KR20210024038A - 치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법 - Google Patents

치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20210024038A
KR20210024038A KR1020217001761A KR20217001761A KR20210024038A KR 20210024038 A KR20210024038 A KR 20210024038A KR 1020217001761 A KR1020217001761 A KR 1020217001761A KR 20217001761 A KR20217001761 A KR 20217001761A KR 20210024038 A KR20210024038 A KR 20210024038A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
cell
antigen
dendritic cells
mature
Prior art date
Application number
KR1020217001761A
Other languages
English (en)
Inventor
카림 베르마엘렌
Original Assignee
유니버시테이트 젠트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시테이트 젠트 filed Critical 유니버시테이트 젠트
Publication of KR20210024038A publication Critical patent/KR20210024038A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/00119—Melanoma antigens
    • A61K39/001191—Melan-A/MART
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/46449—Melanoma antigens
    • A61K39/464491—Melan-A/MART
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/30—Organic components
    • C12N2500/36—Lipids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
    • C12N2500/99—Serum-free medium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/05—Adjuvants
    • C12N2501/051—Lipid A (MPA, MPL)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/22—Colony stimulating factors (G-CSF, GM-CSF)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/23—Interleukins [IL]
    • C12N2501/2304—Interleukin-4 (IL-4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/20—Cytokines; Chemokines
    • C12N2501/24—Interferons [IFN]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/999—Small molecules not provided for elsewhere
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Virology (AREA)

Abstract

본 발명은 면역요법에 사용하기 위한, 그리고 특히 암 백신접종에 사용하기 위한, 고수율의 1형 분극화 mRNA 로드된 수지상 세포를 생성하는 가속화된 방법에 관한 것이다.

