KR20210031901A - 응집체의 제거 - Google Patents

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KR20210031901A
KR20210031901A KR1020217000916A KR20217000916A KR20210031901A KR 20210031901 A KR20210031901 A KR 20210031901A KR 1020217000916 A KR1020217000916 A KR 1020217000916A KR 20217000916 A KR20217000916 A KR 20217000916A KR 20210031901 A KR20210031901 A KR 20210031901A
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스티븐 록맨
제씨 보들
낸시 구쪼-페르넬
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세퀴러스 피티와이 리미티드
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Abstract

본 개시는 인플루엔자 단백질을 포함하는 제제에서 응집된 물질을 분산시키는 방법을 제공한다. 그 방법은 제제에 초음파처리를 적용하는 단계를 포함한다.

Description

응집체의 제거
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 7월 10일에 "응집체의 제거"란 제목으로 출원된 오스트레일리아 출원 번호 2018902497호로부터의 우선권을 주장한다. 그 출원의 전체 내용은 본원에 참조로 포함된다.
기술분야
본 개시는 인플루엔자 항원을 포함하는 제제(preparation)에 응집체를 분산시키는 방법 및 특히, 인플루엔자 백신의 제조에서의 이 방법의 용도에 관한 것이다.
인플루엔자 백신은 감염을 예방하기 위한 가장 효과적인 방법으로 간주된다. 첫 번째 인플루엔자 백신은 전체 바이러스 제제였다 [1]. 비활성화된 3가 및 4가 인플루엔자 백신 (각각 TIV 및 QIV)의 현재 제조 공정은 인플루엔자 바이러스의 화학적 파괴 또는 "분열"을 토대로 하며, 이것은 1960년대에 도입되었다 [2]. (계면활성제 또는 용매에 의한) 화학적 파괴는, 많은 경우에, 면역원성을 포함하지 않는 백신의 반응원성을 감소시키는 것으로 나타났다. 용매의 높은 휘발성으로 인해, 모든 상업적으로 이용 가능한 인플루엔자 백신은 계면활성제로 파괴되거나 분열된다. 그러나, 전체 비리온을 파괴하기 위해 사용된 계면활성제의 농도는 백신 내 허용되는 한계를 초과하고 따라서 허용되는 수준으로 제거되어야 한다.
계면활성제의 제거 결과는 바로, 결과적으로 분열된 비리온이 응집체 또는 응집된 물질을 발생한다는 것이다. 응집체의 발생은 스트레인 및 분열 과정에서 사용된 계면활성제의 수준/유형과 관련된다. 많은 경우에 백신 및 기타 제약학적 생성물은 잔류하는 계면활성제 또는 백신의 적절한 품질 속성을 유지하기 위한 추가적인 계면활성제/화학물질을 함유한다. 그러나, 계면활성제의 존재는 오랫동안, 특히 백신접종의 맥락에서, 항원을 보다 가용성으로 만들어 면역원성의 감소 및 그로 인해 백신의 유효성의 감소를 강화시키는 것으로 확립되어 왔다.
본 개시는 인플루엔자 단백질 또는 바이러스를 포함하는 제제에 응집된 물질을 분산시키는 방법을 제공하며, 그 방법은 제제에 초음파처리를 적용하는 단계를 포함한다.
본 개시는 또한 인플루엔자 백신의 제조 방법을 제공하며, 그 방법은 비활성화된 또는 분열된 인플루엔자 비리온을 포함하는 제제를 제조하는 단계 및 그 제제를 초음파처리하는 단계를 포함한다.
도 1은 A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/California/07/2009 (H1N1) 및 B/Hubei-Wujiagang/158/158/2009 (B Yamagata)의 스트레인의 인플루엔자 바이러스 백신 (IVV) IVV 약물 매트릭스에 대한 광학 밀도 탁도 (ODT)의 반복성을 도시한다.
도 2는 ODT 분석에 의한, H3N2 A/Victoria/361/2011 IVV 약물 매트릭스의 분산에 미치는, 전달된 에너지의 양 (줄(Joules)/mL) 및 열 (37℃, 30분)과 관련하여 초음파처리의 영향을 도시한다.
도 3은 ODT 분석에 의한, H3N2 A/Victoria/361/2011 IVV 약물 매트릭스의 분산에 미치는, 에너지 입력 (진폭)의 세기와 관련하여 초음파처리의 영향을 도시한다.
도 4는 미처리 및 PS80-처리된 샘플과 비교하여, 초음파처리가 응집체를 효과적으로 분산시키고 시간 경과에 따라 H3N2 A/Victoria/210/2009 IVV 약물 매트릭스의 분산된 상태를 유지하는 것을 입증하는 ODT 결과를 도시한다.
도 5는 24주 동안 DLS에 의해 분석된, A/Victoria/210/2009의 (A) 미처리, (B) PS80-처리 및 (C) 초음파처리된 H3N2 IVV 약물 매트릭스의 평균 세기 입자 크기 분포 (PSD) (n=5)를 도시한다.
도 6은 24주 동안 미처리, 계면활성제 (PS80)-처리된 및 초음파처리된 IVV 약물 매트릭스 (H3N2; A/Victoria/210/2009)의 단일 방사상 면역확산 (SRID) 분석을 도시한다.
도 7은 IVV 약물 매트릭스 (MPH), 초음파처리 후 IVV 약물 매트릭스 (초음파처리된 MPH) 및 폴리소르베이트 80 (MPH + PS80)의 존재 하의 IVV 약물 매트릭스를 나타내는 EM 현미경사진을 도시한다. 모든 샘플은 EM에 의해 0, 1, 2 및 6개월 시점에 분석되었다.
도 8은 0, 3 및 6개월 시점에 초음파처리 (Son) 전 및 후의, 인플루엔자의 4개의 계절성 스트레인 (A/Victoria/361/2011 (H3N2), A/California/7/2009 (H1N1), B/Hubei-Wujiagang/158/2009 (B Yamagata) 및 B/Brisbane/60/2008 (B Victoria))에 대한 ODT 결과를 도시한다.
