KR20210006673A - Method of controlling the apoptosis of T cells, by the phospholipase A2 - Google Patents

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Abstract

The present invention relates to a mechanism for controlling T cells (Treg) by treating phospholipase A2 (PLA2), which has an effect of inhibiting the apoptosis of T cells, which are involved in almost all human diseases, such as cancer, degenerative diseases, brain diseases, and immune related diseases. Therefore, the present invention is effective in treating and preventing various immune related diseases, cancer, degenerative diseases, and brain diseases, thereby being able to be effectively used in industries related to the same.

Description

포스포리파아제 A2를 처리하여 T 세포의 세포사멸을 조절하는 방법 {Method of controlling the apoptosis of T cells, by the phospholipase A2}Method of controlling the apoptosis of T cells by processing phospholipase A2 {Method of controlling the apoptosis of T cells, by the phospholipase A2}

본 발명은 포스포리파아제 A2(PLA2)에 의한 T 세포의 세포사멸 조절 메커니즘으로 암, 퇴행성 질환, 뇌 질환 및 면역 관련 질환 등 인간의 거의 모든 질환에 관여하는 T 세포의 세포사멸 억제 효과에 관한 것이다.The present invention relates to an effect of inhibiting apoptosis of T cells involved in almost all human diseases such as cancer, degenerative diseases, brain diseases, and immune-related diseases as a mechanism for controlling T cell apoptosis by phospholipase A2 (PLA2). .

인간을 구성하고 있는 세포의 수를 정확히 측정하기는 힘들지만 대략 수십조개로 추산한다. 그리고 하루에 500억에서 700억개의 세포는 세포사멸(apoptosis)이라는 세포사멸기작을 통해 죽는다고 알려져 있으며 그 만큼의 세포가 새로이 생성된다고 할 수 있다. 의도된 세포사멸(Programmed cell death, apoptosis)은 다세포 생물의 개체발생과 조직의 항상성 유지를 위해 필수적이며 동시에 병원체 감염에 대한 선천성 면역(innate immunity) 방어 전략이기도 하다. 이 세포사멸기작은 크게 두 가지로 구분할 수 있는데 하나는 자외선이나 감마선, 화학물질, 바이러스감염, 영양결핍, 산소결핍, 암유발유전자 발현 등의 스트레스에 의해 발생되는 intrinsic apoptosis와 TNF-α, FAS, TRAIL등의 사이토카인이 유도하는 extrinsic apoptosis로 구분할 수 있다. 두 기작 다 궁극적으로는 caspase라는 세포내 단백질 분해효소의 활성화를 통하여 세포사멸을 유도하게 된다.It is difficult to accurately measure the number of cells that make up humans, but it is estimated to be approximately tens of trillions. And 50 billion to 70 billion cells a day are known to die through the apoptosis mechanism called apoptosis, and it can be said that as many cells are newly created. Programmed cell death (apoptosis) is essential for the ongrowth of multicellular organisms and maintenance of tissue homeostasis, and at the same time is also a defense strategy for innate immunity against pathogen infection. These apoptosis mechanisms can be broadly divided into two categories: intrinsic apoptosis caused by stress such as ultraviolet rays or gamma rays, chemicals, viral infections, nutritional deficiencies, oxygen deficiency, and expression of cancer-causing genes, and TNF-α, FAS. It can be classified as extrinsic apoptosis induced by cytokines such as TRAIL. Both mechanisms ultimately induce apoptosis through the activation of an intracellular proteolytic enzyme called caspase.

한편, 세포사멸기작은 암 및 퇴행성 질환, 뇌질환, 면역질환 등 인간의 거의 모든 질환에 관여하고 있으며 결과적으로 이들 질병의 주요 타겟으로 연구가 되고 있다. 그러나 세포사멸의 경우 거의 모든 세포에서 공통적으로 일어나는 현상이기 때문에 p53, TNF-α 등 일반적인 세포사멸인자를 타겟할 경우 뜻하지 않은 부작용이 발생하는 등 이들을 타겟으로 하는 것에는 한계점이 되어 왔다. 세포사멸은 그 기능이 상실되면 암세포의 경우 DNA 손상, 신호전달계 분균형, anoxia, loss of anchorage 등의 자극 하에서도 생존할 수 있게된다. 암세포는 생존과 번영을 위해 세포사멸 기전을 무력화 할 수 있는 다양한 방법을 고안하였다. 종양세포가 더 악성 형질을 가지게 진화하는 과정은 세포사멸 과정을 회피하여 생존하도록 광범위한 유전자 변화가 생기는 것이다. 만약 세포사멸에 저항성을 가지게 되면 암 발생 뿐만 아니라 항암치료에도 내성을 나타낸다.On the other hand, apoptosis mechanism is involved in almost all diseases of humans, such as cancer and degenerative diseases, brain diseases, and immune diseases, and as a result, it is being studied as a major target of these diseases. However, since apoptosis is a common phenomenon in almost all cells, targeting general apoptosis factors such as p53 and TNF-α may cause unexpected side effects, which has been a limitation in targeting them. If the function of apoptosis is lost, cancer cells can survive under stimulation such as DNA damage, signal transduction balance, anoxia, and loss of anchorage. Cancer cells have devised a variety of methods to neutralize apoptosis mechanisms for survival and prosperity. The process by which tumor cells evolve to have more malignant traits is through extensive genetic changes to avoid the apoptosis process and survive. If it becomes resistant to apoptosis, it is resistant to cancer as well as chemotherapy.

봉독은 꿀벌(Apis cerana Fabricius)의 꼬리부 독낭에서 배출되는 독즙으로서 부신피질 호르몬 유사 작용, 중추 신경계통에 작용, 순환계통에 영향, 소화계통에 작용, 진통 작용, 신경통에 작용, 항균 작용 등이 있는 것으로 알려져 있다. 멜리틴(melittin)과 봉독 유래의 포스포리파아제 A2(이하, bvPLA2)가 봉독의 주요 구성 성분으로 알려져 있는데, 멜라틴은 26개의 아미노산으로 구성된 세포 분해성 단백질이며, bvPLA2는 세포막의 인지질을 가수분해하는 효소이다.Bee venom is a poison juice discharged from the venom of the tail of bees ( Apis cerana Fabricius ) and has an adrenal cortical hormone-like action, an action on the central nervous system, an effect on the circulatory system, an action on the digestive system, analgesic action, action on neuralgia, and antibacterial action It is known to have. Melittin and bee venom-derived phospholipase A2 (hereinafter, bvPLA2) are known as the main constituents of bee venom. Melatin is a cytolytic protein composed of 26 amino acids, and bvPLA2 hydrolyzes phospholipids in cell membranes. It is an enzyme.

현재까지 알려진 꿀벌의 봉독 성분은 40여 가지로, 다양한 생리활성을 보이는 멜리틴 (melittin), 아파민 (apamin), 엠씨디-펩타이드 (MCD-peptide)와 같은 활성 펩타이드, 히아루로니다제 (hyaluronidase), 포스포리파아제 A2 (phospholipase A2)와 같은 효소와 도파민, 히스타민 등과 같은 아민류가 있다.There are more than 40 bee venom components known to date, and active peptides such as melittin, apamin, MCD-peptide, and hyaluronidase showing various physiological activities. ), phospholipase A2, and amines such as dopamine and histamine.

봉독은 곤충의 자기방어 물질로 인체나 동물에 일시적이나 영구적으로 해를 끼치기 위해 갖고 있는 화학적 물질이다. 다양한 성분으로 구성된 봉독은 봉침요법으로 오래전부터 민간요법의 하나로 관절염, 통풍 등의 질환에 사용되고 있다. 또한 봉독은 강한 항균효과 뿐만 아니라 항암, 항치매, 피부 재생 효과 등이 보고되고 있다. 특히 봉독유래 PLA2는 조절 T 세포를 활성화 시켜 면역 항상성 조절, 자가면역질환 억제, 알러지 억제 등의 다양한 면역관련 질환에서 그 효능이 보고된 바 있다.Bee venom is a self-defense substance of insects and is a chemical substance possessed to cause temporary or permanent harm to humans or animals. Bee venom, composed of various ingredients, is one of the folk remedies for a long time as bongchim therapy and has been used for diseases such as arthritis and gout. In addition, bee venom has been reported to have a strong antibacterial effect, as well as anti-cancer, anti-dementia, and skin regeneration effects. In particular, bee venom-derived PLA2 has been reported to be effective in various immune-related diseases such as immune homeostasis control, autoimmune disease suppression, allergy suppression by activating regulatory T cells.