Description

치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법
본 발명은 면역요법, 특히 암 예방접종에 사용하기 위한 고수율의 1형 분극화 mRNA 로드된 수지상 세포를 생성하는 가속화 방법에 관한 것이다.
40년 보다 더 전에 수지상 세포가 발견된 이래, 이러한 세포의 고유한 생물학적 특성을 의료 용도로 변환하는 것은 여전히 어려운 일이다. 대부분의 노력은 암에 대한 백신의 형태로 DC를 클리닉에 가져오는 데 초점을 맞추었다. 이는 수많은 전임상 모델에서 입증된 바와 같이, 종양 항원에 대한 T-세포 반응을 불러 일으켜서, 종양 발생에 대하여 보호하거나, 심지어 확립된 종양을 박멸시키는 DC의 능력을 기반으로 한다.
이 효과를 기반으로, 한 일련의 고유한 생물학적 특성이 "4-신호" 개념으로 요약된다: (1) 주요 조직적합성 등급(MHC) 분자에 매우 많은 양의 처리된 항원을 제시, (2) 세포 표면에 있는 대규모 T-세포 공동자극 분자의 상향조절, (3) T-세포 반응의 적절한 분극화를 유도하는 사이토카인의 방출, 및 (4) 유도된 T-세포 이펙터의 조직-호밍 패턴을 프로그래밍하는 추가 신호 제공. 항종양 면역의 특정 맥락에서, DC는 DNGR-1과 같은 특수 수용체를 통해 죽은 세포를 포획하여 MHC I의 교차-제시와 항원-특이적 세포독성 T-세포의 프라이밍을 유도할 수 있다. T-세포 공동자극 분자 CD40의 높은 발현은 CD4+ 및 CD8+ T-세포 확장의 크기를 증가시켜 종양 보호를 강화하고 내성을 면역으로 전환시키는 반면, CD70의 상향조절은 강력하고 오래 지속되는 기억 세포독성 T-세포 반응의 생성에 필수적이다. 대조적으로, T-세포 억제 수용체 또는 프로그램된 사멸 리간드-1(PD-L1)과 같은 체크포인트 리간드의 발현은 DC 표면에서 최소화되어야 한다.
다음으로, T-세포 접촉시 충분한 양의 생리활성 IL-12를 분비하는 능력은 최적의 종양 제어에 필요한 1형 분극화 반응을 유도하는 동시에 NK-세포 이펙터 기능을 지원하는 데 필수적이다. 또한, DC에 의해 방출된 케모카인의 패턴은 어떤 유형의 T-세포가 동원될 것인지를 즉, 항종양 면역의 경우 T-헬퍼(Th) 2 세포(종양-지원 잠재력 함유) 또는 면역 억제 조절 T-세포(T-regs)보다는 우선적으로 1형 분극화 이펙터가 동원될 것을 결정한다.
이러한 지식을 통해 이상적인 DC-기반 암 백신을 설계하려면 이러한 모든 중요한 매개변수를 최대한 제어하고 최적화해야 한다. 미성숙 DC(iDC)는 T-세포 반응을 자극하는 데 거의 효과가 없고 T-세포 내성을 촉진할 수도 있기 때문에 올바른 DC 활성화 또는 성숙 상태는 T-세포 결과를 결정하는 데 필수적이다.
따라서, 강력한 활성화 자극을 선택하여 완전히 강력한 성숙 DC를 생성하는 동시에 DC "고갈" 현상을 피할 때 신중한 고려가 필요하다.
톨-유사 수용체(TLR) 리간드는 DC 성숙에 대한 가장 강력한 트리거 중 하나이며, 외인성(즉, 병원체-유래된) 또는 내인성(조직 손상 또는 세포 사멸로 인한 위험-관련 분자)일 수 있다. 이러한 지식에도 불구하고 가장 많이 사용되는 성숙 전략 중 하나는 문헌[Jonuleit et al]에 첫번째로 기재된 바와 같이 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-6(IL-6) 및 프로스타글란딘 E2(PGE2)을 포함하는 염증 매개체의 조합에 단핵구-유래 DC를 노출시키는 것으로 구성된다. PGE2를 첨가하는 것의 가치는 DC 수율, 성숙 및 이동을 더욱 증가시킬 수 있다는 관찰에 있다(문헌[Jonuleit et al. 1997]). 그러나, 그것은 또한 PGE2가 생리활성 IL-12p70을 분비하고 Th1-성장이 아닌 Th2-성장 쪽으로 T-헬퍼 세포 분극화를 이동시키는 DC의 능력을 손상시키는 것으로 나타났다(문헌[Kalinski et al, 1998]).
그 이후로, 1형 분극화 반응을 유도하는 DC의 능력을 최대화하기 위해 많은 대안 전략이 탐색되었다. Mailliard 등은 TLR3 작용제 폴리(I:C)와 함께 전-염증성 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IFN-γ 및 인터페론-알파(IFN-α)의 존재하에 DC가 성숙되는 프로토콜을 개발했다(미국 특허 제7972847호; 미국 특허 제8691570호). "표준" TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2-성숙 DC와 비교하여, 이러한 α-1형 분극화 DC(αDC1)는 더 높은 수준의 IL-12p70을 생성하고, 흑색종-관련 항원에 대한 장수명 세포용해성 T세포(CTL)의 보다 강력한 확장을 유도했다(문헌[Maillard et al. 2004]). 이러한 αDC1 세포는 이미 재발성 악성 신경교종 환자를 위한 임상 시험에서 사용되었지만(문헌[Okada et al. 2011]), 성숙 "칵테일"의 복잡성은 우수 제조 관행(GMP)-준수 생산 공정에 있어서 구현 측면에서 중대한 도전을 제기한다.
더 간단한 대안은 TLR4 리간드를 인터페론-감마(IFN-γ)와 결합시키는 것이다. 리포다당류(LPS)는 DC 성숙을 위한 가장 강력한 선천적 자극 중 하나이며, IL-12와 같은 면역자극 사이토카인의 대량 생산을 유발한다. 그러나, LPS-자극된 DC는 이후에 생체 내에서 T-세포와의 동족 상호작용에 관여할 때 추가 IL-12 방출에 불응성이 된다. 이 "고갈" 현상은 DC를 IFN-γ에 공동 노출함으로써 상쇄될 수 있으며, T-세포 접촉 또는 인공 CD40-결찰에 의해 유발될 때 IL-12의 "두 번째 버스트"를 생성할 수 있게 된다(문헌[Paustian et al. 2011]). 그럼에도 불구하고, LPS의 사용은 그의 독성과 GMP 제형의 부재로 인해 대규모 세포 치료 용도에 문제를 제기한다. 그러나, LPS-유도체 모노포스포릴 지질 A(MPLA)는 임상용으로 승인되었으며(문헌[Boccaccio et al. 1997]), LPS의 산 가수분해의 결과로 면역자극 특성은 보존되지만 독성 수준은 상당히 약화된다. MPLA는 현재 대량 생산되는 백신의 보조제 제형의 필수 성분이다. MPLA/IFN-γ DC와 α-1형 분극화 DC는 둘다 IL-12p70 및 케모카인 유인 이펙터 T-세포 분비 측면에서 TNF-α, IL-1β, IL-6 및 PGE2-성숙 DC에 비해 동등하게 우수하고 CD4+ 및 CD8+ T-세포 프라이밍 능력 측면에서도 우수하다고 보고되었다(문헌[Hansen et al. 2013]). MPLA/IFN-γ DC 성숙 접근법은 Ten Brinke 등의 그룹에 의해 추가로 탐구되었으며, GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 8일 동안 배양된 단핵구는 배양의 마지막 2일 동안 성숙 부스트를 받았다. 수확 후, 생성된 DC는 CCR7 리간드로 이동하는 능력을 유지하면서, 높은 세포용해 활성을 갖는 항원-특이적 CD8+ T-세포의 프라이밍뿐만 아니라 새로운 Th1 분극화를 유도하는 능력을 나타냈다(문헌[Ten Brinke et al. 2007]; W02007/078196; 문헌[ten Brinke et al. 2010]). 이 DC 배양 프로토콜은 가능한 임상 구현과 관련하여 추가로 조사되었으며, 이 설정에서 인간 혈청이 DC 성숙 및 이동에 미치는 해로운 영향을 보여주는 추가 연구가 있다(문헌[Kolanowski et al. 2014]).
올바른 유형의 성숙 자극 다음으로, 항원 로딩 방식은 임상적 적용가능성을 결정하는 중요한 요소이다. 위에서 언급한 연구에서 기능 테스트에 전형적으로 사용되는 면역원성 펩타이드로의 DC의 수동 로딩은 고려되는 각 후보 항원에 대한 면역우성 에피토프에 대한 사전 지식을 의미하며, 적격한 환자의 인간 백혈구 항원(HLA)-유형과 관련하여 특정 제한을 부과한다. 미성숙 DC의 높은 항원 흡수 능력을 이용하는 대안은 종양 용해물과 함께 배양하는 것이다. 그러나, 충분한 양의 환자 종양 물질이 필요하며, 이는 일반적으로 작은 생검 또는 세포학적 샘플만 사용할 수 있는 전이성 질환의 가능성을 다시 제한한다. 종양 항원을 암호화하는 전장 mRNA로 DC를 로딩하는 것은 이제 가능한 에피토프의 광범위한 제시를 유도하는 우아한 방법으로 널리 인식되고 있다. 또한 DC의 면역원력을 최적화할 수 있는 RNA 작제물을 공동 도입할 수 있는 기회를 제공한다(문헌[Van Lint et al. 2014]). 이것은 전형적으로 세포의 전기천공에 의해 달성되며, 이 접근법의 반대면은 상당한 세포 손실의 위험이며, 이에 따라 환자에게 충분한 백신 용량을 투여할 가능성을 손상시킨다(문헌[Tuyaerts et al. 2003]; 문헌[Ponsaerts et al. 2003]; 문헌[Bonehill et al. al. 2004]).
백신 생산 측면에서 중요한 추가 양태는 세포 배양 기간이다. 단핵구-유래 DC의 경우, 이는 전통적으로 7 내지 8일의 범위였으며, 이는 새로운 배지 및 사이토카인으로 배양물을 반복적으로 보충함을 의미한다. GMP 생산 환경의 까다로운 맥락에서 이는 소모품 및 운영자 개입 측면에서 비용 증가로 이어진다. 몇몇 그룹은 가속 배양 프로토콜을 사용하여 완전한 기능의 DC를 단핵구로부터 분화시킬 수 있음을 입증했다(문헌[Jarnjak-Jankovic et al. 2007]; 문헌[Dauer et al. 2003]; 문헌[Kvistborg et al. 2009]; 문헌[Massa et al. 2013]; 문헌[Truxova et al. 2014]; EP2829600).
마지막 실제 고려사항은 폐쇄 시스템 세포 배양을 사용하는 옵션이다: 이는 GMP 요구사항 측면에서 또 다른 이점을 구성하며, 생산 공정을 상업적으로 사용가능한 자동화된 세포 배양 장치로 전환할 수 있게 한다.
이러한 고려사항을 염두에 두고, 본 발명의 목적은 임상-등급 DC 기반 암 백신의 생산 공정을 개발하는 것이었으며, 이로써 처음으로 여러 주요 자산을 하나의 동일한 생산 방법: 가속 배양시간으로 재결합하고, mRNA 전기천공에 의한 항원 로딩과 조합하여 GMP-호환형 1형 분극화 성숙 칵테일을 활용한다. 또한, GMP-인증 또는 약제학적-등급 성분을 최대한 사용하여 무-혈청 조건에서 GMP-준수 세포 배양 백의 폐쇄 배양 시스템을 사용하여 이를 달성할 수 있음이 입증되었다.
본 발명에 따른 방법의 성능은 TNF-α 및 PGE2의 조합으로 성숙된 단핵구-유래 DC의 널리 확립된 "표준" 8-일 배양과 비교되었다. 이 성숙 칵테일은 당업자에게 잘 알려져 있으며, TNF-a, PGE2, IL-1b 및 IL-6을 포함하는 문헌[Jonuleit et al]에 의해 기재된 원래의 기존 모노-DC 성숙 칵테일의 단순화된 버전이다.
중요하게도, 많은 이전 보고서와 달리 실제 백신접종 설정을 거의 모방하기 위해 본 발명에서 전기천공된 DC를 사용한 모든 기능 분석은 신선하게 조작된 세포를 사용하는 대신 냉동보존 및 해동 후에 수행되었다. 표준 프로토콜과 비교하여, 본 발명의 방법은 표현형적 및 기능적으로 우수한 DC의 더 높은 수율을 제공한다. 놀랍게도, 본 발명자들은 기존의 프로토콜로 얻은 것과 비교하여 본 발명에 따라 생성된 DC에서 T-세포 억제 체크포인트 리간드 PD-L1의 발현이 크게 감소함을 발견했다. 더욱이, 냉동보존된 분취물의 해동 후 기존의 DC에서 발현이 더욱 증가하였고, 이는 본 발명의 방법으로 수득된 해동된 DC의 분취물의 경우에서는 그렇지 않았다. 이것은 환자에게 실제로 주입될 세포와 관련하여 중요한 관찰이며, 이 면역억제 리간드의 발현은 달성가능한만큼 낮아야 한다.
발명의 요약
본 발명은 폐쇄 시스템(예컨대, 하나 이상의 멸균 연결을 갖는 배양물)에서 성숙, 바람직하게는 자가, 임상 등급 수지상 세포의 생성을 위한, 그리고 예를 들어, 암 환자의 예방접종에 적합한, 시험관내 방법에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 방법은 성숙 인자들, 바람직하게는 임상-등급 IFN-g 및 내독소의 해독된 유도체인 MPLA의 조합에 대한 추가 노출에 의해 얻어진 DC의 추가 성숙과 함께, 임상 등급 사이토카인, 바람직하게는 GM-CSF 및 IL-4를 사용하여 백혈구성분채집술로부터 얻은 단핵구의 분화에 의한 성숙 임상 등급 수지상 세포의 생성(예를 들어, 폐쇄 시스템에서)을 포함한다.
총 시험관내 배양시간(바람직하게는 약 3일 내지 약 5일 배양) 중 약 4일 이내에 생산/생성된 성숙 수지상 세포를 포함하는 수득된 생성물은 그 후 하나 이상의 항원, 특히 종양-관련 항원(TAA)이 로드된다. 본 발명에 따른 이러한 빠른 방법은 바람직하게는 무-혈청 배지를 사용하는 폐쇄 시스템에서 백혈구성분채집술 생성물로부터 많은 수의 DC를 생성할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법은 하기 단계들을 포함한다:
- 환자로부터 단핵 세포 백혈구성분채집술 생성물을 얻는 단계,
- 백혈구성분채집술로부터 단핵구를 분리하는 단계,
- 임상 등급 사이토카인, 바람직하게는 수지상 세포로의 분화에 적합한 양의 GM-CSF 및 IL-4와 함께 단핵구를 배양하는 단계,
- 단핵구-유래 수지상 세포의 최종 성숙을 위한 성숙 인자 MPLA 및 IFN-g를 첨가하는 단계, 및
- 수득된 세포를 회수하고, 이들을 하나 또는 여러 항원 또는 에피토프를 암호화하는 핵산 서열, 특히 mRNA로 형질감염시키는 단계.
일 실시형태에서, 단핵구는 GM-CSF 및 IL-4와 약 1 내지 4일, 바람직하게는 1 내지 3일, 더욱 바람직하게는 2 내지 3일(24시간 동안 1일 계수) 동안 접촉되며, 그 동안 DC 전구체는 미성숙 수지상 세포로 분화된다. 추가 실시형태에서, IFN-g 및 MPLA의 존재하에 성숙시간은 1 내지 3, 바람직하게는 1 내지 2, 더욱 바람직하게는 약 2일(24시간)이 걸린다. 배양 조건은 성숙한 DC 집단을 형성하기 위한 미성숙 DC의 성숙에 적합하다.
추가 실시형태에서, 본 발명은 본원에 제공된 방법에 의해 수득가능한 성숙(및 형질감염된) 수지상 세포 또는 성숙(및 형질감염된) 수지상 세포의 집단을 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 수지상 세포를 포함하는 조성물, 키트, 임상 등급 백 또는 냉동바이알을 제공한다.
형질감염된 수지상 세포는 면역요법용 조성물, 특히 면역요법에 사용하기 위한, 더욱 특히 암 치료용 조성물을 제조하는데 특히 유용하다. 따라서, 본 발명은 또한 본원에 제공된 방법에 의해 수득된 형질감염된 수지상 세포를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 면역요법, 종양 요법 또는 T 세포 활성화 방법을 제공한다.
도면을 구체적으로 참조하면, 도시된 세부사항은 예로서, 그리고 본 발명의 다른 실시형태의 예시적인 논의를 위한 것임을 주목해야 한다. 그것들은 본 발명의 원리 및 개념적 양태의 가장 유용하고 쉽게 설명되는 것으로 여겨지는 것을 제공하는 원인으로 제시된다. 이와 관련하여, 본 발명의 근본적인 이해를 위해 필요한 것보다 더 상세하게 본 발명의 구조적 세부사항을 보여주려는 시도는 이루어지지 않았다. 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 여러 형태가 실제로 구현될 수 있는 방법을 당업자에게 명백하게 한다.
도 1. 수확시 4-일 배양된 moDC의 특성: (A) 잔해 제거 후 CD11c높은 HLA-DR높은 DC의 유세포분석 순도; (B) 사이토스핀(cytospin) 준비 및 May-Grunwald Giemsa 염색 후 광학 현미경 하에서의 형태; (C) 생존율 및 단핵구-DC 전환율(유세포 분석)(n=33)(박스 플롯은 중앙값 및 95% C.I.를 나타냄); (D) 둘 다 생 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 내에서 게이트된, 상대적 MFI(배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하 평균 비율)를 보여주는, 대표적인 개방 히스토그램(대 회색 배경 염색) 및 요약 박스 플롯(중앙값 및 95% C.I.; n=33)을 포함하는 표현형 및 성숙 마커의 세포 표면 발현.
도 2. 4-일 moDC와 8-일 moDC 사이에서 비교한 수확시 DC 프로파일(n=10): (A) 생존율 및 단핵구-DC 전환율(유세포 분석); (B) 상대적 MFI로 계산된, 표현형 및 성숙 마커의 세포 표면 발현 비교(생 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 내에서 게이트된, 배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하학적 평균 비율). 통계: Wilcoxon 일치-쌍 서명 순위 테스트.
도 3. 수확시 4-일 moDC에서 성숙 프로파일 유도에 대한 MPLA, IFN-γ 또는 둘 다의 상대적 기여도(n=3). 막대 그래프로 표시된, DC 성숙 마커의 상대적 MFI. 통계: Kruskal-Wallis는 Dunn의 다중 비교 테스트와 결합되었다.
도 4. 나이브 T 헬퍼 분극화 가능성 측면에서 4-일 moDC에 대한 MPLA 및 IFN-γ의 조합 효과(n=6~12개의 복제는 2개의 다른 DC 공여자와 3개의 다른 동종유래 T-세포 공여자를 사용한 반복 실험으로부터 풀링됨). (A) 동종유래 나이브 T 헬퍼 세포 분극화 분석을 위한 실험 타임라인의 개략도. (B) 미성숙 또는 완전 성숙 동종유래 DC와 14일 공동배양한 후 CD4+ T-세포 내에서 CD4+ T-세포 IFN-γ/IL-10 사이토카인 생산을 보여주는 대표적인 도트 플롯. (C) DC-매개 나이브 T 헬퍼 세포 분극화에 대한 MPLA, IFN-γ 또는 조합의 상대적 기여도: 막대 그래프는 IFN-γ, IL-10, IL-4 및 IL-17 각각의 세포내 발현을 나타내는 CD4+ 세포의 백분율을 나타낸다.
도 5. (A) 전기천공후 4시간 후 생존가능한 CD11c높은 HLA-DR높은 DC의 eGFP 발현 수준을 보여주는, 4-일 moDC, 비히클에 의한 EP(MOCK-EP) 또는 eGFP mRNA(1 μg mRNA/10e6 DC)의 대표적인 도트 플롯. (B) 생존가능한 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 및 상대적 MFI의 백분율로 표시된, 시간에 따른 eGFP 발현 수준의 강도. MOCK-EP DC의 기하학적 평균은 배경 염색으로 사용되었다. 시점은 EP 후 4시간(n=9), 해동 직후(n=9) 및 사이토카인 부재시 24시간 후(n=3)가 분석에 포함되었다. (C) eGFP-mRNA로 전기천공된 후(n=17) 4-일 moDC의 생존율(트립판 블루) 및 회복율. 회복율은 전기천공 후와 전기천공 전 생존가능한 DC(트립판 블루) 수의 나눗셈으로 계산하였다. (D) eGFP mRNA를 사용한 EP 후(n=8) 4-일 및 8-일 moDC 간의 생존율(트립판 블루) 및 회복율 비교. (B-C) 통계: Dunn의 다중 비교 테스트와 결합된 Kruskal-Wallis; (D) 윌콕슨(Wilcoxon) 대응쌍 부호 순위 테스트.
도 6. (A) Luminex 분석을 사용하여 측정된 바와 같은, 사이토카인이 없는 배지에서 24시간의 배양 기간 후 냉동보존된 4-일(n=5) 및 8-일(n=2) eGFP mRNA-EP DC의 사이토카인 및 케모카인 분비물, 통계: 비대응표본(unpaired) t-검정. (B) 동종유래 T 헬퍼 세포와 공동 배양에서 냉동보존된 EP-DC의 타임 라인. (C) 냉동보존 및 해동 후 전기천공된 DC의 T-세포 분극화 특성(연회색 막대). DC가 없는 동종유래 나이브 CD4+ T-세포는 음성 대조군(흰색 막대)으로 사용되었다. (n=3 내지 6개의 복제물은 2개의 서로 다른 DC 공여자 및 1개의 동종유래 T-세포 공여자를 사용한 반복 실험에서 풀링됨). 데이터는 사이토카인-발현 CD4+ T-세포의 백분율을 보여준다. 통계: Mann-Whitney 테스트.
도 7. (A) HLA-A2-양성 공여자로부터의 MACS-정제된 CD8+ T-세포는 표시된 mRNA로 전기천공된 자가 4d-moDC로 두 번 자극되거나, MART-1로부터의 AAAGIGILTV A2-제한 펩타이드로 펄스되었다. 사량체-양성 CD8+ T-세포의 확장을 보여주는 대표적인 도트 플롯. 모든 분석에 사용된 DC는 냉동보존되고 해동되었다. (B) DC 없이, MOCK-펄스 DC로, eGFP-mRNA-EP DC로, MART-1 mRNA-EP DC로, 및 MART-1 펩타이드 펄스된 DC로 자극된 다른 HLA-A2+ 공여자 및 CD8+ T-세포를 사용하여 얻은 데이터의 요약(2개의 서로 다른 HLA-A2-양성 공여자를 사용한 반복 실험에서 풀링된 n=4~8 복제). (C) 표시된 DC 조건으로 자극된 MART-1 특이적 CD8+ T-세포에서 세포내 IFN-γ 및 그랜자임 B의 수준. (B-C) 통계: Dunn의 다중 비교 테스트를 사용한 Kruskal-Wallis.
도 8. (A) HLA-A2+ 공여자와 MART-1을 모델 항원으로 사용한 자가 DC : CD8 T-세포 공동 배양에 따른 항원-특이적 세포독성 분석의 개략도. 자가 4d-moDC로 2주마다 자극을 받은 후, 세포용해성 CD8+ T-세포를 T2 표적 세포 없이, 무관한 펩타이드 펄스 T2 표적 세포(인플루엔자 펩타이드) 또는 MART-1 펩타이드 펄스 T2 표적 세포와 함께 공동 배양했다. DC 대응물에는 음성 대조군 DC(MOCK-펄스 DC(표시되지 않음) 및 eGFP mRNA-EP DC), MART-1 mRNA-EP DC 및 양성 대조군 DC(MART-1로부터의 AAAGIGILTV 펩타이드로 펄스됨(표시되지 않음))가 포함되었다. CD8+ T-세포의 세포용해 활성은 그랜자임 B 및 IFN-γ의 분비와 함께 탈과립화 마커 CD107a 및 활성화 마커 CD137의 동시 상향조절을 특징으로 하였다. (B) 표시된 DC 조건에 의해 이전에 자극된 CD8+ T-세포로서, 대표적인 도트 플롯은 MART-1 펩타이드-로드된 T2 세포와 공동 배양한 후 CD107a/CD137 발현을 나타낸다. (C) 이전 DC 자극 및 T2 표적 세포의 유형에 따른 자가 CD8+ T-세포의 세포독성 활성(CD107a/CD137 발현)(n=4 내지 8개의 복제물이 2개의 다른 HLA-A2-양성 공여자를 사용한 반복 실험에서 풀링됨). 통계: Tukey의 다중 비교 테스트를 사용한 2-원 분산 분석(2-way ANOVA).
도 9. 다른 시점에서 결정된, 8-일 TNF-α/PGE2/IL-1β/IL-6-성숙한 moDC와 8-일 TNF-α/PGE2-성숙한 moDC(n=3) 간의 DC 표현형 비교. 관련이 있을 때마다 시점들, '수확시', 'EP 후 4시간', '해동 직후', '사이토카인이 없는 24시간 후'가 분석에 포함되었다. (A) 수확시 단핵구-DC 전환율(트립판 블루); (B) 적시에 생존율(트립판 블루); (C) 상대적 MFI로 계산된 표현형 및 성숙 마커의 시간에 따른 세포 표면 발현의 비교(배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하학적 평균 비율, 생 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 내에서 게이트됨); (D) 시간에 따른 eGFP 발현 수준의 강도, 생 CD11c높은 HLA-DR높은 세포내 eGFP + 세포의 백분율 및 상대적 MFI로 표시된다. MOCK-EP DC의 기하학적 평균은 배경 염색으로 사용되었다. 통계: 막대 그래프는 95% C.I.로 중앙값을 나타낸다.
도 10. 4-일 MPLA/IFN-γ와 "기존" moDC 프로토콜 사이에서 비교한 냉동보존 전과 후의 T-세포 동시억제 분자 PD-L1의 발현 수준. 표면 PD-L1 발현 수준은 상대적 MFI(배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하학적 평균 비율, 생 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 내에서 게이트됨)로 계산된다. 시점들, '수확 시점(n=2)(각각 4일 또는 8 일)' 및 '해동 직후(n=4)'가 분석에 포함되었다. 두 DC 배양에서, 수확시 각 공여자는 후속 냉동보존 및 해동을 위해 2개의 전기천공 조건(즉, eGFP mRNA- 및 MART-1 mRNA-EP)으로 나누어졌다.
도 11. DC 생존율은 전기천공(또는 전기천공되지 않은 조건에 대한 추가 배양)후 4시간 후, 및 동결 및 해동 후 평가되었다. 짧은 DC 배양: 3일 GM-CSF/IL-4; 24시간 MPLA(2,5 μg/mL) 및 IFN-γ(1000 U/mL). 수확시, DC는 하기 전기천공 설정으로 나뉜다:
ㆍ 전기천공 없음(비-EP);
ㆍ 지수 펄스(EXP-EP): 300V; 150 μF; 200 μl; ∞Ω; +/- 5×10E6 DC/큐벳;
ㆍ 구형파 펄스(SQW-EP): 500V; 0,5 ms; 200 μl; 1 펄스; +/- 5×10E6 DC/큐벳. eGFP mRNA는 0.5 μg/10E6 세포에서 사용되었다.
