KR20210013560A

KR20210013560A - 단백질 거대고리화

Info

Publication number: KR20210013560A
Application number: KR1020207033295A
Authority: KR
Inventors: 탐 노버트 그로스만; 마르타 피레이 지메노; 스벤 헨니그; 사스키아 안토니 네우바처
Original assignee: 스티칭 브이유
Priority date: 2018-04-19
Filing date: 2019-04-18
Publication date: 2021-02-04
Also published as: EP3781682A1; US11788081B2; CN112368379A; AU2019257105A1; JP2021522179A; CA3097104A1; WO2019203645A1; US20210102185A1; JP7524071B2

Abstract

본 발명은 단백질의 거대고리화 방법 및 이를 위한 가교제에 관한 것이다. 본 발명은 단백질의 안정성을 증가시키는 데에 유용하다.

Description

단백질 거대고리화

본 발명은 단백질의 거대고리화(macrocyclization) 방법 및 이를 위한 3가 티올-반응성 가교제에 관한 것이다. 본 발명은 단백질의 안정성을 증가시키는 데에 유용하다.

효소는 생물공학과 생물의학에서 필수적인 요소이나[1,2], 이들의 적용 범위는 종종 요구되는 거친 조건(예를 들어 고온 또는 변성제의 존재) 하에서의 제한된 안정성 때문에 한계가 있다. 결론적으로, 단백질 구조의 안정화는 적합한 효소의 개발에 있어 핵심적인 부분이다. 단백질 3차 구조들 간의 복잡한 상호작용과 서열 변화에 대한 효소 활성의 민감성으로 인해 효소의 안정화는 매우 어려운 문제이다. 최소한의 침습적 전략은 치료제의 생체 안정성을 증가시키기 위해 주로 사용되는 공유 단백질 변형(예를 들어 페그화(pegylation) 또는 글리코실화)을 이용하는 것이다[3, 4]. 혹은, 효소 안정화는 방향 평가(directed evaluation), 보존서열-기반 돌연변이 생성 또는 컴퓨터를 이용한 방법을 적용한 단백질 서열의 변형을 통해서도 달성될 수 있는데[5, 6, 7, 8], 여기에는 비-단백질성 아미노산이 도입될 수도 있다[9]. 이러한 접근은 단백질 코어 상호작용, 구조 강화 및/또는 표면 전하 분포의 개선을 목적으로 하며, 적절한 안정화 효과를 거두기 위해 종종 여러번의 최적화 과정이 요구되기도 한다.

이에, 단백질, 특히 효소의 안정성을 증가시키기 위한 새로운 방법에 대한 요구가 존재한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 단백질의 안정성을 증가시키는 방법을 제공하며, 상기 단백질은 최소 70개 아미노산을 포함한다:

-a) 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질을 제공하는 단계; 및

-b) 상기 단백질과 3가 티올-반응성 가교제(cross-linker)를 접촉시켜 상기 가교제가 각 3개의 시스테인 잔기와 공유결합을 형성하도록 하는 단계.

바람직하게는, 단계 a)는 3개의 시스테인 잔기 중 하나 이상을 도입하기 위해 단백질을 변형시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 적어도 4번째 시스테인 잔기를 포함하며 상기 방법은 상기 4번째 시스테인과 상기 가교제(cross-linker) 간의 공유결합을 형성시키지 않는다. 바람직하게는, 상기 단백질은 효소이고 상기 4번째 시스테인은 효소 활성 부위의 일부이다. 바람직하게는, 상기 가교제는 C₃대칭을 가진다.

바람직하게는, 상기 가교제는 하기 화학식 (I)로 표시된다:

(I)

상기 화학식에서,

Q 는

,

,

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 중심 구조이며,

Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내고,

L은 각각 독립적으로

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며,

U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되고,

V는 CH₂이며,

W는 CF₂이고,

X는 NR, NH 또는 O이며,

R은 형광체(fluorophore) 또는 친화도 핸들(handle)이고,

n은 2-8 범위의 정수이며,

m은 1-4 범위의 정수이고,

o는 2 또는 3이며,

v는 2 또는 3이고,

L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내고,

E는

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이며,

X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되고,

Y는 F, Cl, Br, Tos(O-SO₂-C₆H₄-CH₃) 및 Mes(O-SO₂-CH₃)로부터 선택되며,

Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이고,

E의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득되는 안정화된 단백질을 제공한다. 바람직하게는 상기 단백질은 소르타제(Sortase) A 폴리펩타이드 또는 KIX 도메인 폴리펩타이드이다.

본 발명은 또한 화학식 Ⅱ로 표시되는 3가 티올-반응성 가교제를 제공한다:

(Ⅱ)

상기 화학식에서, Q 는

이고,

Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내며,

L은 각각 독립적으로

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고,

U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되며,

V는 CH₂이고,

W는 CF₂이며,

X는 NR, NH 또는 O이고,

R은 형광체 또는 친화도 핸들이며, n은 2-8 범위의 정수이고,

m은 1-4 범위의 정수이며,

o는 2 또는 3이고,

v는 2 또는 3이며,

L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내고,

E는

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이며,

X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되고,

Y는 F, Cl, Br, Tos(O-SO_2-C₆H_4-CH₃) 및 Mes(O-SO_2-CH₃)로부터 선택되며,

Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이고,

E의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.

바람직하게는,

상기 L은

이고,

U는 CH₂이며, 바람직하게는 n은 2 또는 3이고;

E는

이며,

X는 NH이고 Y는 F, Cl 또는 Br이며, 바람직하게는 Cl이다.

바람직하게는 상기 가교제는 화학식 (Ⅲ)으로 표시된다:

(Ⅲ)

상기 n은 1 또는 2이다.

본 발명은 또한 티올기와 반응하기 위한, 바람직하게는 단백질에 존재하는 3개의 시스테인 잔기와 가교하기 위한 본 발명의 가교제의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한 최소 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 최소 70개 아미노산을 포함하는 단백질로서, 상기 3개의 시스테인 잔기는 각각 3가 티올-반응성 가교제에 공유결합하는 것을 특징으로 하는 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 3가 티올-반응성 가교제는 본 발명에서 개시하는 가교제이다.

본 발명은 또한 황색포도상구균(Staphylococcus aureus) SrtA의 아미노산 위치 번호 기준으로 111, 149 및 177번의 시스테인에 아미노산 치환을 포함하는 소르타제 A 폴리펩타이드로서, 바람직하게는 서열번호 1을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다.

본 발명은 또한 도 13b의 아미노산 위치 번호를 기준으로 594, 599, 및 646번 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하는 KIX 도메인 폴리펩타이드로서, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 도 13c에 나타난 서열을 가지는 폴리펩타이드를 제공한다.

변성제 및 온도 상승에 대항하여 효소 안정성을 증가시키키 위해 분자간 가교를 형성하는 방법이 연구되어 왔다. 추가적인 이황화 결합의 도입이 보고되어 왔으며 또한 최근 비-효소적 단백질 도메인으로서 환원적 환경에 민감하지 않은 이황화 모사체의 도입[10]이 보고된 바 있다. 또한, 락탐(lactam) 형성을 통한 단백질 말단의 가교가 적용되었는데[11-13], 이는 3차 구조에서 N- 및 C-말단의 적절한 공간적 정렬이 요구된다.

이들 구조적 필요조건을 완화시키기 위해, 비-천연 친전자성 아미노산을 도입하여 적절하게 정렬된 시스테인 측쇄와 가교를 형성하고자 하였다[14]. 그러나, 앰버(amber) 종결 코던에 의한 이들 비-천연 아미노산의 억제는 단백질 발현을 까다롭게 만든다. 또한, 이들 변형 아미노산의 도입에는 잘 작동하면서도 모든 비-천연 아미노산에 성공적으로 작동하지는 않도록 적응된 tRNA 합성효소를 필요로 한다는 점에서 링커 라이브러리의 스크리닝은 어려운 문제이다[15]. 이에, 비-천연 아미노산을 이용하는 가교 방법은 많은 불리한 점을 가진다.

본 발명은 비-천연 아미노산을 사용하지 않고 가교된 단백질을 생산하는 방법을 제공한다. 단백질은 예를 들어 사이토카인, 키모카인, 성장인자, 호르몬, 항체, 수용체 및 항원 등 어떠한 기능을 가질 수도 있다. 일 구현예에서, 상기 단백질은 효소이다. 본 발명에서 언급하는 가교된 단백질은 하나 이상의 폴리펩타이드 또는 펩타이드 쇄(chain)로 구성된 단백질을 포함함은 당업자에게 자명하다. 예를 들어, 항체는 본 발명의 예시적인 단백질이며 IgG 항체는 4개의 펩타이드쇄로 이루어진다. 수용체 역시 본 발명의 예시적인 단백질이며 많은 단백질들은 예를 들어 헤테로- 또는 호모-다이머로 구성된다. 일 구현예에 따르면, 시스테인 잔기는 상이한 폴리펩타이드 또는 펩타이드 쇄에 존재하여 가교가 폴리펩타이드/펩타이드 쇄 간에 형성될 수 있도록 한다. 예를 들어, 본 발명은 헤테로다이머 수용체의 안정성을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 다양한 구현예 중 하나로서, 헤테로다이머 수용체는 하나의 수용체 서브유닛에 하나의 시스테인 잔기를 가지고 다른 수용체 서브유닛에 두 개의 시스테인 잔기를 가져 수용체가 3가 티올-반응성 가교제와 접촉했을 때 링커가 각 3개의 시스테인 잔기와 함께 다이머 간의 공유결합을 형성할 수 있도록 한다.

특히, 상기 방법은 가교제를 이용하여 단백질의 안정성을 향상시킨다. 안정성의 증가란 가교된 단백질의 안정성이 가교되지 않은 단백질의 안정성에 비하여 증가되었음을 의미한다는 것은 당업자에게 자명하다. 본 명세서에서 용어“증가된 안정성”은 변성에 대한 저항성의 증가 또는 민감성의 감소를 의미한다. 변성은 2차 또는 3차 구조의 상실을 의미하며, 변성되었을 때 대부분의 단백질, 특히 효소는 생물학적 기능을 상실한다. 변성은 기계적인 진동, 방사, 온도 증가 또는 화학 변성제의 결과로 일어날 수 있다. 일 구현예에 따르면, 증가된 안정성은 가교되었을 때 가교되지 않은 경우에 비하여 언폴딩된 단백질 대비 폴딩된 단백질의 비율이 높음을 의미한다. 안정성의 증가 여부는 예를 들어 온도, 계면활성제, 변성제 및 pH의 다양한 조건 하에서 폴딩된 단백질의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 방법은 화학적 변성제에 대항하여 열적 안정성 및/또는 안정성을 향상시킨다.

일 구현예에 따르면, 단백질의 안정성은 Tm의 측정을 통해 결정될 수 있다. 용어“Tm”은 50%의 단백질이 언폴딩되는 온도를 의미한다. 전형적으로, Tm이 높을수록 단백질은 더 안정하다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 단백질의 Tm을 증가시키는 방법이다.

일 구현예에 따르면, 단백질의 안정성은 단백질에 대한 화학물질의 효과를 측정함으로써 결정될 수 있다. 화학 변성제는 단백질 내 비-공유 상호작용 및 공유결합을 붕괴시키는 시약이다. 예시적인 화학 변성제는 구아니디늄 염산염, 구아나디늄 티오시안산염, 우레아, 아세톤, 유기용매, 염, 환원제(예를 들어 디티오트레이톨, 베타-머캅토에탄올, 디니트로티오벤젠), 계면활성제 및 산을 포함한다. 프로테아제와 같은 생물학적 시약도 변성제로 작용할 수 있다.

일 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은

a) 본 발명에서 개시하는 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질을 제공하는 단계; 및

b) 상기 단백질과 본 발명에서 개시하는 3가 티올-반응성 가교제를 접촉시켜 상기 가교제가 각각의 3개의 시스테인 잔기와 공유결합을 형성함으로써 가교된 단백질(Ⅱ)을 생성하도록 하는 단계로서, 상기 가교된 단백질(Ⅱ)은 가교가 없는 단백질(I)에 비해 증가된 Tm 및/또는 변성에 대한 증가된 저항성을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.

