KR20210014978A - 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물 - Google Patents

골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장결합된 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 또는 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물을 포함하며, 골다공증의 근본적 치료에 현저한 효과를 보이며, 특히 난소기능저하 환자에서 유발된 골다공증을 치료할 수 있는 효과를 갖는다.

Description

골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물 {COMPOSITION CONTAINING H2-OCCLUDED CALCIUM FOR THE TREATMENT OF OSTEOPOROSIS}
본 발명은 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물에 관한 것이며, 더욱 구체적으로 수소(H2)가 흡장 (吸藏, occlusion)된 칼슘소성물을 함유하여 섭취시 골다공증을 갖는 환자의 골밀도 및 피질골 함량을 증가시키며, 혈액 내 ALP, 오스테오칼신, PIN1, TRAP 5b 및 OPG의 함량을 감소시키고, 특히 난소기능저하에 의해 유발된 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 치료할 수 있는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물에 관한 것이다.
골다공증(Osteoporosis)과 관련하여 과거에는 주로 골의 무기질, 즉 칼슘과 인의 대사 이상만을 중심으로 그 연구가 진행되어 왔으며, 이의 발병기전 규명에는 진전을 보지 못하였다. 그러나, 최근에는 골형성에 중요한 무기물 뿐만 아니라 골기질 단백질의 대사에 대한 연구의 중요성이 새로이 부각되고 있다.
골다공증(Osteoporosis)은 그 자체보다는 골의 약화에 따라 용이하게 초래되는 각종 골절, 특히 대퇴골골절 또는 척추골절 등이 장기간 활동을 제한하여 건강한 생활을 영위할 수 없고 결과적으로 노인층 사망원인 중 약 15%를 차지한다는 점에서 심각한 문제로 떠오르고 있다.
골조직은 골아세포에 의해 형성과 파골세포에 의해 파괴 흡수가 끊임없이 반복되는 동적인 조직이다. 이러한 골흡수와 형성의 기전에는 불명확한 점이 많으나 골다공증은 골흡수와 골형성의 밸런스가 무너져 발생하는 것으로 골흡수가 골형성보다 항진되는데 기인한 질환으로, 현재 골흡수 억제제의 개발이 활발히 행해지고 있다.
한편, 하기 특허문헌 1은 칼슘 함유 공급원 또는 합성 아세트산칼슘 함유 공급원으로부터 추출된 적어도 22.75 중량%의 초기 조성을 포함하고, 상기 초기 조성은 마그네슘 및 아연에 의해 강화되어 적어도 4 중량%의 칼슘, 적어도 5 중량%의 마그네슘, 적어도 0.2 중량%의 아연, 및 적어도 400 IU의 비타민 D3의 최종 조성을 제공하는 조성물을 개시하고 있으나, 이러한 조성물에 포함되는 칼슘의 체내 골 흡수율이 낮아 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 개선하는 데 한계가 있으며, 특히 각종 난소 질환 등을 원인으로 난소가 기능저하되어 유발된 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 치료 및 개선하는데 한계가 있었다.
한편, 골다공증 치료제로서 널리 적용되고 있는 칼슘보강제제는 골다공증의 근본적 치료에 실질적인 효과를 보이지 못하는 것으로 보고되고 있다.
따라서, 골다공증의 근본적 치료에 실질적인 효과를 보이며, 특히 난소기능저하 환자에서 유발된 골다공증을 효과적으로 치료할 수 있는 새로운 조성물의 개발이 절실히 요구되고 있다.