도 12. (A) 생존율 및 eGFP 발현의 유세포 분석; (B) 생 DC 대 사전 동결의 생존율 및 효과적인 회복율에 대해 평가된, 냉동보존된 분취물의 해동 후 DC의 안정성. 단핵구-유래 DC는 2개의 분리된 공여자 백혈구성분채집술에서 생성되었다. 수확시 DC는 하기 설정으로 구형파 펄스를 사용하여 0.5 μg eGFP mRNA/10E6 세포로 전기천공되었다: 500 V; 1.0 ms; 200 μl; 1 펄스; 50×10E6 DC/큐벳.
도 13. 단핵구-유래 수지상 세포는 본 발명에 설명된 프로토콜("MIDRIX DC") 또는 문헌[Massa et al., 2013]에 설명된 alt-2 프로토콜("Massa DCs")에 따라 생성되었다. DC를 각각의 시점에서 수확하고 eGFP-암호화 mRNA로 전기천공시켰다. 6명의 다른 공여자로부터의 데이터. (A) 두 프로토콜 모두에서 얻은 생 CD11c+ HLA-DR+ 수지상 세포의 수확시 생존율 및 절대 세포 수율. (B) 단핵구 마커 CD14 대 DC 분화 마커 CD83의 발현. (C) DC 성숙 마커 CD40, CD70, CD86 및 CCR7의 발현. (D) T-세포 공동-억제 수용체 PD-L1의 발현. (E) 전기천공 4시간 후 측정된, 번역된 단백질의 수준에 따라 표현된, 전기천공 효율(eGFP 신호의 상대적 평균 형광 강도)뿐만 아니라 전기천공된 eGFP-mRNA의 성공적인 번역(백분율 eGFP+DC)이 있는 세포의 분획으로 표현된 전기천공 효율.
본 발명은 이제 더 설명될 것이다. 하기의 구절에서, 본 발명의 다른 양태들이 더 상세하게 정의된다. 그렇게 정의된 각 양태는 반대로 명확하게 표시되지 않는한 임의의 다른 양태 또는 양태들과 결합될 수 있다. 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명확하게 지시하지 않는한 복수 지시대상을 포함한다. 예를 들어, "화합물"은 하나의 화합물 또는 하나 이상의 화합물을 의미한다. 본 명세서의 설명 및 청구범위 전체에 걸쳐, "포함하다"라는 단어 및 "포함하는" 및 "포함한다"와 같은 단어의 다른 형태는, 예를 들어 다른 첨가제, 구성요소, 정수 또는 단계들을 포함하지만 이들로 한정되지 않는 것을 의미하며, 이들을 배제하려는 의도는 아니다. 상기 기술된 용어 및 명세서에서 사용된 다른 용어는 당업자에게 잘 이해된다. 본 명세서에 인용된 모든 참고문헌 및 구체적으로 언급된 교시는 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
본 발명은 수지상 세포 백신, 특히 자가 단핵구-수지상 세포 백신의 제조에 관한 것이다. 특히 흥미로운 것은 본 발명의 방법이 임상 등급의 완전히 폐쇄된 시스템을 사용하여 수행될 수 있다는 점이다. 가스-투과성 배양 백 또는 용기는 폐쇄된 유체 경로 배양 시스템의 장점을 제공하여, 세포 현탁액이 멸균-연결 포트를 통해 배양 백에 첨가될 수 있다. 이상적으로는, 전체 세포 수집 및 원하는 경우 사전 선택이 폐쇄된 유체 경로 시스템에서 수행된 다음, 세포를 백으로 이동시키기 위해 가스-투과성 백에 무균적으로 연결된다. 그런 다음 배양 배지를 백을 통해 지속적으로 관류하거나, 멸균 연결 포트 및 멸균 튜브 시스템을 통해 주기적으로 새로 리프레시할 수 있다. 가스-투과성 백 내의 세포 배양은 세포가 원래 백 또는 용기에 도입될 때, 배지가 리프레시되거나 새로운 배지가 추가될 때 배양물에 도입될 수 있는 미생물과 같은 환경적 위험에 노출되지 않으면서 배양기의 가스-조절 분위기에서 유지될 수 있다. 배양 기간 동안, 배양된 세포의 샘플은 분석을 위해 멸균-연결 포트를 통해 백으로부터 무균적으로 추출될 수 있다. 마찬가지로, DC 배양물이 수확 준비가 되면 폐쇄-시스템 세척 및/또는 추가 처리를 위해 세포가 무균적으로 추출될 수 있다. 폐쇄된 시스템은 또한 공기 중 입자 수 측면에서 엄격도가 낮은 클린-룸 환경(예를 들어, 클래스 C 클린룸 환경)에서 세포 배양을 실행할 수 있는 가능성을 연다. 이는 운영자를 위한 작업 조건 측면에서 이점이 있고, 비용을 절감하며, 세포 분화 프로세스를 상업적으로 사용가능한 자동화된 배양 시스템(예를 들어, CliniMACS Prodigy® System, Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany)으로 쉽게 전환할 수 있는 가능성을 제공한다.
따라서, 본원에서 사용되는 용어 "폐쇄된 시스템"은 각각 주변 환경에 대해 폐쇄되고, 각각이 구성요소들 사이의 멸균 연결을 수행하기 위한 수단이 제공되는 구성요소의 어셈블리를 지칭한다. 일 실시형태에서, 폐쇄된 시스템은 본원에서 제공되는 분화 및 성숙 구성요소와 함께 백혈구성분채집술 생성물을 포함한다. GMP-인증 가스-투과성 배양 백 시스템의 예는 MACS® GMP 세포 배양 백(Miltenyi Biotec GmBH, Bergisch Gladbach, Germany)이다. 본원에 사용된 "GMP-인증"은 우수의약품제조관리기준(Good Manufacturing Practice)을 의미하며, 의약품 제조업체가 생산 공정에서 충족해야 하는 최소 표준을 설명한다. 예를 들어 유럽의약청(EMA, European Medicines Agency) 등은 이러한 표준 준수를 확인하기 위해 검사를 조정하고 유럽 연합(EU) 수준에서 GMP 활동을 조화시키는 데 핵심적인 역할을 한다.
일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 수지상 세포 전구체 집단을 분리 및/또는 제공하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 본원에 사용된 "수지상 세포 전구체"는 (인간) 말초 혈액 단핵 세포, 단핵구 또는 다른 골수성 전구 세포이다. 본원에 사용된 "단핵구"는 수지상 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 CD14+ 단핵 백혈구를 지칭한다. 단핵구는 임의의 포유동물로부터 유래될 수 있지만, 바람직하게는 인간 단핵구이다. 단핵구는 혈액, 혈액 분획물(예를 들어, 백혈구(WBC)), 버피 코트, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC), 단핵 세포 백혈구성분채집술 생성물과 같은 조성물 및 뿐만 아니라 단핵구가 더욱 풍부한 조성물에 제공되고, 배양될 수 있으며, 이들로 제한되지는 않는다. 바람직한 실시형태에서, 단핵구는 다른 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)와 함께, 예를 들어 단핵 세포 성분채집술 생성물로서 제공된다. 혈액 및 골수를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단핵구 및 통상적인 수지상 세포와 같은 수지상 세포 전구체가 풍부한 세포 집단을 분리하는 방법은 당 업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 단핵구 및 기존 수지상 세포는 헤파린화된 혈액을 수집하거나, 성분채집술 또는 백혈구성분채집술, 버피 코트의 제조, 로제팅, 원심분리, 밀도 구배 원심분리, 세포의 차등 용해, 여과, 용출, 형광-활성화 세포 분류 또는 면역자기 분리에 의해 분리될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 단핵구는 단핵 세포 백혈구성분채집술로부터 분리된다. 백혈구성분채집술 방법은 당 업계에 알려져 있다. 백혈구성분채집술은 대상체의 혈액에서 백혈구를 제거하고 나머지는 대상체에게 다시 수혈하는 절차이다. 백혈구성분채집술 생성물은 전형적으로 적혈구, 과립구 및 혈소판 오염 수준이 낮은, PBMC가 풍부한 혈액 분획물이다. 백혈구성분채집술을 수행하기 위한 방법 및 장비는 당 업계에 잘 알려져 있다. 단핵구 수지상 세포 전구체 및/또는 분화된 통상적인 수지상 세포는 건강한 대상체 또는 면역자극이 필요한 대상체, 예컨대 예를 들어, 암 환자 또는 세포 면역자극이 유익하거나 바람직할 수 있는 다른 대상체(즉, 박테리아 또는 바이러스 감염이 있는 대상체 등)로부터 분리될 수 있다. 수지상 세포 전구체 및/또는 미성숙 수지상 세포는 또한 면역자극을 필요로 하는 HLA-매칭 대상체에게 투여하기 위해 HLA-매칭된 건강한 개체로부터 얻어질 수 있다.
일 실시형태에서, 단핵구는 분화 단계 전에 농축된다. 조작은 단핵구 또는 PBMC 등에서 수행될 수 있으며, 예를 들어 원심분리, 용출, 접선 흐름 여과, Ficoll 밀도 구배, 희석 Ficoll 밀도 구배 원심분리, 희석 Percoll 밀도 구배 원심분리, 항체 패닝, 자기 세포 분류, 양성 또는 음성 면역자기 선택 등을 포함한다. 또한, 대상체로부터 분리되면 단핵구(예를 들어, 정제된 단핵구, 농축 단핵구, 단핵구를 포함하는 PBMC 등)가 선택적으로 특정 기간 동안, 예를 들어 대상체로부터 격리된 시간으로부터 대략 1 내지 96시간 동안, 예를 들어, 1℃~34℃의 온도에서 배양될 수 있다.
특정 실시형태에서, 단핵구 전구세포는 면역자기 분리에 의해 백혈구성분채집술로부터 얻어진다. 더욱 특히, 생존가능한 단핵구 DC 전구체의 집단은 예를 들어 단핵구 마커 CD14 및 생존율 염색을 사용하는 유세포 분석에 의해 결정된 바와 같이 순도 90% 초과, 95% 초과 또는 99% 초과로, 고도로 정제된다.
따라서, 본원에 개시된 방법의 첫 번째 단계는 특히 본원에 제공된 바와 같은 폐쇄된 시스템을 사용하여 분리된 (자가) 단핵구 DC 전구체를 제공하는 단계를 포함한다. 전형적으로, 세포 배양 개시시 배양 백 또는 용기 내의 DC 전구체 세포 밀도는 당 업계에 공지된 방법에 의해 결정된 바와 같이, 0.5×10E6 내지 2×10E6 세포/ml, 바람직하게는 약 1×10E6 세포/ml 범위이다.
분리, 정제 및/또는 농축 후, DC 전구체는 수지상 세포로 분화하도록 유도된다. 따라서, 추가 실시형태에서, 본 발명의 방법은 미성숙 DC를 얻기 위한 배양 및/또는 분화 단계, 예컨대 적어도 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-4(IL-4)(분화 배지라고 함)의 존재하에 전구체 세포의 배양단계를 포함하며, 이는 약 48 내지 96시간 동안, 더욱 특히 48 내지 84시간 동안, 더욱 특히 최대 80, 75, 74, 73, 72, 71, 70시간 이하, 보다 구체적으로 적어도 48시간 및 최대 72시간 동안이다. +/- 4시간 또는 +/- 2시간의 여유가 허용되며, 실제적인 제약을 고려할 때 필요할 수 있다. 특정 실시형태에서, 분리된 DC 전구체는 폐쇄된 시스템을 통해 (무-혈청) 분화 배지를 함유하는 가스-투과성 배양 백으로 전달된다.
GM-CSF 및 IL-4는 각 사이토카인의 약 100 U/ml 내지 5000 U/ml, 바람직하게는 500 U/ml 내지 2500 U/ml, 더 바람직하게는 500 U/ml 내지 1500 U/ml 또는 약 500 내지 1000 U/ml의 농도로 사용될 수 있다. 특히, GM-CSF는 500 U/ml 내지 2500 U/ml, 바람직하게는 1000 내지 1500 U/ml, 더욱 바람직하게는 약 1000 U/ml의 농도로 사용될 수 있다. 보다 구체적으로, IL-4는 500 U/ml 내지 2500 U/ml, 바람직하게는 500 내지 1500 U/ml, 더욱 바람직하게는 500 내지 1000 U/ml, 더욱더 바람직하게는 약 500 U/ml의 농도로 사용될 수 있다.
단핵구를 미성숙 수지상 세포로 분화시킨 후, 미성숙 수지상 세포를 성숙 수지상 세포로 성숙시킬 수 있다. 따라서, 일 실시형태에서, 본 발명의 방법은 (분화 된) 미성숙 DC 인터페론 감마(IFN-g) 및 모노포스포릴 지질 A(MPLA)(성숙 자극 또는 칵테일로 지칭됨)에 첨가하는 것과 같은 성숙 단계를 포함하고, 이것은 적어도 최대 30시간, 바람직하게는 적어도 24시간 동안이다. 특히, 성숙 자극 IFN-g 및 MPLA는 수확 및/또는 형질감염 전에 세포 배양의 마지막 24시간 +/- 4시간, 특히 +/- 2시간 동안 배지에 첨가된다.
IFN-g는 500 U/ml 내지 2000 U/ml, 바람직하게는 500 U/ml 내지 1500 U/ml, 더욱더 바람직하게는 500 U/ml 내지 1000 U/ml, 특정 실시형태에서는 약 1000 U/ml의 농도로 사용된다. MPLA는 1 내지 20 μg/ml, 특히 1 내지 10 μg/ml, 더욱 특히 1 내지 5 μg/ml의 농도로 사용된다. 특정 실시형태에서, MPLA는 약 2.5 μg/ml의 농도로 사용된다. 추가 실시형태에서, IFN-g는 약제학적-등급 또는 GMP-인증 재조합 인간 IFN-g이다. 본원에 사용된 "약제학적-등급" 화합물은 알려진 국가 또는 지역 약전에 의해 화학적 순도 표준이 확립된 임의의 활성 또는 비활성 약물, 생물학적 또는 시약을 지칭한다.
따라서, 본 발명에 따르면, 전구체 및/또는 미성숙 수지상 세포는 (적어도) 상기 인자들, 즉 분화 및/또는 성숙 인자의 조합으로 배양된다. 이는 배양 배지에 인자를 추가하여 수행될 수 있다. 대안적으로, 전구체 세포 및/또는 미성숙 수지상 세포가 성장한 배양 배지는 이미 인자를 함유하는 배지로 대체된다. 추가 실시형태에서, 상기 언급된 물질이 첨가되거나 상기 세포의 배양 배지에 첨가된 조성물의 일부일 수 있다. 상기 배양 배지는 임의의 적합한 종류일 수 있으며, 즉, 예를 들어 단백질, 아미노산 또는 항생제와 같은 임의의 다른 보충제와 함께 또는 없이 보충될 수 있다. 특정 실시형태에서, 배지는 GMP 조건 하에서 생산되고 사용된다. 더 구체적으로, 배양 배지는 무-혈청, 예컨대 예를 들어, 무-혈청 GMP CellGro®(CG) 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany)이다. 완전히 폐쇄된 시스템의 실시형태에서, 전구체 세포는 본원에 제공된 바와 같이 DC 분화 배지를 함유하는 배양 백으로 옮겨질 수 있다. 두 번째 단계에서 약 48시간(+ 또는 - 4시간) 후에 성숙 자극 IFN-g 및 MPLA가 배양 백의 배지와 세포에 첨가된다.
더욱이, 본 발명의 목적은 핵산-암호화된 항원의 효율적인 제시와 결합된 강력한 Th1 분극화 능력을 갖는 임상-등급 수지상 세포(DC)의 생산을 위한 "가속된" 시험관내 세포 분화 방법을 제공하는 것이다. 전형적으로, 본 발명의 DC 배양 프로토콜의 기간은 8일 "표준" 프로토콜 대신 약 4일로 제한된다.
다양한 공여자에 대해 평가할 때, DC 생존율 및 단핵구-DC 전환율은 표준 프로토콜과 비교하여 본 발명의 방법에서 상당히 더 높다(예를 들어, 전환율에 관하여: 본 발명의 방법: 약 45%, 표준 방법: 약 25%).
표현형적으로, 본원에 제공된 방법에 의해 수득된 세포는 하기를 포함하는 수지상 세포의 주요 특징을 나타낸다:
- 광학 현미경으로 평가된 전형적인 수지상 세포 형태,
- DC 분화 마커 CD11c, MHC 클래스 II(HLA-DR) 및 CD83의 균일한 발현,
- 단핵구 마커 CD14의 균일한 하향조절.
DC의 성숙 상태와 관련하여, 이는 특정 세포 표면 마커의 발현을 측정하여 평가되며, 그중 T-세포 공동자극 분자, 바람직하게는 유세포 분석에 의해 평가된다. 이 경우, 발현 수준은 일반적으로 알려진 방법에 의해 결정된 상대적 평균 형광 강도(MFI)(배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하학적 평균 비율)로 제공된다. T-세포 공동자극 분자는 전형적으로 성숙 마커로 평가되며, DC 표면 상의 발현은 가능한한 높아야 한다. 반대로, 최종 DC 생성물에서 T-세포 공동-억제 분자의 발현을 가능한한 낮게 유지하기 위해 노력하고 있다.
본 발명의 방법에 따라 수득된 DC는:
- T-세포 공동자극 분자(CD40, CD70, CD86)의 균일한 상향조절, 및
- 림프 조직-호밍 케모카인 수용체 CCR7의 균일한 발현을 입증한다.
CD40, CD70 및 CCR7의 중앙값은 "기존" 프로토콜을 사용하여 생성된 DC에 의해 표시되는 것과 비교하여 통계적 유의도(양측 p-값 <0.05)로 더 높다.
본 발명의 일 실시형태에서, 본원에서 생성된 DC 상의 세포 표면 마커 발현 수준은 성숙 자극으로서 PGE2 및 TNF-α를 사용하는 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC 상에서의 동일한 수준과 비교되고, 이에 의해 성숙한 수지상 세포가 8일 후에 수득된다.
예를 들어, T-세포 공동-억제 리간드 PD-L1의 경우, 상대적 평균 형광 강도(relMFI)로 표현된 세포 표면 수준(사용된 분석 방법에 대한 설명은 실시예의 재료 및 방법 섹션 참조)은 400, 350, 320, 310, 300, 250, 200 미만, 특히 150 미만이다. 또한, 본 발명에 따라 생성된 DC에서 전기천공, 냉동보존 및 세포 해동 후 표면 PD-L1 발현(즉, 환자에게 투여되는 시간에 생성물에 대해 대표적)은 500, 470, 450 미만, 특히 400 미만이다.
따라서, 세포 수확시(DC 성숙 직후), 본 발명의 방법에 따라 생성된 DC에 의한 PD-L1의 발현 수준은 성숙 자극으로서 PGE2 및 TNF-a를 사용하는 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC에 의한 발현보다 적어도 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 특히 적어도 10배 더 낮고, 이로써 성숙 수지상 세포가 8일 후에 수득된다(실시예의 도 10 참조). 따라서, 세포 해동시 본 발명의 방법에 따라 생성된 DC에 의한 PD-L1의 발현 수준은 성숙 자극으로 PGE2 및 TNF-a를 사용하는 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC에 의한 발현보다 적어도 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배, 특히 적어도 10배 더 낮으며, 이로써 성숙 수지상 세포가 8일 후에 수득된다(실시예의 도 10 참조).
기능적으로, 냉동보존 및 해동 후 세포는 사이토카인이 없는 배지에서 장기간 배양하는 동안 Th1, CD8 및 NK 세포를 유인하는 1형 분극화 사이토카인(IL-12, IFN-g) 및 케모카인을 분비하는 능력을 보존한다. 특히 본 발명의 방법에 따라 생성된 DC는 통계적으로 유의미한 높은 수준의 CXCR3 리간드 CXCL9(MIG30) 및 CXCL10(IP-10)뿐만 아니라 CCR5 리간드 CCL3(MIP-1α), CCL4(MIP-1β) 및 CCL5(RANTES)를 분비하고, 상기 언급된 "기존" 방법으로 얻은 DC에 비해 CCL17 수준이 검출할 수 없는 수준으로 더 낮다. 일 실시형태에서, 사이토카인 및 케모카인 분비 수준은 상대적인 용어, 즉 성숙 자극으로서 PGE2 및 TNF-α를 사용하는 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC에 의한 사이토카인 또는 케모카인 각각의 분비 수준과 비교하여 표현되며, 성숙 수지상 세포가 8일 후에 수득된다. 분비 수준은 표준 단백질 측정 방법, 예를 들어 ELISA 또는 본원에 제공된 Luminex® 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
예를 들어, 원형 1형 T-세포-분극화 및 NK 세포-지지 케모카인 IL-12의 경우, 상기 언급된 조건에서 해동 및 추가 배양 후 수지상 세포 상청액에서 방출되는 수준의 범위는 하기와 같다:
ㆍ 본 발명의 방법에 따라 생산된 DC의 경우: 50 내지 250 pg/ml; 특히 60 내지 200 pg/ml; 특히 70 내지 150 pg/ml;
ㆍ "표준" 8-일 프로토콜에 따라 생산된 DC의 경우: 0 내지 35 pg/ml, 50 pg/ml 미만.
케모카인 CXCL10(1형 분극화 T-세포 및 NK-세포 모집에 중요)의 경우, 상기 언급된 조건에서 해동 및 추가 배양 후 수지상 세포 상청액에서 방출되는 수준 범위는 하기와 같다:
ㆍ 본 발명의 방법에 따라 생산된 DC의 경우: 200 내지 2000 pg/ml; 특히 250 내지 1800 pg/ml; 더욱 특히 280 내지 1600 pg/ml;
ㆍ "표준" 8-일 프로토콜에 따라 생산된 DC의 경우: 0~5 pg/ml, 10 pg/ml 미만.
따라서, CXCL10의 경우 본 발명의 방법에 따라 생성된 DC에 의한 분비 수준이 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC에 의한 분비보다 적어도 50배 더 높다. 본 발명의 방법으로 얻은 DC의 유사한 우월성은 항암 면역에 필요한 1형 분극화 염증 반응을 촉진하는 추가 사이토카인 및 케모카인, 그중 IFN-g, CCL3, CCL4, CCL5 및 CXCL9에서 관찰된다.
대조적으로, 케모카인 CCL17(조절 T-세포 및 2형-분극화 T-세포의 모집에 관여하며, 둘 다 항암 면역 반응에 해로움)의 경우, 본 발명의 방법에 따라 생성된 DC에 의한 방출은 "기존" 방법을 사용하여 생성된 DC에 의한 분비보다 적어도 3배 낮다.
따라서, 본 발명의 방법으로 수득된 DC는 예를 들어 활성 암 면역요법에 요구되는 바와 같이 높은 IFN-γ 분비를 특징으로 하는 1형 분극화 프로파일을 향해 나이브 T-헬퍼 세포의 분화를 유도한다. 더욱이, 상기 세포는 형질감염된 mRNA로부터 유래된 면역원성 에피토프를 제시할 수 있고, 이어서 이미 언급된 바와 같이 IFN-γ 및 세포독성 분자 그랜자임 B를 발현하는 자가 종양 항원-특이적 CD8+ T-세포의 확장을 유도할 수 있다.
추가 실시형태에서, 본 발명의 방법은 성숙 DC를 핵산, 특히 RNA, 더욱 특히 mRNA를 암호화하는 항원으로 로딩 또는 형질감염시키는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 "항원"은 본 발명을 제한하지 않는다. 일 실시형태에서, 항원은 종양-항원, 종양-관련 항원, 암-고환 항원, 뮤타놈(mutanome)-유래 항원, (발암성) 바이러스 항원, 박테리아 항원, 효모 항원, 기생충 항원 및 균류 항원으로 구성된 군으로부터 선택된다. 항원은 대상체에게 자가일 수 있고, 대상체에게 투여하기 위해 항원-로드된 자가 DC 백신을 제조하는 데 사용될 수 있다. 대상체에게 자가라는 것은 항원(또는 이의 서열)이 동일한 대상체로부터 얻어지거나 유래됨을 의미한다. 비-제한적인 예로서, 항원은 대상체로부터 얻은 암 세포 또는 종양 조직으로부터 유래될 수 있다. 암 항원은 추출물, 정제, 증폭, 시험관내 번역 등에 존재하든지, 암세포로서의 수지상 세포, 암세포 또는 조직 용해물, 암세포 또는 조직으로부터의 추출물, 암세포 또는 조직의 정제 또는 클로닝된 구성요소, 전체 RNA 또는 전체 mRNA, 또는 이러한 세포 또는 조직에서 선택된 RNA 또는 mRNA에 로드될 수 있다. 대안적으로, 항원은 병원체 또는 대상체에 존재하는 병원체-감염된 세포로부터 수득되거나 유래될 수 있다. 용어 "핵산"은 단일-가닥, 이중-가닥 및 삼중 나선 분자, 유전자 또는 유전자 단편, 엑손, 인트론, mRNA, tRNA, rRNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오타이드, 분지형 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머를 지칭한다. 보다 구체적으로, 수지상 세포는 mRNA를 암호화하는 하나 이상의 항원으로 시험관내 형질감염된다. 선택적으로 그리고 대안적인 실시형태에서, 성숙 기간이 완료된 후, DC는 추가 취급(예컨대 예를 들어, 형질감염) 전에 먼저 수확될 수 있으며, 이에 의해 세포가 수집되고, 원심분리되고/되거나 사이토카인이 세척된다.
가속화된 배양 프로토콜의 관점에서, 성숙한 DC의 형질감염은 단핵구 분리 또는 전구체 DC에 분화 자극을 추가한 후 약 72 내지 96시간, 특히 86시간 +/- 4시간 후에 가능하다.
본 발명의 맥락에서, 형질감염 방법은 전기천공, 광 천공, 리포펙션, 바이러스 벡터 시스템, 네이키드 핵산의 인큐베이션 또는 감염된 세포 또는 종양 세포와 DC의 융합을 포함하지만 이들로 제한되지 않는다. 이러한 표준 방법은 당 업계에 잘 알려져 있으며, 실행 가능하며, 항원 암호화 플라스미드, 이들의 RNA 또는 DNA와 같은 핵산을 DC에 도입한다. 임의의 종류의 항원 공급원으로 사용하기 위해 막 단편 또는 엑소좀과 같이 생각할 수 있는 원래 MHC 분자와의 다른 항원 조합이 있을 수도 있다. 특정 실시형태에서, 성숙한 DC는 전기천공에 의해 형질감염된다. 지수 감소 펄스(Exponential Decay Pulse), 구형파 펄스(Square Wave Pulse) 및 시간 상수(Time Constant)와 같은 세 가지 유형의 펄스가 전기천공에 사용될 수 있다. 본 발명의 특정 실시형태에서, 전기천공은 구형파 펄스로 구성된다. 전형적으로 형질감염을 완료하기 위해 1개 또는 2개의 펄스가 유도된다.
본 발명의 일 실시형태에서, 항원은 핵산, 바람직하게는 mRNA로 수지상 세포의 전기천공에 의해 로드된다. 바람직하게는, 수지상 세포는 10E6 수지상 세포 당 대략 0.25 내지 4 μg RNA, 가장 바람직하게는 10E6 수지상 세포 당 약 1 내지 3 μg RNA로 형질감염된다. 일 실시형태에서, 백만 DC 당 1 내지 2 μg 항원 RNA가 형질감염마다 사용된다.
