KR20210024065A - 아연 제제를 이용한 종양학 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 환자에게 치료적 이점을 제공하기 위해 Zn(II) 제제 또는 Zn(II) 제제/ 면역-종양 제제 조합을 투여하는 것을 포함하는 암 환자를 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 고형 종양 및 혈액-기반 암 세포를 포함한 광범위한 인간 암 치료에 유용하다. 특정 구체예들에서, 치료 방법은 유전적 불안정성 돌연변이를 특징으로 하는 암 유형에 관한 것이다.

Description

아연 제제를 이용한 종양학 치료
관련된 출원들
본 출원은 2018년 6월 22일에 출원된 싱가포르 특허 출원 번호 10201805412T 및 2018년 12월 24일에 출원 된 싱가포르 특허 출원 번호 10201811577T의 이점을 주장하며, 이의 우선권을 청구하고,이 출원은 그 전문이 본원의 참조에 편입된다.
발명의 분야
본 발명은 유효량의 Zn(II) 제제를 포함하거나 또는 유효량의 Zn(II) 제제와 면역-종양 제제를 포함하는 제약 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 대상체에서 암을 치료하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
암은 성별, 인종, 민족, 연령대 등의 유전적 요인과 소득 수준, 교육 수준, 생활 방식, 식이 등의 환경적 요인에 따라, 환자마다 임상적 현시, 증상, 증상 및 이의 역학이 크게 달라지는 복합 질환이다. 암의 복잡성과 이질성은 오랫동안 인식되어 왔지만, 이 질환의 정의는 의료계의 이해의 역사적 발전을 반영하며, 여기서 질환은 생리적 위치, 조직학적 외양 및 계통에 따라 분류된다.
많은 고-처리량 DNA/RNA/ 단백질 특성화 기술, 생물정보학 및 면역-종양 (I/O) 약물의 출현으로 인해 암의 제약적 정의는 유전적 프로파일 및/또는 후생적 프로파일에 의해 더 잘 정의될 수 있다. 암세포의 특정 신호생성 또는 생화학적 경로를 표적으로 하고, 또한 부위-독립적 방식으로 작용하는 이마티닙, 수니티닙, 펨브롤리주맙과 같은 정밀 암 면역요법 약물의 임상적 성공으로 암의 병리학적 정의에서의 이러한 변화를 반영하는 예시적인 발전이다. 그러한 한 예에서, 미국 FDA는, 병리학 부위와 무관하게 미세위성 불안정성이 높은 (MSI-H) 또는 미스매치 복구 결함 (dMMR)으로 알려진 유전적 결함을 특징으로 하는 암 유형에 대해 펨브롤리주맙(pembrolizumab) 및 니볼루맙(nivolumab)의 적용을 승인했다.
이것은 암을 생리적-조직학적 특징보다는 분자 생물학으로 정의함으로써, 질환에 치료요법적 이점을 제공하는 치료제의 능력을 병치하게 하는 임상 종양학의 새로운 시대를 알린다. 그러나, 승인된 I/O 약물이 모든 유형의 암에 대해 성공적으로 입증된 것은 아니다. 예를 들면, 두경부 편평세포 암종의 펨브롤리주맙 단일요법 시험 (KEYNOTE-040)에서 하나 또는 그 이상의 백금-함유 전신 치료에 응답하지 않은 500 명의 환자를 대상으로 한 연구에서 표준 치료에 비해 전체 생존율을 크게 향상시키지 못했다. 니볼루맙(nivolumab)은 비-소세포 폐암 환자를 위한 1 선 치료제로 성공하지 못했다. 아테졸리주맙(atezolizumab)은 신속한 승인을 받았음에도 불구하고, 요로상피 세포 암에 대한 3상 시험에서 실패했다. 또한, I/O 약물과 다른 면역-활성제의 병용 요법에 대한 수많은 시도가 실패했다.
첫 번째 승인된 I/O 약물 치료는 아마도 적응 면역계를 활성화하여 환자에게 지속적인 반응을 보여 장기적인 생존을 가져왔던 반면, 대부분의 환자는 저항성을 보였고 일부 환자는 초기 반응 후 재발한다. I/O 치료와 관련된 기전에 대한 완전한 이해가 여전히 제한되어 있기 때문에, 응답 프로파일의 기반은 아직 모른다. 그럼에도 불구하고, 면역학적 상호작용에 관여하는 수많은 수용체와 리간드가 있으며, 종양 미세 환경이 역동적이고 진화한다는 것은 인식지하고 있다. 역동적이고 진화하는 환경의 한 가지 결과는 환자의 면역계가 시간의 경과에 따라 변화되어 I/O 약물에 대한 내성을 발달시킬 수 있다는 것이다.
위에서 언급된 I/O 승인 약물 외에도, T 림프구, 대식세포 및 자연 살해 세포에서 발견되는 마커들이 새로운 면역 치료제 개발의 표적으로 확인되었다. 고형암 및 혈액 암에 대한 환자의 면역 반응을 활성화시키고, 면역요법에 대한 내성을 피하거나 또는 극복할 새로운 약제를 찾는 것이 목표다.
따라서, 공지된 I/O 약물 치료 방법에 비해, 암 치료의 결과를 보완하고 및/또는 더 개선시키는데 조성물 및/또는 치료 방법을 찾아야 하는 요구가 여전히 충족되지 않고 남아 있다.
이전 출원은 2016년 11월 1일에 출원된 싱가포르 특허 출원 번호 10201609131Y 및 2017년 10월 30일자로 제출된 싱가포르 특허 출원 번호 10201708886R에서 분해가능한 폴리머-아연 킬레이트 복합체 (차례로 아연 γ-폴리 글루타메이트 [Zn-γPGA] 및 아연 α-폴리 글루타메이트 [Zn-αPGA])의 항암 효능을 공개했다. 두 출원 모두 그 전문이 본원의 참조에 편입된다.
이러한 아연 (II) 제제가 종양파괴제 역할을 하고, 암세포에 대한 I/O 제제의 활성을 보완할 수 있음을 인지하고, 우리는 현장에서 체계적인 연구를 수행하고, 아연 (II) 복합체의 제형을 단일 요법으로, 그리고 고형 종양 암 및 혈액 암을 포함한 광범위한 암 유형에 대한 암 면역 치료제 (면역 종양 제 또는 I/O 제제)와 조합하여 테스트했으며, 이러한 제제가 강력한 종양파괴 효과 및 면역치료 효과가 있음을 발견했으며, 따라서 본원에 설명된 바와 같이 본 발명을 완성했다.
발명의 요약
본원에 개시된 발명은 아연 및 α-폴리글루탐산 (α-PGA)의 복합체가 다양한 인간 및 마우스의 암 세포 계통에서 괴사-유사성 세포 사멸을 유도할 수 있다는 놀라운 관찰에 근거한다. 이론에 얽매이지 않고, 상세한 조사에 따르면, 상기 세포 사멸은 괴사성 기전의 특성을 가지며, 아연 (II)-특이적 PARP-1 과다활성화의 촉발로 인한 것으로 보인다.
한 측면에서, 본 발명은 예를 들면, 인간 환자들에서 고형 종양을 비롯한 고형 암 세포 또는 혈액 암 세포에 대항하여 치료요법적 잇점을 제공하는 폴리글루탐산과 Zn(II)의 복합체 (본원에서 일반적으로 "Zn(II) 제제"로 지칭)를 제공한다. 이 Zn(II) 제제는 시스플라틴보다 더 일관되고 광범위한 세포 독성을 나타내면서도, 통상적인 약물 내성 돌연변이에 대해서는 낮은 민감도를 보여준다. 이 Zn(II) 제제는 범-면역 자극 효과를 또한 유도한다.
또 다른 측면에서, Zn(II) 제제에 사용되는 폴리글루탐산은 치료 효능을 추가로 향상시키기 위해, 종양-표적 리간드와 콘쥬게이트된다. 콘쥬게이트 여부에 관계없이, 일부 구체예들에서, 폴리글루탐산은 중합체의 감마 (γ)형태인 반면, 다른 구체예들에서는 알파 (α) 형태이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 고형암 또는 혈액암 환자를 치료하는 방법들을 제공한다. 또다른 측면에서, 본 발명은 면역-종양 치료와 조합된 Zn(II) 제제로 이러한 환자를 치료함으로써, 암 환자의 면역-종양 치료를 향상시키는 방법을 제공한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 유전적 불안정성 돌연변이 및/또는 유전자 과다발현으로 인한 유전적 불안정성을 갖는 종양 세포를 포함하는 종양을 갖는 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 종양 세포의 유전적 불안정성 돌연변이는 ATM; ATR; PAXIP1; BRCA1; BRCA2; WRN; RFC1; RPA1; ERCC1; ERCC4; ERCC6; MGMT; PARP1; PARP2; NEIL3; XRCC1; MLH1; PMS2; TP53; CREBBP; JAK1; NFKB1; MSH2; MSH3; MSH6; 그리고 MLH3으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자에서 기능장애성 돌연변이다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ATM 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ATR 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PAXIP1 유전자에 있다. 일부 구체예들에 있어서일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 BRCA1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 BRCA2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 WRN 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 RFC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 RPA1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC4 유전자에 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC6 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MGMT 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PARP1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PARP2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 NEIL3 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 XRCC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MLH1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PMS2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 TP53 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 CREBBP 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 JAK1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 NFKB1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH3 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH6 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MLH3 유전자에 있다.
따라서, 일부 구체예들에서, 치료요법적 유효량의 Zn(II) 제제는 단일요법 치료 방법에서 투여된다.
일부 구체예들에서, 본원에 기술된 임의의 Zn(II) 제제의 치료요법적 유효량은 치료 방법과 복합된 치료요법적 유효량의 면역-종양 제제와 조합하여 투여된다. 환자의 종양 치료 방법의 한 가지 구체예는 치료요법적 유효량의 (i) Zn(II)/γ-폴리글루탐산 조성물 및/또는 Zn(II)/α-폴리글루탐산 조성물을 (ii) T-림프구 마커, 대식세포 마커, 또는 자연 킬러 세포 마커를 표적으로 하는 면역-종양 제제와 조합하여 투여하는 것을 포함한다.
다양한 구체예들에서, 상기 면역-종양 제제는 면역 체크포인트 억제제다. 면역 체크포인트 억제제의 비-제한적인 예로는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA-4 억제제들이 포함된다. 면역조절성 억제제의 추가 비-제한적인 예로는 LAG-3 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, B7-H3 억제제, VISTA 억제제, ICOS 억제제, CD27 억제제, GITR 억제제, CD47 억제제, IDO 억제제, KIR 억제제, 및 CD94/NKG2A 억제제를 포함한다.
본 발명의 추가 구체예들은 본원에 기재된 임의의 Zn(II) 제제와 두 가지 면역요법 제제를 포함하는 복합 치료제를 제공한다. 일부 구체예들에서, 제 1 및 제 2 면역요법 제제는 각각 독립적으로 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA-4 억제제, LAG-3 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, B7-H3 억제제, VISTA 억제제, ICOS 억제제, CD27 억제제, 및 GITR 억제제로부터 선택된다. 많은 구체예들에서, 상기 제 1 및 제 2 면역요법 제제들은 상이한 클래스의 억제제들이며, 즉, 이들은 상이한 마커를 표적으로 한다.
두 가지 면역요법 제제를 이용하는 다른 구체예들에서, 제 1 제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA-4 억제제, LAG-3 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, B7-H3 억제제, VISTA 억제제, ICOS 억제제, CD27 억제제, 및 GITR 억제제로부터 선택되며, 그리고 제 2 제제는 CD47 억제제 및 IDO 억제제로 부터 선택된다. 두 가지 면역요법 제제를 이용하는 다른 구체예들에서, 제 1 제제는 PD-1 억제제, PD-L1 억제제, CTLA-4 억제제, LAG-3 억제제, TIM-3 억제제, TIGIT 억제제, B7-H3 억제제, VISTA 억제제, ICOS 억제제, CD27 억제제 및 GITR 억제제로부터 선택되며, 그리고 제 2 제제는 KIR 억제제 및 CD94/NKG2A 억제제로 부터 선택된다.
도 1은 본 발명에 따른 Zn(II) 제제의 특정 구체예들을 예시한다.
도 2A-2B는 HeLa 세포를 Zn(II) 제제의 특정 구체예들로 처리할 때 세포 생존력 검정법 결과를 보여준다.
도 3A-3B는 Zn(II) 제제의 특정 구체예들에 대한 IC50 값을 결정하기 위한 검정법의 결과를 나타낸다.
도 4A-4E는 Zn(II) 제제의 구체예로 세포를 처리하였을 때, 관찰되는 세포 사멸 기전을 나타내는 실험 결과를 보여준다.
도 5A-5I는 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에 대한 용량-반응 곡선을 보여준다.
도 6는 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에 대한 각 세포 유형에서 식별된 IC50 스크리닝 데이터 및 돌연변이된 유전자들에 대한 표를 나타낸다.
도 7A-7B는 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에서 치료에 대한 반응 분석을 나타낸다.
도 8은 약물 민감성 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에서 약물 민감성에서 단일 유전자 돌연변이 효과를 보여준다.
도 9A-9F는 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에서 치료에 대한 반응 분석을 나타낸다.
도 10A-10P는 실시예 6에서 기술된 50가지 세포 계통 연구에서 약물 감수성에 대한 다중 유전자 돌연변이 효과를 보여준다.
도 11A-11D는 APOBEC3B 유전자 돌연변이 분석 및 C004 및 시스플라틴에 대한 IC50 값 분포에 대한 이의 과다발현 효과를 보여준다.
도 12A-12C는 후보 바이오마커를 보여준다.
도 13은 C004의 반복 독성 테스트 결과를 보여준다.
도 14A-14B는 C005D의 투여 결과를 나타낸다.
도 15는 C005D 단일요법 및 C005D/항-PD-1 mAb 병용 요법 치료의 결과를 보여준다.
도 16은 실시예 10에서 기술된 치료 연구에서 생체내 면역성 특징화를 위한 게이팅 전략(gating strategy)을 보여준다.
도 17A-17B는 실시예 10에서 기술된 치료의 면역 학적 효과의 분석을 보여준다.
도 17C-17G는 실시예 11에서 기술된 HCC PDX-HuMice 모델 테스트 및 TIL 분석 결과를 보여준다.
도 18은 본 발명의 구체예들에 따른 Zn(II) 제제의 PARP-1 오버드라이브 매개된괴사 성 세포 독성 기전을 보여준다.
도 19는 본 발명의 구체예들에 따른 Zn(II) 제제의 추론된 종양 기전의 개략도를 보여준다.
예시적인 구체예들
본 발명의 구체예들은 다음을 포함하지만, 이에 국한되지 않는다:
1. 종양을 가진 환자에게 치료요법적 유효량의 Zn(II) 제제를 투여하는 것을 포함하는, 전술한 환자를 치료하는 방법.
2. 종양을 가진 환자에게 면역-종양 제제와 복합하여 치료요법적 유효량의 Zn(II) 제제를 투여하는 것을 포함하는, 전술한 환자를 치료하는 방법.
3. 구체예 2에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 면역-종양 제제는 면역 체크포인트 억제제인, 방법.
4. 구체예 3에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 면역 체크포인트 억제제는 항-세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 항체 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 활성을 억제시키는 이의 항원-결합 부분; 또는 예정된 세포 사멸-1 (PD-1) 항체 또는 PD-1 수용체에 특이적으로 결합하고 PD-1 수용체을 억제시키는 이의 항원-결합 부분인, 방법.
5. 구체예 1 내지 4의 임의의 하나에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 종양에는 유전적 불안정성 돌연변이 및/또는 유전자 과다발현으로 인한 유전적 불안정성을 갖는 종양 세포를 포함하는, 방법.
6. 구체예 5에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전적 불안정성 돌연변이는 ATM; ATR; PAXIP1; BRCA1; BRCA2; WRN; RFC1; RPA1; ERCC1; ERCC4; ERCC6; MGMT; PARP1; PARP2; NEIL3; XRCC1; MLH1; PMS2; TP53; CREBBP; JAK1; NFKB1; MSH2; MSH3; MSH6; 그리고 MLH3에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자에서 기능장애성 돌연변이인, 방법.
7. 환자의 종양에서 CD4+T 세포 및 CD8+T 세포의 종양 침윤성 백혈구 집단을 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 전술한 종양을 갖는 전술한 환자에게 Zn(II) 제제의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
8. 환자의 종양에서 CD4+T 세포 및 CD8+T 세포의 종양 침윤성 백혈구 집단을 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 전술한 종양을 갖는 전술한 환자에게 면역-종양 제제와 함께 Zn(II) 제제의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법
9. 구체예 8에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 면역-종양 제제는 면역 체크포인트 억제제인, 방법.
