KR20210039846A

KR20210039846A - 암의 약제 내성을 극복하기 위한 src 저해제의 용도

Info

Publication number: KR20210039846A
Application number: KR1020190122558A
Authority: KR
Inventors: 조광현; 황채영; 박상민
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-10-02
Filing date: 2019-10-02
Publication date: 2021-04-12
Also published as: KR102285792B1

Abstract

본 발명은 표적항암제의 약제 내성을 극복할 수 있는 신규한 병용 약물 표적으로서의 SRC의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 SRC저해제는 표적항암제의 약제 내성을 일으키는 핵심적인 피드백을 억제하여, MAPK 및 PI3K 신호전달경로를 억제하는 표적항암제와 병용 투여 시 항암 효과를 상승시킨다. 따라서, 본 발명은 표적항암제에 대한 내성을 극복하고 암환자의 항암제에 대한 치료 적중률을 높일 수 있어 표적항암제를 이용한 치료전략에 새로운 가능성을 제시하고, 정밀의학 실현에 기여할 수 있다.

Description

암의 약제 내성을 극복하기 위한 SRC 저해제의 용도{USE OF SRC INHIBITOR FOR OVERCOMING DRUG RESISTANCE OF CANCER}

본 발명은 표적항암제의 약제 내성을 극복할 수 있는 신규한 병용 약물 표적으로서의 SRC의 용도에 관한 것이다.

암은 대표적인 호발성 난치 질환으로서 사회경제적으로 큰 문제가 되고 있다. 세계보건기구(WHO) 산하 국제암연구센터(IARC)가 2017년 발표한 '암 예방 및 통제 계획 초안'에 따르면 세계적으로 암 환자가 크게 늘어나 2030년에는 연간 암 발병 건수가 2012년 대비 약 54% 증가한 2,200만명에 육박할 것으로 추정되며, 2010년 한 해에만 암 진단 및 치료를 위해 사용된 비용은 전 세계적으로 한화 1315조원에 육박하였다. 우리나라에서도 2014년에 발표된 '보건복지부 암등록통계'에 의하면 암 발생률이 2000년도 이후 꾸준히 증가하여, 2010년에는 발생한 암 환자가 20만 명(10만 명당 약 400명)을 넘어섰고, 2015년 발표된 '통계청 사망원인통계'에 따르면 최근 10년간 사망률이 가장 많이 증가한 사인은 암이며, 암 사망자수는 2015년 전체 사망자의 약 27.9%인 76,975명(10만명당 약 150.8명)에 이르렀다.

최근 암 치료를 위해 다양한 표적항암제가 개발되고 있다. 표적항암제는 암세포에만 발현되는 특정 표적을 공격하기 때문에 부작용은 줄이면서 치료 효과는 획기적으로 높일 수 있다. 그러나, 표적항암제는 많은 기대에도 불구하고 임상에서 약물에 대한 암의 저항성 때문에 그 효과가 제한되고 있다. 특히, 피드백 조절관계가 얽혀있는 신호전달 네트워크의 복잡한 동역학 때문에, 암은 약물에 의한 섭동 효과에 적응하고 이를 상쇄시킬 수 있는 적응형 저항성을 가지고 있다. 이러한 약제 내성은 표적치료제의 효능을 근본적으로 저해한다. 이처럼 여러 신호전달 네트워크가 종합적으로 관여하는 암세포의 약제 내성의 원리를 밝히고, 내성 환자군에 대한 바이오마커 동정 및 내성 극복을 위한 병행치료 표적을 발굴하기 위해서는 네트워크적 접근을 필요로 한다.

한편, 암에서 주로 유전적 변이가 발생하는 원암 신호전달 경로로는 MAPK, PI3K 등이 존재한다. 많은 표적항암제는 변이가 생긴 이러한 신호전달 경로를 억제하도록 개발되었다.

본 발명자들은 표적항암제의 치료적 한계를 극복할 수 있는 병용 약물 표적을 발굴하기 위해 확률적 불리언 네트워크 모델 및 분석 프레임워크를 개발하고, 이를 게놈 정보가 통합된 대규모 신호전달경로 네트워크에 적용하여 MAPK 신호전달 경로, PI3K 신호전달 경로를 표적으로 하는 항암제에서 발생하는 저항성을 매개하는 피드백 회로 중에서 SRC가 핵심적인 역할을 담당함을 파악하였다. 구체적으로, 암세포의 신호전달경로에서 발생하는 MAPK 및 PI3K 신호전달경로 저해제에 대한 내성기작 및 내부 분자들 간의 동역학을 분석하여 내성을 발생시키는 핵심적인 피드백인 SRC를 발굴하고, 상기 SRC를 내성 극복을 위한 병행치료 표적으로 하여 추가적인 약물로 이를 억제하면 표적항암제에 대한 내성을 극복하고 표적항암제의 효능을 증대시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 SRC 저해제를 포함하는 항암제 내성 억제 또는 개선용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 항암 보조제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 SRC 저해제 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 SRC 저해제 및 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 SRC 단백질 또는 SRC 단백질을 코딩하는 유전자에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 SRC 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 감소하는 경우 상기 후보물질은 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선 활성이 있는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SRC 저해제를 포함하는 항암제 내성 억제 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

또한, 본 발명은 SRC 저해제 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SRC 저해제 및 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 SRC 단백질 또는 SRC 단백질을 코딩하는 유전자에 후보물질을 처리하는 단계; 및 상기 SRC 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 감소하는 경우 상기 후보물질은 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선 활성이 있는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 SRC저해제는 표적항암제의 약제 내성을 일으키는 핵심적인 피드백을 억제하여, MAPK 및 PI3K 신호전달경로를 억제하는 표적항암제와 병용 투여 시 항암 효과를 상승시킨다. 따라서, 본 발명은 표적항암제에 대한 내성을 극복하고 암환자의 항암제에 대한 치료 적중률을 높일 수 있어 표적항암제를 이용한 치료전략에 새로운 가능성을 제시하고, 정밀의학 실현에 기여할 수 있다.