봉독 치료법은 치료용 벌을 직접 환부에 쏘이게 하거나, 정제된 봉독 추출물을 경혈점 등에 주사하는 방법으로써, 봉독 치료법이 항염증(anti-inflammation), 항세포자멸사(anti-apoptosis), 항섬유증(anti-fibrosis) 효과가 있다는 연구 결과들도 다수 발표되었으며 임상에서는 국소적 염증이나 류머티즘, 파킨슨병 등 다양한 질환에 사용되어 왔다.Bee venom therapy is a method of stinging a therapeutic bee directly to the affected area or injecting purified bee venom extract to acupuncture points, etc. The bee venom therapy is anti-inflammation, anti-apoptosis, and anti-fibrosis. fibrosis) has been published, and it has been used for various diseases such as local inflammation, rheumatism, and Parkinson's disease.

봉독유래의 PLA2(bvPLA2)는 세포막 인지질의 sn-2 에스테르 결합을 가수분해하여 아라키돈산과 라이소인지질이 유리되도록 촉매하는 효소이다. 많은 연구들에서 bvPLA2가 알레르기성 천식, 알츠하이머 질환, 시스플라틴(cisplatin)으로 인한 장기 염증뿐만 아니라 다양한 질환에 보호 효과가 있는 것으로 보고되고 있다. 또한 최근의 연구에서는 PGE2의 분비를 조절하여 면역 억제 작용을 매개하는 bvPLA2의 새로운 효능이 밝혀졌다. bvPLA2가 dendritic cells(DC) 표면의 CD206 수용기(receptor)에 직접 결합하여 PGE2의 발현을 유도하고, PGE2는 미접촉 T 세포(naive T cells)의 EP2 수용기(receptor)에 결합하여 CD4+CD25+Foxp3+ 조절 T 세포(Treg cells)로의 분화를 유도한다.Bee venom-derived PLA2 (bvPLA2) is an enzyme that catalyzes the release of arachidonic acid and lysophospholipids by hydrolyzing the sn-2 ester bond of cell membrane phospholipids. In many studies, bvPLA2 has been reported to have a protective effect on various diseases as well as allergic asthma, Alzheimer's disease, and long-term inflammation caused by cisplatin. In addition, recent studies have revealed a new efficacy of bvPLA2 that mediates immune suppression by regulating the secretion of PGE2. bvPLA2 directly binds to the CD206 receptor on the surface of dendritic cells (DC) to induce the expression of PGE2, and PGE2 binds to the EP2 receptor of naive T cells and binds to CD4 + CD25 + Foxp3 + Induce differentiation into regulatory T cells (Treg cells).

한편, T 세포는 아직 항원을 만나지 못한 미접촉 T세포와, 항원을 만나 성숙한 효과 T세포(보조 T세포, 세포독성 T세포, 자연살상 T세포), 그리고 기억 T세포로 분류된다. 미접촉 T세포(Naive T cell)는 분화와 성숙을 거쳤지만 아직 말초에서 항원을 만나지 못한 T세포이다. 항원전달세포에 제시된 아직 인지되지 않은 MHC:항원 복합체를 만나면 T세포 항원 수용체 신호 전달 과정(T-Cell Receptor signaling pathway)을 통해 항원을 인식하고 효과 T세포로 활성화되어 적응 면역이 시작된다. 표면에는 세포 접착 분자(cell adhesion molecule)인 L-셀렉틴(CD62L)이 존재하는 반면, 효과 T세포의 특징인 CD25, CD44, CD69와 기억 T세포의 특징인 CD45 등은 거의 존재하지 않는다. 도움 T세포(Helper T cell, 또는 Th cell)는 효과 T세포 중 다른 백혈구들의 분화 및 활성화를 조절함으로써 체액성 면역을 촉진하는 세포를 말한다. 세포 표면에 CD4 단백질을 가지고 있다는 특징 때문에 CD4 T세포라고도 한다. 보조 T세포는 세부 기능에 따라 다시 Th1, Th2, Th17, Treg 등으로 분류된다. Th1 세포는 인터페론 감마(interferon-gamma, IFN-γ)과 종양괴사인자 베타(Tumor Necrosis Factor beta, TNF-β)를 분비함으로써 대식세포의 내부에서 엔도솜과 리소좀이 융합하여 엔도리소좀을 형성하도록 유도한다. 한편 Th2 세포는 여러 종류의 인터류킨(interleukin, IL)을 분비하여 B 세포가 형질 세포로 분화하도록 한다. Th17 세포는 인터루킨-17(IL-17)을 분비하여 호중성백혈구를 모이게 한다. 조절 T세포라고도 부르는 Treg 세포는 면역 반응을 촉진하는 것이 아니라 오히려 억제함으로써 면역의 항상성을 유지하며 자가면역반응 등을 차단한다. 조절 T 세포(Tregs)는 면역 반응이 최대로 발생한 후에 다시 평소 상태로 회복하는 immune homeostasis와 자기 유래 조직에는 면역 반응을 하지 않는 자기관용(self-tolerance)을 핵심 기능으로 하는 특수한 T 세포이다. 생체 밖에서 증식된 CD4+CD25+ Treg cells이 체내에 이식되었을 때 다양한 병리적 변화를 예방하고, 특히 이식편대 숙주병(Graft versus Host Disease, GvHD)은 조절 T 세포의 임상 적용에 매우 적합한 질환으로 알려져 있다. 세포독성 T세포는 그랜자임(granzyme)이나 퍼포린(perforin)과 같은 세포독성물질을 분비하여 바이러스에 감염된 세포나 종양 세포 등을 죽이는 세포이다. 세포 표면에 CD8 단백질을 가지고 있기 때문에 CD8 T세포라고도 한다. 보조 T세포와는 반대로 세포성 면역을 매개하여 바이러스 및 암세포를 제거한다. 자연살상 T세포는 보조 T세포 및 세포독성 T세포에 비해 적은 비율로 분포하는 효과 T세포의 하나로, 표면에 T세포와 같은 T세포 항원수용체(T cell receptor, TCR)를 가지고 있으나, NK1.1과 같은 자연 살세포 특이적 분자도 가지고 있다. 자연살상 T세포는 감마인터페론, 인터루킨-4(IL-4), 인터루킨-10(IL-10) 등을 분비하여 면역 반응을 조절하는 역할을 한다. 기억 T세포는 항원을 인지한 T세포가 분화 및 선별 과정을 거친 뒤 장기간 생존하고 있다가 나중에 항원이 재차 침입하였을 때 빠르게 활성화되어 효과 T세포의 기능을 할 수 있는 잠재적 능력을 가진 세포를 말한다. 미접촉 T세포가 항원을 만나 활성화 된 상태의 세포, 또는 효과 T세포가 인터루킨-7(IL-7)과 인터루킨-15(IL-15)의 영향을 받아 장기 생존가능한 기억 T세포로 분화하게 된다.On the other hand, T cells are classified into non-contact T cells that have not yet met the antigen, T cells that have matured after meeting the antigen (supplementary T cells, cytotoxic T cells, natural killer T cells), and memory T cells. Naive T cells are T cells that have undergone differentiation and maturation, but have not yet encountered an antigen in the periphery. When encountering an MHC:antigen complex that has not yet been recognized presented to an antigen-transmitting cell, the antigen is recognized through the T-Cell Receptor signaling pathway and is activated as an effective T cell, and adaptive immunity is initiated. L-selectin (CD62L), which is a cell adhesion molecule, is present on the surface, whereas CD25, CD44, and CD69, which are characteristic of effective T cells, and CD45, which are characteristic of memory T cells, are hardly present. Helper T cells (Helper T cells, or Th cells) refer to cells that promote humoral immunity by regulating the differentiation and activation of other white blood cells among effective T cells. It is also called a CD4 T cell because it has a CD4 protein on the cell surface. Helper T cells are again classified into Th1, Th2, Th17, and Tregs according to their detailed functions. Th1 cells secrete interferon-gamma (IFN-γ) and tumor necrosis factor beta (TNF-β) to induce endosomes and lysosomes to fuse inside macrophages to form endolysosomes. do. Meanwhile, Th2 cells secrete several types of interleukin (IL) to allow B cells to differentiate into plasma cells. Th17 cells secrete interleukin-17 (IL-17) to collect neutrophils. Treg cells, also called regulatory T cells, do not promote the immune response, but rather suppress it, thereby maintaining the homeostasis of immunity and blocking autoimmune reactions. Regulatory T cells (Tregs) are special T cells whose core functions are immune homeostasis, which recovers to a normal state after the maximal immune response occurs, and self-tolerance, which does not respond to autologous tissues. When CD4 + CD25 + Treg cells grown in vitro are transplanted into the body, various pathological changes are prevented, and in particular, Graft versus Host Disease (GvHD) is known to be a very suitable disease for clinical application of regulatory T cells. have. Cytotoxic T cells are cells that kill virus-infected cells or tumor cells by secreting cytotoxic substances such as granzyme and perforin. It is also called CD8 T cell because it has CD8 protein on the cell surface. In contrast to helper T cells, it mediates cellular immunity to eliminate virus and cancer cells. Natural killer T cells are one of the effective T cells that are distributed in a smaller proportion than auxiliary T cells and cytotoxic T cells, and have the same T cell receptor (TCR) as T cells on the surface, but NK1.1 It also has a natural killer cell-specific molecule such as. Natural killer T cells secrete gamma interferon, interleukin-4 (IL-4), and interleukin-10 (IL-10) to regulate the immune response. Memory T cells refer to cells that have the potential to function as effective T cells by being activated for a long time after antigen-recognizing T cells undergo differentiation and selection process, and then when the antigen reinvades later, they are rapidly activated. Non-contact T cells meet antigens and activated cells, or effective T cells, are affected by interleukin-7 (IL-7) and interleukin-15 (IL-15) to differentiate into long-lived memory T cells.