도 9는 6개월 동안 DLS에 의해 분석된, A/Victoria/361/2011 (A, B), A/California/7/2009 (C, D), B/Hubei-Wujiagang/158/2009 (E, F) 및 B/Brisbane/60/2008 (G, H)에 대한 미처리 (좌측) 및 초음파처리된 (우측) IVV 약물 매트릭스 물질의 평균 입자 크기 분포 (PSD)(n=5)를 도시한다.
도 10은 60, 500 및 1000 ml의 다양한 IVV 약물 매트릭스 배치 부피에 대해, ODT ≥ 80%에 상응하는 IVV 약물 매트릭스 배치 부피 (MPH 부피 mL)에 대한 초음파처리 노출 시간 (분)을 도시한다.
도 11은 60, 500 및 1000 ml의 다양한 IVV 약물 매트릭스 배치 부피에 대해, ODT ≥ 80%에 상응하는 처리 시간에 대한 초음파처리 에너지 입력을 도시한다.
도 12는 IVV 약물 매트릭스의 배치 부피 (60, 500 및 1000 ml)에 대비한 흐름 관통 장치를 사용하여, ODT ≥ 80%를 이루기 위해 필요한 초음파처리 에너지 입력을 도시한다.
도 13은 IVV 약물 매트릭스의 응집량 (% ODT로 표시됨)과 HA 분자 상에 존재하는 글리코실화 부위의 예측된 수 사이의 선형 관계를 도시한다.
본 개시는 인플루엔자 바이러스 백신 (IVV) 약물 물질 또는 IVV 약물 생성물에 응집된 물질을 효과적으로 분산시키기 위한 초음파처리 방법의 사용을 기술하며, 이것은 이하 IVV 약물 매트릭스로 언급될 것이다. 초음파처리의 실행가능성은 인플루엔자 바이러스의 H3N2 스트레인에 대해 평가되었는데, 인플루엔자 A의 이 하위스트레인이 비-3N2 스트레인 및 B 인플루엔자에 비교하여 최대 응집 수준을 나타내기 때문이다.
개시의 한 예는, 단백질 응집의 억제가 보통 양립할 수 있는 부형제(들)의 제형(formulation)에의 첨가에 의해 이루어지기 때문에 이전에 볼 수 없었던 접근법을 제공한다. 예를 들어, 당, 폴리올, 아미노산, 염, 중합체 및 계면활성제와 같은 부형제가 증가된 용매 점도 [Jacob and Schmid (1999)] 뿐만 아니라 우선적인 상호작용에 의해 [(Arakawa et al (1991); Timasheff (1998)], 단백질 접힘의 증가된 속도에 의해 [Wang et al (1995); Frye and Royer (1997)], 용매 접근성 및 형태 이동성의 감소에 의해 [Kendrick et al (1997)] 응집체를 안정화시키는 것으로 나타났다.
본 개시는 백신의 면역원성에 유해하게 영향을 미칠 수 있고 백신을 받는 개체에서 원치 않는 부작용을 유발할 수 있는 이들 첨가제에 대한 필요성을 피할 수 있다.
한 예에서, 개시는 인플루엔자 단백질을 포함하는 제제에서 응집된 물질을 분산시키는 방법을 제공하며, 그 방법은 제제에 초음파 처리를 적용하는 단계를 포함한다.
다른 예에서, 개시는 인플루엔자 백신을 제조하는 방법을 제공하며, 그 방법은 비활성화된 또는 분열된 인플루엔자 비리온을 포함하는 제제를 제조하는 단계 및 그 제제를 초음파처리하는 단계를 포함한다.
초음파처리를 위한 제제는 전체 비리온, 분열된 비리온, 하위유닛 백신 또는 재조합 백신일 수 있다. 제제의 멸균을 위한 여과를 용이하게 하기 위하여 응집체의 백분율이 최종 제제 중의 10% 미만인 것이 바람직하다.
예에서, 제제는 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함한다, 예를 들어, 제제는 분열된 인플루엔자 비리온을 포함한다. 한 예에서, 제제는 계면활성제가 실질적으로 없다. 본원에서 사용되는 바, 구절 "계면활성제가 실질적으로 없다"는 0.02% 미만의 수준을 가지는 것을 의미한다. 예를 들어, 계면활성제의 수준은 200 ppm 미만이다. 추가의 예에서, 계면활성제의 수준은 50 ppm 미만이다.
전형적으로 초음파처리는 제제에 존재하는 응집체의 적어도 50%가 분산되도록 하는 시간 동안 그런 세기에서 수행된다. 응집체 파괴를 위해 생성된 초음파처리 에너지는 표적 IVV 약물 매트릭스에 다음의 3가지 방법 중 하나에 의해 전달될 수 있다: (1) 에너지는 IVV 약물 매트릭스에 현탁된 초음파 발생기 프로브를 통해 직접 전달되거나, (2) IVV 약물 매트릭스는 흐름 관통 장치에 동봉된 초음파 발생기의 프로브 팁의 진동 팁을 가로질러 통과하거나 또는 (3) IVV 약물 매트릭스 가 통과하는 곳인 금속 또는 유리 튜브를 통한 간접 에너지 전달. 모든 초음파처리 방법은 IVV 약물 매트릭스 내에 응집체의 적어도 50%를 분산시키기 위해 적어도 89 줄/mL의 에너지의 전달을 필요로 한다.
본 개시의 방법에 의해 제조된 백신은 1가 계절형 백신 또는 1가 유행성 백신일 수 있다. 다른 예에서, 본 개시의 백신은 3가 및 4가 백신과 같은 다가 백신이다.
본 개시의 방법에 의해 제조된 백신은 전형적으로 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 항원을 포함하고, 예를 들어, 응집된 물질이 실질적으로 없다. 한 예에서, 구절 "응집된 물질이 실질적으로 없다"는 물질의 50% 이상 (약 90 줄/mL 초음파처리)가 응집되지 않는 것을 의미한다. 추가의 예에서, 물질의 적어도 60% (약 134 줄/mL 초음파처리), 70% (약 178 줄/mL 초음파처리) 또는 80% (약 223 줄/mL 초음파처리)가 응집되지 않는다. 또 다른 예에서, 물질의 적어도 90% (약 267 줄/mL 초음파처리)가 응집되지 않는다.