본 발명의 방법은 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질을 제공하는 단계를 포함한다. 상기 단백질을 3가 티올-반응성 가교제와 접촉시켜 가교제와 각 3개의 시스테인 잔기가 공유결합을 형성하도록 한다. 실시예에서 기재한 바와 같이, 이중고리화(bicyclization)는 단백질의 기능을 유지하면서 단일고리화에 비해 단백질 3차 구조를 더 잘 안정화시킨다. 일 구현예에 따르면, 가교된 3개의 시스테인 잔기는 해당 단백질에 내재적인 잔기이다. 그러나, 대부분의 단백질에 있어 3개의 시스테인 잔기 중 하나 이상은 단백질에 도입된 것일 수 있다. 시스테인 잔기의 도입은 당업계에 알려진 방법에 의해 수행될 수 있는데, 예를 들어 변형된 단백질을 화학적으로 합성하거나 재조합 DNA 기술을 통해 하나 이상의 시스테인을 도입할 수 있다. 일 구현예에 따르면, 변형된 단백질은 당업계에 잘 알려진 방법에 따라 발현 벡터로 클로닝되어 세포 내에서 발현될 수 있다. 상기 기술된 가교 결합을 하나 이상 가지는 단백질도 본 발명에 포함됨은 자명하다. 예를 들어, 6개의 시스테인 잔기를 가져 3개의 시스테인 잔기가 가교를 형성하고 다른 3개의 시스테인 잔기는 가교를 형성하지 않는 단백질도 이용될 수 있다. 이러한 구현예에서, 각 3개의 시스테인 잔기에 대한 가교제는 동일할 수도 있고 상이할 수도 있다.

짧은 펩타이드는 대개 본래의 형태를 유지하지 못한다. 실제 많은 펩타이드들은 극히 유연하다. 이에 짧은 펩타이드들을 특정한 형태로 고정시키고 골격의 유연성을 감소시키기 위한 펩타이드 연결 기술이 개발되었다(예를 들어 Lau et al. 2015 Chem Soc Rev 44:91-102). 짧은 선형의 펩타이드를 새로운 활성을 가지는 새로운 구조에 적응하도록 순서대로 정렬시키는 것은 약물 탐색에도 유용하다. 예를 들어, Bashiruddin 등(2015 Bioorganic Chemistry 61: 45-50)은 융합 삼중고리 펩타이드를 라이보솜을 이용하여 합성하는 방법을 기술하였다. 이 기술은 새로운 구조의 펩타이드 라이브러리를 형성하기 위해 사용된 것으로, 이는 예를 들어 생체활성 스크리닝, 특히 새로운 기능을 동정하는 데에 활용될 수 있다. 이 방법에서, 펩타이드는 N-말단 ClAc 기, 두 번째 위치에 하나의 Cys 잔기와 임의의 간격에 위치한 3개의 추가적인 다운스트림 Cys 잔기, 이후의 추가적인 TBMB와 함께 번역된다. Bashiruddin 등은 40개 아미노산 미만의 짧은 펩타이드만을 시험하였다.

Chen 등(2012 ChemBioChem 13: 1032-1038)도 고-친화도 리간드 스크리닝을 위한 펩타이드 라이브러리를 연구하였다. 17개 아미노산 펩타이드를 TCEP로 완전히 환원시키고 아세토니트릴(유기용매)에 용해시킨 상이한 링커 화합물과 배양하였다. 저자는 상이한 링커와 무작위 펩타이드 라이브러리를 조합하는 것이 구조적으로 매우 다양한 거대고리 단백질의 라이브러리 생성 전략이 될 수 있다고 결론내렸다.

2차 구조 또는 루프 형태의 짧은 아미노산을 구조적으로 보강하는 펩타이드 고정과 달리, 본 발명의 방법은 단백질 3차 구조의 안정성을 향상시킨다. 본 발명은 최소 70개 아미노산을 가지는 단백질을 대상으로 한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질은 최소 80개의 아미노산을 가지거나 또는 심지어 최소 100개의 아미노산을 가진다. 펩타이드의 단순한 구조와 달리, 단백질의 다중 2차 구조는 폴딩되어 보다 복잡한 3차원 구조를 형성한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법은 최소 2개의 개별적인 2차 구조를 가지는 단백질을 대상으로 한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 제공되는 단백질은 폴딩된 단백질이거나 가교 전 변성되지 않은 단백질이다. 본 명세서에서 설명하는 바와 같이, 본 발명의 목적 중 하나는 단백질의‘천연의’폴딩 또는 구조를 안정화시키는 방법을 제공하는 데에 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법은 비-가교된 단백질에 비해 단백질의 (천연의) 3차 구조의 안정성을 증가시킨다.

본 명세서에서 용어 단백질의“2차 구조”는 백본의 아미노기와 카복시기 간의 수소결합 패턴으로 정의된다. 알파 나선구조, 베타 쉬트, 베타 턴 및 오메가 루프가 단백질의 예시적인 2차 구조이다. 본 명세서에서, 용어“3차 구조”는 단백질의 3차원적 형상을 의미한다.

단백질 구조를 예측하는 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며 상동성 모델링 및 쓰레딩(threading) 뿐 아니라 신경 네트워크, 은닉 마르코프 모형 및 서포트 벡터머신을 이용하는 보다 진보된 방법도 포함한다. 또한, 단백질의 3차 구조는 X-레이 결정학 또는 핵자기공명(NMR)과 같은 알려진 방법에 의해 결정할 수 있다. Rosetta 소프트웨어와 같은 대중적으로 이용 가능한 소프트웨어를 통해서도 단백질 구조 예측 및 새로운 구조 설계가 가능하다(Voet, Pratt, Voet: Principles of Biochemistry, 2017 Chapter 6 Protein: Three-Dimensional Structure for a review on protein folding and secondary structure; structure prediction and determining protein structure 참조).

바람직하게는, 가교를 위한 3개의 시스테인은 최소 2개의 개별적 2차 구조에 위치한다. 예를 들어, 첫 번째 시스테인은 첫 번째 알파 나선에 위치하고 두 번째 시스테인은 두 번째 알파 나선에 위치할 수 있다. 세 번째 시스테인은 첫 번째 또는 두 번째 알파 나선에 위치하거나 추가적인 2차 구조에 위치할 수도 있다. 이러한 방법은 가교에 의해 최소 2개의 2차 구조 간의 안정성이 증가한다는 이점이 있다. 보다 바람직하게는, 가교를 위한 3개의 시스테인은 최소 3개의 개별적 2차 구조에 위치한다.

3개의 시스테인 잔기는 본 발명의 가교제가 각 3개의 시스테인 잔기와 공유결합을 형성할 수 있도록 단백질 내에서 적절하게 위치한다. 바람직하게는, 상기 시스테인 잔기는 1차 아미노산 서열 상에서 최소 3개 아미노산 떨어져있으며, 이 경우 여전히 공간적으로 근접해있다. 바람직하게는, 3개의 시스테인 잔기의 알파-C 원자는 옆길이가 6 내지 23 옴스트롱인 삼각형을 이룬다. 바람직하게는, 상기 시스테인은 단백질의 동일한 면을 마주한다.

가교 형성을 위해 단백질에 하나 이상의 시스테인 잔기를 도입할 경우, 펩타이드 고정 분야에서 알려진 설계 원리를 고려할 수 있다. 예를 들어, 알파 나선의 동일한 면에 놓여 있는 펩타이드의 아미노산 잔기는 공유결합을 형성하거나“고정될(stapled)”수 있다. 이러한 잔기의 간격은 일반적으로 i, i+4, i+7, i+11, i+12, i+14 및 i+15 이다. 베타-쉬트의 안정성을 향상시키기 위해, 잔기의 간격은 i, i, i+2, i+4, i+6, i+8, i+10 등으로 고정될 수 있다. 이러한 고정으로 인해 견고해지면서 원하는 펩타이드의 2차 구조가 강화될 수 있다.

상기 3개의 시스테인 잔기의 바람직한 위치는 매몰되거나 코어 위치가 아닌 것이 바람직하다. 용어“매몰된 위치”는 단백질의 내부 위치 및/또는 용매가 접근할 수 없거나 거의 접근할 수 없는 위치를 의미한다. 단백질의 접근 가능한 표면은 많은 다양한 예측 방법을 통해 결정될 수 있다(예를 들어, Zheng, et al., Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. 2004;57:558-564; and Faraggi et al., Proteins.. 2014 Nov; 82(11): 3170-3176 참조). 바람직하게는, 3개의 시스테인 잔기는 3차 구조의 표면에 위치하고 결합에 참여하지 않는다(예를 들어 리간드 결합, 기질 인식).

일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질은 최소 4번째 시스테인 잔기를 포함하며, 이는 본 발명의 방법 실행 결과 가교되지 않는다. 이러한 방법은 특히 단백질이 예를 들어 결합 도메인 또는 효소 활성 부위와 같은 생물학적인 기능을 가지는 시스테인 잔기를 포함할 경우 유용하다. 실시예에서 기술하는 바와 같이, 본 발명의 방법을 변형된 SrtA 폴리펩타이드에 적용할 경우 3개의 재조합적으로 도입된 시스테인 잔기의 가교가 일어나는 반면, 효소 활성에 중요한 내인성 시스테인 잔기는 가교되지 않는다.

본 발명의 방법이 가지는 이점 중 하나는 가교 형성이 비-천연 아미노산에 의존하지 않는다는 점이다. 일 구현예에 따르면, 본 발명의 단백질은 비-천연 아미노산을 포함하지 않는다. 용어“비-천연 아미노산”에는 천연 아미노산과 측쇄 기능성이 상이한 아미노산이 포함된다. 천연 아미노산은 알라닌, 아르기닌, 글리신, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 세린, 트레오닌, 히스티딘, 라이신, 메티오닌, 프롤린, 발린, 이소류신, 류신, 티로신, 트립토판, 페닐알라닌의 일반적인 20개 아미노산 뿐 아니라 피로라이신 및 셀레노시스테인도 포함한다.

비-내인성 시스테인 잔기를 단백질에 도입하는 경우, 변형의 효과는 예를 들어 생물학적 활성 어세이를 통해 측정할 수 있다. 예를 들어, 단백질이 효소인 경우, 하나 이상의 시스테인이 도입된 단백질의 효소 활성을 측정할 수 있다. 몇몇 효소 활성의 상실이 용인된다 하더라도, 효소 활성을 유의하게 감소시키는 변형은 피해야한다. 결합의 효과(예를 들어 친화도 및 특이성) 및 단백질 활성(예를 들어 다운스트림 신호)을 측정하기 위해 유사한 어세이가 수행될 수 있다. 단백질의 생물학적 활성을 측정하는 인 비트로 스크리닝 방법은 잘 알려져 있다.

본 발명은 단백질 안정성을 증가시키는 3가 티올-반응성 가교제에 관한 것이다. 본 명세서에서 용어“가교제”는 분자들, 예를 들어 단백질을 하나 이상의 공유결합을 통해 화학적으로 결합시킬 수 있는 시약을 의미한다. 가교제는 시스테인 내 티올 측쇄와 같은 설프히드릴기와 결합할 수 있는 3개의 반응성 말단을 포함하는“3가 티올-반응성”이다. 바람직하게는, 가교제의 티올-반응성 말단은 친전자체를 포함한다. 바람직하게는, 가교제는 동종 3작용성(homo-trifunctional)이거나 또는 각 티올 반응성 말단은 동일한 작용기를 가진다. 바람직하게는, 가교제는 C₃-대칭 코어를 가진다. 이 경우 (3중)가교된 단백질의 하나의 형태만이 형성된다는 이점이 있다. 3가 티올-반응성 가교제는 당업계에 잘 알려져있다(예를 들어 26-29 참조). 그러나, 이러한 가교제는 최소 70개 아미노산을 가지는 단백질을 그 기능(특정 결합 활성 또는 효소 작용)을 유지한 채 안정성을 향상시킬 수 있다고 보고된 바는 없다.

일 구현예에 따르면, 3가 티올-반응성 가교제는 형광체 또는 친화도 핸들을 포함한다. 적합한 형광체는 당업계에 잘 알려져 있으며 Alexa Fluor 350, Alexa Fluor 405, AMCA, 마리아나 블루 염료 및 캐스케이드 블루 염료(Invitrogen 판매)를 포함한다. 친화도 핸들은 검출 및/또는 정제에 사용되는 분자를 의미한다. 적합한 친화도 핸들은 당업계에 잘 알려져 있으며 항체, 이중가닥 DNA 서열, 펩타이드 핵산, 잠긴(locked) 핵산, 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머(PMO)와 같은 변형된 핵산 및 핵산 모사체, 리간드, 수용체, 펩타이드 또는 동족 결합제를 사용할 수 있는 저분자를 포함한다. 적합한 친화도 태그는 폴리히스티딘, 칼모듈린, S-태그, SBP-태그, Strep-태그, V5, FLAG, HA 및 Myc 태그와 같은 펩타이드‘태그’이다. 그 밖의 적합한 친화도 태그는 당업계에 잘 알려져있다.