면역 시스템에서 항원에 대한 면역 반응으로 증식되었던 림프구들은 면역 반응이 종결된 이후에는 세포사멸(apoptosis)을 통해 항상성(homeostasis)을 회복한다. 활성화된 림프구들에서는 사멸 수용체(death receptor)의 발현이 높게 나타므로 림프구들은 세포사멸(apoptosis)에 매우 민감하게 작용한다. 조절 T 세포 역시 세포사멸 신호(apoptosis signal)에 민감하게 반응하며, 세포사멸 신호의 변화는 조절 T 세포의 생존 여부와 높은 관련성이 있다.Lymphocytes that have proliferated by an immune response to an antigen in the immune system recover homeostasis through apoptosis after the immune response is terminated. In activated lymphocytes, the expression of death receptors is high, so lymphocytes act very sensitively to apoptosis. Regulatory T cells are also sensitive to apoptosis signals, and changes in apoptosis signals are highly related to the survival of regulatory T cells.

본 연구에서는 포스포리파아제 A2(PLA2)를 처리한 면역세포에서 세포사멸 신호(apoptotic signaling)의 변화를 알아보고자 봉독 유래의 PLA2(bvPLA2)를 처리한 후 caspase-3와 Annexin V 모두에 양성인 초기 사멸 세포(early apoptotic cell)를 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석하였다. 또한 세포사멸(apoptosis)의 초기 과정을 시작시키는 caspase-3의 활성화 정도를 웨스턴 블롯(Western Blot)으로 분석하였다. 추가적으로 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 CTLA-4와 PD-1의 발현 정도를 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석한 결과 유의성 있는 결과를 도출하였다.In this study, in order to investigate the changes in apoptosis signaling in immune cells treated with phospholipase A2 (PLA2), an initial death positive for both caspase-3 and Annexin V after treatment with PLA2 (bvPLA2) derived from bee venom. Cells (early apoptotic cells) were analyzed by Flow Cytometry. In addition, the degree of activation of caspase-3, which initiates the initial process of apoptosis, was analyzed by Western Blot. In addition, the expression levels of CTLA-4 and PD-1, which inhibit apoptosis, were analyzed by flow cytometry, resulting in significant results.

즉, 본 발명은 포스포리파아제 A2(PLA2)에 의한 T 세포의 조절 메커니즘으로 암, 퇴행성 질환, 뇌 질환 및 면역 관련 질환 등 인간의 거의 모든 질환에 관여하는 T 세포의 세포사멸 억제 효과에 관한 것이다.That is, the present invention relates to an effect of inhibiting apoptosis of T cells involved in almost all diseases of humans, such as cancer, degenerative diseases, brain diseases, and immune related diseases, as a regulatory mechanism of T cells by phospholipase A2 (PLA2). .

본 연구에서는 포스포리파아제 A2(PLA2)가 T 세포의 세포사멸을 조절하는지 확인하고, 특히 PLA2가 T 세포를 증가시키는 것이 세포사멸(apoptosis)과 관련이 있는지 알아보았다. 또한, 세포사멸 초기단계(early apoptosis)에 PLA2가 미치는 영향을 확인하기 위해 유동세포분석(flow cytometry)을 수행하였고, 마우스 췌장세포에 PBS와 PLA2 처리 후 anti-CD3/anti-CD28 항체와 같이 72시간 동안 배양한 후 T 림프구 중 세포사멸한 세포의 수 및 초기상태의 세포사멸한 세포 수를 측정하였다. 세포사멸(apoptosis)의 초기 과정을 시작시키는 caspase-3의 활성화에 대한 영향을 확인하기 위하여 웨스턴 블롯(Western Blot)을 수행하였으며, 추가적으로 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 CTLA-4와 PD-1의 발현 정도를 유동세포분석(flow cytometry)하였다.In this study, we examined whether phospholipase A2 (PLA2) regulates T cell apoptosis, and specifically, whether PLA2 increases T cells is related to apoptosis. In addition, flow cytometry was performed to determine the effect of PLA2 on early apoptosis, and mouse pancreatic cells were treated with PBS and PLA2, followed by anti-CD3/anti-CD28 antibodies. After incubation for a period of time, the number of apoptotic cells among T lymphocytes and the number of apoptotic cells in the initial state were measured. Western blot was performed to confirm the effect on the activation of caspase-3, which initiates the initial process of apoptosis, and additionally, CTLA-4 and PD-1 inhibited apoptosis. The expression level was analyzed by flow cytometry.

그 결과, 본 발명의 PLA2를 처리한 실험군에서 세포사멸 초기단계의 T 세포가 현저하게 감소하였고, PLA2를 처리한 실험군에서 caspase-3의 활성화가 극적으로 감소하였으며, 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 단백질인 CTLA-4와 PD-1이 상당히 증가하였다. 또한, 세포사멸의 마커인 Foxp3, Helios의 발현이 증가하는 것으로 보아 결과적으로 PLA2가 세포사멸(apoptosis)을 억제하여 T 세포를 증가시킴으로써 암, 퇴행성 질환, 뇌 질환 및 면역 관련 질환에 보호 효과가 있는 것을 확인하였다.As a result, in the experimental group treated with PLA2 of the present invention, T cells at the initial stage of apoptosis were significantly reduced, and in the experimental group treated with PLA2, the activation of caspase-3 was dramatically reduced, and apoptosis was inhibited. The proteins CTLA-4 and PD-1 were significantly increased. In addition, as the expression of Foxp3 and Helios, which are markers of apoptosis, is increased, as a result, PLA2 inhibits apoptosis and increases T cells, which has a protective effect on cancer, degenerative diseases, brain diseases and immune-related diseases. Confirmed.

상기한 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 In vitro 상에서 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 조절하는 방법을 제공한다.In order to solve the above problems, the present invention provides a method of controlling apoptosis of T cells by treating phospholipase A2 (PLA2) in vitro.

또한, 본 발명은 In vitro 상에서, 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inhibiting apoptosis of T cells by treating phospholipase A2 (PLA2) in vitro, thereby inhibiting apoptosis of T cells.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+CD25+ 조절 T 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the T cells may be CD4 + CD25 + regulatory T cells, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+CD25- 작용 T 세포인 것인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the T cell is CD4 + CD25 -, but can be characterized in that that the functional T cell is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포인 것인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In an embodiment of the present invention, the T cells may be CD8 + cytotoxic T cells, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포사멸은 세포사멸 초기단계인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the apoptosis may be characterized in that the initial stage of apoptosis, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 caspase-3 또는 cytochrome C의 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the method may be characterized by reducing the activation of caspase-3 or cytochrome C, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 세포사멸 마커인 Foxp3, PD-1, CTLA-4 및 Helios 중 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the method may be characterized by increasing the expression of any one or more of Foxp3, PD-1, CTLA-4, and Helios, which are apoptosis markers, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 포함하는, T 세포의 세포사멸 억제용 배지 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a medium composition for inhibiting apoptosis of T cells, including phospholipase A2 (PLA2).