10. 구체예 8에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 면역 체크포인트 억제제는 항-세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 항체 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 활성을 억제시키는 이의 항원-결합 부분; 또는 예정된 세포 사멸-1 (PD-1) 항체 또는 PD-1 수용체에 특이적으로 결합하고 PD-1 수용체을 억제시키는 이의 항원-결합 부분인, 방법.
11. 구체예 1 내지 10의 임의의 하나에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 Zn(II) 제제는 Zn(II)/γ-폴리글루탐산 및/또는 Zn(II)/α-폴리글루탐산을 포함하는, 방법.
12. 환자의 종양 치료 방법에 있어서, 이 방법은 (ii) T-림프구 마커, 대식세포 마커, 또는 자연 킬러 세포 마커를 표적으로 하는 면역-종양 제제와 함께 치료요법적 유효량의 (i) Zn(II)/폴리글루탐산 제제의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
13. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3)인, 방법.
14. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 면역글로블린- 및 뮤신-도메인-함유하는 분자 3 (TIM-3)인, 방법.
15. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 면역글로블린 및 ITIM 도메인 (TIGIT)인, 방법.
16. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 B7-H3 (CD276)인, 방법.
17. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 활성화 (VISTA)의 Ig 억제인자를 함유하는 V-도메인인, 방법.
18. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 유도성 T-세포 공동자극자 (ICOS)인, 방법.
19. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 CD27인, 방법.
20. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR)인, 방법.
21. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 대식세포 마커는 CD47인, 방법.
22. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 대식세포 마커는 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO)인, 방법.
23. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 자연 킬러 세포 마커는 킬러 면역글로블린-유사 수용체 (KIR)인, 방법.
24. 구체예 12의 방법에 있어서, 여기에서 상기 자연 킬러 세포 마커는 CD94/NKG2A인, 방법.
25. 구체예 12 내지 24중 임의의 하나의 방법에 있어서, 여기에서 전술한 Zn(II)/폴리글루탐산 제제는 종양-표적으로 하는 모이어티 및/또는 전하-운반하는 모이어티에 콘쥬게이트된 폴리글루탐산을 포함하는, 방법.
26. 구체예 25의 방법에 있어서, 여기에서 종양-표적으로 하는 모이어티 및/또는 전하-운반하는 모이어티에 콘쥬게이트된 전술한 폴리글루탐산은 γ-폴리글루탐산인, 방법.
27. 구체예 25의 방법에 있어서, 여기에서 전술한 폴리글루탐산의 분자량은 약 2.5 kDa ~ 약 60 kDa 범위 안에 있는, 방법.
28. 구체예 5에 따른 방법에 있어서, 여기에서 과다발현으로 인한 전술한 유전적 불안정성은 APOBEC3B의 과다발현에 의해 야기되는, 방법.
29. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 ATM인, 방법.
30. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 ATR인, 방법.
31. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 PAXIP1인, 방법.
32. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 BRCA1인, 방법.
33. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 BRCA2인, 방법.
34. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 WRN인, 방법.
35. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 RFC1인, 방법.
36. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 RPA1인, 방법.
37. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 ERCC1인, 방법.
38. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 ERCC4인, 방법.
39. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 ERCC6인, 방법.
40. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MGMT인, 방법.
41. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 PARP1인, 방법.
42. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 PARP2인, 방법.
43. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 NEIL3인, 방법.
44. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 XRCC1인, 방법.
45. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MLH1인, 방법.
46. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 PMS2인, 방법.
47. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 TP53인, 방법.
48. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 CREBBP인, 방법.
49. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 JAK1인, 방법.
50. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 NFKB1인, 방법.
51. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MSH2인, 방법.
52. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MSH3인, 방법.
53. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MSH6인, 방법.
54. 구체예 6에 따른 방법에 있어서, 여기에서 전술한 유전자는 MLH3인, 방법.
발명의 상세한 설명
본 명세서에서 사용 된 약어의 의미는 다음과 같다: "kDa"는 kiloDalton을 의미하고; "wt%"는 중량%를 의미한다.
Zn(II) 제제
Zn(II) 제제들은 폴리글루탐산에 복합된 Zn(II) (동등하게, Zn2+)으로 구성된다. Zn(II) 제제의 구체예의 일반화된 구조는 도 1에 나타낸다. 폴리글루탐산 ("PGA")은 글루탐산의 축합 폴리머로써, 두 개의 카르복실산을 포함하고 있기 때문에, 두 가지 배치로 형성될 수 있다. α-카르복실레이트 모이어티를 통한 축합으로 α-폴리글루탐산이 생성되며, γ-카르복실레이트 모이어티를 통한 축합으로 γ-폴리글루탐산이 생성된다. Zn(II) 제제는 α-PGA, γ-PGA, 또는 α-PGA와 γ-PGA 둘 모두를 사용하여 만들 수 있으며, 이러한 임의의 조성물을 "ZnPGA"로도 지칭될 수 있다. 형태 (α- 또는 γ-)가 명시되지 않는 경우, 달리 언급되지 않는 한, 둘 중 하나의 형태로 별로로, 또는 임의의 비율의 블렌드(blend)로써 두 형태가 추론될 수 있다는 것을 이해해야 한다. ZnPGA 조성물은 유리 Zn(II) 이온 뿐만 아니라 Zn 양이온에 대한 원래 반대이온(counterions)들이 공정에서 제거되도록 일번적으로 정제된다.
Zn(II) 제제들을 준비하는데 이용되는 아연 염은 Zn(II) 염 (동등하게, Zn2+ 염)이며, 여기에서 상기 반대이온 (음이온)은 의약품 제조에 사용하기에 적합한 임의의 무기 또는 유기 음이온일 수 있다. 적합한 음이온은 독성이 없는 음이온을 비롯한, 인체에 허용되는 음이온이다. 일반적으로, 상기 아연 염은 화학식 Zn2+X2- 또는 Zn2+(X-)2 또는 심지어 Zn2+(X-)(Y-)으로 나타낼 수 있는데, 여기에서 X와 Y는 적합한 음이온이다. 상기 음이온은 FDA-승인된 의약품의 성분인 음이온 그룹에서 선택될 수 있다. 일부 구체예들에서, 상기 Zn(II) 염은 제약학적으로 수용가능한 아연 염이다. 아연 염의 예로는 염화 아연, 황산 아연, 시트르산 아연, 아세트산 아연, 피콜린산 아연, 글루콘산 아연, 아미노산-아연 킬레이트, 이를 테면, 글리세네이트, 또는 당분야에 공지되고 이요오디는 다른 아미노산이 내포된다.
알파-폴리글루탐산 (택일적으로 α-폴리글루탐산 또는α-PGA)은 아미노산인 글루탐산의 중합체로써, 여기에서 상기 중합체 백본은 당해 아미노산 측쇄에 있는 카르복실기가 아닌, α-탄소에서 아미노기와 카르복실 기를 연결시키는 펩티드 결합에 의해 형성된다. α-PGA는 L 이성질체, D 이성질체, 또는 글루탐산의 DL 라셈체(racemate)로부터 형성될 수 있다. 이들 형태 중 임의의 것이 사용될 수 있고, 둘 또는 그 이상의 상이한 형태가 임의의 비율로 함께 사용될 수 있다. α-PGA의 다양한 이성체 형태는 합성 또는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있다. 유기체는 일반적으로 L 이성질체의 폴리(아미노산) 만 생산하는 반면, α-PGA를 생성하는 특정 박테리아 효소는 어느 한 이성질체로부터, 또는 두 이성질체 모두로부터 중합체를 만들 수 있다.
감마-폴리글루탐산 (택일적으로 γ-폴리글루탐산 또는 γ-PGA)은 아미노산인 글루탐산의 중합체로써, 여기에서 상기 중합체 백본은 당해 아미노산 측쇄에 있는 아미노기와 카르복실 기를 연결시키는 펩티드 결합에 의해 형성된다. γ-PGA는 L 이성질체, D 이성질체, 또는 글루탐산의 DL 라셈체로부터 형성될 수 있다. 이들 형태 중 임의의 것이 사용될 수 있고, 둘 또는 그 이상의 상이한 형태가 임의의 비율로 함께 사용될 수 있다. γ-PGA의 다양한 이성체 형태는 합성 또는 천연 공급원으로부터 유래될 수 있다. 예를 들면, γ-PGA는 일본 낫토와 바다 다시마에서 발견된다. 유기체는 일반적으로 L 이성질체의 폴리(아미노산) 만 생산하는 반면, γ-PGA를 생성하는 특정 박테리아 효소는 어느 한 이성질체로부터, 또는 두 이성질체 모두로부터 중합체를 만들 수 있다.
다양한 크기 및 다양한 중합체 분산도의 α-PGA 및 γ-PGA가 이용될 수 있으며, 각각에 동일한 고려사항이 적용된다. PGA의 중합체 분자량은 일반적으로 최소한 약 1 kDa이며, 최대한 약 100 kDa이다. 일부 구체예들에서, PGA의 중합체 분자량은 최소한 약 1 kDa, 또는 최소한 약 2.5 kDa, 또는 최소한 약 5 kDa, 또는 최소한 약 10 kDa, 또는 최소한 약 20 kDa, 또는 최소한 약 30 kDa, 또는 최소한 약 35 kDa, 또는 최소한 약 40 kDa, 또는 최소한 약 50 kDa이다. 일부 구체예들에서, PGA의 중합체 분자량은 최대한 약 100 kDa, 또는 최대한 약 90 kDa, 또는 최대한 약 80 kDa, 또는 최대한 약 70 kDa, 또는 최대한 약 60 kDa이다. 수용가능한 중합체 분자량 범위는 상기 표시된 중합체 분자량 값중 임의의 것으로부터 선택될 수 있다. 구체예에서, 상기 중합체 분자 중량은 약 2.5 kDa ~ 약 50 kDa 범위다. 구체예에서, 상기 중합체 분자 중량은 약 50 kDa ~ 약 100 kDa 범위다. 한 구체예에서, 상기 중합체 분자량은 약 50 kDA이다. 중합체 분자량은 일반적으로 겔 투과 크로마토 그래피 (GPC)에 의한 측정을 기반으로 수 평균 분자량 (Mn)으로 제공된다. 위의 고분자 질량은 Mn으로 지칭되며; 예를 들어, 질량 (중량) 평균 분자량 (Mw)을 결정하기 위해 다른 측정 기술이 사용될 수 있으며, 임의의 주어진 중합체에 대한 사양은 다양한 중합체 질량 표현 사이에서 변환될 수 있다.
PGA는 종양-표적으로 하는 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 엽산, N5, N10-디메틸 테트라히드로폴레이트 (DMTHF), 및 RGD 펩티드일 수 있다. 각각의 상기 모이어티는 임의의 조합 및 비율로 폴리 글루타민산에 공유 결합되어, 예를 들어, 엽산 콘쥬게이트 및/또는 DMTHF 및/또는 PGA의 RGD 펩티드 콘쥬게이트를 형성할 수 있다.
엽산 수용체 단백질은 인간의 많은 종양에서 흔히 발현된다. 엽산은 자연적으로 엽산 수용체에 대해 높은 친화력을 가지며, 또한 결합 시 엽산과 부착된 접합체는 세포 내 이입(endocytosis)에 의해 세포 내로 수송될 수 있다. 이러한 방식으로 엽산으로 변형된 ZnPGA는 종양 세포를 표적으로 삼아 축적될 수 있으며, 아연 (II)을 종양 세포 주변 및/또는 내부로 전달할 수 있다.
DMTHF는 또한 엽산 수용체에 대해 높은 친화력을 갖는 것으로 알려져 있다. DMTHF의 제조는 Leamon, C.P. et al., Bioconjugate Chemistry 13, 1200-1210에서 기술되어 있다. 더욱이, 엽산 수용체 (FR), FR-α 및 FR-β의 두 가지 주요 아이소형이 있으며, DMTHF는 FR-β 보다는 FR-α에 더 높은 친화력을 갖는 것으로 나타났다(Vaitilingam, B., et al., The Journal of Nuclear Medicine 53, 1127-1134.). FR-α은 많은 악성 세포 유형에서 과다발현되는 반면, FR-β은 염증성 질환과 관련된 대식세포에서 과다발현되기 때문에, 이것은 표적으로 하는 종양 세포에 유익하다. 따라서, DMTHF를 PGA에 콘쥬게이트하면 종양 세포에 의해 발현되는 엽산 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 콘쥬게이트가 제공된다.
유사하게, RGD 펩티드는 종양 내피 세포 및 일부 종양 세포에서 발현되는 α(V)β(3) 인테그린에 강력하게 결합하는 것으로 알려져 있다. 따라서, RGD 콘쥬게이트는 항종양 제제를 종양부위로 표적화시키고, 종양 부위로 이러한 제제를 전달하는데 사용될 수 있다.
본 발명에서 고려되는 바와 같이, PGA는 종양을 표적으로 하는 제제중 임의의 하나 또는 둘, 또는 모두에 콘쥬게이트(즉, 공유 결합)될 수 있고, 이들 제제가 2개 또는 그 이상이 존재할 때, 이들 제제의 상대적 비율에 특별한 제약은 없다. 예를 들면, PGA 운반체는 PGA와 (a) 엽산, (b) DMTHF, (c) RGD, (d) 엽산 및 DMTHF, (e) 엽산 및 RGD, (f) DMTHF 및 RGD, 또는 (g) 엽산, DMTHF, 및 RGD와의 콘쥬게이트를 포함할 수 있다. 당업자에게 공지된 다른 유사한 종양-표적으로 하는 모이어티 또한 본 발명의 범위 안에 있다.
α-PGA는 각 글루탐산 단위의 γ-탄소에서 유리 카르복실산을 갖고, γ-PGA는 각 글루탐산 단위의 α-탄소에서 유리 카르복실산을 갖고, 이는 엽산 및 RGD 펩티드와의 콘쥬게이트를 형성하는데 이용될 수 있다. 엽산은 글루탐산의 유리 카르복실 산기와 결합하여 둘을 연결하는 아미드 결합을 형성할 수 있는 외환식(exocyclic) 아민기를 갖는다. 엽산에서와 동일한 외환식 아민 그룹은 아미드 결합 형성을 위해 DMTHF에서 사용할 수 있다. RGD 콘쥬게이트는 또한 당업계에 잘 알려져 있고, 예를 들면, RGD에서 α-아미노기를 통한 유리 카르복실산 기에 유사하게 공유결합될 수 있다. 택일적으로, 어느 모이어티이든 간에 스페이서 기, 이를 테면, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 아민을 통하여 PGA에 콘쥬게이트될 수 있다. α-PGA의 γ 탄소 카르복실레이트 기와 아미노기 사이의 콘쥬게이션 반응의 예는 U.S. 특허 9,636,411(Bai et al)에서 찾아볼 수 있고, 아미노기와 히드록실기와의 콘쥬게이션은 U.S. Pre-Grant 공개 번호 2008/0279778(Van et al)에서 찾아볼 수 있다. 엽산 및 구연산의 것을 비롯하여 γ-PGA에 대한 콘쥬게이션 반응의 예는 WO 2014/155142 (2014년 10월 2일자로 공개됨)에서 찾아볼 수 있다.
PGA는 전하-변형 모이어티를 포함할 수 있다. 이러한 모이어티는 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 1,4,7,10-테트라시클로도데칸-N,N',N'',N'''-테트라아세트산 (DOTA), 및 디에틸렌트리아민 펜타아세트산 (DTPA)일 수 있다. 상기 모이어티의 임의의 조합은 상기 논의된 바와 같이, 다시 유리 카르복실산에서 폴리글루탐산에 공유적으로 결합될 수 있다. 시트르산은 에스테르 결합을 형성함으로써 PGA의 유리 카르복실산기에 콘쥬게이트될 수 있다. (가령, γ-PGA의 α 탄소를 포함하는 반응에 대해서는 WO 2014/155142 참고) EDTA, DOTA, 및 DTPA는 예를 들어, 스페이서 그룹을 사용하여 PGA에 연결되어, 이들 모이어티의 아민을 PGA의 유리 카르복실산 그룹에 연결시킬 수 있다. 당업자는 다양한 옵션을 이용할 수 있다. 상기 전하-변형 모이어 티는 Zn(II) 이온을 킬레이트화하는 부위로 사용할 수 있으며, 상기 전하-변형은 ZnPGA 복합체의 수송 및 용해도에도 영향을 미치므로 담체와 ZnPGA 복합물의 제약 효과를 조정하는 데 사용할 수 있다.