도 1은 약물에 대한 적응 내성을 분석하기 위한 시뮬레이션 프레임워크를 나타낸 도로서, 하나 또는 두개의 약물에 대한 확률적 약물 시뮬레이션 모델 및 시뮬레이션 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 우회 경로(bypass pathway)를 포함하는 확률적 약물 시뮬레이션 모델 및 시뮬레이션 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 대규모 신호전달경로 정보를 기반으로 불리언 모델을 재구성하여 구축된 대장암 특이적 대규모 신호전달 네트워크 모델을 나타낸 도이다. 파란색 화살표는 활성(activation)을 의미하고, 빨간색 무딘 화살표는 억제(inhibition)를 의미한다.
도 4는 대규모 게놈 정보를 기반으로 신호전달 네트워크를 재구성하여 구축된 세포주별 신호전달 네트워크 모델을 나타낸 도이다. 맵핑된 네트워크는 계층적 클러스터링(좌측)으로 정렬되었으며, 총 37개 네트워크 중 각 노드에 대한 유전적 변이의 비율을 그래프로 나타내었다(우측).
도 5는 입력 노드(EGF, DNA damage, WNT 또는 TGFβ)의 자극에 대한 네트워크 모델의 반응 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 적응 내성을 극복하기 위한 병용 약물 표적의 발굴 과정을 나타낸 도이다.
도 7은 KRAS 돌연변이를 갖는 대장암 세포주 HCT116, SW620에서 MEK 저해제 및 SRC 저해제 병용에 따른 효과를 확인한 도이다. (a) 내지 (e) HCT116 세포주. (f) 내지 (i) SW620 세포주. 각 값은 평균 ± SEM(n=5)를 나타내며, *p<0.05(Student's t-test).
도 8은 BRAF 돌연변이를 갖는 대장암 세포주 HT29에서 BRAF 저해제 및 SRC 저해제 병용에 따른 효과를 확인한 도이다. 각 값은 평균 ± SEM(n=3)를 나타내며, *p<0.05(Student's t-test).
도 9는 (a) 신호전달 네트워크에서의 적응 내성의 일반적 모델 및 (b) 내지 (g) 다른 암종의 세포주에서 MAPK 경로 억제제 및 SRC 저해제 병용 처리에 대한 약물 내성 극복 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 10은 SRC가 조절 노드로 작용하는 PI3K 신호전달 네트워크 적응 내성 모델에서 PI3K 경로 억제제 및 SRC 저해제 병용 처리에 대한 약물 내성 극복 여부를 확인한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.

암 세포는 MAPK 신호전달경로(RAS → RAF → MEK → ERK)의 다양한 키나아제(kinases)를 표적으로 하는 약물에 적응하여 적응 내성(adaptive resistance)을 나타낸다. 예를 들어, FDA 승인된 BRAF 저해제(BRAFi)로 BRAF V600E 돌연변이를 가진 환자를 치료하는데 사용되는 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)은 BRAF-돌연변이 흑색종(melanoma)에서 단일 요법으로 처리되는 경우 80% 반응률의 효과적인 항암 효과를 나타내는 반면, BRAF-돌연변이 대장암(colorectal cancer, CRC)에서는 5% 미만의 반응률을 보이며 단독 요법으로서 실패하였다. BRAF-돌연변이 대장암을 BRAF 저해제로 처리시, ERK 하류 신호전달경로로부터 EGFR 상류 신호전달경로로의 음성 피드백이 완화되고, 그 결과 EGFR에 따른 MAPK 신호전달경로의 지속적인 활성화로 인해 적응 내성이 발생한 것이다. KRAS-돌연변이 대장암의 경우, MEK 저해제 처리 시 BRAF 및 CRAF를 통한 MAPK 신호전달경로 활성화가 적응 내성을 유도하였다.

이와 같은 신호전달 네트워크의 복잡한 동역학을 분석하고 약제 내성 기저의 메커니즘을 예측하기 위해서는 정량적 수학적 모델의 이용이 효과적이다. 대규모 네트워크 시스템의 분석을 위해 사용되는 불리언 네트워크 모델(Boolean network model)은 신호 분자들을 네트워크 상에 노드(node)로 맵핑하고, 해당 분자가 활성 상태인 경우 1(“ON”) 또는 비활성 상태인 경우 0(“OFF”)로 표시하여 해당 분자의 활성화 수준을 나타낸다. 한편, 상기 불리언 네트워크 모델에서 약물 섭동(drug perturbation)의 효과는 일반적으로 표적 노드의 상태값을 OFF로 고정시켜 구현된다. 결과적으로, 신호전달경로가 경로 중 하나의 노드를 표적으로 하는 단일 약물에 의해 완전히 차단될 수 있어, 이 접근법으로는 적응 내성을 예측할 수 없다.

이에, 본 발명자들은 확률적 불리언 모델(probabilistic Boolean model)을 사용하여 약물 억제를 비율(ratio)로 나타내는 시뮬레이션 프레임워크를 개발하였다. 또한, 실험을 통해 이와 같은 접근법은 노드가 부분적으로 억제된 상태를 반영하고, 약물 처리 후 피드백 조절 변화로부터 발생하는 적응적 변화를 포착할 수 있어, 시뮬레이션 상에 약물 효과를 적절하게 나타냄과 동시에 적응 내성의 메커니즘을 정확하게 예측할 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 대장암의 대규모 신호전달 네트워크를 게놈 정보와 통합하여, 표적 저해제에 대한 반응으로서 세포주 특이적 동역학을 분석하였다. 적응 내성을 극복하기 위한 병용 치료 표적을 발굴하기 위해, 약물 처리 후의 모든 노드에 대한 동역학 변화 및 원래 약물 표적에 대한 이들의 피드백 구조를 분석한 결과, SRC가 MAPK 신호전달경로를 표적으로 하는 다수 약물의 적응 내성을 조절하는 핵심적인 역할을 담당함을 확인하였다. SRC는 표적 경로 및 보상 기전의 매개된 활성화를 재활성화함으로써 차단된 표적 경로를 우회하였으며, 본 발명자들은 SRC 저해제를 KRAS 돌연변이를 가진 대장암 세포주(HCT116, SW620)에서 MEK 저해제와 함께 사용하거나, 돌연변이 BRAF를 가진 대장암 세포주(HT29)에서 BRAF 저해제 또는 pan-RAF 저해제와 함께 사용하는 경우 효과적인 병용 치료 효과를 얻을 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 SRC 저해제와 MAPK 신호전달경로 억제제와의 병용 처리가 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 가진 폐암 및 유방암에서 효과적이며, PI3K 신호전달경로 억제제와 병용 처리 시 PI3K-돌연변이 대장암 세포주에서 효과적임을 확인하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명자들은 SRC 저해제를 조합하는 치료법이 여러 암종에서 효과적인 전략이 될 수 있음을 확인하였다.