또한, 본 발명은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 개체에 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of inhibiting apoptosis of T cells by treating an individual with phospholipase A2 (PLA2).

마지막으로, 본 발명은 상기의 방법에 따라 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)가 세포사멸을 억제하여 T 세포를 증가 시킴으로써 면역 항상성 조절, 자가면역질환 억제, 알러지 억제 등의 다양한 면역관련 질환 및 암, 퇴행성 질환, 뇌 질환 예방 또는 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다.Finally, the present invention provides various immune-related diseases such as immune homeostasis control, autoimmune disease suppression, allergy suppression, etc. by increasing T cells by inhibiting apoptosis by phospholipase A2 (PLA2) according to the above method. It is expected to be effective in preventing or treating cancer, degenerative diseases, and brain diseases.

본 발명은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)에 의한 T 세포의 조절 메커니즘으로 면역반응에 중요한 역할을 하는 T 림프구의 세포사멸(apoptosis) 억제 효과에 관한 것으로써, In vitro 상에서 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여 T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제함으로써 T 세포를 증가시키는 효과가 있는바, 다양한 면역질환 또는 암, 퇴행성 질환, 뇌질환의 치료 및 예방에 효과적이므로 이의 관련 산업에 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to an effect of inhibiting apoptosis (apoptosis) of T lymphocytes, which plays an important role in the immune response as a regulatory mechanism of T cells by phospholipase A2 (PLA2). In vitro, phospholipase A2 (phospholipase A2, PLA2) is effective in inhibiting apoptosis of T cells, thereby increasing T cells.As it is effective in the treatment and prevention of various immune diseases or cancers, degenerative diseases, and brain diseases, its related It can be usefully used in industry.

도 1은 포스포리파아제 A2가 작용 T세포 및 조절 T세포의 세포사멸 수를 나타낸 도이다.
도 2는 포스포리파아제 A2가 조절 T 세포의 증가에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 포스포리파아제 A2가 조절 T 세포의 표현형에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 포스포리파아제 A2가 세포사멸에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 포스포리파아제 A2를 처리후 anti-CD3/anti-CD28 항체와 배양하여 세포사멸한 세포 수를 나타낸 도이다.
도 6은 포스포리파아제 A2에 의한 CD4+ T 세포의 세포사멸 억제 기작이 IL-2 의존적인 현상인지 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 7은 포스포리파아제 A2가 세포사멸 초기단계에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 포스포리파아제 A2를 처리후 anti-CD3/anti-CD28 항체와 배양하여 T 세포 중 초기단계의 세포사멸한 세포의 수를 나타낸 도이다.
도 9는 포스포리파아제 A2가 caspase-3의 활성화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 세포사멸에 따라 증가하는 cleaved caspase-3가 포스포리파아제 A2 처리로 감소함을 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도이다.
도 11은 포스포리파아제 A2가 PD-1 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 12는 포스포리파아제 A2가 CTLA-4 단백질의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 13은 조절 T 세포 관련 세포사멸의 마커인 Foxp3, PD-1, CTLA-4, Helios의 발현정도를 확인한 도이다.1 is a diagram showing the number of apoptosis of phospholipase A2 acting T cells and regulatory T cells.
2 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the increase of regulatory T cells.
3 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the phenotype of regulatory T cells.
4 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on apoptosis.
5 is a diagram showing the number of cells killed by culturing with anti-CD3/anti-CD28 antibody after treatment with phospholipase A2.
6 is a diagram showing the results of confirming whether the mechanism of inhibition of apoptosis of CD4 + T cells by phospholipase A2 is an IL-2 dependent phenomenon.
7 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the initial stage of apoptosis.
FIG. 8 is a diagram showing the number of T cells in the early stage of apoptosis by incubating with anti-CD3/anti-CD28 antibody after treatment with phospholipase A2.
9 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the activation of caspase-3.
10 is a diagram confirming through Western blot that cleaved caspase-3, which increases according to apoptosis, decreases by treatment with phospholipase A2.
11 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the expression of PD-1 protein.
12 is a diagram showing the effect of phospholipase A2 on the expression of CTLA-4 protein.
13 is a diagram confirming the expression levels of Foxp3, PD-1, CTLA-4, and Helios, which are markers of regulatory T cell-related apoptosis.

본 발명은 In vitro 상에서, 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 조절하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.An object of the present invention is to provide a method for controlling apoptosis of T cells by treating phospholipase A2 (PLA2) in vitro.

또한, 본 발명은 In vitro 상에서, 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method for inhibiting apoptosis of T cells by treating phospholipase A2 (PLA2) in vitro, thereby inhibiting apoptosis of T cells.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+CD25+ 조절 T 세포인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the T cells may be CD4 + CD25 + regulatory T cells, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD4+CD25- 작용 T 세포인 것인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the T cell is CD4 + CD25 -, but can be characterized in that that the functional T cell is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포인 것인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In an embodiment of the present invention, the T cells may be CD8 + cytotoxic T cells, but are not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 세포사멸은 세포사멸 초기단계인 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the apoptosis may be characterized in that the initial stage of apoptosis, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 caspase-3 또는 cytochrome C의 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the method may be characterized by reducing the activation of caspase-3 or cytochrome C, but is not limited thereto.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 방법은 세포사멸 마커인 Foxp3, PD-1, CTLA-4 및 Helios 중 어느 하나 이상의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.In one embodiment of the present invention, the method may be characterized by increasing the expression of any one or more of Foxp3, PD-1, CTLA-4, and Helios, which are apoptosis markers, but is not limited thereto.

또한, 본 발명은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 포함하는, T 세포의 세포사멸 억제용 배지 조성물을 제공한다.In addition, the present invention provides a medium composition for inhibiting apoptosis of T cells, including phospholipase A2 (PLA2).

또한, 본 발명은 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 개체에 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법을 제공한다.In addition, the present invention provides a method of inhibiting apoptosis of T cells by treating an individual with phospholipase A2 (PLA2).

마지막으로, 본 발명은 상기의 방법에 따라 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)가 세포사멸을 억제하여 T 세포를 증가 시킴으로써 면역 항상성 조절, 자가면역질환 억제, 알러지 억제 등의 다양한 면역관련 질환 및 암, 퇴행성 질환, 뇌 질환 예방 또는 치료에 효과가 있을 것으로 기대된다.Finally, the present invention provides various immune-related diseases such as immune homeostasis control, autoimmune disease suppression, allergy suppression, etc. by increasing T cells by inhibiting apoptosis by phospholipase A2 (PLA2) according to the above method. It is expected to be effective in preventing or treating cancer, degenerative diseases, and brain diseases.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 구현예로 본 발명을 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 구현 예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허 청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다.Hereinafter, the present invention will be described in detail as an embodiment of the present invention with reference to the accompanying drawings. However, the following implementation examples are presented as examples of the present invention, and when it is determined that a detailed description of a technique or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description may be omitted. However, the present invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of equivalents interpreted therefrom and description of the claims to be described later.

또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시 예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 “포함”한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.In addition, terms used in the present specification are terms used to properly express preferred embodiments of the present invention, which may vary according to the intention of users or operators, or customs in the field to which the present invention belongs. Therefore, the definitions of these terms should be made based on the contents throughout this specification. Throughout the specification, when a certain part "includes" a certain component, it means that other components may be further included rather than excluding other components unless otherwise stated.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 '%'는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (w/w) %, 고체/액체는 (w/v) %, 그리고 액체/액체는 (v/v) %이다.Throughout this specification, the'%' used to indicate the concentration of a specific substance is (w/w)% for solids/solids, (w/v)% for solids/liquids, and Liquid/liquid is (v/v) %.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 자세히 설명한다. 다만, 상기 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 예시로 제시되는 것으로, 당업자에게 주지 저명한 기술 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있고, 이에 의해 본 발명이 제한되지는 않는다. 본 발명은 후술하는 특허청구범위의 기재 및 그로부터 해석되는 균등 범주 내에서 다양한 변형 및 응용이 가능하다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the above embodiments and experimental examples are presented as examples of the present invention, and if it is determined that a detailed description of a technique or configuration well known to those skilled in the art may unnecessarily obscure the subject matter of the present invention, the detailed description thereof will be omitted. And the invention is not limited thereby. The present invention is capable of various modifications and applications within the scope of equivalents interpreted from the description of the claims to be described later and therefrom.