가교 반응은 당업계에 공지된 조건 하에서 수행되며, 예를 들어 Mattson et al. Molecular Biology Reports 1993, Volume 17:pp 167-183; Paramelle et al. Proteomics 2013 13:438-456를 참조할 수 있다. 일반적으로, 반응은 pH 6-8 및 4-40℃ 사이의 온도에서 수행된다. 선택적으로, 예를 들어 MS를 이용하여 가교 반응의 효율 및/또는 특이성을 측정할 수 있다. 본 발명에서 추가적으로 기술하는 바와 같이, 본 발명은 단백질의“자연적”인 폴딩 구조를 안정화시키는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 바람직하게는, 상기 반응은 단백질의 3차 구조를 왜곡하지 않는 조건 하에서 수행된다. 몇몇 가교제는 용해도를 위해 유기용매를 요한다. 유기용매의 존재는 단백질의 변성을 야기할 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 반응은 유기용매의 사용하지 않고 수행된다. 바람직한 가교제는 용해도를 위해 유기용매를 요하지 않는 가교제이다.

일 구현예에서, 상기 방법은 가교된 단백질의 안정성을 결정하는 단계를 추가적으로 포함한다. 예를 들어, 열적 및/또는 화학적 안정성을 본 발명에서 기술한 방법으로 측정하여 가교되지 않은 단백질과 비교할 수 있다. 가교된 단백질의 생물학적 활성도 측정할 수 있다.

본 발명은 또한 화학식 (I)로 표시되는 가교제를 제공한다:

(I)

상기 화학식에서,

Q 는

,

,

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 중심 구조이며,

Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내고,

L은 각각 독립적으로

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며,

U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되고,

V는 CH₂이며,

W는 CF₂이고,

X는 NR, NH 또는 O이며,

R은 형광체(fluorophore) 또는 친화도 핸들이고,

n은 2-8 범위의 정수이며,

m은 1-4 범위의 정수이고,

o는 2 또는 3이며,

v는 2 또는 3이고,

L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내고,

E는

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이며,

X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되고,

Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이고,

E의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.

바람직하게는, 상기 L은

이고, U는 CH₂이며, 바람직하게는 n은 2 또는 3이고;

E는

이며, 바람직하게는 X는 NH이고 Y는 F, Cl 또는 Br이며, 바람직하게는 Cl이다.

이론에 구속되는 것은 아니나, 비-소수성 코어(예를 들어, Q)를 가지는 3가 가교제는 단백질 가교에 보다 적합한 것으로 간주된다. 삼중친전자체를 사용하는 알려진 펩타이드 고정 기술에 있어서, 방향성 코어를 가지는 가교제가 일반적으로 사용된다. 이 경우, 코어 구조는 근처의 비극성 아미노산 측쇄를 정렬하는 소수성 코어로 기능한다. 그러나, 바람직하게는 비-방향성 가교제가 단배질 표면에 위치한다. 바람직하게는, Q는

이다.

본 발명은 또한 화학식 (Ⅱ)로 표시되는 가교제를 제공한다:

(Ⅱ)

상기 화학식에서, Q는

이고,

Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내며,

L은 각각 독립적으로

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고,

U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되며,

V는 CH₂이고,

W는 CF₂이며,

X는 NR, NH 또는 O이고,

R은 형광체(fluorophore) 또는 친화도 핸들이며, n은 2-8 범위의 정수이고,

m은 1-4 범위의 정수이며,

o는 2 또는 3이고,

v는 2 또는 3이며,

L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내고,

E는 각각 독립적으로

,

및

로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이며,

X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되고,

Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이고,

eE의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.

바람직하게는, 상기 L은

이고,

U는 CH₂이며, 바람직하게는 n은 2 또는 3이고; 및/또는

E는

바람직한 구현예에 따르면, 상기 가교제는 화학식 (Ⅲ)으로 표시된다:

상기 n은 1이거나 n은 2이다. 실시예에서 언급한 바대로, 이러한 가교제는 용해도를 위해 유기용매를 요하지 않는다.

상술한 가교제는 티올기와 결합할 때 특히 유용하다. 이에, 시스테인 잔기를 가교하는 데에 이용될 수 있으며 예를 들어 상술항 방법에 따라 3가 티올-반응성 가교제로 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 방법으로 수득한 안정화된 단백질을 제공한다. 일 구현예에 따르면, 본 발명은 예를 들어 최소 70개 아미노산을 포함하고 최소 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질로서 각 3개의 시스테인 잔기가 3가 티올-반응성 가교제에 공유결합하는 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 상기 단백질은 화학식 (I), (Ⅱ) 또는 (Ⅲ)의 가교제와 가교된다. 예시적인 구현예에 따르면, 상기 단백질은 소르타제 A (SrtA) 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 상기 SrtA는 화학식 (Ⅲ) 화합물과 가교된다.

SrtA는 원핵생물 효소의 소르타제 패밀리에 속하는 트랜스펩티다제이다. 이는 단백질의 특이적 표지를 가능하게 해주는 중요한 생물분자적 도구이다[16-18]. 그러나, 더 높은 온도 또는 변성제가 필요할 경우 표지 효율성이 극적으로 감소하여 이들 효소의 사용을 어렵게 만든다. 실시예에 기재된 바와 같이, 본 발명은 황색포도상구균 SrtA의 아미노산 위치 번호를 기준으로 111, 149 및 177 위치에 시스테인을 가지는 SrtA 폴리펩타이드 합성 방법을 제공한다. 이 변형 단백질을 3가 티올-반응성 가교제로 가교시키면 녹는점이 11.2℃ 증가하고 구아니디늄 염산염에 대한 내성이 향상되어 안정성이 증가한다. 바람직한 구현예에 따르면, 상기 SrtA 폴리펩타이드는 다음의 아미노산 서열을 가진다:

GSHMQAKPQIPKDKSKVAGYIEIPDADIKEPVYPGPATPEQLNRGVSFAEENESLDDQNISIAGHTFIDRPNYQFTNLKAAKKGSMVYFKVGNETRKYKMTSIRDVKPTDVGVLDEQKGKDKQLTLITCDDYNEKTGVWEKRKIFVATEV (서열번호 1).

실시예에 기재되 바와 같이, 본 발명의 가교된 SrtA는 야생형(비-가교된) SrtA가 충분한 활성을 보이지 않는 조건 하에서 단백질 표지 실험에 이용될 수 있다. 본 발명은 또한, 바람직하게는 구아니디늄 염산염과 같은 화학 변성제 의 존재 하에, 단백질/세포를 표지하기 위한 본 발명의 가교된 SrtA의 용도를 제공한다.

예시적인 구현예에서, 상기 단백질은 KIX 도메인 폴리펩타이드이다. 바람직하게는, 상기 KIX 도메인은 화학식 (Ⅲ) 또는 화학식 (IV) 화합물과 가교된다. 본 발명은 3가 티올-반응성 가교제에 공유결합된 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 KIX 도메인 폴리펩타이드를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "포함하다" 및 이의 활용형은 이 단어가 수식하는 요소가 포함되지만, 특별히 언급되지 않은 다른 요소가 제외되지는 않는 경우에 사용된다. 동사“~로 구성되다”는 본 명세서에서 정의된 화합물 또는 부수적 화합물이 특별히 특정된 것 이외의 추가적인 구성을 포함할 수도 있음을 의미하는“~로 필수적으로 구성되다”로 대체될 수 있으며, 이 경우 상기 추가적인 구성은 본 발명의 고유의 특성을 변형시키지 않는다.

본 발명에서 관사“a”및“an”은 하나 이상(예를 들어 적어도 하나)의 문법적인 대상을 언급할 경우에 사용된다. 예를 들어“an element”는 하나의 요소 또는 하나 이상의 요소를 의미한다.

수치적 값(대략 10, 약 10)과 함께 사용되는 용어“대략”또는“약”은 바람직하게는 해답 값의 1%가 초과되거나 미만인 값을 포함하는 의미이다.