특허문헌 1: 대한민국 공개특허 제10-2010-0107468호 (2010.10.05)
본 발명은 상기 문제점을 해결하기 위해 이루어진 것으로서, 본 발명의 목적은 골다공증의 근본적 치료에 실질적인 효과를 보이며, 특히 난소기능저하 환자에서 유발된 골다공증을 효과적으로 치료할 수 있는 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장결합된 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 또는 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물을 포함한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 골다공증 환자의 골밀도 및 피질골의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 골다공증 환자의 혈액 내 칼슘(Ca), 인 (P), 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase, ALP), 오스테오칼신 (osteocalcin), 프로콜라겐 1 N-말단 프로펩티드 (procollagen 1 N-terminal propeptide, P1NP), 타르타르산염 저항성 산성 포스파타아제 5b (tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRAP 5b) 및 오스테오프로테게닌 (osteoprotegenin, OPG)의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 정제(tablet), 젤리, 평균입경이 10 내지 200㎛인 분말, 또는 평균 입경이 0.5 내지 2㎜인 과립의 제형을 가지며, 상기 분말 또는 과립 제형의 조성물은 섭취가능한 연질캡슐 또는 경질캡슐에 내장되거나 캡슐 이외의 포장재에 내장되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 난소기능저하에 의해 유발된 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 치료하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 수소분위기 하에서 소성하여 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 구현예에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 상기 제1소성단계는 상기 유기탄산칼슘을 300 내지 1,000℃에서 2 내지 10 시간 동안 소성하여 제1소성체를 제조하는 과정으로 수행되며, 상기 제2소성단계는 상기 제1소성체를 수소 분위기 하에서 300 내지 1,000℃로 2 내지 10시간 동안 소성하여 제2소성체를 제조하는 과정으로 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 골다공증의 근본적 치료에 실질적인 효과를 보이며, 특히 난소기능저하 환자에서 유발된 골다공증을 치료할 수 있는 효과를 갖는다.
도 1은 대퇴골의 조직형태학적 관찰을 위해 기능저하한 대퇴골을 조직 처리하여 H&E 염색을 실시하여 현미경으로 관찰한 사진이다.
본 발명을 좀 더 구체적으로 설명하기 전에, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정되어서는 아니되며, 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다. 따라서, 본 명세서에 기재된 실시 예의 구성은 본 발명의 바람직한 하나의 예에 불과할 뿐이고, 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형 예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.
본 발명은 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물에 관한 것이며, 더욱 구체적으로 수소(H2)가 흡장 (吸藏, occlusion) 결합된 칼슘소성물을 함유하여 섭취 등을 통하여 체내 투여시 골다공증을 갖는 환자의 골밀도 및 피질골 함량을 증가시킴과 동시에, 혈액 내 ALP, 오스테오칼신, PIN1, TRAP 5b 및 OPG의 함량을 감소시키며, 특히 난소기능저하에 의해 유발된 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 치료할 수 있는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 함유 조성물에 관한 것이다.
본 발명자는 특허 제10-1405431호로 등록된 수소 함유물을 이용하여 각종 실험을 수행하는 과정에서, 상기 특허 제10-1405431호로 등록된 수소 함유물의 전혀 예상치 못한 효능을 발견하게 되었다.
즉, 본 발명자는 상기 특허 제10-1405431호로 등록된 수소 함유물이 골다공증 환자의 골대사 개선에 효과가 있고, 특히 난소기능저하로 인하여 유발된 골다공증의 개선에 우수한 효과가 있다는 사실을 우연히 발견하게 되었다.
본 발명의 골다공증 치료용 조성물에 포함되는 칼슘 소성물은 통상적인 칼슘 제제와는 전혀 상이한 것이며, 다음과 같은 과정을 통하여 제조된다.
즉, 본 발명의 골다공증 치료용 조성물에 포함되는 칼슘 소성물은 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 수소분위기 하에서 소성하여 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조된다.
한편, 상기 제1소성단계는 상기 유기탄산칼슘을 300 내지 1,000℃에서 2 내지 10 시간 동안 소성하여 제1소성체를 제조하는 과정으로 수행되며, 상기 제2소성단계는 상기 제1소성체를 수소 분위기 하에서 300 내지 1,000℃로 2 내지 10시간 동안 소성하여 제2소성체를 제조하는 과정으로 수행된다.
이러한 고온 소성과정을 통하여 수소 (H2)가 흡장결합된 (occluded) 칼슘 소성물이 제조되며, 본 발명자는 아래와 같은 실험을 통하여 이와 같이 수소 (H2)가 흡장결합된 (occluded) 칼슘 소성물이 골다공증을 현저하게 개선하며, 특히 난소가 기능저하되어 유발된 골다공증을 효과적으로 치료할 수 있음을 우연히 발견하게 되었으며, 이에 따라 특허 제10-1405431호의 수소 함유물을 효과적인 골다공증 치료용 조성물로 이용할 수 있음을 발견하게 되었다.