실시예 1. 실험의 준비 및 실험 방법Example 1. Preparation of experiment and experimental method

1.1 실험용 쥐의 준비 및 세포 배양1.1 Preparation of mice and cell culture

생후 생후 6~7주의 수컷 Foxp3EGFPC57BL/7 쥐를 The Jackson Lab.(Bar Harbor, ME, USA)으로부터 구매하였다. 모든 실험용 쥐에게 공조되고 병원체(pathogen) 없는 환경에서 12시간씩 낮/밤을 교대로 유지시켜 주었다. 또한 실험 기간 동안은 사료와 물을 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 모든 과정은 <Rules for Animal care>, <Guiding Principles for Experiment Using Animals>를 준수하여 수행되었다.Male Foxp3 EGFP C57BL/7 mice 6-7 weeks old were purchased from The Jackson Lab. (Bar Harbor, ME, USA). All experimental mice were kept alternately day/night for 12 hours in an air-conditioned and pathogen-free environment. In addition, feed and water were allowed to be freely ingested during the experiment. All procedures were performed in accordance with <Rules for Animal care> and <Guiding Principles for Experiment Using Animals>.

실험용 쥐를 흡입마취제(isoflurane)로 마취시킨 후 비장을 적출하여 40μm 세포 여과기(Corning, NY, USA)에 통과시켰다. 적혈구가 용해된 후에 비장세포를 인산완충 생리식염수(PBS)로 씻어내고 RPMI-1640 (WelGENE INC., 대구, 한국)에서 재부유시켰다. 배양액에는 10% FBS, 50 IU/ml 페니실린, 50 μg/ml 스트렙토마이신(Hyclone, Logan, UT, USA)이 첨가되었다. 비장세포에는 plate-bound CD3(5μg/ml)와 soluble CD28(2μg/ml) 단일클론항체(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)와 함께 0.4 μg/ml의 bvPLA2(Sigma-Aldrich, ST. Louis, MO, USA)를 처리하였다. 100nM 라파마이신(rapamycin)만 단독으로 처리한 세포군이 실험 대조군으로 준비되었다. 비장세포들을 37℃에서 72시간동안 배양시켰다.The experimental mice were anesthetized with an inhalation anesthetic (isoflurane), and the spleen was removed and passed through a 40 μm cell filter (Corning, NY, USA). After the red blood cells were dissolved, the splenocytes were washed with phosphate buffered saline (PBS) and resuspended in RPMI-1640 (WelGENE INC., Daegu, Korea). To the culture medium, 10% FBS, 50 IU/ml penicillin, and 50 μg/ml streptomycin (Hyclone, Logan, UT, USA) were added. In splenocytes, 0.4 μg/ml of bvPLA2 (Sigma-Aldrich, ST.Louis) with plate-bound CD3 (5 μg/ml) and soluble CD28 (2 μg/ml) monoclonal antibody (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) together with 0.4 μg/ml of bvPLA2 (Sigma-Aldrich, ST.Louis) , MO, USA). A cell group treated with only 100 nM rapamycin alone was prepared as an experimental control. Splenocytes were cultured at 37° C. for 72 hours.

1.2 유동세포분석(Flow Cytometry) 방법1.2 Flow Cytometry Method

배양된 세포들을 튜브에 분액시킨 후 stain buffer(BD Biosciences)에서 씻어내고 형광표지된 항체들과 함께 4℃에서 30분간 배양시켰다. anti-CD4-PE-Cy7, anti-CD25-APC-Cy7, anti-CD127-PE, anti-CD62L-APC, anti-CTLA-4-PE, 및 anti-PD-1-PE 항체들이 유동세포분석(Flow Cytometry)에 사용되었다. 세포사멸(Apoptosis) 여부를 확인하기 위하여 Annexin V-APC, PI, anti-activated caspase-3/7-FITC 항체(BD Biosciences)를 표지자로 사용하였다. 기기는 BD FACS Calibur flow cytometer(BD Biosciences)를 사용하였고, 통계분석은 FLOWJO software(Tree star, Ashland, OR, USA)를 이용하여 시행되었다.The cultured cells were separated into tubes, washed with stain buffer (BD Biosciences), and incubated at 4° C. for 30 minutes with fluorescently labeled antibodies. Anti-CD4-PE-Cy7, anti-CD25-APC-Cy7, anti-CD127-PE, anti-CD62L-APC, anti-CTLA-4-PE, and anti-PD-1-PE antibodies were analyzed by flow cytometry ( Flow Cytometry). Annexin V-APC, PI, and anti-activated caspase-3/7-FITC antibody (BD Biosciences) were used as markers to determine whether apoptosis was present. The instrument was a BD FACS Calibur flow cytometer (BD Biosciences), and statistical analysis was performed using FLOWJO software (Tree star, Ashland, OR, USA).

1.3 웨스턴 블롯(Western blot) 방법1.3 Western blot method

세포들을 Pro-PREP Protein Extraction Solution(iNtRON Biotechnology, 서울,한국)에서 용해시키고 4℃에서 30분간 유지하였다. 단백질 농도는 소혈청 알부민(BSA)을 기준값으로 하여, Bradford 방식을 이용해 측정하였다. 추출된 단백질 중 동일한 양을 SDS-PAGE 전기영동으로 분리하여, 니트로셀룰로오스 멤브레인(nitrocellulose membrane)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)으로 이동시켰다. 그 후 멤브레인(membrane) 전체에 3% 무지방 우유를 도포하고, 0.05% Tween-20이 함유된 PBS에서 실온으로 1시간동안 유지하였다. Cells were lysed in Pro-PREP Protein Extraction Solution (iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea) and maintained at 4° C. for 30 minutes. Protein concentration was measured using the Bradford method using bovine serum albumin (BSA) as a reference value. The same amount of the extracted protein was separated by SDS-PAGE electrophoresis and transferred to a nitrocellulose membrane (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Thereafter, 3% fat-free milk was applied to the entire membrane, and maintained at room temperature for 1 hour in PBS containing 0.05% Tween-20.

또한, caspase-3 항혈청(Cell Signaling, Boston, MA, USA)과 β-actin(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)을 각각 1:1000으로 희석하여 실온에서 2시간동안 배양하였다. 멤브레인(membrane)을 한번 세척한 후, 1:5000으로 희석된 2차 항체(horseradish peroxidase 부착)와 1시간동안 배양하였다. 또한 실험 대조군으로 동일한 멤브레인(membrane)을 β-actin 특이 항체를 이용하여 재측정하였다. 화학발광 시약(ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 사용하여 특정 밴드가 드러나도록 하였다.In addition, caspase-3 antiserum (Cell Signaling, Boston, MA, USA) and β-actin (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) were each diluted 1:1000 and incubated at room temperature for 2 hours. After washing the membrane once, it was incubated with a secondary antibody (attached to horseradish peroxidase) diluted 1:5000 for 1 hour. In addition, the same membrane (membrane) as an experimental control was re-measured using a β-actin specific antibody. A chemiluminescent reagent (ECL, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) was used to reveal specific bands.

1.4 조절 T 세포의 준비1.4 Preparation of regulatory T cells

비장 세포 중 CD4+CD25+ Treg 세포는 CD4+CD25+ Regulatory T Cell Isolation Kit(Miltenyi Biotec, USA)를 이용하여 magnetic-activated cell sorting(MACS) 방법으로 분리되었다. biotinylated antibody 혼합액과 anti-biotin magnetic beads를 이용하여 CD4+ T 세포를 우선 선별한 후, PE-labeled anti-CD25 antibody와 anti-PE magnetic beads를 이용하여 CD4+CD25+ T 세포를 선별하였다. 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석 결과 Treg 세포의 순도는 78% 이상으로 확인되었다.Among splenocytes, CD4 + CD25 + Treg cells were isolated by magnetic-activated cell sorting (MACS) using a CD4 + CD25 + Regulatory T Cell Isolation Kit (Miltenyi Biotec, USA). CD4 + T cells were first selected using a biotinylated antibody mixture and anti-biotin magnetic beads, and then CD4 + CD25 + T cells were selected using PE-labeled anti-CD25 antibody and anti-PE magnetic beads. As a result of analysis by flow cytometry, the purity of Treg cells was found to be 78% or higher.