PGA는 종양-표적화 모이어티 및 전하-변형 모이어티를 모두 포함할 수 있으므로, 두 유형의 모이어 티의 이점 및 기능이 PGA 담체 및 Zn(II) 제제에 부여될 수 있다. 종양-표적화 모이어티 및 전하-변형 모이어티의 임의의 조합은 PGA에 콘쥬게이트될 수 있으며, 당해 모이어티들의 상대 비율은 특별히 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 Zn(II) 제제에서 아연 이온의 양은 아연 대 글루탐산 단위 ( "GAU")의 비율로 표현될 수 있다. 킬레이트기가 PGA에 콘쥬게이트될 때 글루탐산 단위당 제공되는 평균 킬레이트 부위 수의 관계를 통해 동일한 개념을 사용할 수 있다. 명목상 콘쥬게이트된 종양-표적화 모이어티 또는 전하-변형 모이어티를 배제하더라도, 상기 비율은 Zn:GAU이 1:1 만큼 높을 수 있다. 1:2, 1:5, 1:10, 1:20의 더 낮은 비율이 고려되고, 더 낮은 비율이 가능하지만 적절한 Zn(II) 투여량을 전달하는데 필요한 용량(dosage amount)에 포함된 PGA의 양은 증가한다. 상기 용량과 비-아연 성분의 양 사이의 적절한 균형은 당업자에 의해 결정될 수 있다. 한 구체예에서, 상기 Zn:GAU 비율은 약 1:2 내지 약 1:10 사이의 임의의 값이다. 또다른 구체예에서, 상기 비율은 약 1:3 내지 약 1:6 사이의 임의의 값이다. 또다른 구체예에서, 상기 비율은 약 1:4.5이다.
Zn(II) 제제에서 종양-표적 모이어티와 전하-변형 모이어티는 PGA 중합체 당 콘쥬게이트된 모이어티의 평균 수로 통상적으로 표현된다. 중합체 가닥(strand) 당 결합된 모이어티의 평균 수를 결정하는 분석 기술은 당업자에게 공지되어 있다. 중합체 가닥 당 원하는 모이어티 수는 평균 중합체 크기와 이용가능한 단량체 단위 수, 원하는 Zn:GAU의 비율, 원하는 다른 유형의 모이어티 수 및 이와 유사한 것들의 균형을 반영한다. 중합체 가닥 당 임의의 모이어티의 약 1:1, 약 2:1, 약 3:1, 약 4:1, 약 5:1, 약 6:1, 또는 약 8:1의 비율이 고려된다. 더 높은 비율이 또한 고려되지만, 당업자는 더 많은 모이어 티가 첨가됨에 따라 종종 더 적은 이익을 얻는다는 것을 인식한다.
원하는 평균 분자량, 다분산성(polydispersity), 콘쥬게이트된 모이어티 등을 갖는 PGA 중합체를 먼저 얻거나 또는 제조함으로써 ZnPGA 조성물이 일반적으로 만들어진다. 예를 들어, 더 넓은 범위의 중합체 크기를 제공하고, 상이한 표적화 능력 및 이와 유사한 것등을 제공하기 위해, 각각의 특성이 상이한 PGA 중합체의 혼합물을 사용할 수도 있다. 그 다음, PGA 중합체는 완충 수용액에서 아연 염과 조합되고, 본원에 개시된 처리 방법에 사용될 수 있는 약제학적으로 허용되는 제형화된 조성물, Zn(II) 제제를 제조하기 위해 적절하게 처리된다. ZnPGA 조성물 및 Zn(II) 제제 (제형)을 준비하는 예시적인 방법들이 본원의 실시예에서 제공된다.
액체 투약형의 조성물 또는 제형에 제공된 아연의 농도는 일반적으로 약 1μg/mL ~ 약 100mg/mL의 아연 (Zn(II) 이온)이다. 이는 약 0.0001wt% ~ 약 10wt%의 아연에 해당된다. Zn(II)의 농도는 최소한 약 10μg/mL, 또는 최소한 약 0.1mg/mL, 또는 최소한 약 1mg/mL, 또는 최소한 약 10mg/mL, 또는 최소한 약 50mg/mL, 또는 Zn(II)의 농도 범위는 이러한 예시적인 농도 중 어느 두 가지에 속할 수 있다. 한 구체예에서, 상기 농도는 약 100μg/mL ~ 약 5mg/mL 범위일 수 있다. 또다른 구체예에서, 상기 농도는 약 200μg/mL ~ 약 2mg/mL일 수 있다.
투약형에 제공된 액체의 양은 총 용량을 결정하게 될 것이다. 예를 들면, 100 mL 양의 액체는 상기 제 1 예시 범위에 대해 약 10mg ~ 약 500mg의 Zn(II)를 제공할 것이고, 상기 제 2 범위에 대해 약 20mg ~ 약 200mg의 Zn(II)를 제공할 것이다. 사용할 액체 제형의 적절한 농도와 양은 일반적으로 환자의 체중에 따라 달라질 것이다. 적절한 투여 요법은 일반적으로 1 일 환자 체중 (예를 들어, kg 당) 당 아연의 양으로 제공되며, 따라서 Zn mg/kg/일의 수로 나타낸다.
적합한 액체 제형에는 액체 용액, 액체 현탁액, 시럽 및 경구 스프레이가 내포된다. 액체 용액은 경구로 투여되거나 또는 주사에 의해 투여될 수 있는데, 예를 들어 정맥내, 피내, 근육내, 척수강내 또는 피하로, 또는 종양내로 또는 그 부근에서 직접적으로 투여 될 수 있는 반면, 액체 현탁액, 시럽 및 스프레이는 일반적으로 경구 투여에 적합하다.
액체 투약형을 제조하는 방법은 (i) 아연 염 (들) 및 PGA 담체 및/또는 (ii) ZnPGA 복합체의 원하는 양을 적합한 부형제와 함께 혼합하는 것을 포함한다. 일부 구체예들은 상기 제형에 위장-저항성 결합제 및/또는 코팅을 추가로 포함한다.
액체 용액 제형은 투여 형태와 관련하여 적합하게 선택된 적합한 담체, 희석제, 완충제, 보존제 또는 기타 부형제와 함께 제조될 수 있다. 예를 들어, 정맥 내 제형은 적절한 pH에서 등장화제로 완충되어 제조될 수 있다.
주사 또는 경구 전달에 적합한 액체 제형의 구체예는 아연 (II) 염, PGA 담체 (상기 기재된 바와 같이 변형되지 않은 PGA 및/또는 임의의 형태의 변형된 PGA) 및 물을 포함한다. 추가 구체예들에서, 상기 액체 제형은 완충제 및/또는 염화나트륨과 같은 염을 추가로 포함할 수 있다. 완충 제제가 포함되는 경우, 바람직한 완충 pH는 약 pH 4 ~ 약 pH 9 범위이다. 주사될 때, 바람직하게 상기 용액은 주입될 용액과 등장 성이고 적절한 pH를 갖는다. 한 구체예에서, 황산 아연 7수화물, α-PGA, 및 염화나트륨은 물 안에서 복합되고, 여기에서 Zn(II)의 농도는 1mg/mL이며, γ-PGA의 농도는 10mg/mL이다. γ-PGA의 중합체 분자량은 전술한 임의의 범위에서 선택될 수 있다. 한 구체예에서, 이는 약 1 kDa ~ 약 100 kDa의 범위이며, 다른 구체예들에서 이는 약 2.5 kDa ~ 약 50 kDa의 범위다. 임의의 구체예에서, 하나 또는 그 이상의 중합체 분자량의 γ-PGA가 내포될 수 있다.
일부 구체예들에서, 아연 염 및 PGA 운반체는 ZnPGA 복합체로 제조될 수 있다. 일반적으로, ZnPGA 복합체를 만들기 위해, 상기 아연 염(들) 및 PGA 운반체는 예를 들면, 실시예 1, 2, 및 12-23에서 기술된 바와 같이, 복합 및 정제된다. 수득된 ZnPGA 복합체의 용액은 액체 투약형을 제조하는 절차에 사용하기 위해 희석되거나 또는 실질적으로 건조되고, 더욱 농축된 형태로 재구성될 수 있다. ZnPGA 복합체는 주사용 용액 또는 액체 현탁액, 시럽 또는 스프레이로 제형화될 수 있다.
실시예 9에 개시된 바와 같이, 마우스에게 C004 Zn(II) 제제 용액을 주사하고, 0.5, 1.0, 또는 2.5mg/kg 체중/일의 Zn(II)의 생리학적으로 관련된 투여량을 제공하거나, 또는 0.5, 1.0, 또는 2.0mg/kg 체중/일의 Zn(II)의 생리학적으로 관련된 투여량의 C005D Zn(II) 제제 용액을 주사하여 처리하였다.
실시예 10에 기재된 바와 같이, 마우스에게 일일 2mg/kg 체중의 C005D 용액 단독으로 정맥으로 처리하거나, 또는 병용 요법 치료에서 항-인간 PD-1 항체와 병용하여 처리하였다.
일부 구체예들에서, Zn(II) 제제는 고체 투약형으로 제형화된다. 단일 고체 투약형 안에 내포된 아연의 양은 일반적으로 약 1 ~ 약 100mg의 아연 (Zn(II) 이온)의 범위다. 따라서, 제형화된 조성물에 이용되는 아연 염(들)의 특정 양은 당해 염의 양이 반대이온의 중량을 차지하기 때문에 더 높을 것이다. 오로지 Zn(II) 만을 고려할 때, 투약형에 제공된 양은 최대 약 100mg, 최대 약 75mg, 최대 약 50mg, 최대 약 25mg, 최대 약 10mg의 아연, 또는 최대 약 5mg일 수 있다. 고체 투약형으로 제공되는 Zn(II)은 일반적으로 최소한 약 1mg이다. 비교를 위해, 시판되는 보충제는 예를 들면, 20, 25, 30, 50, 75, 및 심지어 100mg의 아연을 제공한다. 제공된 양이 생리학적으로 과도한 수준의 아연의 흡수를 야기하지 않는 한, 이 범위 또는 더 높은 양의 아연은 허용가능하다. 그러나, 과도한 수준과 그로 인한 위험을 고려하여, 종양 치료를 통해 얻는 치료적 이점과 균형을 이루는 것이다. 대부분의 성인에서 허용되는 아연의 높은 섭취 수준은 하루에 약 40mg (어린이의 경우 더 낮음)이지만, 경구로 복용하는 고체 투약형에서 모든 아연은 흡수될 가능성이 낮다는 점을 인식해야 하고; 이들중 일부는 흡수되지 않고 몸을 통과한다. 흡수되는 아연의 양도 제형에 따라 또한 달라지기 때문에, 특정 제형의 아연 함량에 대한 상한은 당해 제형에 의해 제공되는 흡수 수준을 확인하기 위해 당업계에 알려진 방법에 의해 테스트될 수 있으며, 그 다음에는 당해 제형의 투여에 의해 얻어지는 임의의 치료요법적 이점의 관점에서 주어진 투약형 또는 제형에 대해 투여되는 양을 조정할 수 있다.
다른 구체예들에서, Zn(II)은 액체에 현탁된 고체로부터 또한 제공될 수 있다. 제공된 아연 (II)의 양과 현탁액의 부피는 고체 및 액체 제형에 대해 위에 명시된 지침을 따른다.
액체 투약형에 내포된 PGA의 양은 일반적으로 약 0.01wt% ~ 약 10wt% 범위 안에 있다. 일부 구체예들에서, 이 양은 약 0.1wt% 또는 약 1wt%이다.
사용되는 양은 일반적으로 아연과 폴리글루탐산 단량체 단위 사이의 원하는 몰비, 담체 PGA의 특성 (즉, 변형되지 않았는지 또는 종양-표적화 모이어티 및/또는 전하-변형 모이어티로 변형되었는지 여부), 그리고 담체 PGA와 Zn(II) 복합체의 형성 정도을 기반으로 한다. 예를 들면, 실시예 12 및 13에서 예시된 바와 같이, ZnPGA 복합체는 대략적으로 1wt% PGA와 대략적으로 400μg/mL의 복합체화된 아연을 포함하는 용액으로 수득되었다.
고체 투약형에 내포된 PGA의 양은 일반적으로 약 10wt% ~ 약 40wt% 범위다. 일부 구체예들에서, 상기 양은 약 20wt% 또는 약 30wt%이다. 사용되는 양은 일반적으로 아연과 폴리글루탐산 단량체 단위 사이의 원하는 몰비, 아연 염의 질량 (상대 이온의 중량을 설명함) 및 허용가능한 제형화된 투약형을 제공하는 데 필요한 부형제의 양을 기반으로 한다. 예를 들면, 사용되는 PGA 및 아연 염의 양이 많을수록 주어진 전체 투약형 크기에 대해 첨가될 수 있는 부형제의 양이 적어진다. 당업자는 안정한 투약형을 얻기 위해 필요한 부형제의 양 및 유형에 대한 활성 성분의 양을 쉽게 균형을 맞출 수 있다. 아연과 PGA 사이의 원하는 비율은 또한 투약형당 아연 밀리그램 대 PGA의 중량%의 비율로 표현될 수 있다. 예시적인 비율에는 5mg:10wt%; 5mg: 20wt%; 5mg: 40wt%; 30mg:10wt%; 30mg: 20wt%; 30mg: 40wt%; 또는 심지어 100mg:10wt%; 100mg: 20wt%; 100mg: 40wt%; 또는 각 성분에 대해 인용된 값에서 명시적인 다른 값 세트가 내포된다.
유효량의 Zn(II) 염 및 폴리글루탐산 담체를 갖는 적합한 고체 또는 액체 조성물 및 약제학적으로 허용되는 제형에 도달하기 위해, PGA 및 아연의 상대적인 양 및 각각의 농도는 당업자에 의해 용이하게 조정될 수 있다.
본원에 기재된 투약형은 대상체에서 원하는 생물학적 반응을 달성하기 위해 치료요법적 유효량의 Zn(II)을 제공하기 위해 투여될 수 있다. 치료요법적 유효량이란 Zn(II), PGA, 및 PGA에 임의의 변형, 임의의 ZnPGA 복합체, 및/또는 당해 투약형의 전달 효과 및 이와 유사한 것들의 복합 효과를 통하여 치료를 요하는 환자에게 전달되는 아연의 양으로 원하는 생물학적 반응을 얻을 수 있음을 의미한다. 상기 치료요법적 유효량은 병용 요법 치료 방법에서 또한 상이할 수 있고, 여기에서 당해 환자는 면역-종양 제제를 또한 제공받을 수 있다. 상승적 효과가 수득되는 경우, 치료요법적 유효량의 상기 Zn(II) 제제는 단일요법 치료 방법보다 더 낮은 양이 될 수 있다.
원하는 생물학적 반응은 대상체, 예를 들면 인간(또한 환자로 지칭됨)과 같은 포유 동물 대상체에서 종양 또는 암의 발병 또는 발달의 예방, 종양 또는 암의 진행의 부분적 또는 전체적 예방, 지연 또는 억제, 또는 종양 또는 암의 재발의 예방, 지연 또는 억제를 포함한다. 치료 방법의 임상적 이점은 객관적인 반응률, 종양 크기, 반응 기간, 치료 실패까지의 시간, 무-진행 생존율, 임상 사용에서 평가된 기타 1 차 및 2 차 종점으로 평가할 수 있다.
본원에 개시된 치료 방법은 인간 암, 이를 테면, 고형암 또는 혈액암 또는 종양의 광범위한 범위의 치료에 이용될 수 있다. 예를 들면, 본원에 기재된 방법 및 치료는 유전자 과다발현으로 인한 유전적 불안정성 돌연변이 및/또는 유전적 불안정성을 갖는 종양 세포를 포함한, 종양을 가진 환자의 치료에 이용될 수 있다. 일부 구체예들에서, 본원에 기술된 종양 세포의 유전적 불안정성 돌연변이는 ATM; ATR; PAXIP1; BRCA1; BRCA2; WRN; RFC1; RPA1; ERCC1; ERCC4; ERCC6; MGMT; PARP1; PARP2; NEIL3; XRCC1; MLH1; PMS2; TP53; CREBBP; JAK1; NFKB1; MSH2; MSH3; MSH6; 그리고 MLH3으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자에서 기능장애성 돌연변이다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ATM 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ATR 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PAXIP1 유전자에 있다. 일부 구체예들에 있어서일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 BRCA1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 BRCA2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 WRN 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 RFC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 RPA1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC4 유전자에 있다. 일부 구체예들에 있어서, 상기 기능장애성 돌연변이는 ERCC6 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MGMT 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PARP1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PARP2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 NEIL3 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 XRCC1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MLH1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 PMS2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 TP53 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 CREBBP 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 JAK1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 NFKB1 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH2 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH3 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MSH6 유전자에 있다. 일부 구체예들에서, 상기 기능장애성 돌연변이는 MLH3 유전자에 있다.