하기에서 기술되는 것과 같이 본 개시의 방법은 다수의 예상치 못했던 장점을 제공한다. 첫째로, 방법은 인플루엔자 항원 제제에 존재하는 응집체를 분산시키는 데 매우 효율적이다. 놀랍게도 이들 분산된 응집체는 연장된 보관 (4℃) 기간에도 불구하고 재응집되지 않는다. 추가로 본 개시의 방법을 사용하여 제조된 백신은 페렛 모델에서 동일하지만 처리되지 않았거나 응집체를 분산시키기 위해 첨가제로 처리된 항원을 포함하는 백신보다 더 강력한 면역 반응을 유도할 수 있었던 것으로 나타났다.
본 명세서를 통해서, 맥락이 다른 것을 필요로 하지 않는 한, 단어 "포함하다", 또는 "포함하는"과 같은 변용은 임의의 다른 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹을 배제하는 것이 아니라 언급된 요소 또는 정수 또는 요소 또는 정수의 그룹의 포함을 함축하는 것임이 이해될 것이다.
본 명세서에서 임의의 선행 출판물 (또는 그것으로부터 유래된 정보), 또는 공지된 임의의 사안에 대한 언급은 이전의 출판물 (또는 그것으로부터 유래된 정보) 또는 공지된 사안이 본 명세서가 관련된 노력의 분야에서 공통된 일반적인 지식의 일부를 형성한다는 인정 또는 승인 또는 임의의 형태의 제안이 아니며, 그런 것으로서 취급되지 않아야 한다.
본 명세서에서 언급된 모든 출판물은 본원에 그 전문이 참조로 포함된다.
본 명세서에서 사용되는 바, "단수"를 나타내는 단어 형태는 맥락이 분명하게 다른 것을 표시하지 않는 한 복수의 형태를 포함한다. 그러므로, 예를 들어, "작용제"에 대한 언급은 단일한 작용제, 뿐만 아니라 둘 이상의 작용제를 포함하며; "분자"에 대한 언급은 단일 분자, 뿐만 아니라 둘 이상의 분자를 포함하는 식이다.
실시예
방법
VV 약물 매트릭스의 초음파처리
직접 프로브 초음파처리 방법
IVV 약물 매트릭스를 '직접' 초음파처리 방법을 사용하여 처리함으로써, 초음파 발생기 혼(horn)/프로브가 비이커 내에 함유된 샘플에 직접 침지된다.
Branson 모델 450 Sonifier® (Branson Ultrasonics)을 사용하여 초음파처리를 수행하고 동력 유닛, 모델 102C 변환기 및 0.5 인치 태핑된 혼을 포함한, 4개의 구성요소를 포함하였다.
초음파처리 과정의 효율을 평가하기 위하여, Bandelin SONOPULS 초음파 발생기 (Bandelin Electronic GmbH & Co. KG)를 사용하였다. 설정은 GM3200 Sonifier 동력 유닛, UW3200 변환기, SH213G 부스터 및 TT13 13 mm 티타늄 팁으로 구성되었다. IVV 약물 물질의 초음파처리를 Branson 초음파 발생기에 대해 기술된 방법대로 비이커에서 수행하였다.
IVV 약물 매트릭스 샘플을 10 ml 배치로 제조하여 깨끗한 30 ml 비이커에 넣고, 그것을 샘플 용액에 충분히 침지된 초음파 발생기 프로브로 클램프 스탠드 위에 고정시켰다 (즉 초음파 발생기 팁과 비이터 기저 사이의 거리는 대략 1 mm임). 그런 후 초음파처리를 수행하여 에너지 전달 속도 (진폭)를 다르게 하면서 다양한 에너지 입력을 전달하였다.
전달된 초음파처리 에너지의 범위를 의 밀리리터당 줄 (에너지)로서 측정하였고 0 줄/mL, 83 줄/mL, 165 줄/mL, 259 줄/mL, 345 줄/mL을 포함하였다.
샘플의 과열을 피하기 위하여, 초음파처리를 적어도 2개 부분에서 수행하였고 비이커는 처리 사이사이 짧게 얼음 상에 냉각되도록 놓아두었다. 최종 초음파처리된 IVV 약물 물질 샘플을 플라스틱 튜브에 옮기고 추가의 분석 전에 2-8℃에서 보관하였다.
흐름 관통 초음파처리 방법
초음파처리 과정의 확장성을 평가하기 위하여, 흐름 관통 장치가 장착된 Bandelin SONOPULS 초음파 발생기 (Bandelin Electronic GmbH & Co. KG)를 사용하였다. 설정은 GM3200 Sonifier 동력 유닛, UW3200 변환기, SH213G 부스터, TT13 13 mm 티타늄 팁 및 DG 4 G 흐름 관통 처리 용기로 구성되었다. IVV 약물 물질의 초음파처리를 520U 연동 펌프 (Watson & Marlow, Australia)에 의해 초음파 발생기의 흐름 관통 장치를 통해 순환시켰다.
응집된 물질의 측정
광학 밀도 탁도 (ODT) 검정
백신 중간체 생성물 IVV 약물 물질에서 비응집 물질의 정도를 평가하기 위하여, 보통의 원심분리력의 적용 후에 상층액의 A280 nm에서의 광학 밀도 (OD)를 사용하여 회수된 단백질의 수준을 측정하였다 (Tay et al : Investigation into alternate testing methodologies for characterization of influenza vaccine. Human Vaccine Immunotherapy 2015 11 (7) 1673-84). 원심분리 후 펠릿의 단백질의 비율은 샘플 내의 응집된 물질의 정도와 직접 상관이 있기 때문에, 상층액의 더 높은 회수율은 분산된 단백질의 더 큰 비율에 상응할 것이다. 이 검정은 광학 밀도 탁도 (ODT) 방법으로 명명되었다; 단백질 회수율 값은 0 내지 100% (본원에서 % ODT로서 표시됨)의 범위이며, 샘플 중의 분산된 단백질의 양에 따라 증가한다.