본 발명의 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장결합된 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 또는 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물을 포함한다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 사용되는 칼슘 소성물은 고온의 소성과정을 통하여 제조된다.
한편, 본 발명의 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 골다공증 환자의 골밀도 및 피질골의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 한다.
즉, 본 발명의 조성물을 경구 투여 등의 방법으로 골다공증 환자에 투여시 대퇴골의 골밀도가 현저하게 개선됨과 동시에 대퇴골의 피질골의 함량 또한 현저하게 증가하는 효과를 발휘한다.
한편, 본 발명의 조성물은 골다공증 환자의 혈액 내 칼슘(Ca), 인 (P), 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase, ALP), 오스테오칼신 (osteocalcin), 프로콜라겐 1 N-말단 프로펩티드 (procollagen 1 N-terminal propeptide, P1NP), 타르타르산염 저항성 산성 포스파타아제 5b (tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRAP 5b) 및 오스테오프로테게닌 (osteoprotegenin, OPG)의 함량을 감소시키게 된다.
즉, 이러한 단백질들은 골대사와 직접적인 관련이 있으며, 혈액 내에 이러한 물질들의 함량이 높을수록 골대사가 악화된 것으로 골다공증의 증상을 보이게 된다.
예를 들어, 혈액 내에 칼슘 및 인의 함량이 높다는 것은 뼈에서 이들 성분들이 용해되어 혈액으로 다량 유입되고 있음을 의미하는 것이며, 결국 뼈의 골밀도 증가에 기여하는 이들 물질이 뼈에서는 부족한 상태에 있음을 의미하는 것이다.
한편, 본 발명의 수흡장 칼슘 조성물은 정제(tablet), 젤리, 평균입경이 10 내지 200㎛인 분말, 또는 평균 입경이 0.5 내지 2㎜인 과립의 제형 등으로 제조될 수 있으며, 상기 분말 또는 과립 제형의 조성물은 섭취가능한 연질캡슐 또는 경질캡슐에 내장되거나 캡슐 이외의 포장재에 내장되는 형태로 제조하는 것 또한 가능하다.
본 발명에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물은 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 수소분위기 하에서 소성하여 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조될 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 제1소성단계는 상기 유기탄산칼슘을 300 내지 1,000℃에서 2 내지 10 시간 동안 소성하여 제1소성체를 제조하는 과정으로 수행되며, 상기 제2소성단계는 상기 제1소성체를 수소 분위기 하에서 300 내지 1,000℃로 2 내지 10시간 동안 소성하여 제2소성체를 제조하는 과정으로 수행된다.
본 발명자는 본 발명의 조성물이 특히 난소기능저하로 인하여 유발된 골다공증에 대하여 실질적인 치료효과를 갖는다는 것을 우연히 발견하였다.
이하, 본 발명의 수흡장 칼슘 조성물의 골대사 개선 효능을 평가하기 위하여 수행한 실험에 대하여 자세히 설명한다.
본 발명자는 본 발명에 따른 수소흡장 칼슘 조성물의 골대사 개선 효능을 평가하기 위하여 난소를 기능저하하여 골다공증을 유발시킨 동물모델을 이용하는 방법으로 실험을 수행하였다.
더욱 구체적으로, 본 발명자는 생체내 (in vivo) 체계에서 본 발명에 따른 수소흡장 칼슘 소성물(TA)의 골대사 개선 효능을 평가하기 위해 난소를 기능저하하여 골다공증을 유도한 ICR 마우스에 8주 동안 시험물질을 경구투여한 (6주령에 난소 기능저하, 12주령에서 20주령까지 시험물질 경구 투여) 후 골밀도 등 골대사 관련 지표를 평가하였다.
[시험물질]
시험물질 (TA, TB)은 다음과 같이 준비하였다.
TA: 본 발명에 따른 수소흡장 칼슘
TB: 산화소성칼슘
본 발명에 따른 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물에 포함되는 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장 결합된 (occluded) 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 및 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물은 난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및 상기 제1소성체를 수소분위기 하에서 소성하여 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조되는 것이 가능하며, 상기 제1소성단계는 상기 유기탄산칼슘을 300 내지 1,000℃에서 2 내지 10 시간 동안 소성하여 제1소성체를 제조하는 과정으로 수행되고, 상기 제2소성단계는 상기 제1소성체를 수소 분위기 하에서 300 내지 1,000℃로 2 내지 10시간 동안 소성하여 제2소성체를 제조하는 과정으로 수행될 수 있다.
