KR20210005145A - 인테그린 표적화 리간드 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20210005145A
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전 리
제프리 칼슨
앤소니 니콜라스
샤오카이 리
동쉬 수
매튜 파울러-워터스
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애로우헤드 파마슈티컬스 인코포레이티드
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Abstract

인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물, 이들 화합물의 합성, 및 인테그린을 발현하는 세포로의 화물 분자의 전달을 용이하게 하는 리간드로서의 이들 화합물의 용도가 기재된다. 기재된 인테그린 표적화 리간드는 혈청 안정성 및 αvβ3 인테그린 및/또는 αvβ5 인테그린에 대한 친화도를 갖고, 화물 분자, 예컨대 올리고뉴클레오티드-기반 치료제 (예를 들어, RNAi 작용제)에 접합되어 인테그린 αvβ3, 인테그린 αvβ5, 또는 인테그린 αvβ3 및 인테그린 αvβ5 둘 다를 발현하는 세포 및 조직, 예컨대 종양 세포로의 화물 분자의 전달을 용이하게 하는데 적합하다. 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물 및 사용 방법이 또한 기재된다.

Description

인테그린 표적화 리간드 및 그의 용도
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/663,763, 및 2019년 1월 9일에 출원된 62/790,372를 우선권 주장하며, 이는 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
발명의 분야
인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물, 이러한 화합물의 합성 방법, 및 화물 분자를 생체내 전달하기 위한 리간드로서의 이러한 화합물의 용도가 본원에 개시된다.
인테그린은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호작용을 매개하는 막횡단 당단백질이다. 인테그린 알파-v 베타-3 (αvβ3) 및 알파-v 베타-5 (αvβ5)는 부착 분자의 인테그린 슈퍼패밀리의 구성원이고, 세포외 매트릭스 (ECM) 단백질 비트로넥틴에 대한 수용체인 것으로 공지되어 있다 (Horton, MA, 29(5) Int. J. Biochem. Cell Biol. 721-725 (1997)). 인테그린 αvβ3 및 인테그린 αvβ5를 포함한 특정 인테그린의 변경된 발현은 종양 진행, 침습, 및 전이의 원인이 되는 것으로 여겨진다.
실제로, 인테그린 αvβ3 및 αvβ5를 포함한 인테그린의 과다발현이 많은 종양 세포에서 보고되어 있다 (Desgrosellier, JS et al., Nat Rev Cancer, 10(1):9-22 (2010)). αvβ3의 길항제 (및 보다 적은 정도로 αvβ5의 길항제)는 변경된 인테그린 기능과 연관된 다양한 질환에서의 사용에 대해 고려되고 있다. 예를 들어, αvβ3 수용체의 억제가 혈관신생을 억제하여 종양 성장에 필요한 것으로 여겨지는 새로운 혈관의 형성을 막는 것으로 나타났기 때문에, 잠재적 암 치료로서 αvβ3 억제제를 개발하고자 하는 시도가 이루어졌다 (예를 들어, 문헌 [Brooks et al., 79 Cell 1157-1164 (1994); Mas-Moruno et al., Anticancer Agents Med Chem, 10(10):753-768] 참조). 그러나, αvβ3 억제제의 하나의 주요 예인 길항제 실렌기티드(Cilengitide)는 교모세포종을 갖는 환자에서 종양 혈관신생 및 진행을 제한하는 것을 목표로 한 임상 시험에서 비-효과적인 것으로 밝혀졌다 (예를 들어, 문헌 [Ley et al., Integrin-based Therapeutics: Biological Basis, Clinical Use and New Drugs, 15(3) Nat. Rev. Drug Discov. 173-183 (2016)] 참조).
일반적으로, 치료상 유효한 제약 화합물 또는 활성 제약 성분을 포함하는 화물 분자를 목적하는 세포 및/또는 조직으로 생체내 전달하는 것은 치료상 실행가능한 약물 제품의 개발에 있어서 계속해서 일반적 도전과제가 되고 있다. 특정 세포 및 조직에 대해 친화도를 갖고/거나 그에 선택적으로 결합할 수 있는 안정하고 효과적인 표적화 화합물에 대한 필요는 계속해서 존재하며, 이는 치료 화물 분자를 그러한 특정 세포 또는 조직으로 전달하는 것을 용이하게 하기 위한 리간드로서 이용 또는 활용될 수 있다. 또한, 인테그린 알파-v 베타-3을 선택적으로 표적화할 수 있고, 화물 분자에 접합되어 화물 분자를 이러한 인테그린을 발현하는 세포, 예컨대 종양 세포로 생체내 전달하기에 적합한 화합물에 대한 구체적 필요가 존재한다. 특히 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드-기반 치료제 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제)를 위한, 인테그린 알파-v 베타-3 및/또는 인테그린 알파-v 베타-5를 표적화하고, 이들 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 이러한 인테그린을 발현하는 세포로 전달하는 것을 용이하게 할 수 있는 리간드에 대한 계속적인 필요가 존재한다.
αvβ3 및 αvβ5를 포함한 특정 인테그린에 대해 친화도를 갖는 화합물이 본원에 기재되며, 이는 화합물 또는 그에 부착된 다른 분자를 인테그린 αvβ3 및/또는 αvβ5를 발현하는 세포 또는 조직으로 선택적으로 지시하기 위한 리간드 (본원에서 "인테그린 표적화 리간드", "αvβ3 인테그린 표적화 리간드", "αvβ3 인테그린 리간드", 또는 간단히 "인테그린 리간드"로 지칭됨)로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 혈청에서 안정하고, 이들 인테그린에 대해 친화도를 갖고, 그에 특이적으로 결합할 수 있다. 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 인테그린 αvβ3 및/또는 αvβ5를 발현하는 세포 또는 조직으로의 화물 분자(들)의 전달을 용이하게 하기 위해 화물 분자(들)에 접합될 수 있다.
또 다른 측면에서, 1개 이상의 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 화물 분자를 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5을 발현하는 조직 및/또는 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 기재된다. 추가로, 1개 이상의 치료 화물 분자에 접합된 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, αvβ3 인테그린 및/또는 αvβ5 인테그린을 발현하는 세포로 치료 화물 분자 (예를 들어, 활성 제약 성분)를 전달하는 것이 대상체를 치료할 수 있는 질환, 증상, 또는 장애를 갖는 대상체를 치료하는 방법이 본원에 개시된다.
추가로, 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 치료제, 예컨대 RNAi 작용제에 접합된 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 접합체의 유효량을 세포에 투여하는 것을 포함하는, 시험관내 또는 생체내 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 기재된다. 일부 실시양태에서, 대상체의 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제하는 방법이 본원에 기재되며, 여기서 대상체에게 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 접합된 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 치료제 (예컨대 RNAi 작용제)의 유효량이 투여된다.
또 다른 측면에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물이 본원에 기재된다. 본원에 기재된 조성물은 1개 이상의 치료 화물 분자, 예컨대 RNAi 작용제 또는 다른 화물 분자 또는 치료 물질에 접합된 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 제약 조성물 또는 의약일 수 있다.
일부 실시양태에서, 인테그린 αvβ3을 발현하는 세포에서 표적 유전자의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 기재되며, 여기서 방법은 유효량의 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제약 조성물은 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 접합된, 표적화된 유전자의 발현을 억제할 수 있는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 치료제, 예컨대 RNAi 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 종양 세포에서 표적 유전자의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 기재되며, 여기서 방법은 유효량의 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제약 조성물은 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 접합된, 표적화된 유전자의 발현을 억제할 수 있는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 치료제, 예컨대 RNAi 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 신장 종양 세포, 예컨대 투명 세포 신암종 종양 세포에서 표적 유전자의 발현에 의해 적어도 부분적으로 매개되는 질환 또는 장애를 갖는 대상체의 치료 방법이 본원에 기재되며, 여기서 방법은 유효량의 제약 조성물을 그를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 제약 조성물은 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 접합된, 표적화된 유전자의 발현을 억제할 수 있는 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 치료제, 예컨대 RNAi 작용제를 포함한다.
제1 측면에서, 본 개시내용은 합성 인테그린 표적화 리간드를 제공한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00001
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
X는 -C(R3)2-, -NR3-,
Figure pct00002
이고;
Y는 임의로 치환된 C1-C8 알킬렌이고;
Z는 O, NR3, 또는 S이고;
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드 중 임의의 것은 화물 분자, 반응성 기, 및/또는 보호된 반응성 기에 연결될 수 있다. 반응성 기에의 연결은, 예를 들어, 인테그린 표적화 리간드를 화물 분자에 접합시키는 것을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 αvβ3 인테그린 및/또는 αvβ5 인테그린을 포함한 인테그린을 발현하는 세포로 화물 분자를 표적화하는 것을 증가시킬 수 있다. 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 화합물, 전구약물, 또는 공지된 치료 이익을 갖는 또 다른 물질일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제), 천연 또는 변형된 핵산, 펩티드, 압타머, 중합체, 폴리아민, 단백질, 독소, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단일 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분 또는 전구약물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 올리고뉴클레오티드-기반 치료제, 예컨대 안티센스 화합물 또는 RNAi 작용제이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분인 올리고뉴클레오티드-기반 화합물이거나 또는 이를 포함한다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 성분인 RNAi 작용제이거나 또는 이를 포함한다.
화물 분자를 인테그린을 발현하는 세포로 표적화하고 전달하기 위한, 기재된 αvβ3/5 인테그린 표적화 리간드의 용도가 본원에 기재된다. 화물 분자는 세포로 시험관내, 계내, 생체외, 또는 생체내 전달될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 인테그린 표적화 리간드 중 1개 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물은 세포로 생체내 전달될 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 1개 이상의 RNAi 작용제를 포함한다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제를 세포로 생체내 전달하기 위한 조성물이 본원에 기재되며, 여기서 RNAi 작용제는 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드에 연결된다.
1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물이 기재된다. 일부 실시양태에서, 조성물은 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물은 1개 이상의 다른 제약 물질 또는 제약 활성 성분 또는 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 의약이 본원에 기재된다.
본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물은, 예를 들어 투명 세포 신암종 종양 세포 (예를 들어, A498), 다른 신장암 세포 (예를 들어, ACHN, CAKI-2, 769-P, 786-O), 흑색종 세포 (예를 들어, A375), 교모세포종 세포 (예를 들어, U87MG), 췌장암 세포 (예를 들어, (PANC-1), 폐암 세포 (예를 들어, H460, H661, H1573, H2126), 결장암 세포 (예를 들어, HT29, HCT116), 간암 세포 (예를 들어, Hep2G, Hep3B), 유방암 세포 (예를 들어, MCF7, SK-BR3), 전립선암 세포 (예를 들어, DU145, PC3, LNCaP, MDA-PCa-2b), 구강암 세포 (예를 들어, KB), 설암 세포 (예를 들어, CAL27, SCC9), 인두암 세포 (예를 들어, 디트로이트562), 및/또는 난소암 세포 (예를 들어, OVCAR3, SKOV3, A2780) 및/또는 다른 환자 유래 이종이식편을 포함한 다양한 암 세포로 생체내 또는 시험관내 전달될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본원에 기재된 바와 같은 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드 및/또는 조성물의 사용을 포함하는 방법, 및 원하는 경우에, 개시된 인테그린 표적화 리간드 및/또는 조성물을 제약 제품으로서 투여하기에 적합한 형태가 되도록 하는 방법을 제공한다. 다른 실시양태에서, 개시내용은 본원에 기재된 리간드 및 조성물, 예를 들어 의약의 제조 방법을 제공한다.
1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물은, 예를 들어 피하, 정맥내, 종양내, 흡입 (에어로졸 또는 건조 분말 제제), 비강내, 복강내, 피내, 경피, 경구, 설하, 또는 국소 투여를 포함한, 투여하고자 하는 화물 분자를 고려하여 이러한 투여에 적합한 것으로 관련 기술분야에 공지된 투여 경로를 사용하여 대상체에게 생체내 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 조성물은 전신 전달을 위해, 예를 들어 정맥내 또는 피하 투여에 의해 투여될 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자에 접합된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 1개 이상의 목적하는 화물 분자(들)를 투명 세포 신암종 종양 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 종양 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 RNAi 작용제에 접합된 1개 이상의 인테그린 표적화 리간드를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, RNAi 작용제를 종양 세포로 생체내 전달하는 방법이 본원에 개시된다. 일부 실시양태에서, αvβ3 인테그린 및/또는 αvβ5 인테그린에 대해 친화도를 갖는 1개 이상의 리간드에 접합된 RNAi 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 투명 세포 신암종 종양 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법이 본원에 개시된다.
본 발명의 다른 목적, 특색, 측면 및 이점은 하기의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이다.
인테그린 표적화 리간드
인테그린에 대해 친화도를 갖고, 생체내 혈청 안정성을 나타내고, 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5와 같은 인테그린을 발현하는 세포 및/또는 조직으로의 화물 분자의 전달을 용이하게 하는 리간드로서 사용될 수 있는 화합물이 본원에 기재된다. 인테그린 표적화 리간드는 인테그린을 발현하는 세포를 시험관내, 계내, 생체외, 및/또는 생체내 표적화하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는, 화물 분자를 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5를 포함한 인테그린을 발현하는 세포 또는 조직으로 우선적으로 지시하고 표적화하기 위해, 1개 이상의 화물 분자에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 제약 활성 화합물을 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 화물 분자는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제를 포함하거나 또는 이로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 화물 분자를 종양 세포로 생체내 지시하기 위해 화물 분자에 접합된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 화물 분자를 투명 세포 신암종 종양 세포로 생체내 지시하기 위해 화물 분자에 접합된다.
화학식 I
한 측면에서, 본 발명은 하기 구조의 인테그린 리간드를 제공하며:
Figure pct00003
여기서,
X는 -C(R3)2-, -NR3-,
Figure pct00004
이고;
Y는 임의로 치환된 알킬렌이고;
Z는 O, NR3, 또는 S이고;
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 I의 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00005
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00006
는 부착 지점을 나타내고, CM은 화물 분자를 포함한다.
화학식 I의 일부 실시양태에서, Y는 C1 내지 C6 알킬렌이다.