도 1a는 안정화된 단백질의 3차 구조를 얻기 위해 이중 또는 삼중 친전자체 가교를 이용한 거대고리화 전략을 보여주는 그림이다. 도 1b는 접근 가능한 시스테인에 대한 가교 형성을 위해 고려된 친전자체(말레이미드, 1; 2-브로모아세트아마이드, 2; 2-클로로아세트아마이드, 3; 아크릴아마이드, 4)를 보여주는 그림이다.
도 2a는 환형 효소의 형성에 사용된 이중친전자체 (b1 - b6)를 보여주는 그림이다. 도 2b는 시스테인 위치를 표시한 SrtA (PDB: 1ija)의 NMR 구조를 나타낸다. 시스테인 쌍(같은 색) 및 이들의 위치를 표시하였다. 도 2c는 선형 또는 가교된 SrtA 변이체의 Tm-값을 보여주는 열지도이다(75 μM). 도 2d는 SrtA-매개 펩티드 전이 반응의 메카니즘을 보여주는 그림이다(인식 모티프: LPETG). 도 2e는 선형 및 가교된 SrtA 변이체의 65℃에서의 효소 활성(10 μM 효소, 10 μM 형광 프로브)에 대한 열지도 그림이다(vr, 야생형 SrtA에 대한 상대값)(도 2c 및 2e의 완충액: 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 도 2e는 2 mM TCEP와 0.01 % Tween 사용).
도 3a는 S7 내의 시스테인 변이 위치가 강조표시된 SrtA(PDB: 1ija)의 NMR 구조를 보여주는 그림이다. 도 3b는 삼중친전자체 t1의 화학구조와 t1 배양 후 쿠마시-염색된 단백질 밴드를 나타내는 SDS-PAGE 겔 사진이다(50 μM S7, 1 mM t1, 50 mM HEPES, pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP). 도 3c는 Tm-값을 포함하는 SrtA, S4-b3 및 S7-t1의 융해 곡선을 나타낸다. 도 3d는 65℃에서 효소 활성에 의한 프로브 절단의 형광 판독결과를 보여주는 그림이다(10μM 효소, 10μM 형광 프로브)(도 3c 및 3d의 완충액: 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 도 3d는 2 mM TCEP와 0.01 % Tween 사용).
도 4a는 펩티드 전이 반응에 대해 형광 프로브(●)를 이용하여 HPLC 크로마토그램(440 nm)을 수행한 결과로서(65℃에서 12시간) 효소 없이(밝은 회색), SrtA와 함께(짙은 회색) 또는 S7-t1와 함께(붉은색) 수행하였다. 생성물의 형성(▲, ■)은 S7-t1가 존재할 경우에만 관찰되었다(50 μM 효소, 10 μM 프로브, 2.5 mM GGG). 도 4b는 효소 활성의 온도 의존성을 보여주는 그림이다(vr, 37℃에서 SrtA에 대한 상대값)(10μM 효소, 10μM 프로브, 2.5 mM GGG, 완충액: 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP, 0.01 % Tween). 값들은 3회 반복실험의 평균값이다(+/-1σ, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ns: 유의성 없음). 도 4c는 다양한 농도의 GdnHCl에 대한 37℃에서의 상대적 효소 활성을 보여주는 그림이다(vr, GdnHCl 부재시 SrtA에 대한 상대값)(실험조건과 데이터 프로세싱은 도 3b와 동일). 도 4d는 피브릴 형성 전(A) 및 GdnHCl(1 M)의 부재(B) 또는 존재(C) 하에서의 재-가용화 후의 가용성 α-Syn 단편에 대한 쿠마시-염색 SDS-PAGE 겔 결과를 나타낸다. 도 4e는 SrtA 또는 S7-t1와 함께 피브릴 형성 전(A)(w/o GdnHCl) 및 재-가용화 후(w/o GdnHCl-(B)/1 M GdnHCl-(C)) 가용성 단편을 이용하여 Syn 표지를 형광 판독(λem = 520 nm)한 결과이다.
도 5는 이중친전자성 가교제의 화학구조 및 3D 켐드로우(ChemDraw)로 계산한 이들의 길이를 보여주는 그림이다.
도 6a는 본 발명에서 클로닝되고, 발현되고 측정된 SrtA의 아미노산 서열을 나타낸다. 도 6b는 b) List of StrA 변이체 목록(색상의 의미는 도 2b와 동일)과 NMR 구조에서 Cα 원자간의 측정된 거리를 나타낸 그림이다(PDB 코드: 1ija).
도 7a는 SrtA 효소 활성 어세이의 모식도를 보여주는 그림이다. 화학구조, HPLC 크로마토그램(10분 간 30%에서 70% ACN 까지 선형 구배, 210 nm) 및 형광 프로브의 MS 스펙트럼을 각각 나타낸다. 도 7b는 37℃(실선) 및 65℃ (점선)에서의 SrtA 가수분해 활성 어세이 플롯을 나타낸다.
도 8은 HPLC-조합 고해상도 질량분석으로 S7 및 S7-t1 내의 4개 시스테인의 변형 단계를 분석한 결과이다. 다음의 트립신 절편에 대한 스펙트럼을 나타내었다: 도 8a 및 8b는 아미노산 100 - 134(C111 포함), 도 8c 및 8d는 138 - 151 (C149 포함), 도 8e 및 8f는 176 - 190 (C177 및 활성 부위 C184 포함). 유리 시스테인 잔기 또는 C4H4ON(회색) 변형된 잔기는 MS 측정 전 효소(S7 또는 S7-t1) 내 유리 시스테인을 의미하고, C2H2O(붉은색) 변형된 시스테인은 t1과 공유 변형되었음을 의미한다.
도 9a는 C-말단 가요성 링커(볼드체), SrtA 인식 모티프(회색) 및 친화도 정제를 위한 His6-태그(밑줄)를 포함하는 α-시누클레인(α-Syn) 서열(서열번호 2)를 보여준다. 도 9b는 형광 프로브 GGGK-FITC의 화학구조와 HPLC/MS 분석결과이다. 크로마토그램(λ=210 nm) 및 MS 스펙트럼을 나타내었다.
도 10a는 피브릴 형성 및 GdnHCl를 이용한 재-가용화 과정의 모식도를 보여주는 그림이다(A: 피브릴 형성 전의 정제된 α-Syn, B: GdnHCl- 불용성 α-Syn 피브릴의 부존재 하의 재-가용화 시도, C: GdnHCl(1 M) 처리 후 재-가용화된 α-시누클레인). 도 10b는 도 4d 및 4e에 나타난 전체 SDS-PAGE 겔(17% SDS)의 쿠마시-염색결과(I)와 이의 형광판독결과(Ⅱ)를 나타낸다.
도 11은 열 변성 전후의 StrA(회색)와 두고리 S7-t1(붉은색) 트랜스펩티다제 활성을 나타내는 그림이다. 열처리되지 않은 단백질(StrA 및 S7-t1)과 가열/냉각 순환을 수행한 시료(StrA# 및 S7-t1#, 상온에서 85℃까지 30분간 가열하고 다시 상온으로 15분간 냉각)를 비교하였다. 효소가 없는 시료도 포함되었다(-). 통계적 유의성은 비대응 t-검정으로 평가하였다(n = 3, ns: 유의성 없음 p > 0.05)..
도 12a는 KIX (PDB: 2agh)의 NMR 구조를 나타낸 그림으로 K1 내 시스테인 변이 위치를 표시하였으며, 2차 구조적 요소를 나타내었다. 도 12b는 Tm-값을 포함하여 KIX, K1-t1 및 K1-t2의 녹는점 곡선을 나타낸다.
도 13a는 서브 클로닝되고 발현되어 본 발명에서 연구된 KIX 야생형의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다. 도 13b는 서브 클로닝되고 발현되어 본 발명에서 연구된 KIX의 변이체인 K1의 아미노산 서열을 나타내는 그림이다. 돌연변이는 녹색으로 표시하였다. 도 13c는 KIX NMR 구조(PDB code: 2agh)의 20개 콘포머(conformer)에서 밑줄친 아미노산 위치의 Cα 원자들 간의 평균 거리를 보여주는 그림이다. 도 13d는 S7 변이체의 시스테인 위치를 표시한 그림이다. SrtA NMR 구조(PDB code: 1ija)의 25개 콘포머에서 밑줄친 아미노산 위치의 Cα 원자들 간의 평균 거리를 표시하였다.
도 14a는 MLL 펩타이드의 화학구조, HPLC 크로마토그램(10분 이상(3-13 분) 40 %에서 80 % ACN까지 선행구배, λ = 210 nm) 및 MS 스펙트럼을 나타낸다. 도 14b는 KIX 야생형과 가교 변이체인 K1-t1 및 K1-t2에 대한 FP 어세이 결과를 보여주는 그림이다. 상응하는 Kd 값을 표시하였다.
도 15a는 t2 (50 μM S7, 1 mM t2, 50 mM HEPES, pH 8.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP)와 함께 배양한 후의 단백질 밴드를 보여주는 쿠마시-염색 SDS-PAGE 겔 그림이다. 도 15b는 S7-t2에 대한 m/z의 계산값 및 측정값을 정리한 표이다. 도 15c는 두고리 S7-t2의 MS 스펙트럼을 나타낸 그림이다. 도 15d는 명확한 Tm-값을 포함한 SrtA 및 S7-t2의 녹는점 곡선을 나타내는 그림이다. 도 15e는 65℃에서 효소 가수분해 활성에 의한 프로브 절단의 형광 판독 결과를 보여주는 그림이다(10 μM 효소, 10 μM 형광 프로브). 도 15d 및 15e에서 사용된 완충액: 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP, 도 15e에서는 0.01% Tween 20 사용).

본 발명은 하기의 실시예를 통해 보다 상세하게 설명된다. 이들 실시예는 발명의 명확하게 설명하기 위한 것을 뿐 이를 통해 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1

본 발명자들은 단백질성 아미노산으로만 구성된 단백질의 전사후 변형을 통한 구조-기반 효소 안정화 전략을 제안한다. 이중친전자체 라이브러리를 이용하여 접근 가능한 시스테인 잔기가 있는 효소 변이체들을 고정시킨다(도 1a). 생성된 단일고리 단백질의 안정화 행동에 근거하여, 열 및 화학 변성에 대한 내성을 크게 증가시키는 두고리 효소를 설계하였다.

황색포도상구균 소르타제 A (SrtA, aa 60-206)가 안정화의 타겟으로 선정되었다. SrtA를 안정화시키기 위해, 펩타이드들을 체결하는 데에 사용되었으며 시스테인 잔기 쌍을 타겟팅하는 이중친전자체를 사용하는 가교화 전략을 사용하였다[19-23]. SrtA는 활성 부위에 위치하는 단일 시스테인을 포함한다. 먼저, 용매에 노출된 시스테인의 공유적 변형에 사용되어온 4개의 친전자체(1-4, 도 1b)를 시험하여 활성 부위 시스테인과 반응하지 않는 기능을 탐색하고자 하였다. 예비적 규모의 단백질 변형에 적합한 조건은 가장 반응성이 높은 2개의 친전자체 말레이미드(1) 및 2-브로모-아세트아마이드(2)와 함께 배양되었을 때 이러한 주요 시스테인이 실질적으로 변형되도록 하나, 2-클로로-아세트아마이드(3) 및 아크릴아마이드(4)와 함께 배양되었을 때는 그렇지 않다. 티올은 아크릴아마이드가 가역적으로 첨가되므로, 2-클로로아세트아마이드를 친전자체로 선정하고 광범위한 거리(21Å, 도 5)의 17개 가교 원자(b1 - b6, 도 2a)를 가지는 이중친전자성 링커를 설계하였다.

다음으로, 전체적 3차 구조를 안정화하기 위해 시스테인 쌍을 도입할 SrtA 내 적절한 위치를 선정하였다. 본 발명자들은 (i) 기질 인식에 관여하지 않는 표면 잔기이면서 (ⅱ) 2개의 상이한 2차구조 요소에 위치하는 쌍이고(ⅲ) 여전히 공간적으로 근접해있는(NMR 구조에 기반한 거리<20 Å, PDB: 1ija) 시스테인 쌍을 고려하였다. 이러한 기준에 근거하여, 6개 SrtA 변이체(S1 - S6, 도 2b, 도 6)를 설계하고, E. coli에서 비균질적으로 발현시킨 뒤 정제하였다. 이어서, 모든 이중친전자체와의 고정반응을 수행하여 다양한 정도의 변환이 나타났다. MS 및 SDS-PAGE로 고리화된 생성물의 형성을 확인하였다. S1, S3, S4 및 S6가 모든 가교제와의 반응에서 높은 변환을 보인 반면, S5는 가장 짧은 가교에서 효율이 낮았다(b1). S2에서, 모든 가교제의 수율이 낮았다. 반응 후, 단백질 시료를 투석하여 반응하지 않은 이중친전자체를 제거하였다.

초기에, 모든 변형되지 않은 가교된 변이체(투석 후 수득됨)들의 녹는점(Tm)을 트립토판 형광의 변화를 통해 측정하였다(도 2c). SrtA(Tm = 59.4 ℃)와 비교하여, 모든 비-가교된 변이체는 S3(ΔTm = +2.9℃)를 제외하고 더 낮은 열적 안정성을 보였다. 효소 가교의 결과 고리형 S3 버전이 강하게 안정화된 반면(ΔTm≥+10.1℃), 나머지 변이체에서는 중간 정도의 효과가 관찰되었다. 변이체 당 가장 안정적인 버전은 S1 b1(ΔTm = +2.8℃), S2 b2(ΔTm = +0.4℃), S4 b3(ΔTm = +4.4℃), S5 b5(ΔTm = +3.4℃) 및 S6 b1(ΔTm = +3.9℃)이다.

SrtA는 짧은 펩타이드 서열(LPETG, 도 2d)을 인식하고 이를 절단하여 N-말단 절편으로 아실 중간체를 형성하는 트랜스펩티다제이다. 상기 중간체는 올리고-글리신의 N-말단에게 공격받아(도 2d) 새로운 펩타이드 결합을 형성한다. 적합한 친핵체가 없을 경우, 물분자가 공격하여 아실 중간체를 가수분해한다(도 2d). 트랜스펩티다제 활성을 조사하기 위해, 종래 보고된 형광체/퀀쳐 쌍이 분리되는 프로브 시스템을 적용하였다(도 7). 활성 스크리닝을 위해, 65℃에서 가수분해 반응[24, 25]을 수행하였으며, 그 결과 야생형 SrtA는 매우 낮은 활성을 보였다(4% 잔여 활성, 도 7). SrtA(vr = 1, 도 2e)에 비해, 많은 가교된 효소는 증가된 활성을 보였다. 놀랍게도, S3의 열안정적인 고리형 버전은 효소 활성 간소를 나타낸다(도 2e). 반면, S4 및 S5의 가교된 버전은 격렬한 활성 강화를 보였다(>2배, 밝은 적색 및 어두운 적색, 도 2e). 가장 많은 활성 증가는 S4-b3에서 관찰되었으며, SrtA 활성의 3.4배였다. 종합하면, 65℃에서의 관찰된 중간 정도의 활성 개선을 통해 단일 고리화로는 3차 구조의 충분한 안정화가 달성되기에는 부족함을 알 수 있었다.

단백질 3차 구조를 보다 강력하게 안정화하기 위해, 효소의 이중고리화(bicyclization)를 시도하였다. 특히, 가장 효과가 좋은 2개의 SrtA 변이체인 S4 및 S5(밝은 파란색 및 어두운 파란색, 도 2b)은 변이 위치가 동일하였다(aa 149). 시스테인 치환의 동시 도입(aa 111, 149 및 177)으로 S7 변이체를 생성하였으며(도 3a), 이는 삼중친전자체와의 반응을 통해 두고리 단백질을 형성하였다. 종래 보고된 두고리 펩타이드[26-28] 및 미니-단백질[29]의 합성 방법과 유사하게, 가교제를 위해 C₃ 대칭 코어를 선정하고 3개의 2-클로로아세트아마이드기를 변형하였다(t1, 도 3b). 13개 연결(bridging) 원자를 제공하도록 삼중친전자체 t1을 디자인하여 S4(b3/b4:10/11 원자) 및 S5 (b5/b6: 14/17 원자)를 위한 바람직한 가교 범위에 포함되도록 하였다. S7 및 t1의 가교 반응이 효율적으로 진행되어 S7-t1의 결합 효소를 수득하였다(도 3b). HPLC/MS 분석 결과 예측되는 분자량의 생성물을 명확히 보여주는 S7의 정량적 변환이 나타났다. 고해상도 MS 분석결과 정확한 변형 부위가 확인되어(시스테인 111, 149 및 177) 고정 후 활성 부위 시스테인이 변형되지 않은 단계를 보여주었다(도 8). S7-t1의 열적 안정성을 조사하는 동안 녹는점의 큰 증가가 관찰되었다(Tm = 70.6℃, 도 3c). 이는 SrtA (Tm = 59.4 ℃)보다 11.2℃ 높고 가장 활성이 높은 단일고리 단백질인 S4-b3(Tm = 63.8 ℃)보다 6.8℃ 높은 값이다. 다음으로, 65℃에서의 효소 활성을 단일고리 버전에서와 같은 방법으로 측정하였다(도 3d). 보다 우수한 열적 안정성에 걸맞게, 65℃에서 SrtA 대비(8.7배), 그리고 가장 활성이 높은 단일고리 단백질인 S4-b3 대비(2.6배) 효소활성 증가가 관찰되었다(도 3d).