더욱 구체적으로, 본 발명에 따른 체내 알코올 및 아세트알데히드 분해기능을 갖는 숙취해소용 수소흡장 칼슘 함유 조성물에 포함되는 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장 결합된 (occluded) 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 및 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물은 특허 제10-1405431호에 개시된 방법을 통하여 제조하는 것이 가능하다.
후술하는 실험에 사용된 수소흡장 칼슘은 굴패각을 이용하여 제조되었다.
[동물실험 승인 및 윤리규정]
본 발명의 수소흡장 칼슘 조성물의 골대사 개선 효능을 평가하기 위한 모든 동물모델 실험은 한림대학교 동물실험윤리위원회의 승인 아래 동물실험 규정에 따라 수행되었다(Hallym2018-50).
[실험동물 및 시험물질 투여]
특정병원체 (specific pathogen free)가 없는 7주령, 난소기능저하 ICR 생쥐를 ㈜두열 바이오텍에서 구입하여 사용하였다. 1주일간의 검역 및 적응과정을 거친 뒤 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하여 실험에 사용하였다. 실험동물은 온도 23 ±3℃ 상대습도 50±10%, 환기회수 10-15회/시간, 조명시간 12시간 (08:00 - 20:00), 조도 150-300Lux로 설정된 사육환경에서 사육하였다. 적응 기간 동안 실험동물은 실험동물용 고형사료 (㈜카길애그리퓨리나)와 음수를 자유 섭취하도록 하였다.
1 주간의 적응 기간을 거친 후 체중 감소 없는 건강한 동물을 선별하였고, 체중 감소 없는 건강한 동물을 난괴법에 의거하여 5개의 시험군으로 분류하였다. 즉, (G1) 정상 (sham-operation) 대조군, (G2) 난소기능저하(ovariectomy) 대조군, (G3) 난소기능저하 + 100 mg/kg 체중(body weight, BW) TA 투여군, (G4) 난소기능저하 + 300 mg/kg BW TA 투여군, (G5) 난소기능저하 + 300 mg/kg BW TB투여군으로 분류하였으며 이를 각각 하기 표 1에 나타내었다.
G1 G2 G3 G4 G5
난소기능저하 － ＋ ＋ ＋ ＋
시험물질 － － 100㎎/㎏BW TA 300㎎/㎏BW TA 300㎎/㎏BW TB
실험동물수 10 10 10 10 10
각각의 시험군은 각 10마리의 실험동물을 사용하였다. 골다공증을 유도하기 위해 시험물질 투여 없이 4주간 사육하였고, 이후 각각의 시험물질은 8주 동안 매일 일정한 시간에 경구투여하였다. 시험기간 동안 식이는 AIN-93G 식이(Research Diets Inc.)를 공급하였고, 식이와 음수는 자유로이 섭취하도록 하였다.
각 시험군의 실험동물의 체중은 시험군 분류일을 1일로 하여 시험 종료일까지 1주일 간격으로 측정하였다.
[채혈 및 혈청분리]
실험동물을 희생 전 12시간 동안 절식시킨 후 트리브롬에탄올(tribromoethanol)을 3차 아밀알코올(tertiary amylalcohol)로 희석하여 만든 마취제를 사용하여 마취한 후 안와에서 채혈하였다. 혈액은 혈청분리튜브(serum separate tube)(Becton Dickinson)에 담아 30분간 실온에서 방치하고 3,000rpm에서 20 분간 원심분리하여 혈청을 분리하였고, 분석 전까지 -70℃에 보관하였다.
[대퇴골 골밀도 측정]
부검 당일 채혈 후 대퇴골을 기능저하하여 골격에 붙어 있는 근육, 인대 및 지방을 제거한 후, 골밀도측정기(PIXImusTM, GE LUVAR)를 사용하여 대퇴골의 골밀도(Bone mineral density, BMD)를 측정하였다.