화학식 II
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00007
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1 또는 R2 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 III
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00008
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
R3은 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 IV
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00009
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
R3은 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 V
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00010
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 VI
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00011
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
화학식 VII
화학식 I의 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 화학식의 구조:
Figure pct00012
또는 그의 제약상 허용되는 염을 포함하며, 여기서
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 R1, R4 및 R5 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
R1
화학식 I의 실시양태에서, R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함한다. 일부 실시양태에서, R1은
Figure pct00013
로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서
Figure pct00014
는 부착 지점을 나타내고, CM은 화물 분자를 포함한다.
인테그린 표적화 리간드 전구체
일부 실시양태에서, 본 발명은 인테그린 표적화 리간드를 화물 분자를 포함하는 모이어티에 부착시키는데 사용될 수 있는 인테그린 표적화 리간드 전구체를 제공한다. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 전구체가 본원에 제공되며:
Figure pct00015
여기서,
X는 -C(R3)2-, -NR3-,
Figure pct00016
이고;
Y는 임의로 치환된 알킬렌이고;
Z는 O, NR3, 또는 S이고;
n은 1 내지 8의 정수이고;
R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 반응성 기를 포함한다.
화학식 Ip의 화합물의 일부 실시양태에서, 반응성 기는 아지드를 포함한다.
화학식 I의 화합물
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기에 의해 나타내어진 구조 중 임의의 것을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 구조를 갖는다:
Figure pct00017
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
Figure pct00021
Figure pct00022
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10; 또는 1 내지 10, 2 내지 10, 1 내지 9, 1 내지 8, 1 내지 7, 1 내지 6, 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 1 내지 2, 2 내지 10, 3 내지 10, 4 내지 10, 5 내지 10, 2 내지 5, 2 내지 4, 또는 3 내지 5개)의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 화물 분자 중 임의의 것)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 초과의 인테그린 표적화 리간드 (예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 또는 30; 또는 1 내지 30, 1 내지 25, 1 내지 20, 1 내지 15, 1 내지 10, 1 내지 5, 5 내지 30, 5 내지 25, 5 내지 20, 5 내지 15, 5 내지 10, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 20, 10 내지 15, 15 내지 30, 15 내지 25, 15 내지 20, 20 내지 30, 20 내지 25, 또는 25 내지 30개의 인테그린 표적화 리간드)가 1개의 화물 분자 (예를 들어, 본원에 기재되거나 관련 기술분야에 공지된 화물 분자 중 임의의 것)에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 연결기, 예컨대 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기를 통해 1개 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 각각의 리간드에 대한 적어도 1개의 부착 지점 및 각각의 화물 분자에 대한 적어도 1개의 부착 지점을 포함하는 스캐폴드를 통해 1개 이상의 화물 분자에 임의로 접합된다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 1개의 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 리간드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 1개 초과의 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 리간드를 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 각각 본원에 개시된 바와 같은 구조 1a, 구조 2a, 구조 2.1a, 구조 2.2a, 구조 2.3a, 구조 2.4a, 구조 2.5a, 구조 2.6a, 구조 2.8a, 구조 2.9a, 구조 2.10a, 구조 2.11a, 구조 28a, 구조 29a, 구조 30a, 구조 31a, 구조 32a, 구조 33a, 구조 34a, 구조 36a, 구조 37a, 구조 38a, 구조 39a, 구조 40a, 및 구조 41a 중 임의의 것을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00023
일부 실시양태에서, 구조 1a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00024
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드 전구체는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00025
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00026
일부 실시양태에서, 구조 2a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00027
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00028
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00029
일부 실시양태에서, 구조 2.1a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00030
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00031
일부 실시양태에서, 구조 2.2a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00032
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00033
일부 실시양태에서, 구조 2.3a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00034
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00035
일부 실시양태에서, 구조 2.4a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00036
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00037
일부 실시양태에서, 구조 2.5a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00038
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00039
일부 실시양태에서, 구조 2.6a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00040
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00041
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00042
일부 실시양태에서, 구조 2.7a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00043
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00044
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00045
일부 실시양태에서, 구조 2.8a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00046
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00047
일부 실시양태에서, 구조 2.9a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00048
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00049
일부 실시양태에서, 구조 2.10a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00050
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00051
일부 실시양태에서, 구조 2.11a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00052
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00053
반응성 기 (또는 보호된 반응성 기)는 관심 분자, 예를 들어 화물 분자에 대한 (직접적으로의 또는 1개 이상의 스캐폴드 및/또는 링커를 통한) 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00054
일부 실시양태에서, 구조 28a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00055
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00056
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00057
일부 실시양태에서, 구조 29a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00058
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00059
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00060
일부 실시양태에서, 구조 30a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00061
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00062
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00063
일부 실시양태에서, 구조 31a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00064
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00065
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00066
일부 실시양태에서, 구조 32a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00067
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00068
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00069
일부 실시양태에서, 구조 33a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00070
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00071
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00072
일부 실시양태에서, 구조 34a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00073
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00074
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00075
일부 실시양태에서, 구조 36a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00076
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00077
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00078
일부 실시양태에서, 구조 37a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00079
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00080
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00081
일부 실시양태에서, 구조 38a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00082
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00083
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00084
일부 실시양태에서, 구조 39a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00085
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00086
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00087
일부 실시양태에서, 구조 40a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00088
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00089
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00090
일부 실시양태에서, 구조 41a의 인테그린 표적화 리간드는 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제(들))에 연결된다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함하며:
Figure pct00091
여기서 X는 반응성 기, 보호된 반응성 기, 또는 화물 분자 (예를 들어, RNAi 작용제)를 포함한다.
일부 실시양태에서, 인테그린 표적화 리간드는 아지드 반응성 기를 포함하도록 합성될 수 있고, 하기 구조를 포함한다:
Figure pct00092
구조 1c, 구조 2c, 구조 2.1c, 구조 2.2c, 구조 2.3c, 구조 2.4c, 구조 2.5c, 구조 2.6c, 구조 2.7c, 구조 2.8c, 구조 2.9c, 구조 2.10c, 구조 2.11c, 구조 28c, 구조 29c, 구조 30c, 구조 31c, 구조 32c, 구조 33c, 구조 34c, 구조 36c, 구조 37c, 구조 38c, 구조 39c, 구조 40c, 및 구조 41c 중 임의의 것에 개시된 바와 같은 아지드 반응성 기는 인테그린 표적화 리간드를 관심 분자, 즉 화물 분자, 예컨대 RNAi 작용제에 부착시키는데 사용될 수 있다. 화물 분자는 인테그린-발현 세포로 표적화하는 것을 목적으로 하는 임의의 분자일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은 달리 명시되지 않는 한 1 내지 10개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄 또는 분지형의 포화 지방족 탄화수소 기를 지칭한다. 예를 들어, "C1-C6 알킬"은 선형 또는 분지형 배열의 1, 2, 3, 4, 5 또는 6개의 탄소를 갖는 알킬 기를 포함한다. 알킬 기의 비제한적 예는 메틸, 에틸, 이소-프로필, tert-부틸, n-헥실을 포함한다. 본원에 사용된 용어 "아미노알킬"은 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 1개 이상의 아미노 기로 치환된, 상기 정의된 바와 같은 알킬 기를 지칭한다. 아미노 기는 비치환, 일치환 또는 이치환될 수 있다. 아미노알키 기의 비제한적 예는 아미노메틸, 디메틸아미노메틸 및 2-아미노프로프-1-일을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "시클로알킬"은 달리 명시되지 않는 한 3 내지 14개의 탄소 원자를 갖는 포화 또는 불포화 비방향족 탄화수소 고리 기를 의미한다. 시클로알킬 기의 비제한적 예는 시클로프로필, 메틸-시클로프로필, 2,2-디메틸-시클로부틸, 2-에틸-시클로펜틸 및 시클로헥실을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 시클로알킬은 다중 스피로- 또는 융합 고리를 포함할 수 있다. 시클로알킬 기는 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "알케닐"은 달리 명시되지 않는 한 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하며 2 내지 10개의 탄소 원자를 갖는, 직쇄형 또는 분지형의 비-방향족 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 이중 결합이 이러한 기에 존재할 수 있다. 예를 들어, "C2-C6" 알케닐은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알케닐 라디칼로서 정의된다. 알케닐 기의 예는 에테닐, 프로페닐, 부테닐 및 시클로헥세닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알케닐 기의 직쇄형, 분지형 또는 시클릭 부분은 이중 결합을 함유할 수 있으며, 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다. 용어 "시클로알케닐"은 명시된 수의 탄소 원자 및 적어도 1개의 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 모노시클릭 탄화수소 기를 의미한다.
본원에 사용된 용어 "알키닐"은 달리 명시되지 않는 한 2 내지 10개의 탄소 원자를 함유하며 적어도 1개의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는, 직쇄형 또는 분지형 탄화수소 라디칼을 지칭한다. 5개 이하의 탄소-탄소 삼중 결합이 존재할 수 있다. 따라서, "C2-C6 알키닐"은 2 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알키닐 라디칼을 의미한다. 알키닐 기의 예는 에티닐, 2-프로피닐 및 2-부티닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 알키닐 기의 직쇄형 또는 분지형 부분은 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환될 수 있다.
본원에 사용된 "알콕실" 또는 "알콕시"는 나타낸 수의 탄소 원자를 갖는 -O-알킬 라디칼을 지칭한다. 예를 들어, C1-6 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5 및 C6 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 예를 들어, C1-8 알콕시는 C1, C2, C3, C4, C5, C6, C7 및 C8 알콕시 기를 포함하도록 의도된다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, s-펜톡시, n-헵톡시 및 n-옥톡시를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "케토"는 카르보닐 가교를 통해 부착된, 본원에 정의된 바와 같은 임의의 알킬, 알케닐, 알키닐, 시클로알킬, 시클로알케닐, 헤테로시클릴, 헤테로아릴, 또는 아릴 기를 지칭한다. 케토 기의 예는 알카노일 (예를 들어, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 펜타노일 또는 헥사노일), 알케노일 (예를 들어, 아크릴로일), 알키노일 (예를 들어, 에티노일, 프로피노일, 부티노일, 펜티노일 또는 헥시노일), 아릴로일 (예를 들어, 벤조일), 헤테로아릴로일 (예를 들어, 피롤로일, 이미다졸로일, 퀴놀리노일 또는 피리디노일)을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "알콕시카르보닐"은 카르보닐 가교를 통해 부착된, 상기 정의된 바와 같은 임의의 알콕시 기 (즉, -C(O)O-알킬)를 지칭한다. 알콕시카르보닐 기의 예는 메톡시카르보닐, 에톡시카르보닐, 이소-프로폭시카르보닐, n-프로폭시카르보닐, t-부톡시카르보닐, 벤질옥시카르보닐 또는 n-펜톡시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교를 통해 부착된, 본원에 정의된 바와 같은 임의의 아릴 기 (즉, -C(O)O-아릴)를 지칭한다. 아릴옥시카르보닐 기의 예는 페녹시카르보닐 및 나프틸옥시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "헤테로아릴옥시카르보닐"은 옥시카르보닐 가교를 통해 부착된, 본원에 정의된 바와 같은 임의의 헤테로아릴 기 (즉, -C(O)O-헤테로아릴)를 지칭한다. 헤테로아릴옥시카르보닐 기의 예는 2-피리딜옥시카르보닐, 2-옥사졸릴옥시카르보닐, 4-티아졸릴옥시카르보닐 또는 피리미디닐옥시카르보닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 "아릴" 또는 "방향족"은 각각의 고리에 6개 이하의 원자를 가지며, 여기서 적어도 1개의 고리는 방향족인, 임의의 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 탄소 고리를 의미한다. 아릴 기의 예는 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 테트라히드로나프틸, 인다닐 및 비페닐을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 아릴 치환기가 비시클릭이고 1개의 고리가 비-방향족인 경우에, 방향족 고리를 통해 부착이 이루어지는 것으로 이해된다. 아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로아릴"은 각각의 고리에 7개 이하의 원자를 가지며, 여기서 적어도 1개의 고리는 방향족이고, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 것인, 안정한 모노시클릭 또는 폴리시클릭 고리를 나타낸다. 헤테로아릴 기의 예는 아크리디닐, 카르바졸릴, 신놀리닐, 퀴녹살리닐, 피라졸릴, 인돌릴, 벤조트리아졸릴, 푸라닐, 티에닐, 벤조티에닐, 벤조푸라닐, 벤즈이미다졸로닐, 벤족사졸로닐, 퀴놀리닐, 이소퀴놀리닐, 디히드로이소인돌로닐, 이미다조피리디닐, 이소인돌로닐, 인다졸릴, 옥사졸릴, 옥사디아졸릴, 이속사졸릴, 인돌릴, 피라지닐, 피리다지닐, 피리디닐, 피리미디닐, 피롤릴 및 테트라히드로퀴놀린을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. "헤테로아릴"은 또한 임의의 질소-함유 헤테로아릴의 N-옥시드 유도체를 포함하는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 치환기가 비시클릭이고 1개의 고리가 비-방향족이거나 또는 헤테로원자를 함유하지 않는 경우에, 방향족 고리 또는 헤테로원자 함유 고리를 통해 부착이 이루어지는 것으로 이해된다. 헤테로아릴 기는 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "헤테로사이클", "헤테로시클릭" 또는 "헤테로시클릴"은 폴리시클릭 기를 포함한, O, N 및 S로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 4개의 헤테로원자를 함유하는 3- 내지 14-원 방향족 또는 비방향족 헤테로사이클을 의미한다. 본원에 사용된 용어 "헤테로시클릭"은 또한 용어 "헤테로사이클" 및 "헤테로시클릴"과 동의어인 것으로 간주되며, 또한 본원에 제시된 동일한 정의를 갖는 것으로 이해된다. "헤테로시클릴"은 상기 언급된 헤테로아릴, 뿐만 아니라 그의 디히드로 및 테트라히드로 유사체를 포함한다. 헤테로시클릴 기의 예는 아제티디닐, 벤조이미다졸릴, 벤조푸라닐, 벤조푸라자닐, 벤조피라졸릴, 벤조트리아졸릴, 벤조티오페닐, 벤족사졸릴, 카르바졸릴, 카르볼리닐, 신놀리닐, 푸라닐, 이미다졸릴, 인돌리닐, 인돌릴, 인돌라지닐, 인다졸릴, 이소벤조푸라닐, 이소인돌릴, 이소퀴놀릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 나프트피리디닐, 옥사디아졸릴, 옥소옥사졸리디닐, 옥사졸릴, 옥사졸린, 옥소피페라지닐, 옥소피롤리디닐, 옥소모르폴리닐, 이속사졸린, 옥세타닐, 피라닐, 피라지닐, 피라졸릴, 피리다지닐, 피리도피리디닐, 피리다지닐, 피리딜, 피리디노닐, 피리미딜, 피리미디노닐, 피롤릴, 퀴나졸리닐, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 테트라히드로피라닐, 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티오피라닐, 테트라히드로이소퀴놀리닐, 테트라졸릴, 테트라졸로피리딜, 티아디아졸릴, 티아졸릴, 티에닐, 트리아졸릴, 1,4-디옥사닐, 헥사히드로아제피닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피리딘-2-오닐, 피롤리디닐, 모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 디히드로벤조이미다졸릴, 디히드로벤조푸라닐, 디히드로벤조티오페닐, 디히드로벤족사졸릴, 디히드로푸라닐, 디히드로이미다졸릴, 디히드로인돌릴, 디히드로이소옥사졸릴, 디히드로이소티아졸릴, 디히드로옥사디아졸릴, 디히드로옥사졸릴, 디히드로피라지닐, 디히드로피라졸릴, 디히드로피리디닐, 디히드로피리미디닐, 디히드로피롤릴, 디히드로퀴놀리닐, 디히드로테트라졸릴, 디히드로티아디아졸릴, 디히드로티아졸릴, 디히드로티에닐, 디히드로트리아졸릴, 디히드로아제티디닐, 디옥시도티오모르폴리닐, 메틸렌디옥시벤조일, 테트라히드로푸라닐 및 테트라히드로티에닐, 및 그의 N-옥시드를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 헤테로시클릴 치환기의 부착은 탄소 원자 또는 헤테로원자를 통해 발생할 수 있다. 헤테로시클릴 기는 정상 원자가에 의해 허용될 때 임의의 위치에서 임의로 일치환, 이치환, 삼치환, 사치환 또는 오치환된다.