더욱이, PARP1-중재된 괴사에 민감한 모든 종양 유형은 본원에 개시된 치료 방법에 따라 치료될 수 있는 징후로 고려된다. 다양한 실시예는 개시된 조성물 및 약제학적 제형의 구현 예를 사용하여, 개시된 방법의 구체 예에 따른 치료의 효능을 입증한다. 결과는 인간화된 면역 마우스를 비롯한 마우스 모델에서 생체 내 마우스 암 세포 및 인간 암 세포의 효과적인 치료를 입증한다.
치료요법적 유효량을 달성하는 것은 제형의 특성에 따라 다르며, 성별, 연령, 상태 및 각 개체의 유전적 구성에 따라 달라질 것이다. 예를 들어 유전적 원인이나 흡수 장애 또는 심각한 식이 제한의 다른 원인으로 인해 아연이 부족한 개체는 일반적으로 적절한 수준의 아연을 가진 개체들과 비교하여 치료 효과를 위해 다른 양이 필요할 수 있다.
상기 대상체에게 일반적으로 일일 약 0.1mg/kg 내지 최대 약 5mg/kg의 양의 아연이 투여된다. 일부 구체예들에서, 투여되는 아연의 양은 일일 약 1.0mg/kg ~ 약 3mg/kg이다. 다중 투약형은 하루에 함께 또는 별도로 복용할 수 있다. 경구 투약형은 일반적으로 식사 시간에 관계없이 투여될 수 있다. 치료는 일반적으로 원하는 치료 효과가 달성될 때까지 지속된다. 본원에 기재된 조성물 및 제형의 낮은 투약형 수준은 또한 종양의 재발을 예방, 지연을 목적으로, 또는 종양 재발을 억제할 목적으로 종양을 퇴행 또는 억제하는 경우, 또는 예방제로 사용되는 경우, 본 발명의 구체예에 따른 치료로서 계속될 수 있다.
면역-종양 제제
상기-언급된 Zn(II) 제제와의 병용 요법에 사용하기 위해 고려되는 면역-종양 제제는 임의의 암 면역요법 제제일 수 있다. 상기 용어 "면역-종양 제제", "암 면역요법 제제", 및 "I/O 제제"는 본원에서 호환 사용된다. 이론에 결부되지 않고, 이들 제제는 환자 면역계에서, 또는 종양에 의해 제시되는 수용체 또는 리간드를 표적으로 삼고, 종양에 대한 면역 반응에 관여함으로써, 면역 조절에 관여하는 자연 기전을 간섭한다. 이러한 수용체 또는 리간드에 결합하는 작용제에 의해 일반적으로 야기되는 간섭은 그렇지 않으면 환자에서 발생할 수 있는 자연 면역 반응을 활성화, 자극, 억제 또는 억제시킬 수 있다. 면역-종양 제제는 소분자 약물이거나, 또는 최근에 더 일반적으로 사용되는 항체일 수 있다.
상기 면역-종양 제제는 T-세포, 대식세포, 자연 킬러 세포, 수지상 세포, 또는 다른 항원-제시 세포, 또는 종양 세포 상에 나타나는 수용체 또는 리간드를 표적으로 삼을 수 있다. 일부 수용체 또는 리간드는 하나 초과의 세포 유형에서 나타날 수 있으며, 따라서 특정 세포 유형에 나타나는 수용체 또는 리간드에 대한 모든 언급은 편의를 위한 것이며, 본 개시 내용 또는 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 없다.
종양 (예를 들어, 암)을 치료하기 위한 병용 요법에서 Zn(II) 제제와 함께 사용하기에 적합한 면역-종양 제제에 는 표적화되는 면역 성분의 관점에서 편의를 위해 하기 기재된 다음 제제들이 내포되지만, 이에 국한되지 않는다. I/O 제제의 현재 개발 상태에 대한 추가 정보는 Burugu, S. et al., Emerging Targets in Cancer Immunotherapy, Seminars in Cancer Biology 2018, 52, 39-52에서 제공된다.
특정 구체예들에서, 상기 면역-종양 제제는 예정된 세포 사멸 단백질 1 (PD-1) 억제제다. PD-1 억제제에 대한 정보, 이를 테면, 이들의 조성, 제조 방법, 제형화 방법, 투약 및 투여방법을 비롯한 정보들은 일반에게 공지 및 기술되어 있으며, 예를 들어., 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680 (이전에 AMP-514), AMP-224, 또는 BGB-A317와 같은 약물이 알려져 있다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 예정된 세포 사멸 단백질 리간드 1 (PD-L1) 억제제다. PD-L1 억제제에 대한 정보, 이를 테면, 이들의 조성, 제조 방법, 제형화 방법, 투약 및 투여방법을 비롯한 정보들은 일반에게 공지 및 기술되어 있으며, 이를 테면, 예를 들면, 아테졸리주맙, 아벨루맙, 두르발루맙, BMS-936559, CK-301, ZKAB001, 및 faz053과 같은 약물이 알려져 있다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 세포독성 T 림프구 연합된 단백질 4 (CTLA-4) 억제제다. CTLA-4 억제제에 대한 정보, 이를 테면, 이들의 조성, 제조 방법, 제형화 방법, 투약 및 투여방법을 비롯한 정보들은 일반에게 공지 및 기술되어 있으며, 예를 들면, 이필리무맙과 같은 약물이 알려져 있다.
PD-1, PD-L1, 및 CTLA-4 억제제는 면역 체크 포인트 억제제의 첫 번째 세트로서 언급되는데, 이러한 표지가 이 집단을 제한하거나 또는 특정하는 것으로 보일 수 있다. 아래에서 논의되는 바와 같이, 많은 다른 면역 체크 포인트가 억제제 또는 자극제의 표적으로 개발 중에 있다. 그럼에도 불구하고, 승인된 제품의 첫 번째 그룹이 당업자의 이해에 중요하다. 이들 I/O 제제의 상태에 대한 추가 배경은 Chae, Y. K. et al., Current landscape and future of dual anti-CTLA-4 and PD-1/PD-L1 blockage immunotherapy in cancer, Journal for Immunotherapy of Cancer 2018, 6, 39에서 제공된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3) 억제제다. LAG-3 (CD223)은 활성화된 T 세포, B 세포, 및 수지상 세포 상에서 발현되는 억제 수용체다. 명백한 활성화를 제어하고 자가 면역을 예방하기 위해서는 상향-조절(up-regulation)이 필요하지만, 종양 미세 환경에서 지속적으로 항원에 노출되면 수용력(capacity)이 감소된 소모형(exhausted) 표현형이 되는 것으로 보고되었다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 REGN3767, IMP321, BMS-986016, LAG525, 및 MK-4280-001이 내포된다. 수용체 및 임상 시험에 대한 논의는Andrews, L.P. et al., LAG3 (CD223) as a Cancer Immunotherapy Target, Immunol. Rev. 2017, 276(1), 80-96에서 제공된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 T-세포 면역글로블린- 및 뮤신-도메인-함유하는 분자 3 (TIM-3) 억제제다. TIM-3은 공동-억제 면역 수용체다. 이의 발현은 T-세포 활성화 후에 증가하는 것으로 보고되며, 일반적으로 종양 미세환경에서 T-세포의 가장 기능장애가 큰 집단을 표시한다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 TSR-022, LY3321367, Sym023, 및 MBG453이 내포된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 T-세포 면역글로블린 및 ITIM 도메인 (TIGIT) 억제제다. TIGIT는 Tregs, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ T 세포, 및 NK 세포 상에서 발현된다. 항-PD1 요법을 제공받은 마우스에서 TIGIT를 차단시키면 CD8+ T 세포의 활성이 개선된 것으로 보고되었다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 OMP-313M32, BMS-986207, MTIG7192A/RG6058이 내포된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 B7-H3 (CD276) 억제제다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 MGA271, MGD009 (듀얼-친화력 재-표적화 단백질)이 내포된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 T-세포 활성화 (VISTA) 억제제의 Ig 억제인자를 함유하는 V-도메인이다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 JNJ-61610588 및 CA-170 (소분자 약물)이 내포된다. VISTA의 면역 체크포인트 억제는 T 세포 증식과 사이토킨 생산을 활성화시키는 것으로 보고되었다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 유도성 T-세포 공동자극자 (ICOS) 억제제다. ICOS는 B7-결합 단백질의 CD28 패밀리의 수용체이며, 주로 활성화된 T 세포에 의해 발현되다. T-세포 활성화 및 작동체 기능을 유지하는 이중 역할을 하는 동시에 Treg 억제 활동에 참여함으로써 ICOS/ICOS-L이 면역-종양 요법에 적합한 표적이 되도록 만든다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 JTX-2011, BMS-986226, MEDI-570, 및 GSK3359609이 내포되는데, 이들은 모두 작용제 및 길항제 항체를 모두 포함한다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 CD27 억제제다. CD27은 이의 리간드인 CD70과의 결합을 통해 세포 활성화, 증식, 작동체 기능 및 세포 생존을 중개하는 세포-내 신호를 유도하는 T 세포 상의 공동-자극 분자다. 자극은 T-세포 활성화 및 항종양 활성을 유발하는 것으로 보고되었다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 CD27의 작용제인 CDX-1127 (Varlilumab)이 내포된다. I/O 제제 표적으로 하는 이의 리간드, CD70에는 ARGX-110, BMS-936561, 및 보르세투주맙 마포도틴이 내포된다.
특정 구체예들에서, 상기 면역-종양 제제는 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR) 억제제다. GITR은 Tregs 상에서 구성적으로 발현되며, 활성화된 CD8+ 및 CD4+ T 세포 상에서 유도된다. 이의 리간드 (GITR-L)에 결합함으로써 작동체 T 세포를 자극한다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 TRX518, MEDI1873, GWN323, 및 INCAGN01876이 내포된다. 추가 배경은 Knee, D. A. et al., Rationale for anti-GITR cancer immunotherapy, Euro. J. Cancer 2016, 67, 1-10에서 제공된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 CD47 억제제다. CD47의 과발현은 대부분의 암에서 관찰되었으며, 악성 세포에 의한 면역 감시에서 벗어나는 이유로 생각된다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 Hu5F9-G4, CC-90002, 및 TTI-621이 내포된다. 추가 배경은 Huang, Y. et al., Targeting CD47: the achievements and concerns of current studies on cancer immunotherapy, J. Thorac. Disease 2017, 9(2), E168-E174에서 제공된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO) 억제제다. IDO는 트립토판을 대사하는 면역 조절 효소이며, 이는 면역 억제성 종양 미세환경을 창출시킨다. IDO의 억제는 면역 세포의 증식과 활성화를 지원하고, 트립토판 대사산물의 면역억제 효과를 상쇄시킨다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 BMS-986205 및 에파카도스태트(epacadostat), Pf-06840003, GDC-0919, 및 NLG802 (소분자)가 내포된다.
특정 구체예들에서 상기 면역-종양 제제는 킬러 면역글로블린-유사 수용체 (KIR) 억제제다. 이 수용체를 차단하시키면 NK 세포가 활성화되고 궁극적으로 종양 세포가 파괴된다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 IPH2101, IPH4102, 및 릴리무맙(lirilumab)이 내포된다.
특정 구체예들에서, 상기 면역-종양 제제는 CD94/NKG2A 억제제다. CD94/NKG2A는 HLA-E에 결합하는 억제 수용체다. 이 리간드는 일반적으로 종양 세포에서 상향-조절되고 발현되어 활성화되므로, 따라서 종양 미세 환경에서 이러한 결합을 차단시키는 억제제 I/O 제제는 NK 및 세포 독성 T 세포 반응의 발생을 허용한다. 현재 개발중인 I/O 제제에는 모날리무맙 (IPH2201)이 내포된다.
키트
본 발명은 Zn(II) 제제를 포함하는 키트, 그리고 일부 구체예들에서, I/O 제제, 이를 테면, 면역 체크포인트 억제제, 항-PD-1 항체, 또는 상기 기술된 치료 방법을 수용하기 위하여 개시된 임의의 다른 면역-종양 제제를 포함하는 키트를 더 고려한다.
키트는 전형적으로 당해 키트 내용물의 의도된 용도를 명시한 라벨을 포함한다. 용어 "라벨"은 당해 키트 상에 또는 당해 키트와 함께 공급되는, 또는 그렇지 않으면 키트에 수반된 임의의 기재된 또는 기록된 물질을 포함한다. 따라서, 본 명세서는 (a) 유효 투여량의 Zn(II) 제제, 그리고 (b) Zn(II) 제제 사용 지침서를 포함하는, 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 키트를 제공한다.
다른 구체예들에서, 본 명세서는 병용 요법으로 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 키트를 제공하는데, 이때 이 키트는 다음을 포함한다: (a) 유효 투여량의 Zn(II) 제제 및 유효 투여량의 면역-종양 제제; 그리고 (b) 본원에 개시된 방법에 따라 면역-종양 제제와 병용되는 Zn(II) 제제의 사용 지침.
다른 구체예들에서 본 명세서는 병용 요법으로 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 키트를 제공하는데, 이 키트는 다음을 포함한다: (a) 유효 투여량의 Zn(II) 제제 및 유효 투여량의 두 가지 면역-종양 제제; 그리고 (b) 본원에 개시된 방법에 따라 면역-종양 제제와 병용되는 Zn(II) 제제의 사용 지침.
다른 구체예들에서 본 명세서는 암에 걸린 대상체를 치료하기 위한 키트를 제공하는데, 이 키트는 다음을 포함한다: (a) 유효 투여량의 Zn(II) 제제 및 유효 투여량의 항-PD-1 항체 또는 이의 항원-결합 부분; 그리고 (b) 본원에 개시된 임의의 방법에서 항-PD-1 항체와 병용되는 Zn(II) 제제의 사용 지침.
일부 구체예들에서, 상기 Zn(II) 제제 및 I/O 제제는 단위 투약형으로 공동-포장될 수 있다. 인간 환자들을 치료하기 위한 특정 구체예들에서, 상기 키트는 본원에 개시된 항-인간 PD-1 항체, 예를 들면, 니볼루맙, 펨브롤리주맙, MEDI0680 (이전에 AMP-514), AMP-224, 또는 BGB-A317를 포함한다. 특정 구체예들에서, 상기 키트는 상기에서 개시된 하나 또는 그 이상의 임의의 I/O 제제를 포함하는데, 이들은 각 조합이 이 안에 별도로 내포된 것처럼 포함된다.
본 발명은 하기 실시 예에 의해 추가로 설명된다.
실시예
실시예 1: Zn(II) 제제 C004의 제조
Zn(II) 제제 C004 (구조에 대해서는 도 1A 참고; 아연 염 45 kDa γ-PGA (콘쥬게이트안됨))를 다음과 같이 제조하고, 제형화하였다. 염화나트륨, 그리고 물. 황산 아연 7 수화물과 45kDa γ-PGA (다분산)를 염화나트륨과 트로메타몰이 함유된 수용액에서 혼합하고, 물을 부피 조절을 위해 첨가하고, 필요에 따라 pH를 7.0로 조정했으며, 이때 각 성분의 농도는 1:4.5의 Zn/글루타메이트 단량체 몰 비에서 1mg/mL의 아연 (II), 10mg의 γ-PGA 그리고 1mM의 트로메타몰, 1mM 염화나트륨이다.