[대퇴골의 조직형태학적 관찰]
대퇴골은 4% 파라폼 알데히드 용액 (Paraform Aldehyde Solution) (PFA, Biosesang Co.)에 담가 24시간 동안 고정하였다. 고정 후 Calci-Clear Rapid (national diagnostics, Inc.)에 24시간 담가 탈회한 후, 일반적인 조직처리 과정에 준하여 조직 처리하였고, 파라핀에 포매(embedding)하고 10㎛ 두께로 박절 (cutting)하여 절편을 만들었다. 일반적인 방법에 따라 헤마톡실린 & 에오신 (hematoxylin & eosin, H&E)(Sigma-Aldrich, Co.) 염색을 실시하고 광학현미경 (Zeiss)으로 대퇴골의 조직형태학적 변화를 관찰하였다.
[혈액 내 함유 성분의 생화학적 분석]
부검 당일 채취된 혈액에서 분리한 혈청을 혈액생화학분석기 (KoneLab 20 XT, Thermo Fisher Scientific)를 이용하여 혈청 내 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase, ALP), 칼슘 (Ca) 및 인 (P)의 함량을 측정하였다.
[혈청 내 골대사 관련 단백질 수준 분석]
혈청 내의 오스테오칼신 (osteocalcin), 오스테오프로테게닌 (osteoprotegenin, OPG), 1형 콜라겐의 교차결합 N-말단 텔로펩티드 (Cross-linked N-terminal telopeptide of type I collagen)(NTX), 타르타르산염 저항성 산성 포스파타아제 5b (tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRAP 5b), 프로콜라겐 1 N-말단 프로펩티드 (procollagen 1 N-terminal propeptide, P1NP) 함량은 ELISA 키트 (Elabscience Biotechnology Inc.)를 사용하여 제조회사가 제시한 방법에 따라 측정하였다.
[통계처리]
모든 분석 수치는 mean±SEM으로 나타내었다. 수집된 결과는 GraphPad Prism 5.0 (GraphPad software) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 시험물질투여군과 대조군의 차이를 비교하기 위하여 스튜던트 t-테스트 (Student's t-test) 및 일원분산분석법 (one-way analysis variance, ANOVA)을 이용하였다. p<0.05 이상일 때만 통계적으로 유의성 있는 것으로 판단하였다.
[실험동물의 체중에 미치는 영향]
시험군 분류일을 0일로 하여 1주 간격으로 실험동물의 체중(g)을 측정하여 하기 표 2에 나타내었다.
[표 2]
Figure pat00001
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
상기 표 2의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 시험 전 기간 동안 모든 실험동물의 체중은 시간이 지남에 따라 정상적으로 증가하였다. 난소기능저하 대조군 (G2)의 체중은 Sham-operation을 한 정상대조군 (G1)에 비해 4주, 5주 및 6주에는 유의적으로 증가하였으나, 이외 기간에는 증가하는 경향을 보였으나 유의적인 영향을 보이지 않았다. 이는 다른 시험군에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)의 개체 차이가 컸는데 이로 인해 정상대조군 (G1)과 통계적인 유의성이 나타나지 않은 것으로 판단된다. 시험물질을 공급한 5주차 이후 시험물질 투여군 (G3, G4, G5)의 체중이 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이를 나타내지는 않았다 (표 2). 이는 시험물질은 실험동물의 체중에는 영향을 미치지 않음을 제시한다.
[대퇴골의 골밀도]
시험 종료일에 동물을 희생하여 대퇴골을 기능저하하여 대퇴골의 골밀도 (bone mineral density, BMD)를 측정하여 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
[표 3]
Figure pat00002
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
상기 표 3의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, Sham-operation을 한 정상대조군 (G1)의 대퇴골 (좌+우) 골밀도는 0.096 ± 0.002 g/cm2이었고, 난소기능저하 대조군 (G2)의 대퇴골 골밀도는 0.085 ± 0.001 g/cm2이었으며, 정상대조군(G1)에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)의 대퇴골 골밀도가 유의적으로 감소하였다. 이는 난소기능저하에 의해 골밀도 감소가 유도되었음을 나타낸다. 시험물질 투여군은 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 대퇴골의 골밀도가 증가하는 경향을 나타내었고, 특히 300mg/kg BW TA투여군 (G4)의 대퇴골 골밀도는 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 유의적으로 증가하였다.