지금까지 물을 친핵체로 이용하는 가수분해 조건(도 2d) 하에서 효소 활성을 조사하였다. S7-t1을 단백질 표지에 적용하기 위해, 상술한 형광 프로브를 가지고, 단 이번에는 친핵체 트리글리신의 존재 하에서, 65℃에서의 S7-t1의 펩티드 전이 능력을 조사하였다(전이, 도 2d). HPLC/MS을 이용하여(도 4a) SrtA의 매우 약한 기질 변환을 관찰하였는데(진한 회색), 이는 효소를 전혀 처리하지 않은 경우와 유사하였다(밝은 회색). S7-t1의 존재 하에(붉은색, 도 4a), 출발 물질의 신호(●)는 크게 감소하였으며, 2개의 새로운 피크가 나타났다. MS에 기반하여, 하나의 피크를 C-말단(▲), 다른 하나를 N-말단 절편(■)으로 지정하였으며, 이는 트리글리신과 결합하는 것으로 나타났다. 특히, 가수분해 산물의 신호(Dabcyl-QALPET)가 검출되지 않음으로써 S7-t1의 정확한 기능성을 입증하였다. 고온에서 단백질 미접힘이 되돌려질 수 있는지를 조사하기 위해, 37℃에서 SrtA와 S7-t1의 효소 활성을 가열 전후로 비교하였다(85℃ 도 11). 명백히, 두 효소의 트랜스펩티다제 활성은 가열/냉각 사이클에 영향을 받지 않음으로써 가역적인 미접힘임을 알 수 있었다.

다음 실험 세트에서, 다시 형광 판독(도 4b)을 이용하여 펩티드 전이 반응의 열적 활성 프로피일을 측정하였다. 37℃ 및 55℃ 사이에, 효소 활성 of SrtA (회색) 및 S7-t1(적색)의 효소 활성은 유사하여 약한 온도 의존성만을 보였다. 55℃ 이상에서, 양 효소는 활성을 상실하였으며, 특히 SrtA에서 심하여 65℃에서 완전히 비활성화되었다(도 4b). S7-t1에 있어, 활성 감소 정도는 훨씬 덜하여 잔여 활성은 37℃ 대비 각각 63% (65℃) 및 27% (70℃)였다. SrtA와 비교하여, S7-t1은 열스트레스에 대해 ~10℃의 증가된 내성을 보여 +11.2℃ 높은 녹는점과 일치하였다. 강화된 열적 안정성은 종종 구아니디늄 염산염(GdnHCl)과 같은 변성제에 대한 내성으로 나타난다. 이러 이유로, GdnHCl가 트랜스펩티다제 활성에 미치는 영향을 조사하였으며(도 4c), 그 결과 SrtA 및 S7-t1은 0.5M까지는 변성제 농도에 영향을 받지 않음이 밝혀졌다. 0.75 및 1.5 M 사이에서, S7-t1는 SrtA보다 유의하게 활성이 높았다. 특히 1 M GdnHCl에서, SrtA는 어떠한 검출 가능한 효소 활성도 보이지 않은 반면(vr < 1%, 도 4c) S7-t1는 여전히 40% 잔여활성을 보였다(GdnHCl 부재시 대비). GdnHCl의 농도가 더 높으면(≥ 2 M) 양 효소 모두 효소 활성을 상실하였다.

이제까지는 S7-t1을 짧은 검정 펩타이드의 표지로 적용하였다. 다음으로, 본 발명자들은 야생형 SrtA가 충분한 활성을 발휘하지 않는 조건 하에서도 S7-t1가 단백질 표지로 유용한지를 확인하고자 하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 α-시누클레인(α-Syn)을 목적 단백질로 선정하였다. α-Syn은 140개 아미노산을 포함하며 파킨슨병을 비롯한 다양한 신경퇴행성 질환과 관련된 병원성 피브릴을 형성할 수 있다[30]. α-Syn 피브릴은 GdnHCl을 이용하여 가용화될 수 있다[31]. 본 발명자들은 C-말단의 SrtA-인식 모티프를 가지는 α-Syn 버전을 설계하여 표지될 수 있도록 하였다. 발현 및 정제 후, 가용성 α-Syn(A)로 피브릴을 형성하고 초원심분리를 하였다[31]. 불용성 피브릴을 세척하고 GdnHCl(1M)이 없거나(B) 포함된(C) 완충액을 처리하였다[31]. 생성된 가용성 단편(B 및 C)과 정제된 가용성의 α-Syn(A, 도 4d)를 비교하자, GdnHCl의 존재 하에서만(C) 재-가용화가 명확히 관찰되었고 GdnHCl가 존재하지 않은 경우(B)는 그렇지 않았다. 단백질 표지를 조사하기 위해 이들 가용성 시료(A, B, C)를 형광기질(도 9) 및 SrtA 또는 S7-t1와 배양하였다. 이후 판독을 위한 형광 촬영기를 이용한 SDS-PAGE로 분석을 수행하였다. 피브릴 형성 전(A)으로서 GdnHCl가 없는 경우에 가용성 α-Syn에 있어, SrtA와 S7-t1는 강한 밴드가 나타나 효과적으로 단백질 표지가 되었음을 알 수 있었다(도 4e). 예상대로, GdnHCl 가 부재하여(B) 가용성 α-Syn가 없는 재-가용화 조건 하에서 어떠한 형광 신호도 관찰되지 않았다(B, 도 4e). 반면, GdnHCl(1 M)를 이용한 재-가용화에서, S7-t1를 이용한 경우 α-Syn 표지가 일어났으나 야생형 SrtA(C)에서는 그렇지 않았다. 특히, S7-t1의 형광 밴드 강도 차이(A vs. C, 도 4e)는 가용성 단편 내 α-Syn의 양과 연관되어 있어(A vs. C, 도 4d), GdnHCl의 존재 하에 S7-t1가 잘 표지되었음을 알 수 있었다.

이중고리화를 통한 단백질 안정화를 보다 광범위하게 적용할 수 있을지를 확인하기 위하여, 인간 CREB 결합 단백질의 KIX 도메인을 두 번째 타겟으로 선정하였다(도 5a). KIX는 다중 단백질 결합 파트너를 가지고 중앙의 3개의 α나선 묶음(α1, α2, α3)으로 구성된 어댑터 도메인이다. 이들 묶음과 C-말단의 310 나선(G1) 간의 접합은 견고한 구조 형성에 있어 중요하다(도 12a)[34]. 따라서, 본 발명자들은 시스테인 삽입에 적합한 3개의 위치를 탐색함에 있어 3차 구조 안정화를 위한 이들 영역에 초점을 맞추었다. SrtA 안정화에서의 경험에 기반하여, 다음의 지침이 적용되었다: (i)용매에 접근 가능한 잔기를 고려하되, (ⅱ)2차 구조 3개의 거리에 위치하고, (ⅲ)단백질의 동일한 면을 향하고 있으며, (iv)한 면의 길이가 6에서 17Å(Cα-Cα 거리) 사이인 삼각형을 이룰 것. 이러한 기준에 기반하여 H594, L599 및 R646를 시스테인 치환 위치로 선정하여 KIX 변이체인 K1을 수득하였다(도 12a, 도 12).

K1 내 3개의 변이 부위 간의 거리(7.8, 10.0 및 11.5 Å, 도 12)는 S7(8.5, 12.4 및 15.7 Å, 도 13d)에서보다 짧았기 때문에, 가교를 위해 삼중친전자체 t1(n=2, 도 3b)과 더 짧은 버전인 t2(n=1)를 선정하였다. SDS-PAGE 및 HPLC-MS 분석 결과 두 삼중친전자체를 이용한 가교는 효율적으로 진행되었다(데이터 미기재). 가교가 3차 구조에 여향을 주는지를 확인하고자, KIX 및 두 개의 이원고리 변이체(K1-t1 및 K1-t2)와 결합 파트너인 MLL과의 친화도를 비교하였다. 형광 편광 어세이를 이용하여, KIX, K1-t1 및 K1-t2의 유사한 결합 친화도를 관찰하였다(Kd는 각각 0.6, 0.9 및 0.9 μM, 도 14). 이후, 3개의 단백질의 정확한 녹는점을 측정한 결과(도 12b), K1-t1 및 K1-t2의 열적 안정성이 KIX에 비해 크게 증가하였음을 발견하였다(ΔTm은 각각 +20.6℃ 및 +24.6℃). 특히, 두 삼중친전자체는 유사한 안정화 효과를 보였으며 더 짧은가교인 t2가 가장 효과가 좋았다. 이러한 결과에 기반하여, 삼중친전자체 t2의 StrA 변이체 S7에 대한 효과도 평가하고자 하였다. 가교 반응이 효율적으로 진행되어 두고리 효소 S7-t2를 수득하였다(도 15). 특히, S7-t1(ΔTm = +11.2℃)에서와 유사한 열적 안정화가 S7-t2에서 관찰되어(ΔTm = +11.5℃, 도 15), 가교 길이의 작은 차이에 대한 내성이 있음을 알수 있었다.

요약하면, 본 발명자들은 효소 안정화를 위반 구조 기반 접근법을 제안하며, 이를 통해 단백질성 아미노산만으로 구성된 천연 단백질에 모듈식 가교를 도입할 수 있다. 몇몇 단일 고리화된 SrtA 변이체를 탐색하여 열적 및 화학적 변성에 대한 내성이 크게 증가된 두고리 효소인 S7 t1을 설계하였다. 중요한 것은, S7 t1이 1M의 GdnHCl 존재 하에 α-Syn를 표지하는 데 효율적이라는 점이다. 이러한 조건 하에, 야생형 SrtA는 효소 활성을 보이지 않았음에도, SrtA 변이체에는 이러한 문제점이 나타나지 않았으며, 중요한 점은 표면에 노출된 추가적 시스테인 잔기가 고리환 반응 동안 원치않는 부산물을 생성한다는 점이다. 이런 경우, 이들 시스테인을 변형시키거나(예를 들어 세린으로) 또는 촉매적 활성에 필요할 경우 가교반응 동안에 블로킹하여야 한다. SrtA에 대한 발견을 통해, 본 발명자들은 단백질의 이중고리화 및 안정화를 위한 가이드라인을 도출하고 이를 KIX 도메인에 적용하였다. 3개 시스테인 KIX 변이체를 디자인하고 2개의 상이한 C₃-대칭 삼중친전자체와 반응시켜 열적 안정성이 크게 증가한 2개의 두고리 KIX 버전을 수득하였다. 전반적으로, 본 발명의 방법은 단백질성 아미노산만으로 구성된 재조합 단백의 구조-기반 안정화를 촉진하였다. 단백질 고리화에 합성 친전자체를 사용하면 다양하고 가변적인 가교 구조물을 직접적으로 제작할 수 있다. 추가적인 특징으로서, 본 발명자들은 친화도 핸들(예를 들어 효소 정제/재생)[32] 또는 근접성-기반 소르타제-매개 라이게이션을 위한 리간드[33]와 같은 추가적인 기능성을 확보할 수 있는 가교제의 사용을 계획하였다. 종합하면, 본 발명의 단백질 안정화 기술은 안정화된 신규 효소를 신속하게 이용할 수 있는 장점을 가져 추가적 기능을 동시에 도입할 수 있는 기회를 제공한다.

참고문헌

[1] U. T. Bornscheuer, G. W. Huisman, R. J. Kazlauskas, S. Lutz, J. C. Moore, K. Robins, Nature 2012, 485, 185-194.

[2] C. P. R. Hackenberger, D. Schwarzer, Angew. Chem. Int. Ed. 2008, 47, 10030-10074.

[3] A. J. Keefe, S. Jiang, Nat. Chem. 2012, 4, 59-63.