본원에 사용된 용어 "치료하다", "치료" 등은 대상체에서 질환의 1종 이상의 증상의 완화 또는 그의 수, 중증도 및/또는 빈도의 경감을 제공하도록 취해지는 방법 또는 단계를 의미한다. 본원에 사용된 "치료하다" 및 "치료"는 대상체에서의 질환의 1종 이상의 증상의 수, 중증도 및/또는 빈도의 방지, 관리, 예방적 치료 및/또는 억제를 포함할 수 있다.
본원에 사용된 어구 "세포로 전달하다" 등은, 화물 분자를 지칭하는 경우에, 화물 분자를 세포로 기능적으로 전달하는 것을 의미한다. 어구 "기능적으로 전달하는"은 화물 분자가 예상되는 생물학적 활성을 갖는 것을 가능하게 하는 방식으로 화물 분자를 세포로 전달하는 것을 의미한다. RNAi 작용제인 화물 분자를 구체적으로 지칭하는 경우에, 예상되는 생물학적 활성은, 예를 들어, 유전자 발현의 서열-특이적 억제이다.
달리 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 기호
Figure pct00093
의 사용은 본원에 기재된 본 발명의 범주에 따라 임의의 기 또는 기들이 상기 기호에 연결될 수 있다는 것을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "이성질체"는 동일한 분자식을 갖지만, 그의 원자의 성질 또는 결합 순서에 있어서 또는 그의 원자의 공간 배열에 있어서 상이한 화합물을 지칭한다. 그의 원자의 공간 배열이 상이한 이성질체는 "입체이성질체"로 명명된다. 서로 거울상이 아닌 입체이성질체는 "부분입체이성질체"로 명명되고, 중첩가능하지 않은 거울상인 입체이성질체는 "거울상이성질체" 또는 때때로 광학 이성질체로 명명된다. 4개의 동일하지 않은 치환기에 결합된 탄소 원자는 "키랄 중심"으로 명명된다.
본원에 사용된 연결기는 하나의 분자 또는 분자의 부분을 또 다른 내지 제2 분자 또는 분자의 제2 부분에 연계시키는 1개 이상의 원자이다. 관련 기술분야에서, 연결기 및 스페이서라는 용어는 때때로 상호교환가능하게 사용된다. 유사하게, 관련 기술분야에서 사용되는 바와 같이, 스캐폴드라는 용어가 때때로 연결기와 상호교환가능하게 사용된다. 일부 실시양태에서, 연결기는 PEG 기 또는 PEG 모이어티를 포함하거나 또는 이로 이루어질 수 있다.
본원에 사용된 용어 "연결된" 또는 "접합된"은, 2개의 분자 사이의 연계를 지칭하는 경우에, 2개의 분자가 공유 결합에 의해 이어지거나 또는 2개의 분자가 비공유 결합 (예를 들어, 수소 결합 또는 이온 결합)을 통해 회합되는 것을 의미한다. 일부 예에서, 용어 "연결된"이 비공유 결합을 통한 2개의 분자 사이의 회합을 지칭하는 경우에, 2개의 상이한 분자 사이의 회합은 생리학상 허용되는 완충제 (예를 들어, 포스페이트 완충 염수) 중에서 1 x 10-4 M 미만 (예를 들어, 1 x 10-5 M 미만, 1 x 10-6 M 미만, 또는 1 x 10-7 M 미만)의 KD를 갖는다. 언급되지 않는 한, 본원에 사용된 용어 연결된은 임의의 개재 원자 또는 원자단을 갖거나 또는 갖지 않는, 제1 화합물과 제2 화합물 사이의 연계를 지칭할 수 있다.
관련 기술분야의 통상의 기술자는, 본원에 개시된 화합물 또는 조성물이 위치하는 환경에 따라, 화합물 및 조성물이 특정 원자 (예를 들어, N, O 또는 S 원자)를 양성자화 또는 탈양성자화된 상태로 가질 수 있다는 것을 용이하게 이해하고 인지할 것이다. 따라서, 본원에 사용되는 바와 같이, 본원에 개시된 구조는 특정 관능기, 예컨대, 예를 들어, OH, SH 또는 NH가 양성자화 또는 탈양성자화될 수 있는 것으로 고려된다. 본원의 개시내용은, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같이, 개시된 화합물 및 조성물을 환경의 pH에 기초하여 그의 양성자화 상태와 상관없이 포괄하도록 의도된다.
본원의 청구항에 사용된 어구 "로 이루어진"은 그 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본원의 청구항에 사용되는 경우에, 어구 "로 본질적으로 이루어진"은 청구항의 범주를 명시된 물질 또는 단계 및 청구된 발명의 기본적이며 신규한 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 것들로 제한한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질이 본 발명의 실시 또는 시험에서 사용될 수 있지만, 적합한 방법 및 물질이 하기에 기재된다. 본원에 언급된 모든 간행물, 특허 출원, 특허, 및 다른 참고문헌은 그 전문이 참조로 포함된다. 상충되는 경우, 정의를 포함하여 본 명세서가 우선할 것이다. 또한, 물질, 방법 및 예는 예시적일 뿐이며, 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
다중자리 αvβ3 인테그린 리간드 및 스캐폴드
본원에 개시된 바와 같이, 일부 실시양태에서, 1개 이상의 αvβ3/5 인테그린 리간드가 1개 이상의 화물 분자에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 단지 1개의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "한자리" 또는 "1가" 리간드로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 2개의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "두자리" 또는 "2가" 표적화 기로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 3개의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "세자리 " 또는 "3가" 표적화 기로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 4개의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다 (본원에서 "네자리" 또는 "4가" 표적화 기로 지칭됨). 일부 실시양태에서, 4개 초과의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된다.
일부 실시양태에서, 오직 1개의 인테그린 리간드가 화물 분자에 접합된 경우 (본원에서 "한자리" 리간드로 지칭됨), 인테그린 리간드는 화물 분자에 직접 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 리간드는 스캐폴드 또는 다른 링커 구조를 통해 화물 분자에 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 리간드는 1개 이상의 스캐폴드를 포함한다. 또한, 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 리간드에 대한 1개 이상의 화물 분자의 연결을 용이하게 하기 위해, 때때로 관련 기술분야에서 연결기 또는 링커로서 지칭되는 스캐폴드가 사용될 수 있다. 본원에 개시된 리간드와 상용성인 유용한 스캐폴드는 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 본원에 개시된 αvβ3 인테그린 리간드와 함께 사용될 수 있는 스캐폴드의 비제한적 예는 중합체 및 폴리아미노산 (예를 들어, 비스-글루탐산, 폴리-L-리신 등)을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드는 시스테인 링커 또는 기, DBCO-PEG1-24-NHS, 프로파르길-PEG1-24-NHS, 및/또는 다중자리 DBCO 및/또는 프로파르길 모이어티를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 1개 이상의 인테그린 리간드를 1개 이상의 화물 분자에 연결시키는데 사용되는 스캐폴드는 하기 구조를 갖는다:
Figure pct00094
스캐폴드 1의 사용은, 예를 들어, 인테그린 리간드 단량체 및 1개 이상의 화물 분자 둘 다와의 효율적인 접합을 용이하게 한다. 스캐폴드 1은 아민 반응성 p-니트로페놀 (또한 4-니트로페놀로도 불림) 에스테르, 아미드 연결, 및 3개의 PEG2 단위 아암, 뿐만 아니라 말단 알킨을 포함한다. 4-니트로페놀 에스테르는 화물 분자 상의 1급 아민, 예컨대 말단 아민 기 (예를 들어, NH2-(CH2)6)를 갖도록 제제화된 RNA 촉발자 상의 1급 아민과, 아미드 형성을 통해 접합될 수 있다. 말단 알킨은 아지도 변형된 리간드 (펩티드 및 소분자 둘 다)와 구리-촉매된 클릭 화학을 통해 접합될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화물 분자는 RNAi 작용제이다. 일부 실시양태에서, 스캐폴드 1은 RNAi 작용제의 말단 단부, 예컨대 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단 단부에 부착될 수 있다. 예를 들어, RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단 단부는 RNAi 작용제의 5' 말단 뉴클레오티드의 5' 단부에 부착된 C6 아민 (-(CH2)6-NH2)을 포함하도록 변형될 수 있다. 하기 구조로 표시되어 제시된 바와 같이, 이러한 C6 아민 변형 (또는 말단 아민을 생성하는 또 다른 기타 변형)을 갖는 RNAi 작용제는 스캐폴드 1에 용이하게 접합될 수 있고:
Figure pct00095
여기서,
Figure pct00096
는 RNAi 작용제를 나타낸다.
이어서, 상기 구조 380의 알킨 기는 본원에 개시된 인테그린 리간드에 접합되어 세자리 인테그린 표적화 기를 형성할 수 있다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 하기 구조로 표시될 수 있는 DBCO (디벤조시클로옥틴)를 사용하여 합성될 수 있고:
Figure pct00097
여기서,
Figure pct00098
는 반응성 기 또는 모이어티 포함 화물 분자에 대한 부착을 나타낸다.
일부 실시양태에서, 하기 일반 구조에 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 RNAi 작용제 및 인테그린 리간드 사이에 트리아졸 기가 형성되고:
Figure pct00099
여기서,
Figure pct00100
는 리간드를 RNAi 작용제에 결합시키는데 사용될 수 있는 임의의 적합한 스캐폴드 또는 링커를 나타내고,
Figure pct00101
는 RNAi 작용제를 나타낸다.
일부 실시양태에서, 스캐폴드는 포스포르아미다이트 화합물로서 합성될 수 있고, 그의 예는 하기 구조에 제시된다:
Figure pct00102
구조 400의 트리알킨 화합물은 알킨과 아지드를 포함하는 표적화 리간드의 클릭 반응을 통해 세자리 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단 단부에 용이하게 커플링되게 한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 기는 구조 1a, 구조 2a, 구조 2.1a, 구조 2.2a, 구조 2.3a, 구조 2.4a, 구조 2.5a, 구조 2.6a, 구조 2.7a, 구조 2.8a, 구조 2.9a, 구조 2.10a, 구조 2.11a, 구조 28a, 구조 29a, 구조 30a, 구조 31a, 구조 32a, 구조 33a, 구조 34a, 구조 36a, 구조 37a, 구조 38a, 구조 39a, 구조 40a, 및 구조 41a를 포함하며, 여기서 αvβ3 인테그린 표적화 기는 세자리 표적화 기이고, 3개의 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 αvβ3 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure pct00103
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure pct00104
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure pct00105
일부 실시양태에서, 글루타르산 링커를 포함하는 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있다:
Figure pct00106
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있으며:
Figure pct00107
여기서
Figure pct00108
는 RNAi 작용제를 나타내고, X = O 또는 S이다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있으며:
Figure pct00109
여기서
Figure pct00110
는 리간드 및 화물 분자를 결합시키는데 사용될 수 있는 임의의 적합한 스캐폴드 또는 링커를 나타낸다.
일부 실시양태에서, RNAi 작용제에 접합된 αvβ3 세자리 표적화 기는 구조 2a의 3개의 리간드를 포함하고, 이는 하기 구조에 의해 나타내어질 수 있으며:
Figure pct00111
여기서
Figure pct00112
는 리간드 및 RNAi 작용제를 결합시키는데 사용될 수 있는 임의의 적합한 스캐폴드 또는 링커를 나타내고,
Figure pct00113
는 RNAi 작용제를 나타낸다.
반응성 기 및 보호된 반응성 기.