이에, 본 발명은 SRC 저해제를 포함하는 항암제 내성 억제 또는 개선용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서, 용어 “SRC”는 다양한 막 수용체 단백질에 의해 인산화되며, 활성화된 SRC 단백질은 세포 신호 전달에 관여하여 세포 증식, 분화, 골격 유지 등 다양한 세포 내 반응을 매개하는 약 60kDa 크기의 단백질을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에서, 본 발명에 따른 대규모 신호전달 네트워크 모델을 사용한 시뮬레이션을 통해 SRC가 항암제의 약제 내성 메커니즘에 핵심적인 피드백을 억제하고, 그에 따라 SRC 저해제를 항암제와 병용 시 치료 효과가 현저히 개선됨을 확인하였다. 나아가, 세포 실험을 통해 상기 시뮬레이션 결과가 in vitro 실험결과와도 부합함을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 SRC 저해제(SRC inhibitor; SRCi)는 SRC 유전자 또는 SRC 단백질 발현 억제제; 또는 SRC 단백질 활성 억제제일 수 있다.

상기 SRC 유전자 또는 SRC 단백질 발현 억제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 리보자임으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 SRC 단백질 활성 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체는 상기 SRC 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일클론 항체, 다클론항체, 또는 재조합 항체 등을 포함하며, 당업자에게 알려진 공지의 방법으로 제작하거나 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 화합물은 이에 제한되는 것은 아니나, 다사티닙(dasatinib), 보수티닙(bosutinib), 포나티닙(ponatinib), 사라카티닙(saracatinib), WH-4-023 및 WZ3105로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 바람직하게는 다사티닙을 사용할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 SRC 저해제로 다사티닙(dasatinib)을 사용하여 실험을 진행하였다.

본 발명은 SRC 저해제와 항암제를 병용 투여하는 경우 항암제에 대하여 유도된 저항성 또는 약제 내성을 극복하고 기존 항암제의 항암 효과를 현저히 개선할 수 있음을 밝힌 것에 그 의의가 있으므로, 상기 SRC 저해제는 본 발명의 기술분야에서 사용되거나 SRC 저해 활성이 있는 것으로 밝혀진 것이라면 그 종류에 상관 없이 본 발명에 적용될 수 있고, 구체적인 종류에 한정되는 것이 아님은 당업자에게 자명하다고 할 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 SRC 저해제는 항암제와 동시 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 항암제는 이에 제한되지는 않으나, 트라메티닙(Trametinib), 베무라페닙(vemurafenib), 알페리십(alpelisib), 닥톨리십(dactolisib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(Sorafenib), 크리조티닙(Crizotinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 토파시티닙(Tofacitinib), 이마티닙(Imatinib), 보르테조밉(Bortezomib), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 알렘투주맙(Alemtuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 치료제일 수 있다.

바람직하게는, 상기 항암제는 트라메티닙, 베무라페닙, 알페리십 및 닥톨리십으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 치료제일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 항암 보조제를 제공한다.

본 발명에서, 용어 “항암 보조제”는 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 항암 보조제는 항암보조제는 처리농도에 따라 항암제 또는 항암보조제로서 사용할 수 있으며, 항암제의 감수성을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, SRC 저해제는 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 가진 대장암 세포주에서 각각 MEK 저해제 또는 BRAF 저해제의 반응성을 증가시킬 수 있음을 확인하여, 본 발명에 따른 SRC 저해제가 항암 보조제로 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 있어서, 상기 항암 보조제는 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병용하여 투여될 수 있다.

본 발명에서, 용어 “MAPK 신호전달경로”는 RAS-RAF-MEK-ERK 캐스케이드(cascade)로 이루어진 신호전달경로로 여러 세포 내 신호전달경로에 공통적으로 존재하는 매우 중요한 신호전달시스템으로 알려져 있다. 특히, 사람 암 조직 의 약 30% 정도에서 MAPK 신호전달경로의 비정상적 활성화가 관찰되는 등 MAPK 신호전달경로에서의 이상(aberration)은 암 세포학에서 중요한 역할을 수행한다.

본 발명에 있어서, 상기 MAPK 신호전달경로 억제제(MAPK inhibitor; MAPKi)는 당업계에서 현재 공지되었거나 혹은 장래에 확인될 것인 임의의 MAPK 신호전달경로 억제제를 의미하며, MAPK 신호전달경로의 활성화 저해를 초래하는 물질이라면 제한 없이 포함된다. 상기 억제제는 MAPK 신호전달경로에 관여하는 RAS, RAF, MEK 및 ERK와 같은 인산화 효소의 신호전달 메커니즘을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, 상기 “MEK”는 MEK1과 MEK2로 구성되어 있으며 다양한 성장인자(growth factor), 사이토카인(cytokine), 막 탈분극(membrane depolarization) 또는 칼슘 유입(calcium influx)에 의해 활성화 된다. 또한 MEK의 인산화에 의해 ERK가 활성화된다.

상기 MAPK 신호전달경로 억제제는 이에 제한되지는 않으나 B-Raf의 저해제 (BRAFi), MEK의 저해제(MEKi) 및 ERK의 저해제(ERKi)로부터 선택될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 MEK 저해제는 셀루메티닙(selumetinib), 레파메티닙(refametinib), PD-0325901, CI-1040, BIX02189 및 BAY87-9766으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 B-Raf 저해제는 다브라페닙(dabrafenib), 소라페닙(sorafenib), HG6-64-1, SB-590885, GDC-0879 및 PLX3603으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 ERK 저해제는 SCH772984, XMD8-92, FR-180204, GDC-0094 및 BVD-523으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 상기 MAPK 신호전달경로 억제제는 추가적으로 Pan-RAF 저해제로서 PLX-4720일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 MAPK 신호전달경로 억제제로 MEK 저해제인 트라메티닙(Trametinib; GSK1120212), RAF 저해제인 AZ628, 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032)을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 간암 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캡슐, 정제, 과립, 주사제, 연고제, 분말 또는 음료 형태임을 특징으로 할 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 인간을 대상으로 하는 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약학적 조성물은 이들로 한정되는 것은 아니지만, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 캡슐, 정제, 수성 현탁액 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 경구투여시에는 결합제, 활탁제, 붕해제, 부형제, 가용화제, 분산제, 안정화제, 현탁화제, 색소, 향료 등을 사용할 수 있으며, 주사제의 경우에는 완충제, 보존제, 무통화제, 가용화제, 등장제, 안정화제 등을 혼합하여 사용할 수 있으며, 국소투여용의 경우에는 기제, 부형제, 윤활제, 보존제 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 제형은 상술한 바와 같은 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 다양하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 경구투여 시에는 정제, 트로키, 캡슐, 엘릭서(elixir), 서스펜션, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 제조할 수 있으며, 주사제의 경우에는 단위 투약 앰플 또는 다수회 투약 형태로 제조할 수 있다.