본 발명의 방법에 의해 수득된 세포는 형질감염된 mRNA로부터 유래된 단백질을 균일하고 안정적으로 발현한다는 것이 본원에서 입증되었다(실시예 참조). 더욱이, 상기 세포는 형질감염된 mRNA로부터 유래된 면역원성 에피토프를 제공할 수 있고, 이어서 예를 들어 활성 암 면역요법에 요구되는 바와 같이 세포독성 프로파일을 갖는 자가 종양 항원-특이적 CD8+ T-세포의 확장을 유도할 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 본 명세서에 제공된 바와 같은 짧은 배양시간 하에서, 예를 들어, 대략 3일 이내의 미성숙 수지상 세포의 자극으로 인해 8일의 "기존" 프로토콜에 의해 제조된 mDC에 비해 향상된 생존율, 기능성 및/또는 면역자극 활성을 갖는 성숙한 수지상 세포가 생성된다는 것이 발견되었다.
본원에 사용된 용어 "면역자극 활성"은 성숙한 수지상 세포 또는 성숙한 수지상 세포 집단이 충분한 양의 특정 사이토카인 및 케모카인, 특히 IL-12 및 CXCL10을 생산 및/또는 분비하는 능력을 지칭하며, 예를 들어, 암 및 특정 병원체에 대한 면역에 필요한, 1형 분극화 이펙터 T-세포 및 NK-세포의 정확한 분화 및 동원을 매개한다.
본 발명의 일 실시형태에서 로드된/형질감염된 수지상 세포는 동결보호제를 포함하는 조성물에서 동결될 수 있다. DC를 동결하기 위한 수많은 동결보호제 및 방법이 당업자에게 알려져 있다. 예를 들어, 수지상 세포는 제어 속도 냉동기를 사용하여 냉각되고 액체 질소 용기의 증기상에서 냉동보존 및 저장을 위해 옮겨진다. 특히, 수지상 세포는 20~70×10E6 생세포/mL, 보다 구체적으로 약 40~60×10E6 생세포/mL, 더욱더 구체적으로 약 50×10E6 생세포/mL의 농도로 100 μL의 부피 분취량으로 적합한 냉동보존 배지에 재현탁된다. 추가 단계에서, 해동된 수지상 세포 백신은 해동 후 언제든지, 일반적으로 약 4시간 이내에 대상체에게 투여할 준비가 되어 있다.
일 실시형태에서, 본 발명은 본원에 제공된 바와 같은 냉동보존, 성숙, 형질감염, 특히 전기천공된 DC, 특히 냉동보존 전에 측정된 100 μL 당 약 5×10E6 세포의 양을 포함하는 냉동바이알을 제공한다.
본 발명은 본원에 제공된 방법에 따라 제조된 냉동보존된 생 수지상 세포를 해동하는 단계 및 이를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 항원 로드된 수지상 세포 백신의 투여 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 또한 약제로서, 특히 약제 또는 약제학적 조성물의 제조를 위한, 본원에 개시된 방법에 의해 수득된 항원-로드된 수지상 세포의 용도를 제공한다. 본 발명은 면역요법에 사용하기 위한, 특히 암 또는 병원체 감염의 치료 또는 예방을 위한 본원에 기재된 바와 같은 DC 또는 조성물을 제공한다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 성숙 수지상 세포 및 약제학적으로 허용가능한 담체 및/또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 포함한다. 더욱이, 본 발명은 또한 악성 장애(암), 특정 비-악성 장애(예를 들어, LAM 폐 질환(림프관평활근종증), 및 감염성 질환(예를 들어, 바이러스, 박테리아, 세포내 박테리아 또는 진균에 의해 유발됨)으로 구성된 군으로부터 선택된 질환을 치료하는 방법에 사용하기 위한 본 발명의 성숙한 수지상 세포 또는 성숙한 수지상 세포의 집단에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 종양 질환(예컨대, 암) 또는 감염성 질환을 앓고 있는 환자를 치료하는 방법에 관한 것으로서, 여기서 유효량의 본 발명의 성숙 수지상 세포가 상기 환자에게 투여된다.
본 발명의 항원-로드된 수지상 세포는 질환의 치료 또는 예방 또는 T 세포의 활성화를 위한 백신으로서 유용하다. 예를 들어, 항원 로드된 수지상 세포가 사용되어 항원에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 이들은 미래의 감염 또는 질환을 예방하기 위한("예방 백신접종"), 또는 병원체 감염 또는 암과 같은(이에 국한되지 않음) 진행중인 질환을 치료하기 위한 면역 체계를 활성화하기 위한("치료 백신접종") 백신으로 사용될 수 있다. 본원에서 제조된 항원 로드된 수지상 세포는 생리학적 완충제 또는 기타 주사가능한 액체와 같은 적합한 담체와 함께 백신 또는 약제학적 조성물로 사용하기 위해 제형화될 수 있다. 백신 또는 약제학적 조성물은 면역 반응을 유도하기에 충분한 치료적 유효량으로 투여된다.
본원에 사용된 용어 "치료" 및 "치료하는"은 일반적으로 원하는 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 얻는 것을 의미하고, 하기를 포함하는, 포유동물, 특히 인간에서의 질환의 임의의 치료를 포함한다:
(1) 질환 또는 증상에 취약할 수 있지만 아직 걸렸다고 진단받지 않은 대상체에서 질환 또는 증상이 발생하는 것을 방지.
(2) 질환 증상 억제, 즉 그의 발병 억제; 또는
(3) 질환 증상 완화, 즉 질환 또는 증상의 퇴행 유발.
효과는 질환 또는 이의 증상을 완전히 또는 부분적으로 예방하는 측면에서 예방적일 수 있고/있거나 질환 및/또는 질환에 기인하는 부작용에 대한 부분적 또는 완전한 안정화 또는 치료 측면에서 치료적일 수 있다. 또한, 백신은 치료 환경에서 그의 효과를 극대화하기 위해 1차 또는 초기 요법에 추가로 제공되는 "보조 요법"으로 사용되거나, 질환 통제를 최대화하고, 질환 재발을 지연시키기 위한 초기 요법 이후에 "유지" 또는 "통합" 요법으로 사용될 수 있다.
본 발명의 맥락에서, 용어 "암"은 악성 종양에 의해 유발되는 모든 종류의 질환을 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "감염성 질환"은 병원성 바이러스, 병원성 박테리아, 진균, 원생동물 또는 다세포 기생충을 포함하는 병원성 미생물 제제의 존재로 인한 임상적으로 명백한 임의의 종류의 질환을 지칭한다.
수지상 세포 백신을 제형화하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 투여에 적합한 제형은 항산화제, 완충제, 박테리오스타트, 및 의도된 수혜자의 혈액과 제형을 등장성으로 만드는 용질을 함유할 수 있는 수성 등장성 멸균 주사 용액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정제, 방부제, 면역자극제, 사이토카인 및 보조제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함할 수 있다.
수지상 세포 조성물/백신은 주사(예를 들어, 피하, 피내, 정맥내, 림프내, 관절내, 근육내, 복강내), 연속 주입, 임플란트로부터의 지속 방출 등과 같은 다양한 방법에 의해 투여될 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. DC 백신은 특정 간격으로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, DC는 2 내지 4주 간격, 특히 2주 간격으로 투여된다. 수지상 세포 백신은 생리학적으로 허용가능한 담체, 완충제, 희석제, 보조제, 면역조절제 등과 함께 투여될 수 있다. 바람직하게는, 수지상 세포 백신은 투여되는 환자에게 자가이거나 최대 HLA-매칭이다.
대상체에게 투여되는 세포의 용량은 유효량으로, 시간이 지남에 따라 대상체에서 원하는 유익한 치료 반응을 달성하거나, 암 세포의 성장을 억제하거나, 감염을 억제하는 동시에 우수한 내약성 프로파일(최소 독성)을 유지한다. 이를 달성하기에 적당한 양은 "치료적 유효 용량"으로 정의된다. 용량은 생산된 수지상 세포의 생물학적 및/또는 임상적 활성 및 선택적으로 환자의 상태에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한 특정 환자에서 특정 세포의 투여에 수반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 암과 같은 질환(예를 들어, 전이성 흑색종, 전립선 암 등)의 치료 또는 예방에 투여할 세포의 유효량을 결정할 때 의사(또는 연구자)는 측정가능한 매개변수(정규 또는 면역-관련 RECIST 기준에 의한 방사선 종양 부담, 종양 마커, 순환 종양 세포, 혈장 순환 종양 DNA 또는 질환 부하 또는 질환 활성의 기타 대리 마커)를 사용한 종양의 임상적 진화와 함께 백신(즉, 면역모니터링)에 포함된 표적에 대한 면역 반응을 평가해야 한다.
특정 수준의 생물학적 및/또는 임상적 효과를 달성하기 위해 투여되는 DC의 바람직한 용량에 대한 증거가 없다는 것은 당업자에게 잘 알려져 있다. 마찬가지로 명확한 용량-제한 독성(DLT)이 관찰되지 않았고 따라서 최대 허용 용량(MTD)도 관찰되지 않았다. 가장 일반적으로 투여되는 용량은 한 라운드의 백혈구성분채집술로부터 얻은 DC의 수율과 후속 백신접종의 원하는 횟수에 따라 결정된다. 일 실시형태에서, 용량은 2 내지 8회, 특히 2 내지 6회, 더욱 특히 2 내지 4회 반복되는 백신 라운드 당 5~100×10E6 DC 이내이다. 마찬가지로, 주입된 세포의 수와 독성 사이에는 관계가 없다. DC 예방접종의 독성은 일반적으로 낮으며, 오히려 투여 경로와 관련이 있다(피내 경로에 비해 정맥내 경로에서 더 심각한 부작용). 주사는 예를 들어 1주, 2주 또는 3주 간격으로 2, 3, 4, 5 또는 6회 반복되고 정맥내로 또는 림프절 근처에 피내 또는 피하 주사로 투여하거나 림프절에 직접 주사해야 한다. 부스터 주사는 일시 중지 후, 예를 들어 1개월 내지 수개월후 수행될 수 있다.
생물학적 반응 조절제는 선택적으로 본 발명의 DC 또는 활성화된 T 세포에 의한 치료를 위해 첨가된다. 예를 들어, 세포는 선택적으로 보조제, 또는 사이토카인, 예컨대 GM-CSF, IL-12, IFN-α 또는 IL-2와 함께 투여된다.
본원(수반되는 청구범위, 요약서 및 도면 포함)에 설명된 모든 특징들 및/또는 본원에 개시된 임의의 방법 또는 프로세스의 모든 단계는 이러한 특징들 및/또는 단계들 중 적어도 일부가 상호배타적인 것을 제외하고는 임의의 조합으로 상기 양태들 중 임의의 것과 조합될 수 있다.
본 발명은 하기 도면들, 표들 및 실시예들에 의해 추가로 설명될 것이며, 이는 청구범위에 정의된 보호 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 실시예에 설명된 방법과 실험은 대부분 익명의 공여자 버피 코트를 출발 물질로 사용하는 전임상 개발과 관련이 있다.
실시예
재료 및 방법
단핵구-유래 수지상 세포 배양
버피 코트는 국소 수혈 센터에서 얻었으며, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)는 Ficoll-불투명 밀도 구배 원심분리에 의해 단리시켰다(GE Healthcare Life Science, Chicago, Illinois, USA). 제조업체의 프로토콜에 따라 인간 항-CD14 면역자기 마이크로비즈(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 단핵구를 면역자기적으로 정제하였다. 유세포 분석(데이터는 표시되지 않음)으로 평가한 바와 같이 > 90%의 순도가 지속적으로 얻어졌다.
단핵구-고갈된 분획(말초 혈액 림프구(PBL))을 RPMI-GlutaMAX 배지(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에서 10% 소 태아 혈청(FBS)(Sigma-Aldrich, Missouri, USA), 100 U/ml 페니실린/스트렙토마이신(P/S)(Gibco by Life Technologies, California, USA) 및 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)와 함께 동결시켰다.
본 발명의 가속화된(즉, 4-일) DC 배양 프로토콜의 경우, 단핵구를 30 ml GMP 세포 분화 백(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에서 1000 U/ml 약제학적-등급 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF)(Leukine(Berlex), Bayer Healthcare Pharmaceuticals, New Jersey, USA), 1000 U/ml GMP-인증 재조합 인간 인터루킨-4(huIL-4)(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)를 함유하는 무-혈청 GMP CellGro(CG) 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany)에서 2×10E6 세포/ml의 밀도로 배양했다. 3일째에, 2.5 μg/ml 합성 MPLA(Invivogen, California, USA) 및 1000 U/ml 약제학적-등급 IFN-γ(Immukine, Boehringer Ingelheim BV, Ingelheim, Germany)를 추가 24시간 동안 배양 배지에 첨가하였다. 성숙한 DC(mDC)는 4일째에 수확하였다.
"기존" (8-일) 프로토콜의 경우, 낮은 농도의 재조합 huIL-4(250 U/ml; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 1% 풀링된 인간 AB 혈청(huAB 혈청)(Sigma-Aldrich, Missouri, USA) 첨가를 제외하고는, 단핵구를 동일한 완전 배지에서 1×10E6의 밀도로 폴리스티렌 배양 플라스크(Nunc by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)에서 배양하였다. 3일 또는 4일째에 신선한 GM-CSF-함유 및 IL-4-함유 배양 배지를 첨가하였다. 6일째에, 20 ng/ml 재조합 인간 TNF-α(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 2.5 μg/ml 약제학적-등급 PGE2(Prostin E2, Pfizer, New York, USA)를 추가로 배양 배지에 48시간 동안 첨가하였다. 성숙한 DC는 8일째에 수확하였다.
DC 표현형 분석
표면 염색을 위해, 세포를 먼저 세척한 다음, 인산염 완충 식염수(PBS)(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에 재현탁한 후, FcR 차단 시약(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 고정가능한 생존성 염료 eFluor 506(eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)과 함께 4℃에서 20분 동안 배양하여 죽은 세포를 염색하였다.
다음으로, 0.5 mM 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA); 0.25% 소 혈청 알부민(BSA); 및 0.05% NaN3(모두 Sigma-Aldrich, Missouri, USA)이 보충된 PBS(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)로 구성된 FACS 완충액으로 세포를 세척한 후, 4℃에서 30분 동안 표면 항체(Ab)를 첨가하였다. 하기 플루오로크롬-접합된 단일클론 Ab를 사용하였다: 항-CD40 FITC; 항-HLA-ABC FITC; 항-CCR7 APC; 항-CD11c Alexa Fluor 700; 항-HLA-DR APC-Cy7(eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA); 항-HLA-A2 FITC; 항-DNGR-1 PE; 항-CD86 PE Texas Red; 항-CD83 PE-Cy7; 항-PD-L1 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(BD Biosciences, New Jersey, USA); 항-CD70 PE; 및 항-CD14 퍼시픽 블루(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).
LSR Fortessa 분석 유세포 분석기(BD Biosciences, New Jersey, USA)에서 샘플을 획득하고, FlowJo 소프트웨어(버전 9.9.4; BD Biosciences, New Jersey, USA)를 사용하여 분석하였다. 표현형 및 성숙 마커 발현 수준은 상대적 평균 형광 강도(MFI)로 표시된다(배경 형광에 대한 양성 형광 신호의 기하학적 평균 비율, 생 CD11c높은 HLA-DR높은 DC 내에서 게이트됨).
Luminex 분석
4-일 및 8-일 단핵구-유래된 DC(moDC)의 냉동보존 분취량을 해동하고, 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)가 보충된 혈청-없는 및 사이토카인-없는 CG 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany)에서 24시간 동안 배양하였다. DC 배양 상청액을 수집하고, Luminex 분석(R&D Systems, Minneapolis, USA)을 사용하여 분석했으며, 하기 인간 사이토카인 및 케모카인: IL-12p70; IFN-γ; IL-10; CCL3; CCL4; CCL5; CXCL9; CXCL10; CCL17; CCL20; 및 CXCL12를 포함하도록 맞춤화하였다. Luminex 분석은 Bio-Plex(Bio-Rad, California, USA) 리더에서 분석하였다.
DC의 mRNA 전기천공
수확 후, 각각 4일 또는 8일째에 DC를 전기천공하고, 이어서 3.5% 인간 혈청 알부민(Sanquin, Amsterdam, The Netherlands); 6.25% 하이드록시에틸 전분(HES)(Grifols, Barcelona, Spain); 및 6.25% DMSO(Sigma-Aldrich, Missouri, USA)이 풍부한 Plasma-Lyte A(Baxter, Illinois, USA)에서 냉동보존하였다. eGFP mRNA는 브뤼셀 Free University의 분자 및 세포 치료 연구소(LMCT), K. Thielemans 교수가 친절하게 제공한 pST1-eGFP2 플라스미드에서 유래했다. 플라스미드를 먼저 Sapl 제한 효소(New England Biolab, Massachusetts, USA)를 사용하여 선형화하고, 이어서 mMESSAGE mMACHINE T17 Ultra 키트(Ambion by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)를 사용하여 mRNA로 시험관내 전사하였다. MART-1 mRNA도 LMCT에 의해 공여되었다. MART-1의 오픈 리딩 프레임은 문헌[Bonehill et al (2004)]에 의해 이전에 기술된 바와 같이 리소좀 단백질 DC-LAMP1의 HLA 클래스 II-표적화 서열에 융합되었다. 4 내지 16×10E6 DC를 170 μl 무-혈청 CG 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany)에 재현탁하고, 1 μg mRNA/10E6 DC의 용량으로 뉴클레아제가 없는 물(Applied Biosystems by Life Technologies, California, USA)에 용해된 30 μl mRNA를 보충하고, 4 mm 갭 큐벳(Bio-Rad, California, USA)으로 옮겼다. 지수파 펄스를 사용한 전기천공은 하기 매개변수와 함께 Gene Pulser Xcell 전기천공 시스템(Bio-Rad, California, USA)을 사용하여 수행하였다: 용량 150 μF; 전압 300V; 저항 ∞Ω. EP 직후, 1000 U/ml GM-CSF(Leukine(Berlex), Bayer Healthcare Pharmaceuticals, New Jersey, USA), 재조합 huIL-4(DC 유형에 따라 1000 U/ml 또는 250 U/ml; Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Technologies, California, USA)가 보충된 CG 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany) 중의 초-저 부착 플레이트(Corning, New York, USA)에서 37℃ 및 5% CO2에서 4시간 동안 DC를 회수하였다. MOCK-EP DC는 mRNA없이 CG 배지(CellGenix GmBH, Freiburg, Germany)에서 동일한 펄스 설정으로 전기천공하였다. 구형파 펄스 전기천공(SQW-EP)을 사용한 전기천공은 하기 매개변수와 함께 동일한 전기천공 시스템을 사용하여 수행하였다: 전압 500V; 0,5ms; 200 μl; 1 펄스; 5×10E6 또는 50×10E6 DC/큐벳.
동종유래 T 헬퍼 세포 분극화 분석
전기천공된 및 냉동보존된 DC를 해동하고, 10% huAB 혈청(Invitrogen by Life Technologies, California, USA) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)이 보충된 따뜻한 RPMI-GlutaMAX 배지(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에서 37℃ 및 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 회복시키고, 자극제로 사용하였다. 반응자로서 CD45RO-음성 T 헬퍼 세포는 AutoMACS 세포 분리기(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)에서 나이브 CD4+ T-세포 분리 키트 II를 사용하여 동종유래 PBL로부터 농축되었다. DC 및 T-세포는 10% huAB 혈청(Sigma-Aldrich, Missouri, USA) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)이 보충된 RPMI-GlutaMAX 배지(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에서 1:5 DC:T-세포 비율로 14일 동안 공동-배양하였다. 10 ng/ml 재조합 인간 IL-2(R&D Systems, Minneapolis, USA)는 공동-배양 7일째에 첨가하였고, DC를 함유하지 않는 대조군 조건에서는 3일과 10일째에 추가로 첨가하였다.
동종유래 공동-배양이 끝나면, 50 ng/ml 포볼(phorbol) 12-미리스테이트 13 아세테이트(PMA); 1 μg/ml 이오노마이신(iono) 및 10 μg/ml 브레펠딘 A(BFA)(모두 Sigma-Aldrich, Missouri, USA)를 37℃ 및 5% CO2에서 5시간 동안 첨가한 후 유세포 분석 염색을 위해 세포를 수확했다. 표면 T-세포 마커를 검출하는 항체는 항-CD3 PerCP-Cy5.5; 항-CD8a PE-Cy7(BioLegend, California, USA); 항-CD4 APC-Cy7(BD Biosciences, New Jersey, USA); 및 항-CD45RO PE-Cy7(eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)을 포함하였다. 세포내(IC) 염색의 경우, 세포를 표면 염색 후 FACS 완충액으로 세척하고, 제조업체의 프로토콜에 따라 Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences, New Jersey, USA)으로 처리한 후 하기 Ab들과 함께 4℃에서 30분 동안 배양하였다: 항-IL-4 FITC(BD Biosciences, New Jersey, USA); 항-IL-10 PE; 항-IL-17A APC; 및 항-IFN-γ 퍼시픽 블루(eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA).
항원-특이적 자가 CTL의 확장
HLA-A2+ 공여자의 버피 코트를 사용하여 4-일 MPLA/IFN-γ-성숙 DC를 생성했으며, 이를 수확 후 4시간후에 냉동시키거나(즉, 비-EP DC), 두 비히클(즉, eGFP mRNA-EP DC) 또는 항원 MART-1 mRNA(즉, MART-1 mRNA-EP DC)를 먼저 전기천공한 후 냉동보존하였다. DC 배양 및 조작에 대한 자세한 내용은 상기 재료 및 방법 섹션 "단핵구-유래 수지상 세포 배양" 및 "DC의 mRNA 전기천공"을 참조한다.
해동 후, 비-EP DC; eGFP mRNA-EP DC; 및 MART-1 mRNA-EP DC는 10% huAB 혈청(Invitrogen by Life Technologies, California, USA) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)이 보충된 RPMI-GlutaMAX 배지(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에서 37℃ 및 5% CO2에서 적어도 1시간 동안 회복시켰다. 그 후, 비-EP DC의 절반을 MART-1(AAAGIGILTV; 서열 번호 1)(Genscript, New Jersey, USA)(문헌[Valmori D, et al. 1998])로부터의 최적화된 면역우성 HLA-A*201-제한 펩타이드 10 μM으로 펄스하여, 양성 대조군 조건으로 사용하였다. 비-EP DC의 절반은 비히클로만 펄스되고, 음성 대조군 조건(MOCK-펄스 DC)으로 사용하였다. 37℃ 및 5% CO2에서 적어도 1시간 배양한 후, 결합되지 않은 펩타이드는 위에서 설명한 것과 동일한 배양 배지를 사용하여 세척하였다.
