용해도 및 불안정성을 제공한다.

DLS 분석 결과는 도 19에 나타내었다. 개체들의 입자 크기의 2개 군이 있다. 하나의 군은 616 ± 160 nm에 집중되었고(전체 개체들의 20.8%), 가장 흥미로운 군은 188 ± 42 nm에 집중되었다(전체 개체들의 79.2%).

수용액(pH 5.4) 중 부하된 커큐민의 평균 유체역학적 입자 크기는 0.337의 PDI(다분산성 지수)하에 476.5 nm인 것으로 확인되었다.

도 20은 상이한 pH(2 내지 11)에서 본 발명의 조성물의 Z-전위를 나타낸다. Z-전위가 높을수록, 혼합물은 더 불안정하다. 본 발명의 조성물은 pH 2 내지 pH 11에서 음성 Z-전위를 갖는다. 입자들은 수성상에서 음으로 하전된다. pH 2에서, Z-전위는 0(등전점: 전위가 영(제로)인 pH)에 가깝고, 여기서 유화액의 불안정성 대역을 갖는다. pH 2 내지 pH 4에서, Z-전위는 비교적 낮고(<25 mV), 4 이상의 pH에서, 샘플은 안정성 대역에 들어간다. 상기 안정성은 pH 5에서부터 강하게 확인된다. 등전점의 신속한 이동은 pH 8.0에서 관찰되었으며, 부하된 커큐민의 제타-전위는 놀랍게도 2 내지 7의 pH 범위에서 더 높았다. 수성상에서, <4.0의 pH에서, 부하된 커큐민은 통상적으로 이의 최저 표면 에너지 상태로 존재한다. pH 8.0에서, 부하된 커큐민은 이의 낮은 전자 전하 쪽을 아라비아 고무쪽으로 향하게 하고 이의 높은 전자 전하 쪽은 물과 상호작용하도록 노출될 수 있어서, 상승된 제타-전위를 유도한다.

도 20은 청구된 조성물이 4보다 높은 pH에서 수용액에 분산될 때 안정함을 분명하게 보여준다.

실시예 6 - CQ-MO-304를 사용한 본 발명의 조성물의 입자 크기 분포(PSD)

재료 및 시약

재료

- 맬버른 인스트루먼트의 마스터사이저(Mastersizer) 3000, 또는 등가물;

- 하이드로 2000SM 샘플 분산 유닛, 또는 등가물(액체상의 경우);

- 맬버른 AERO S 샘플 분산 유닛, 또는 등가물(고체상의 경우).

시약

- 물

절차

분석 파라미터

- 배경 시간: 10 초

- 측정 시간: 10 초

- 증류수의 굴절률: 1.33

- 결과 산출: 일반적 목적

- 펌프/교반 속도: 1800 RPM

- 액체 분산제: 물

- 고체 분산제: 외기

특정 파라미터

- 100705 (굴절률: 1, 흡착: 1)

- 100019 (굴절률: 1, 흡착: 2)

- 3CAA0075 및 3CAA0076 (본 발명의 조성물)

본 발명의 조성물의 샘플을 증류수와 혼합하고 샘플을 하이드로 2000SM 유닛 또는 마스터사이저 3000(시로코(Scirocco) 2000 유닛 사용)을 사용하여 검사하였다.

결과

건조 및 밀링후에 수득된 본 발명의 조성물의 여러 배치들을 상기 언급한 방법에 따라 검사하였다. 결과는 하기 표 61에 제공되어 있다.

[표 61]

본 발명의 조성물의 입자 크기 분포(여기서 (D90)은 입자 크기 집단의 90%에 상응하고, (D4:3)은 입자 크기 집단의 부피 모멘트 평균에 상응한다)

실시예 7 - 본 발명의 조성물의 형태(주사 전자 현미경, SEM에 의함)

SEM 분석을 위해 다음과 같이 샘플들을 제조하였다: 분말 형태의 본 발명의 조성물을 단순히 살포함으로써 샘플 홀더위에 침착시켰다. 이어서 백금/팔라듐 침착물을 금속화시킨 다음 에너지 분산에서 X-선 검출기가 장착된 주사 전자 현미경으로 관찰하고 촬영하였다.

도 21, 22 및 23에 나타낸 SME 영상들은 본 발명의 조성물의 가시영상을 제공한다.

본 발명의 조성물은 +/- 170 nm의 크기를 갖는 구형 미셀에 자가-조립된 공액체를 나타낸다. SEM 분석에서 대략 구형 형태는 동적 광산란 기술에 의해 수행된 크기 측정 분석을 입증하였다.

SEM으로부터, 본 발명의 조성물 중의 입자들이 비코팅된 레시틴 나노입자에 부재한 키토산의 외면 코팅을 명확하게 나타낸 것을 볼 수 있다. 커큐민은 상기 나노입자들의 레시틴 코어에 잘 분산되는 것으로 밝혀졌다. SEM 측정은 또한 거의 구형 기하구조의 증거를 입증하였으며 표면 거칠기는 표면 흡수율을 나타낸다. 이는 상기 유형의 흡착의 구동력이 직접적인 정전 상호작용이거나 이온-이온 상호작용임을 시사한다.

Claims

(i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야, 및 (iii) 변성 전분 및/또는 아라비아 고무를 포함하는 조성물의 형태의 커큐미노이드의 투여를 포함하는, 포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하는 방법.
포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성을 개선하기 위한, (i) 커큐미노이드, (ii) 퀼라야, 및 (iii) 변성 전분 및/또는 아라비아 고무를 포함하는 조성물의 용도.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
포유동물에서 커큐미노이드의 생체접근성, 생체이용률, 생체효능 및/또는 생체활성의 개선이 커큐미노이드의 개선된 위장 내성 및/또는 장 세포에 의한 커큐미노이드의 개선된 흡수 및/또는 개선된 혈액 순환에 기인하는, 방법 또는 용도.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
커큐미노이드가 커큐민 및 이의 제 1 상 또는 제 2 상 대사산물, 디메톡시커큐민 및 이의 제 1 상 또는 제 2 상 대사산물, 비스디메톡시커큐민 및 이의 제 1 상 또는 제 2 상 대사산물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법 또는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
포유동물이 인간인, 방법 또는 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
커큐미노이드가 유리 형태인, 방법 또는 용도.