검정의 여러 속성을 H1N1; A/California/07/2009, H3N2; A/Victoria/361/2011 및 B; B/Hubei Wujiagang/158/158/2009를 포함한 3개의 인플루엔자 스트레인에 대해 평가하였다. 검증 결과는 (각각) 2.9, 3.1 및 3.1%의 반복성 (% CV), (각각) 8.8, 6.5 및 3.4%의 정확성 로트간 가변성 (% CV), (각각) 0.4%, 6.3% 및 0.2%의 중간 정확성, (각각) p= 0.81, 0.13 및 0.78의 통계학적으로 무의미한 작업자간 차이, 및 예상된 결과와 관찰된 결과 사이의 예측 가능한 선형성 (R=0.9685)을 입증하였다. 계절성 백신 하위유형: H1N1, H3N2 및 인플루엔자 B를 나타내는 IVV 약물 물질의 복제 로트에 대한 전형적인 % ODT 프로파일은 도 1에 상세하게 표시된다.
추가로 이 검정은 동적 광산란 (DLS) 및 비대칭 필드 흐름 분류 (A4F)를 포함한, 응집 특징의 대체 방법과 상관이 있었다. ODT 분석으로부터의 저수준의 변동은 이 검정이 중간 백신 물질의 응집의 평가에 매우 적합한 것을 나타냈다.
동적 광산란 (DLS)
DLS에 의한 입자 크기 분석을 샘플 내의 응집 특징을 추가로 이해하기 위하여 ODT 검정에 대한 보완 방법으로서 사용하였다. DLS 기법은 주변의 용매 분자와의 충돌로 인한 입자의 무작위 이동인, 용액 중의 단백질의 브라운 온동의 측정을 토대로 한다. 브라운 운동은 DLS에 의해 측정되는 산란광의 세기의 시간 의존적 변동을 유도하고 샘플에 대한 입자 크기 분포 (PSD)를 생성한다.
DLS 측정을 Malvern Zetasizer 나노 시리즈 ZS (Malvern Instruments Ltd)를 사용하여 수행하였다. 분석된 각 샘플의 밀도 (DA-100M 밀도계, Mettler Toledo), 점도 (Lovis 2000M 마이크로점도계, Anton Paar) 및 굴절률 (30GS Refractometer, Mettler Toledo)을 포함한, 용액 중의 입자의 브라운 운동에 영향을 미치는 여러 특성을 사전 측정하였다. 샘플의 사전 처리는 불안정하고 계속해서 분석을 간섭하는 큰 입자를 함유하는 임의의 외부 물질 또는 침전물을 제거하기 위한 8000 rpm에서의 1분 동안의 원심분리를 포함하였다. 그런 후 각 샘플의 결과적으로 생성된 상층액 구성요소를 뽑아서 DLS에 의해 평가하였다; 각 샘플 측정은 180°의 후방 산란각에서 수행되고 25℃의 온도로 3분 동안 보정된 5개의 복제물 (n=5)을 토대로 하였다.
인플루엔자 항원성 평가
단일 방사상 면역확산 (SRID)
SRID 검정을 이전에 기술된 것과 같이 수행하였다 [Williams et al, 1980]. 간단히 설명하면, 참조 및 테스트 항원 물질을 PBS-함유 1% 쯔비터이온 용액 (Calbiochem, Darmstadt, Germany)에 1:1, 2:3 및 1:3으로 희석하고, 다클론성 항혈청을 함유한 아가로스 겔의 이중 웰에 첨가하였다. 겔을 72시간 동안 가습실에서 인큐베이션하고, 유리 플레이트 상에서 건조시키고, 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 (Sigma, California, USA)으로 염색하였다. 항원-항체 침전의 원형 구역을 측정하고, HA 농도를 IZP 표준 (15)과 비교하여 평행선 생물학적 검정 방법에 의해 계산하였고, 테스트 타당성을 'g' 테스트를 사용하여 확인하였다 (g≤0.061)(16).
전자 현미경 (EM) 영상화
네거티브 염색 EM을 Hayat 및 Miller (1990)에 의해 채택된 아가 확산 여과 방법에 의해 수행하였다. 각 샘플의 3개의 그리드를 준비하였다; IVV 약물 물질을 인산염 완충 식염수 (PBS; pH 7.2)를 사용하여 1:50으로 희석하여 불연속 단층을 제공하였다. 샘플 (1 μL)을 포름바(formvar)-코팅된 구리 전자 현미경 그리드에 적용하고, 그런 후에 그것을 2% w/v 아가 플레이트 위로 뒤집어 놓았다. 그리드를 아가 플레이트 (즉 아가에 의해 흡수된 액체) 위로 놓으면, 그리드는 네거티브 염색 (2% w/v 포스포텅스텐산 나트륨, pH 7.0)의 방울 위로 떠 있다. 20초 후에, 그리드를 들어올리고 그리드의 모서리를 찢어진 Whatman No. 1 여과지의 작은 스트립과 접촉시킴으로써 과도한 염색을 제거하였다. 염색의 나머지 박막을 공기 건조시킨 후 전자 현미경에 의해 조사하였다.
결과
초음파처리에 의한 응집된 IVV 약물 매트릭스의 파괴
응집된 물질을 분산시키기 위한 가장 효과적인 방법을, 계면활성제 파괴 후 최대 수준의 응집된 물질을 형성하려는 경향으로 인해 인플루엔자의 H3N2 하위스트레인을 사용하여 측정하였다. 계면활성제 파괴 후 응집된 물질이 분산될 수 있었는지를 확립하기 위해 여러 방법을 평가하였다.
첫 번째 접근법은 초음파처리에 의한 고주파수 음파를 사용하여 응집체를 A/Victoria/361/2011, 하위유형 H3N2의 IVV 약물 물질 물질 내에 분산시키는 것을 포함하였다 (도 2). 에너지의 국지화되고 매우 강렬한 초음파가 프로브로부터 직접 샘플을 함유한 비이커에 전송될 수 있는 직접 초음파처리 방법을 사용하였다. 샘플 (10 ml 배치로 제조됨)에 83 줄/mL - 345 줄/mL의 범위의 초음파처리 입력 에너지의 범위를 적용하였고 분산 정도를 ODT 검정에 의해 평가하였다. 그 결과는 에너지 입력량과 분리된 응집체 수준 사이에 선형 관계, 즉 미처리 때의 40%와 비교하여 초음파처리 후 50% 내지 80%의 범위의 % ODT 값을 나타낸다 (도 2). 주목할만한 흥미로운 것은 분산 수준이 259 줄/mL에서 최대값에 도달하였고, 그것으로부터 더 이상의 분산의 증가가 관찰되지 않았다는 것이었다. 대조적으로, 약한 가열 및 IVV 약물 물질의 교반 (37℃에서 교반하면서 30분)은 분산된 물질의 수준을 변경시키지 못하였다.
노출 시간은 모든 샘플에 대해 0.70 s/ml로 유지하면서 초음파처리 진폭을 조정 (0 - 100%)함으로써 에너지가 IVV 약물 물질로 전송된 세기를 조사하였다. ODT 결과는 전달된 에너지의 양과 관련하여 이전에 볼 수 있었던 것과 같이 예측 가능한 경향을 나타냈고, 여기서 IVV 약물 물질에서의 분산 정도는 노출 시간을 일정하게 유지했을 때 초음파처리 진폭과 함께 증가하였다 (도 3). 초음파처리 에너지 전달의 최적 속도는 80% 진폭에서 이루어졌고, 그 이상에서는 응집체 분리 수준의 추가의 상승이 없었다. 이들 결과는 응집체 분리의 경우 80%가 최적 진폭 (즉 에너지 전달 속도)인 것을 시사한다.
IVV 약물 매트릭스 물질을 분산시키기 위한 초음파처리의 실행 가능성
허용되는 비활성화된 백신이 되기 위해서는 일관된 품질 속성이 필요하다. 즉, 만약 방법이 응집된 물질을 분산시키는 것으로 나타났다면 물질은 이런 특징을 보유하는 것이 중요하다.
계면활성제, 폴리소르베이트 80 (PS80)의 존재 및 부재 하에서 모두, H3N2 A/Victoria/210/2009의 IVV 약물 매트릭스에서 응집된 물질을 분산시키는 방법으로서 초음파처리의 실행 가능성을 평가하기 위하여 연구를 24주 동안 수행하였다. 샘플의 다양한 특징을 모니터링하기 위하여, 응집 평가를 위한 ODT 및 DLS, 항원성에 대한 단일 방사상 면역확산 (SRID) 및 형태 영상화를 위한 전자 현미경검사 (EM)를 포함한, 수많은 테스트를 사용하였다.
ODT 및 DLS에 의한 응집 거동
미처리된, 초음파처리된 및 PS80-처리된 IVV 약물 매트릭스의 응집 특징을 ODT 검정 및 DLS에 의해 평가하였다. ODT 분석은 초음파처리 (적어도 200 줄/mL) 후에, IVV 약물 매트릭스에서 분산된 물질의 수준이 비-초음파처리 물질 (시간 0)의 경우 40%와 비교하여 80%에 도달했음을 입증하였다 (도 4). 이런 분산 수준은 4℃에서 24주 동안 일관되게 유지되었고, 이것은 비가역적으로 분산된 상태를 나타낸다 (도 4). 추가로 이 시간 동안 대조군 (미처리) 물질의 분산 또는 추가의 응집의 증가는 없었다. 계면활성제 (0.1% PS80)의 첨가는 이 물질에서 초기 수준과 비교하여 응집체의 수준에 주지할만한 영향을 미치지 않았다. 그러므로, 이것은 IVV 약물 매트릭스 물질의 응집 수준이 계면활성제의 파괴 후에 설정된 것을 나타냈다.
ODT 검정과 함께, 샘플을 DLS에 의해 분석하여 추가로 응집의 특성을 확인하였다. 각 샘플에 대해, DLS 측정 (n=5)은 세기 입자 크기 분포 (PSD)를 생성하였고, 이것은 다양한 크기 집단에서 입자에 의해 산란된 빛의 상대적인 세기를 입증한다. DLS에 대한 결과는 3개의 샘플 전부에 대해 ODT의 그것과 밀접한 상관관계를 나타냈다 (도 5). 예를 들어, 미처리 및 PS80-처리된 IVV 약물 매트릭스 샘플은 60, 400 및 7000 ppm에서 제시된 피크를 가진 다중모드 PSD를 입증하였고 그로써 그 안의 응집을 나타냈다 (도 5A 및 B). 그러나, 초음파처리 치료는 300 nm에서 제시된 뚜렷한 단일 피크를 가지는 단일 모드의 분포를 유발하였고, 이것은 응집체가 없는 균일하고 잘 분산된 샘플을 시사한다 (도 5C). 분석의 각 시점에서, 모든 샘플은 재생 가능한 PSD를 생성하였고 추가로 24주 기간 동안 변화하지 않은 채로 유지하였다.
SRID 및 EIA에 의한 항원성
항원성 물질의 수준을 SRID에 의해 평가하여 초음파처리 또는 계면활성제의 추가가 인플루엔자 항원에 영향을 미쳤는지의 여부를 측정하였다. SRID 분석은 물질이 초음파처리되었는지 또는 계면활성제의 존재 하에 테스트되었는지의 여부와 관계없이, 항원성 물질의 수준이 미처리된 샘플의 그것과 동일한 효능을 유지하였고 시간 경과에 따라 일정하였음을 나타냈다 (표 1, 도 6).
미처리, 계면활성제 (PS80)-처리된 및 초음파처리된 IVV 약물 매트릭스 (H3N2; A/Victoria/210/2009)의 시간 경과에 따른 SRID 결과.