[4] J. Milton Harris, R. B. Chess, Nat. Rev. Drug Discov. 2003, 2, 214-221.

[5] M. T. Reetz, Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 2658-2666.

[6] C. Jost, A. Pl

ckthun, Curr. Opin. Struct. Biol. 2014, 27, 102-112.

[7] T. J. Magliery, Curr. Opin. Struct. Biol. 2015, 33, 161-168.

[8] A. M. Chapman, B. R. McNaughton, Cell Chem. Biol. 2016, 23, 543-553.

[9] F. Agostini, J. S. V

ller, B. Koksch, C. G. Acevedo-Rocha, V. Kubyshkin, N. Budisa, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 9680-9703.

[10] N. Mart

nez-S

ez, S. Sun, D. Oldrini, P. Sormanni, O. Boutureira, F. Carboni, I. Compa

n, M. J. Deery, M. Vendruscolo, F. Corzana, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 14963-14967.

[11] J. A. Camarero, T. W. Muir, J. Am. Chem. Soc. 1999, 121, 5597-5598.

[12] H. Iwai, A. Plu, FEBS Lett. 1999, 459, 166-172.

[13] C. Schoene, J. O. Fierer, S. P. Bennett, M. Howarth, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 6101-6104.

[14] E. J. Moore, D. Zorine, W. A. Hansen, S. D. Khare, R. Fasan, Proc. Natl. Acad. Sci. 2017, 201708907.

[15] J. W. Chin, EMBO J. 2011, 30, 2312-2324.

[16] C. P. Guimaraes, M. D. Witte, C. S. Theile, G. Bozkurt, L. Kundrat, A. E. M. Blom, H. L. Ploegh, Nat. Protoc. 2013, 8, 1787-1799.

[17] J. J. Bellucci, J. Bhattacharyya, A. Chilkoti, Angew. Chem. Int. Ed. 2015, 54, 441-445.

[18] L. Schmohl, D. Schwarzer, Curr. Opin. Chem. Biol. 2014, 22, 122-128.

[19] H. Jo, N. Meinhardt, Y. Wu, S. Kulkarni, X. Hu, K. E. Low, P. L. Davies, W. F. Degrado, D. C. Greenbaum, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 17704-17713.

[20] A. Muppidi, K. Doi, S. Edwardraja, E. J. Drake, A. M. Gulick, H. G. Wang, Q. Lin, J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 14734-14737.

[21] P. Diderich, D. Bertoldo, P. Dessen, M. M. Khan, I. Pizzitola, W. Held, J. Huelsken, C. Heinis, ACS Chem. Biol. 2016, 11, 1422-1427.

[22] A. M. Spokoyny, Y. Zou, J. J. Ling, H. Yu, Y. S. Lin, B. L. Pentelute, J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 5946-5949.

[23] M. R. Jafari, L. Deng, P. I. Kitov, S. Ng, W. L. Matochko, K. F. Tjhung, A. Zeberoff, A. Elias, J. S. Klassen, R. Derda, ACS Chem. Biol. 2014, 9, 443-450.

[24] B. C. Chenna, J. R. King, B. A. Shinkre, A. L. Glover, A. L. Lucius, S. E. Velu, Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 3752-3761.

[25] K. B. Oh, S. H. Kim, J. Lee, W. J. Cho, T. Lee, S. Kim, J. Med. Chem. 2004, 47, 2418-2421.

[26] P. Timmerman, J. Beld, W. C. Puijk, R. H. Meloen, ChemBioChem 2005, 6, 821-824.

[27] C. Heinis, T. Rutherford, S. Freund, G. Winter, Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 502-507.

[28] S. Chen, D. Bertoldo, A. Angelini, F. Pojer, C. Heinis, Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 1602-1606.

[29] B. Dang, H. Wu, V. K. Mulligan, M. Mravic, Y. Wu, T. Lemmin, A. Ford, D.-A. Silva, D. Baker, W. F. DeGrado, Proc. Natl. Acad. Sci. 2017, 201710695.

[30] M. R. Cookson, Mol. Neurodegener. 2009, 4, 9.

[31] R. Porcari, C. Proukakis, C. A. Waudby, B. Bolognesi, P. P. Mangione, J. F. S. Paton, S. Mullin, L. D. Cabrita, A. Penco, A. Relini, et al., J. Biol. Chem. 2015, 290, 2395-2404.

[32] C. B. Rosen, R. L. Kwant, J. I. MacDonald, M. Rao, M. B. Francis, Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 8585-8589.

[33] H. H. Wang, B. Altun, K. Nwe, A. Tsourkas, Angew. Chem. Int. Ed. 2017, 56, 5349-5352.

[34] R. N. De Guzman, N. K. Goto, H. J. Dyson, P. E. Wright, J. Mol. Biol. 2006, 355, 1005-1013.

실험방법

1.1 펩타이드 합성 및 특성 분석

펩타이드를 Fmoc-Rink Amid MBHA 레진(Iris Biotech GmbH) 상에서 표준 Fmoc-기반 고상 펩타이드 합성(SPPS) 프로토콜에 따라 수동으로 합성하였다. 모든 Fmoc-보호된 아미노산을 레진의 초기 아민-로딩에 대해 계산된 eq.을 이용하여 커플링하였다. (1-시아노-2-에톡시-2-옥소에틸리덴아미노옥시)-디메틸아미노-모르폴리노-카르베늄 헥사플루오로포스페이트(COMU) 4 eq., 옥시마 4 eq. 및 디메틸포름아마이드 (DMF) 내 N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA) 8 eq.을 제1 커플링 반응(20분)에 사용하였다. 제2 커플링 반응(45분)을 위해 벤조트리아졸-1-일-옥시-tris-피롤리디노-포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP) 4 eq. 및 DMF 내 DIPEA 8 eq.를 사용하였다. Fmoc-탈보호기화는 DMF 내 20 % 피페리딘 용액을 레진과 함께 15분간 처리함으로써 완료되었다. 플루오레세인 이소티오시안산염(FITC)을 이의 이성질체 3 eq. 및 DMF 내 DIPEA 6 eq.를 이용하여 2시간 동안 2회 커플링하였다. TFA:H₂O:TIPS(95:2.5:2.5) 용액을 처리 후(2 x 2h) 펩타이드를 레진으로부터 잘라내고 Et2O으로 -20℃에서 침전시켰다. Freezone 4.5-105 ℃ 동결건조시스템(Labconco)에서 동결건조한 뒤, 펩타이드를 H₂O:아세토니트릴(1:1)에 용해시키고 Nucleodur C18 역상 컬럼(10 x 125 mm, 110 Å, 입자 크기 5 μm, Macherey-Nagel; 용매 A: H₂O + 0.1 % TFA; 용매 B: 아세토니트릴 + 0.1% TFA; 유속 6 mL/min)을 이용하여 역상 반-분취 HPLC에서 정제하였다. 수득한 생성물은 동결건조시켰다.

펩타이드 동정 및 순도를 Zorbax Eclipse, XDB-C18 역상 컬럼(4.6 x 150 mm, 입자 크기 5 μm, Agilent; 용매 A: H₂O + 0.1 % TFA; 용매 B: 아세토니트릴 + 0.1% TFA; 유속 1 mL/min)의 HPLC-MS 시스템(Agilent Technologies) 상에서 HPLC/ESI-MS 분석으로 확인하였다. FITC 표지된 펩타이드를 V-550 UV/VIS 분광광도계(Jasco)를 이용하여 측광 정량하였다. GGGK-FITC 펩타이드에 대해, 100 mM 인산나트륨 완충액(pH 8.5)에서 494 nm에서의 흡광도를 측정하였으며 흡광계수 ε(FITC)494 = 77000 M^-1cm^-1를 이용하여 농도를 계산하였다. Dabcyl-QALPETGEK-FITC 펩타이드에 대해, 494 nm에서의 Dabcyl 흡광도를 추가적으로 고려하였다(ε(Dabcyl)494 = 14000 M^-1cm^-1).

1.2 단백질 발현 및 정제

황색포도상구균 SrtA aa 60-206를 코딩하는 변형된 pET28a(+) 벡터를 AG Musacchio(Max Planck Institute, Dortmund, Germany)에서 구입하였다. 변이체 S1-S7을 N-말단에 His 6-태깅된 단백질을 형성시키는 위치 특이적 돌연변이 유발(Quikchange^TM, Stratagene), 절단 및 라이게이션 또는 인 비보 클로닝(도 6)을 이용한 서열 변형을 통해 수득하였다. 이들 컨스트럭트를 E. coli BL21 Gold(DE3)(Agilent Technologies)에 형질전환하였다. 형질전환체를 이용하여 Luria Broth(LB)(50μg/mL 카나마이신)를 접종하고 밤새 사전배양하였다(37℃). 이러한 배양을 통해 Terrific Broth(TB) 배양(2L)을 접종하고 37℃에서 0.7의 OD600에 도달할 때까지 배양하였다. 0.5 mM IPTG를 첨가하여 단백질 발현을 유도하고 배양액을 25℃에서 밤새 배양하였다. 원심분리를 통해 세포를 수집하고, 용해 완충액(50 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM TCEP, 10% 글리세롤(v/v))에 재부유한 뒤 미세유체기에서 붕괴시켰다. 원심분리(70000 rcf, 4℃, 45분)를 통해 세포 용해물을 세포 잔해로부터 제거하였다. 이후의 모든 정제과정은 4℃에서 수행하였다. SrtA 및 변이체 S1 - S7를 FPLC 친화도 크로마토그래피(HisTrap^TM Fast Flow Crude 5 mL, GE Healthcare)를 통해 상등액에서 분리하였다. 컬럼을 5CV 세척 완충액(50 mM Tris(pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM TCEP, 5% 글리세롤(v/v), 20 mM 이미다졸)으로 세척하였다. 트롬빈 완충액(50 mM Tris(pH 8), 100 mM NaCl, 2.5 mM CaCl₂, 1 mM DTT)에서 컬럼 상의 트롬빈을 밤새 4℃에서 절단(5 U/mg)하여 타겟 단백질을 용출시켰다. SrtA 및 변이체를 트롬빈 효소에서 분리하기 위해 크기배제 크로마토그래피를 수행하였다(Aekta Pure, 20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP 내의 Column HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare). 정제된 단백질을 한외여과(Amicon, Merck, 10 kDa 컷오프)로 25 mg mL-1까지 농축하고, 신속 냉각 후 -80℃에서 저장하였다.

C-말단 가요성 링커, SrtA 인식 부위 및 친화도 정제를 위한 His6-태그를 포함하는 α-시누클레인(α-Syn) 컨스트럭트의 코딩 서열(도 9)은 유전자 합성(Integrated DNA Technologies) 후 절단(NcoI 및 XhoI) 및 라이게이션을 통해 pET28a(+) 벡터에 서브클로닝된 상태로 구입하였다. 단백질 발현을 위해 벡터를 E. coli BL21 Gold(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환체는 LB 전배양(50 μg/mL 카나마이신, 37℃)에 밤새 접종하였다. 이 배양액을 이용하여 카나마이신(50 μg/mL) 함유 LB 배지(2L)를 접종하고 이를 37℃에서 0.7의 OD600에 이를 때까지 배양하였다. 0.5 mM IPTG를 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 단백질 발현을 유도하였다. 원심분리로 세포를 수집하고 용해 완충액 (50 mM Tris (pH 7.5), 150 mM NaCl)에 재부유한 뒤 초음파 처리(1초 온/ 2초 오프의 4 x 30초 사이클, 40% 전력, 0℃)로 파쇄하였다. 원심분리(70000 rcf, 1시간)를 통해 세포 잔해로부터 세포 용해물을 제거하였다. 모든 후속 정제 과정은 4℃에서 수행하였다. α-Syn를 친화도 크로마토그래피(Aekta Pure, HisTrap^TM Fast Flow Crude 5 mL, GE Healthcare)를 통해 상등액에서 분리하였다. 5 mM 이미다졸을 포함하는 용해 완충액으로 세척하였다. α-Syn을 이미다졸 농도 구배(5 mM-500 mM) 하에서 컬럼으로부터 용출하였다. 단백질 포함 분획을 수집하여 밤새 4℃에서 PBS 완충액(pH 7.4)에 대해 투석하였다(Slide A Lyzer Dialysis Cassette, Thermo, 3.5 kDa 컷오프). 생성된 순수한 α-Syn를 한외여과(Amicon, Merck, 3 kDa 컷오프)로 5 mg/mL까지 농축하고 피브릴 형성에 이용하였다.