한편, 제제화에 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등이 사용될 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 경로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 구강, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하 또는 직장이 포함된다. 상기 "비경구"는 피하, 피내, 정맥내, 근육내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 경막내, 병소내 및 두개골 내 주사 또는 주입기술을 포함한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물은 또한 직장 투여를 위한 좌제의 형태로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 사용된 특정 유효성분의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 정식, 투여시간, 투여경로, 배출율, 약물 배합 및 예방 또는 치료될 특정 질환의 중증을 포함한 여러 요인에 따라 다양하게 변할 수 있고, 상기 약학적 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직하게는 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱더 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg/day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서, 용어 “PI3K 신호전달경로”는 대부분의 종양에서 다양한 기질들을 인산화하여 세포성장, 증식과 생존을 촉진하는 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 알려진 신호전달시스템으로, PI3K-Akt-mTOR 경로를 따르는 것으로 잘 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PI3K 신호전달경로 억제제(PI3K inhibitor; PI3Ki)는 당업계에서 현재 공지되었거나 혹은 장래에 확인될 것인 임의의 PI3K 신호전달경로 억제제를 의미하며, PI3K 신호전달경로의 활성화 저해를 초래하는 물질이라면 제한 없이 포함된다. 상기 억제제는 MAPK 신호전달경로에 관여하는 RAS, RAF, MEK 및 ERK와 같은 인산화 효소의 신호전달 메커니즘을 억제시키는 것을 특징으로 한다.

상기 PI3K 신호전달경로 억제제는 이에 제한되지는 않으나 PI3Kα의 저해제 (PI3Kαi) 또는 PI3K-Akt의 하류(downstream) 단백질인 mTOR의 저해제(mTORi)일 수 있다. 상기 mTOR는 직접적으로 미토콘드리아 양을 조절하며 아스파라진(asparagine), 프롤린(proline), 아르지닌(arginine), 글루타민(glutamine) 등 다양한 아미노산의 합성 대사과정을 조절함으로써 암세포 성장에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

본 발명에 있어서, 상기 PI3K 신호전달경로 억제제는 PI3K 저해제로서 BKM120, 픽틸리십(pictilisib), 타셀리십(taselisib), 복스탈리십(voxtalisib), 필라랄리십(pilaralisib) 및 GSK1059615로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, AKT 저해제로서 아퍼레서티닙(afuresertib), A-443654, AT13148, AT7867, AZD5363, GSK690693, 이파타서티닙(ipatasertib), MK-2206, 및 어프로서티닙(uprosertib)으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, mTOR 저해제로서 JW-7-52-1, 템시롤리무스(temsirolimus), 라파마이신(rapamycin), AZD8055 및 OSI-027로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는, 상기 PI3K 신호전달경로 억제제로 알페리십(alpelisib; BYL719), 닥톨리십(dactolisib; NVP-BEZ235)을 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 양을 측정하는 방법은 공지의 기술을 이용하여 생물학적 시료로부터 mRNA 또는 단백질을 분리하는 공지의 공정을 포함하여 수행될 수 있다. 상기 생물학적 시료는 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 수준이 정상 대조군과는 다른, 생체로부터 채취된 시료를 말하며, 상기 시료로는 예를 들면, 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 및 뇨 등이 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 유전자의 발현 수준 측정은 바람직하게는 mRNA의 수준을 측정하는 것이며, mRNA의 수준을 측정하는 방법으로는 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소연쇄반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿 및 DNA 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 단백질 수준의 측정은 항체를 이용할 수 있는데, 이러한 경우 생물학적 시료 내의 상기 마커 단백질과 이에 특이적인 항체는 결합물, 즉, 항원-항체 복합체를 형성하며, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정할 수 있다. 이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블롯, ELISA, 방사선면역분석, 방사선 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 SRC 단백질 또는 SRC 단백질을 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 저해하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, SRC 저해제를 MAPK 또는 PI3K 신호전달경로 억제제와 병용 투여 시 시너지 효과를 통하여 항암제 내성을 극복하고 항암 효과를 증대시킬 수 있음을 확인하였는바, 상기 SRC 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 감소시키는 물질은 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제로서 사용될 수 있다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실험방법 및 재료

세포 배양

MAPK 신호전달경로에 유전적 변이가 있는 대장암, 유방암 또는 폐암 세포주인 HCT116(KRAS G13D, PI3K H1047R), SW620(KRAS G12V), HT29(BRAF V600E, PI3K P449T), A549(KRAS G12S), SW1573(KRAS G12C) 및 MDA-MB-231(KRAS G13D, BRAF G464V)를 10% FBS(WelGENE Inc.) 및 항생제(penicillin 100 units/ml, streptomycin 100 μg/ml 및 Fungizone 0.25 μg/ml)(Life Technologies Corp., Carlsbad, CA)를 함유한 DMEM 배지(WelGENE Inc., Gyeongsan, Republic of Korea)에서 37℃, 5% CO₂, 습윤조건으로 배양하였다.

반응 시약

트라메티닙(Trametinib; GSK1120212, MEK1/2 저해제)은 APExBIO(Boston, MA, USA)에서 구매하여 사용하였고, AZ628(pan-Raf 저해제), 다사티닙(dasatinib; SRC 저해제), 베무라페닙(vemurafenib; PLX4032, B-RafV600E 저해제), 알페리십(alpelisib; BYL719, PI3Kα 저해제) 및 닥톨리십(dactolisib; NVP-BEZ235, PI3K 및 mTOR 저해제)은 Selleckchem(Houston, TX, USA)으로부터 수득하여 사용하였다. 크리스탈 바이올렛 용액, DMSO(Dimethyl sulfoxide) 및 PFA(파라포름알데히드)는 Sigma-Aldrich(Saint Louis, MO, USA)로부터 수득하여 사용하였다.

세포 성장 및 생존율 분석

세포들을 성장 배지(growth medium) 조건 하에 96-웰 플레이트에 3~7 x 10³ cells/웰로 시딩하고, 24시간 동안 배양 후 지시된 약물로 처리하였다. 플레이트를 72시간 내지 120시간 동안 배양 후, 상대적인 세포 생존율을 측정하였다. 시딩 후, 세포들은 IncuCyte ZOOM을 사용하여 이미징하였으며, IncuCyte ZOOM 분석 소프트웨어를 사용하여 각 시점에서 세포의 평균 면적을 측정하여 세포 성장을 평가하였다. 이미지는 20x 배율로 3개의 개별 영역에서 3시간 간격으로 캡쳐하였으며, 상대적인 세포 생존율은 WST-1 세포 증식 시약(Daeillab, Republic of Korea) 및 xMark™ 마이크로플레이트 분광광도계(Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 흡광도 450nm에서 측정하였다.