1.5 통계 처리 방법1.5 How to process statistics

두 개 또는 둘 이상의 실험군에서 나온 비정규 분포 데이터에는 one-way Analysis of Variance(ANOVA) 분석과 Tukey’s Multiple Comparison test를 이용하거나, Prism 5.01 software(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)를 이용하여 Student’s t-test로 유의성 검증을 하였다. P<0.05인 경우 통계적으로 유의하다고 보았으며, 실험 결과는 평균 ± 평균의 표준편차(Standard error of mean, SEM)로 나타내었다.For nonnormal distribution data from two or more experimental groups, one-way Analysis of Variance (ANOVA) analysis and Tukey's Multiple Comparison test are used, or Prism 5.01 software (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA) is used. Significance was verified with Student's t-test. If P<0.05, it was considered statistically significant, and the experimental results were expressed as mean ± standard error of mean (SEM).

실시예 2. 포스포리파아제 A2가 조절 T세포(Treg)에 미치는 영향 확인Example 2. Confirmation of the effect of phospholipase A2 on regulatory T cells (Treg)

2.1 포스포리파아제 A2를 처리하지 않은 상태에서의 T 세포 세포사멸2.1 T cell apoptosis without phospholipase A2 treatment

실험에 사용된 포스포리파아제 A2(phospholipase A2)는 봉독 유래의 포스포리파아제 A2(bvPLA2)를 사용하여 이하 실험을 진행하였다. 실험에 앞서 bvPLA2를 처리하지 않은 상태에서의 T 세포 세포사멸의 수를 염색을 통해 측정해 보았다. 도 1에서 보는 것과 같이 (A)작용 T 세포 (Teff; CD4+CD25-)와 (B)조절 T 세포 (Treg; CD4+CD25+)의 염색을 통해 7-AAD와 Annexin V 모두 양성인 세포사멸 수가 조절 T 세포에서 2배이상 존재함을 확인하였고, (C)작용 T 세포 (Teff; CD4+CD25-)와 (D)조절 T 세포 (Treg; CD4+CD25+)의 염색을 통해 caspase-3와 Annexin V 모두 양성인 초기 세포사멸 수가 조절 T 세포에서 현저하게 증가함을 확인하였다.Phospholipase A2 (phospholipase A2) used in the experiment was the following experiment using phospholipase A2 (bvPLA2) derived from bee venom. Prior to the experiment, the number of T cell apoptosis without bvPLA2 treatment was measured through staining. Figure (A) functional T cell, as shown in 1 (Teff; CD4 + CD25 - ) and (B) regulatory T cells (Treg; CD4 + CD25 +) staining for 7-AAD and Annexin V can kill all cells positive with the was confirmed that the presence of two or more times in the regulatory T cells, (C) functional T cells;; and the caspase-3 through the dye of the (CD4 + CD25 + Treg) and (D) regulatory T cells (Teff CD4 + CD25) It was confirmed that the number of initial apoptosis positive for both Annexin V was remarkably increased in regulatory T cells.

2.2 포스포리파아제 A2가 CD42.2 Phospholipase A2 is CD4 ++ CD25CD25 ++ Foxp3Foxp3 ++ Treg 증가에 미치는 영향 Effect on Treg increase

bvPLA2가 Treg cells의 증식을 유도하는 효과를 확인하기 위하여 비장세포에 PBS, bvPLA2, 라파마이신(rapamycin)을 각각 처리한 후 72시간 후에 anti-CD4-PE-Cy7와 anti-CD25-APC-Cy7으로 표지한 후 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석하였다. Treg 세포를 식별하기 위하여 우선 전체 림프구 세포 중에서 CD4+ 세포를 프로그램에서 선택하고, 그 중에서 CD25+ 세포와 Foxp3+ 세포를 선별하여 결과를 도출하였다.To confirm the effect of bvPLA2 inducing the proliferation of Treg cells, splenocytes were treated with PBS, bvPLA2, and rapamycin, respectively, and 72 hours later, anti-CD4-PE-Cy7 and anti-CD25-APC-Cy7 were used. After labeling, it was analyzed by flow cytometry. In order to identify Treg cells, CD4 + cells were first selected in the program among all lymphocyte cells, and CD25 + cells and Foxp3 + cells were selected among them to derive results.

또한 라파마이신(rapamycin)이 실험실 환경에서 murine(쥣과의 동물)과 인간의 Foxp3+ Treg cells 증식을 촉진한다는 연구 결과를 토대로, 실험군의 정상적인 발현을 확인하기 위하여 라파마이신(rapamycin)을 처리한 실험 대조군을 준비하였다. In addition, based on the results of a study that rapamycin promotes the proliferation of murine (murine) and human Foxp3 + Treg cells in a laboratory environment, an experiment treated with rapamycin to confirm the normal expression of the experimental group. A control was prepared.

그 결과 도 2에서와 같이 CD4+CD25+Foxp3+ Treg cells은 PBS 처리군(A)에서 2.99%, 라파마이신(rapamycin) 처리군(B)에서 6.03%, bvPLA2를 처리군(C)에서 5.79%로, bvPLA2와 라파마이신(rapamycin)을 처리한 실험군에서 PBS 처리군보다 유의하게 높은 것으로 나타났고(p<0.05), bvPLA2 처리군과 라파마이신(rapamycin) 처리군 사이에는 큰 차이점이 없었다.As a result, as shown in FIG. 2, CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cells were 2.99% in the PBS-treated group (A), 6.03% in the rapamycin-treated group (B), and 5.79% in the bvPLA2-treated group (C). As a result, the experimental group treated with bvPLA2 and rapamycin was significantly higher than that of the PBS treatment group (p<0.05), and there was no significant difference between the bvPLA2 treatment group and the rapamycin treatment group.

실시예 3. 포스포리파아제 A2가 CD4Example 3. Phospholipase A2 is CD4 ++ CD25CD25 ++ Foxp3Foxp3 ++ Treg의 표현형에 미치는 영향 확인 Confirmation of effects on the phenotype of Tregs

CD4+CD25+Foxp3+ Treg cell은 CD62L(L-Selectin)과 CD127의 발현 정도에 따라 resting Treg(CD62LhiCD127low), activated effector Treg(CD62LlowCD127low), memory Treg(CD62LlowCD127hi)으로 구분할 수 있다. CD4 + CD25 + Foxp3 + Treg cells are resting Treg (CD62L hi CD127 low ), activated effector Treg (CD62L low CD127 low ), memory Treg (CD62L low CD127 hi ), depending on the level of expression of CD62L (L-Selectin) and CD127. Can be distinguished.

비장세포를 Treg cell 표현형 마커(CD4, CD25, Foxp3, CD62L, CD127)로 염색한 후 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석하였다. Splenocytes were stained with Treg cell phenotypic markers (CD4, CD25, Foxp3, CD62L, CD127) and then analyzed by flow cytometry.

실험 결과, 도 3(A)에서와 같이 resting Treg 비율은 bvPLA2(p<0.01)와 라파마이신(rapamycin)(p<0.001) 처리군에서 PBS 처리군에 비해 유의하게 증가하였고, 반면,도 3(B) 및 도 3(C)를 참조하면 effector Treg(p<0.05)과 memory Treg(p<0.01)의 비율은 bvPLA2 처리군에서 PBS 처리군에 비해 유의하게 감소하였다.As a result of the experiment, the resting Treg ratio was significantly increased in the bvPLA2 (p<0.01) and rapamycin (p<0.001) treatment group compared to the PBS treatment group, as shown in FIG. Referring to B) and FIG. 3(C), the ratio of effector Treg (p<0.05) and memory Treg (p<0.01) was significantly decreased in the bvPLA2 treatment group compared to the PBS treatment group.