Gateway attB1 및 attB2(Thermo)이 부착되고 PreScission 프로테아제 인식 부위를 포함하는 KIX 및 K1 컨스트럭트의 코딩 서열(도 13)을 Integrated DNA Technologies에서 합성 및 구입하였다. 이후, 코딩 영역을 pDONR201 벡터(BP Clonase 효소 혼합물, Thermo)에 도입하였다. 이후, LR Clonase 효소 혼합물(Thermo)을 이용하여 코딩 영역을 pGEX-4t-3 Gateway 호환 목적 벡터에 도입하였다. 생성된 발현 벡터를 E. coli BL21 Gold(DE3)에 형질전환하였다. 형질전환체를 이용하여 밤새 LB 전배양(100 μg/mL 앰피실린, 37℃)을 이어서 이를 이용하여 앰피실린(100 μg/mL) 함유 TB 배양액(2L)을 접종한 뒤 1의 OD600에 도달할 때까지 37 ℃애서 배양하였다. 0.5 mM IPTG을 첨가하여 밤새 20℃에서 단백질 발현을 유도하였다. 세포를 원심분리로 수집하고, 용해 완충액(50 mM Tris (pH 7.4), 500 mM NaCl, 2 mM PMSF 및 2 mM DTT)에 재부유시킨 뒤 미세유체기에서 붕괴시켰다. 원심분리(70000 rcf, 4℃, 60분)를 통해 세포 잔해로부터 세포 파쇄물을 제거하였다. 이후의 모든 정제 과정은 4℃에서 수행하였다. 친화도 크로마토그래피(Aekta Pure, GSTPrep^TM FF 16/10, GE Healthcare)를 이용하여 KIX 및 K1를 상등액에서 분리하였다. 기저선(OD280)에 도달할 때까지 세척 완충액(50 mM Tris (pH 7.4), 100mM NaCl, 2mM DTT)으로 세척하였다. 세척 완충액에서 밤새 4℃에서 PreScission 절단을 컬럼 상에서 수행하였다. 생성된 타겟 단백질을 한외여과로 6 mg/mL까지 농축하였다(Amicon, Merck, 3 kDa 컷오프, 상온). 이어서 크기배제 크로마토그래피를 수행하였다(Aekta Pure, Column HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, GE Healthcare, 25 mM HEPES(pH 7.4), 100 mM NaCl, 2 mM TCEP). 정제된 단백질을 6 mg/mL까지 농축하고(Amicon, Merck, 3 kDa 컷오프, 상온), 신속히 동결시켜 -80℃에 저장하였다.

모든 생성된 벡터 컨스트럭트는 생어 시퀀싱으로 서열을 확인하였다. 모든 단백질은 SDS-PAGE로 정선분석을 하였다.

1.3 α-Syn 피브릴 형성 및 재-가용화

피브릴 형성을 위해, 4 mL의 정제된 가용성 α-Syn(5 mg/mL)을 37℃, 1250rpm로 4일간 교반하였다. 생성된 현탄액을 600μL씩 나누어 초원심분리하였다(135000 rcf, 4℃, 45분). 상등액의 단백질 함량을 Nanodrop(OD280)으로 정량하여 피브릴 형성의 효율성을 조사하였다. 상등액 제거 후, 펠렛을 SrtA 완충액(4회 500 μL, 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP)으로 세척하였다. 재-가용화를 위해 피브릴 시료에 1M GdnHCl를 처리하거나 처리하지 않고 SrtA 완충액에서 3시간 동안 상온에서 부드럽게 교반하였다. 상등액은 이후의 표지에 사용하였다.

1.4 α-Syn 표지(labeling) 반응

재-가용화된 α-Syn 단편을 초기 GndHCl 농도를 유지하면서 SrtA 완충액(+/- 1M GdnHCl)으로 1:6 희석하고 2 mM GGGK-FITC와 함께 100μM SrtA 또는 S7-t1를 첨가하였다. 표지 시료를 16시간 동안 350 rpm에서 37℃로 배양하였다. Gel Doc XR 시스템(BioRad)을 이용하여 시료를 SDS-PAGE 겔 상에서 형광 분석하였다. 이후 겔을 쿠마시로 염색하였다(도 10).

1.5 이중- 및 삼중친전자성 가교제의 합성과 특성 분석

0℃의 H₂O/DCM(2:3, 18 mL) 내의 K₂CO₃(33 mmol, 3.3 eq.) 용액에 상응하는 디아민(10 mmol, 1 eq.)을 첨가하였다. 클로로아세틸 클로라이드(22 mmol, 2.2 eq.)를 1시간 동안 0℃에서 적상 첨가하기 전 생성된 혼합물을 냉각하였다. 첨가 완료 후, 얼음수조를 제거하고 혼합물을 상온에서 밤새 교반하였다. 원하는 생성물을 DCM으로 3회 추출하였다. 이어서, 유기층을 브린으로 세척하고, Na₂SO₄로 건조시킨 뒤 감압 하에서 여과 및 농축하였다. 생성물은 NMR로 동정하였다. 삼중친전자성 가교제 t1에 대해 동일한 프로토콜을 적용하였으며, 모든 가교 반응에서 신선한 가교제가 사용되어야 한다.

N,N’-bis(클로로아세틸)-1,2-에틸렌디아민(b1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.27 (bs, CONH, 2H), 4.04 (s, CH₂, 4H), 3.17 (m, CH₂, 4H).

N,N’-bis(클로로아세틸)-1,3-프로필렌디아민(b2). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.20 (m, CONH, 2H), 4.04 (s, CH₂, 4H), 3.10 (td, J = 6.9, 5.7 Hz, CH2, 4H), 1.57 (p, J = 6.9 Hz, CH₂, 2H).

N,N’-bis(클로로아세틸)-1,4-부탄디아민(b3). 1H NMR(400 MHz, DMSO-d6) δ8.19 (m, CONH, 2H), 4.02 (s, CH₂, 4H), 3.08 (m, CH₂, 4H), 1.41 (m, CH₂, 4H).

N,N’-(옥시bis(에탄-2,1-디일))bis(2-클로로아세트아마이드)(b4). 1H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 6.92 (bs, CONH, 2H), 4.07 (s, CH₂, 4H), 3.59 (m, CH₂, 4H), 3.53 (m, CH₂, 4H).

N,N’-((에탄-1,2-디일bis(옥시))bis(에탄-2,1-디일))bis(2-클로로아세트아마이드)(b5). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.23(m, CONH, 2H), 4.06(s, CH₂, 4H), 3.52(m, CH₂, 4H), 3.44(t, J = 5.8Hz, CH₂, 4H), 3.25(q, J = 5.8 Hz, CH₂, 4H).

N,N’-(((옥시bis(에탄-2,1-디일))bis(옥시))bis(에탄-2,1-디일))bis(2-클로로아세트아마이드)(b6). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ8.23 (m, CONH, 2H), 4.06 (s, CH₂, 4H), 3.52 (m, CH₂, 8H), 3.44(t, J = 5.8 Hz, CH₂, 4H), 3.25 (q, J = 5.8 Hz, CH2, 4H).

N,N’,N’’-(니트릴로tris(프로판-3,1-디일))tris(2-클로로아세트아마이드) (t1). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (t, J = 5.6 Hz, CONH, 3H), 4.03 (s, CH₂, 6H), 3.10 (q, J = 6.6 Hz, CH₂, 6H), 2.34 (t, J = 6.9 Hz, CH₂, 6H), 1.52 (p, J = 7.1 Hz, CH₂, 6H).

1.6 친전자체를 이용한 단백질 변형

4개의 상이한 친전자체와 야생형 SrtA와의 반응성을 평가하였다. 이에, 50 μM SrtA를 2 mM 친전자체(아크릴아마이드 1, 2-브로모아세트아마이드 2, 2-클로로아세트아마이드 3 또는 4 말레이미도부티르산 4)와 함께 가교 완충액(50 mM HEPES (pH 8.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ 및 2 mM TCEP) 내에서 35℃ 및 350 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 반응은 MS로 분석하였다.

단백질 변이체인 S1 - S6를 반응 완충액(50 mM HEPES (pH 8.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂ 및 2 mM TCEP) 내에서 50 μM로 희석하고 0.5 mM 이중친전자성 가교제(DMSO 내 b1 - b6 50 mM)와 함께 35℃에서 350 rpm으로 24시간 동안 배양하였다. 반응을 중단시키기 위해, 용액을 한외여과(Amicon 한외여과 필터, 0.5 mL, Merck, 10 kDa 컷오프)로 농축하고 SrtA 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP)으로 5회 세척하여 저분자량의 이중친전자성 가교제를 제거하고 완충액을 교환하여 최종 가교된 단백질 변이체를 농축하였다. 생성된 단백질을 신속하게 동결시키고 -80℃에 저장하였다. 변이체 S7과 삼중친전자성 가교제 t1의 가교를 위해, 상술한 프로토콜에서 t1 농도만 0.5 mM에서 1 mM로 변경시켰다(도 3b).

1.7 녹는점(Tm)의 측정

각 단백질을 20 mM HEPES(pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP에서 75 μM로 희석하였다. 35% 여기력을 이용하여 1℃/min 속도로 가열하면서 Prometheus NT.48(NanoTemper Technologies)로 온도를 스캐닝(20 - 95 ℃)하였다. 350 nm 및 330 nm에서의 형광 강도 비율(F350/F330)을 온도에 대한 그래프로 나타내고 Nanotemper Technologies 프로토콜을 이용하여 Tm-값을 결정하였다.

1.8 효소적 가수분해 어세이

StrA 및 변이체들에 의한 Dabcyl-QALPETGEK-FITC 프로브의 가수분해(도 7)에 의해 형광이 증가된 절단된 생성물 GEK-FITC을 수득하였다. 실시간 PCR 시스템(StepOnePlus^TM Real-Time PCR System, Applied Biosystems)으로 정해진 온도에서 형광을 측정(FAM 채널, 520 nm)함으로써(16시간 동안 10분 간격) 형광 변화를 모니터링하였다. 효소를 Tween(최종 농도 0.01 %)이 보충된 SrtA 완충액(20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP)에서 20 μM로 희석하였다. 생성된 효소 용액을 동일한 완충액(최종 부피 20μL, 10 μM 프로브, 10 μM 효소)에서 20μM 펩타이드 프로브(Dabcyl-QALPETGEK-FITC) 용액과 1:1로 혼합하였다. 효소가 없는 시료를 블랭크(blank)로 사용하였다. 형광 판독에서 배경을 제거하고 시간에 대한 그래프를 그렸다. 곡선의 선형 부분의 기울기(v)로 효소 활성을 측정하였다. 이후, v-값을 v(SrtA)로 나누어 상대적 활성을 계산하였다.

1.9 효소적 펩티드 전이 어세이

형광 판독

이 어세이는 상술한 가수분해 어세이와 유사한 방법으로 수행하되, 2.5 mM 트리글리신(G3, Sigma-Aldrich) 존재 하에 진행하였다. SrtA 및 S7-t1의 열적 활성 특성을 분석하기 위해, 다양한 온도(37℃, 45℃, 55℃, 60℃, 65℃, 70℃, 75℃)에서 펩티드 전이 활성을 측정하였다. 3회 측정 후 평균값으로 에러바(1σ)와 함께 그래프를 그렸다. 통계적 유의성은 비대응 t-검정(GraphPad)으로 평가하였다. p-값<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다(ns: 유의성 없음, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 도 4b).

HPLC-MS을 통한 펩티드 전이 활성 모니터링

반응은 SrtA 및 S7-t1에 대하여 65℃에서 수행되었다. 반응 조건: 50 μM POI(SrtA 또는 S7-t1); 10 μM 펩타이드 프로브(Dabcyl-QALPETGEK-FITC); SrtA 완충액 (20 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP) 내 2.5 mM G3; 65℃, 12시간, 350 rpm. 반응 혼합물에 1% TFA를 첨가하여 퀀칭하였다. 이들 반응의 생성물을 HPLC-MS로 분석하였다(도 4a).

GdnHCl 존재 하의 펩티드 전이 활성

변성제인 GdnHCl가 존재할 경우의 SrtA 및 S7-t1에 대한 펩티드 전이 효율을 펑가하였다. 몇몇 GdnHCl 농도(0 M, 0.5 M, 0.75 M, 1.0 M, 1.5 M 및 2.0 M)에서, 고정된 POI(10 μM), 펩티드 프로브(10 μM) 및 G3(2.5 mM) 농도와 고정된 온도(37℃)에서의 펩티드 전이 활성을 측정하였다. 3회 측정 후 평균값으로 에러바(1σ)와 함께 그래프를 그렸다. 통계적 유의성은 비대응 t-검정(GraphPad)으로 평가하였다. p-값<0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다(ns: 유의성 없음, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, 도 4c).