세포 증식 분석

크리스탈 바이올렛 염색법으로 세포 증식 여부를 확인하였다. 세포들을 플레이트에 3~7 x 10³ cells/웰로 시딩하고, 다음날 지시된 약물을 적정 용량으로 처리하였다. 약물 첨가 후 3일 내지 7일 동안 추가로 배양하고, 플레이트를 PBS로 세척하고, 고정한 후, 0.5% 크리스탈 바이올렛(Sigma-Aldrich)을 처리한 후 상온에 방치하여 30분 동안 염색하였다. 수돗물로 씻어낸 후 상온에서 건조하여 다음날 세포 증식 여부를 확인하였다.

웨스턴 블롯

세포를 용출 용액(20 mM HEPES, pH 7.2, 150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 10% glycerol, 1 mg/ml aprotinin, 1 mg leupeptin, 1 mM Na₃VO₄, 1 mM NaF)으로 용해시키고 세포로부터 얻어진 용해물 내의 단백질을 정량하였다. 면역블롯팅에는 항-ERK1/2, 항-포스포-ERK1/2, 항-포스포-SRC(Cell Signaling Technology Inc.), 항-β액틴, 항-bcl2 및 항-caspase 3(Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX)을 사용하였다. 래빗 폴리클로날 항-GAPDH 항체는 권기선 박사(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)로부터 제공받아 사용하였다.

실시예 1. 약물 시뮬레이션 프레임워크 구축

1-1. 확률적 약물 시뮬레이션 프레임워크 구축

MAPK 신호전달 경로 억제제, 예를 들어, BRAF 저해제 또는 MEK 저해제를 이용한 대장암 치료는 MAPK 신호전달경로의 재활성화에 의해 적응 내성을 유도한다. 한편, 종래의 결정론적 약물 시뮬레이션을 이용하면 음성 피드백 루프로부터 발생하는 적응 내성을 효과적으로 규명할 수 없으므로, 본 발명자들은 약물이 표적으로 하는 노드에 대한 억제 비율을 통합하여 신호전달 네트워크에서의 적응 내성을 분석하는 약물 시뮬레이션 프레임워크를 구축하였다(이하에서, 이를 “확률적 불리언 모델(probabilistic Boolean model)”이라고 한다). 생체 내에서 약물이 특정 단백질의 기능을 100% 차단할 가능성은 낮기 때문에, 이와 같은 모델의 사용은 생체 내 상황을 보다 정확히 반영할 뿐만 아니라 실제 실험 결과와도 일치하는 예측을 가능하게 한다.

본 발명에서 약물이 표적으로 하는 노드, 즉 “약물 표적 노드(drug target node)”의 상태는 하기 도면(b)에 나타낸 2개 진리표(truth table) 중 하나에 따라 확률적으로 결정하였다. 노드의 활성은 확률적 약물 섭동(drug perturbations)을 가진 100개의 시뮬레이션 단계에서 ON 상태의 비율로 계산된다. 예를 들어, 약물 표적 노드가 30%의 비율로 억제된 경우, 표적 노드의 상태는 30%의 시뮬레이션 단계에서 OFF로 고정되어 억제 로직(inhibited logic)을 따르고, 나머지 70%의 시뮬레이션 단계에서는 원래의 로직(original logic)을 따라 계속적으로 업데이트된다.

구체적으로, 약물 표적 노드(상기 도면에서, Node B에 해당)의 상태 값은 0에서 1까지의 억제 비율에 따라 확률적으로 결정하였다. 각 노드의 활성은 시뮬레이션 동안의 평균 상태값으로 계산되었고, 0 내지 1 범위의 억제 비율에서 상류 노드(A)가 지속적으로 자극되면 표적 약물 및 하류 노드(B, C)의 활성은 감소하였다. 약물 효과는 억제율의 변화에 따른 활성의 변화를 나타내는 반응 곡선의 AUC(Area Under Curve)에 의해 측정되었다.

1-2. 확률적 약물 시뮬레이션 검증

상기 실시예 1-1에서 구축한 확률적 약물 시뮬레이션을 통해 음성 피드백 루프(NFL)를 가진 네트워크에서의 약제 내성의 출현을 포착할 수 있는지 여부를 확인하였다. 이를 도 1에 나타내었다.

도 1의 왼쪽 패널에 나타낸 것은 단순 캐스케이드(cascade) 모델로, 해당 모델은 약물 표적 노드의 상류 노드 활성에는 어떠한 변화도 없이 경로 활성이 억제 비율과 선형적인 상관관계를 보이며 억제되었다.

이와 비교하여, 도 1의 중간 패널에 나타낸 NFL 네트워크는 약물 표적 노드의 상류 노드의 활성 증가를 나타내었고, 경로 활성 억제와 억제 비율은 선형적인 상관관계를 나타내지 않았다. NFL 네트워크는 단순 캐스케이드에 비해 더 많은 양의 억제를 필요로 하였으며, 노드 C에서 A로의 음성 피드백의 감소로 인해 억제 비율 증가에 따라 상류 노드(A)의 활성이 증가되었다.

또한, 도 1의 오른쪽 패널에 나타낸 바와 같이, 노드 A를 표적으로 하는 병용 약물 처리 시에는 단일 약물 처리 시보다 낮은 억제 비율에서 NFL 네트워크가 억제되었다. 즉, 노드 A 및 B를 조합하여 표적하면 효과적인 억제가 가능하였고, 반응 곡선의 AUC는 이와 같은 NFL 네트워크의 약제 내성 유도 및 병용 약물에 따른 증가된 효과를 명확하게 입증하였다. 상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 확률적 약물 시뮬레이션을 사용하면 NFL 매개된 적응 내성의 확인, 나아가 피드백 조절에 의해 매개되는 적응 내성을 극복하기 위한 병용 약물 표적을 발굴할 수 있음을 확인하였다.

상기 확률적 약물 시뮬레이션을 보다 복잡한 상호 연결된 우회 경로(bypass pathway)에 적용한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명자들은 노드 D가 가장 효과적인 병용 약물 표적임을 확인하였다. 노드 D는 초기에 표적화된 A-B-C 경로 밖에 있음을 고려하면, 상기 결과는 병용 약물 표적이 초기에 표적화된 경로 밖에 있을 수 있고, 따라서 계산적, 네트워크적 접근 없이는 효과적인 병용 약물 표적의 예측이 어려움을 의미한다고 보았다.

실시예 2. 대규모 신호전달 네트워크 모델 구축

2-1. 대장암 특이적 대규모 신호전달 네트워크 모델 구축

대장암에서 약물에 대한 적응 내성의 메커니즘을 체계적으로 분석하기 위해, 대규모 데이터베이스인 Pathway Interaction Database(PID) 및 Kyoto Encyclopedia of Genes(KEGG)를 기반으로 불리언 모델을 재구성하여 신호전달경로 및 세포주 정보가 통합된 대장암 특이적 대규모 신호전달 네트워크 모델을 구축하였다.