실시예 2: Zn(II) 제제 C005D의 제조
Zn(II) 제제 C005D (구조에 대해서는 도 1A 참고; 엽산-PEG4-NH2 및 cRGDfK-PEG4-NH2에 콘쥬게이트된 45 kDa γ-PGA의 아연 염)를 다음과 같이 제조하고, 제형화하였다. 우선, EDC 커플링 반응을 통해 Boc-NH2-PEG4-NH2를 엽산의 꼬리 카르복실기에 커플링시킨 후, TFA 탈-보호를 통해 엽산 -PEG4-NH2를 제조하였다. 유사하게, 2HN-PEG4-COOH를 cRGDfK의 리신 아민에 EDC 커플링에 의해 커플링시켜 cRGDfK-PEG4-NH2를 제조 하였다. 그 다음, 완전하게 양성자화된 45kDa γ-PGA (다분산)를 1-포트 EDC 커플링 반응에서 1:3:3의 비율로 엽산-PEG4-NH2 및 cRGDfK-PEG4-NH2에 콘쥬게이트시키고, 여기서 100%의 엽산과 cRGDfK 모이어티는 γ-PGA에 성공적으로 결합되었다. 생성된 γ-PGA 콘쥬게이트를 용매 교환에 의해 정제시키고, 염수에서 아연:글루타메이트 단량체 = 1:4.5의 몰비로 황산 아연을 첨가하고, pH는 ~ 6으로 조정하여 Zn(II) 제제 C005D를 얻었다.
실시예 3: HeLa 세포에 대한 Zn(II) 제제의 세포독성
C004 (실시예 1 참고) 및 상이한 분자량의 콘쥬게이트안됨 PGA 중합체를 포함하는 유사한 Zn(II) 제제의 HeLa에 대한 세포독성을 아연 (II) 농도의 함수로써 테스트하였다. 특이적 테스트 조건 및 결과는 도 2A-2B에 나와 있다. 도 2A에서 Zn(II)의 공급원은 황산 아연 또는 염화 아연이었다. 도 2B에서 Zn:AUT의 비율은 1:4.5 또는 1:1이었다.
HeLa 세포의 세포 배양물 준비. ATCC 지침에 따라, 세포 배양물은 Freshney R., Culture of Animal Cells (6th ed.) vol. 346 (2010)에서 기재된 바와 같이 준비되었다. 간략하게 설명하자면, 10% 소 태아 혈청 (FBS)이 보충된 Eagle 's Minimum Essential Medium (EMEM)이 완전 성장 배지 (CGM)로 사용되었다. 37℃ 및 5% CO2에서 성장한 새로운 흡착성 세포를 0.25% (w/v) 트립신-EDTA (0.53mM) 용액으로 철저히 헹구어 미량의 모든 트립신 억제제를 제거했다. 세포층 분산을 위해 헹구어 낸 플라스크에 3.0 mL의 트립신 -EDTA 용액을 15 분 동안 첨가함으로써, 세포를 분리하고 분해한 다음, 7.0 mL의 CGM을 첨가하여 추가 세포 해리를 위해 부드럽게 피펫팅하였다. 해리된 세포 현탁액을 1:4 비율로 새로운 배양 용기에 분취한 후, 계대배양(subculturing) 또는 세포주 실험 준비를 위해 37℃에서 항온처리했다.
세포 생존력 테스트. CCK-8 테스트는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다. 간단히 말해서, 대상이 되는 배양된 세포를 특정 시간 동안 특정 처리제와 함께 96-웰 플레이트에서 항온처리했다. 관심 조건에서 10 μL의 WST-8 용액을 추가하고 37℃에서 1 시간 동안 항온처리했다. 그 다음 플레이트는 세포 생존력 정량화를 위해 460nm에서 흡광도를 측정했다.
도 2A-2B에 보고된 연구에서 Zn(II) 제제는 테스트된 중합체 분자량의 중간 범위에서 최대 세포독성을 나타내고, 하단(lower end)의 세포독성과 비교하여 상단(upper end)의 세포독성이 더 낮다. 또한, 1:4.5의 Zn:GAU 비율은 100 kDA 미만의 모든 γ-PGA의 경우 1:1 비율 제제보다 더 지속적으로 세포독성을 나타내었다.
실시예 4: HeLa 세포에서 C004 및 C005D의 IC50 결정.
HeLa 세포에서 C004 (실시예 1 참고) 및 C005D (실시예 2 참고)의 IC50가 결정되었다. 실시예 3에 기재된 테스트 방법이 이용되었고, 그 결과는 도 3A-3B에 나타낸다.
도 3A에 나타낸 바와 같이, HeLa에 대한 C004에 대한 IC50은 24 시간과 48 시간에 각각 15.18μg Zn/mL과 15.30μg Zn/mL이었다. 도 3B에 나타낸 바와 같이, C005D의 IC50은 24h에서 4μg Zn/mL이었다.
실시예 5: 세포 사멸 기전 분석
HeLa 세포를 시험관내에서 C004에 노출시키는 것은 6 시간 후에 폴리(ADP-리보스) 중합체 (PAR 중합체)의 시간 및 용량-의존적 축적을 유도했으며, 이는 응집된 핵을 나타내는 괴사 세포의 출현과 일치했다 (도 4A 및 4B). 프로피듐 요오드화물 (PI) 및 Annexin-VD-634 (AnxV)를 사용한 사멸 방식의 유세포 분석 특징화에서 괴사 세포 사멸의 확증 패턴을 보여 주었으며, 이에 따라 죽어가는 세포는 22μg Zn/mL C004에서 6 시간 항온처리 후, PI와 AnxV 모두를 동시에 흡수하는 것으로 나타났고, 이는 누출 핵 및 세포막을 나타낸다 (도 4C). 반면, 시간별-젖산 탈수소 효소 (LDH) 방출 분석은 동일한 조건에서 24h 후에만 괴사 누출을 나타냈다 (도 4E 참조).
파르타나토스의 특징적인 것으로 보고된 사건 (Andrabi, SA et al. PNAS, vol. 111, p. 10209-10214 (2014) 참조)과 일치하여, 2h 처리 후 세포 NAD+ 및 ATP의 투여량-의존적 고갈된 다음 이 세포 사멸이 이루어졌다(도 4D). 특정 PARP-1 억제제 PJ34와 C004의 24h 공동-항온처리는 LDH 방출 검정법에 의해 분석된 바와 같이(도 4E) 괴사 사멸을 억제했다. 유사하게, 도 4E에서도 볼 수 있듯이, 파르타나토스에서 주요 하류 효소들중 일부의 억제제(사이클로스포린A (MPTP 형성), 네크로스태틴-1 (RIP1), 3-MA (p62/SQSTM1), 및 피퓌트린-μ (p53 및 p62/SQSTM1의 이중 억제)를 비롯하여)는 HeLa 세포에서 괴사성 세포독성의 억제를 또한 유도하였다. 반대로, PDTC에 의한 JNK 활성화로부터 p62/SQSTM1의 항진은 IC50 괴사 세포 독성의 변화를 일으키지 않았다. 마지막으로, 특이적 PARG 억제제 PDD 00017273은 또한 괴사성 세포독성을 억제했고, 이는 PARP1-PARG NAD+ 이화 주기(catabolism cycle)가 파르타나토스 동안 세포독성 결정 인자임을 암시했다. 이러한 발견은 이전에 제안된 RIP1과 p62/SQSTM1이 C004- 의해 유도된 파르타나토스의 주요 하류 세포 독성 기전으로 협의된 괴사를 총괄적으로 암시했다 (도 18). Goodall, M. L. et al., Developmental Cell, vol. 37, 337-349 (2016) 참고.
실시예 6: 50개 암 세포 계통에서 Zn/γ-PGA 제제 C004의 효과
이 연구에서 Zn(II) 제제가 세포 생존력에 미치는 잠재적 영향을 50 개의 암 세포주에서 조사했다. 50% 억제 농도 (IC50)는 다양한 농도의 활성제와 함께 항온처리한 후 CellTiter-Glo 발광 세포 생존력 분석을 사용하여 암 세포주에서 결정되었다. 각 세포주는 활성 Zn(II) 제제, 대조군으로써 표준 화학 요법 약물, 그리고 비히클 대조군으로써 배양 배지로 처리했다.
이 실시예에 이용된 약어: CTG: CellTiter-Glo; DMSO: 디메틸 술폭시드; FBS: 태아 소 혈청; IC50: 50% 억제 농도; ID: 정체성(Identity); Lum: 발광; PBS: 인산염 완충 염수; RT: 실온.
세포 계통. 모든 세포주는 37℃, 5% CO2 및 95% 습도에서 10-15% FBS가 보충된 배지에서 배양되었다. 모든 세포주에 대한 참조 대조군 약물은 게놈 분석에 사용되는 시스플라틴이다. 테스트된 세포주, 조직 기원은 아래 표 1에 나와 있다:
Figure pct00001
재료 및 시약.
일반 세포 배양 시약 및 플라스틱.
FBS, (Cat# FND500, ExCell Bio. -20℃에 보관)
FBS, (Cat# 10091148, Gibco. -20℃에 보관)
96-웰 평면 투명 하단 검정색 폴리스티렌 TC-처리된 마이크로플레이트 (Cat # 3340, Corning).
CellTiter-Glo® 발광 세포 생존력 검정법 (Cat# G7572, Promega. -20℃에 보관)
기질은 96-웰 플레이트에서 검정 당 100 μL에서 1,000 분석에 충분하다.
다음이 내포됨:
ㆍ 1 × 100 mL CellTiter-Glo® 완충제
ㆍ 1 × vial CellTiter-Glo® 기질(동결건조됨)
시약 제제
a. CellTiter-Glo 완충제를 해동시키고, 사용하기 전에 실온으로 평형화시킨다. 편의를 위해, CellTiter-Glo Buffer는 해동하여 사용 전 최대 48h 동안 실온에서 보관할 수 있다.
b. 사용하기 전, 동결건조된 CellTiter-Glo 기질을 실온으로 평형화시킨다.
c. 동결건조된 효소/기질 혼합물을 재구성하기 위해, 적절한 부피 (100 mL)의 CellTiter-Glo 완충제를 CellTiter-Glo 기질이 들어있는 호박색 병으로 옮긴다. 이것은 CellTiter-Glo 시약을 형성한다.
주석: CellTiter-Glo Buffer 병의 전체 액체 부피를 CellTiter-Glo 기질 바이알에 추가할 수 있다.
d. 부드럽게 볼텍싱하거나, 휘돌리거나, 또는 내용물을 위-아래로 뒤집어 혼합시킴으로써, 균일한 용액을 얻는다. CellTiter-Glo 기질은 1 분 안에 쉽게 용액에 들어갈 것이다.
Zn(II) 제제 및 참조 대조군 약물.
Zn(II) 제제 테스트 물품은 다음과 같다:
Figure pct00002
화합물의 원 용액(stock solution)을 분취 액으로 나누고, 4℃ 냉동고에 보관했다. 상기 Zn(II) 제제 C004 조성물은 다음과 같다:
Figure pct00003
참조 대조군 약물은 다음과 같다:
Figure pct00004
장비. EnVision Multi Label Reader 2104-0010A, Perkin Elmer (USA), Equip ID: TAREA0020; Countstar, Inno-Alliance Biotech (USA), Equip ID: BEANA0020; Forma Series II Water Jacket CO2 Incubator, Thermo Scientific (USA), Equip ID: BEINC0190/ BEINC0200/ BEINC0220/ BEINC0260; Biological safety Cabinet, Thermo Scientific (USA), Equip ID: BEBSC0170/ BEBSC0180/ BEBSC0250/ BEBSC0270; Clean bench, HDL Apparatus (China), Equip ID: BACLB0390; Biomek FXP Laboratory Automation Workstation, BECKMAN COULTER (USA), Equip ID: BESTA0010; Inverted Microscope, Olympus CKX41SF (Japan), Equip ID: BEMIC0190; Multidrop combi, Thermo Scientific (USA), Equip ID: BEPFL0010.
최대 억제 농도의 절반 IC50을 결정하는 절차
1. 대수 성장 기간 동안 수확된 세포와 Count-star를 사용하여 세포 수를 계산한다.
2. 각 배양 배지를 사용하여 세포 농도를 4.44 x104 세포/mL로 조정했다.
3. 최종 세포 밀도가 4x103 세포/웰인 두 개의 96-웰 플레이트 (플레이트 A 및 B)에 90 μL 세포 현탁액을 추가했다. (세포 농도는 데이터베이스 또는 밀도 최적화 분석에 따라 조정되었다.)
4a. 다음 날: T0 판독 플레이트의 경우:
1) T0 판독을 위해 플레이트 A의 각 웰에 10 μL 배양 배지를 추가했다.
2) 약 30 분 동안 RT에서 플레이트와 그 내용물을 평형화시켰다.
3) 각 웰에 50μL CellTiter-Glo 시약을 추가했다.
4) 세포 용해를 유도하기 위해 궤도 셰이커(orbital shaker)에서 5 분 동안 내용물을 혼합했다.
5) 플레이트를 RT에서 20 분 동안 항온처리하여 발광 신호를 안정화시켰다.
6) EnVision Multi Label Reader를 사용하여 기록된 발광 (T0)을 기록했다.
4b. 테스트 판톡 플레이트의 경우:
1) Zn(II) 제제 테스트 물품의 10× 용액을 준비했다. 상부 작업 농도: Zn(II) 제제의 50, 25, 10, 5, 2.5, 1, 0.5, 0.25 및 0μg/mL 농도의 9 가지 투여량 수준을 달성하기 위해, 2/2.5-배 연속 희석된 배지에서 50μg/mL의 테스트 물품).
2) 10×참조 대조군 용액 시스플라틴을 준비했다. 상부 작업 농도: 100 μM, 31.6 μM, 10 μM, 3.16 μM, 1 μM, 316 nM, 100 nM, 31.6 nM 및 10 nM 농도의 시스플라틴의 9 가지 투여량 수준을 달성하기 위해 3.16-배 연속 희석이 있는 배지에서 100 μM.
3) 플레이트 B의 각 웰 (각 약물 농도에 대해 3 중)에 테스트 물품 및 참조 대조군의 10 μL (10x) 약물 용액을 분배했다.
4) 5% CO2로 37℃의 가습 인큐베이터에서 테스트 플레이트 B를 96 시간 동안 항온처리한 다음, CTG 분석으로 측정했다.
5) 약 30 분 동안 RT에서 플레이트와 그 내용물을 평형화시켰다.
6) 각 웰에 50μL CellTiter-Glo 시약을 추가했다.
7) 세포 용해를 유도하기 위해 궤도 셰이커에서 5 분 동안 내용물을 혼합했다.
8) 플레이트를 RT에서 20 분 동안 항온처리하여 발광 신호를 안정화시켰다.
9) 발광을 기록했다.
데이터 분석
10) 데이터는 GraphPad Prism 5.0을 사용하여 그래픽으로 표시되었다.
11) 절대값 IC50 (EC50)을 계산하기 위해, 시그모이드 투여량 반응이 있는 비-선형 회귀 모델을 사용하여 투여량-반응 곡선을 피팅했다. 생존율을 산출해내는 공식은 다음과 같으며, 절대값 IC50 (EC50)은 GraphPad Prism 5.0에서 생성된 투여량-반응 곡선에 따라 계산되었다.
12) 생존율 (%) = (LumTest 물품 -LumMedium 대조군)/(LumNon-처리된 -LumMedium 대조군) × 100%.
결과.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
각 세포주에 대한 투여량-반응 곡선은 도 5A-5I에 나와 있다.
실시예 7: 유전적 불안정성 돌연변이 (GIM) 분석
C004's 파르타나토스 기전을 감안할 때, 유전적 불안정성 돌연변이는 더 큰 PARylation 잠재력을 부여하여 C004에 대한 암 민감성을 높여야 한다. 따라서, 상동성 재조합 복구, 뉴클레오티드 절제 복구, 직접적 역전, 염기 절제 복구, 미스매치 복구, DNA 손상 신호 및 기타 관련 기능을 둘러싼 단일 돌연변이 효과 분석을 스크리닝 결과를 사용하여 테스트했다. 시스플라틴 데이터는 양성 대조군으로 사용되어, 세포주에서 수집된 게놈 정보의 품질을 보장하고, MSH2mt에 대한 시스플라틴 내성, BRCA1mt에 대한 민감도의 연관성 (도 8 참조). , PARGmt에 의해 부여된 세포 자멸사 저항성, ATM 및 BRCA1과 같은 대부분의 DNA-복구 유전자의 조합(도 10F)과 BRCA1WT와 CREBBmt + KRASmt에 대한 저항성 사이의 많은 합성 치사율 예(도 10D)에 대한 의미있는 해석을 보장한다. C004 IC50 분포에 대해 동일한 게놈 정보를 적용하면 PARP1, PARP2, TP53, MGMT, XRCC1, ERCC1, ERCC4, ERCC6, RFC1, MLH1, PMS2, ATM, ATR, BRCA1, BRCA2, PAXIP1, 및 WRN를 포함하는 대부분의 테스트된 DNA-복구 유전자들의 돌연변이와 연합된 약물 민감성 연합이 입증되었다. JAK1mt, CREBBPmt, NEIL3mt, 및 NFKB1mt는 또한 민감성 증가와 또한 연합되었다 (도 8 및 도 10F-10L). 돌연변이 유발의 가장 널리 퍼트리는 구동요인 중 하나인 APOBEC3B 과다발현 효과를 연구함으로써, 돌연변이 로드에 대한 C004의 향상된 효능에 대한 가설을 추가 검사하여 ssRNA 카피 수와 C004 IC50 값 분포 사이에 네가티브 상관 관계를 보여줌으로써, 일관된 결과를 또한 나타내었다 (도 11A-11D). 이러한 모든 관찰은 C004의 세포 독성이 파르타나토스(parthanatos) 기전이 관련된다는 결정을 뒷받침한다.
또한 이 메커니즘을 뒷받침하기 위해, PARG (PAPR1-PARG NAD + 이화작용 주기), NEIL1 또는 NEIL2 (염기 절제 복구 시작)와 같은 NAD+ 고갈에 대한 효율적인 PARP1의 활성을 위한 필수 파트너에서 돌연변이는 약하지만, 일관된 내성이 있는 것으로 관찰되었 (도 8), 한편 이들의 조합은 C004 효능의 현저한 감쇠를 증가시켰다(도 10B-10C 및 도 10J-10K). 시스플라틴에 대한 강한 저항성을 보인 CREBBPmt-KRASmt-BRCA1WT 조합은 또한 C004에 대한 다소 덜하지만 유의미한 저항성과 연관되어, 돌연변이 조합을 잠재적 저항 기전으로 주목받았다. 끝으로, PD-L1 체크포인트 억제제에 대한 내성 발달 (JAK1 24), 자가사멸 (TP53, BAK1), 그리고 다양한 항신생물 약물 및 다중약물 저항성 (TP53 25, 26, MLH1, MSH2, PMS2 27 및 NFKB1)에 대한 공지의 돌연변이 유발자의 조사에서 C004 세포독성은 이들 약물 저항성 유발 돌연변이에 대해 더 많이 활성을 보여주지 않는다면(JAK1, TP53, MLH1, PMS2, NFKB1) (도 8, 도 10), C004 세포독성은 미온적이다 (BAK1, MSH2).
실시예 6에 설명된 50 개의 세포주 스크리닝 테스트 (OmniScreenTM) 에 따라, OncoExpressTM 데이터베이스 (Crown Biosciences Inc., Santa Clara, data accession date 18th May 2018 ~ 30th May 2018)를 컨설팅함으로써, 다음 유전자들에 돌연변이 존재(예 또는 아니오)에 대해 각 세포주의 목록을 만들었다.
ㆍ MLH1 (결함 미스매치 복구의 일부분 ㆍ dMMR- 돌연변이 그룹)
ㆍ MSH2 (결함 미스매치 복구의 일부분 ㆍ dMMR- 돌연변이 그룹)
ㆍ PMS2 (결함 미스매치 복구의 일부분 ㆍ dMMR- 돌연변이 그룹)
ㆍ PARP1
ㆍ BRCA1 (BRCA1/BRCA2 돌연변이 그룹의 일부분)
ㆍ BRCA2 (BRCA1/BRCA2 돌연변이 그룹의 일부분)
ㆍ TP53
이들 유전자 각각은 중요한 DNA 복구 효소 중 일부를 인코드하고, 이들 유전자 중 어느 하나 또는 이들의 조합에서 돌연변이를 휴대하는 세포주는 유전적 불안정성이 예상될 수 있다.
Zn/γ-PGA 및 시스플라틴 IC50 값의 통합 데이터 표와 선택한 50 개 세포주에 걸친 세포주 유전자 돌연변이 데이터가 도 6에 나와 있다. 통합 데이터는 Excel® 소프트웨어 (Microsoft, Seattle)를 사용하여 분석되었다. 간단히 말해서, Excel® 소프트웨어의 분류 알고리즘은 특정 돌연변이를 휴대하고 있는 세포주를 그룹화시키고, 각 그룹의 IC50 분포를 추가로 분석하는데 사용되었다.
특정 유전적 돌연변이를 공유하는 세포주 그룹 간의 IC50 분포는 통계적 유의성에 대해 분석되었다.
JMP 13 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA) 또는 Origin 9 (Origin Lab Corp., Northampton, MA, USA)를 이용하여 통계학적 분석이 실행되었다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시되며, Mann-Whitney U 테스트 또는 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 테스트했다. <0.05의 p- 값은 통계적으로 유의한 것으로 해석되었다.
결과 및 분석.
세포주 패널 구성을 계층화시킨 50 개의 세포주에는 30 개의 혈액 암 (백혈병 17개 및 림프종 세포주 13 개) 그리고 유방암 (3개), 자궁 경부암 (1개), 결장 직장암 (1개), 간암 (4개), 폐암 (4개), 난소암 (2개), 췌장암 (2개), 전립선암 (2개) 및 자궁암 (1개) 세포주가 내포된 고형 종양 암 20 개가 포함되었.
Zn(II) 제제에 대해 얻은 결과를 광범위한 스펙트럼 화학요법에 대한 현재 치료 표준인 시스플라틴과 비교해 보면, Zn(II) 제제는 48 개 (50 개 중) 세포주에서 99% 이상 제거되고, 전체 50 개 세포주에서 97% 이상 제거되었는데, 시스플라틴의 경우 39 개 (50 개 중)의 세포주에서만 99% 이상 제거되고, 45 개 세포주에서 97% 이상 제거되었다. 반대로, 시스플라틴은 2 개의 세포주에서 90% 미만의 살균 반응이 불량한 반면, Zn(II) 제제에 대한 반응이 불량한 세포주는 없었다.
Zn(II) 제제 치료에 대한 100% 반응률과 낮은 Z-값 확산 (도 6 참조)은 모든 다양한 암 유형에 걸쳐 Zn(II) 제제에 대한 광범위한 스펙트럼 적용 가능성을 보여준다. 특히, 데이터는 Zn(II) 제제가 다음 DNA 복구 유전자 중 하나 또는 그 이상에서 돌연변이를 주최하는 암 세포 유형에 대해 현재 승인된 치료 표준보다 더 효과적이라는 것을 보여준다: dMMR (MLH1/MSH2/PMS2), PARP1, BRCA1/BRCA2, 및 TP53. 상당수의 암 세포는 이들 유전자 중 하나 또는 이상에서 돌연변이를 휴대하고 있으며 (추정치는 모든 암의 ~ 90-95% 임), 따라서 본원에 개시된 방법이 암에 대한 광범위한 스펙트럼 치료제임을 나타낸다.
전체 세포주 세트, 혈액암 대 고형암 그리고 돌연변이에 의해 계층화된 세포주에 대한 데이터 분석이 도 9A-9F 및 10M-10P에 나와 있다.
실시예 8: 50 개 세포주 스크린을 기반으로 한 바이오마커 발견.
발현 및 돌연변이는 RNAseq 데이터에서 얻었다. 50 개 세포주의 RNAseq 미가공(raw) 데이터는 CCLE 데이터베이스 및 SRA 데이터베이스 (HeLa 세포주의 경우 SRR6799773)에서 다운로드되었다. 유전자 카피 수 결과는 CCLE 웹 사이트에서 다운로드되었다. 구동자(driver) 돌연변이는 Cancer Genome Interpreter 데이터베이스 (www.cancergenomeinterpreter.org/home)에서 예측되었으며, 구동자 돌연변이만 돌연변이 분석에 사용되었다. Welch의 t-test는 야생형 세포주와 삭제된/증폭된/돌연변이된 유전자 사이의 평균 log2(IC50)를 비교하고, 유의적인 유전자 식별을 위해 사용되었다. 유전자 발현 수준과 log2(IC50)의 상관관계를 확인하기 위해 Spearman 상관 관계 검사를 사용하였다. 시그니처 유전자는 R에서 Boruta 패키지를 사용하여 유의 한 유전자에서 선택되었다. LPS (X) = ΣajXj 형태의 각 세포주에 대한 선형 예측 자 점수 (LPS)를 산출했고, 이때 Xj는 유전자 j의 유전자 발현을 나타내고, aj는 민감한 세포주와 둔감한 세포주 사이의 t-test에 의해 생성된 t 통계이다. 민감한 그룹과 둔감한 그룹에서 LPS 분포의 평균과 분산을 추정하고, 당해 그룹 (민감한 그룹 또는 둔감한 그룹)에 속할 세포주는 Bayes의 법칙을 적용하여 예측된다:
Figure pct00008
여기에서
Figure pct00009
(x; μ,σ2)는 정상 밀도 함수를 나타내고, 평균 μ, 및 분산(variance) σ2 및 μ1, σ12, vμ2, σ22는 그룹 1과 그룹 2에서 차례로 LPS의 관찰된 평균 및 분산이다. 모든 통계 분석은 R로 수행되었다.
서열-기반 자동화된 생물정보학 접근법을 이용한 초기 바이오마커 검색에서 C004 민감성에 대한 잠재적 바이오마커로 ADAM6 del, CREBBP mt, 및 PIK3CA WT 를 얻었다 (도 12A-12C).
실시예 9: Zn(II) 제제의 생체내 테스트.
Zn(II) 제제 C004: 6-일 반복 독성 테스트는 일일 최대 2.5mg Zn/kg 용량으로 C004를 매일 정맥 주사하여 수행했다. CT26 종양을 품고 있는 BALB/c 마우스에서 독성이 관찰되지 않았지만, 유의미한 치료 활성 (p = 0.072)이 기록되지 않았다. (도 13).
Zn(II) 제제 C005D: 인간 환자로부터-구동된 간 세포 암종 (HCC PDX-NSG)을 품고 있는 NSG 마우스의 면역결합 생체내 모델에서 일일 주사 투여량으로 1mg Zn/kg 또는 2mg Zn/kg의 투여 (* p<0.05)의 경우 이 암종에 대한 유의적인 치료요법적 활성이 관찰되었다(도 14A). 또한, 인간화된 면역 마우스 (HCC-PDX-HuMice)에게 HCC PDX에 대한 C005D를 일일 2mg Zn/kg으로 투여하면, 20-일 치료 기간 종료 시 두 마리 동물에서 완전한 종양 퇴행을 관찰되어, 유의적인 종양 억제 효과가 나타났다(도 14B).
실시예 10: 단일요법 및 면역-종양 제제 병용 요법 및 면역요법 상호작용
CT26 뮤린 암을 품고 있는 면역적격성(immunocompetent) BALB/c 마우스에게 14일간의 치료 프로토콜에서 단일요법 PD-1 억제제, aPD1 (매주 1회 5mg/kg, i.v.) 또는 C005D (2mg Zn/kg, 매일 i.v.)의 단일 요법 군과 더 낮은 용량의 C005D (0.5mg Zn/kg C005D, 매일 i.v. + 5mg/kg aPD1, 매주 i.v.)을 이용한 병용 요법 군으로 처리후, 10일간 관찰하였다. 상기 프로토콜 요약, 각 암에 대한 종양 성장 역학 및 종점 종양 크기는 도 15에서 제공된다.
aPD1 (5mg/Kg, 매주 1회, i.v.) 또는 C005D (2mg Zn/Kg, 매일 i.v.)의 단일요법 군에서 통계적으로 유의적인 종양 성장 억제 효과를 나타내지 않았다. 그러나, 말초 혈액 샘플 및 수집된 종양으로부터의 종점 면역 특성에서는 두 단일 요법 군 사이의 면역에서 뚜렷한 차이를 드러냈다. 면역 특성화를 위한 게이팅(gating) 전략은 도 16에 나타낸다. 구체적으로, aPD1 단일요법의 유의적인 (* p <0.05) 면역 자극 효과는 종양내 공간에 국한되어, NK 세포, Ly6C+ 단핵구 (MN), 수지상 세포 및 연구된 모든 CD4 + T 세포 하위 집합 및 CD8 + T 세포 하위 집합은 상승했다. (도 17A-17B 참고) 반면에, C005D 단일 요법은 말초 혈액 구획과 종양 내 공간 모두에서 면역력을 크게 향상시켰지만, 후자의 경우 그 정도가 덜하다.
그러나, 병용 치료군은 단일요법 군보다 말초 및 종양 내 구획 모두에서 더 광범위하고 유의미적인 (* p <0.05, ** p <0.01) 면역 상승을 초래했다. 조합 군에 특이적으로, 기억 세포 EM CD8 + T 세포 및 CM CD8 + T 세포의 종양 내 수준은 마우스의 종양 부하와 역-관계를 보였고, 동일한 그룹에서 완전한 종양 퇴행의 두 사례도 관찰되었다.
상기 시험 결과는 Zn(II) 제제 병용 요법이 PD1 차단과 함께 면역-자극 및 상승 작용을 유발한다는 것을 나타낸다. 또한, 이러한 결과는 aPD1과 C005D의 병용이 종양 제거에 필요한 특정 CD8+ T 세포 기억의 형성을 가속화할 수 있음을 시사한다.
Zn(II) 제제 C005D가 투여될 때, 종양 세포에서 발생하는 것으로 생각되는 사건의 개략도가 도 19에 제시되어 있다. Zn(II) 제제에서 방출된 아연 (II) 이온은 PARP-1을 과도하게 구동시키며, 동시에 카스파제-3으로부터 PARP-1 보호를 부여함으로써 PAR 중합체 축적을 유도한다. 차례로, PAR 중합체 생산 및 축적은 AIF-중개된 핵 괴사, MLKL-중개된 미토콘드리아 괴사 그리고 MPTP-중개된 미토콘드리아 괴사를 포함한 다중 괴사 사멸 모드에 대한 접근을 가능하게 한다. 상기 도면의 오른쪽으로 계속해서 PARP-1 과다구동으로 인한 괴사는 DAMP 방출을 통해 CD8+ T 세포 종양 제거 활성을 프라이밍시킴으로써 2 차 면역치료 효과를 부여한다. 묘사된 사건이 본 명세서의 개시 내용과 일치하지만, 본 발명의 조성물, 제형 및 치료 방법은 도면에 의해 뒷받침되는 이론에 의해 구속되거나 또는 국한되지 않는다.
실시예 11: 인간화된 마우스 테스트 및 종양 침윤 백혈구 분석에서 간세포 암종 환자-유래된 이종이식편.
실험용 약물.
펨브롤리주맙 25mg/mL (Keytruda®, Merck® KGa)는 Merck®에서 구입했다. 등장성 황산 아연 감마-폴리글루타메이트 용액은 Tris 완충제(1mM)를 사용하여 pH 7.0에서 원소 아연 농도 1mg/mL 및 감마-폴리글루타메이트 농도 10mg/mL에서 제조되었다.
NSG 및 Humice.
마우스를 사용한 모든 조작 및 절차는 Agency for Science, Technology and Research (A * STAR) 및 Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)의 승인을 받았다. 제공된 식단은 조사된 TEKLAD GLOBAL 18% Protein Rodent Diet (2918)이다. 마우스는 무균 환경에 가둬두고, BSL2 후드를 통해서만 접근했다. 마우스에게 먹이 및 물을주고, 건강을 매일 모니터링하고, 우리는 매주 교체했다.
NSG 마우스는 Jackson Laboratory에서 구입하여, 싱가포르 A * STAR의 Biological Resource Centre (BRC)에있는 특별 병원균이 없는 시설에서 사육되었다. 1 ~ 3 일령 NSG 새끼에게 1.1 Gy에 해당하는 55초 노출로 조사하고(irradiated), 간-내(intra-hepatic) 주사에 의해 1x105 CD34+ 인간 태아 간 세포를 이식했다. 인간 면역 세포 재구성 분획율(fraction)을 결정하기 위해 이식-후 8 주에 마우스로부터 채혈하였다. 재구성은 다음과 같이 산출되었다: [%hCD45+/(%hCD45+ +%mCD45+)]. 인간 CD45+ 세포의 20-50%로 재구성된 8-10 주령의 인간화된 마우스를 생착(engraftment)에 사용했다.
HCC-PDX 종양 유지 및 이종이식편(xenografts).
생체내 HCC-PDX 피하 인간화된 모델 확립을 위해, 환자 HCC 종양을 HCC 수술 표본으로부터 수집했다. 수술 전, 모든 환자는 HCC 샘플을 연구에 사용할 수 있도록 서면 동의를 제공했다. 적절한 임상 조직을 채취한 후, 나머지 HCC는 10% FCS, 1% 페니실린/스트렙타비딘을 포함하는 DMEM으로 구성된 배지와 함께 얼음에 옮겨져, PDX가 확립된다. 4시간 이내, 멸균 수술기구를 사용하는 HCC 단편을 ca. 3 × 3 × 3mm로 절단한다. 마우스를 마취시키고, 면도시캬 피하 배치를 위해 집게를 사용하여 복막 방해(violation)가 없도록 피부를 들어 올리고, 가위로 피부에 작은 1cm 절개를 만든다. 피하에 주머니를 만들고, 조직을 주머니 안에 넣고, 당해 피부를 접착제, 봉합사 또는 클립으로 닫는다.
NSG 마우스에서 HCC-PDX 종양을 유지시키기 위해, 1 세대 마우스 (P1)에서 얻은 HCC를 다음 마우스 코호트 (P2 및 P3)에 연속적으로 이식시켰다. HCC는 확립된 PDX에서 수확하여, 라미나 유동 캐비넷(laminar flow cabinet)에서 ca. 3 × 3 × 3 mm3의 조각으로 절단하였다. 상기 조각들은 1.5 mL 95%FCS/5% DMSO를 함유하는 멸균 저온 튜브로 옮겼다. 상기 저온튜브(Cryotubes)를 CoolCell 용기 (Biocision)에 넣고 하룻밤 동안 -80℃ 냉장고에 넣고, 다음날 액화 질소 저장고로 옮겼다. 해동을 위해, 상기 저온튜브는 녹을 때까지 수조 (37℃)에 두었다.
종양 크기 결정.
캘리퍼스를 사용하여 종양 부피를 2-차원 (길이 및 너비)으로 측정하고, 다음 공식을 사용하여 종양 부피를 산출했다: 종양 크기= (길이 2x 폭) x 1/2.
혈액, 비장, 골수 및 HCC-PDX 종양으로부터 백혈구 단리.
150-200 μl의 혈액을 볼 출혈을 통해 칼륨 EDTA MiniCollect® 튜브 (Greiner bio-one, 450475)에 수집했다. 20μl CountBright ™ Absolute Counting Beads (ThermoFisher)와 혼합된 혈액 30μl를 프로세싱 및 데이터 수집 전, 실온에서 96-웰 V-자형 바닥 플레이트에 도말했다. 마우스로부터 비장을 새로 잘라내어, 얼음 위의 PBS에 넣었다. 결합 조직만 남을 때까지 주사기 플런저(plunger)를 사용하여 100μm 세포 스트레이너 (Falcon)를 통해 비장을 분쇄했다. 골수 세포 단리를 위해, 경골, 대퇴골, 엉덩이 및 척추를 마우스에서 절개했다. 깨끗한 뼈는 배지 (PBS + 2% FCS + 2mM EDTA)에서 막자 사발과 유봉으로 분쇄시킨다. 각 마우스로부터 얻은 세포 혼합물을 별도로 보관하고, 100μm 세포 스트레이너 (Falcon)를 통해 여과시킨다. 모든 샘플은 수집 후 1 시간 이내에 처리되었다. HCC에서 TIL을 분리하기 위해, 종양을 지방과 결합 조직을 제거하여 정리한 후, 1-2 mm2 조각으로 자르고, gentleMACS ™ Dissociator (Miltenyi Biotec)를 사용하여 인간 종양 해리 키트 (Miltenyi Biotec)로 분해했다. 세포 현탁액은 100μm 세포 스트레이너 (Falcon)를 통해 여과되었다. 불연속적인 40% 위에 층을 이룬 세포 현탁액에 이어 80% Percoll® 밀도 구배 배지 (GE Healthcare)가 이어진다. 백혈구는 Percoll 40%에서 80% 사이의 경계면에 있다. 농축된 TIL을 D-PBS, 1% BSA에서 세척한 다음 설명된대로 처리했다.
유세포 분석.
혈액, 비장, 골수 및 종양의 세포 혼합물을 염화 암모늄-칼륨 (ACK) 용해 완충액 (Life Technologies)에 현탁하고, 부드럽게 혼합하면서 실온에서 10 분 동안 항온처리하여 오염 적혈구 (RBC)를 용해시켰다. 표면 염색을 위해, 백혈구를 FACS (Fluorescence-activated cell sorting) 완충액 [인산염-완충된 염수(PBS) + 2% BSA + 1mM EDTA + 0.1% 아지드 나트륨]에서 2 회 세척하고 Fc 차단 시약 (Miltenyi Biotec)과 함께 항온처리하고, 직접적으로 콘쥬게이트된 항체로 착색된다. 세포-내 착색의 경우, 혈액 백혈구를 이전에 설명한대로 표면 마커로 라벨시킨 다음, 고정시키고, Transcription Factor Buffer Set (BD Pharmingen ™)로 퍼밍했다(permed). 이 연구에는 5 개의 항체 패널이 사용되었다. 인간 T 세포 패널 (15개 색): hCD4- BUV395, hCD8-BUV373, hCD183-BV421, hCD197-BV510, hCD25-BV605, hCD196-BV650, hCD38-BV711, hCD45RO-BV785, hCD45RA-FITC, hCD127-PE, hCD194-PE-CF594, hCD3-PERCP5.5, hCD185-PE-CY7, hCCR10-APC 및 hHLA-DRAPC-CY7. 인간 비-T 세포 패널 (15개 색): hCD45- BUV395, hCD19-BUV373, hCD56-BV421, hIgD-BV510, hCD11c-BV605, hCD27-BV650, hCD38-BV711, hCD16BV785, hCD123-FITC, hCD20-PE, hCD24-PE-CF594, hCD66b-PERCP5.5, hCD3-PE-CY7, hCD14-APC 및 hHLA-DR-APC-CY7. 인간 Tex 세포 패널 (15개 색): hCD4- BUV395, hCD8-BUV373, hCD272-BV421, hCD197-BV510, hKLRG-1-BV605, hCD28-BV650, hCD279-BV711, hCD366-BV785, hCD45RA-FITC, hCD57-PE, hCD152-PE-CF594, hCD160-PERCP5.5, hTIGIT-PE-CY7, hCD223-APC 및 hCD244-APC-CY7. 인간 Tc 세포 패널 (11개 색): hCD4- BUV395, hCD8-BUV373, Granzyme B-BV421, hCD197BV510, hIFN-γ-BV605, hTNF-α-BV650, hCD3-BV785, hCD45RA-FITC, Granulysin-PE, Granzyme A-PERCP5.5, Perforin-APC 및 hIL-2-APC-CY7.TAM 및 MDSC panel(13 color): hCD45- BUV395, hCD11b-BV421, hCD86-BV605, hCD15-BV650, hCD204-BV711, hCD16-BV785, hCD33-FITC,Lineage (hCD3, hCD19 및 hCD56)-PE, hCD68-PE-CF594, hCD163-PERCP5.5, hCD124-PE-CY7, hCD14-APC 및 hHLA-DR-APC-CY7. DAPI (Life Technologies)를 추가하여 죽은 세포를 배제시켰다.
인간 복합 사이토킨 분석.
혈장 사이토킨은 제조업체의 프로토콜에 따라 Biolegend의 LEGENDplex ™ 인간 Th 사이토 카인 패널 (13plex) 어레이 키트, 인간 사이토킨 패널 2 (13-플렉스) 어레이 키트 및 인간 CD8/NK 패널 분석 키트 (13-플렉스)를 사용하여 분석되었다. LSR II 유세포 분석기에서 데이터를 수집하고, LEGENDplex™ 소프트웨어 버전 7.0 (Biolegend)을 사용하여 분석했다.
대조군 및 실험 약물 치료.
HCC-PDX 이종이식편이 Humanized NSG 마우스에서 대략 100 mm3의 종양 부피로 확립되면, 대조군 및 실험 약물 치료가 시작되었다. 연구가 종료될 때까지 2 일마다 종양 부피를 측정했다 (첫 번째 치료-후 21 일 [dpf]). 상기 치료 일정은 다음과 같다.
ㆍ 염수 치료 (대조군 그룹): 꼬리 정맥을 통해 매일 100 μL 염수 주사.
ㆍ 오로지 펨브롤리주맙만 (Keytruda 그룹): 0 dpf에서만 꼬리 정맥을 통해 5mg/kg의 볼루스 주사.
ㆍ XYLONIX Zn-γPGA 치료 (Xylonix 그룹): 꼬리 정맥을 통해 매일 2mg Zn/Kg의 투여량으로 주사.
ㆍ 펨브롤리주맙 + Xylonix (Combo 그룹): 위의 두 치료 요법의 병용.
통계 분석.
JMP 13 (SAS Institute Inc. Cary, NC, USA) 또는 Origin 9 (Origin Lab Corp., Northampton, MA, USA)를 이용하여 통계학적 분석이 실행되었다. 모든 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차 (SEM)로 표시되며, Mann-Whitney U 테스트 또는 분산 분석 (ANOVA)을 사용하여 통계적 유의성을 테스트했다. <0.05의 p-값은 통계적으로 유의한 것으로 해석되었다.
결과 및 분석
성장 역학 연구는 염수, 펨브롤리주맙 단일요법 (시작시 볼루스) 또는 펨브롤리주맙과의 병용에 비교하여, Zn-γPGA 단일요법 (매일 iv)의 우수한 항-종양 효능을 분명히 보여주었다. TIL 분석 결과는 Zn-γPGA 단일 요법이 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포를 모두 자극하는 반면, 펨브롤리주맙 단일요법 또는 병용요법의 효능은 CD8+ T 세포에만 의존한다는 것을 보여줌으로써 성장 역학을 뒷받침했다.
상기 전체 종양 침윤성 백혈구 (TIL) 분석은 도 17C-17G에 나타낸다. 다음 공식을 사용하여 계산된 면역 세포 활성 지수는 도 17F 및 17G에서 다양한 면역 세포 유형에 대해 나타낸다.
Figure pct00010
환자 유래 이종이식편은 원발성 종양의 유전적 패턴을 충실히 보존하는 것으로 알려져 있으며, 연구 결과 본 명세서에서 입증 된 유형의 스크리닝 연구는 환자 결과와 상관관계가 있으며, 따라서 이들 모델이 임상적 이점이 있는 치료법을 입증하는 것으로 나타났다.
다음 실시예들은 Zn(II) 염과 감마-폴리글루탐산 (γ-PGA) 또는 알파-글루탐산 (α-PGA)으로 만든 Zn(II) 제제를 설명한다.
실시예 12: 결합되지-않은 과잉 아연을 제거하기 위한 인산염 침전 방법을 사용하여 pH 7.0에서 Zn/γ-PGA의 준비 및 특징화
Zn/γ-PGA를 준비하기 위해, 55mg PGA (50,000 Da 분자량)를 실온에서 10 mM ZnSO4를 함유하는 5 mL 10 mM MES 완충제, pH 7.0에 용해시킨 다음 얼음 위에 10 분 동안 두면서 초음파처리하였다. 그 다음, 0.5 mL의 200 mM 인산염 완충액, pH 7.0을 용액에 첨가하여 유리 아연 이온을 침전시키고, 혼합물을 0.2 μm 주사기 멸균 필터를 통해 여과하였다. 아연 함량은 ICP-MS 및 4-(2-피리딜아조)-레소르시놀(resorcinol) 분석을 사용하여 측정되었다. 최종 원액 Zn/γ-PGA에는 1% (wt/vol) PGA 및 400μg/mL 결합된 아연 이온이 함유되어 있다. 원액 Zn/γ-PGA 용액은 매 투여 일마다 새롭게 준비되었다.
실시예 13: 결합되지-않은 과잉 아연을 제거하기 위한 투석 방법을 사용하여 pH 7.0에서Zn/γ-PGA의 제조 및 특징화
ZnPGA를 준비하기 위해, 55mg PGA (50,000 Da 분자량)를 실온에서 10 mM ZnSO4를 함유하는 5 mL 10 mM MES 완충제, pH 7.0에 용해시킨 다음 얼음 위에 10 분 동안 두면서 초음파처리하였다. 그 후, 용액을 1L 10mM MES, pH 7.0에 대해 얼음 위에서 2 시간 동안 연속적으로 3 회, 6 시간에 걸쳐 총 3 회 투석 하였다. 회수된 용액은 0.2μm 주사기 멸균 필터를 통해 여과되었다. 아연 함량은 ICP-MS 및 4-(2-피리딜아조)-레소르시놀(resorcinol) 분석을 사용하여 측정되었다. 최종 원액 Zn/γ-PGA에는 0.9% (wt/vol) PGA 및 380μg/mL 결합된 아연 이온이 함유되어 있다. 원액 Zn/γ-PGA 용액은 매 투여 일마다 새롭게 준비되었다.
실시예 14: 액체 제형.
예를 들어, 주사에 적합한 액체 제형의 예시적인 구체예의 조성물은 아연 (II) 염, γ-PGA, 염화나트륨 및 물을 포함한다. 조성물은 황산 아연 7 수화물, γ-PGA (칼륨 염, ≤100kDa), 염화나트륨을 결합하고 부피에 물을 첨가하여 제조되며, 각 성분의 농도는 1mg/mL 아연 (II), 10mg/mL γ-PGA, 그리고 6.5mg/mL 염화나트륨이다. 결과 조성물은 약 276 mOsm/kg 삼투압 및 pH 5.68으로, 인간 환자의 주사에 적합하다.
실시예 15: γ-폴리글루탐산-아연 액체 조성물.
구체예에 따라 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물이 표 3에 제시되어 있다. 이 조성물은 왁스-코팅된 입자를 포함하는 액체 현탁액 제제로서 100g 당 0.68mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 제형을 제조하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00011
A. 코팅된 Zn/γ-PGA 미세구 (cZPM)의 제조. 10 g 수크로스 (5% w/v), 45mg γ-PGA, 및 19.79mg 황산 아연 7수화물 (원소 Zn으로 4.5mg)를 함유하는 물 200mL을 준비하고, 동결-건조시켰다. 생성된 분말을 최대 5%의 옥수수 전분을 함유하는 미분된 수크로스로 1:4 비율로 분쇄하고, No. 50 US 표준 스테인리스 스틸 체 (48 Mesh)를 통해 압착했다. 그 다음, 이 분말을 400 mL 비커에 200 mL의 흰색 파라핀 오일에 현탁시켰다. 혼합물을 고-토크 교반기에 장착된 44mm 폴리에틸렌 3중-날 패들 (Type RXR1, Caframo, Wiarton, Ontario)을 사용하여 260rpm에서 교반하여 분산시켰다. 이 현탁액에 아세톤-95% 에탄올 (9:1) 안에 10% (w/v) 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스-프탈레이트 (HPMC-P) 20mL를 첨가하였다. 5 분 동안 계속 교반하여, 미세구를 형성시킨 다음, 75 mL의 클로로포름을 첨가하였다. 현탁 배지를 따라 내고, 미세구를 75 mL의 클로로포름에 잠시 재현탁시키고 주위 온도에서 대기-건조시켰다. 건조 시, 상기 미세구는 Carnauba 왁스로 코팅되었다. 구체적으로, 1g의 Carnauba 왁스를 70℃에서 200mL의 백색 파라핀 오일에 용해시키고, 45℃ 미만으로 냉각시켰다. 이 냉각된 왁스-파라핀 용액에 준비된 미세구를 넣고 계속 교반하면서 15 분 동안 현탁시켰다. 그런 다음, 왁스 용액을 따라내고, 미세구를 여과지에 수집하여 과량의 왁스 용액을 흡수시키고, 코팅된 Zn/γ-PGA 미세구 (cZPM)를 얻었다.
B. 코팅된 Zn/γ-PGA 미세구 (cZPM)의 액체 현탁 용액 제조. 다음 구성요소들을 78.7mL 물에 용해시켰다: 0.3g 잔탄 검 (예를 들어, 현탁 중합체로서); 0.3g 구아 검 (예를 들어, 점도 제로서); 자일리톨 10g (예를 들어, 감미료로서); 0.5g 시트르산 완충액 (예를 들어 완충액으로서); 리모넨 0.1g (예를 들어, 향료로서); 0.025g의 포타슘 소르 베이트 (예를 들어, 보존제로서). 상기 수용액의 pH를 4.5로 조절한 다음, 10g cZPM을 수용액에 현탁하여, cZPM 액체 현탁액을 얻었다.
실시예 16: γ-폴리글루탐산-아연 조성물.
구체예에 따른 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물은 표 4에 제시되어 있다. 상기 조성물은 정제당 25mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 정제를 준비하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00012
표 2에 나타낸 조성물로 코팅된 정제는 습식 과립화 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 우선, 황산 아연 및 γ-폴리글루탐산을 함께 건조시킨다. 미정질의셀룰로오스, 전분 및 이산화 규소를 추가로 첨가하고, 건조 성분을 모두 함께 더 혼합한다. 상기 혼합된 성분을 과립기로 옮기고, 적절한 양의 에탄올 수용액을 첨가하여 과립화를 수행한다. 수득된 과립화된 혼합물을 50-70℃에서 건조시켜 약 5% 미만의 수분 함량을 갖는 과립화된 조성물을 수득한다. 스테아레이트 마그네슘을 상기 과립화된 조성물에 첨가하고 혼합시킨다. 상기 수득된 혼합물을 정제로 압착한다. 마지막으로, 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트로 정제를 코팅한다.
실시예 17: γ-폴리글루탐산-아연 조성물.
구체예에 따라 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물이 표 5에 나타나 있다. 이 조성물은 정제 당 30mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 상기 정제를 준비하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00013
* 여기서는 용제 (에탄올, 이소 프로필 알코올 및 물)가 제조 된 정제에 미미한 양으로 존재한다고 가정한다.
표 3에 나타낸 조성물로 코팅된 정제는 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 황산 아연, γ-폴리글루탐산, 미정질 셀룰로오스, HPMC-P (히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 말토 덱스트린 및 카르복시메틸셀룰로오스-칼슘을 함께 혼합 건조시켰다. 상기 혼합된 성분을 과립기로 옮기고, 적당량의 70% 수성 에탄올을 첨가하여 습식 과립화를 수행하였다. 상기 수득된 과립화된 혼합물을 최대 약 60℃에서 건조시켜 약 3% 미만의 LOD (건조 감량)를 갖는 과립화된 조성물을 수득하였다. 실리카 (예를 들어, Aerosil®) 및 스테아레이트 마그네슘을 상기 과립화된 조성물에 첨가하고 혼합하였다. 상기 수득된 혼합물을 정제로 압착시켰다. 상기 정제를 먼저 HPMC-P의 이소프로필 알코올 용액을 사용하여 코팅시킨 다음, 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 HPMC의 수용액을 사용하여 두 번째 단계에서 코팅하였다.
실시예 18: 결합되지-않은 과잉 아연을 제거하기 위한 인산염 침전 방법을 사용하여 pH 7.0에서 Zn/α-PGA의 준비 및 특징화
Zn/α-PGA를 준비하기 위해, 55mg α-PGA, 나트륨염, 60kDa 분자량(단분산) (Alamanda Polymers, Huntsville, AL)을 실온에서 10 mM ZnSO4를 함유하는 5 mL 10 mM MES 완충제, pH 7.0에 용해시킨 다음 얼음 위에 10 분 동안 두면서 초음파처리하였다. 그 다음, 0.5 mL의 200 mM 인산염 완충액, pH 7.0을 용액에 첨가하여 유리 아연 이온을 침전시키고, 혼합물을 0.2 μm 주사기 멸균 필터를 통해 여과시켰다. 아연 함량은 ICP-MS 및 4-(2-피리딜아조)-레소르시놀(resorcinol) 분석을 사용하여 측정되었다. 예를 들면, 1% (wt/vol) PGA 및 400μg/mL 결합된 아연 이온을 함유하는 Zn/α-PGA 원액을 준비할 수 있고, 경구 투여에 이용할 수 있다.
실시예 19: 결합되지-않은 과잉 아연을 제거하기 위한 투석 방법을 사용하여 pH 7.0에서 Zn/α-PGA의 준비 및 특징화
Zn/α-PGA를 준비하기 위해, 55mg α-PGA, 나트륨염, 60kDa 분자량(단분산) (Alamanda Polymers, Huntsville, AL)을 실온에서 10 mM ZnSO4를 함유하는 5 mL 10 mM MES 완충제, pH 7.0에 용해시킨 다음 얼음 위에 10 분 동안 두면서 초음파처리하였다. 그 후, 용액을 1L 10mM MES, pH 7.0에 대해 얼음 위에서 2 시간 동안 연속적으로 3 회, 6 시간에 걸쳐 총 3 회 투석하였다. 회수된 용액은 0.2μm 주사기 멸균 필터를 통해 여과되었다. 아연 함량은 ICP-MS 및 4-(2-피리딜아조)-레소르시놀(resorcinol) 분석을 사용하여 측정되었다. 예를 들면, 1% (wt/vol) PGA 및 400μg/mL 결합된 아연 이온을 함유하는 Zn/α-PGA 원액을 준비할 수 있고, 경구 투여에 이용할 수 있다.
실시예 20: 액체 제형.
예를 들어, 주사에 적합한 액체 제형의 예시적인 구체예의 조성물은 아연 (II) 염, α-PGA, 염화나트륨 및 물을 포함한다. 조성물은 황산 아연 7 수화물, α-PGA 나트륨 염, 60kDa 평균 분자량(단분산) (Alamanda Polymers, Huntsville, AL)염화나트륨을 결합하고 부피에 물을 첨가하여 제조되며, 각 성분의 농도는 1mg/mL 아연 (II), 10mg/mL α-PGA, 그리고 6.5mg/mL 염화나트륨이다. 결과 조성물은 약 276 mOsm/kg 삼투압 및 pH 5.68으로, 인간 환자의 주사에 적합하다.
실시예 21: α-폴리글루탐산-아연 액체 조성물.
구체예에 따라 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물이 표 6에 나타나 있다. 이 조성물은 왁스-코팅된 입자를 포함하는 액체 현탁액 제제로서 100g 당 0.68mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 제형을 제조하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00014
A. 코팅된 Zn/α-PGA 미세구 (cZPM)의 제조. 10 g 수크로스 (5% w/v), 45mg α-PGA, 및 19.79mg 황산 아연 7수화물 (원소 Zn으로 4.5mg)를 함유하는 물 200mL을 준비하고, 동결-건조시켰다. 생성된 분말을 최대 5%의 옥수수 전분을 함유하는 미분된 수크로스로 1:4 비율로 분쇄하고, No. 50 US 표준 스테인리스 스틸 체 (48 Mesh)를 통해 압착했다. 이 분말을 400 mL 비커에 200 mL의 백색 파라핀 오일에 현탁시켰다. 혼합물을 고-토크 교반기에 장착된 44mm 폴리에틸렌 3중-날 패들 (Type RXR1, Caframo, Wiarton, Ontario)을 사용하여 260rpm에서 교반하여 분산시킨다. 이 현탁액에 아세톤-95% 에탄올 (9:1) 안에 10% (w/v) 히드 록시 프로필 메틸 셀룰로오스-프탈레이트 (HPMC-P) 20mL를 첨가한다. 5 분 동안 계속 교반하여, 미세구를 형성시킨 다음, 75 mL의 클로로포름을 첨가한다. 현탁 배지를 따라 내고, 미세구를 75 mL의 클로로포름에 잠시 재현탁시키고 주위 온도에서 대기-건조시킨다. 건조 시, 상기 미세구는 Carnauba 왁스로 코팅된다. 구체적으로, 1g의 Carnauba 왁스를 70℃에서 200mL의 백색 파라핀 오일에 용해시키고, 45℃ 미만으로 냉각시킨다. 이 냉각된 왁스-파라핀 용액에 준비된 미세구를 넣고 계속 교반하면서 15 분 동안 현탁시킨다. 왁스 용액을 따라내고, 미세구를 여과지에 수집하여 과량의 왁스 용액을 흡수시키고, 코팅된 Zn/α-PGA 미세구 (cZPM)를 얻는다.
B. 코팅된 Zn/α-PGA 미세구 (cZPM)의 액체 현탁 용액 제조. 다음 구성요소들을 78.7mL 물에 용해시킨다: 0.3g 잔탄 검 (예를 들어, 현탁 중합체로서); 0.3g 구아 검 (예를 들어, 점도 제로서); 자일리톨 10g (예를 들어, 감미료로서); 0.5g 시트르산 완충액 (예를 들어 완충액으로서); 리모넨 0.1g (예를 들어, 향료로서); 0.025g의 포타슘 소르 베이트 (예를 들어, 보존제로서). 상기 수용액의 pH를 4.5로 조절하고, 10g cZPM을 수용액에 현탁하여, cZPM 액체 현탁액을 얻었다.
실시예 22: α-폴리글루탐산-아연 조성물.
구체예에 따라 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물이 표 7에 나타나 있다. 상기 조성물은 정제당 25mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 상기 정제를 준비하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00015
표 2에 나타낸 조성물로 코팅된 정제는 습식 과립화 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 우선, 황산 아연 및 α-폴리글루탐산을 함께 건조시킨다. 미정질의셀룰로오스, 전분 및 이산화 규소를 추가로 첨가하고, 건조 성분을 모두 함께 더 혼합한다. 상기 혼합된 성분을 과립기로 옮기고, 적절한 양의 에탄올 수용액을 첨가하여 과립화를 수행한다. 수득된 과립화된 혼합물을 50-70℃에서 건조시켜 약 5% 미만의 수분 함량을 갖는 과립화된 조성물을 수득한다. 스테아레이트 마그네슘을 상기 과립화된 조성물에 첨가하고 혼합시킨다. 상기 수득된 혼합물을 정제로 압착한다. 마지막으로, 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트로 정제를 코팅한다.
실시예 23: α-폴리글루탐산-아연 조성물.
구체예에 따라 본 발명을 수행하는데 유용한 조성물이 표 8에 나타나 있다. 이 조성물은 정제 당 30mg의 Zn (Zn2+ 이온)을 제공한다. 상기 정제를 준비하는 방법은 표를 따른다. 이 조성물은 단지 본 발명에 유용한 많은 조성물 중 하나를 예시한 것이다.
Figure pct00016
* 여기서는 용제 (에탄올, 이소 프로필 알코올 및 물)가 제조 된 정제에 미미한 양으로 존재한다고 가정한다.
표 3에 나타낸 조성물로 코팅된 정제는 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 황산 아연, α-폴리글루탐산, 미정질 셀룰로오스, HPMC-P (히드록시프로필메틸셀룰로오스 프탈레이트), 말토 덱스트린 및 카르복시메틸셀룰로오스-칼슘을 함께 혼합 건조시킨다. 상기 혼합된 성분을 과립기로 옮기고, 적당량의 70% 수성 에탄올을 첨가하여 습식 과립화를 수행한다. 상기 수득된 과립화된 혼합물을 최대 약 60℃에서 건조시켜 약 3% 미만의 LOD (건조 감량)를 갖는 과립화된 조성물을 수득한다. 실리카 (예를 들어, Aerosil®) 및 스테아레이트 마그네슘을 상기 과립화된 조성물에 첨가하고 혼합한다. 상기 수득된 혼합물을 정제로 압착한다. 상기 정제를 먼저 HPMC-P의 이소프로필 알코올 용액을 사용하여 코팅시킨 다음, 당업자에게 알려진 표준 기술을 사용하여 HPMC의 수용액을 사용하여 두 번째 단계에서 코팅한다.
본 발명은 특정 구체예들과 관련하여 본 명세서에서 설명되지만, 설명, 실시예 및 예시들은 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 당업자는 그럼에도 불구하고 본 발명의 범위와 함께 다양한 수정 및 변경이 있음을 인식할 것이다.

Claims (28)

  1. 종양을 가진 환자에게 치료요법적 유효량의 Zn(II) 제제를 투여하는 것을 포함하는, 전술한 환자를 치료하는 방법.
  2. 종양을 가진 환자에게 면역-종양 제제와 복합하여 치료요법적 유효량의 Zn(II) 제제를 투여하는 것을 포함하는, 전술한 환자를 치료하는 방법.
  3. 청구항 2에 있어서, 여기에서 전술한 면역-종양 제제는 면역 체크포인트 억제제인, 방법.
  4. 청구항 3에 있어서, 여기에서 전술한 면역 체크포인트 억제제는 항-세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 항체 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 활성을 억제시키는 이의 항원-결합 부분; 또는 예정된 세포 사멸-1 (PD-1) 항체 또는 PD-1 수용체에 특이적으로 결합하고 PD-1 수용체을 억제시키는 이의 항원-결합 부분인, 방법.
  5. 청구항 1 내지 4중 임의의 한 항에 있어서, 여기에서 전술한 종양에는 유전적 불안정성 돌연변이 및/또는 유전자 과다발현으로 인한 유전적 불안정성을 갖는 종양 세포를 포함하는, 방법.
  6. 청구항 5에 있어서, 여기에서 전술한 유전적 불안정성 돌연변이는 ATM; ATR; PAXIP1; BRCA1; BRCA2; WRN; RFC1; RPA1; ERCC1; ERCC4; ERCC6; MGMT; PARP1; PARP2; NEIL3; XRCC1; MLH1; PMS2; TP53; CREBBP; JAK1; NFKB1; MSH2; MSH3; MSH6; 및 MLH3에서 선택된 하나 또는 그 이상의 유전자에서 기능장애성 돌연변이인, 방법.
  7. 환자의 종양에서 CD4+T 세포 및 CD8+T 세포의 종양 침윤성 백혈구 집단을 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 전술한 종양을 갖는 전술한 환자에게 Zn(II) 제제의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  8. 환자의 종양에서 CD4+T 세포 및 CD8+T 세포의 종양 침윤성 백혈구 집단을 증가시키는 방법에 있어서, 이 방법은 전술한 종양을 갖는 전술한 환자에게 면역-종양 제제와 함께 Zn(II) 제제의 치료요법적 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 방법
  9. 청구항 8에 있어서, 여기에서 전술한 면역-종양 제제는 면역 체크포인트 억제제인, 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 여기에서 전술한 면역 체크포인트 억제제는 항-세포독성 T-림프구 항원-4 (CTLA-4) 항체 또는 CTLA-4에 특이적으로 결합하고, CTLA-4 활성을 억제시키는 이의 항원-결합 부분; 또는 예정된 세포 사멸-1 (PD-1) 항체 또는 PD-1 수용체에 특이적으로 결합하고 PD-1 수용체을 억제시키는 이의 항원-결합 부분인, 방법.
  11. 청구항 1-10중 임의의 한 항에 있어서, 여기에서 전술한 Zn(II) 제제는 Zn(II)/γ-폴리글루탐산 및/또는 Zn(II)/α-폴리글루탐산을 포함하는, 방법.
  12. 환자의 종양 치료 방법에 있어서, 이 방법은 (ii) T-림프구 마커, 대식세포 마커, 또는 자연 킬러 세포 마커를 표적으로 하는 면역-종양 제제와 함께 치료요법적 유효량의 (i) Zn(II)/폴리글루탐산 제제의 치료요법적 효과량을 투여하는 것을 포함하는, 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 림프구 활성화 유전자 3 (LAG-3)인, 방법.
  14. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 면역글로블린- 및 뮤신-도메인-함유하는 분자 3 (TIM-3)인, 방법.
  15. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 면역글로블린 및 ITIM 도메인 (TIGIT)인, 방법.
  16. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 B7-H3 (CD276)인, 방법.
  17. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 T-세포 활성화 (VISTA)의 Ig 억제인자를 함유하는 V-도메인인, 방법.
  18. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 유도성 T-세포 공동자극자 (ICOS)인, 방법.
  19. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 CD27인, 방법.
  20. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 T-림프구 마커는 글루코코르티코이드-유도된 TNF 수용체 (GITR)인, 방법.
  21. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 대식세포 마커는 CD47인, 방법.
  22. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 대식세포 마커는 인돌아민-2,3-디옥시게나제 (IDO)인, 방법.
  23. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 자연 킬러 세포 마커는 킬러 면역글로블린-유사 수용체 (KIR)인, 방법.
  24. 청구항 12에 있어서, 여기에서 상기 자연 킬러 세포 마커는 CD94/NKG2A인, 방법.
  25. 청구항 12 내지 24중 임의의 한 항에 있어서, 여기에서 전술한 Zn(II)/폴리글루탐산 제제는 종양-표적으로 하는 모이어티 및/또는 전하-운반하는 모이어티에 콘쥬게이트된 폴리글루탐산을 포함하는, 방법.
  26. 청구항 25에 있어서, 여기에서 종양-표적으로 하는 모이어티 및/또는 전하-운반하는 모이어티에 콘쥬게이트된 전술한 폴리글루탐산은 γ-폴리글루탐산인, 방법.
  27. 청구항 25에 있어서, 여기에서 전술한 폴리글루탐산의 분자량은 약 2.5 kDa ~ 약 60 kDa 범위 안에 있는, 방법.
  28. 청구항 5에 있어서, 여기에서 과다발현으로 인한 전술한 유전적 불안정성은 APOBEC3B의 과다발현에 의해 야기되는, 방법.
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