CD8+ T-세포는 양성 면역자기 선택 키트(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 냉동보존된 자가 CD14-음성 분획물로부터 정제하였다. DC 및 T-세포를 10% huAB 혈청(Invitrogen by Life Technologies, California, USA) 및 100 U/ml P/S(Gibco by Life Technologies, California, USA)이 보충된 RPMI-GlutaMAX 배지(Invitrogen by Life Technologies, California, USA)에서 14일 동안 1:10 비율로 공동-배양하였다. 20 ng/ml 재조합 인간 IL-2(R&D Systems, Minneapolis, USA)를 3일과 10일째에 첨가하였다. DC가 없는 자가 CD8+ T-세포가 있는 배양 웰을 추가 대조군으로 포함했다. 공동-배양 7일째에, 자가 CD8+ T-세포를 해당 DC(즉, MOCK-펄스된 DC, eGFP mRNA-EP DC, MART-1 mRNA DC 및 MART-1 펩타이드 펄스된 DC)로 재자극하였다. 공동-배양이 끝나면, 상기 기재된 바와 같이 세포를 PMA/iono/brefA와 함께 5시간 동안 배양하고, PE-접합된 A*02:01/인간 MART-1 MHC 사량체(Sanquin, Amsterdam)를 사용한 표면 염색 및 하기 마커: 항-IFN-γ FITC(BioLegend, California, USA); 및 항-그랜자임 B 퍼시픽 블루(BD Biosciences, New Jersey, USA)를 사용한 세포내 염색을 위해 수확하였다.
DC-유도 항원-특이적 세포용해 활성 평가
이펙터 T-세포는 상기 기재된 바와 같이 자가 DC:T-세포 공동 배양 설정의 14일째에 수확되었다. 표적 세포는 상기 기재된 바와 같이 MART-1으로부터의 동일한 펩타이드(Genscript, New Jersey, USA) 또는 대조군으로서 서열 GILGFVFTL을 갖는 인플루엔자 매트릭스 단백질(AnaSpec, California, USA; 서열 번호 2)로부터의 관련없는 A2-제한 펩타이드로 로드된 TAP2-결핍 T2 세포들로 구성된 표적 세포들은 둘 다 10 μg/ml로 사용되었다. T2 세포를 3시간 동안 펄스하고 완전히 세척하여 결합되지 않은 펩타이드를 제거하였다. 모넨신(Golgistop, BD Biosciences, New Jersey, USA) 및 항-CD107a 퍼시픽 블루 Ab(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)의 존재하에 10:1의 E:T 비율로 14시간 동안 공동-배양을 설정했다. 공동-배양이 끝날 때 세포를 표면 항-CD3, 항-CD8 및 항-CD137(eBioscience by Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, USA)로 염색했다.
통계
GraphPad Prism(버전 7.02, GraphPad 소프트웨어, California, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행하였다. 정규 분포는 D'Agostino-Pearson 옴니버스 정규성 테스트를 사용하여 첫번째로 테스트하였다. 정규-분포된 데이터는 2개 그룹에 대한 비대응표본(unpaired) 또는 대응표본(paired) t-검정 또는 3개 이상의 그룹에 대한 Tukey의 다중 비교 테스트와 조합된 분산 분석(ANOVA) 테스트로 분석하였다. 비정규 분포 데이터의 경우, 비모수 테스트, 즉 비대응표본 데이터 세트에 대한 Mann-Witney 테스트와 두 그룹들에 대한 대응표본 데이터 세트에 대한 Wilcoxon 일치-쌍 서명 순위 테스트를 사용하였다. 2개 이상의 그룹에 대해 Dunn의 다중 비교 테스트와 함께 비모수 Kruskal-Wallis 테스트를 사용하였다. 통계적 유의 수준은 하기와 같이 별표 기호로 암호화되었다: p-값 0.01~0.05(*), p-값 0.001~0.01(**), p-값 <0.001(***) 및 p-값 <0.0001(****).
결과
TLR4-리간드와 IFN-γ를 사용한 성숙을 포함하는 단축된 단핵구 배양 프로토콜에 의해, 완전히 분화된 성숙 수지상 세포의 높은 수율을 얻을 수 있다.
확립된 1형 분극화 인자 조합을 사용하는 성숙과 함께, 크게 감소된 단핵구 배양 기간을 결합하여 DC를 생성하는 가능성은 버피 코트에서 시작하는 광범위한 소규모 배양 시리즈를 사용하여 평가하였다. 우리의 GMP 생산 환경으로의 직접 옮김을 위해 세포 배양 배지, 사이토카인 및 폐쇄된-시스템 용기를 선택했다.
운영자 개입의 필요성을 줄이기 위해 표준 8-일 DC 배양 기간을 총 4일로 줄이는 것을 목표로 했다. 이는 GM-CSF/IL-4-보충 GMP-준수, 무-혈청 배지에서 3일 배양한 후 수확전 추가 24시간 동안 MPLA와 IFN-γ의 조합에 노출시키는 것으로 구성되었다. 이 프로토콜은 중앙 순도 94.6% [95% Cl: 93.7~96.9]를 갖고(도 1a), 광학 현미경으로 특징적인 수지상 형태를 보여주는(도 1b), CD11c높은 HLA-DR높은 단핵 세포 집단을 생성한다. 수확시, 중앙 단핵구-DC 전환율은 41.5%[95% Cl: 30.7~51.7]였으며, (유세포 분석에 의한) 중앙 생존율은 95.7%[95% Cl: 92.7~96.4]였다(도 1c).
세포의 표현형은 완전히 분화된 성숙 DC의 표현형과 일치했으며, 단핵구 마커 CD14의 엄청난 하향조절은 CD83의 상향조절뿐만 아니라 높은 수준의 HLA 클래스 I 및 클래스 II 항원-제시 분자와 조합된 T-세포 공동자극 마커 CD40, CD70 및 CD86의 높은 표면 발현과 병행되었다. 또한, 분자 DNGR-1이 높은 수준에서 검출될 수 있다는 관찰은 외인성 세포-결합 항원을 포획하고 교차-제시할 가능성을 시사한다. CCR7은 성숙한 DC에서 유도되어, 2차 림프 기관으로 옮겨질 수 있는 능력을 나타낸다. T-세포 체크포인트 분자인 PD-L1은 또한, moDC의 전체적인 활성화 상태를 반영하여 상향조절되었다(도 1d).
그런 다음, 이 4-일 moDC 분화 프로토콜을 백신 생산과 관련된 몇 가지 주요 매개변수 측면에서 확립된 "기존" 임상 등급 8-일 DC 배양과 비교하였다. GM-CSF/IL-4-보충된 배양 배지에서 8-일 moDC를 생성하고 TNF-α 및 PGE2를 첨가하여 마지막 2일 동안 성숙시켰다. 문헌[Jonuleit et al(1997)]에 의해 처음 설명된 원래의 성숙 칵테일은 TNF-α, PGE2, IL-1β 및 IL-6으로 구성되었지만, 본 발명자들과 다른 사람들은 IL-1β 및 IL-6의 누락이 생성된 DC의 생존율, 분화 및 성숙도에 해로운 영향을 미치지 않으며(도 9), DC 기능에 부정적인 영향을 주지 않았음을 관찰하였다(문헌[Van Driessche et al. 2009]).
첫째, 본 발명자들은 4-일 moDC가 수확시 8-일 moDC보다 훨씬 더 생존할 수 있음(p-값 0.0010)을 일관되게 관찰했으며, 96.3%[95% Cl: 92.7~98]의 중간 생존율(유세포 분석)은 58%[95% Cl: 45.1~69.1]와 비교되었다. 4-일 moDC는 또한 가장 높은 중간 단핵구-DC 전환율(46.9%[95% Cl: 27.2~63.2] 대 26.8%[95% Cl: 14.1~36.2])로 증가시켜 통계적 유의도에 도달했다(p-값 0.0195)(도 2a).
다음으로 수확시 표현형 프로파일의 차이를 살펴보았다. 4-일 moDC는 표준 8-일 moDC보다 훨씬 높은 수준(MFI)의 CD40, CD70 및 HLA-ABC를 나타냈다. 예기치 않게, CCR7은 PGE2에 노출되지 않았음에도 불구하고 MPLA/IFN-γ-성숙 4-일 moDC에서 더 높은 수준으로 발현되었다. 대조적으로, CD86의 발현은 8-일 moDC에서 더 높다(도 2b 및 표 1). CD83, HLA-DR 및 DNGR-1은 두 DC-배양 프로토콜에서 발현에 통계적으로 유의한 차이를 보이지 않았다. 예기치 않게, PD-L1 발현은 4-일 moDC에 비해 표준 8-일에서 지속적으로 더 높았으며(평균 4배), 냉동보존된 DC 분취물을 해동한 후 더 증가했다(도 10).
Figure pct00001
이 데이터로부터, 활성화 인자 MPLA 및 IFN-γ와 함께 단핵구 배양 기간을 절반으로 줄이면 전환 수율이 높고, 세포 생존율이 높으며, 공동자극 분자 발현 수준에 해로운 영향을 미치지 않는, 완전히 분화된 성숙한 DC가 생성된다.
우리가 알고 있는 한, 단 하나의 보고서만이 단 24~36시간의 단핵구-DC-분화 기간을 갖는 가속 DC-분화 프로토콜에서 성숙 칵테일로서 MPLA + IFN-γ의 통합을 설명했다(문헌[Massa et al. 2013]). 그러나, DC 백신의 활성에 대한 결과는 상기 대체 DC에 대해 평가되지 않았다. 비교로서, 단핵구-유래 수지상 세포는 이전에 본원에 기재된 프로토콜("MIDRIX DC")에 따라, 또는 문헌[Massa et al.]에 의해 기재된 alt-2 프로토콜("Massa DC")에 따라 생성되었다. CD14+ 단핵구는 이전에 본 명세서에 기재된 바와 같이 버피 코트로부터 분리되었다. DC를 각각의 시점에서 수확하고 eGFP-암호화 mRNA로 전기천공시켰다. 데이터는 6명의 다른 공여자로부터 도출되었으며, 하기 양태들을 평가하였다:
(A) 두 프로토콜 모두에서 얻은 생 CD11c + HLA-DR + 수지상 세포의 수확시 생존율 및 절대 세포 수율;
(B) 단핵구 마커 CD14 대 DC 분화 마커 CD83의 발현;
(C) DC 성숙 마커 CD40, CD70, CD86 및 CCR7의 발현;
(D) T-세포 공동-억제 수용체 PD-L1의 발현;
(E) 전기천공 4시간 후 측정된, 번역된 단백질의 수준(eGFP 신호의 상대적 평균 형광 강도)뿐만 아니라 전기천공된 eGFP-mRNA의 성공적인 번역(eGFP + DC 백분율)이 있는 세포의 분획으로 표현된 전기천공 효율.
도 13에서 볼 수 있는 바와 같이, 24시간 내지 36시간의 분화 단계의 기간은 단핵구의 DC로의 충분한 분화를 달성하고 T-세포 자극 능력과 상관 관계가 있는 충분한 표현형 성숙 특징을 생성하기에 충분하지 않았다. 중요한 것은, 생존가능한 DC의 절대 수율이 본 발명의 방법과 비교할 때, 문헌[Massa et al.]에 기재된 프로토콜을 사용하여 현저하게 낮아졌으며, 이는 전기천공 및 냉동보존으로 이러한 세포를 추가로 처리할 가능성을 현저히 손상시켜 DC 백신에 영향을 미치는 것으로 나타났다. "Massa DC"는 전장 단백질을 암호화하는 mRNA를 사용하여 전기천공에 덜 민감한 반면, 본 발명에 따라 생성된 DC는 높은 전기천공 효율을 나타냈다.
또한, "Massa DC"는 단핵구 마커 CD14의 하향조절이 적고, DC 분화 마커 CD83의 상향조절이 적으며, DC 성숙/T-세포 공동자극 수용체 CD40, CD70 및 CD86의 수준이 낮다. 림프 조직의 T-세포 영역으로의 이동에 필요한 CCR7 수준은 D1 DC에서 덜 상향조절된다. 더욱이, PD-L1 수준은 "Massa DC"에서 더 높은 발현 경향을 나타냈다.
MPLA와 IFN-γ는 모두 단기 배양된 DC에 완전히 성숙한 표현형과 새로운(de novo) T 헬퍼 1 분극화를 유도하는 능력을 부여하는 데 필요하다
본 발명자들은 다음으로 표현형 성숙 상태에 대한 MPLA, IFN-γ 또는 조합의 상대적 기여도뿐만 아니라 4-일-배양된 moDC의 T 헬퍼-분극화 능력 측면에서 기능적 영향을 분석했다.
본 발명자들은 T-세포 공동자극 분자 CD40, CD70, CD86, 뿐만 아니라 CD83 및 CCR7의 표면 발현 수준을 최대화하기 위해 두 성숙 자극이 필요하다는 것을 발견했다(도 3). 이 효과는 HLA-DR 또는 DNGR-1의 발현과 관련하여 관찰되지 않았으며, 후자는 미성숙 DC에 비해 안정적으로 남아 있었다. 주목할 점은 moDC에 대한 PD-L1 유도가 주로 IFN-γ 노출보다는 MPLA에 의해 주도되었다는 것이다.
기능적 수준에서, 나이브한 동종유래 CD4+ T-세포에 의한 IFN-γ 분비의 최대 유도는 DC를 MPLA 및 IFN-γ 둘 다에 이전에 노출시킴으로써만 달성되었다. 제한된 양의 IL-10 생산은 나이브 T 헬퍼 세포에서 미성숙 DC에 의해 유도되었으며, 이는 이전 IFN-γ 노출에 관계없이 MPLA 사전-노출된 DC의 존재하에 더욱 억제되었다. T 헬퍼 세포 IL-4 생산은 MPLA/IFN-γ-성숙 DC의 존재하에 약간의 증가를 보인 IL-17과 같이 낮은 수준에서만 유도되었다(도 4).
따라서, MPLA 및 IFN-γ 모두에 대한 단기-분화된 moDC의 노출은 완전히 성숙한 표현형을 얻고 이러한 세포에 강력한 새로운 1형-분극화된 T 헬퍼 세포 반응을 유도할 수 있는 능력을 부여하는 데 필요하다.
단기 배양된 DC는 높은 mRNA 번역 효율과 함께 전기천공에 대한 우수한 탄력성을 나타낸다.
표현형 성숙 및 1형 면역 분극화 가능성 외에도 임상 실습에서 구현할 수 있으려면 전기천공 및 냉동보존 스트레스 후 충분한 DC 양을 회복해야 한다.
본 발명자들은 먼저 MPLA/IFN-γ-성숙, 단기 배양된 DC가 전기천공된 항원-암호화 mRNA에서 유래된 단백질 항원을 성공적이고 안정적으로 발현하는 능력을 평가했다. eGFP-암호화 mRNA를 전기천공 효율에 대한 마커로 사용하여, 전기천공 4시간 후/냉동보존 전, 세포 해동 직후 및 사이토카인이 없는 배지에서 추가 배양 후 세포 해동 24시간 후 eGFP 발현을 조사했다.
지수 펄스에 의해 전기천공된 eGFP 양성 DC의 중앙 백분율은 냉동보존 전 64.8[95% Cl: 55.2~87.7]에서 해동 직후 80.2[95% Cl: 73.1~87.7]로 진화했으며, 다음 24시간 동안 안정적으로 유지되었다(86.3[95% Cl: 75.2~86.4), 그 기간 동안 발현 강도(MFI)에 유의한 변화가 없었다(도 5a, 도 5b).
지수 펄스 전기천공은 4-일 moDC에서 17.3%의 평균 생존율(트립판 블루) 감소를 가져왔다. 전기천공-유도된 순 세포 손실과 결합하여, 이는 51.4%[95% Cl: 36~67%]의 중앙 백분율 생 DC 회복으로 변환되었다(전기천공 후 대 전기천공 전 회복된 생세포)(도 5c). 별도의 일련의 공여자를 사용하여, 4-일 MPLA/IFN-γ moDC를 전기천공에 대한 탄력성 측면에서 표준 8-일 moDC와 비교했다. 본 발명자들은 67.3%[95% Cl: 18.2~93.5] 대 16.5%[95% Cl: 2.8~57.8]의 중앙 생존율로 EP 후 4-일 DC가 8-일 DC보다 훨씬 더 생존가능했다는 것을 관찰했다(트립판 블루). 8-일 moDC는 또한 eGFP mRNA EP 후 순 세포 손실에 더 민감했으며, 평균 생세포 회복율은 4-일 moDC에 의한 41.5%[95% Cl: 12.8~83.8]에 비해 24.6%[95% Cl: 3.7~47.5]였다.(도 5d)
추가 테스트에서 본 발명자들은 구형파 펄스 전기천공 후 결과를 평가하였다. 다양한 사이토카인 농도에 걸쳐 생성된 DC를 사용하는 소규모 실행을 사용하여, 본 발명자들은 전기천공 후 및 냉동보존 후 세포 생존율이 지수 펄스 프로그램에 비해 구형파 펄스를 사용하여 지속적으로 더 높음을 발견했다(도 11).
구형파 펄스의 추가 평가는 GMP 환경에서 본격적인 DC 생산 라운드에서 수행되었다. 구형파 펄스를 사용하여 전기천공된 DC에 의한 eGFP 발현의 유세포 분석은 eGFP 양성 세포% 측면에서 지수 펄스에 비해 열등하지 않았다(도 12a에 표시된 대표 데이터). 구형파 펄스에 의한 전기천공은 > 75%의 생존율을 가진 > 80% 냉동보존된 DC의 해동 직후 DC 회복을 초래하였다(도 12b).
구형파 펄스 전기천공 후 거시적 세포 응집체의 형성이 관찰되지 않았으며, 이는 추가 세포 처리를 크게 촉진하고 전체 세포 회복을 개선한다(결과는 표시되지 않음).
전기천공 및 냉동보존은 1형-분극화된 T-세포 반응을 선택적으로 촉진하는 단기 배양된 DC의 능력을 손상시키지 않는다
전기천공 및 냉동보존의 스트레스 이후 온전하게 유지되어야 하는 주요 DC 속성은 환자에게 투여될 때 1형-분극화된 및 세포용해성 T-세포를 선택적으로 동원할 수 있는 잠재력이다. 이 기능에 대한 평가를 제공하기 위해 본 발명자들은 사이토카인이 없는 배지에서 24시간 배양 기간 후 전기천공 및 냉동보존된 4-일 moDC 대 표준 8-일 DC의 사이토카인 및 케모카인 분비물을 분석했다(도 6a). 본 발명자들은 4-일 moDC가 여전히 생리활성 IL-12뿐만 아니라 IFN-γ를 분비할 수 있는 반면, 8-일 moDC에 의한 이들 사이토카인의 생산은 검출 한계 미만이었음을 발견하였다. 두 DC 유형간에 IL-10 생산의 차이는 관찰되지 않았다. 더욱 놀랍게도, 본 발명자들은 MPLA/IFN-γ-성숙된 4-일 moDC만이 1형 분극화된 T 헬퍼 세포, 세포용해성 T-세포 및 NK-세포를 유인하는 데 관여하는 다량의 케모카인을 생성하고, 표준 8-일 moDC에서 분비물이 검출되지 않았음을 발견하였다(문헌[Colantonio et al. 2002]). 여기에는 높은 수준의 CXCR3 리간드 CXCL9(MIG30) 및 CXCL10(IP-10)(문헌[Groom et al. 2011]), 뿐만 아니라 CCR5 리간드 CCL3(MIP-1α), CCL4(MIP-1β) 및 CCL5(RANTES)(문헌[Samson et al. 1997])가 포함된다. CXCR3 리간드 CXCL11(문헌[Groom et al. 2011])의 분비는 검출 한계 미만이었다. 대조적으로, T-reg 및 Th2-동원 케모카인 CCL17(TARC)(문헌[Yoshie et al. 2015])의 분비는 표준 8-일 moDC에서 5배 더 높았다. 4-일 moDC에 의한 Th17-유인 및 T-reg-유인 케모카인 CCL20(문헌[Yamazaki et al. 2008])의 더 높은 방출 경향이 있는 반면, T-reg-유인 CXCR4 리간드 CXCL12(SDF-1α)의 생산(문헌[Colantonio et al. 2002])은 두 DC 배양 프로토콜(데이터는 표시되지 않음)간에 차이가 없었다.
본 발명자들은 또한 전기천공 및 냉동보존이 새로운 T 헬퍼 1-분극화 반응을 유도하는 4-일 moDC의 용량에 영향을 미치는지 조사하였다(도 6c). 동종유래 나이브 CD4 T-세포와 해동된 4-일 moDC의 공동 배양은 갓 수확한 전기천공되지 않은 4-일 moDC에서 얻은 것과 비슷한 높은 IFN-γ 생산 수준을 나타냈다(도 4). IL-10 생산 유도는 이 설정에서 매우 낮았으며(도 6c), 신선한 DC에서 얻은 결과와 일치했다(도 4).
단기 배양된 DC는 세포용해 활성으로 종양 항원-특이적 CD8+ T-세포를 효율적으로 프라이밍하고 확장한다
수율, 표현형, 전기천공/냉동보존 후 회복 및 1형 분극화 T-세포 반응을 촉진하는 능력 측면에서 단기 배양된 moDC의 우월성을 확립했으며, 본 발명자들은 다음으로 전기천공된 종양 항원-암호화 mRNA로부터 면역원성 에피토프를 제시하는 이러한 세포의 능력을 테스트했다. 다시, 실제 임상 환경에서 DC 백신의 구현을 반영하기 위해, 신선한 mRNA-EP DC가 아닌 냉동보존된 것으로 모든 분석을 수행하였다. MART-1/Melan-A는 HLA-A2-양성 건강한 혈액 공여자에서 사량체를 사용하여 MART-1 특이적 CD8+ T-세포를 검출할 수 있는 가능성을 고려하여 모델 종양-관련 항원으로 사용되었다.
본 발명자들은 MART-1-mRNA-EP DC를 사용한 총 2회의 주간 자극 라운드가 관련없는 항원(eGFP)이 로드된 DC를 사용한 자극과 비교하여 항원-특이적(사량체-양성) CD8+ T-세포의 30배 초과의 확장을 유도하기에 충분했다는 것을 관찰하였다(중앙값 0.43%[95% Cl: 0.22~0.53]) 대 13.2%[95% Cl: 1.21~37.6]). 4-일 moDC가 MART-1 mRNA 또는 eGFP mRNA로 전기천공되었는지 여부와 상관없이 전기천공 후 생존율 및 회복 속도 측면에서 차이가 관찰되지 않았다(데이터는 표시되지 않음). MART-1-특이적 CD8+ T-세포의 확장은 MART-1 펩타이드 펄스된 DC(양성 대조군)(중앙값 18.9%[95% Cl: 5.75~28.8])로 얻은 것과 동일한 크기였다. 이러한 결과는 MPLA/IFN-γ 성숙된 4-일 moDC가 Ag-특이적 자가 CD8+ T-세포에 대한 효율적인 제시를 위해, 전기천공된 MARTI-암호화 mRNA로부터 면역원성 에피토프를 추출할 수 있음을 나타낸다(도 7a~도 7b).
자극된 CD8+ T-세포의 이펙터 잠재력을 평가하기 위해 본 발명자들은 IFN-γ 및 그랜자임 B에 대한 IC 염색과 사량체 검출을 결합했다. 본 발명자들은 MART-1 -mRNA-EP 4-일 moDC가 음성 대조군 조건(즉, MOCK-펄스된-DC 또는 eGFP mRNA-EP-DC를 사용한 자극 또는 DC 없음)과 비교하여 가장 많은 수의 IFN-γ 및 그랜자임 B-생산 항원-특이적 CD8+ T-세포를 유도했음을 발견하였다(도 7c).
4-일 moDC-자극된 CD8+ T-세포의 세포용해 능력을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 TAP-결핍, HLA-A2+ T2 세포를 A2-제한 MART-1 펩타이드 대 관련없는(플루) 펩타이드가 수동적으로 로드된 표적으로 사용했다(도 8a에 예시된 실험 설정). 세포용해성 탈과립화 마커 CD107a와 함께 T-세포 활성화 마커 CD137/4-1BB의 이중 발현을 관찰하는 유세포분석법 분석을 사용하여 이전에 설명한대로 표적 참여 및 사멸 활성을 검출했다(문헌[Bonehill et al. 2009]). 본 발명자들은 MART-1-mRNA-로드된 및 MART-1 펩타이드 펄스된 4-일 moDC로 2주 동안 자극된 CD8+ T-세포만이 MART-1-펩타이드 로드된 T2-세포와 접촉한 후 CD137/CD107a를 상향조절하였음을 관찰하였다(도 8b의 대표 도트 플롯). 이 신호는 대부분의 공여자에서 검출되었으며, 관련없는 표적(플루-펩타이드-로드된 T2 세포)의 참여가 세포용해성 마커 발현을 유도하지 않았거나 MOCK-펄스된 또는 eGFP-mRNA-전기천공된 DC로 이펙터 CD8+ T-세포를 사전 자극하지 않았으므로 특이적이었다(도 8c).
논의
본 발명자들이 아는 한, 이것은 전기천공법에 의해 도입된 mRNA-암호화된 종양 항원의 효율적인 제시와 결합된, 강력한 Th1 분극화 능력을 가진 임상-등급 DC의 생산을 허용하는 가속된 시험관내 세포 분화 방법에 대한 첫 번째 설명이다.
완전히 성숙한 DC를 생산하기 위해 기존 7~8일 시험관내 배양을 단축하는 가능성은 과거에 다른 그룹에 의해 설명되었다. 성숙 프로필 및 기능 측면에서 기존 장기간 DC 배양과 비교해서 동일하게 수행된, GM-CSF 및 IL-4의 존재하에 24시간(문헌[Dauer et al. 2003]; 문헌[Kvistborg et al. 2009]; 문헌[Jarnjak-Jankovic et al. 2007])에서 72시간(문헌[Truxova et al. 2014])의 단핵구-DC 분화 시간후 이어서 표준 염증성 사이토카인 칵테일 TNF-α, IL-1β, IL-6, PGE2 또는 TLR 리간드를 사용하여 24시간(문헌[Truxova et al. 2014])의 성숙 기간후 종종 "고속-DC"라고 불리는 세포들이 수득되었다. 단 하나의 보고서만이 24~36시간의 단핵구-DC-분화 기간 후 4가지 다른 성숙 전략을 사용한 비교 연구의 일환으로, 가속된 DC-분화 프로토콜에서 성숙 칵테일로 MPLA + IFN-γ의 통합을 설명하였다(문헌[Massa et al. 2013]). TNF-α + IL-1β + IL-6 + PGE2 또는 대체 TNF-α + IL-1β + IFN-α + IFN-γ + 폴리(I:C) 또는 TNF-α + IL-1β + IFN-γ + CL097의 기존 칵테일로 성숙된 DC와 비교하여, MPLA + IFN-γ-성숙 DC는 가장 높은 수준의 공동자극 분자 발현을 발현하고, IL-12p70/IL-10 방출의 최고 비율을 생성했다.
문헌[Ten Brinke et al.(2007; 2010)]에 의해 수행된 연구에서도 6~7일 배양시간을 사용했지만 1형 분극화 효능 측면에서 MPLA/IFN-γ의 사용이 문서화되었다. 본 발명은 MPLA/IFN-γ가 가속화된 배양 프로토콜에도 적용될 때 DC의 완전한 성숙을 유도할 수 있음을 입증한다(도 1d; 도 2b). 또한, 본 발명자들은 CD86, CD40 및 CD70과 같은 주요 T-세포 공동자극 분자뿐만 아니라 림프절-호밍 케모카인 수용체 CCR7의 최대 발현을 유도하기 위해 두 작용제의 조합이 필요함을 입증한다(도 3). 이 중 CD40 및 CD70 상향조절은 복잡한 염증성 칵테일로 성숙된 8-일 DC를 사용하여 얻은 것보다 지속적으로 높았다. 두 분자의 충분한 수준은 항종양 면역 반응에 필수적이다: CD40은 T 헬퍼 세포-DC 활성화를 촉진시켜, CD8+ 세포독성 T 림프구의 다운스트림 최적 자극을 허용하는데 핵심적인 반면, CD70은 T-reg 또는 Th17 T-세포 분화보다 Th1을 유도하는 데 중추적 역할을 하고, CD8+ T-세포에 이펙터 및 메모리 특성을 부여하는 데 핵심적인 역할을 한다. 따라서 CD40/CD40L 및 CD70/CD27 축의 잠재력을 활용하는 것은 임상 암 백신 용도를 위한 DC 면역원성을 높이기 위한 전략으로 성공적으로 활용되었다.