[대퇴골의 조직형태학적 관찰]
대퇴골의 조직형태학적 관찰을 위해 기능저하한 대퇴골을 조직 처리하여 H&E 염색을 실시하였고 그 결과를 도 1에 나타내었다. 난소기능저하 대조군 (G2)은 정상대조군(G1)에 비해 피질골 (compact bone)이 감소하고 해면골이 증가하였고 전체적으로 조직이 다공성의 치밀하지 않은 구조를 나타내었다. 시험물질에 따른 대퇴골의 조직형태학적 차이가 크지는 않았으나 300mg/kg BW TA투여군 (G4)이 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 피질골의 증가가 관찰되었다 (도 1).
[혈청 내 Ca 및 P 함량]
시험물질이 체내 무기질 항상성에 미치는 영향을 조사하기 위해 혈액 내 Ca과 P의 함량을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
[표 4]
Figure pat00003
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
상기 표 4의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 혈청 내 Ca 함량은 정상대조군 (G1)에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)에서 유의적으로 증가하였고, 시험물질 투여군 (G3, G4, G5)의 혈청 내 Ca 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에서 비해 감소하는 경향을 보였으나 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 혈청 내 P 함량은 정상대조군 (G1)에 비해 난소기능저하 대조군(G2)에서 유의적으로 증가하였다. 100 mg/kg BW TA 투여군 (G3)과 300 mg/kg BW TA 투여군 (G4)의 혈청 내 P 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에서 비해 유의적으로 감소하였다 (표 4).
[혈청 내 ALP 활성]
G1 내지 G5의 혈청 내 ALP 활성을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
[표 5]
Figure pat00004
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
ALP는 골아세포에서 분비되는 효소로 조골세포의 활성을 반영하여 골 형성의 중요한 지표이다. 난소기능저하로 골다공증이 유발 시에 골 교체가 증가하여 조골세포의 활성이 증가하여 혈청 ALP가 증가하는 것으로 보고되고 있다.
상기 표 5의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 혈청 ALP 활성은 정상 대조군 (G1)에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)에서 유의적으로 증가하였다. 시험물질 투여군 (G3, G4, G5)의 혈청 ALP 활성은 난소기능저하 대조군 (G2)에 대해 감소하는 경향을 보였으며, 300 mg/kg BW TA 투여군 (G4)에서는 난소기능저하 대조군 (G2)에서 비해 유의적으로 감소하였다 (표 5).
[혈청 내 골대사 관련 단백질 함량]
우선, 골과 상아질에 특이성을 가지는 단백질로 조골세포에서 만들어져 조골세포의 활성을 반영하여 골 형성의 중요한 지표인 오스테오칼신 (osteocalcin)과 P1NP 혈청 내 함량을 측정하여 하기 표 6에 나타내었다.
[표 6]
Figure pat00005
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
상기 표 6의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 정상 대조군 (G1)에 대해 난소기능저하 대조군 (G2)에서 osteocalcin과 P1NP 함량은 유의적으로 감소하였다. 혈청 내 오스테오칼신 (osteocalcin) 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에 대해 시험물질 300 mg/kg BW TA 투여군 (G4)에서 유의적으로 증가하였다 (표 6).
다음으로, 뼈흡수의 대표적 표지자인 NTX 와 TRAP 5b의 혈청 함량을 측정하여 표 7에 나타내었다.
[표 7]
Figure pat00006
(Values are expressed as mean±SEM.)
(* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
(# p < 0.05, ## p < 0.01, ### p < 0.001 significantly different from that of G1 group)
상기 표 7의 결과를 통하여 확인할 수 있는 바와 같이, 정상대조군 (G1)에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)에서 NTX와 TRAP 5b 함량은 유의적으로 증가하였다. 혈청 내 NTX 함량은 300 mg/kg BW TB 투여군 (G5)에서 유의적으로 감소하였다. 혈청 내 TRAP 5b 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 모든 시험군 (G3, G4, G5)에서 유의적으로 감소하였다 (표 7).