신호전달경로의 경우, 대장암에서의 종양 형성(colorectal tumorigenesis)에서 높은 빈도로 발견되는 돌연변이, 즉 APC 또는 β-카테닌 돌연변이(WNT pathway), BRAF 또는 KRAS 돌연변이(MAPK pathway), PI3Kα 돌연변이(PI3K/AKT pathway), SMAD4 돌연변이(TGFβ pathway), p53 돌연변이(DNA damage pathway) 및 각 신호전달경로 사이의 상호연관관계(crosstalk)를 통합하였다. 또한, 약물 반응의 결과를 대표하는 신호전달경로, 즉 p38/JNK pathway, JAK/STAT pathway, 세포주기 경로 및 세포사멸 경로를 통합하였다. 구축된 대장암 특이적 신호전달 네트워크는 모두 95개 노드(node)와 340개 링크(link)로 이루어졌으며, 이를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, 4개의 입력 노드(EGF, DNA damage, WNT 및 TGFβ는 네트워크 모델의 상응하는 신호전달경로를 자극하고, 2개의 출력 노드인 세포 증식(proliferation) 및 세포사멸(apoptosis)은 네트워크 모델에 의해 발생한 표현형을 나타낸다.

세포주의 경우, The Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)를 사용하여 총 60개의 대장암 세포주의 유전적 변이(genetic alteration) 중에서 기능적 발암성 돌연변이를 유발하는 유전적 변이를 선택하여 신호전달 네트워크에 맵핑하였다. 유전적 변이의 효과는 OncoKB 데이터베이스에 따라 기능 획득(gain of function)으로 분류되는 경우 활성(“ON”) 또는 기능 손실(loss of function)로 분류되는 경우 비활성(“OFF”)로 표시되었다. 그 결과, 총 37개의 서로 다른 대장암 세포주 특이적 네트워크가 완성되었으며, 이를 도 4에 나타내었다.

2-2. 대규모 신호전달 네트워크 모델 검증

상기 실시예 2-1에서 구축한 대규모 신호전달 네트워크 모델의 동역학을 분석하기 위해 시뮬레이션을 수행하였다. 입력 레벨은 0% 내지 100%로 다양하게 입력하고, 입력 레벨이 30%인 경우 입력 노드의 상태는 30%의 시뮬레이션 단계에서 ON으로 고정되거나 또는 다른 70%의 단계에서 OFF로 고정되었다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 네트워크 모델은 신호전달 네트워크의 입력-출력 관계를 성공적으로 재현할 수 있음을 확인하였다. 구체적으로, EGF의 자극은 ERK, AKT, S6K, c-MYC 및 CyclinD 활성과 양적 상관관계를 보였고, p27 활성과는 음적 상관관계를 보였다. DNA 손상 자극은 p53 및 p21 활성과 양적 상관관계를 보였다. WNT 자극은 β-catenin, c-MYC 및 CyclinD 활성과 양적 상관관계를 보였으며, TGFβ 자극은 Smad4(combined with Smad2/3), ERK 및 AKT 활성과 양적 상관관계를 보였다.

실시예 3. 병용 약물 표적 발굴

3-1. 평가 기준

상기 실시예 2-1에서 구축한 대규모 신호전달 네트워크 모델을 사용하여, MAPK 억제제에 대한 효과적인 병용 약물 표적을 발굴하였다. 각 후보 노드에 대한 점수 계산에는 i) 노드 활성 변화, ii) 피드백 강도 및 iii) 우회 신호전달의 세 가지 기준을 고려하였다(도 6의 a). 상류 노드의 활성 변화는 경로 재활성화에 크게 기여할 수 있으며 피드백 루프 길이가 짧을수록 적응 내성에서 더 기능적일 수 있기 때문에 ERK와 후보 노드 간의 피드백 강도를 평가하였다. 후보 노드에서 세포 생존(cell survival) 및 세포사멸(apoptosis) 경로로의 우회 경로에 대한 강도 역시 약물 내성을 부여할 수 있어, 평가대상에 포함하였다.

구체적인 점수 계산 방법은 다음과 같다: 각 노드의 활성 변화(activity change, AC)는 세포주 특이적 네트워크에서의 약물 시뮬레이션의 반응 곡선으로부터 초기값을 뺀 후 AUC에 의해 계산되었다. 각 노드에서 ERK까지의 최단 음성 피드백 루프의 길이는 명목형 네트워크(nominal network)에서 계산되었다. 각 노드로부터 출력(output) 노드까지의 우회 신호전달(bypass signaling) 효과로서, 세포사멸(Apoptosis; BA) 및 세포 증식(Proliferation; BP)이 하기 명목형 네트워크에 의해 계산되었다.

또는

는 각각 각 노드로부터 세포사멸 또는 세포 증식 노드까지의 모든 경로의 길이의 집합을 나타낸다.

또는

세트의 경로 길이는 대응하는 출력 노드에 대해 각각 양 또는 음의 부호를 갖는다. 결과적으로, 짧은 양의 경로가 풍부한 노드는 우회 신호전달 효과에 대해 높은 값을 가진다. 노드 간 평균 최단 경로 길이인 대장암(CRC) 신호전달 네트워크의 특징적인 경로 길이가 3.989로 계산되었으므로, l=8을 고려가능한 최장 경로 길이로 사용하였다. 점수는 다음과 같이 계산되었다.

θ은 음수 또는 양수 인수에 대한 값이 각각 0 또는 1인 헤비사이드 계단 함수(Heaviside step function)을 의미한다. 병용 표적의 후보로서 양의 AC만을 가진 노드를 고려하기 위해 θ(AC)를 곱했다.

3-2. 적응 내성을 극복하기 위한 병용 약물 표적의 발굴

HCT116 네트워크에서 MEKi 시뮬레이션 및 HT29 네트워크에서 BRAFi 시뮬레이션을 수행한 결과, EGFR 및 IGFR과 같은 상류 노드가 효과적인 표적으로 확인되었다. 그러나, 두 세포주 모두에서 MAPK 경로 억제제에 대한 적응 내성을 극복할 수 있는 가장 효과적인 표적 후보는 SRC인 것으로 확인되었다(도 6의 b). 또한, 동일한 방법으로 총 37개의 세포주 특이적 신호전달 네트워크에 대하여 시뮬레이션을 수행한 결과, 다수 대장암 세포주에서 MAPK 경로 억제제와 조합하여 표적할 수 있는 최적의 후보는 마찬가지로 SRC임을 확인하였다(데이터는 나타내지 않음).