본 발명자들은 MPLA/IFN-γ-성숙된 DC 대 TNF-α/PGE2 DC에서 T-세포 공동억제 수용체 PD-L1의 낮은 수준을 검출하는 것에 놀랐다(도 2b). 놀랍게도, 수확시 PD-L1 발현 수준의 차이는 냉동보존/해동 후 더욱 증가하며(도 10), 즉 이 면역억제 리간드의 발현이 가능한한 낮아야 하는 환자에게 효과적으로 투여될 생물학적 제형이다. 면역억제 능력이 있는 종양-관련 골수 세포의 경우에서 보여지는 바와 같이(문헌[Prima et al. 2017]), 2형 인터페론은 많은 세포 유형에서 PD-L1 발현의 원형 유도물질이지만(문헌[Gato-Canas et al. 2017]), PGE2는 골수 세포에서 PD-L1 상향조절의 강력한 동인으로 설명되었다. DC 배양 프로토콜에서 PGE2의 사용은 일반적으로 DC에서 CCR7의 최적 발현을 유도하여, 림프 조직의 T-세포 의존 영역으로의 이동 효율을 최대화하는 능력에 의해 동기부여되었다. 그러나, 본 발명에서 4-일 MPLA/IFN-γ DC는 적어도 TNF-α/PGE2-성숙 DC만큼 많은 CCR7을 발현하였다. TNF-α/PGE2-성숙 DC에서 볼 수 있는 IL-12 억제와 결합하여(도 6a), 이러한 결과는 모두 차세대 DC-기반 암 백신을 위한 기존 DC 성숙 칵테일에서 벗어나는 움직임을 강력하게 지원한다.
1형 분극화 면역 반응을 지원하는 4-일 MPLA/IFN-γ-성숙 DC의 능력을 추가로 확인하는 것은 사이토카인이 없는 배지에서 냉동보존, 해동 및 추가 24시간 배양 후 방출된 케모카인의 프로필이다(도 6a). 8-일 TNF-α/PGE2-성숙 DC와 비교하여, 4-일 MPLA/IFN-γ-성숙 DC만이 Th1-유인 케모카인 CCL3, CCL4, CCL5, CXCL9 및 CXCL10의 높은 수준을 분비하였다. 생체내에서, CD4+ T-세포에서 DC-분비된 CXCL10과 CXCR3 수용체 발현 사이의 상호작용은 림프절에서 이들 세포 유형 사이의 안정적인 접촉 형성을 보장하는 것으로 나타났다. 이러한 CD4+ T-세포를 높은 IFN-γ 생산의 잠재적인 틈새에 배치하는 것과 함께 이러한 안정적인 세포-접촉은 Th1-분화를 더욱 촉진할 수 있다. 또한, 본 발명의 실험은 가능하게는 PGE2 사전조건화의 결과로서, T-reg 및 Th2-동원 케모카인 CCL17이 8-일 TNF-α/PGE2 성숙 DC에 의해 주로 방출되는 것으로 나타났다. 통계적 유의도는 도달하지 않았지만, 4-일 MPLA/IFN-γ-성숙 DC에 의해 Th17-유인 및 T-reg-유인 케모카인 CCL20의 더 높은 방출 경향도 있었다. DC 성숙 자극의 선택이 Th1- 또는 Th2-T-세포 동원 프로파일을 정의한다는 사실은 이미 문헌[Lebre et al(2005)]에 의해 문서화되었다. 그들의 테스트에서 새로 수확된 성숙 DC의 케모카인 생산은 CD40 결찰에 대한 반응으로 평가되었다. LPS 및 IFN-γ의 존재하에 성숙된 DC는 주로 Th1-유인 케모카인을 방출하는 것으로 나타났지만, Th2-관련 케모카인 CCL22의 발현 수준은 PGE2가 성숙 칵테일에 존재할 때 유의하게 증가했다. 본 발명의 결과와는 달리 CCL17의 발현 패턴은 Lebre et al.의 논문에서 DC 유형에 의존하지 않았다.
달성된 DC 성숙 수준에 잠재적으로 영향을 미치는 추가 요소는 사용된 배양 용기의 물리적 특성이다. 본 발명의 방법에 의해, 임상적으로 인증된 면역자기 분리 시스템과 호환되는 폐쇄된 시스템을 구성하는 가스-투과성 백에서 세포를 분화하고 활성화하는 것이 가능하다. 본 발명의 결과는 임상 등급 백에서 생성된 DC가 하향조절된 공동자극 분자 발현, 케모카인 및 IL-12 분비로 손상된 성숙 프로그램을 가지고 있음을 나타내는 이전 연구와 모순된다(문헌[Rouas et al. 2010]). 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 모든 기능이 DC에서 유도되고 심지어 사이토카인이 없는 기본 배지에서 냉동보존, 해동 및 추가 배양 후에도 온전함을 보여준다. G. Gaudernack et al 및 G. Kvalheim et al(Kyte et al. 2005; Mu et al. 2003) 그룹에서 유사한 연구를 수행하여, 온전한 면역원성 특성을 가진 임상-등급 DC가 실제로 백에서 생성될 수 있다는 생각을 강화했다. 세포 분화 백에서 배양하면, 본 발명의 방법을 상업적으로 사용가능한 완전 자동화된 폐쇄된 세포 배양 시스템으로 쉽게 전환할 수 있다. 이 옵션을 사용하면 운영자 개입을 더욱 줄이고 오염 위험을 줄이며, 전반적인 재현성을 높일 수 있다.
본 발명은 항원으로 DC를 로드하는 방법으로 mRNA 전기천공을 선택함으로써 대체 배양 기간 및/또는 성숙 프로토콜에 초점을 맞춘 이전 보고서와 더욱 차별화된다. 이 기술의 장점은 MHCI 및 MHCII 제시를 모두 최적화하기 위해 서열을 통합할 수 있는 옵션과 함께 종양-관련 항원 또는 돌연변이-유래 신-에피토프를 함유하는 서열을 암호화하는 맞춤형 서열을 합성하는 측면에서 유연성이다. 또한 DC가 선택된 HLA-제한 펩타이드로 수동적으로 로드되는 이전 연구와 달리, 전장 mRNA를 사용한 전기천공은 HLA-유형 측면에서 임의의 환자의 사전-선택을 부과하지 않고도 광범위한 에피토프의 처리 및 잠재적 제시를 보장한다. 더욱이, DC에서 번역된 단백질의 반감기는 MHC I-에피토프 복합체의 연장된 생성을 보장하는 반면, 수동적으로 로드된 외인성 펩타이드는 표면 HLA 분자에 일시적으로 결합되거나 내재화에 의해 고갈된다. mRNA로 전기천공된 DC가 펩타이드-로드된 DC만큼 강력한 T-세포 반응을 유도하는 능력은 이전에 입증되었다. 본원에서 본 발명자들은 모델 종양-관련 항원으로 전기천공된 4-일 배양된 MPLA/IFN-γ-성숙 DC가 필요한 항종양 툴킷이 장착된 희귀 항원-특이적 CD8+ T-세포의 격렬한 확장을 유도할 수 있음을 보여주며(예를 들어, 높은 IFN-γ 및 퍼포린의 발현), 이는 효율적이고 매우 특이적인 세포독성 활성에 의해 반영된다. 중요한 것은, 본 발명자들은 실제 예방접종 설정을 반영하는 냉동보존 및 해동 후, 이 필수 DC 특성을 평가하였다.
결론적으로, 본 발명은 세포 수율, 표현형 및 1형 분극화 프로파일 측면에서 "기존" 8-일 TNF-α/PGE2-성숙 DC보다 4-일 MPLA/IFN-γ-성숙 단핵구-유래 DC의 우월성을 입증한다. 폐쇄된 시스템에서 GMP-준수 재료 및 무-혈청 배양 배지를 사용하여 배양시간을 단축하고, 전기천공 및 냉동보존은 세포용해성 종양-유래 항원 특이적 CD8+ T-세포 반응을 유도하는 짧은-배양 MPLA/IFN-γ-DC의 능력을 손상시키지 않았으며, 이는 임상 구현을 위한 이 생산 방법의 견고성을 더욱 강조한다.
참고문헌
H. Jonuleit, U. Kuhn, G. Muller, K. Steinbrink, L. Paragnik, et al, Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions, European journal of immunology 27(12) (1997) 3135-42.
P. Kalinski, J.H. Schuitemaker, C.M. Hilkens, M.L. Kapsenberg, Prostaglandin E2 induces the final maturation of IL-12-deficient CD1 a+CD83+ dendritic cells: the levels of IL-12 are determined during the final dendritic cell maturation and are resistant to further modulation, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 161 (6) (1998) 2804-9.
R.B. Mailliard, A. Wankowicz-Kalinska, Q. Cai, A. Wesa, C.M. Hilkens, M.L. Kapsenberg, et al, alpha-type-1 polarized dendritic cells: a novel immunization tool with optimized CTL-inducing activity, Cancer research 64(17) (2004) 5934-7.
H. Okada, P. Kalinski, R. Ueda, A. Hoji, G. Kohanbash, T.E. Donegan, et al, Induction of CD8+ T-cell responses against novel glioma associated antigen peptides and clinical activity by vaccinations with {alpha}-type 1 polarized dendritic cells and polyinosinic-polycytidylic acid stabilized by lysine and carboxymethylcellulose in patients with recurrent malignant glioma, Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology 29(3) (201 1 ) 330-6.
C. Paustian, R. Caspell, T. Johnson, P.A. Cohen, S. Shu, S. Xu, et al, Effect of multiple activation stimuli on the generation of Th1 -polarizing dendritic cells, Human immunology 72(1 ) (201 1 ) 24-SI .
C. Boccaccio, S. Jacod, A. Kaiser, A. Boyer, J.P. Abastado, A. Nardin, Identification of a clinical-grade maturation factor for dendritic cells, Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. 1997) 25(1 ) (2002) 88-96.
A.G. Johnson, M. Tomai, L. Solem, L. Beck, E. Ribi, Characterization of a nontoxic monophosphoryl lipid A, Reviews of infectious diseases 9 Suppl 5 (1987) S512-6.
K.A. Gregg, E. Harberts, F.M. Gardner, M.R. Pelletier, C. Cayatte, et al Rationally Designed TLR4 Ligands for Vaccine Adjuvant Discovery, mBio 8(3) (2017).
M. Hansen, G.M. Hjorto, M. Donia, O. Met, N.B. Larsen, M.H. Andersen, et al, Comparison of clinical grade type 1 polarized and standard matured dendritic cells for cancer immunotherapy, Vaccine 31 (4) (2013) 639-46.
A. Ten Brinke, M.L. Karsten, M.C. Dieker, J.J. Zwaginga, S.M. van Ham, The clinical grade maturation cocktail monophosphoryl lipid A plus IFNgamma generates monocyte-derived dendritic cells with the capacity to migrate and induce Th1 polarization, Vaccine 25(41 ) (2007) 7145-52.
A. ten Brinke, G. van Schijndel, R. Visser, T.D. de Gruijl, J.J. Zwaginga, S.M. van Ham, Monophosphoryl lipid A plus IFNgamma maturation of dendritic cells induces antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells with high cytolytic potential, Cancer Immunol Immunother 59(8) (2010) 1 185-95.
S.T. Kolanowski, L. Sritharan, S.N. Lissenberg-Thunnissen, G.M. Van Schijndel, S.M. Van Ham, A. ten Brinke, Comparison of media and serum supplementation for generation of monophosphoryl lipid A/interferon-gamma-matured type I dendritic cells for immunotherapy, Cytotherapy 16(6) (2014) 826-34.
S. Van Lint, S. Wilgenhof, C. Heirman, J. Corthals, K. Breckpot, A. Bonehill, et al, Optimized dendritic cell- based immunotherapy for melanoma: the TriMix-formula, Cancer Immunol Immunother 63(9) (2014) 959-67.
S. Tuyaerts, A. Michiels, J. Corthals, A. Bonehill, C. Heirman, C. de Greet, et al, Induction of Influenza Matrix Protein 1 and MelanA-specific T lymphocytes in vitro using mRNA-electroporated dendritic cells, Cancer gene therapy 10(9) (2003) 696-706.
P. Ponsaerts, V.F. Van Tendeloo, Z.N. Berneman, Cancer immunotherapy using RNA-loaded dendritic cells, Clinical and experimental immunology 134(3) (2003) 378-84.
A. Bonehill, C. Heirman, S. Tuyaerts, A. Michiels, K. Breckpot, F. Brasseur, et al, Messenger RNA-electroporated dendritic cells presenting MAGE-A3 simultaneously in HLA class I and class II molecules, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 172(1 1 ) (2004) 6649-57.
S. Jarnjak-Jankovic, H. Hammerstad, S. Saeboe-Larssen, G. Kvalheim, G. Gaudernack, A full scale comparative study of methods for generation of functional Dendritic cells for use as cancer vaccines, BMC cancer 7 (2007), 1 19.
M. Dauer, B. Obermaier, J. Herten, C. Haerle, K. Pohl, S. Rothenfusser, et al, Mature dendritic cells derived from human monocytes within 48 hours: a novel strategy for dendritic cell differentiation from blood precursors, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 170(8) (2003) 4069-76.
P. Kvistborg, M. Boegh, A.W. Pedersen, M.H. Claesson, M.B. Zocca, Fast generation of dendritic cells, Cellular immunology 260(1 ) (2009) 56-62.
C. Massa, B. Seliger, Fast dendritic cells stimulated with alternative maturation mixtures induce polyfunctional and long-lasting activation of innate and adaptive effector cells with tumor-killing capabilities, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 190(7) (2013) 3328-37.
I. Truxova, K. Pokorna, K. Kloudova, S. Partlova, R. Spisek, J. Fucikova, Day 3 Poly (l:C)-activated dendritic cells generated in CellGro for use in cancer immunotherapy trials are fully comparable to standard Day 5 DCs, Immunol Lett 160(1) (2014) 39-49.
A. Van Driessche, A.L. Van de Velde, G. Nijs, T. Braeckman, B. Stein, J.M. De Vries, et al, Clinical-grade manufacturing of autologous mature m RNA-electroporated dendritic cells and safety testing in acute myeloid leukemia patients in a phase I dose-escalation clinical trial, Cytotherapy 1 1 (5) (2009) 653-68.
L. Colantonio, H. Recalde, F. Sinigaglia, D. D'Ambrosio, Modulation of chemokine receptor expression and chemotactic responsiveness during differentiation of human naive T cells into Th1 or Th2 cells, European journal of immunology 32(5) (2002) 1264-73.
J.R. Groom, A.D. Luster, CXCR3 ligands: redundant, collaborative and antagonistic functions, Immunology and cell biology 89(2) (2011) 207-15.
M. Samson, G. LaRosa, F. Libert, P. Paindavoine, M. Detheux, G. Vassart, et al, The second extracellular loop of CCR5 is the major determinant of ligand specificity, The Journal of biological chemistry 272(40) (1997) 24934-41 .
O. Yoshie, K. Matsushima, CCR4 and its ligands: from bench to bedside, International immunology 27(1) (2015) 1 1 -20.
T. Yamazaki, X.O. Yang, Y. Chung, A. Fukunaga, R. Nurieva, B. Pappu, et al, CCR6 regulates the migration of inflammatory and regulatory T cells, Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950) 181 (12) (2008) 8391 - 401 .
A. Bonehill, A.M. Van Nuffel, J. Corthals, S. Tuyaerts, C. Heirman, V. Francois, et al, Single-step antigen loading and activation of dendritic cells by mRNA electroporation for the purpose of therapeutic vaccination in melanoma patients, Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 15(10) (2009) 3366-75.
M. Gato-Canas, M. Zuazo, H. Arasanz, M. Ibanez-Vea, L. Lorenzo, G. Fernandez-Hinojal, et al, PDL1 Signals through Conserved Sequence Motifs to Overcome Interferon-Mediated Cytotoxicity, Cell reports 20(8) (2017) 1818-1829.
V. Prima, L.N. Kaliberova, S. Kaliberov, D.T. Curiel, S. Kusmartsev, COX2/mPGES1/PGE(2) pathway regulates PD-L1 expression in tumor-associated macrophages and myeloid-derived suppressor cells, P Natl Acad Sci USA 1 14(5) (2017) 1 1 17-1 122.
M.C. Lebre, T. Burwell, P.L. Vieira, J. Lora, A.J. Coyle, M.L. Kapsenberg, et al, Differential expression of inflammatory chemokines by Th1 - and Th2-cell promoting dendritic cells: a role for different mature dendritic cell populations in attracting appropriate effector cells to peripheral sites of inflammation, Immunology and cell biology 83(5) (2005) 525-35.
R. Rouas, H. Akl, H. Fayyad-Kazan, N. El Zein, B. Badran, B. Nowak, et al, Dendritic cells generated in clinical grade bags strongly differ in immune functionality when compared with classical DCs generated in plates, Journal of immunotherapy (Hagerstown, Md. : 1997) 33(4) (2010) 352-63.
J.A. Kyte, G. Kvalheim, S. Aamdal, S. Saeboe-Larssen, G. Gaudernack, Preclinical full-scale evaluation of dendritic cells transfected with autologous tumor-mRNA for melanoma vaccination, Cancer gene therapy 12(6) (2005) 579-591 .
L.J. Mu, G. Gaudernack, S. Saeboe-Larssen, H. Hammerstad, A. Tierens, G. Kvalheim, A protocol for generation of clinical grade mRNA-transfected monocyte-derived dendritic cells for cancer vaccines, Scandinavian journal of immunology 58(5) (2003) 578-86.
Valmori D, Gervois N, Rimoldi D, Fonteneau JF, Bonelo A, Lienard D, Rivoltini L, Jotereau F, Cerottini JC, Romero P. Diversity of the fine specificity displayed by HLA-A*0201 -restricted CTL specific for the immunodominant Melan-A/MART-1 antigenic peptide. J Immunol. 1998 Dec 15; 161 (12):6956-62.
SEQUENCE LISTING <110> Universiteit Gent <120> Method for the in vitro differentiation and maturation of dendritic cells for therapeutic use <130> P2018/021PCT <150> EP18179073.4 <151> 2018-06-21 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 1 Ala Ala Ala Gly Ile Gly Ile Leu Thr Val 1 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Artificial sequence <400> 2 Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu 1 5