효능 (μg HA/mL)
주 0
2 4 8 12 24
미처리 1451.5 1860.0 1829.2 1760.3 1934.4 1759.3
초음파처리된 1722.5 1657.5 1829.2 1559.1 1779.8 1670.8
PS80 1740.0 1710.6 1654.5 1578.8 1780.7 1749.8
EM에 의한 형태 영상화
EM에 의한 영상화를 사용하여 0, 1, 2 및 6개월 시점에서 샘플의 형태적 외관을 조사하였다 (도 7). 주지할만한 차이를 초음파처리된 IVV 약물 매트릭스 샘플과 대조군 IVV 약물 매트릭스 샘플 사이에서 관찰하였다. 대조군/미처리 IVV 약물 매트릭스 (PS80이 있거나 없음)는, 현미경사진에서 더 진한 영역으로 표시되는 바, 전체 6개월 기간 동안 상당량의 응집체를 함유하였다. 대조적으로, 초음파처리된 IVV 약물 매트릭스는 크기가 감소된 더 적은 수의 응집체를 함유하였고 물질의 외관은 조사된 기간 동안 일관되게 유지되었다. 이들 관찰은 ODT 및 DLS 분석 둘 다로부터 얻어진 결과를 반영하는 것으로, 초음파처리된 물질은 미처리되었거나 계면활성제 (PS80)를 포함한 IVV 약물 매트릭스보다 분명하게 더 분산되었다.
인플루엔자의 모든 계절성 스트레인에 대한 초음파처리의 적용 가능성
H3N2가 다른 계절성 스트레인에 비교하여 가장 큰 수준의 응집을 나타내는 한편 (도 1), 이 방법이 모든 스트레인의 응집체를 파괴할 수 있는 것을 입증하는 것이 필수적이다. 4개의 계절성 스트레인을 6개월의 기간 동안 초음파처리 (적어도 200 줄/mL) 전과 후의, 분산된 응집체 수준에 대해 조사하였다 (도 8). 조사된 모든 바이러스 제제에서, 초음파처리의 적용은 분산된 물질의 수준을 증가시켰고 이 물질은 6개월 기간 동안 분산을 유지하였다.
초음파처리 치료시 응집체 분산의 상승은 Yamagata 및 Victoria 계통으로부터 파생된 2개의 인플루엔자 B 바이러스와 비교하여, 인플루엔자 A의 2개의 하위스트레인, H3N2 및 H1N1에 대해 더 현저한 것으로 나타났다. 예를 들어, 분산된 물질의 수준은 B 스트레인에 대한 3-10% 증가와 비교하여 2개의 A 스트레인에 대해 대략 60-100% 증가하였다.
ODT 결과를 전부 4개의 인플루엔자 스트레인의 DLS 분석으로부터 얻어진 데이터에 의해 추가로 확인하였다. 0, 3 및 6개월째에 각 샘플에 대한 5개의 복제 측정으로부터 유래된 세기 PSD를 도 8에 도시한다. A/Victoria/361/2011의 미처리 샘플이 그것의 다중모드 프로파일로 인해 다양한 크기 집단의 응집체의 존재를 나타낸 반면 (도 9A), A/California/7/2009, B/Hubei-Wujiagang/158/2009 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 PSD는 더 많은 단일모드 구조를 가졌고, 따라서 입자의 보다 균일한 집단을 시사한다 (각각 도 9C, E, G). 초음파처리 후, 전부 4개의 스트레인은 임의의 응집체를 함유하지 않은 잘 분산된 IVV 약물 매트릭스의 특징적인 분포를 나타냈다 (도 9B, D, F, H).
초음파처리된 IVV 약물 매트릭스의 안정성 및 배치 일관성
4개의 백신 후보 유형/하위유형을 나타내는 IVV 약물 매트릭스를 초음파처리하여 목표 수준의 응집체 분산을 이루기 위해 제어된 수준의 에너지 (줄/mL)을 적용하는 것의 일관성 및 안정성 둘 다를 측정하였다 (표 2, 도 8). 각각의 대표적인 스트레인에 대한 IVV 약물 물질을 6개의 하위 분취액으로 나누었다. 6개의 분취액 중 3개를 적어도 200 줄/mL의 초음파처리에 독립적으로 노출시켰고 최대 6개월 동안 2-8℃에서 그것들의 초음파처리되지 않은 대조군 그룹과 함께 보관하였다. 샘플을 모든 그룹으로부터 0, 1, 3 및 6개월째에 취하여 ODT에 의해 존재하는 응집체 수준에 대해 분석하였다. 인플루엔자 A 스트레인 하위유형: A/California/07/2009 및 A/Victoria/361/2011 내에서 모든 하위-로트에 대한 초음파처리되지 않은 대조군과 비교했을 때 분산된 응집체의 수준의 상당한 변화를 초음파처리된 샘플에서 관찰하였다. 둘 다의 대표적인 인플루엔자 A 스트레인에 대해 독립적으로 초음파처리된 하위-로트 중에서 큰 일관성이 있었다. 시간 0에서 H1N1 및 H3N2 스트레인의 전부 3개의 하위-로트는 초음파처리 후에 목표 % ODT (>80%)를 충족하였고, % CV는 각각 2.1% 및 1.1%였고, 10% 한계 내에 있었다. B 스트레인을 나타내는 로트에서는 대조군 그룹에 이미 존재하는 저함량의 응집체로 인해 응집체 분산 수준의 더 적은 변화가 관찰되었다. 초음파처리 후 B 스트레인 하위-로트는 A 스트레인을 나타내는 로트와 동일한 수준의 배치 대 배치 일관성을 나타냈고, 시간 0일 때 B/Hubei Wujiagang/158/2009 및 B/Brisbane/60/2008에 대한 % CV는 각각 1.2% 및 0.7%였다. 중요하게 전부 4개의 계절성 인플루엔자 스트레인을 나타내는 하위-로트는 전체 6개월의 기간 동안 그것들의 상승된 % ODT 수준 및 배치 대 배치 일관성을 유지하였고, 이것은 초음파처리에 의한 응집체 파괴가 영구적인 것을 시사한다.
6개월의 기간 동안 초음파처리 전 및 후의 4개의 계절성 인플루엔자 스트레인: A/California/07/2009, A/Victoria/361/2011, B/Hubei Wujiagang/158/2009 및 B/Brisbane/60/2008을 나타내는 IVV 약물 매트릭스의 배치 (n=3).