한편, 파골세포를 억제하는 표지자인 OPG는 정상대조군(G1)에 대해 난소기능저하 대조군(G2)에서 유의적으로 감소하였다. 300 mg/kg BW TA 투여군 (G4)의 혈청 OPG 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 유의적으로 감소하였다.
상기 표 2 내지 7 및 도 1에 나타난 실험결과를 종합적으로 평가한 결과, 난소기능저하 대조군 (G2)에서는 sham-operation을 한 정상대조군 (G1)에 비해 대퇴골의 골밀도가 유의적으로 감소하였다. 난소기능저하 대조군 (G2)의 혈청 Ca 함량, 혈청 P 함량, 혈청 ALP 활성, 혈청 NTX 함량 및 혈청 TRAP 5b 함량은 정상대조군 (G1)에 비해 유의적으로 증가하였고, 혈청 osteocalcin 함량 및 혈청 P1NP 함량은 정상 대조군 (G1)에 비해 난소기능저하 대조군 (G2)에서 유의적으로 감소하였다. 이는 난소기능저하에 의해 골다공증 동물모델이 적절하게 구축됨을 나타낸다.
한편, 100 mg/kg BW TA 투여는 난소기능저하 골다공증 동물모델의 골대사에 영향을 미치지 않았다. 300 mg/kg BW TA를 투여한 경우 (G4) 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 대퇴골의 골밀도, 혈청 osteocalcin 및 혈청 osteoprotegenin 함량이 증가하였고, 혈청 P 함량, 혈청 ALP 활성 및 혈청 TRAP 5b 함량은 난소기능저하 대조군 (G2)에 비해 300 mg/kg BW TA 투여군 (G4)에서 유의적으로 감소하였다.
이상의 결과는 수소함유칼슘 (TA)을 고함량 (300 mg/kg BW)으로 장기간 (8주) 투여시 난소기능저하 골다공증 동물모델에서 골대사 개선 효능이 있음을 나타낸다.

Claims (7)

  1. 탄산칼슘 (CaCO3) 또는 산화칼슘 (CaO)에 수소(H2)가 흡장결합된 칼슘 소성물인 수소흡장 탄산칼슘 (CaCO3·H2) 소성물 또는 수소흡장 산화칼슘 (CaO·H2) 소성물을 포함하는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 골다공증 환자의 골밀도 및 피질골의 함량을 증가시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 골다공증 환자의 혈액 내 칼슘(Ca), 인 (P), 알칼리 포스파타아제 (alkaline phosphatase, ALP), 오스테오칼신 (osteocalcin), 프로콜라겐 1 N-말단 프로펩티드 (procollagen 1 N-terminal propeptide, P1NP), 타르타르산염 저항성 산성 포스파타아제 5b (tartrate-resistant acid phosphatase 5b, TRAP 5b) 및 오스테오프로테게닌 (osteoprotegenin, OPG)의 함량을 감소시키는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 정제(tablet), 젤리, 평균입경이 10 내지 200㎛인 분말, 또는 평균 입경이 0.5 내지 2㎜인 과립의 제형을 가지며,
    상기 분말 또는 과립 제형의 조성물은 섭취가능한 연질캡슐 또는 경질캡슐에 내장되거나 캡슐 이외의 포장재에 내장되는 것인 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 난소기능저하에 의해 유발된 골다공증을 갖는 환자의 골다공증을 치료하는 것을 특징으로 하는 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  6. 청구항 1에 있어서,
    상기 칼슘 소성물은
    난각칼슘, 진주칼슘, 패각칼슘 및 해조칼슘으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유기탄산칼슘을 소성하여 제1소성체를 제조하는 제1소성단계; 및
    상기 제1소성체를 수소분위기 하에서 소성하여 제2소성체를 제조하는 제2소성단계;를 통하여 제조되는 것인 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서,
    상기 제1소성단계는 상기 유기탄산칼슘을 300 내지 1,000℃에서 2 내지 10 시간 동안 소성하여 제1소성체를 제조하는 과정으로 수행되며,
    상기 제2소성단계는 상기 제1소성체를 수소 분위기 하에서 300 내지 1,000℃로 2 내지 10시간 동안 소성하여 제2소성체를 제조하는 과정으로 수행되는 것인 골다공증 치료용 수소흡장 칼슘 조성물.
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