Claims (12)

  1. 자가 수지상 세포 백신을 제조하기 위한 시험관내 방법으로서,
    상기 방법은:
    - 분리된 단핵구 수지상 세포 전구체를 제공하는 단계;
    - 과립구-대식세포 콜로니-자극 인자(GM-CSF) 및 인터루킨-4(IL-4)의 존재하에 약 48 내지 96시간 동안 상기 전구체를 배양하는 단계;
    - 미성숙 DC의 성숙에 적합한 배양 조건 하에서, 마지막 24시간 동안 미성숙 DC를 인터페론 감마(IFN-g) 및 모노포스포릴 지질 A(MPLA)와 접촉시켜, 성숙한 DC 집단을 형성하는 단계; 및
    - 항원-암호화 mRNA로 성숙 DC를 형질감염시키는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 수지상 세포는 임상 등급의 완전 폐쇄형 시스템에서 분화 및 성숙시키는, 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 단핵구 수지상 세포 전구체는 배양 백으로 제공되며, 특히 세포 배양 개시시 상기 배양 백의 세포 밀도는 0.5 내지 2×10E6 세포/mL 범위인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 GM-CSF, IL-4 및 IFN-g의 농도는 500 내지 2,500 U/ml인, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 MPLA의 농도는 1~10 μg/ml인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형질감염은 특히 구형파 펄스를 사용하여 전기천공에 의해 수행되는, 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형질감염된 DC는 냉동보존 배지에 추가로 재현탁되고, 액체 질소 용기의 증기 상에 저장되는, 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항원은 종양 항원, 종양-관련 항원, 암-고환 항원, 뮤타놈(mutanome)-유래 항원, (발암성) 바이러스 항원, 박테리아 항원, 효모 항원, 기생충 항원 및 균류 항원으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득가능한 수지상 세포.
  10. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 성숙하고, 형질감염되고, 선택적으로 냉동보존된 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물 또는 백신.
  11. 활성 면역요법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 수득된 형질감염된 수지상 세포.
  12. 성숙, mRNA 전기천공, 냉동보존 및 해동된 수지상 세포 집단으로서, 상기 수지상 세포는 IFN-g 및 MPLA의 존재하에 성숙되고, 상대적 평균 형광 강도(relMFI)로 표현되는, 400 미만의 T-세포 공동-억제 리간드 PD-L1의 세포 표면 수준을 특징으로 하는, 성숙, mRNA 전기천공, 냉동보존 및 해동된 수지상 세포 집단.
KR1020217001761A 2018-06-21 2019-06-20 치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법 KR20210024038A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP18179073 2018-06-21
EP18179073.4 2018-06-21
PCT/EP2019/066398 WO2019243537A1 (en) 2018-06-21 2019-06-20 Method for the in vitro differentiation and maturation of dendritic cells for therapeutic use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20210024038A true KR20210024038A (ko) 2021-03-04