본 발명에 따른 네트워크 모델에서, SRC는 MAPK 경로와 복잡한 상호작용을 한다(도 6의 c). 예를 들어, SRC는 상류 수용체들과 함께 MAPK 경로 억제제 처리 후 증가되는 양성 피드백에 참여하기 때문에, 상류 신호전달의 적응적 활성화를 강화할 수 있다. 또한, 활성화된 SRC는 RAF와 상호 연관되어 MAPK 경로를 직접적으로 자극함으로써 경로 재활성화를 유도할 수 있고, 다른 세포 생존 경로를 통해 우회 경로를 활성화시켜 궁극적으로 약물 내성을 발생시킬 수 있다. 이에 본 발명자들은 SRC가 MAPK 경로 억제제에 대한 적응 내성을 조절하는 핵심적인 역할을 할 것이라 보고, ERK 및 출력 노드의 활성에 대한 약물 조합의 효과, 세포 증식 및 세포사멸을 평가하고 이를 단일 약물 처리시의 효과와 비교하여 대장암 신호전달 네트워크에서의 약물 조합의 효과를 확인하였다. 그 결과, SRC 저해제(SRCi) 및 MAPK 경로 억제제의 병용 처리는 MAPK 경로 활성의 억제에 효과적일 뿐만 아니라 세포 증식을 감소시키고 세포사멸을 증가시킴을 확인하였다(도 6의 d). 상기 결과를 통해, SRC 저해제는 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 가진 대장암 세포주에서 각각 MEK 저해제 또는 BRAF 저해제의 반응성을 증가시킬 수 있을 것으로 생각되었다.

실시예 4. SRC 저해제 및 MAPK 경로 억제제 병용에 따른 효과 확인

SRC 저해제 및 MAPK 경로 억제제의 약물 조합이 MAPK 경로 억제제에 대한 약물 내성을 극복할 수 있는지 확인하기 위해, 본 발명에 따른 신호전달 네트워크의 시뮬레이션을 수행하고 세포주를 사용하여 in vitro에서 수준에서 이를 검증하였다.

4-1. 대장암 세포주에 대한 병용 효과 확인

KRAS G13D 및 PI3K H1047R 돌연변이를 갖는 HCT116 네트워크의 시뮬레이션 수행 결과, SRC 저해제와 MEK 저해제의 병용 처리가 효과적임을 확인하였으며(도 7의 a), 이를 세포 실험을 통해 검증하였다. 구체적으로, 세포들을 트라메티닙(MEK 저해제; MEKi) 단독, 다사티닙(SRC 저해제; SRCi) 단독 또는 이들의 조합에 대하여 3일 동안 노출시키고, 세포 컨플루언스(confluence), 생존능(viability), 콜로니 형성(colony formation), ERK 및 SRC 활성 및 세포사멸 정도를 확인하였다. 그 결과, 트라메티닙과 다사티닙의 병용 처리는 HCT116 세포 생존을 억제함에 있어 시너지 효과를 나타내고(도 7의 b, c), 크리스탈 바이올렛 분석 및 위상차 현미경을 이용한 세포 분석에서도 동일한 상승적 억제 효과가 나타남을 확인하였다(도 7의 d). 한편, HCT116 세포는 트라메티닙 단독 처리 후 1시간 동안 pERK의 일시적 감소를 나타내다가 24시간 후 pERK 활성이 회복되었고, 다사티닙 단독 처리 시 pERK 활성에 거의 영향이 없었던 반면, 트라메티닙과 다사티닙을 병용 처리하는 경우에는 pERK 활성이 감소됨은 물론 24시간 후 ERK 재활성도 제한됨을 확인하였다. BCL2 발현의 감소는 트라메티닙 단독, 다사티닙 단독 및 상기 두 종류 약물의 병용 처리 시 HCT116 세포의 세포사멸을 의미한다(도 7의 e).

동일한 시뮬레이션을 SW620 네트워크에서 수행한 결과, 상기 네트워크에서도 SRC 저해제와 MEK 저해제의 병용 처리가 효과적임을 확인하였으며(도 7의 f), 마찬가지로 이를 세포 실험을 통해 검증하였다. 그 결과, SRC 저해제 단독 처리에 따른 세포생존에 대한 억제 효과는 HCT116과 비교하여 다소 낮았지만(도 7의 g, h), HCT116 세포와 마찬가지로 트라메티닙과 다사티닙을 병용 처리하는 경우에는 세포 생존을 현저히 감소시킴을 확인하였다(도 7의 g 내지 i).

SRC 저해제와 MEK 저해제의 병용 처리에 따른 시너지 효과가 MAPK 경로의 다른 지점에 돌연변이를 가진 세포에서도 나타나는지, 상기 돌연변이된 노드를 표적으로 하는 약물 처리시에도 나타나는지 확인하기 위해, BRAF V600E 돌연변이를 가진 HT29 세포에 SRC 저해제 및 BRAF 저해제를 병용처리하여 동일한 실험을 수행하였다.

먼저, 본 발명에 따른 시뮬레이션을 HT29 네트워크에서 수행한 결과, SRC 저해제와 BRAF 저해제의 병용 처리는 효과적일 것으로 확인되었다(도 8의 a). 다음으로, 세포를 베무라페닙 또는 AZ628 단독, 다사티닙 단독(10 nM, 0.1 μM 및 1 μM) 또는 이들의 조합에 대하여 5일 동안 노출시키고, 세포 컨플루언스, 생존능, 콜로니 형성, ERK 및 SRC 활성 및 세포사멸 정도를 확인하였다. 그 결과, 가장 낮은 농도의 다사티닙 단독 처리는 세포 생존능에 큰 영향을 미치지 않았지만, 베무라페닙 또는 AZ628과 조합되면 생존능은 현저히 감소됨을 확인하였다(도 8의 b, c). 크리스탈 바이올렛 분석 및 위상차 현미경을 이용한 세포 분석에서도 HT29 세포에서 베무라페닙 또는 AZ628과 다사티닙의 병용 처리는 세포 생존능 억제에 대해 시너지 효과를 나타냄이 확인되었다(도 8의 d). 또한, 웨스턴 블롯 결과 베무라페닙과 다사티닙의 병용 처리에 따라 pro-caspase3 발현이 현저히 낮아짐을 통해 세포사멸이 증가함을 확인하였다(도 8의 e). 상기 결과를 통해, MAPK 경로 억제제 단독 처리는 KRAS 또는 BRAF 돌연변이를 갖는 대장암 세포에서 경로 재활성화 및 적응 내성을 유발하였지만, MAPK 경로 억제제와 함께 SRC 저해제의 병용 처리시에는 적응 내성이 억제되고, MAPK 경로 억제제의 세포 독성 효과에 대한 세포 반응성이 증가됨을 확인하였다.

4-2. 다른 암종에서의 병용 효과 확인

본 발명에 따른 시뮬레이션 결과 및 상기 실시예 4-2의 실험 결과를 통해, SRC와 같이 적응 내성에 핵심적 역할을 수행하는 노드를 표적으로 하면, 적응 내성을 극복함으로써 발암(oncogenic) 신호전달 경로 내에서 분자를 표적하는 약물의 효능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다(도 9의 a). 한편, MAPK 신호전달경로는 대장암 외에도 다양한 암에 포함된다. 이에, 본 발명자들은 SRC 저해제 및 MAPK 경로 억제제의 약물 조합이 대장암 외에, MAPK 신호전달경로에 의존하는 다른 암종의 세포주에서도 MAPK 경로 억제제에 대한 약물 내성을 극복할 수 있는지 확인하였다.

구체적으로, KRAS 돌연변이를 갖는 폐암 세포주 및 KRAS, BRAF 돌연변이를 갖는 삼중음성유방암(triple negative breast cancer) 세포주에 대하여 MAPK 경로 억제제 및 SRC 저해제를 병용 처리하여 약물 조합에 따른 효과를 확인하였다. 그 결과, MEK 저해제 및 SRC 저해제는 단독 처리시에도 세포 생존능을 감소시켰지만, 병용 처리 시 SW1573(KRAS G12C) 및 A549(KRAS G12S) 폐암 세포주의 생존능을 현저히 감소시킴을 확인하였다(도 9의 b 내지 d). 비슷하게, MEK 저해제 및 SRC 저해제의 병용 처리는 MDA-MB-231(KRAS G13D, BRAF G464V) 삼중음성유방암 세포주의 세포 생존능을 현저히 감소시켰다(도 9의 e 내지 g). 상기 결과를 통해, MAPK 경로 억제제 및 SRC 저해제의 조합으로 폐암, 유방암과 같은 다른 암세포에서도 약물에 대한 적응 내성을 극복할 수 있고, 따라서 MAPK 신호전달경로에 이상이 있는 암 환자에게 효과적인 치료방법 제공할 수 있음을 확인하였다.

실시예 5. SRC 저해제 및 PI3K 경로 억제제 병용에 따른 효과 확인

SRC는 양성 피드백 루프를 가진 다른 수용체 타이로신 키나아제 경로(receptor tyrosine kinase pathway), 특히 PI3K 경로를 자극하는 경로에 대해서도 조절 노드로 작용하며, 이와 같은 네트워크는 도 9의 a에 나타낸 것과 동일한 피드백 구조로 모델링될 수 있다.

이에, 본 발명자들은 SRC가 동일한 피드백 구조를 가진 다른 신호전달 네트워크에서도 병용 약물 표적으로서 일반적으로 적용될 수 있는지 확인하고자 하였다. PI3K 신호전달경로는 다양한 암의 증식 및 생존에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 다양한 표적항암제가 PI3K 신호전달경로를 표적으로 한다. MAPK 경로에서와 유사하게, SRC는 PI3K 신호전달경로의 상류 노드 및 하류 노드와 상호작용하며, 본 발명에 따른 네트워크 모델에서 우회 경로에 해당된다(도 10의 a). KRAS 및 PI3K 돌연변이를 갖는 HCT116 세포에 BYL719 또는 BEZ-235(PI3K 억제제; PI3Ki) 및 다사티닙(SRCi)을 병용 처리하고 6일 후 세포 생존능을 확인한 결과, PI3K 억제제 및 SRC 저해제의 병용 처리 시 세포 생존능이 현저히 감소하고(도 10의 b, d), HCT116 세포의 세포사멸이 유도됨을 확인하였다(도 10의 c). 상기 결과를 통해, 도 9의 a에 나타낸 것과 같은 피드백 및 조절 네트워크 구조를 가진 발암 신호전달 경로 내에서, 적응-매개 중심(resistance-mediating hub)으로 작용하는 노드는 약물 적응 내성을 극복할 수 있게 하는 효과적인 병용 약물 표적이 될 수 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 상기 실험을 통해 추가적인 SRC 저해제의 병용 투여는 시너지 효과를 통하여 표적항암제의 적응 내성을 극복하고 이의 항암 효과를 증대시킬 수 있음을 확인하였다. 특히, MAPK 경로 억제제와 SRC 저해제는 MAPK 신호전달 경로에 유전적 변이가 있는 대장암, 유방암, 폐암 세포주에서 모두 시너지 효과를 나타내어 SRC 저해제를 조합하는 치료법이 여러 암종에서 효과적인 전략이 될 수 있음을 확인하였다. 뿐만 아니라, SRC 저해제와 PI3K 경로 억제제의 병용 처리 역시 표적항암제에 대한 저항성을 극복하고 항암 효과를 증가시킬 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명에 따른 SRC 저해제는 약제 내성을 일으키는 피드백 구조를 갖는 발암 신호전달 네트워크에서 병용 약물로 사용되어, 기존 표적항암제의 약제 내성을 극복하고 암환자의 표적항암제에 대한 치료 적중률을 높일 수 있을 것으로 기대된다.

비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.

Claims

SRC 저해제를 포함하는 항암제 내성 억제 또는 개선용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 SRC 저해제는 항암제와 동시 또는 순차적으로 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항에 있어서, 상기 항암제는 트라메티닙(Trametinib), 베무라페닙(vemurafenib), 알페리십(alpelisib), 닥톨리십(dactolisib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 라파티닙(Lapatinib), 수니티닙(Sunitinib), 소라페닙(Sorafenib), 크리조티닙(Crizotinib), 다브라페닙(Dabrafenib), 트라스투주맙(Trastuzumab), 세툭시맙(Cetuximab), 베바시주맙(Bevacizumab), 파니투무맙(Panitumumab), 이필리무맙(Ipilimumab), 퍼투주맙(Pertuzumab), 토파시티닙(Tofacitinib), 이마티닙(Imatinib), 보르테조밉(Bortezomib), 오파투무맙(Ofatumumab) 및 알렘투주맙(Alemtuzumab)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 표적 치료제인 것을 특징으로 하는, 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 항암 보조제.
SRC 저해제 및 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 암은 대장암, 유방암, 폐암, 위암, 전립선암, 갑상선암, 결장직장암, 흑색종, 두경부암, 피부암, 췌장암, 난소암, 방광암, 간암 및 신장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
SRC 저해제 및 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase) 신호전달경로 억제제를 포함하는 암의 예방 또는 치료를 위한 병용 투여용 약학적 조성물.
SRC 단백질 또는 SRC 단백질을 코딩하는 유전자에 후보물질을 처리하는 단계; 및
상기 SRC 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준이 후보물질 처리 전보다 감소하는 경우 상기 후보물질은 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선 활성이 있는 것으로 판정하는 단계; 를 포함하는 항암제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제의 스크리닝 방법.