　 　 개월
　 초음파처리 전 또는 후 0 1 3 6
A/California/07/09 (H1N1) 전 %ODT 60.4 59.4 58.2 62.2
후 %ODT 95.7 90.7 91.8 93.1
후 %CV 2.1% 3.0% 2.3% 1.5%
A/Victoria/361/11 (H3N2) 전 %ODT 41.9 43 43.4 46.2
후 %ODT 86.7 84.2 84.6 84.7
후 %CV 1.1% 1.2% 2.9% 5.1%
B/Hubei Wujiagang/158/09 (B YAM) 전 %ODT 88.1 90.6 93.3 91.7
후 %ODT 98.6 97.3 95.4 96.9
후 %CV 1.2% 5.0% 1.9% 3.8%
B/Brisbane/60/08 (B YAM) 전 %ODT 92.2 93.5 92.5 93.3
후 %ODT 95.4 96 96.5 98.3
후 %CV 0.7% 1.7% 2.0% 1.6%
HA 상의 예측된 글리코실화 부위의 수 및 필요한 초음파처리의 양에 대한 선형 관계.
외피가 있는 당단백질; 헤마글루티닌 (HA)은 그것이 숙주 세포와 도킹하고 엔도솜에 흡수된 후에 소화로부터 벗어나는 것을 가능하게 하는 인플루엔자 바이러스의 시알산 수용체-결합 단백질이다. HA 분자의 구형 헤드 영역은 항원성 부위와 중복되고 이들 항원성 부위의 항체 및 주요 조직적합성 복합체에 의한 결합으로부터의 차폐에 관여하는 것으로 여겨지는 N-결합 글리코실화 부위를 함유한다 (Skehel et al., 1984; Jackson et al., 1994). 더불어, N-글리칸의 구조적 복합성은 HA-수용체 결합 특이성과 양의 상관관계가 있다 (Tsuchia et al., 2002). HA의 구형 헤드 영역의 N-결합 글리코실화 부위의 수는 H1N1 및 H3N2 인간 인플루엔자 A 바이러스의 진화 중에 증가하였다 (Suzuki. 2011). 본 발명자들은 인플루엔자 A의 HA 분자 상의 예측된 글리코실화 부위의 수와 존재하는 응집 수준 사이의 관계를 측정하였다. 글리코실화 부위의 수는 NetNGlyc 1.0 서버 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 상에서 입수 가능한 알고리즘을 사용하여 확률 점수를 계산함으로써 예측할 수 있다. 확률 점수를 생성하기 위하여, 의문의 스트레인의 HA 단백질 서열을 알고리즘 제출 패널에 넣고 분석을 위해 제출한다. 소프트웨어는 도입된 서열 내에서, 가능성의 강도에 따라 1-3개의 플러스 (+) 기호로 채점한, 예측된 글리코실화 부위의 표를 작성한다. 예측된 HA 글리코실화 부위 확률 점수 (pGly 점수)는 주어진 출력 서열에 대한 플러스 기호의 합으로서 정의한다. 본 발명자들은 ≥ 16의 pGly 점수를 가지는 H3N2 스트레인은 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 하며 ≥ 11의 pGly 점수를 가지는 H1N1 스트레인은 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 한다 (물질의 50% 이상이 응집되지 않는 경우)고 제안한다.
인플루엔자 A의 HA1 분자 상의 예측된 글리코실화 부위의 수와 존재하는 응집 수준 사이의 관계.
스트레인 년도 % ODT 예측된 HA Glyc. 부위
(확률 점수)
H3N2
A/Hiroshima/52/05 2005 62 14
A/Wisconsin/67/05 2005 86 16
A/Brisbane/10/07 2007 44 17
A/Uruguay/716/07 2007 65 16
A/Wisconsin/15/09 2009 55.4 16
A/Victoria/210/09 2009 42.8 17
A/Victoria/361/11 2011 41.7 18
A/Texas/50/12 2012 33.3 18
A/South Australia/55/14 2014 33.6 17
A/New Caledonia/71/14 2014 28.5 17
A/Hong Kong/4801/14 2014 32.0 19
A/Singapore/INFIMH-16-0019/2016 2016 18.0 19
H1N1
A/California/07/09 2009 52.3 11
A/Singapore/GP1908/15 2015 24.7 12
IVV 약물 물질을 분산시키기 위한 대체 물리적 분산 방법
IVV 약물 매트릭스를 분산시키는 초음파처리의 독특한 능력을 평가하기 위하여, 다른 물리적 파괴 방법을 조사하였다. 이것은 국지화된 열 (1 및 10초 동안의 마이크로파) 및 전단력 (25 및 100 스트로크를 사용한 다운스(dounce) 균질화)을 포함하였다. 어느 경우든지 미처리 물질과 비교하여 분산에 주지할만한 차이는 없었다(표 4).
마이크로파 가열 및 전단력 다운스 균질화 후 A/Victoria/361/2011 IVV 약물 물질에 대한 ODT 결과.
% ODT 표준 편차 (±)
A/Victoria/361/2011 IVV 약물 물질; 미처리 (대조군) 38.1 0.1
마이크로파 가열
· 1초
· 10초
37.2
39.0
0.3
0.5
다운스 균질화
· 25 스트로크
· 100 스트로크
40.5
39.6
1.5
0.3
결론
직접 초음파처리 방법의 사용은 IVV 약물 매트릭스 내에서 응집체를 효과적으로 분산시키는 것으로 나타났다. 하위 유형: H3N2 내의 인플루엔자 스트레인은 최고 수준의 응집을 나타낸다. 과정의 최적화는 IVV 약물 매트릭스에 전달된 에너지의 양 및 전달이 발생하는 속도가 응집체 분산의 수준을 제어하는 데 필수적이었음을 나타냈다. 초음파처리의 속도 (진폭) 및/또는 노출 시간 (초)을 증가시키면 선형 경향과 상관이 있는 응집체 분리 수준의 증가를 초래하였다. 분산 수준의 안정기는 ODT가 97%에 도달했을 때 관찰되고 그 후에는 응집체거 거의 또는 더 이상 분산되지 않았다 (ODT에 의해 측정되는 바). IVV 약물 물질에서 응집체를 분산시키기 위한 방법으로서 초음파처리의 사용을 24주 (6개월)의 기간 동안 계면활성제 (PS80)의 존재 및 부재 하에서 모두 평가하였다. ODT, DLS 및 EM을 포함한 여러 특성화 분석은 초음파처리된 IVV 약물 매트릭스가 미처리 및 계면활성제-처리된 샘플과 비교하여 상당히 감소된 양의 분산된 물질을 함유한 것을 나타냈다. 응집체 분산의 목표 수준에 도달하기 위해 필요한 초음파처리의 양은 예측할 수 있었고 배치 간에 일관되었다. 추가로, 분산 수준은 실행 가능성 연구의 전체 기간 동안 일관되게 유지하였고, 따라서 안정적이고 영구적으로 응집체 분산된 상태를 나타낸다. SRID에 의한 면역학적 평가는 초음파처리나 계면활성제 처리 중 어느 것도 IVV 약물 매트릭스의 항원성을 손상시키지 않은 것을 확인시켜 주었다.