Family

ID=62748830

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020217001761A KR20210024038A (ko) 2018-06-21 2019-06-20 치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20210139852A1 (ko)
EP (1) EP3810757A1 (ko)
JP (1) JP7397493B2 (ko)
KR (1) KR20210024038A (ko)
CN (1) CN112313328A (ko)
AU (1) AU2019289973A1 (ko)
CA (1) CA3100931A1 (ko)
IL (1) IL279480A (ko)
SG (1) SG11202011806WA (ko)
WO (1) WO2019243537A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102346167B1 (ko) * 2021-06-29 2022-01-03 (주)더스탠다드 전기화학적 작용을 유도하는 고주파 비가역적 전기천공 시스템의 펄스 인가 방법

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE10041515A1 (de) 2000-08-24 2002-03-14 Gerold Schuler Verfahren zur Herstellung gebrauchsfertiger, Antigen-beladener oder -unbeladener, kryokonservierter reifer dendritischer Zellen
EP1806395A1 (en) 2006-01-06 2007-07-11 Stichting Sanquin Bloedvoorziening Maturation of dendritic cells
JP2017513812A (ja) 2014-02-28 2017-06-01 ザ ロイヤル インスティチューション フォー ジ アドヴァンスメント オブ ラーニング／マギル ユニヴァーシティ 免疫療法用のａｐｃ活性剤としてのｔｃ−ｐｔｐ阻害剤
TWI752930B (zh) 2015-12-23 2022-01-21 德商梅迪基因免疫治療公司 抗原特異性ｔｃｒ的新生成

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102346167B1 (ko) * 2021-06-29 2022-01-03 (주)더스탠다드 전기화학적 작용을 유도하는 고주파 비가역적 전기천공 시스템의 펄스 인가 방법

Also Published As

Publication number Publication date
CN112313328A (zh) 2021-02-02
WO2019243537A1 (en) 2019-12-26
US20210139852A1 (en) 2021-05-13
SG11202011806WA (en) 2021-01-28
EP3810757A1 (en) 2021-04-28
JP7397493B2 (ja) 2023-12-13
JP2021527674A (ja) 2021-10-14
AU2019289973A1 (en) 2020-12-03
WO2019243537A9 (en) 2024-02-22
CA3100931A1 (en) 2019-12-26
IL279480A (en) 2021-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8574901B2 (en) Cryoconserved mature dendritic cells
KR102484433B1 (ko) T 세포 제조 조성물 및 방법
JP5020935B2 (ja) 樹状細胞組成物および方法
US8486694B2 (en) Generation of antigen specific T cells
US20080254537A1 (en) Compositions and Methods for Inducing the Activation of Immature Monocytic Dendritic Cells
Erdmann et al. Effective clinical-scale production of dendritic cell vaccines by monocyte elutriation directly in medium, subsequent culture in bags and final antigen loading using peptides or RNA transfection
US20150166955A1 (en) Method for loading of dendritic cells with class i antigens
JP2018531022A6 (ja) 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法
JP2018531022A (ja) 改変ヒト初代血液樹状細胞株を生成するための方法
EP3622056A1 (en) Interferon primed plasmacytoid dendritic cells
Brabants et al. An accelerated, clinical-grade protocol to generate high yields of type 1-polarizing messenger RNA–loaded dendritic cells for cancer vaccination
KR20200085299A (ko) 수지상 세포 요법을 위한 방법 및 용도
KR20210024038A (ko) 치료용 수지상 세포의 시험관내 분화 및 성숙 방법
JP2004520033A (ja) 分化拘束された成熟樹状細胞の調製用補助組成物
EP3173474A1 (en) Enhancing the t-cells stimulatory capacity of human antigen presenting cells and their use in vaccination
AU2011260606B2 (en) Novel interferon-alpha-producing bone marrow dendritic cells
EP1959007A1 (en) Method for providing mature dendritic cells
US20040033213A1 (en) Methods of modulating dendritic cells using adjuvants
WO2012101109A1 (en) Native dendritic cells
RU2793344C2 (ru) Композиции и способы для производства т-клеток
AU2013206016B2 (en) Compositions and methods for inducing the activation of immature monocytic dendritic cells

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination