KR20210024868A

KR20210024868A - 3d 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 및 그의 프린팅가능성 예측 방법

Info

Publication number: KR20210024868A
Application number: KR1020190104584A
Authority: KR
Inventors: 김상헌; 오승자
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2019-08-26
Filing date: 2019-08-26
Publication date: 2021-03-08
Also published as: KR102250268B1

Abstract

본 발명은 하기 수학식 1을 도출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 바이오 폴리머로 구성된 바이오잉크의 프린팅가능성을 평가하는 방법과, 수학식의 NV 값이 0.4 이상인 바이오잉크 조성물에 관한 것이다.

Description

3D 바이오프린팅을 위한 바이오잉크 및 그의 프린팅가능성 예측 방법{Bio ink for 3D bioprinting and method of predicting its printability}

3D 바이오프린팅을 위한 바이오잉크의 프린팅가능성 예측 방법 및 그의 이용에 관한 것이다.

3차원 프린팅은 복잡한 형상을 가진 조직(tissue)이나 장기(organ)의 의료 데이터로부터 얻은 임의 형상 정보를 G-code로 변환한 후 적층 공정(layer-by-layer process)을 통하여 복잡한 골격 구조를 구축하는 것을 말한다. 이러한 3차원 프링팅은 또한 '3차원 바이오 프린팅(three-dimensional bioprinting, 3D bioprinting)'으로도 지칭된다. 일반적으로 생체적합성 고분자 하이드로겔을 피스톤식 시린지 등을 이용하여 3차원 구조체를 제작한다.

'바이오 잉크(bio-ink)'는 살아있는 세포 혹은 바이오 분자를 포함하며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 통칭하는 용어이다. 따라서 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하여 주어야 한다. 바이오 잉크는 우선 우수한 세포 친화성을 가져야 한다. 인공 조직 및 장기 재생의 경우는 프린팅된 세포의 증식 및 분화에 유리한 생물학적 환경이 바이오 잉크로부터 주어져야 하는 것이다. 프린팅 공정이 길어질 때에는 카트리지 내에서 세포의 생존에 필요한 영양분과 산소의 공급이 적절히 이루어져야 한다. 또한 프린팅 과정에서 발생하는 물리적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있어야 한다. 그 외에도 바이오 잉크는 3차원 패터닝의 반복성, 생산성, 노즐의 막힘이 없어야 하는 등 프린팅 공정상에서 필요로 하는 물리적 성질을 가져야 한다. 이와 같이 살아 있는 세포를 이용하는 3D 바이오 프린팅 기술이 요구하는 잉크가 가져야 할 특성은 매우 다양하며 서로 복잡하게 얽혀 있다. 우수한 바이오 잉크 기술의 개발은 우수한 바이오 프린팅 기술 개발의 핵심이라 할 수 있다. 더불어 상기 바이오잉크의 프린팅가능성의 판단에 대해서는 연구가 미비한 실정이다.

바이오잉크의 구성으로 알려진 물질에는 하이드로겔이 있다. 하이드로겔은 친수성이 우수하여 물을 쉽게 흡수할 수 있을 뿐 아니라 강도, 모양 등을 쉽게 바꿀 수 있어 조직공학용 지지체 또는 약물전달 등에 사용되며, 친수성으로 인해 수용액 내 또는 수성환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있고, 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것이 특징이다.

FDA 가 승인한 바이오물질(biomaterials)에는 히알루론산, 피브린, 및 콜라겐 등이 있다. 일반적으로 상기 물질과 같은 자연의 바이오폴리머들은 아무 처리 없이는 3D 바이오 프린팅에 적용이 어려운 것으로 여겨져 왔다. 더불어 상기와 같은 자연적 물질의 경우, 특성이 미세구조, 구성 및 적용 공정과 같은 다양한 요인들에 의해 영향을 받기 때문에 유변학적 연구로 접근하여야 할 필요가 있으나, 이러한 연구는 미비하였다. 본 발명자들은 유변학적 특성을 분석하여 자연적 물질을 포함하는 바이오잉크를 도출하려는 시도를 하였다.

바이오잉크를 구성하는 요소들은 각자가 유변물성에 영향을 준다는 사실 것은 알려져 있으나, 각자의 요소가 구체적으로 어떻게 프린팅 가능성에 영향을 미치는지에 대한 연구는 미비한 실정이다. 따라서 현재 바이오 프린팅가능성 판단을 위해서는 바이오잉크의 조성을 결정한 다음, 실제 바이오잉크를 프린팅하여 판단하여야 하였다. 이러한 방식은 소재의 양, 노동, 시간 및 비용이 막대하게 소요되는 단점이 있다. 이러한 문제를 극복하기 위해, 본 발명에서 실제 프린팅 없이도 프린팅가능성을 예측할 수 있는 방법을 확인하였다.

일 양상은 하기 수학식 1을 도출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 바이오 폴리머로 구성된 바이오잉크 프린팅가능성 평가 방법을 제공한다.

<식 1>

NV = a + bC - cH - dF + (C - e)(C - e)f + (C - e)(H - g)h - (H - g)(H - g)i + (C - e)(F - j)k - (H -g)(F - j)l + (F - j)m

다른 양상은 상기 바이오잉크의 프린팅가능성을 평가하는 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.

다른 양상은 콜라겐, 히알루론산, 및 피브린을 포함하고, 상기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하인 것인 바이오잉크 조성물을 제공한다.

또 다른 양상은 콜라겐, 히알루론산 및 피브린을 상기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하가 되도록 혼합하는 단계를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조방법을 제공한다.

< 수학식 1>

상기 식에서, C는 콜라겐의 농도, F는 피브린의 농도, H는 히알루론산의 농도이며, 농도의 단위는 %w/v이다. a=0.4290567362, b=0.0051813811, c=0.001484911, d=0.037698223, e=6.210563158, f=0.0018163108, g=1.1842105263, h=0.0013134514, i=0.00722503, j=4.3157894737, k=0.0004778907, l=0.006967951, m=0.0018847494 이다. NV는 프린팅가능성을 나타내는 0과 1사이의 수치를 나타내는 것일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 수학식에 의한 NV 값이 0 내지 0.3인 경우 프린팅 가능성이 낮은 것으로 판단하고, 0.3 내지 0.5인 경우 프린팅 가능성이 보통인 것으로 판단하며, 0.5 내지 1.0인 경우 프린팅 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 NV 값은 높은 G(탄성) 값과 낮은 항복 응력 값을 가질수록 1에 가까워지는 것일 수 있다. NV값이 1에 가까울수록 프린팅가능성이 우수한 것으로 평가하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "바이오 잉크(bioinks)"는 바이오프린팅에 사용되는 하이드로겔 또는 하이드로겔과 세포의 혼합물을 의미할 수 있으며, 바이오 프린팅 기술에 응용하여 필요로 하는 구조물을 제작할 수 있는 소재를 총칭한다. 바이오 잉크는 3차원 가공을 위한 물리적 성질과 세포가 목적된 기능을 수행하게 하기 위한 생물학적 환경을 제공하며, 우수한 세포 친화성을 가지는 소재이다, 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 바이오 프린팅을 위한 것일 수 있다. 또한, 상기 바이오 잉크 조성물은 하이드로겔일 수 있으며, 콜라겐, 피브린, 피브리노겐, 트롬빈, 화학적 가교제를 포함할 수 있다. 더욱 상세하게는 상기 바이오 잉크 조성물은 피부 재생, 연조직 지지체, 또는 연조직 필러에 사용되는 것일 수 있다. 바이오 잉크 조성물에는 세포, 세포 배양액, 생리활성물질 및 첨가제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 함유될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "바이오프린팅(bioprinting)"이란, 자동화된, 컴퓨터 보조의, 삼차원 시제품화 장치(예, 바이오프린터)와 상용되는 방법론을 통해 삼차원의 정확한 세포 침착(예, 세포 용액, 세포 함유 겔, 세포 현탁액, 세포 농축물, 다세포 응집체, 다세포체 등)을 이용하는 것을 의미한다. 바이오 프린팅 발명은 연속 또는 실질적으로 연속일 수 있다. 연속 바이오 프린팅 방법의 비제한적 예는 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 연속 바이오 프린팅 방법은 기능 단위의 반복 패턴에서 바이오 잉크를 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 바이오프린팅은 3D 바이오프린팅일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "3D 바이오 프린팅(three-dimensional bio printing)"은 3D 프린팅을 이용해 인공 생체조직 및 장기를 만들어내는 것으로, 인체 조직에서 추출한 세포를 포함한 바이오 잉크를 3D 프린터에 넣고, 3차원 공간에서 세포 구조물을 만드는 것이다.

본 명세서에서 용어 "프린팅가능성(printability)"는 바이오프린팅, 또는 3D 바이오 프린팅의 시도에서 성공하는 가능성을 의미한다. 상기 가능성은 확률로 수치화될 수 있다. 예를 들어, 바이오 잉크의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip) (예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 바이오 잉크를 분사하는 경우, 노즐이 막혀 분사되지 않는 경우 프린팅이 실패하였으며, 사용된 바이오잉크의 프린팅가능성이 낮다고 평가할 수 있다. 프린팅가능성이 높은 잉크는, 노즐이 막히지 않으며, 세포와 융합력이 뛰어나고, 프린팅 이후에도 유지력이 뛰어난 것을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 수학식의 도출은 회귀분석 모델을 설계하는 단계 및 상기 회귀분석 모델을 이용하여 회귀분석을 실시하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

회귀분석 모델의 설계는 머신러닝을 통한 분석 방법이 포함될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 방법은 G' 값 압출 여부, 및 항복응력 값을 표준화하여 0과 1 사이의 값으로 변환하는 단계; 표준화된 값을 이용해 머신 러닝을 실시하는 단계; 및 머신러닝을 통해 G'와 형상 충실도(shape fidelity)와의 관계, 항복응력(Yield stress)와 압출(extrusion)의 관계를 도출하는 단계; 를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 회귀분석 모델의 설계는 바이오잉크가 높은 G'값 및 낮은 항복 응력(yield stress)를 갖도록 설계하는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "머신러닝(machine learning)"이란, 경험적 데이터를 기반으로 학습을 하고 예측을 수행하고 스스로의 성능을 향상시키는 시스템을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 머신러닝은 프린팅 가능성을 결정하는 요인들에 지배적으로 영향을 미치는 변수들이 무엇인지 파악하는 데에 이용될 수 있다. 프린팅가능성에 영향을 미치는 변수는 탄성력, 형상 충실도, 항복응력, 점도, 각 구성요소의 농도일 수 있다. 보다 구체적으로, 머신러닝을 통하면 형상 충실도의 결정은 84.6%가 탄성력에 의해서이고, 압출(extrusion)의 결정은 89.5%가 항복 응력에 의해서 일어날 수 있다.

본 명세서에서 용어 "회귀분석(regression analysis)"이란, 하나 이상의 독립변수의 종속변수에 대한 영향의 추정을 할 수 있도록 하는 통계기법이다. 예를 들어, 하나의 독립변수를 가지는 회귀분석의 경우 독립변수와 종속변수가 만나는 지점들의 분포 구성을 통해 회귀선을 구할 수 있다 상기 회귀선은 Y=a+bX+e 형태일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 각 바이오폴리머의 개별 농도와 상호간의 작용을 고려하여 다중 회귀 방정식을 유도하였다. 상기 바이오폴리머는 콜라겐, 하이드로겔, 및 피브린일 수 있다. 유도된 다중 회귀 방정식은 탄성과 항복 응력을 0과 1 사이에서 표준화한 것일 수 있다. 1에 가까울수록 바이오잉크가 높은 탄성값과 낮은 항복 응력을 가짐을 의미할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "항복 응력"이란, 유체가 흐르기 시작하고 모양이 변형되기 시작하는 시점의 응력을 의미하는 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 프린팅가능성에 밀접하게 연관되어 있는 요소로서 압출 여부를 결정하는 주요 요인일 수 있다.

상기 표준화 단계는 머신러닝 중 하나인 유도논리 프로그래밍(inductive logic programming) 을 통해 분석적으로 접근하여 각 변수들 간의 상관관계를 분석하는 것일 수 있다. 먼저 탄성(G')과 같은 변수는 낮음, 중간, 높음의 세 가지 단계로 구분하여 표시하고, 형상 충실도는 높고 낮음으로 표시하는 것일 수 있다. 방출된 경우는 1, 방출되지 않으면 0으로 표시하는 분류 단계를 거치는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 머신 러닝을 이용하여 탄성과 형상 충실도의 관계, 항복 응력과 압출의 관계를 도출하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 머신 러닝 결과 바이오잉크의 프린팅가능성을 결정하는 주요 요인은 형상 충실도와 압출 여부이며, 형상 충실도에 가장 많이 기여하는 변수는 탄성(G')이고, 압출에 가장 많이 기여하는 변수는 항복 응력일 수 있다. 결과적으로 바이오잉크의 성공적 프린팅을 위해서는 일정 이상의 탄성(G') 값과 일정 이하의 모양 충실도를 동시에 충족해야 하도록 설계하는 것일 수 있다. 예를 들어, 탄성력이 2000 내지 4000Pa이상, 항복 응력이 2000 내지 4000Pa이상인 경우 프린팅 가능성이 높을 수 있다. 바람직하게는 탄성력이 3000 내지 4000Pa이상, 항복 응력이 3000 내지 4000Pa이상인 경우 프린팅가능성이 높을 수 있다. 항복 응력이 지나치게 높은 경우 노즐 막힘을 유발하여 압출 실패가 일어날 수 있다. 상기 수치는 바이오프린터의 압력과 니들 직경에 따른 오차를 가질 수 있다. 상기 탄성력은 저장 탄성력일 수 있다(G').

상기 회귀분석의 실시는 머신러닝에 의해 도출된 G'와 형상 충실도의 관계를 기반으로, 다수의 변수들간의 관계를 도출한 것일 수 있으며, 다중회귀분석을 실시하는 것일 수 있다. 다중회귀분석은 Linear fitting 방법일 수 있다. 다중회귀분석은 탄성값와 형상 충실도의 값이 만나는 지점의 분포 구성을 파악하여 회귀선을 도출하는 것일 수 있다. 상기 회귀선의 R²값은 0.87일 수 있다. 다중회귀분석은 값의 비율을 정확하게 하기 위해서 가장 높은 값을 1로, 가장 낮은 값을 0으로 규정한 것일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 바이오폴리머(biopolymer)는 콜라겐, 아테로 콜라겐, 히알루론산, 피브리노겐, 트롬빈 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "바이오폴리머"란, 생물이 생산하는 고분자 물질로서 고분자 단백질, 핵산, 다당류 등이 포함될 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 바이오폴리머는 콜라겐, 아테로콜라겐, 히알루론산, 피브린일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "하이드로겔(hydrogel)"은 친수성 고분자가 공유 또는 비공유 결합으로 가교되어 만들어진 3차원 망상구조물을 의미할 수 있다. 구성 물질의 친수성으로 인해 수용액 내 및 수성 환경 하에서 많은 양의 물을 흡수하며 팽윤하지만 가교 구조에 의해 용해되지 않는 성질을 가지고 있다. 따라서 구성성분과 제조방법에 따라 다양한 형태와 성질을 가진 하이드로겔이 만들어질 수 있으며 일반적으로 다량의 수분을 함유하고 있으므로 액체와 고체의 중간성질을 갖는 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "콜라겐(collagen)"은 동물에서 발견되며, 피부와 연골 든 체내의 결합조직을 구성하는 섬유 단백질을 의미할 수 있다. 콜라겐은 폴리펩타이드 세 분자가 서로 삼중나선으로 꼬인 밧줄과 같은 형태를 이루고 있는 것일 수 있다. 콜라겐과 관련하여 그의 원천은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 콜라겐을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 콜라겐은 "아테로콜라겐(atelocollagen)"일 수 있다