실시예 4. 포스포리파아제 A2가 세포사멸(apoptosis)에 미치는 영향 확인Example 4. Confirmation of the effect of phospholipase A2 on apoptosis

bvPLA2가 T 세포의 세포사멸에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여 Annexin V-APC와 propidium iodide(PI) 염색을 이용하였다. Annexin V는 사멸세포(apoptotic cell)의 세포막 phosphatidic serin(PS)과 결합하고, PI 염색은 late-stage apoptotic cell과 necrotic cell에서 세포핵과 결합하므로, Annexin V와 PI를 동시에 이용하여 초기단계(early-stage)와 말기단계(late-stage)의 사멸세포(apoptotic cell)을 판별할 수 있다. Annexin V-APC and propidium iodide (PI) staining were used to determine how bvPLA2 affects T cell apoptosis. Annexin V binds to the cell membrane phosphatidic serin (PS) of apoptotic cells, and PI staining binds to the cell nucleus in late-stage apoptotic cells and necrotic cells, so Annexin V and PI are used at the same time. stage) and late-stage apoptotic cells can be identified.

(1) 실험 결과, 도 4에서와 같이 Annexin V와 PI 모두에 양성을 나타낸 Treg cell의 비율은 PBS 처리군(A)에서 6.55%, 라파마이신(rapamycin) 처리군(B)에서 6.59%, bvPLA2 처리군(C)에서 3.66%로 나타났다. Annexin V와 PI 모두에 양성을 나타낸 Treg cell의 숫자는 PBS 처리군과 라파마이신(rapamycin) 처리군보다 bvPLA2 처리군에서 매우 유의하게 적었다(p<0.01). 즉, bvPLA2를 처리한 군에서 apoptotic Treg cell의 절대적인 숫자와 비율 모두 감소함을 확인하였다.(1) As a result of the experiment, the proportion of Treg cells that showed positive for both Annexin V and PI as in FIG. 4 was 6.55% in the PBS-treated group (A), 6.59% in the rapamycin-treated group (B), and bvPLA2. It was found to be 3.66% in the treatment group (C). The number of Treg cells that were positive for both Annexin V and PI was significantly lower in the bvPLA2 treatment group than in the PBS treatment group and rapamycin treatment group (p<0.01). That is, it was confirmed that both the absolute number and ratio of apoptotic Treg cells decreased in the group treated with bvPLA2.

(2) 또한, 도 5에서와 같이 마우스 췌장세포를 PBS와 bvPLA2 처리 후 anti-CD3/anti-CD28 항체와 같이 72시간 동안 배양한 후 CD4+ T 림프구 중 세포사멸한 세포의 수를 측정한 결과, PI와 Annexin V 모두 양성인 세포사멸이 bvPLA2를 처리한 세포에서는 1.5배정도 감소함을 확인하였다.(2) In addition, as shown in FIG. 5, mouse pancreatic cells were cultured with anti-CD3/anti-CD28 antibody for 72 hours after treatment with PBS and bvPLA2, and the number of apoptotic cells among CD4 + T lymphocytes was measured. , It was confirmed that both PI and Annexin V positive apoptosis decreased by 1.5-fold in bvPLA2 treated cells.

(3) bvPLA2에 의한 CD4+ T 세포의 세포사멸 억제 기작이 IL-2 의존적인 현상인지 확인을 한 결과, 도 6에서와 같이 IL-2의 첨가에 비의존적으로 bvPLA2 처리군에서 세포사멸의 감소가 나타남을 확인할 수 있었다.(3) As a result of confirming whether the mechanism of inhibition of apoptosis of CD4 + T cells by bvPLA2 is an IL-2 dependent phenomenon, as shown in FIG. 6, reduction of apoptosis in the bvPLA2 treatment group independent of the addition of IL-2 It could be confirmed that appears.

실시예 5. 포스포리파아제 A2가 세포사멸 초기단계(early apoptosis)에 미치는 영향 확인Example 5. Confirmation of the effect of phospholipase A2 on early apoptosis

Caspase 활성화는 세포사멸(apoptosis)의 초기 단계에 필수적인 과정이다. apoptosis의 초기 과정에 bvPLA2가 관여하는지 확인하기 위하여 fluorogenic capase-3 substrate와 Annexin V - APC, 7-AAD(DNA bindig dye)로 형광 표지하여 유동세포분석법(Flow Cytometry)으로 분석하였다. 7-AAD에 음성인 세포를 선별한 후, caspase-3과 Annexin V 모두에 양성인 초기 사멸 세포(early apoptotic cell)를 측정하였다. Caspase activation is an essential process in the early stages of apoptosis. To confirm whether bvPLA2 is involved in the initial process of apoptosis, fluorescent labeling with fluorogenic capase-3 substrate, Annexin V-APC, and 7-AAD (DNA bindig dye) was analyzed by flow cytometry. After selecting cells negative for 7-AAD, early apoptotic cells positive for both caspase-3 and Annexin V were measured.

(1) 측정 결과 도 7에서와 같이 PBS 처리군(A)에서는 10.9%, 라파마이신(rapamycin) 처리군(B)에서는 5.88%, bvPLA2 처리군(C)에서는 0.15%로 관찰되었다. bvPLA2 처리군에서 초기 사명 세포(early apoptotic cell)가 PBS 처리군에 비해 통계적으로 매우 유의하게 감소하였다(p<0.01). 라파마이신(rapamycin) 처리군에서도 초기 사멸 세포(early apoptotic cell)의 감소가 확인되나, 통계적으로 유의한 정도는 아니었다.(1) Measurement result As shown in FIG. 7, 10.9% in the PBS-treated group (A), 5.88% in the rapamycin-treated group (B), and 0.15% in the bvPLA2-treated group (C) were observed. In the bvPLA2 treatment group, the number of early apoptotic cells was significantly significantly decreased compared to the PBS treatment group (p<0.01). The decrease in early apoptotic cells was also confirmed in the rapamycin-treated group, but it was not statistically significant.

(2) 도 8에서와 같이 마우스 췌장세포를 PBS와 bvPLA2 처리 후 anti-CD3/anti-CD28 항체와 같이 72시간 동안 배양한 후 CD4+ T 세포 중 초기상태의 세포사멸한 세포의 수를 측정한 결과, active caspase-3와 Annexin V 모두 양성인 초기 세포사멸이 bvPLA2를 처리한 세포에서는 현저히 감소하였다.(2) As shown in FIG. 8, mouse pancreatic cells were treated with PBS and bvPLA2 and cultured with anti-CD3/anti-CD28 antibody for 72 hours, and then the number of cells in the initial state of CD4+ T cells was measured. In addition, the initial apoptosis, both active caspase-3 and Annexin V, was significantly reduced in bvPLA2 treated cells.

실시예 6. 포스포리파아제 A2가 caspase-3의 활성화에 미치는 영향 확인Example 6. Confirmation of the effect of phospholipase A2 on the activation of caspase-3

(1) 세포사멸(Apoptosis)의 과정 중에서 caspase-3의 활성화는 핵심적인 메커니즘이다. caspase-3는 32 kDa의 단백질 가수분해성 전효소로서, 12 kDa 과 17 kDa의 서브유닛(subunit)으로 분할되면서 활성화된다. 실시예 4과 실시예 5에서 bvPLA2가 사멸세포(apoptotic cell)를 감소시키는 것을 확인한후, bvPLA2가 caspase-3의 활성화에도 영향을 미치는지 확인하기 위하여 비장세포에 bvPLA2를 처리하고 37℃ 실온에서 0, 1, 3, 6, 24, 72 시간동안 각각 배양하여 웨스턴 블롯(Western Blot) 방식으로 단백질 밴드를 측정하였다. (1) In the process of apoptosis, the activation of caspase-3 is a key mechanism. caspase-3 is a 32 kDa proteolytic preenzyme, which is activated by dividing into 12 kDa and 17 kDa subunits. After confirming that bvPLA2 decreases apoptotic cells in Examples 4 and 5, in order to confirm whether bvPLA2 also affects the activation of caspase-3, splenocytes were treated with bvPLA2 and 0 at 37°C at room temperature. Incubated for 1, 3, 6, 24, and 72 hours, respectively, and protein bands were measured by Western Blot.