1.10 SrtA 및 S7-t1의 폴딩 가역성

SrtA 및 S7-t1를 20 mM HEPES, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl₂, 2 mM TCEP 및 0.01% Tween 20에서 20 μM로 희석하였다. 이들 용액을 상온에서 85℃까지 30분 간 ThermoMixer(HTA-BioTec)에서 가열하고, 60분 간 상온으로 냉각시켰다. 이후, 37℃에서 이들 단백질의 펩티드 전이 활성을 미리 가열되지 않은 단백질의 막 제작된 용액과 함께 측정하였다.

1.11 HPLC-연동 고해상도 질량분석

변형되지 않은 S7 및 두고리 S7-t1을 먼저 1 mM DTT와 함께 배양한 뒤 5.5 mM 아이오도아세트아마이드와 함께 배양하고, 8M 우레아에 변성시킨 다음 마지막으로 분해시켰다. 먼저, 3시간 동안 LysC(Wako^TM, Osaka, Japan)를 사용하고(단백질-효소 비율 50:1) 4배 용적의 50 mM 암모늄 비카보네이트(AMBIC, pH 8.3)를 이용하여 최종 농도 2.0 M 우레아로 희석한 뒤, 펩타이드를 시퀀싱 등급의 변형된 트립신(Promega^TM, Madison, WI; 단백질-효소 비율 50:1)으로 37℃에서 밤새 분해시켰다. 펩타이드를 C18 스테이지 팁으로 탈염시키고 100-300 ng의 펩타이드를 PepMap100 RSLC C18 나노-HPLC 컬럼(2 mm, 100Å, 75 IDx25 cm, nanoViper, Dionex, Germany)를 이용하여 UltiMate^TM 3000 RSLCnano 시스템(ThermoFisher Scientific, Germany) 상에서 0.1% 포름산과 함께 65분 간의 5 - 60% 아세토니트릴의 농도구배를 통해 분리하였다. 이후 Q Exactive^TM Hybrid Quadrupole-Orbitrap 질량분석계 HF(ThermoFisher Scientific)에서 나노-전자분무 소스(Nanospray Flex Ion Scource, Thermo Scientific)를 통해 직접 분무하였다. 나노-HPLC와 Quadrupole-Orbitrap 질량분석계를 커플링하기 위해, 표준 코팅된 SilicaTip (ID 20mm, Tip-ID 10mm, New Objective, Woburn, MA, USA)을 사용하였다. Q Exactive^TM HF을 데이터-의존성 모드에서 구동하여 하나의 조사 스캔과 이어서 10개의 MS/MS 스캔을 획득하였다. 해상도 70000으로 300 내지 1650 m/z의 질량범위에서 MS 스펙트럼을 수득한 다음 고에너지충돌 분해(HCD) MS/MS 스캔을 해상도 17500으로 수행하였다. 도출된 미가공 파일을 탈아미드화(de, Asn 및 Gln), 산화(ox, Met), 카바미도메틸화(ca, Cys) 및 t1 잔여물(cl, C₂H₂O[-H], Cys)을 다양한 변형으로 이용하여 S7을 탐색하는 Andromeda 서치 알고리즘을 포함하는 MaxQuant 소프트웨어(버전 1.5.2.18)로 프로세싱하였다. 전체 질량 스펙트럼의 정확도를 1차는 20 ppm으로, 2차는 4.5 ppm으로, 그리고 MS/MS는 20 ppm으로 세팅하였다. 2개의 오절단(Two miscleavage)이 허용되었다. 펩타이드 및 미끼 단편에서 1%의 오류 발견률 컷오프값을 적용하였다.

1.12 형광 편광 어세이 (FP)

FITC-표지된 펩타이드 FITC-O2Oc-GNILPSDI(Nle)DFVLKNTP-NH2를 이용하여 K1-t1 및 K1-t2와 혼합직계성백혈(MLL) 전사인자와의 결합을 측정하였다. 이 서열은 MLL에서 유래하였으며 본 명세서에서 MLL 펩타이드라 칭한다. 25 mM HEPES(pH 7.4) 내의 MLL 펩타이드 40 nM 용액, 100 mM NaCl 및 2 mM TCEP를 준비하였다. 384-웰 플레이트(검은색 둥근 바닥, Corning)에서 KIX, K1-t1 및 K1-t2의 3배 희석을 동일한 완충액을 사용하여 14단계로 수행하였다. 40nM MLL 펩타이드 용액 5 μL를 첨가하고 마지막 20μL 용액을 상온에서 배양하였다. 70μM - 0μM의 마지막 단백질 범위가 사용되었다. 1시간 동안 배양 후, Spark 20M 플레이트 리더(Tecan)를 이용하여 λ(ex) = 485 nm 및 λ(em) = 525 nm에서 형광 극화를 측정하였다. Kd 값은 GraphPad Prism 소프트웨어에서 용량-반응 곡선의 비-선형 회귀분석을 적용하여 측정하였다.

실시예 2

알데하이드 탈수소효소(ALDH)은 높은 화학 선택성으로 다양한 기질 분자의 알데하이드 부분을 카복시산으로 산화시키는 데에 적용되어 왔다[T. Knaus, V. Tseliou, L. D. Humphreys, N. S. Scrutton, F. G. Mutti, Green Chemistry 20181]. 녹는점은 47℃보다 조금 높아 2 내지 4시간만 지나면 ALDH의 촉매활성이 유의하게 감소한다. 가교된 ALDH는 효소의 열적 안정성을 향상시키고 생물촉매적 산화 동안의“지속성”을 증가시킬 수 있다. 소 수정체의 ALDH(ALDH-Bov)는 4차 구조를 수득할 수 있는 호모다이머 및/또는 테트라머를 형성한다. 다량체의 3개 단량체를 가교하기 위해, ALDH-Bov 폴리펩타이드를 73, 414, 499번 위치에 시스테인을 가지도록 설계하여 다량체의 2개 단량체와 가교되도록 하였으며, ALDH-Bov 폴리펩타이드는 다음 아미노산 서열을 가지는 ALDH-Bov 폴리펩타이드의 아미노산 위치 번호를 기준으로 72, 238, 448번 위치에 시스테인을 가지도록 설계하였다:

MSSSAMPDVPAPLTNLQFKYTKIFINNEWHSSVSGKKFPVFNPATEEKLCEVEEGDKEDVDKAVKAARQAFQIGSPWRTMDASERGRLLNKLADLIERDHLLLATMEAMNGGKLFSNAYLMDLGGCIKTLRYCAGWADKIQGRTIPMDGNFFTYTRSEPVGVCGQIIPWNFPLLMFLWKIGPALSCGNTVVVKPAEQTPLTALHMGSLIKEAGFPPGVVNIVPGYGPTAGAAISSHMDVDKVAFTGSTEVGKLIKEAAGKSNLKRVSLELGGKSPCIVFADADLDNAVEFAHQGVFYHQGQCCIAASRLFVEESIYDEFVRRSVERAKKYVLGNPLTPGVSQGPQIDKEQYEKILDLIESGKKEGAKLECGGGPWGNKGYFIQPTVFSDVTDDMRIAKEEIFGPVQQIMKFKSLDDVIKRANNTFYGLSAGIFTNDIDKAITVSSALQSGTVWVNCYSVVSAQCPFGGFKMSGNGRELGEYGFHEYTEVKTVTIKISQKNS.

이러한 가교된 ALDH-Bov 폴리펩타이드는 증가된 열적 안정성을 가질 것으로 기대된다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 단백질의 안정성을 증가시키는 방법으로서, 상기 단백질은 최소 70개 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:
a) 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 단백질을 제공하는 단계; 및
b) 상기 단백질과 3가 티올-반응성 가교제(cross-linker)를 접촉시켜 상기 가교제가 각각의 3개의 시스테인 잔기와 공유결합을 형성하도록 하는 단계로서, 바람직하게는 상기 방법은 비-가교된 단백질에 비해 상기 단백질의 3차 구조의 안정성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 a)는 3개의 시스테인 잔기 중 하나 이상을 도입하기 위해 단백질을 변형시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 단백질은 적어도 4번째 시스테인 잔기를 포함하며 상기 방법은 상기 4번째 시스테인과 상기 가교제(cross-linker) 간의 공유결합을 형성시키지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 단백질은 효소이고 상기 4번째 시스테인은 효소 활성 부위의 일부인 것을 특징으로 하는 방법.
앞선 청구항에 있어서, 상기 가교제는 C₃대칭을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
앞선 청구항에 있어서, 상기 가교제는 화학식 (I)로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:

(I)
상기 화학식에서, Q는
,
,
,
,
및
로 구성된 군으루부터 선택되는 중심 구조이며,
Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내고,
L은 각각 독립적으로
,
및
로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이며,
U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되고,
V는 CH₂이며,
W는 CF₂이고,
X는 NR, NH 또는 O이며,
R은 형광체(fluorophore) 또는 친화도 핸들이고,
n은 2-8 범위의 정수이며,
m은 1-4 범위의 정수이고
o는 2 또는 3이며,
v는 2 또는 3이고,
L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내며,
E는
,
및
로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이고,
X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되며,
Y는 F, Cl, Br, Tos(O-SO_2-C₆H_4-CH₃) 및 Mes(O-SO_2-CH₃)로부터 선택되고,
Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이며,
E의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.
제 6 항에 있어서, 상기 가교제는 하기 화학식 (Ⅲ)으로 표시되는 것을 특징으로 하는 방법:

(Ⅲ)
상기 화학식에서 n은 1 또는 2이다
앞선 청구항의 방법으로 수득되는 안정화된 단백질.
화학식 Ⅱ로 표시되는 3가 티올-반응성 가교제:

(Ⅱ)
상기 화학식에서, Q 는
이고,
Q의 각 점선은 Q와 L의 결합 위치를 나타내며,
L은 각각 독립적으로
,
및
로 구성된 군으로부터 선택되는 링커이고,
U는 각각 독립적으로 CH₂및 CF₂로부터 선택되며,
V는 CH₂이고,
W는 CF₂이며,
X는 NR, NH 또는 O이고,
R은 형광체(fluorophore) 또는 친화도 핸들이며, n은 2-8 범위의 정수이고,
m은 1-4 범위의 정수이며,
o는 2 또는 3이고,
v는 2 또는 3이며,
L의 각 점선은 L과 Q 또는 E의 결합 위치를 나타내고,
E는
,
및
로 구성된 군으로부터 선택되는 친전자체이며,
X는 각각 독립적으로 NH 및 O로부터 선택되고,
Y는 F, Cl, Br, Tos(O-SO_2-C₆H_4-CH₃) 및 Mes(O-SO_2-CH₃)로부터 선택되며,
Z는 CH₂, NH-C(O)-CH₂또는 O-C(O)-CH₂이고,
E의 각 점선은 E와 L의 결합 위치를 나타낸다.
제 9 항에 있어서, 상기 L은
이고, U는 CH₂이며, 바람직하게는 n은 2 또는 3이고;
E는
이며,
X는 NH이고 Y는 F, Cl 또는 Br이며, 바람직하게는 Cl인 것을 특징으로 하는 3가 티올-반응성 가교제.
티올기와 반응하기 위한, 바람직하게는 단백질에 존재하는 3개의 시스테인 잔기와 가교하기 위한 제 9 항의 가교제의 용도.
최소 3개의 시스테인 잔기를 포함하는 최소 70개 아미노산을 포함하는 단백질로서, 상기 3개의 시스테인 잔기는 각각 3가 티올-반응성 가교제에 공유결합하는 것을 특징으로 하는 단백질.
제 12 항에 있어서, 상기 3가 티올-반응성 가교제는 제 9 항에 따른 가교제인 것을 특징으로 하는 단백질.
황색포도상구균 SrtA의 아미노산 위치 번호 기준으로 111, 149 및 177번의 시스테인에 아미노산 치환을 포함하는 소르타제 A 폴리펩타이드로서, 바람직하게는 서열번호 1을 가지는 폴리펩타이드.
도 13b의 아미노산 위치 번호를 기준으로 594, 599, 및 646번 아미노산의 시스테인으로의 치환을 포함하는 KIX 도메인 폴리펩타이드로서, 바람직하게는 상기 폴리펩타이드는 도 13c에 나타난 서열을 가지는 폴리펩타이드.