본 명세서에서 용어 "아테로콜라겐(atelocollagen)"은 콜라겐의 텔로펩타이드 말단을 제거한 콜라겐을 의미할 수 있다. 텔로펩타이드는 효소로 제거된 것일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 콜라겐의 n 말단 텔로 펩타이드(n-terminal telopeptide)와 c 말단 텔로 펩티드(c-terminal telopeptide)가 제거되어 가교 결합 부위가 적은 특성을 가질 수 있다. 아테로 콜라겐은 온도가 높아질수록 항복 응력과 탄성이 높아질 수 있다. 아테로콜라겐은 천연 콜라겐보다 유동성이 뛰어난 것일 수 있다. 아테로콜라겐은 생체 내 조건에서 자연적으로 겔을 형성하는 특성을 가진 것일 수 있어 바이오잉크 형성시에 생체 조건에서의 안정성이 높은 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "젤라틴(gelatin)"은 동물의 뼈, 연골, 가죽 등 결합조직의 주요 단백질 성분인 콜라겐의 부분적인 가수분해에 의해 얻어지는 단백질을 의미할 수 있다. 상기 젤라틴은, 순수 젤라틴 외에, 젤라틴 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 젤라틴 유도체는 프탈화 젤라틴, 에스터화 젤라틴, 아미드화 젤라틴, 또는 포르밀화 젤라틴 중에서 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 젤라틴과 관련하여, 그의 종류 (원천)은 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 포유류, 어류, 예를 들면, 소 뼈, 소 피부, 돼지 뼈, 돼지 피부 등으로부터 유래된 다양한 젤라틴을 사용할 수 있다. 또한, 상기 젤라틴은 분자량이 10,000 내지 30,000인 것일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "히알루론산(hyalruronic acid)"은 "히알루로난(hyaluronan)", "히알루로네이트(hyaluronate)" 또는 "HA"와 호환적으로 사용되고, 하기 식 1의 화학식 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염, 예를 들면, 히알루론산나트륨 (NaHA), 히알루론산칼륨, 히알루론산마그네슘, 히알루론산칼륨 및 그 조합을 포함할 수 있다.

(1)

식 1 중 n은 반복단위 (repeating unit) 수이다. 박테리아 및 조류 기원을 포함한, 모든 기원의 히알루론산이 유용하다. 유용한 히알루론산은 약 0.5MDa 내지 약 6.0MDa, 예를 들면, 약 1.5MDa 내지 약 6.0MDa, 약 2.5MDa 내지 약 6.0MDa, 약 3.5MDa 내지 약 6.0MDa, 약 0.5MDa 내지 약 5.0MDa,약 0.5MDa 내지 약 4.0MDa, 또는 약 0.5MDa 내지 약 3.0MDa일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "피브리노겐(fibrinogen)"은 척추 동물에 존재하는 당 단백질의 일종으로 섬유소원이라고도 한다. 일 구체예에 있어서, 피브리노겐은 가교제의 역할을 수행하는 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 하이드로겔 조성물, 조직공학용 지지체 조성물 또는 바이오 잉크 조성물에 있어서, 상기 조성물은 추가적인 가교제를 실질적으로(substantially) 함유하지 않는 것일 수 있다. 피브린의 전구체이다.

본 명세서에서 용어 "피브린(Fibrin)"은, 혈액응고를 일으키는 당단백질이다. 혈액 중에는 전구체인 피브리노겐으로서 존재하고, 혈액 응고 효소 트롬빈의 작용으로 생성되는 불용성 단백질을 의미할 수 있다. 제법으로는 피브리노겐에 정제한 트롬빈을 작용시켜 순수한 피브린을 얻는 것이 있다. 피브리노겐과 비슷한 아미노산 구성을 가지고 있을 수 있다. 섬유화된 경우 탄성을 가지는 특성이 있다. 본 발명의 일 구체예에서 피브린은 항복응력을 좌우하는 주요 요인일 수 있다.

본 명세서에서 용어 "트롬빈"은, 단백질 분해효소이다. 혈액 응고에 작용하는 가수 분해 효소일 수 있다. 피브리노겐에 작용하여 피브린을 형성할 수 있다.

다른 양상은, 상기 프린팅가능성을 평가하는 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체를 제공한다.

상기 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체란, 컴퓨터 시스템에 의하여 읽혀질 수 있는 데이터가 저장되는 모든 종류의 기록장치를 포함한다. 컴퓨터가 읽을 수 있는 기록매체의 예로는 ROM, RAM, CD-ROM, 자기 테이프, 플로피디스크 및 광데이터 저장장치 등이 있지만, 그에 한정되는 것은 아니다.

또 다른 양상은 콜라겐, 히알루론산 및 피브린을 포함하고, 상기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하인 바이오 잉크 조성물을 제공하는 것이다. 상기 콜라겐은 천연 콜라겐 또는 아테로콜라겐일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 콜라겐은 탄성에, 히알루론산은 점성에, 피브린은 항복응력에 지배적으로 영향을 미치는 구성요소일 수 있다. 콜라겐의 농도를 높이는 경우 탄성값을 높일 수 있고 이는 프린팅가능성을 높인다. 본 발명의 일 구체예에서, 콜라겐의 농도를 높이기 위해 콜라겐은 말단을 제거한 아테로콜라겐일 수 있다. 아테로콜라겐은 용해성이 높아 크림 같은 제형의 바이오잉크를 형성하는 데 유리할 수 있다.

상기 바이오잉크는 스캐폴드로 프린팅되는 형태로 이용될 수 있다. 상기 바이오잉크를 이용해 고탄성바이오잉크 스캐폴드를 제조할 경우, 상기 스캐폴드와 저탄성의 콜라겐을 혼합하여 바이오프린팅을 실시할 수 있다. 일반적으로 세포와 저탄성 콜라겐을 혼합해 배양할 경우 콜라겐의 수축이 일어나고, 장기베양시 세포의 생존률이 떨어진다. 그러나 상기 바이오잉크의 경우 수축이 일어나지 않고, 세포의 생존률이 높고, 세포의 형태 및 분포가 일률적인 효과를 가질 수 있다. 더불어 배양할 동안의 형태 유지력과 세포 생존률이 높은 효과가 있을 수 있다.

상기 바이오 잉크, 수학식, 콜라겐, 히알루론산, 바이오잉크, 수학식 및 피브린은 전술한 바와 같다.

일 구체예에 있어서, 상기 콜라겐 또는 젤라틴은 전체 조성물 중 0.2 내지 20중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상세하게는 상기 콜라겐은 0.25 내지 19 중량%, 0.5 내지 18 중량%, 0.7 내지 17 중량%, 또는 2 내지 15 중량%로 포함되거나, 3 내지 15 중량%, 4 내지 13 중량%, 4 내지 12 중량%, 5 내지 10 중량%일 수 있다. 또한, 예를 들면, 8중량% 또는 12중량%일 수 있다. 상기 젤라틴은 약 1.5 내지 약 6중량%, 약 2 내지 약 6중량%, 약 2.5 내지 약 6중량%, 또는 약 3.5 내지 약 6중량%로 포함되거나, 또한, 예를 들면, 약 2중량%, 약 3중량%, 약 4중량%, 약 5중량%, 또는 약 6중량%일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 히알루론산은 전체 조성물 중 약 0.25 내지 8중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상세하게는 상기 히알루론산은 0.2 내지 6중량%, 0.2 내지 5.5중량%, 0.5 내지 약 6중량%, 0.5 내지 약 5.5중량%, 또는 1 내지 약 5중량%로 포함되는 것일 수 있다.

일 구체예에 있어서, 상기 피브리노겐 또는 피브린은 전체 조성물 중 약 1 내지 약 15중량%로 포함되는 것일 수 있다. 상세하게는 상기 피브리노겐 또는 피브린은 약 1 내지 약 14중량%, 1 내지 약 13중량%, 1.5 내지 약 13중량%, 1.5 내지 약 12중량%, 2 내지 12중량%, 2 내지 11중량%, 2 내지 10중량%으로 포함되거나, 또한, 예를 들면, 약 5중량%, 7.5중량%, 또는 10중량%, 또는 일 수 있다. 보다 구체적으로, 상기 콜라겐의 농도는 5 내지 20중량%, 상기 히알루론산의 농도는 1 내지 5 중량%, 상기 피브린의 농도는 2 내지 10중량% 일 수 있다.

상기 조성물은 트롬빈을 더 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 구체예에 있어서, 상기 조성물은 세포가 적재된 것일 수 있다. 또한, 상기 조성물은 성장인자, 생리활성인자, 첨가제 또는 분화인자가 더 포함되어 있는 것일 수 있다. 상기 세포는 하이드로겔 조성물 내에서 배양하고자 하는 세포, 조직, 또는 다른 세포로 분화시키고자 하는 세포, 또는 조직 재생에 사용하고자 하는 세포를 포함할 수 있다. 상기 세포의 예는 줄기세포, 감각세포, 뇌세포, 생식세포, 상피세포, 면역세포, 암세포 또는 그들의 조합일 수 있다. 상기 줄기세포는 분화능을 갖는 세포를 의미할 수 있으며, 상기 분화능을 갖는 세포는 예를 들면, 아세포, 간세포, 섬유아세포, 근육아세포, 성체줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방유래 중간엽줄기세포, 골수유래 중간엽줄기세포, 신경유래 중간엽줄기세포, 태반유래 중간엽줄기세포, 또는 제대혈줄기세포 또는 그의 조합을 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 세포의 성장과 기능을 조절할 수 있는 물질을 의미할 수 있다. 상기 분화인자는 세포의 조직으로의 분화, 또는 다른 세포로의 분화를 유도하는 물질을 의미할 수 있다. 예를 들면, 상기 성장인자 또는 분화인자는 형질전환성장인자(TGF), 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 사이토카인, 캐모카인 또는 그의 조합을 포함할 수 있다.

상기 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌 Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures; Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양액, 세포 배양 시스템 또한 문헌 Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 상기 세포 배양액은, 이에 제한되지는 않으나, 목적하는 세포에 적합한 임의의 배지를 포함하는 것으로, 당업계 에 세포주에 적합한 임의의 배지들이 공지되어 있고, 예를 들어, MEM 배지, RPMI1640 배지, DMEM 배지, IMDM 배지 등일 수 있다. 또한, 상기 세포 배양액에는 이에 제한되지는 않으나, 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항생 물질 등이 추가로 포함될 수 있다.

상기 생리활성물질은, 이에 제한되지는 않으나, 세포를 증식시키거나 세포외 기질 분비를 촉진시키기 위하여, 전환 성장인자(transforming growth factor-beta, TGF-β), 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor,FGF), 골 형태발생 단백질(bone morphogenic protein, BMP), 혈관내피 성장인자(vascular endothelial growth factor, VEGF), 표피 성장인자(epidermal growth factor, EGF), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판-유래 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF), 신경 성장인자(nerve growth factor, NGF), 간세포 성장인자(hepatocyte growth factor, HGF), 태반 성장인자 (placental growth factor, PIGF), 과립구 콜로니 자극인자(granulocyte colony stimulating factor,G-CSF), 및 아스코르베이트 2-포스페이트(ascorbate 2-phosphate)와 같은 세포 배양액 첨가물로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 포함하는것일 수 있다.

상기 첨가제는, 이에 제한되지는 않으나, 글리세롤일 수 있다. 상기 '글리세롤'은 C3H5(OH)3의 분자식을 가진 지방족 3가 알코올의 하나로서, 바이오 프린팅 적용시 막힘 방지효과 측면에서 본 발명의 조성물에 적합하게 사용될 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “구성된다” 또는 “포함한다” 는 명세서 상에 기재된 여러 구성 요소들, 또는 여러 단계들을 반드시 모두 포함하는 것으로 해석되지 않아야 하며, 그 중 일부 구성 요소들 또는 일부 단계들은 포함되지 않을 수도 있고, 또는 추가적인 구성 요소 또는 단계들을 더 포함할 수 있는 것으로 해석되어야 한다.

다른 양상은, 콜라겐, 히알루론산 및 피브린을 상기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하가 되도록 혼합하는 단계를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

예를 들면, 상기 수학식 1에 일정 콜라겐 농도, 일정 히알루론산 농도, 일정 피브린 농도를 입력하였을 때 수학식의 NV값이 0.4 이상 1 이하가 되도록 하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 농도는 중량비일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 상기 콜라겐, 히알루론산 및 피브린의 후보 농도를 설정하는 단계; 및 후보 농도를 상기 수학식 1에 대입하여 NV값을 확인하여 프린팅가능성을 예측하는 단계; 및 상기 NV 값이 0.4 이상 1 이하인 경우 상기 후보 농도로 바이오잉크 조성물을 제조하는 단계일 수 있다.

상기와 같은 제조방법의 경우, 바이오프린팅을 시도하기 전에도 프린팅 성공가능성을 미리 예측할 수 있어 여러 번의 시도 끝에 성공적인 조성물을 얻는 기존의 방법보다 시간적, 경제적 낭비를 줄일 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 제조방법은 상기 콜라겐의 농도가 5 내지 20중량%, 상기 히알루론산의 농도가 1 내지 5 중량%, 상기 피브린의 농도가 2 내지 10중량% 인 것일 수 있다. 상기와 같은 농도범위를 가지면, 상기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 내지 1 이하일 수 있다. 또는 프린팅가능성이 높음으로 평가될 수 있다. 예를 들면, 프린팅 시 노즐이 막히지 않고 프린팅 된 결과물이 생체 적합성이 뛰어나며, 장기간 유지력이 뛰어난 것일 수 있다.

상기 조성물은 트롬빈을 더 포함하는 것일 수 있다.

하기 실시예들에 대한 설명은 권리범위를 제한하는 것으로 해석되지 말아야 하며, 해당 기술분야의 당업자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 실시예들의 권리범위에 속하는 것으로 해석되어야 할 것이다.

일 양상에 따른 바이오잉크의 프린팅가능성 예측에 따르면, 바이오잉크를 실제 프린팅하지 않아도 본 발명에서 도출된 수학식에 구성요소의 농도 값을 입력하여 프린팅가능성을 예측할 수 있다. 더불어, 위 수학식을 만족시키는 바이오잉크의 경우, 장기배양시 수축을 최소화하고 세포의 생존률이 높으며, 세포의 형태 및 분포가 일률적인 효과가 있다.

도 1은 바이오잉크 디자인을 위한 예측 모델 개발 및 응용을 나타낸 본 발명의 개념도를 나타낸 이미지이다.
도 2은 천연 콜라겐과 아테로 콜라겐의 유변 물성 특성을 비교한 그래프이다. 도 2a는 탄성 계수를, 도 2b는 항복 응력을 농도 구배에 따라 비교한 그래프이다. 도 2의 c는 천연 콜라겐과 아테로 콜라겐으로 제조된 젤의 가역성 실험을 나타낸 것이며, 시간에 따라 온도는 4℃에서 37℃로, 다시 4℃로 변화했다. 도 2에 따르면 아테로 콜라겐이 천연 콜라겐보다 탄성과 항복 응력이 낮아 가역적 거동을 보임을 알 수 있다.
도 3는 단일 성분으로 구성된 하이드로겔의 유변물성을 나타낸 그래프이다. 도 3a 및 b는 4℃, 20℃, 37℃ 에서 각각 시간이 흐름에 따른 탄성 계수를 나타낸 것이고, a는 콜라겐 1%의, b는 피브린 1%를 포함할 때의 탄성 계수 그래프이다. 도 c 및 d는 전단 응력의 측정과, 점도 대 전단 응력을 보여주는 항복 응력의 측정에 대한 그래프이다. C는 콜라겐 10%, d는 피브린 10% 구성의 항복 응력을 나타내었다. 도 3 e 내지 f는 콜라겐 1%, HA 2.5%, alc 섬유소 1%의 하이드로겔의 전단 속도를 나타낸 그래프이다. f는 주파수를 나타낸 것이고, e는 전단 점도(shear viscosity)가 일정할 때의 전단 속도(shear rates) 함수이다.
도 4은 머신 러닝 분석 결과를 나타낸 이미지이다. 도 4의 a 내지 d는 프린팅 가능성과 관련이 있는 유변물성을 나타낸 것이다. a, c, e, g는 머신러닝에 의해 유도된 규칙성을 나타낸 표이다. A는 모양 충실도, c는 압출, e는 G'의 값, g는 항복 응력에 관한 것이다. "Number of data"는 지배적인 범위에 해당하는 데이터의 수이다. "Data purity"는 데이터 중 몇 퍼센트가 "class" 범위에 속하는지를 나타낸 것이다. 평균은 해당 범위 내의 평균값이다. b는 형상 충실도에 기여하는 변수를, d는 압출여부를 결정하는 주요 변수를, f는 탄성력을 결정하는 변수를, h는 항복 응력을 결정하는 변수를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 다중 회귀 분석의 결과를 나타낸 그래프이다. b는 표 2의 실제 데이터를 0.0439의 p값을 갖도록 방정식에 입력하여 예측값을 도출한 표이다. C는 실제 프린팅 결과물을 나타낸 이미지이다.
도 6는 G'와 항복응력을 함수로 나타낸 인쇄용 윈도우 맵(window maps)을 나타낸 이미지이다. A는 바이오잉크의 유변학적 성질이 모두 그려져 있고, 모양 충실도를 색상으로 구분하고 있다. 빨간색은 0-10, 노란색은 10-15, 노란색은 10-15, 밝은 녹색은 16-30, 진한 녹색은 31-42의 모양 충실도(shape fidelity)를 의미한다.
도 7은 바이오 프린팅 결과물의 안정성과 세포 호환성을 나타내는 이미지이다. 7a는 프레임워크 바이오잉크와 세포 탑재 바이오잉크의 프린팅 모식도 및 실제 프린팅 구조물을 나타낸 것이다. 7b는 인간 피부 섬유아세포(400,000cells/ml)를 사용한 세포 배양 구조물을 나타낸 것이다. 7b는 밝은 초록색으로 살아있는 세포를 표시한 이미지이다. 전체 이미지는 다른 위치에서 촬영된 400개의 이미지로 재구성하였다. 빨간색 점은 죽은 세포를 나타낸다. 흰색 화살표는 스캐폴드로의 세포 이동을 나타낸다. 7c는 프레임워크 스캐폴드가 없이 세포 탑재 바이오잉크만을 프린팅하고 배양한 것이다.
도 8은 항복 응력의 결정 방법을 나타내는 그래프이다; 변형률의 기울기가 매우 낮은 값에서 높은 값으로 변하는 지점을 측정하는 방법인 stress-ramp 실험을 이용한 것이다.
도 9는 점탄성의 결정 방법을 나타내는 그래프이다; frequency 1 rad/s에서 측정되었다.

실시예 1. 바이오 프린팅에서 콜라겐의 특성 확인

천연 재료로 구성된 생체에 적합한 3차원 프린팅 잉크를 찾기 위하여, 본 발명자들은 아직까지 연구된 바가 없는 두 가지 천연 콜라겐의 구조와 유변 물성을 조사하였다. 천연 콜라겐(native collagen) 과 아테로 콜라겐(atelocollagen)이 그것이다. 아테로 콜라겐은 천연 콜라겐보다 적은 항원성 및 생체 적합성을 가지기 위하여 n 말단 텔로 펩타이드(n-terminal telopeptide)와 c 말단 텔로 펩티드(c-terminal telopeptide)가 제거되었다. 모든 종류의 콜라겐들에 보편적인 결과를 얻기 위하여, 본 발명자들은 다양한 소스로부터 얻은 그룹의 3가지 콜라겐을 분석하였다. 콜라겐의 종류는 표 1에 나열하였다. 제조자 또는 공급원에 관계없이, 콜라겐의 유동학적 성질은 천연 콜라겐인지, 아테로 콜라겐인지 여부에 따라 달랐다.

Source	Description by Manufacture	Physical form	Abbreviation
Calf skin	Native collagen	Lyophilized	NTⅠ
Bovine	Native collagen	Liquid	NT Ⅱ
Rat tail	Native collagen	Liquid	NT Ⅲ
Porcine skinⅠ	Atelocollagen	Lyophilized	ATⅠ
Porcine skin Ⅱ	Atelocollagen	Lyophilized	AT Ⅱ
Porcine skin Ⅲ	Atelocollagen	Lyophilized	AT Ⅲ

잉크를 통해 바이오프린팅을 할 때에 중요한 물리적 특성은 높은 형태 유지력과 가공성이다. 따라서, 탄성 및 항복 응력과 같은 프린팅가능성에 밀접한 유변학적 특성은 겔화 후 37 ℃ 에서 측정되었다. 모든 유형의 콜라겐의 탄성 계수는 콜라겐 농도가 증가함에 따라 증가하였고, 천연 콜라겐은 아테로 콜라겐보다 약간 높은 탄성 계수를 나타내었다. (도 1a) 탄성 계수는 콜라겐의 농도가 증가함에 따라 기하급수적으로 증가하기 때문에 콜라겐의 농도를 증가시키는 것으로 탄성 또한 높일 수 있었다. 모든 유형의 콜라겐에서, 항복 응력은 콜라겐의 농도가 증가함에 따라 증가하였고 아테로 콜라겐보다 천연 콜라겐이 항복 응력이 더 높은 것을 확인할 수 있었다. (그림 1b) 보다 구체적으로, 아테로 콜라겐은 농도가 1%까지 증가하는 지점까지 항복 응력이 거의 변화하지 않지만, 천연 콜라겐은 항복 응력이 약 104Pa까지 증가함을 확인할 수 있었다.

상기와 같은 두 가지 유형의 콜라겐의 별개의 유변학적 특성을 분석으로 인해 본 발명자들은 합리적인 인쇄 가능성 예측을 할 수 있었다. 콜라겐의 농도를 높이는 것은 별도의 화학 처리 없이 콜라겐의 탄성력을 증가시키는 가장 단순하고 유일한 방법이었다. 탄성을 위해 콜라겐의 농도를 높이면, 천연 콜라겐의 경우 항복 응력 또한 급격하게 증가하지만, 아테로 콜라겐은 그렇지 않았다. 천연 콜라겐의 농도가 너무 높으면, 프린팅의 처리 과정에서 인쇄 노즐에서 빠져 나오는 것이 어려웠다. 이는 다음 실시예 3에서 더 설명된다. 고분자 가공 이론에 따르면, 높은 항복 응력 재료는 일반적으로 잘 부서지는 특성을 보이며, 고도의 가교된 네트워크 구조로 인해 쉽게 재형성될 수 없다는 것이 알려져 있다. 반면에, 낮은 항복 응력을 갖는 응력 재료는 유동적인 특성을 가져 쉽게 재형성될 수 있다. 따라서 낮은 항복 응력을 갖는 아테로 콜라겐은 천연 콜라겐보다 유동성이 중요한 인쇄 분야와 같은 응용 분야에서 더 유리할 수 있다.

천연 콜라겐의 높은 항복 응력은 분자 구조를 고려하여 이해될 수 있다. 이전의 연구들은 가교 부위가 콜라겐 나선 뿐 아니라 n 말단 펩티드, c 말단 펩티드에 존재한다고 보고하였다. 따라서 이 부분이 제거된 아테로 콜라겐은 천연 콜라겐보다 가교 결합 부위가 적고, 천연 콜라겐보다 약간 겔을 형성하게 된다. 이러한 교차 결합 부위를 반영하는 단백질 패턴은 SDS-page에서 찾을 수 있었다. 두 종류의 콜라겐 사이의 이렇게 상이한 가교 결합 패턴은 겔화 시 바이오잉크의 특성의 원인이 되었다. 4℃에서 37 ℃로 온도를 상승시킬 경우, 콜라겐의 겔화로 인하여 유변학적 특성이 점성에서 고탄성 혹은 겔의 형태로 우세하게 변화하였다. 다시 4 ℃로 온도가 낮아짐에 따라, 각 콜라겐의 고유 탄성률은 거의 동일하거나 조금 감소하였으며, 아테로 콜라겐의 탄성 계수는 초기 값으로 감소하는 경향을 보였다. 이는 천연 콜라겐의 경우 저온에서 다시 풀리지 않고 가교 겔을 형성하여 강도 및 항복 응력이 높은 겔을 형성한다는 것을 의미한다. 아테로 콜라겐은 약한 탄성 및 가역적 거동을 나타내어 낮은 항복 응력을 갖는 크림 타입의 젤을 형성하였다. 이는 가공에 의해 재 형성 될 수 있었다. 2개의 겔의 미세 구조 차이는 SEM 이미지로 분석하였다. (도 2 참조)

바이오 프린팅의 높은 모양 충실도를 위하여, 콜라겐 하이드로겔의 탄성을 증가시킬 필요가 있었다. 따라서 본 발명자들은 기존의 연구에서 통상적으로 사용되는 범위 이상으로 콜라겐의 농도를 증가시켰다. 가장 상용화된 콜라겐 범위는 0.3% 내지 1.0%로서, 이러한 천연 콜라겐을 정제한 후 산 용액 처리하여 제공하였다. 이러한 농도 범위는 세포의 신진 대사에 적절하지만, 너무 낮은 탄성 때문에 인쇄에는 적합하지 않았다. 이것이 기존 콜라겐 하이드로겔의 바이오잉크 인쇄의 한계점이었다. 낮은 용해도로 인해 천연 콜라겐의 농도를 높이는 것은 쉽지 않으며, 가능하다 하더라도 천연 콜라겐은 인쇄 노즐을 통과하기에 너무 높은 항복 응력을 보였다. 인쇄 가능성을 높이기 위하여 본 발명자들은 아테로 콜라겐의 농도를 높여 사용하였다. 아테로 콜라겐은 일부 가교 결합 부위의 제거로 인하여 보다 유연한 구조를 가지기 때문에 용해도가 더 높은 특성을 가지고 있기 때문이다. 일반적으로 상업화 된 아테로 콜라겐의 농도는 6%이고 기존에는 이상의 농도 제작은 시도되지 않았다. 본 발명자들은 아테로 콜라겐의 형태 유지력(shape fidelity)를 높이기 위해 농도를 최대화하는 시도를 하였다. 본 실험에서, 아테로콜라겐은 0.01N HCL 용액에 30wt까지 용해되었으며 이는 일반적인 천연 콜라겐 용액의 30배에 해당하는 값이었다. 이 용액은 이전에 사용된 하이드로겔의 농도보다 훨씬 높은 20wt%의 아테로콜라겐 젤을 제조할 수 있는 것에 특징이 있다. 본 발명자들은 이 농도 범위 이내의 아테로 콜라겐 젤이 적절한 탄력성과 유동성을 갖는 인쇄 가능한 바이오 잉크로 사용될 수 있음을 확인하였다.

실시예 2. 단일 구성의 하이드로겔 젤의 유동학적 특성 확인

본 실험에서, 발명자들은 아테로 콜라겐 잉크를 바탕으로 HA 및 피브린과 같은 FDA 승인 재료를 혼합하여 적절한 천연 유래 잉크를 찾으려고 시도하였다. 아테로콜라겐, HA, 및 피브린은 서로 다른 점탄성 특성을 갖기 때문에, 서로의 특성을 보완하여 적절한 인쇄 창 맵(printing window maps)을 찾는 데에 매우 유용하다. 본 발명자들은 대표 농도에서 단일 성분 하이드로겔의 점탄성 특성을 도시하였다. (도 2) 온도 변화에 따른 겔 변화를 관찰하기 위해, 본 발명자들은 먼저 다양한 온도에서 시간의 변수로 하여 아테로 콜라겐과 피브리노겐의 탄성 계수를 측정하였다. 아테로 콜라겐 용액은 4℃ 에서 매우 낮은 G'(저장탄성률) 값을 가지고, 액체와 같은 거동을 보였으며, 20℃과 37℃에서 3도 이상의 G'의 증가를 보여주어 젤과 유사한 거동을 보였다. (도 2a) 결과적으로, 온도가 20 ℃또는 37℃로 상승한 직후에 아테로 콜라겐 용액의 겔 전이가 일어나고 탄성 계수는 거의 일정하게 유지되었다. 피브린 젤은 피브리노겐에 프로테아제 트롬빈이 작용하여 형성되므로 피브린의 겔화 속도는 온도에 따라 다른 것으로 나타났다. (도 2b) 겔화에 소요되는 시간은 온도의 증가, 트롬빈의 활성화 속도의 증가에 따라 더 빨라졌다. 최종 탄성 계수는 15분 후, 20℃과 37℃에서 거의 동일 하였다. 아테로 콜라겐과 피브린의 탄성을 비교할 경우, 아테로 콜라겐은 20℃ 과 37℃ 에서 피브린보다 약간 높은 탄성을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다.

일반적으로 겔화 단계는 항복 응력의 증가와 함께 저 전단 점도 (low shear viscocity)의 증가를 수반한다. 항복 응력은 유체가 흐르기 시작하고 모양이 변형되기 시작하는 응력을 의미하기 때문에 프린팅가능성에 깊이 연관되어 있다. 본 발명자들은 다양한 온도에서의 아테로 콜라겐 및 트롬빈이 첨가된 피브리노겐 용액에 대해 항복 응력 측정치를 도시하였다(도 2c, d). 상기 측정치는, 대수 변형률(logarithmic deformation)의 기울기가 매우 낮은 값에서 높은 값으로 변하는 지점을 스트레스-램프(stress-ramp)를 사용하여 측정되었다. 상기 지점들은 (도 2b, d)에서 회색 점선과 화살표로 표현하였다. 아테로 콜라겐과 피브린은 온도가 20℃에서 37℃로 상승할 때에 항복 응력이 증가하는 경향을 보였고, 20℃, 혹은 37℃에서 겔화가 일어났을 경우 항복응력은 온도에 의존하지 않았다. 아테로 콜라겐의 항복 응력과 피브린의 항복 응력을 비교할 경우, 20℃ 37℃에서 각각 피브린 겔이 아테로 콜라겐보다 훨씬 높은 항복 응력을 나타내었다. 콜라겐과 피브린은 상온과 생체 내 조건에서 겔을 형성하지만, 히알루론산은 같은 조건에서 액체와 같은 형태를 보인다. 이는, G'(저장탄성률)이 G"(손실탄성률)보다 낮고, 두 변수가 모두 저주파에서 이완되는 모습에서 확인하였다. 결과적으로, 콜라겐과 피브린의 그래프는 점도가 수십 배 감소하는 곳에서 강한 전단 감소(shear thinning) 효과를 보여주지만 HA는 전단 속도(shear rate)로 일정한 점도를 보임이 확인되었다.

도 1에서 나타낸 바와 같은 단일 성분 하이드로겔의 점탄성 특성을 통해 본 발명자들은 아테로콜라겐, 피브린 및 하이드로겔의 세 가지 성분의 바이오 잉크의 경우 각각의 유변학적 성질이 프린팅에 기여할 것이라고 예측할 수 있었다. 본 발명자들이 도출한 데이터에 따르면, 세 가지 성분 모두 지배적으로 기여하는 성질이 다른 것을 확인할 수 있었다. 아테로 콜라겐은 탄성에, 피브린은 항복 응력에, HA는 탄성과 항복 응력을 감소시킴으로써 유동성에 영향을 미치는 것으로 나타났다. (데이터 미도시) 이러한 결과는 3D 인쇄의 주요 유변학적 특성을 결정하는 데 도움을 주었다.

아테로 콜라겐 및 피브린 용액이 실온 또는 생체 조건에서 자체적으로 겔을 형성하며 항복 응력 및 탄성과 같은 유변학적 특성 또한 두 온도에서 거의 일정한 특성을 가지기 때문에, 본 발명의 바이오잉크는 어느 온도에서나 프린팅 가능하고 생체 조건에서의 탄성 또한 매우 안정적인 장점이 있었다.

실시예 3. 각 유변 물성과 프린팅 가능성 사이의 관련성 확인

Input *			Output Ⅰ		Output Ⅱ
Collagen	Hyaluronic acid	Fibrin	G' (Pa)	τy	Shape Fidelity**	Extrusion***
10	0	0	3620	632	14.60	1
8	0	2	1295	730	7.34	1
5	0	5	1112	3130	0.47	1
2	0	8	1693	9400		0
0	0	10	7761	50000		0
10	2.50	0	2260	430	12.61	1
8	2.50	2	1122	415	0.13	1
5	2.50	5	731	541	0.00	1
2	2.50	8	1327	3960		0
0	2.50	10	1888	10855		0
2	0	0	382	282	0.00	1
10	0	8	5582	19700		0
10	2.50	8	4380	5506	14.08	1
10	1.25	4	2463	2429	0.00	1
6	1.25	8	4572	8052		0
2	1.25	4	460	770	1.08	1
2	2.50	0	230	74	4.94	1
6	1.25	0	820	226	0.70	1
20	0	0	9517	1465	31.27	1

프린팅 결과물의 질에 영향을 미치는 주요 유변학적 특성이 무엇인지 알아보기 위해, 본 발명자들은 먼저 콜라겐, 섬유소 하의 다양한 조합을 무작위로 추출하였다. 표 2에 무작위 추출 조합을 나열하였다. 이 초기 조합들은 직교 구조에서 파생된 것이다(데이터 미도시). 머신 러닝 분석을 위해서, 출력 1(Output 1)로서 입력 변수(input parameter), G'와 같은 유변학적 매개 변수, 및 항복 응력으로 각 구성 요소의 농도를 설정하였다. 그리고 shape fidelity, extrusion 과 같은 상응하는 프린팅 결과를 출력 2로 잡았다. 도 8 에 나타낸 바와 같이, 항복 응력의 측정 방법은 변형률의 기울기가 매우 낮은 값에서 높은 값으로 변하는 지점을 항복 응력의 값으로 결정하는 stress-ramp 실험을 사용하였다(도 8a). 도 8a의 붉은 실선이 항복 응력을 나타내는 것이다. 또한 점탄성은 도 8b에서 나타내는 바와 같이, frequency 1 rad/s에서 측정된 값으로 결정하는 방법을 사용하였다. 또한, 이 지점에서 점도가 다시 한번 감소하는 것을 확인하여 Yield stress를 한번 더 확인할 수 있었다. 표 2의 프린팅 결과물은 도 9에 나타내었다. 표에 있는 바이오 잉크 중에 결과물이 없는 것은, 프린팅 노즐이 막혀서 결과물을 확보할 수 없었던 케이스이다.

본 발명자들은 머신 러닝의 하나인 유도논리 프로그래밍(inductive logic programming)을 이용하여 분류적으로 접근하여 문제를 해결하고자 하였다. 따라서 유변 물성과 프린팅 품질과 같은 결과 데이터들을 두 가지 혹은 세 가지로 분류하였다. 출력 1에서의 G'와 항복응력과 같은 변수들의 레벨은 낮음, 중간, 높음으로 구분하여 표시하였다. 출력 2에서의 변수인 shape fidelity는 높고 낮음으로, extrusion은 방출은 1, 방출되지 않으면 0으로 구분하였다.

본 발명에서는 머신 러닝을 통해 유동학적 특성(출력 1)과 프린팅 가능성(출력 2) 사이의 관계를 나타내었다. Shape fidelity를 나타내는 주된 변수는 (그림 4a)의 황색 음영 부분이 나타내는 대로 G'(탄성값)이다. 표 2의 13가지 잉크에서 공통적으로, G'의 값이 230Pa - 2463Pa의 범위인 경우에는 90%의 잉크가 낮은 형상 충실도를 나타내었다. 표 2의 8가 포함되는 G'가 2260 Pa 내지 9517 Pa 범위의 경우, 80%의 잉크는 높은 수준의 형상 충실도를 나타냄을 확인할 수 있었다. 결과적으로, 형상 충실도(shape fidelity)를 나타내는 주요 요인은 84.6%의 G'값이며, 15.4%은 불명으로 나타났다.

압출(extrusion)을 결정하는 주요 요인은 그림 3c의 황색 음영에 나타난 바와 같이 항복 응력이었다. 표 2의 14가지 잉크가 포함되는 74 Pa 내지 5506 Pa 범위의 항복응력을 가지는 경우, 92.90%의 잉크가 1의 압출 레벨을 나타내었다. 이는 압출 성공을 의미한다. 표 2의 7가지 잉크가 포함된 3960 Pa 내지 50000 Pa 범위의 항복응력을 가지는 경우, 85.70%의 잉크가 0의 압출 레벨을 나타냈다. 이는 압출 실패를 의미한다. 결과적으로, 압출 여부를 결정하는 변수는 89.5%가 항복 응력이고, 나머지 10.5%는 원인불명이었다.

실시예 4. 3D 바이오 잉크의 프린팅 가능성 예측

머신 러닝을 통해서, 본 발명자들은 프린팅가능성 높은 잉크가 높은 형상 충실도를 위한 높은 G'값, 압출 성공을 위한 낮은 항복 응력을 가져야 함을 발견하였다. 높은 모양 충실도를 갖는 인쇄 가능한 잉크를 얻기 위해서, 다중 회귀 분석을 사용하여 높은 G'값 및 낮은 항복 응력을 갖는 예측 방정식을 도출하였다. 유변 물성의 특성상, 개별적인 변수들의 농도로는 완전히 설명될 수 없다. 상기 특성을 고려하여, 콜라겐, 하이드로겔, 및 피브린의 개별 농도뿐 아니라 각 요인의 상호 작용을 고려하여 다중 회귀 방정식을 유도하였다.

<식 1>

첫 번째로, 입력 값과 G'값의 관계, 그리고 항복 응력과 입력 값의 관계를 각각 도출하였다. 그 다음, G' 및 항복 응력은 0과 1 사이에서 표준화되었다. 표준화된 G'값 및 항복 응력은 도출된 방정식에 통합되었다. 표준화된 값인 NV 값이 1에 가까울수록 잉크가 높은 G'값과 낮은 항복 응력을 가짐을 의미한다.

NV 값은 높은 G'값과 낮은 항복 응력을 표준화시킨 값이며, C는 콜라겐의 농도이다. H는 하이드로겔의 농도이고, F는 피브린의 농도를 의미한다. a부터 m은 상수 값이다. : a=0.4290567362, b=0.0051813811, c=0.001484911, d=0.037698223, e=6.210563158, f=0.0018163108, g=1.1842105263, h=0.0013134514, i=0.00722503, j=4.3157894737, k=0.0004778907, l=0.006967951, m=0.0018847494.

본 발명자들은 도출된 방정식과 표 2에서 나타낸 실제 데이터를 대조해보았으며, 대조 결과 통계적으로 유의미한 값을 걷을 수 있었다. (p value <0.05) 더불어 상기 방정식을 통해 몇 가지 프린팅 잉크 공식을 0.5보다 큰 값을 갖도록 표준화해 보았다. (도 5b) 선택된 모든 잉크는 그림 5c에서와 높은 shape fidelity를 가지며, 상기 방정식에 신뢰도를 부여하였다. 본 발명자들은 표 2에서 나타낸 잉크의 유변학적 성질을 도 5b에 나타낸 잉크와 같이 조정한 뒤에, 3D 프린팅을 위한 윈도우 맵을 작성하였다. 상기 맵은 세 부분으로 나뉘었다. 그 결과, 다양한 잉크 조성에도 불구하고 유변학적 특성과 프린팅 가능성 사이의 보편적인 관계를 발견할 수 있었다. 보다 구체적으로, 높은 탄성 계수는 형상 충실도(shape fidelity)를 향상시키고 임계 항복 응력 아래에서 압출을 가능하게 하는 사실, 잉크가 임계 항복 응력을 초과하면, 도 6a의 회색 상자와 같이 노즐 막힘으로 압출이 실패한다는 사실이 그것이다. 마지막으로, 본 발명자들은 탄성 계수와 항복 응력으로 구성된 조작 창(operating window)에서 높은 형상 충실도 영역을 찾을 수 있었다. 상기 결과들은 머신 러닝과 다중회귀분석에 의한 것으로서, 프린팅 가능성을 결정하는 데에 중요한 가이드라인을 제공할 것이다.

실시예 5. 프린팅 된 구조물의 장기적인 안정성과 세포 호환성 확인

본 발명자들은 천연 재료를 이용한 바이오잉크의 세포 호환성을 조사하기 위해, 프레임워크(framework)로서 높은 점도의 바이오 잉크와 세포 운반체로서 낮은 점도의 하이드로겔(콜라겐 1%)을 사용하여 세포 탑재(cell-laden) 3d 구조를 준비하였다 (도 7a). (도 7b) 본 발명자들은 그림 6a의 작동 창(operating window)의 고 모양 충실도 부분에서, 대표 바이오잉크를 선택하였다. 선택된 바이오 잉크는 아테로 콜라겐 18%가 3D 구조의 프레임워크를 구성하는 것이었다. 본 발명자들은 바이오 잉크의 모양 충실도의 프레임 워크와 세포 탑재 하이드로겔의 3차원 구조를 성공적으로 생산하였고, 생산된 잉크의 모양은 붕괴 또는 수축 없이 28일 동안 유지됨을 확인하였다. 공 초점 현미경을 통해 볼 때, 세포 배양이 진행됨에 따라 살아있는 세포를 나타내는 녹색 점의 강도가 증가하는 것 또한 확인할 수 있었다. 반면에 프레임 워크가 없이 세포 탑재 하이드로젤만 28일 동안 배양하였을 경우, 배양시간이 경과함에 따라, 세포 탑재 하이드로젤의 형태가 수축하게 되고, 배양 28일째에는 죽은 세포를 나타내는 적색의 점이 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (도 7c).

본 발명자들은 두 개의 다른 부분에서 세포 생존력을 관찰하였는데, 세포 탑재 하이드로겔과 스캐폴드(도 7b)가 그것이다. 세포들은 처음에는 스캐폴드 영역에 존재하지 않지만, 배양 후 14일에서 28일 사이에 세포가 증식하고 이동함에 따라 스캐폴드가 덮이는 것이 관찰되었다. 이전의 PCL 또는 PLA 발판은 세포의 이동과 부착에 어려움이 있었던 점과 구분된다. 조작 창(operating window)에서의 높은 모양 충실도를 가지는 다른 잉크 조성물을 선택하고, 세포 배양을 통일한 방식으로 수행하였다. 콜라겐 16%, 하이드로겔 2%, 및 피브린 3%의 경우, 배양 1일 후에 지지체가 분해되어 형태가 유지되지 않았고, (보충 그림 8) 콜라겐 18%, 하이드로겔 0%, 및 섬유소 0%의 구성을 가지는 잉크는 세포 배양 후 1개월까지 안정하게 유지되었다. 콜라겐, 하이드로겔 및 피브린은 세포에 대한 분해 반응이 다르기 때문에 두 구성 잉크의 결과는 확연히 구분되었다. 즉, 피브린 및 하이드로겔은 콜라겐보다 세포 효소에 의해 분해가 용이한 것이 확인되었다. 상기 방정식에서 유도된 높은 형상 충실도를 갖는 다양한 조성의 잉크는 원하는 분해 속도에 따라 계산되어 조합될 수 있다. 잉크를 구성하는 상기 3개의 구성의 조절 방법은 분해 속도의 제어가 필요한 경우에 활용도가 높을 것이다.

Claims

하기 수학식 1을 도출하는 단계를 포함하는, 하나 이상의 바이오 폴리머로 구성된 바이오잉크의 프린팅가능성을 평가하는 방법.
<식 1>
NV = a + bC - cH - dF + (C - e)(C - e)f + (C - e)(H - g)h - (H - g)(H - g)i + (C - e)(F - j)k - (H -g)(F - j)l + (F - j)m
상기 식에서, C는 콜라겐의 농도, F는 피브린의 농도, H는 히알루론산의 농도이며, a=0.4290567362, b=0.0051813811, c=0.001484911, d=0.037698223, e=6.210563158, f=0.0018163108, g=1.1842105263, h=0.0013134514, i=0.00722503, j=4.3157894737, k=0.0004778907, l=0.006967951, m=0.0018847494 이다.
청구항 1에 있어서, 상기 수학식에 의한 NV값이 0 내지 0.3인 경우 프린팅 가능성이 낮은 것으로 판단하고, 0.3 내지 0.5인 경우 프린팅 가능성이 보통인 것으로 판단하며, 0.5 내지 1.0인 경우 프린팅 가능성이 높은 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 바이오폴리머의 농도값을 이용하여 회귀분석 모델을 설계하는 단계 및;
상기 회귀분석 모델을 이용하여 회귀분석을 실시하는 단계를 포함하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 방법은 G' 값 압출 여부, 및 항복응력 값을 표준화하여 0과 1 사이의 값으로 변환하는 단계;
표준화된 값을 이용해 머신 러닝을 실시하는 단계; 및
머신러닝을 통해 G'와 형상 충실도(shape fidelity)와의 관계, 항복응력(Yield stress)와 압출(extrusion)의 관계를 도출하는 단계; 를 추가적으로 포함하는 방법.
청구항 3에서, 상기 회귀분석 모델의 설계는 상기 바이오잉크가 높은 G'값 및 낮은 항복 응력을 갖도록 설계하는 것인, 방법.
청구항 1에 있어서, 상기 바이오폴리머는 콜라겐, 아테로콜라겐, 히알루론산(HA), 피브리노겐, 트롬빈, 및 피브린으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 1의 바이오잉크의 프린팅가능성을 평가하는 방법을 컴퓨터에서 실행시키기 위한 프로그램을 기록한 컴퓨터로 읽을 수 있는 기록매체.
콜라겐, 히알루론산, 및 피브린을 포함하고, 하기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하인 것인 바이오잉크 조성물.
<식 1>
NV = a + bC - cH - dF + (C - e)(C - e)f + (C - e)(H - g)h - (H - g)(H - g)i + (C - e)(F - j)k - (H -g)(F - j)l + (F - j)m
상기 식에서, C는 콜라겐의 농도, F는 피브린의 농도, H는 히알루론산의 농도이며, a=0.4290567362, b=0.0051813811, c=0.001484911, d=0.037698223, e=6.210563158, f=0.0018163108, g=1.1842105263, h=0.0013134514, i=0.00722503, j=4.3157894737, k=0.0004778907, l=0.006967951, m=0.0018847494 이다.
청구항 8에 있어서, 상기 콜라겐은 천연 콜라겐(Native collagen) 또는 아테로콜라겐(atelocollagen)인 바이오잉크 조성물.
청구항 8에 있어서, 상기 콜라겐의 농도는 5 내지 20중량%, 상기 히알루론산의 농도는 1 내지 5 중량%, 상기 피브린의 농도는 2 내지 10중량% 인 것인 바이오잉크 조성물.
콜라겐, 히알루론산 및 피브린을 하기 수학식 1의 NV 값이 0.4 이상 1 이하가 되도록 혼합하는 단계를 포함하는, 바이오잉크 조성물의 제조방법.
<수학식 1>
NV = a + bC - cH - dF + (C - e)(C - e)f + (C - e)(H - g)h - (H - g)(H - g)i + (C - e)(F - j)k - (H -g)(F - j)l + (F - j)m
상기 식에서, C는 콜라겐의 농도, F는 피브린의 농도, H는 히알루론산의 농도이며, a=0.4290567362, b=0.0051813811, c=0.001484911, d=0.037698223, e=6.210563158, f=0.0018163108, g=1.1842105263, h=0.0013134514, i=0.00722503, j=4.3157894737, k=0.0004778907, l=0.006967951, m=0.0018847494 임.
제11항에 있어서, 상기 콜라겐의 농도는 5 내지 20중량%, 상기 히알루론산의 농도는 1 내지 5 중량%, 상기 피브린의 농도는 2 내지 10중량% 인 것인 제조방법.
제 11항에 있어서, 상기 제조방법은 상기 콜라겐, 히알루론산 및 피브린의 후보 농도를 설정하는 단계; 및 후보 농도를 상기 수학식 1에 대입하여 NV 값을 확인하여 프린팅가능성을 예측하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.