그 결과, 도 9(A)에서와 같이 bvPLA2 처리군에서 caspase-3의 분할이 매우 현저히 감소된 것을 확인하였다. PBS 처리군에서는 caspase-3의 분할이 1시간(1h) 이후로 명확히 관찰되지만, bvPLA2 처리군에서는 24시간(24h) 이후의 결과부터 caspase-3의 분할이 관찰되었다. 또한, 도 9(B)는 상기 실험 방법에 따른 마우스 췌장세포의 웨스턴 블롯 결과로 PBS 처리한 정상군의 경우 배양 72간째에 Procaspase-3가 bvPLA2를 처리한군 보다 더욱 활성화 되는 것을 확인 할 수 있었다.As a result, it was confirmed that the splitting of caspase-3 was very significantly reduced in the bvPLA2 treatment group as shown in FIG. 9(A). In the PBS-treated group, the cleavage of caspase-3 was clearly observed after 1 hour (1h), but in the bvPLA2-treated group, the cleavage of caspase-3 was observed from the results after 24 hours (24h). In addition, FIG. 9(B) shows that in the case of the PBS-treated normal group as a result of Western blot of mouse pancreatic cells according to the above experimental method, Procaspase-3 was more activated than the bvPLA2-treated group at 72 hours of culture.

(2) 또한, 세포사멸에 따라 증가하는 cleaved caspase-3가 봉독 유래의 PLA2 처리로 감소함을 웨스턴 블롯(western blot)을 통해 확인하였다. Magnetic-bead로 분리한 작용 T 세포 (Teff; CD4+CD25-)와 조절 T 세포 (Treg; CD4+CD25+)를 anti-CD3/anti-CD28 항체와 같이 72시간 배양 후, 세포 사멸이 증가하는 것을 세포사멸 마커인 cleaved caspase-3와 cytochrome C을 통해 관찰하였다. 그 결과 도 10에서와 같이 봉독 유래의 PLA2를 처리하였을 때 cleaved caspase-3와 cytochrome C의 발현이 감소함을 확인 할 수 있었다. (2) In addition, it was confirmed through western blot that cleaved caspase-3, which increases with apoptosis, decreases by treatment with PLA2 derived from bee venom. A functional separation in Magnetic-bead T cells (Teff; CD4 + CD25 -) and regulatory T cells (Treg; CD4 + CD25 +) after 72 hours of incubation, as anti-CD3 / anti-CD28 antibody, that apoptosis increased This was observed through apoptosis markers cleaved caspase-3 and cytochrome C. As a result, it could be confirmed that the expression of cleaved caspase-3 and cytochrome C decreased when PLA2 derived from bee venom was treated as shown in FIG. 10.

실시예 7. 포스포리파아제 A2가 세포사멸 마커의 발현에 미치는 영향 확인Example 7. Confirmation of the effect of phospholipase A2 on the expression of apoptosis markers

T 세포의 CTLA-4와 PD-1 단백질은 T 세포의 활성을 억제하는 억제 수용기(inhibitory receptor)들이다. bvPLA2가 이들 억제성 단백질의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여 anti-CD4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CTLA-4 antibody, anti-PD-1 antibody 염색을 이용하여 유동세포 분석(Flow Cytometry)을 하였다. The CTLA-4 and PD-1 proteins of T cells are inhibitory receptors that inhibit the activity of T cells. Flow Cytometry was performed using anti-CD4 antibody, anti-CD25 antibody, anti-CTLA-4 antibody, and anti-PD-1 antibody staining to determine the effect of bvPLA2 on the expression of these inhibitory proteins. I did.

실험 결과, 도 11 및 도 12에서와 같이 PBS 처리군의 PD-1이 9.07%, CTLA-4가 1.59%였고, bvPLA2 처리군의 PD-1이 20.4%, CTLA-4가 3.81%로 확인되었다. 즉, bvPLA2 처리군에서 CD4+CD25+ Treg cell에서의 PD-1(p<0.05) 과 CTLA-4(p<0.05) 발현이 유의하게 증가하였다. 도 13에서는 조절 T 세포 관련 세포사멸의 마커인 Foxp3, PD-1, CTLA-4, Helios의 발현정도를 확인한 결과로, 조절T세포 관련 세포사멸 마커 모두 bvPLA2를 처리하였을 때 정상보다 증가하는 경향을 나타냄을 확인하였다.As a result of the experiment, as shown in FIGS. 11 and 12, PD-1 of the PBS-treated group was 9.07% and CTLA-4 was 1.59%, and PD-1 of the bvPLA2-treated group was 20.4%, and CTLA-4 was 3.81%. . That is, the expression of PD-1 (p<0.05) and CTLA-4 (p<0.05) in CD4 + CD25 + Treg cells was significantly increased in the bvPLA2 treatment group. In Figure 13, as a result of confirming the expression levels of Foxp3, PD-1, CTLA-4, and Helios, which are markers of regulatory T cell-related apoptosis, all of the regulatory T cell-related apoptosis markers tend to increase from normal when bvPLA2 is treated. It was confirmed to appear.

따라서 본 발명을 통해 봉독(bee venom) 유래의 유효물질 포스포리파아제 A2(PLA2)에 의한 T 세포의 조절 메커니즘으로 면역반응에 중요한 역할을 하는 T 림프구의 세포사멸(apoptosis) 억제함으로써 T 세포를 증가시키는 방법을 확인 하였다.Therefore, through the present invention, T cells are increased by suppressing apoptosis of T lymphocytes, which play an important role in the immune response as a regulatory mechanism of T cells by phospholipase A2 (PLA2), an effective substance derived from bee venom. Confirmed how to make.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시 예들을 중심으로 살펴보았다.So far, the present invention has been looked at around its preferred embodiments.

본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시 예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구 범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.Those of ordinary skill in the art to which the present invention pertains will be able to understand that the present invention can be implemented in a modified form without departing from the essential characteristics of the present invention. Therefore, the disclosed embodiments should be considered from an illustrative point of view rather than a limiting point of view. The scope of the present invention is shown in the claims rather than the above description, and all differences within the scope equivalent thereto should be construed as being included in the present invention.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyunghee Unversity <120> Method of controlling the apoptosis of T cells, by the phospholipase A2 <130> PN1905-280 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation of Kyunghee Unversity <120> Method of controlling the apoptosis of T cells, by the phospholipase A2 <130> PN1905-280 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 134 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130 <210> 2 <211> 134 <212> PRT <213> Apis mellifera <400> 2 Ile Ile Tyr Pro Gly Thr Leu Trp Cys Gly His Gly Asn Lys Ser Ser 1 5 10 15 Gly Pro Asn Glu Leu Gly Arg Phe Lys His Thr Asp Ala Cys Cys Arg 20 25 30 Thr His Asp Met Cys Pro Asp Val Met Ser Ala Gly Glu Ser Lys His 35 40 45 Gly Leu Thr Asn Thr Ala Ser His Thr Arg Leu Ser Cys Asp Cys Asp 50 55 60 Asp Lys Phe Tyr Asp Cys Leu Lys Asn Ser Ala Asp Thr Ile Ser Ser 65 70 75 80 Tyr Phe Val Gly Lys Met Tyr Phe Asn Leu Ile Asp Thr Lys Cys Tyr 85 90 95 Lys Leu Glu His Pro Val Thr Gly Cys Gly Glu Arg Thr Glu Gly Arg 100 105 110 Cys Leu His Tyr Thr Val Asp Lys Ser Lys Pro Lys Val Tyr Gln Trp 115 120 125 Phe Asp Leu Arg Lys Tyr 130

Claims (7)

In vitro 상에서,
포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법.In vitro,
A method of inhibiting apoptosis of T cells by treatment with phospholipase A2 (PLA2). 제1항에 있어서,
상기 세포사멸은 세포사멸 초기단계인 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 1,
The apoptosis is characterized in that the initial stage of apoptosis, the method. 제1항에 있어서,
상기 방법은 카스파제-3(caspase-3)의 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 1,
The method, characterized in that it reduces the activation of caspase-3 (caspase-3). 제1항에 있어서,
상기 방법은 시토크롬 C(cytochrome C)의 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 1,
The method, characterized in that it reduces the activation of cytochrome C. 제1항에 있어서,
상기 방법은 세포사멸 마커인 Foxp3, PD-1, CTLA-4 및 Helios 중 어느 하나 이상의 마커의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 방법.The method of claim 1,
The method is characterized in that to increase the expression of any one or more of the apoptosis markers Foxp3, PD-1, CTLA-4 and Helios. 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 포함하는, T 세포의 세포사멸 억제용 배지 조성물.A medium composition for inhibiting apoptosis of T cells, comprising phospholipase A2 (PLA2). 포스포리파아제 A2(phospholipase A2, PLA2)를 개체에 처리하여, T 세포의 세포사멸(apoptosis)을 억제하는 방법.
A method of inhibiting T cell apoptosis (apoptosis) by treating an individual with phospholipase A2 (PLA2).
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