이 작업은 고도로 응집된 IVV 약물 매트릭스를 함유하는 인플루엔자 백신의 품질 속성을 개선시키기 위한 간단하고, 실제적이며 효과적인 접근법으로서의 초음파처리의 가치를 강력하게 예시하였다. 더불어, 이 방법은 또한 인플루엔자의 모든 계절성 스트레인에 적용할 수 있는 것으로 나타났다. 초음파처리 처치 후에, 증가된 수준의 분산된 물질이 H3N2, H1N1 및 Yamagata 및 Victoria 계통의 2개의 인플루엔자 B 스트레인에서 관찰되었고, 이것은 6개월 기간 동안 잘 유지되었다.
실험실 규모 연구조사를 위해 설계된 직접 초음파처리 방법에 대한 대안으로서, 연속적인 흐름 초음파처리 구성을 IVV 약물 매트릭스의 상업적 부피를 처리하기 위해 연구조사하였다. 간단히 설명하면, 초음파 발생기 유닛을 20 kHz에서 변환기와 결합된 고주파 발생기로 전원을 공급한다; 연결용 부스터 혼은 지정된 유량으로 일정하게 재순환되는 샘플을 함유하는 흐름 관통 장치 처리 용기에 의해 매입된다.
시스템의 확장성을 평가하기 위하여, 초음파처리 세기 (진폭) 및 생성물 재순환 유량을 포함한, 다양한 처리 파라미터의 영향을 조사하여 IVV 약물 물질 내에서 응집체 분산의 효율에 미치는 영향을 측정하였다. 120 ml/분의 초음파 발생기를 통과하는 일정한 재순환 유량 및 80%의 고정된 진폭을 사용하면, 배치 부피 (60, 500 및 1000 ml)와 80%의 ODT 한계값에 도달하기 위해 필요한 초음파처리 시간 (60분 동안) 사이에서 강력한 선형 상관관계를 관찰하였다 (R2=0.989). 이런 경향을 또한 초음파처리 에너지 (줄)과 시간 사이에서 (R2 ≥ 0.998), 따라서 초음파처리 에너지와 IVV 약물 매트릭스의 배치 부피 사이에서 관찰하였다 (R2=0.981, 표 5 및 도 10-12). 이 데이터는 개관된 초음파처리 과정이 IVV 약물 물질 배치 크기와 관련하여 확장될 수 있음을 시사한다. 추가로, 데이터는 적어도 300 줄/mL의 고정된 에너지 입력이, 이 시스템의 부피와 관계없이, ≥80%의 ODT 수준으로 응집체를 분리하기에 충분한 것을 시사한다.
다양한 배치 부피에 대해 흐름 관통 초음파 발생기에서 IVV 약물 매트릭스의 재순환 동안 ≥80%의 ODT를 이루기 위해 필요한 초음파처리 시간 및 에너지 입력 (80% 진폭; 120 ml/분 IVV 약물 매트릭스 유량).
IVV 약물 매트릭스 초음파처리 시간 (초e 에너지 입력 mL 당 에너지 ODT
(ml) (초) (줄) (줄/mL) (%)
60 150 18272 305 83
500 660 89354 179 82
1000 1500 222953 223 83
본 발명자들은 인플루엔자 A HA 분자 상의 예측된 글리코실화 부위의 수와 그 스트레인의 IVV 약물 매트릭스에서 발견된 응집도 사이의 선형 관계를 측정하였다 (도 13). 상관계수 값 (r 값)을 2005년과 2017년 사이에 제조된 12개의 H3N2 스트레인의 IVV 약물 매트릭스에 대한 예측된 글리코실화 부위와 응집도 사이의 관계에 대해 계산하였다. r 값은 0.75였고, 이것은 이들 두 속성에 대한 중간정도의 강력한 상관관계를 시사한다. 본 발명자들은 ≥ 16의 pGly 점수를 가지는 H3N2 스트레인이 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 하고 ≥ 11의 pGly 점수를 가지는 H1N1 스트레인이 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 한다고 제안한다.
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Claims (15)

  1. 인플루엔자 단백질을 포함하는 제제에서 응집된 물질을 분산시키는 방법으로서, 제제에 초음파처리를 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 제제는 인플루엔자 헤마글루티닌을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 제제는 분열된 인플루엔자 비리온을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 제제는 계면활성제가 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 초음파처리는 제제에 존재하는 응집체의 적어도 50%가 분산되도록 하는 시간 동안 그런 세기로 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 초음파처리는 80% 진폭의 속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 초음파처리는 적어도 90 줄/mL의 에너지를 전달하기 위해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, ≥16의 예측된 HA 글리코실화 부위 확률 점수 (pGly 점수)를 가지는 H3N2 스트레인은 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 하며 ≥ 11의 pGly 점수를 가지는 H1N1 스트레인은 ≥ 90 줄/mL의 초음파처리를 필요로 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 인플루엔자 백신을 제조하는 방법으로서, 비활성화된 또는 분열된 인플루엔자 비리온을 포함하는 제제를 제조하는 단계 및 그 제제를 초음파로 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 백신은 적어도 3개의 상이한 인플루엔자 스트레인을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제8항에 있어서, 백신은 1가 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제8항에 있어서, 백신은 4가 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제8항, 제9항 및 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 응집된 물질이 실질적으로 없는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 초음파처리는 80% 진폭의 속도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
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