반응성 기는 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 반응성 기는 아미노 기, 아미드 기, 카르복실산 기, 아지드, 알킨, 프로파르길 기, BCN(비시클로[6.1.0]노닌, DBCO(디벤조시클로옥틴) 티올, 말레이미드 기, 아미노옥시 기, N-히드록시숙신이미드 (NHS) 또는 다른 활성화된 에스테르 (예를 들어, PNP, TFP, PFP), 브로모 기, 알데히드, 카르보네이트, 토실레이트, 테트라진, 트랜스-시클로옥텐 (TCO), 히드라지드, 히드록실 기, 디술피드, 및 오르토피리딜 디술피드 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
반응성 기의 혼입은 본원에 개시된 인테그린 리간드의 화물 분자에 대한 접합을 용이하게 할 수 있다. 접합 반응은 관련 기술분야에 널리 공지되어 있고, 2개의 분자 또는 반응물 사이의 공유 연결의 형성을 제공한다. 본원 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 접합 반응은 아미드 커플링 반응, 마이클 첨가 반응, 히드라존 형성 반응 및 클릭 화학 고리화첨가 반응을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 화물 분자를 부착시키기 위해 반응성 아미노 기에 의해 대체될 수 있는, 테트라플루오로페닐 (TFP) 에스테르로서 합성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 화물 분자를 부착시키기 위해 예를 들어 클릭 화학 고리화첨가 반응을 통해 프로파르길 또는 DBCO 기에 접합될 수 있는 아지드로서 합성된다.
보호된 반응성 기가 또한 관련 기술분야에서 통상적으로 사용된다. 보호기는, 예를 들어 후속 화학 반응에서 화학-선택성을 제공하기 위해, 비-보호된 기가 반응하는 조건 하에 반응하지 않는 기로의 반응성 기의 일시적인 화학적 변환을 제공한다. 본원 발명의 범주에서 사용하기에 적합한 보호된 반응성 기는 BOC 기 (t-부톡시카르보닐), Fmoc (9-플루오레닐메톡시카르보닐), 카르복시벤질 (CBZ) 기, 벤질 에스테르, 및 PBF (2,2,4,6,7-펜타메틸디히드로벤조푸란-5-술포닐)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
화물 분자 (RNAi 작용제 포함)
화물 분자는 본원에 기재된 인테그린 리간드로부터 탈착되는 경우 인테그린 수용체를 포함하는 세포에 대해 바람직한 효과를 갖게 될 임의의 분자이다. 화물 분자는 제약 성분, 약물 제품, 전구약물, 공지된 치료 이익을 갖는 물질, 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 핵산 또는 폴리뉴클레오티드, 펩티드, 중합체, 폴리아민, 단백질, 압타머, 독소, 비타민, PEG, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자 (예를 들어, 동일하거나 상이한 화물 분자)는 화물 분자를 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5를 발현하는 세포로 표적화하기 위해 1개 이상의 인테그린 리간드에 연결된다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자는 제약 성분 또는 제약 조성물이다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물이다. 본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드-기반 화합물"은 약 10-50개 (예를 들어, 10 내지 48, 10 내지 46, 10 내지 44, 10 내지 42, 10 내지 40, 10 내지 38, 10 내지 36, 10 내지 34, 10 내지 32, 10 내지 30, 10 내지 28, 10 내지 26, 10 내지 24, 10 내지 22, 10 내지 20, 10 내지 18, 10 내지 16, 10 내지 14, 10 내지 12, 12 내지 50, 12 내지 48, 12 내지 46, 12 내지 44, 12 내지 42, 12 내지 40, 12 내지 38, 12 내지 36, 12 내지 34, 12 내지 32, 12 내지 30, 12 내지 28, 12 내지 26, 12 내지 24, 12 내지 22, 12 내지 20, 12 내지 18, 12 내지 16, 12 내지 14, 14 내지 50, 14 내지 48, 14 내지 46, 14 내지 44, 14 내지 42, 14 내지 40, 14 내지 38, 14 내지 36, 14 내지 34, 14 내지 32, 14 내지 30, 14 내지 28, 14 내지 26, 14 내지 24, 14 내지 22, 14 내지 20, 14 내지 18, 14 내지 16, 16 내지 50, 16 내지 48, 16 내지 46, 16 내지 44, 16 내지 42, 16 내지 40, 16 내지 38, 16 내지 36, 16 내지 34, 16 내지 32, 16 내지 30, 16 내지 28, 16 내지 26, 16 내지 24, 16 내지 22, 16 내지 20, 16 내지 18, 18 내지 50, 18 내지 48, 18 내지 46, 18 내지 44, 18 내지 42, 18 내지 40, 18 내지 38, 18 내지 36, 18 내지 34, 18 내지 32, 18 내지 30, 18 내지 28, 18 내지 26, 18 내지 24, 18 내지 22, 18 내지 20, 20 내지 50, 20 내지 48, 20 내지 46, 20 내지 44, 20 내지 42, 20 내지 40, 20 내지 38, 20 내지 36, 20 내지 34, 20 내지 32, 20 내지 30, 20 내지 28, 20 내지 26, 20 내지 24, 20 내지 22, 22 내지 50, 22 내지 48, 22 내지 46, 22 내지 44, 22 내지 42, 22 내지 40, 22 내지 38, 22 내지 36, 22 내지 34, 22 내지 32, 22 내지 30, 22 내지 28, 22 내지 26, 22 내지 24, 24 내지 50, 24 내지 48, 24 내지 46, 24 내지 44, 24 내지 42, 24 내지 40, 24 내지 38, 24 내지 36, 24 내지 34, 24 내지 32, 24 내지 30, 24 내지 28, 24 내지 26, 26 내지 50, 26 내지 48, 26 내지 46, 26 내지 44, 26 내지 42, 26 내지 40, 26 내지 38, 26 내지 36, 26 내지 34, 26 내지 32, 26 내지 30, 26 내지 28, 28 내지 50, 28 내지 48, 28 내지 46, 28 내지 44, 28 내지 42, 28 내지 40, 28 내지 38, 28 내지 36, 28 내지 34, 28 내지 32, 28 내지 30, 30 내지 50, 30 내지 48, 30 내지 46, 30 내지 44, 30 내지 42, 30 내지 40, 30 내지 38, 30 내지 36, 30 내지 34, 30 내지 32, 32 내지 50, 32 내지 48, 32 내지 46, 32 내지 44, 32 내지 42, 32 내지 40, 32 내지 38, 32 내지 36, 32 내지 34, 34 내지 50, 34 내지 48, 34 내지 46, 34 내지 44, 34 내지 42, 34 내지 40, 34 내지 38, 34 내지 36, 36 내지 50, 36 내지 48, 36 내지 46, 36 내지 44, 36 내지 42, 36 내지 40, 36 내지 38, 38 내지 50, 38 내지 48, 38 내지 46, 38 내지 44, 38 내지 42, 38 내지 40, 40 내지 50, 40 내지 48, 40 내지 46, 40 내지 44, 40 내지 42, 42 내지 50, 42 내지 48, 42 내지 46, 42 내지 44, 44 내지 50, 44 내지 48, 44 내지 46, 46 내지 50, 46 내지 48, 또는 48 내지 50개)의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 염기 쌍을 함유하는 뉴클레오티드 서열이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 세포 내의 발현된 표적 핵산 또는 표적 유전자 (예를 들어, 표적 유전자의 유전자 전사체 또는 mRNA) 내의 코딩 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵염기 서열을 갖는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은, 유전자를 발현하는 세포로 전달되면, 근본적인 유전자의 발현을 억제할 수 있고, 이는 본원에서 "발현-억제 올리고뉴클레오티드-기반 화합물"로 지칭된다. 유전자 발현은 시험관내 또는 생체내 억제될 수 있다.
"올리고뉴클레오티드-기반 화합물"은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 안티센스 올리고뉴클레오티드, 짧은 또는 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 리보자임, 간섭 RNA 분자, 및 다이서 기질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 이중-가닥 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은 RNAi 작용제인 이중-가닥 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자는 "RNAi 작용제"이고, 이는 서열 특이적 방식으로 표적 mRNA의 메신저 RNA (mRNA) 전사체의 번역을 분해 또는 억제할 수 있는 RNA 또는 RNA-유사 (예를 들어, 화학적으로 변형된 RNA) 올리고뉴클레오티드 분자를 포함하는 화학적 조성물이다. 본원에 사용된 RNAi 작용제는 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동할 수 있거나 (즉, 포유동물 세포의 RNA 간섭 경로 기구 (RNA-유도 침묵화 복합체 또는 RISC)와의 상호 작용을 통해 RNA 간섭을 유도함), 또는 임의의 대안적 메카니즘(들) 또는 경로(들)에 의해 작동할 수 있다. RNAi 작용제는 이 용어가 본원에 사용되는 경우에, 주로 RNA 간섭 메카니즘을 통해 작동하는 것으로 여겨지지만, 개시된 RNAi 작용제는 임의의 특정한 작용 경로 또는 메카니즘에 얽매이거나 또는 이에 제한되지 않는다. 본원에 개시된 RNAi 작용제는 센스 가닥 및 안티센스 가닥으로 구성되고, 짧은 또는 소형 간섭 RNA (siRNA), 이중-가닥 RNA (dsRNA), 마이크로 RNA (miRNA), 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), 및 다이서 기질을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 기재된 RNAi 작용제의 안티센스 가닥은 표적화되는 mRNA에 적어도 부분적으로 상보적이다. RNAi 작용제는 1개 이상의 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결을 포함할 수 있다.
전형적으로, RNAi 작용제는 적어도 제1 서열을 포함하는 센스 가닥 (또한 패신저 가닥으로 지칭됨), 및 제2 서열을 포함하는 안티센스 가닥 (또한 가이드 가닥으로도 지칭됨)으로 구성될 수 있다. RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥의 길이는 각각 16 내지 49개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 17 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 19 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 26개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 독립적으로 21 내지 24개 뉴클레오티드 길이이다. 일부 실시양태에서, 센스 및 안티센스 가닥은 각각 21개 뉴클레오티드 길이이다. 센스 및 안티센스 가닥은 동일한 길이 또는 상이한 길이일 수 있다. RNAi 작용제는 표적 유전자 내의 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 안티센스 가닥 서열을 포함하고, 표적을 발현하는 세포로 전달되면, RNAi 작용제는 1개 이상의 표적 유전자의 발현을 생체내 또는 시험관내 억제할 수 있다.
일반적으로 올리고뉴클레오티드-기반 화합물은, 및 특히 RNAi 작용제는, 변형된 뉴클레오티드 및/또는 1개 이상의 비-포스포디에스테르 연결로 구성될 수 있다. 본원에 사용된 "변형된 뉴클레오티드"는 리보뉴클레오티드 (2'-히드록실 뉴클레오티드) 이외의 뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에서, 뉴클레오티드의 적어도 50% (예를 들어, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100%)가 변형된 뉴클레오티드이다. 본원에 사용된 변형된 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 뉴클레오티드 모방체, 무염기성 뉴클레오티드, 2'-변형된 뉴클레오티드, 3'에서 3' 연결 (역전된) 뉴클레오티드, 비-천연 염기-포함 뉴클레오티드, 가교된 뉴클레오티드, 펩티드 핵산, 2',3'-세코 뉴클레오티드 모방체 (비잠금 핵염기 유사체, 잠금 뉴클레오티드, 3'-O-메톡시 (2' 뉴클레오시드간 연결된) 뉴클레오티드, 2'-F-아라비노 뉴클레오티드, 5'-Me, 2'-플루오로 뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 데옥시리보뉴클레오티드, 비닐 포스포네이트 함유 뉴클레오티드, 및 시클로프로필 포스포네이트 함유 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 2'-변형된 뉴클레오티드 (즉, 5-원 당 고리의 2' 위치에 히드록실 기 이외의 기를 갖는 뉴클레오티드)는 2'-O-메틸 뉴클레오티드, 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클레오티드, 2'-데옥시 뉴클레오티드, 2'-메톡시에틸 (2'-O-2-메톡시에틸) 뉴클레오티드, 2'-아미노 뉴클레오티드 및 2'-알킬 뉴클레오티드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물, 예컨대 RNAi 작용제의 1개 이상의 뉴클레오티드는 비-표준 연결 또는 백본 (즉, 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 변형된 백본)에 의해 연결될 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결은 비-포스페이트-함유 공유 뉴클레오시드간 연결일 수 있다. 변형된 뉴클레오시드간 연결 또는 백본은 5'-포스포로티오에이트 기, 키랄 포스포로티오에이트, 티오포스페이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬-포스포트리에스테르, 알킬 포스포네이트 (예를 들어, 메틸 포스포네이트 또는 3'-알킬렌 포스포네이트), 키랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포르아미데이트 (예를 들어, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포르아미데이트, 또는 티오노포스포르아미데이트), 티오노알킬-포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 모르폴리노 연결, 통상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 보라노포스페이트의 2'-5' 연결된 유사체, 또는 역극성을 갖는 보라노포스페이트 (여기서 뉴클레오시드 단위의 인접 쌍은 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2' 연결됨)를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
주어진 화합물 내의 모든 위치가 균일하게 변형될 필요는 없다. 반대로, 1개 초과의 변형이 단일 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 또는 심지어 그의 단일 뉴클레오티드에 혼입될 수 있다.
일부 실시양태에서, 화물 분자는 HIF-2 알파 (EPAS1) 유전자 발현을 억제하기 위한 RNAi 작용제이다. 화물 분자는 각각 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/196239 및 WO 2014/134255에 기재된 RNAi 작용제일 수 있다.
RNAi 작용제 센스 가닥 및 안티센스 가닥은 관련 기술 분야에 공지된 방법에 의해 합성되고/거나 변형될 수 있다. 예를 들어, HIF-2 알파 유전자 발현의 억제를 위해 지시된 RNAi 작용제의 개시내용은, 예를 들어 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 국제 특허 출원 공개 번호 WO 2016/196239에서 확인할 수 있다.
일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자(들)는 약동학 (PK) 증진제 또는 조정제로서 작용할 수 있는 PEG 모이어티를 포함할 수 있거나 또는 이로 이루어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자는 약 20-900개의 에틸렌 옥시드 (CH2-CH2-O) 단위 (예를 들어, 20 내지 850, 20 내지 800, 20 내지 750, 20 내지 700, 20 내지 650, 20 내지 600, 20 내지 550, 20 내지 500, 20 내지 450, 20 내지 400, 20 내지 350, 20 내지 300, 20 내지 250, 20 내지 200, 20 내지 150, 20 내지 100, 20 내지 75, 20 내지 50, 100 내지 850, 100 내지 800, 100 내지 750, 100 내지 700, 100 내지 650, 100 내지 600, 100 내지 550, 100 내지 500, 100 내지 450, 100 내지 400, 100 내지 350, 100 내지 300, 100 내지 250, 100 내지 200, 100 내지 150, 200 내지 850, 200 내지 800, 200 내지 750, 200 내지 700, 200 내지 650, 200 내지 600, 200 내지 550, 200 내지 500, 200 내지 450, 200 내지 400, 200 내지 350, 200 내지 300, 200 내지 250, 250 내지 900, 250 내지 850, 250 내지 800, 250 내지 750, 250 내지 700, 250 내지 650, 250 내지 600, 250 내지 550, 250 내지 500, 250 내지 450, 250 내지 400, 250 내지 350, 250 내지 300, 300 내지 900, 300 내지 850, 300 내지 800, 300 내지 750, 300 내지 700, 300 내지 650, 300 내지 600, 300 내지 550, 300 내지 500, 300 내지 450, 300 내지 400, 300 내지 350, 350 내지 900, 350 내지 850, 350 내지 800, 350 내지 750, 350 내지 700, 350 내지 650, 350 내지 600, 350 내지 550, 350 내지 500, 350 내지 450, 350 내지 400, 400 내지 900, 400 내지 850, 400 내지 800, 400 내지 750, 400 내지 700, 400 내지 650, 400 내지 600, 400 내지 550, 400 내지 500, 400 내지 450, 450 내지 900, 450 내지 850, 450 내지 800, 450 내지 750, 450 내지 700, 450 내지 650, 450 내지 600, 450 내지 550, 450 내지 500, 500 내지 900, 500 내지 850, 500 내지 800, 500 내지 750, 500 내지 700, 500 내지 650, 500 내지 600, 500 내지 550, 550 내지 900, 550 내지 850, 550 내지 800, 550 내지 750, 550 내지 700, 550 내지 650, 550 내지 600, 600 내지 900, 600 내지 850, 600 내지 800, 600 내지 750, 600 내지 700, 600 내지 650, 650 내지 900, 650 내지 850, 650 내지 800, 650 내지 750, 650 내지 700, 700 내지 900, 700 내지 850, 700 내지 800, 700 내지 750, 750 내지 900, 750 내지 850, 750 내지 800, 800 내지 900, 850 내지 900, 또는 850 내지 900개의 에틸렌 옥시드 단위)를 갖는 PEG 모이어티를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자(들)는 대략 455개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 PEG 모이어티 (약 20 킬로달톤 (kDa) 분자량)로 이루어진다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 2 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 20 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 일부 실시양태에서, PEG 모이어티는 약 40 킬로달톤의 분자량을 갖는다. 본원에 기재된 PEG 모이어티는 선형 또는 분지형일 수 있다. PEG 모이어티는 이산 (단분산) 또는 비-이산 (다분산)될 수 있다. PK 증진 화물 분자로서 사용하기 위한 PEG 모이어티는 상업적으로 구입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1개 이상의 화물 분자(들)는 PK 조정제 또는 증진제로서 작용할 수 있는 PEG 모이어티, 뿐만 아니라 상이한 화물 분자, 예컨대 제약 활성 성분 또는 화합물을 포함한다.
기재된 인테그린 리간드는 그의 염 또는 용매화물을 포함한다. 인테그린 리간드의 용매화물은 상호 인력으로 인해 형성된, 인테그린 리간드 상의 불활성 용매 분자의 부가물을 의미하는 것으로 이해된다. 용매화물은, 예를 들어, 1- 또는 2수화물 또는 알콜, 예컨대 예를 들어, 메탄올 또는 에탄올과의 부가 화합물이다.
유리 아미노 기 또는 유리 히드록실 기는 상응하는 보호기를 갖는 인테그린 리간드의 치환기로서 제공될 수 있다.
αvβ3 인테그린 리간드는 또한 예를 들어 유도체, 즉 시험관내 또는 유기체에서 절단되는, 예를 들어 알킬 또는 아실 기, 당 또는 올리고펩티드로 변형된 인테그린 리간드를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 리간드는 리간드-매개 세포내 이입, 음세포작용을 통해, 또는 다른 수단에 의해, 그의 표면 상에서 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5를 제시하는 세포의 시토졸로의 화물 분자의 전달을 용이하게 한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 인테그린 리간드는 인테그린 αvβ3 및/또는 인테그린 αvβ5를 제시하는 세포의 형질 막으로의 화물 분자의 전달을 용이하게 한다.
제약 조성물
일부 실시양태에서, 본 개시내용은 본원에 개시된 인테그린 리간드 중 1개 이상을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 본질적으로 이루어진 제약 조성물을 제공한다.
본원에 사용된 "제약 조성물"은 약리학상 유효량의 활성 제약 성분 (API), 및 임의로 1종 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함한다. 제약상 허용되는 부형제 (부형제)는 약물 전달 시스템에 의도적으로 포함되는, 활성 제약 성분 (API, 치료 제품) 이외의 물질이다. 부형제는 의도된 투여량에서 치료 효과를 발휘하지 않거나 또는 치료 효과를 발휘하도록 의도되지 않는다. 부형제는 a) 제조 동안 약물 전달 시스템의 가공을 보조하고/거나, b) API의 안정성, 생체이용률 또는 환자 용인성을 보호, 지원 또는 증진시키고/거나, c) 제품 식별을 돕고/거나, d) 저장 또는 사용 동안 API의 전반적인 안전성, 유효성, 전달의 임의의 다른 속성을 증진시키는 작용을 할 수 있다. 제약상 허용되는 부형제는 불활성 물질일 수 있거나 또는 불활성 물질이 아닐 수 있다.
부형제는 흡수 증진제, 부착방지제, 소포제, 항산화제, 결합제, 완충제, 담체, 코팅제, 착색제, 전달 증진제, 전달 중합체, 덱스트란, 덱스트로스, 희석제, 붕해제, 유화제, 증량제, 충전제, 향미제, 활택제, 함습제, 윤활제, 오일, 중합체, 보존제, 염수, 염, 용매, 당, 현탁화제, 지속 방출 매트릭스, 감미제, 증점제, 등장화제, 비히클, 발수제 및 습윤제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 기재된 제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 추가의 성분은 제약 활성 물질이다. 제약 활성 물질은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등), 소분자 약물, 항체, 항체 단편, 압타머 및/또는 백신을 포함하나 이에 제한되지는 않는다.
제약 조성물은 또한 보존제, 가용화제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 감미제, 착색제, 부취제, 삼투압의 변동을 위한 염, 완충제, 코팅제 또는 항산화제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 공지된 치료 이익을 갖는 다른 작용제를 함유할 수 있다.
제약 조성물은 국부 치료가 바람직한지 또는 전신 치료가 바람직한지의 여부 및 치료하고자 하는 부위에 따라 다수의 방식으로 투여될 수 있다. 투여는 관련 기술분야에 통상적으로 공지된 임의의 방식에 의해, 예컨대, 비제한적으로, 국소 (예를 들어, 경피 패치에 의해), 폐 (예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 취입에 의해, 예컨대 네뷸라이저, 기관내, 비강내에 의한 것 포함), 표피, 경피, 경구 또는 비경구로 이루어질 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복강내 또는 근육내 주사 또는 주입; 피하 (예를 들어, 이식된 장치를 통해), 두개내, 실질내, 척수강내 및 뇌실내 투여를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 제약 조성물은 정맥내 주사 또는 주입 또는 피하 주사에 의해 투여된다. 제약 조성물은 경구로, 예를 들어 정제, 코팅된 정제, 당의정, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태로 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장으로, 예를 들어 좌제를 사용하여; 국부로 또는 경피로, 예를 들어 연고, 크림, 겔 또는 용액을 사용하여; 또는 비경구로, 예를 들어 주사액을 사용하여 수행될 수 있다.
주사가능한 사용에 적합한 적합한 제약 조성물은 멸균 수용액 (수용성인 경우) 또는 분산액, 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여를 위해 적합한 담체는 생리 염수, 정박테리아 수, 크레모포르 ELTM (바스프(BASF), 뉴저지주 파시파니) 또는 포스페이트 완충 염수를 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에 안정적이어야 하며, 미생물 예컨대 박테리아 및 진균의 오염 작용에 대해 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜) 및 그의 적합한 혼합물을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들어, 코팅 예컨대 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에는 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들어, 당, 폴리알콜 예컨대 만니톨, 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 지속 흡수는 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 포함시킴으로써 야기될 수 있다.
멸균 주사가능한 용액은 요구되는 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 상기 열거된 성분 중 1종 또는 그의 조합과 함께 적절한 용매 중에 혼입한 다음, 여과 멸균함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 활성 화합물을 기본 분산 매질 및 상기 열거된 것들 중 요구되는 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클 중에 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사가능한 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 제조 방법은 그의 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분 플러스 임의의 추가의 목적하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결-건조를 포함한다.
관절내 투여에 적합한 제제는 미세결정질 형태, 예를 들어, 수성 미세결정질 현탁액의 형태일 수 있는, 본원에 기재된 임의의 리간드의 멸균 수성 제제의 형태일 수 있다. 리포솜 제제 또는 생분해성 중합체 시스템이 또한 관절내 및 안과적 투여 둘 다를 위한 본원에 기재된 임의의 리간드를 제공하기 위해 사용될 수 있다.
활성 화합물은, 이식물 및 마이크로캡슐화 전달 시스템을 포함한 제어 방출 제제와 같이, 체내로부터의 급속 제거에 대해 화합물을 보호할 담체와 함께 제조될 수 있다. 생분해성 생체적합성 중합체, 예컨대 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산이 사용될 수 있다. 이러한 제제의 제조 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다. 리포솜 현탁액이 또한 제약상 허용되는 담체로서 사용될 수 있다. 이들은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 따라, 예를 들어, 미국 특허 번호 4,522,811에 기재된 바와 같이 제조될 수 있다.
제약 조성물은 제약 조성물에서 통상적으로 발견되는 다른 추가의 성분을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 성분은 항소양제, 수렴제, 국부 마취제 또는 항염증제 (예를 들어, 항히스타민제, 디펜히드라민 등)를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 "약리학상 유효량", "치료 유효량" 또는 간단하게 "유효량"은 약리학적, 치료적 또는 예방적 결과를 발생시키기 위한 제약 활성제의 양을 지칭한다.
αvβ3 인테그린 리간드를 함유하는 의약이 또한 본 발명의 목적이며, αvβ3 인테그린 리간드를 함유하는 1종 이상의 화합물 및 원하는 경우에 1종 이상의 다른 공지된 치료 이익을 갖는 물질을 제약상 허용되는 형태가 되도록 하는 것을 포함하는, 이러한 의약의 제조 방법도 마찬가지로 본 발명의 목적이다.
기재된 인테그린 리간드, 및 본원에 개시된 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물은 키트, 용기, 팩 또는 분배기 내에 패키징되거나 포함될 수 있다. 인테그린 리간드, 및 인테그린 리간드를 포함하는 제약 조성물은 사전-충전된 시린지 또는 바이알 내에 패키징될 수 있다.
연결기, 약동학 (PK) 증진제, 약역학 (PD) 조정제, 전달 비히클, 및 표적화 기
일부 실시양태에서, αvβ3 리간드는 연결기, 약동학 (PK) 증진제 (또한 PK 조정제도로 지칭됨), 약역학 (PD) 조정제, 전달 중합체, 또는 전달 비히클을 포함하나 이에 제한되지는 않는 1개 이상의 비-뉴클레오티드 기에 접합된다. 비-뉴클레오티드 기는 화물 분자의 표적화, 전달 또는 부착을 증진시킬 수 있다. 표적화 기 및 연결기에 대한 스캐폴드의 예가 본원에 개시되어 있다. 비-뉴클레오티드 기는 센스 가닥 및/또는 안티센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 공유 연결될 수 있다. 화물 분자가 RNAi 작용제인 실시양태에서, RNAi 작용제는 센스 가닥의 3' 및/또는 5' 단부에 연결된 비-뉴클레오티드 기를 함유한다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제 센스 가닥의 5' 단부에 연결된다. 본원에 개시된 인테그린 리간드는 링커/연결기를 통해 화물 분자에 직접적으로 또는 간접적으로 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 인테그린 리간드는 불안정성, 절단가능한 또는 가역적인 결합 또는 링커를 통해 화물 분자에 연결된다.
일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착되는 RNAi 작용제 또는 접합체의 약동학 또는 생체분포 특성을 증진시켜, RNAi 작용제 또는 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 RNAi 작용제의 세포내이입을 증진시킨다. 일부 실시양태에서, 비-뉴클레오티드 기는 그것이 부착되는 RNAi 작용제 또는 접합체의 약역학적 특성을 증진시키거나 조정하여, RNAi 작용제 또는 접합체의 세포- 또는 조직-특이적 분포 및 세포-특이적 흡수를 개선시킨다.
표적화 기 또는 표적화 모이어티는 그것이 부착되는 화물 분자의 약동학 또는 생체분포 특성을 증진시켜, 화물 분자의 세포-특이적 (일부 경우에, 기관 특이적을 포함) 분포 및 세포-특이적 (또는 기관 특이적) 흡수를 개선시킨다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 본원에 기재된 바와 같은 αvβ3 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 링커를 포함한다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 PK 증진제를 포함한다. 일부 실시양태에서, αvβ3 인테그린 리간드는 링커, 예컨대 PEG 링커, 또는 일부 경우에 링커로서 기능할 수 있는 1, 2, 또는 3개의 무염기성 및/또는 리비톨 (무염기성 리보스) 잔기를 사용하여 화물 분자에 연결된다. 표적화 기는 1개 이상의 표적화 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 본원에 개시된 1 내지 4개의 인테그린 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 표적화 기는 세자리 표적화 기이고, 본원에 개시된 3개의 인테그린 리간드를 포함한다.
화물 분자는 반응성 기, 예컨대 아미노 기 (또한 본원에서 아민으로도 지칭됨)를 갖도록 합성될 수 있다. 화물 분자가 RNAi 작용제인 실시양태에서, 반응성 기는 5'-말단 및/또는 3'-말단에서 연결될 수 있다. 반응성 기는 후속해서, 관련 기술분야에서 전형적인 방법을 사용하여, αvβ3 인테그린 리간드에 부착시키는데 사용될 수 있다.
예를 들어, 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에서 NH2-C6 기를 갖도록 합성된다. 후속해서, 말단 아미노 기는 예를 들어 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성하도록 반응할 수 있다. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5'-말단에서 1개 이상의 알킨 기를 갖도록 합성된다. 후속해서, 말단 알킨 기(들)는 예를 들어 αvβ3 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 기와 접합체를 형성하도록 반응할 수 있다.
일부 실시양태에서, 연결기는 αvβ3 리간드에 접합된다. 연결기는 화물 분자, PK 증진제, 전달 중합체 또는 전달 비히클에 대한 αvβ3 리간드의 공유 연결을 용이하게 한다. 연결기의 예는 Alk-SMPT-C6, Alk-SS-C6, DBCO-TEG, Me-Alk-SS-C6, 및 C6-SS-Alk-Me, 반응성 기 예컨대 1급 아민 및 알킨, 알킬 기, 무염기성 잔기/뉴클레오티드, 아미노산, 트리-알킨 관능화 기, 리비톨, 및/또는 PEG 기를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다.
링커 또는 연결기는 하나의 화학적 기 (예컨대 RNAi 작용제) 또는 관심 절편을 또 다른 화학적 기 (예컨대 αvβ3 인테그린 리간드, PK 증진제, PD 조정제, 또는 전달 중합체) 또는 관심 절편에 1개 이상의 공유 결합을 통해 연결하는 2개의 원자 사이의 연계이다. 불안정성 연결은 불안정성 결합을 함유한다. 연결은 2개의 이어진 원자 사이의 거리를 증가시키는 스페이서를 임의로 포함할 수 있다. 스페이서는 연결에 가요성 및/또는 길이를 추가로 부가할 수 있다. 스페이서는 알킬 기, 알케닐 기, 알키닐 기, 아릴 기, 아르알킬 기, 아르알케닐 기, 및 아르알키닐 기를 포함하나 이에 제한되지는 않고; 이들 각각은 1개 이상의 헤테로원자, 헤테로사이클, 아미노산, 뉴클레오티드, 및 사카라이드를 함유할 수 있다. 스페이서 기는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 상기 목록은 설명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
일부 실시양태에서, αvβ3 리간드는 추가의 링커를 사용하지 않고 화물 분자에 연결된다. 일부 실시양태에서, αvβ3 리간드는 화물 분자에 대한 연결을 용이하게 하기 위해 용이하게 존재하는 링커를 갖도록 설계된다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 RNAi 작용제가 조성물 내에 포함되는 경우, 2개 이상의 RNAi 작용제는 동일한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결될 수 있다. 일부 실시양태에서, 2개 이상의 RNAi 작용제가 조성물 내에 포함되는 경우, 2개 이상의 RNAi 작용제는 상이한 링커를 사용하여 그의 각각의 표적화 기에 연결된다.
특정 연결기 및 스캐폴드의 예가 표 A에 제공된다.
표 A. 다양한 연결기 및 스캐폴드를 나타내는 구조
Figure pct00114
Figure pct00115
Figure pct00116
Figure pct00117
Figure pct00118
Figure pct00119
Figure pct00120
Figure pct00121
Figure pct00122
Figure pct00123
Figure pct00124
Figure pct00125
여기서
Figure pct00126
는 화물 분자에 대한 부착 지점을 나타낸다.
대안적으로, 관련 기술 분야에 공지되어 있는 다른 연결기가 사용될 수 있다. 적합한 연결기의 예는 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 PCT 출원 번호 PCT/US19/18232에 제공되어 있다.
상기 제공된 실시양태 및 항목은 이제 하기의 비제한적인 실시예로 예시된다.
내부 연결 표적화 리간드
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 인테그린 표적화 리간드가 RNAi 분자에 결합되거나 연결되는 경우에, 인테그린 표적화 리간드는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥의 내부 뉴클레오티드에 결합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 최대 15개의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥 상의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 또는 15개의 표적화 리간드가 HIF-2 알파 RNAi 작용제의 센스 가닥 상의 내부 뉴클레오티드에 접합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 1 내지 5개 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개)의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥 상의 내부 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 3 내지 4개의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥 상의 내부 뉴클레오티드에 접합된다.
일부 실시양태에서, 내부 표적화 리간드의 배치는 RNAi 작용제의 효능 또는 효력에 영향을 미칠 수 있다. RNAi 작용제에 결합된 αvβ3 인테그린 표적화 리간드의 일부 실시양태에서, 표적화 기는 센스 가닥의 5' 단부에 접합되고, 센스 가닥의 5' 단부에 위치한 세자리 표적화 기 및 센스 가닥에 위치한 다음으로 가장 가까운 표적화 리간드 사이에 적어도 10개의 뉴클레오티드가 위치한다. 일부 실시양태에서, 센스 가닥의 5' 단부에 위치한 세자리 표적화 기 및 센스 가닥에 위치한 다음으로 가장 가까운 표적화 리간드 사이에 적어도 5개의 뉴클레오티드가 위치한다.
2개 이상의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥에 위치하는 내부 뉴클레오티드에 접합된 일부 실시양태에서, 표적화 리간드에 접합된 2개의 내부 뉴클레오티드 사이에 위치하는, 표적화 리간드에 접합되지 않은 적어도 1개의 뉴클레오티드 공간이 존재한다. 2개 이상의 표적화 리간드가 RNAi 작용제의 센스 가닥에 접합된 일부 실시양태에서, 표적화 리간드에 접합된 2개의 내부 뉴클레오티드 사이에 위치하는, 표적화 리간드에 접합되지 않은 적어도 2개의 뉴클레오티드가 위치한다.
일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 안티센스 가닥 상의 뉴클레오티드와 염기 쌍을 형성하는 가장 먼 3' 뉴클레오티드로부터 출발하여 3'에서 5'로 넘버링 시, 센스 가닥 상의 제2, 제4, 및 제6 뉴클레오티드에 접합된다. 일부 실시양태에서, 표적화 리간드는 안티센스 가닥과 염기 쌍을 형성하는 센스 가닥 상의 3' 말단 뉴클레오티드로부터 제2, 제4, 제6, 및 제8 뉴클레오티드 (3' → 5')에 접합된다.
내부 표적화 리간드를 부착시키기 위한 변형된 뉴클레오티드의 예가 하기 표 B에 제시된다:
표 B. 표적화 리간드를 부착시키기 위한 변형된 뉴클레오티드를 나타내는 구조.
Figure pct00127
Figure pct00128
실시예
하기 실시예는 본원에 개시된 특정 실시양태를 제한하지 않고 예시하는 것으로 의도된다.
실시예 1. 인테그린 표적화 리간드의 합성
실시예의 합성의 하기 실험 세부사항에 사용된 약어의 일부는 하기와 같이 정의된다: h 또는 hr = 시간; min = 분; mol = 몰; mmol = 밀리몰; M = 몰; μM = 마이크로몰; g = 그램; μg = 마이크로그램; rt 또는 RT = 실온; L= 리터; mL = 밀리리터; wt = 중량; Et2O = 디에틸 에테르; THF = 테트라히드로푸란; DMSO = 디메틸 술폭시드; EtOAc = 에틸 아세테이트; Et3N 또는 TEA = 트리에틸아민; i-Pr2NEt 또는 DIPEA 또는 DIEA = 디이소프로필에틸아민; CH2Cl2 또는 DCM = 메틸렌 클로라이드; CHCl3 = 클로로포름; CDCl3 = 중수소화 클로로포름; CCl4 = 사염화탄소; MeOH = 메탄올; EtOH = 에탄올; DMF = 디메틸포름아미드; BOC = t-부톡시카르보닐; CBZ = 벤질옥시카르보닐; TBS = t-부틸디메틸실릴; TBSCl 또는 TBDMSCl = t-부틸디메틸실릴 클로라이드; TFA = 트리플루오로아세트산; DMAP = 4-디메틸아미노피리딘; NaN3 = 아지드화나트륨; Na2SO4 = 황산나트륨; NaHCO3 = 중탄산나트륨; NaOH = 수산화나트륨; MgSO4 = 황산마그네슘; K2CO3 = 탄산칼륨; KOH = 수산화칼륨; NH4OH = 수산화암모늄; NH4Cl = 염화암모늄; SiO2 = 실리카; Pd-C = 탄소 상 팔라듐; HCl = 염화수소 또는 염산; NMM = N-메틸모르폴린; H2 = 수소 기체; KF = 플루오린화칼륨; EDC-HCl = N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 히드로클로라이드; MTBE = 메틸-tert-부틸 에테르; MeOH = 메탄올; Ar = 아르곤; N2 = 질소; SiO2 = 실리카; RT = 체류 시간; PTSA = 파라-톨루엔술폰산; PPTS = 피리디늄 파라-톨루엔술포네이트.
구조 1c ((S)-3-(6-((1-아지도-15-옥소-3,6,9,12-테트라옥사-16-아자노나데칸-19-일)옥시)피리딘-3-일)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00129
벤젠 (25 mL) 중 화합물 1 (1.03 g, 8.23 mmol), 화합물 2 (0.92 g 14.8 mol), 및 PTSA 수화물 (156 mg, 0.82 mmol)을 함유하는 혼합물을 딘-스타크 장치 내에서 밤새 환류하였다. 다음 날 아침, 반응 혼합물을 포화 중탄산나트륨에 붓고, 에틸 아세테이트를 후속적으로 첨가하였다. 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켜 화합물 3을 95% 수율로 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00130
DMF (100 mL) 중 화합물 4 (5.39 g, 53.3 mmol) 및 3Å 분자체를 함유하는 용액에 수소화나트륨 (60 wt%, 2.13 g, 53.3 mmol)을 첨가하고, 반응물을 1시간 동안 교반하였다. DMF (20 mL) 중 화합물 3 (7.52 g, 7.52 g)의 용액을 후속적으로 첨가하고, 현탁액을 80℃에서 밤새 가열하였다. 완결된 후, 현탁액을 코튼 플러그 상에서 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 디에틸 에테르와 물 사이에 분배하고, 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 TFA 중 10% H2O 20 ml로 처리하고, 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 용액을 0℃로 냉각시키고, 6M NaOH로 pH를 11로 조정하였고, 이때 생성물이 오일로서 침전되었다. 화합물 5를 유성 현탁액으로부터 디에틸 에테르를 사용하여 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 화합물 5를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 26% 수율로 단리하였다.
Figure pct00131
DCM (22 mL) 중 화합물 5 (2.29 g, 9.94 mmol), 화합물 6 (4.82 g, 39.8 mmol), PPTS (125 mg, 0.50 mmol), 황산마그네슘 (3 g, 24.9 mmol), 황산구리 (3.97 g, 24.9 mmol), 및 3 옹스트롬 분자체를 함유하는 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 완결된 후, 혼합물을 여과하고, 감압 하에 농축시켰다. 이어서, 화합물 7을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 76% 수율로 단리하였다.
Figure pct00132
화염 건조된 플라스크에 THF (40 mL) 및 디이소프로필아민 (2.29 g, 22.6 mmol)을 채웠다. 이것을 -20℃로 냉각시키고, n-BuLi (2.5 M, 8.64 mL, 21.6 mmol)를 캐뉼라를 통해 첨가하였다. 용액을 -20℃에서 10분 동안 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 화합물 8 (2.02 mL, 20.6 mmol)을 격렬한 교반 하에 적가하였다. 첨가한 후, 용액을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 다음에, THF (10 mL) 중 용액으로서 ClTi(iPrO)3 (11.26 g, 43.2 mmol)을 첨가 깔때기를 통해 대략 10분에 걸쳐 격렬한 교반 하에 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종적으로, 화합물 7 (2.29 g. 6.86 mmol)을 THF 중 현탁액으로서 적가하고, 반응이 완결될 때까지 -78℃에서 1.25시간 동안 교반하였다. 반응물에 -78℃에서 포화 수성 염화암모늄을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 냉각으로부터 제거하고, 수성 상이 서서히 해동 및 켄칭되게 하였다 (황색빛 오렌지색이 사라짐). 혼합물을 EtOAc와 포화 수성 염화암모늄 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 EtOAc로 2회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수에 이어서 황산나트륨 상에서 건조시키고, 이어서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 정제 후, 화합물 9를 단일 부분입체이성질체로서 75% 수율로 수득하였다.
Figure pct00133
MeOH (3.2 mL) 중 화합물 9 (1.28 g, 3.21 mmol)를 디옥산 중 HCl (4M, 3.2 mL, 12.9 mmol)로 처리하고, 실온에서 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 물로 희석하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 후속적으로, 2 N 수성 NaOH를 사용하여 pH를 11로 조정하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 화합물 10을 92% 수율로 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00134
15℃에서 THF (6 mL) 중 화합물 10 (0.78 g, 2.67 mmol) 및 화합물 11 (0.60 g, 3.46 mmol)의 혼합물에 STAB-H (1.29g, 6.12 mmol)를 조금씩 고체로서 첨가하였다. 첨가한 후, 냉각을 제거하고, 혼합물을 대략 2.5시간 내지 완결될 때까지 교반하였다. 반응물을 포화 수성 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하고, pH를 9로 만들었다. 생성물을 EtOAc로 3회 추출하고, 유기 상을 합하고, 염수로 건조시키고, 이어서 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 12를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 85% 수율로 단리하였다.
Figure pct00135
THF (35 mL) 중 DIPEA (7.53 mL, 53.75 mmol)에 n-BuLi (2.5 M, 19.9 mL, 49.8 mmol)를 오븐 건조된 기밀 구조의 시린지를 통해 2분에 걸쳐 -10℃에서 첨가하였다. 혼합물을 -10℃에서 10분 동안 교반하고, 이어서 -60℃로 냉각시키고, THF (8 mL) 중 디메틸 메틸포스포네이트 (6.42 g, 51.8 mmol)의 용액을 5-10분에 걸쳐 적가하였다. -60℃에서 약 1시간 동안 숙성시킨 후, 화합물 13 (7.37 g. 39.82 mmol)을 THF (15 mL) 중 용액으로서 5분에 걸쳐 -60℃에서 적가하였다. 반응 혼합물을 -60℃에서 1시간 동안 교반한 다음, -41℃에서 약 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 2.6 당량의 H2SO4 (2.0 M)의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (~50 mL)로 3회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 간단히 농축시켜 조 물질의 중량을 결정하고, NMR을 위한 샘플을 채취하였다. 건조 중량이 결정되면, 화합물 14를 후속 반응에 사용하기 위해 추가 정제 없이 MeOH 중에 용해시켰다. 계산치 75.83% 수율. NMR에 의한 조 물질 wt/wt% 76.3%.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 4.75 (s, 1 H), 3.81 (s, 3 H), 3.78 (s, 3 H), 3.10 - 3.14 (m, 2 H), 3.04 - 3.09 (m, 2 H), 2.68 (t, 2 H), 1.82-1.75 (m, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
Figure pct00136
MeOH (40 mL) 중 화합물 14 (~12g 조 물질의 NMR로부터의 중량 기준 9.33g, 30.16 mmol)에 물 (1.5 mL) 중 NaOH (1.45 g, 36.2 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃로 가열하고, 화합물 15 (2.76 g, 22.62 mmol)를 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 화합물 15의 제2 부분 (736 mg, 6.03 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 50℃에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 오일로 농축시키고, 2 부피 EtOAc와 1 부피 H2O 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 1 부피의 물로 세척하였다. 수성 세척물을 합하고, EtOAc로 역추출하였다 (2x, 1 vol). 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 조 물질을 건조시켰고, 대략 20g의 실리카 화합물 16을 실리카 상에서 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 69% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 9.09 (dd, 1 H), 8.17 (dd, 1 H), 8.12 (d, 1 H), 7.46 (dd, 1 H), 7.41 (d, 1 H), 4.78 (s, 1 H), 3.24 (q, 2 H), 3.10 (t, 2 H), 2.12 (quin, 2 H), 1.43 (s, 9 H).
Figure pct00137
EtOH (50 mL) 중 화합물 16 (5.98 g, 20.8 mmol)의 용액에 팔라듐 (탄소 상 10%, 2.22 g, 2.08 mmol) 및 수소를 1 기압에서 채웠다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 셀라이트(Celite)® 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 17을 실리카 상에서 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 79% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.05 (d, 1 H), 6.34 (d, 1 H), 5.48 (s, 1 H), 4.81 (s, 1 H), 3.36 - 3.43 (m, 2 H), 3.16 (q, 2 H), 2.68 (t, 2 H), 2.59 (t, 2 H), 1.90 (dt, 2 H), 1.83 (quin, 2 H), 1.44 (s, 9 H).
Figure pct00138
화합물 17 (4.81 g, 16.53 mmol)을 수성 6 M HCl (16.4 mL) 중에 용해시키고, 42℃에서 2시간 동안 가열하였다. 이어서, 6 M HCl의 추가의 부분 (2.8 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 2시간 동안 교반하였다. 반응물에 염화나트륨에 이어서 수성 2 N NaOH를 생성물이 오일로서 침전될 때까지 첨가하였다 (pH는 12를 초과함). 혼합물을 2-부탄올로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 18을 85% 수율로 수득하고, 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.06 (d, 1 H), 6.35 (d, 1 H), 4.83 (s, 1 H), 3.35 - 3.46 (m, 2 H), 2.75-2.67 (m, 4 H), 2.58 (t, 2 H), 1.88 - 1.95 (m, 2 H), 1.84-1.76 (m, 4 H).
Figure pct00139
-10℃에서 화염 건조된 플라스크 내의 THF (0.9 mL) 중 트리포스겐 (85 mg, 0.28 mmol)의 용액에 THF (0.5 mL) 중 화합물 18 (236 mg, 0.62 mmol) 및 TEA (0.134 mL, 0.96 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. TLC가 완전한 반응을 나타낸 후, 추가의 TEA (0.134 mL)를 첨가하고, 이어서 화합물 12 (166 mg, 0.87 mmol)를 고체로서 첨가하였다. 불균질 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 격렬한 교반 하에 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 1 부피의 물로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 19를 100% 수율로 가정하여 수득하고, 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00140
THF (37 mL) 중에 용해시킨 조 화합물 19 (400 mg, 0.62 mmol로 가정됨)에 H2SO4(2M, 0.6 mL)를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, H2SO4의 추가의 부분 (0.65 당량)을 첨가하였다. 4시간 후에 반응이 완결되었다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 에틸 아세테이트로 1회 역추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 20을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 75% 수율로 단리하였다.
Figure pct00141
에탄올 (9 mL) 중 화합물 20 (251 mg, 0.47 mmol) 및 Pd/C (10 wt%, 100mg, 0.094 mmol)의 현탁액에 1 기압까지 H2를 채우고, 35℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 팔라듐을 셀라이트® 상에서 여과에 의해 제거하였다. 화합물 21을 C18 5u 19x250 mm BEH 칼럼 (워터스 코포레이션(Waters Corp.))을 사용하여 1% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 TFA 염으로서 20% 수율로 단리하였다.
Figure pct00142
DCM (250uL) 중 화합물 21 (61 mg, 0.097 mmol)의 용액에 TEA (8 uL, 0.24 mmol)를 첨가하고, 이어서 NHS-PEG4-N3 (41.4 mg, 0.11 mmol)을 DCM (275 μL) 중 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 15분 동안 교반하고, LC-MS를 확인하였고, 이는 반응이 완결되었음을 나타내었다. 모든 휘발물을 제거하고, 잔류물을 EtOH (0.4 mL) 및 물 (0.4 mL) 중에 용해시켰다. LiOH (11.2 mg, 0.47 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시켰다. 화합물 22 (구조 1c)를 C18 5u 19x250 mm BEH 칼럼 (워터스 코포레이션)을 사용하여 1% TFA를 함유하는 H2O 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 42% 수율로 단리하였다.
구조 2c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00143
톨루엔 (80 mL) 중 화합물 23 (10 g, 43.4 mmol)의 용액에 화합물 6 (21.1g, 0.17 mol), PPTS (0.55g, 2.2 mmol)에 이어서 아세트산 (1.24 mL, 21.7 mmol)을 첨가하였다. 반응 용기에 딘 스타크 트랩을 장착한 다음, 환류 하에 밤새 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 농축시키고, 실리카 60 그램 상에서 건조시키고, 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 SiO2 상에서 정제하여, 화합물 24를 66% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 8.47 (s, 1 H), 7.68 (d, 1 H), 7.31 - 7.56 (m, 6 H), 6.98 - 7.16 (m, 1 H), 5.23 (s, 2 H), 1.26 (s, 9 H).
Figure pct00144
화염 건조된 플라스크에 THF (190 mL) 및 DIPEA (9.07 g, 89.7 mmol)를 채우고, -20℃로 냉각시킨 다음, 캐뉼라를 통해 n-BuLi (2.5M, 34.2 mL, 85.6 mmol)를 채웠다. 용액을 -20℃에서 10분 동안 교반한 다음, -78℃로 냉각시켰다. 화합물 8 (8 mL, 81.5 mmol)을 격렬한 교반 하에 적가하였다. 첨가한 후, -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 이어서, ClTi(iPrO)3 (44.6g, 0.171 mol)을 THF (40 mL) 중 용액으로서 첨가 깔때기를 통해 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 -78℃에서 30분 동안 교반하였다. 최종적으로, 화합물 24 (9.06g, 27.2 mmol)를 THF (20 mL) 중 현탁액으로서 적가하고, 반응이 완결될 때까지 -78℃에서 1.25시간 동안 교반하였다. -78℃에서 반응물에 포화 수성 염화암모늄을 첨가하였다. 이어서, 반응물을 냉각으로부터 제거하고, 수성 상이 서서히 해동 및 켄칭되게 하였다 (황색빛 오렌지색이 사라짐). 혼합물을 EtOAc와 포화 수성 염화암모늄 사이에 분배하였다. 유기 상을 분리하고, 수성 상을 EtOAc로 2회 세척하였다. 유기 상을 합하고, 염수에 이어서 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 25를 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 단일 부분입체이성질체로서 70% 수율로 수득하였다.
1H NMR:400 MHz CDCl3 δ 7.31 - 7.48 (m, 5 H), 7.09 (dd, 1 H), 6.89 - 7.04 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 4.59 - 4.76 (m, 2 H), 4.13 (q, 2 H), 2.81 (dd, 2 H), 1.21 - 1.25 (m, 12 H).
Figure pct00145
화합물 25 (8.07g, 19.1 mmol)에 수성 HCl (6M, 20.7 mL, 0.124 mol)에 이어서 MeOH (60 mL)를 첨가하였다. 균질 용액이 수득될 때까지 THF를 첨가하고, 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 2 N NaOH를 사용하여 pH 10으로 염기성화시킨 다음, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 26을 95% 수율로 수득하였고, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.28 - 7.46 (m, 6 H), 7.18 (d, 1 H), 6.99 (t, 1 H), 5.11 (s, 2 H), 4.57 (t, 1 H), 4.09 (q, 2 H), 2.97 - 3.09 (m, 1 H), 2.81 - 2.93 (m, 1 H), 1.18 (t, 3 H).
Figure pct00146
0℃에서 THF (40 mL) 중 화합물 26 (5.76g, 18.2 mmol) 및 화합물 27 (4.09g, 23.6 mmol)의 혼합물에 STAB-H (8.85g, 41.8 mmol)를 고체로서 조금씩 첨가하였다. 최종 첨가 후, 냉각을 제거하고, 혼합물을 대략 2.5시간 내지 완결될 때까지 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 28을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리하여 73% 수율로 단리하였다.
1H NMR: 400 MHz CDCl3 δ 7.30 - 7.49 (m, 5 H), 7.11 (dd, 1 H), 6.88 - 7.02 (m, 2 H), 5.13 (s, 2 H), 4.40 (t, 1 H), 4.10 (q, 2 H), 4.00 (dd, 1 H), 3.35 (s, 3 H), 3.31 (s, 3 H), 2.47 - 2.75 (m, 4 H), 1.20 (t, 3 H).
Figure pct00147
-10℃에서 화염 건조된 플라스크 내의 THF (24 mL) 중 트리포스겐 (1.2 g, 4.04 mmol)의 용액에 THF (6 mL) 중 화합물 19 (3.64 g, 8.99 mmol) 및 TEA (1.94 mmol, 13.9 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하였다. TLC가 완전한 반응을 나타낸 후, 추가의 TEA (3.3 mL, 23.6 mmol)를 첨가하고, 이어서 화합물 28 (2.61 g, 13.7 mmol)을 고체로서 첨가하였다. 불균질 혼합물을 50℃에서 2시간 동안 격렬한 교반 하에 가열하였다. 완결된 후, 반응 혼합물을 1 부피의 물로 켄칭하고, EtOAc로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 29를 100% 수율로 가정하여 수득하고, 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00148
THF (37 mL) 중에 용해시킨 화합물 29 (5.59g, 8.97 mmol)에 물 (0.8 mL) 및 H2SO4 (2M, 8.07 ml, 16.2 mmol)를 첨가하고, 반응 혼합물을 28℃에서 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, 혼합물의 pH를 중탄산나트륨을 사용하여 9로 조정하고, DCM으로 3회 추출하였다. 합한 유기 상을 염수로 건조시키고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 30을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 82% 수율로 단리하였다.
Figure pct00149
EtOH (30 mL) 중에 용해시킨 화합물 30 (4.13 g, 7.39 mmol)에 데구사(Degussa)® 팔라듐 (10 wt%, 3.15 g, 2.96 mmol) 및 수소를 50psi까지 채웠다. 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응은 64% 완결되었다. 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 EtOH 중에 용해시키고, 팔라듐 (10 wt%, 1.57 g, 1.48 mmol) 및 수소로 50 psi까지 채웠다. 48시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 30℃로 가열하고, 추가로 24시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 셀라이트® 상에서 여과하고, 모든 휘발물을 진공 하에 제거하였다. 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 31을 72% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 9.88 (s, 1 H), 7.02 - 7.14 (m, 2 H), 6.86 - 6.93 (m, 2 H), 6.50 - 6.76 (m, 1 H), 6.31 (d, 1 H), 5.17 (t, 1 H), 4.00 (q, 2 H), 3.23 - 3.28 (m, 4 H), 2.79 - 3.18 (m, 7 H), 2.61 (t, 2 H), 2.41 (t, 2 H), 1.65 - 1.78 (m, 4 H), 1.09 (t, 3 H).
Figure pct00150
-10℃에서 THF (0.47 mL) 중 PPh3 (699 mg, 2.66 mmol)의 용액에 DEAD의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 화합물 31 (600mg, 1.33 mmol) 및 HO-PEG4-N3, (466 mg, 3.06 mmol)의 순수한 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 32를 50% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz DMSO-d6 δ 7.10 - 7.19 (m, 2 H), 6.97 - 7.06 (m, 2 H), 6.18 - 6.31 (m, 2 H), 5.20 (t, 1 H), 4.13 - 4.16 (m, 1 H), 3.98 - 4.04 (m, 2 H), 3.71 - 3.80 (m, 2 H), 3.52 - 3.61 (m, 8 H), 3.38 - 3.37 (m, 5 H), 3.10 - 3.25 (m, 5 H), 2.79 - 3.08 (m, 5 H), 2.59 (t, 2 H), 2.31 - 2.42 (m, 2 H), 1.65 - 1.75 (m, 4 H), 1.10 (t, 3 H).
Figure pct00151
화합물 32 (826 mg, 1.23 mmol)에 EtOH (3 mL) 및 H2O (3 mL)에 이어서 LiOH (97 mg, 4.05 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH=5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 페노메넥스 제미니(Phenomenex Gemini) C18, 50 x 250 mm, 10 μm 칼럼을 사용하여 0.1%를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 정제하여, 화합물 33 (구조 2c)을 81% 수율로 수득하였다.
1H NMR: 400 MHz D2O δ 7.30 (d, 1 H), 7.01 - 7.19 (m, 3 H), 6.45 (d, 1 H), 5.24 (t, 1 H), 4.14 - 4.32 (m, 2 H), 3.84 - 3.92 (m, 2 H), 3.59 - 3.77 (m, 10 H), 3.14 - 3.45 (m, 8 H), .02 - 3.12 (m, 1 H), 2.97 (d, 2 H), 2.85 (q, 1 H), 2.50 - 2.72 (m, 4 H), 1.68 - 1.94 (m, 4 H).
구조 2.1c ((S)-3-(4-((11-아지도운데실)옥시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00152
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 OH-(CH2)11-N3의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물/EtOH를 첨가하였다. 실온에서 1.5시간 동안 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하였다.
구조 2.2c ((S)-3-(4-(2-(1-(6-아지도헥사노일)피페리딘-4-일)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00153
0℃에서 DCM 중에 용해된 화합물 35를 EDAC로 처리하고, 아세토니트릴을 첨가하여 용해도를 보조하였다. 5분 후, TEA 및 화합물 36을 첨가하고, 냉각을 제거하고, 2시간 동안 교반을 계속하였다. 완결된 후, 포화 염화암모늄을 첨가하고, 유기 상을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00154
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 37의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 38 (구조 2.2c)을 수득하였다.
구조 2.3c ((S)-3-(4-(2-((1r,4S)-4-(5-아지도펜탄아미도)시클로헥실)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00155
0℃에서 DCM 중 화합물 35의 현탁액에 EDAC를 DCM 중 용액으로서 첨가하였다. 5분 후, 냉각을 제거하고, 화합물 39를 첨가한 다음, TEA를 첨가하였다. 불균질 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 다음 날, 반응물을 DCM으로 희석하고, 침전물을 용해시켰다. 혼합물을 5% KHSO4로 2회 및 염수로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 40을 함유하는 조 잔류물을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00156
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 40의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 41 (구조 2.3c)을 수득하였다.
구조 2.4c ((S)-3-(4-(4-(5-아지도펜탄아미도)페네톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00157
DCM 중 화합물 35 및 화합물 42의 혼합물에 EEDQ를 첨가하고, 용액을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM으로 희석하고, 1M HCl로 3회 세척하고, 염수로 1회 세척하였다. 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 이어서, 화합물 43을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00158
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 43의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 44 (구조 2.4c)를 수득하였다.
구조 2.5c ((S)-3-(4-(4-((5-아지도펜틸)옥시)페네톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00159
아세톤 중 화합물 45 및 화합물 46의 용액에 탄산칼륨을 첨가하였다. 혼합물을 현탁액으로서 밀봉된 바이알에서 N2 보호 하에 밤새 격렬히 교반하면서 65℃로 가열하였다. 이어서, 반응물을 여과하고, 농축시키고, 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 47을 수득하였다.
Figure pct00160
DMF 중 화합물 47의 용액에 아지드화나트륨을 첨가하고, 혼합물을 밀봉된 바이알에서 질소 보호 하에 80℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 1 부피의 물을 첨가하고, 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 48의 조 물질을 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00161
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 실온에서 격렬한 교반 하에 적가하였다. 혼합물을 화합물 31 및 화합물 48의 혼합물이 들은 바이알로 옮기고, 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반하였다. 휘발물을 반응 혼합물로부터 제거하고, 조 물질을 EtOH 중에 용해시켰다. LiOH를 H2O 중 용액으로서 첨가하고, 반응 혼합물이 균질해질 때까지 추가의 물을 첨가하였다. 1.5시간 동안 실온에서 교반한 후, 혼합물을 H2SO4로 pH 3으로 산성화시키고, 농축시키고, 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm, 아세토니트릴 중 0.1% TFA/물, 구배 용리)에 의해 정제하여 화합물 49 (구조 2.5c)를 수득하였다.
구조 2.6c ((S)-3-(3-(3-(3-(17-아지도-3-옥소-6,9,12,15-테트라옥사-2-아자헵타데실)-5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)-2-옥소이미다졸리딘-1-일)-3-(3-플루오로-4-메톡시페닐)프로판산)의 합성.
Figure pct00162
THF 중 PPh3의 용액에 DEAD 용액을 0℃에서 적가하였다. 첨가를 완결한 후, 혼합물을 화합물 31 및 MeOH의 순수한 혼합물이 들은 바이알로 옮겼다. 바이알을 N2로 캡핑하고, 실온에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 수득된 조 물질을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여, 화합물 50을 수득하였다.
Figure pct00163
AcOH 중 화합물 50의 용액에 브로민을 첨가하고, 혼합물을 0.5시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 에틸 아세테이트 5 부피 및 물 2.5 부피로 희석하였다. 수성 층을 포화 수성 중탄산나트륨으로 pH 7로 중화시키고, 유기 상을 분리하였다. 수성 층을 에틸 아세테이트로 추가로 2회 추출하였다. 합한 유기 상을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 51의 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00164
DMAC 중 화합물 51, Pd(PPh3)4, 및 Zn(CN)2의 용액을 질소로 30분 동안 탈기시켰다. 혼합물을 밀봉된 바이알에서 128℃에서 밤새 가열하였다. 완결된 후, 혼합물을 EtOAc 5 부피로 희석하였다. 유기 상을 분리한 다음, 물로 2회 세척하고, 염수로 2회 세척한 다음, 유기 상을 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 실리카 상에서 100% EtOAc로 용리시키면서 정제하여, 화합물 52를 수득하였다.
Figure pct00165
MeOH 중 화합물 52의 용액에 암모니아를 첨가한 다음, 메탄올로 3회 사전에-헹군 라니 니켈의 슬러리를 첨가하였다. 파르(Parr)® 플라스크를 수소로 60 psi까지 채우고, 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 잔류물을 DMF 중에 재용해시켰다. DIEA 및 NHS-PEG4-N3을 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 잔류물을 MeOH 및 THF의 혼합물 중에 재용해시켰다. H2O 중 LiOH를 첨가하고, 혼합물을 실온에서 17시간 동안 교반하였다. 반응이 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 혼합물을 반정제용 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리) 상에 직접 주입하여 화합물 53 (구조 2.6c)을 수득하였다.
구조 2.7c ((S)-N-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-3-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판아미드), 구조 2.8c, 구조 2.9c, 및 구조 2.10c의 합성.
Figure pct00166
화합물 31에 순차적으로 THF, PPh3, 및 DEAD의 용액을 0℃에서 적가하였다. 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 이어서, 혼합물을 -20℃로 1시간 동안 냉각시키고, 여과하여 트리페닐포스핀 옥시드를 제거하였다. 여과물을 농축시키고, O-알킬화의 중간체를 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 정제하여 단리하였다. 이어서, 단리된 중간체를 THF 및 H2O의 혼합물 중에 현탁시키고, H2O 중 LiOH로 처리하고, 35℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 2 M HCl로 pH를 7로 조정하고, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 H2O에 현탁시키고; 염화나트륨을 첨가하고, 화합물 54를 에틸 아세테이트로 5회 추출하였다. 유기 상을 합하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 화합물 54를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00167
DMF 중 화합물 54의 용액을 HBTU로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. DIEA 및 N3-PEG3-NH2를 후속적으로 첨가하고, 혼합물을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, TFA로 pH를 3으로 조정하고, 화합물 55를 반정제용 역상 HPLC (페노메넥스 제미니 C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에의 직접 주입에 의해 단리하여 화합물 55를 수득하였다.
유사한 절차를 사용하여, 각각 N3-PEG11-NH2, N3-PEG23-NH2 및 N3-PEG35-NH2를 사용하여, 화합물 2.8c, 2.9c 및 2.10c를 합성하였다.
구조 2.11c ((R)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(2-옥소-3-(3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필)이미다졸리딘-1-일)프로판산)의 합성.
Figure pct00168
질소의 불활성 분위기로 퍼징되고 유지된 3-L 4구 둥근 바닥 플라스크에 THF (1.50 L), DIPEA (150.00 mL, 716.000 mmol, 0.88 당량), n-BuLi (430.00 mL, 680.000 mmol, 0.84 당량)를 넣었다. 이어서, 트리메틸 포스파이트 (195.00 mL)를 -60℃에서 첨가하고, -60℃에서 1시간 동안 교반하였다. 여기에 tert-부틸 2-옥소피롤리딘-1-카르복실레이트 (150.00 g, 809.835 mmol, 1.00 당량)를 -60℃에서 첨가하였다. 생성된 용액을 -60℃에서 액체 질소 조에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서 반응물을 H2SO4 (2N) 350 mL를 첨가하여 켄칭하고, H2O 1.5 L로 희석하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하였다. 생성된 혼합물을 H2O 1x1 L로 세척하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[5-(디메톡시포스포릴)-4-옥소펜틸]카르바메이트 200 g (조 물질)을 황색 오일로 수득하였다.
Figure pct00169
3-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[5-(디메톡시포스포릴)-4-옥소펜틸]카르바메이트 (200.00 g, 1500.00 mmol, 1.50 당량), MeOH (1.50 L), 2-아미노피리딘-3-카르브알데히드 (53.00 g, 1000.00 mmol, 1.00 당량), NaOH (50.00 g, 1500.00 mmol, 1.50 당량)를 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 16시간 동안 교반하였다. 용액의 pH 값을 NaHCO3 (수성)으로 8로 조정하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 물 1.5 L의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 2x1.5L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[3-(1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 160 g (조 물질)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00170
5-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[3-(1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 (160.00 g, 556.787 mmol, 1.00 당량), MeOH (2.00 L), Rh/C (140.00 g, 1.360 mmol), H2 (40 Psi)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 tert-부틸 N-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 106 g (65.33%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00171
1-L 둥근 바닥 플라스크에 tert-부틸 N-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바메이트 (106.00 g, 363.767 mmol, 1.00 당량), EtOAc (500.00 mL), EtOAc 중 HCl (4M, 400.00 mL)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 3시간 동안 교반하였다. 생성된 용액을 H2O 1L로 희석하였다. NaOH (수성)를 사용하여 pH를 11로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로판-1-아민 56 g (80.48%)을 황색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00172
2-L 둥근 바닥 플라스크에 3-플루오로-4-히드록시벤즈알데히드 (140.00 g, 999.194 mmol, 1.00 당량), ACN (1000 mL), (브로모메틸)벤젠 (205.08 g, 1199.039 mmol, 1.20 당량), K2CO3 (414.28 g, 2997.581 mmol, 3.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 4-(벤질옥시)-3-플루오로벤즈알데히드 230 g (99.98%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00173
3-L 둥근 바닥 플라스크에 4-(벤질옥시)-3-플루오로벤즈알데히드 (230.00 g, 998.966 mmol, 1.00 당량), DCM (1600 mL), (S)-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (145.29 g, 1198.762 mmol, 1.20 당량), Cs2CO3 (650.97 g, 1997.933 mmol, 2.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 6시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이로써 (S)-N-[[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]메틸리덴]-2-메틸프로판-2-술핀아미드 260 g (78.06%)을 백색 고체로서 수득하였다.
Figure pct00174
질소의 불활성 분위기로 퍼징되고 유지된 3-L 둥근 바닥 플라스크에 THF (2.0 L), Zn (1.02 kg, 15595.945 mmol, 20.00 당량), CuCl (115.80 g, 1169.696 mmol, 1.50 당량), 에틸 2-브로모아세테이트 (325.57 g, 1949.498 mmol, 2.50 당량), (S)-N-[[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]메틸리덴]-2-메틸프로판-2-술핀아미드 (260.00 g, 779.797 mmol, 1.00 당량)를 넣었다. 생성된 용액을 물/빙조에서 0℃에서 30분 동안 교반하였다. 온도를 오일 조에서 50℃로 유지하면서 생성된 용액을 교반하면서 추가로 2시간 동안 반응되게 하였다. 고체를 여과하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 2 L의 물의 첨가에 의해 켄칭하고, 에틸 아세테이트 2x2 L로 추출하였다. 합한 유기 층을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써, 에틸 (3R )-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[[(S)-2-메틸프로판-2-술피닐]아미노]프로파노에이트 150 g (45.63%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00175
1-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[[(S)-2-메틸프로판-2-술피닐]아미노]프로파노에이트 (150.00 g, 355.847 mmol, 1.00 당량), 1,4-디옥산 중 HCl (400.00 mL, 4M)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 생성된 혼합물을 농축시켰다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. NaHCO3 (수성)을 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-아미노-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]프로파노에이트 100 g (88.55%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00176
2-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-아미노-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]프로파노에이트 (100.00 g, 315.100 mmol, 1.00 당량), THF (1.00 L), 2,2-디메톡시아세트알데히드 (49.21 g, 472.696 mmol, 1.50 당량), NaBH(OAc)3 (133.57 g, 630.199 mmol, 2.00 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 2시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)아미노]프로파노에이트 80 g (62.62%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00177
2-L 3구 둥근 바닥 플라스크에 트리포스겐 (22.25 g, 74.975 mmol, 0.38 당량), THF (500 mL), 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)아미노]프로파노에이트 (80.00 g, 197.304 mmol, 1.00 당량), TEA (29.95 g, 295.956 mmol, 1.50 당량), 3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로판-1-아민 (화합물 177, 33.97 g, 177.573 mmol, 0.90 당량)을 넣었다. 생성된 용액을 오일 조에서 50℃에서 1시간 동안 교반하였다. 이어서, 반응물을 물 1 L의 첨가에 의해 켄칭하였다. NaHCO3 (수성)을 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 에틸 아세테이트 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)([[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바모일])아미노]프로파노에이트 96 g (78.13%)을 황색 조 오일로서 수득하였다.
Figure pct00178
1000-mL 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[(2,2-디메톡시에틸)([[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]카르바모일])아미노]프로파노에이트 (96.00 g, 154.158 mmol, 1.00 당량), THF (500.00 mL), H2SO4 (180.00 mL, 2M)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 16시간 동안 교반하였다. NaOH (5M)를 사용하여 pH를 8로 조정하였다. 생성된 용액을 디클로로메탄 2x1 L로 추출하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 농축시켰다. 잔류물을 디클로로메탄/메탄올 (50/1)을 사용하여 실리카 겔 칼럼 상에 적용하였다. 수집된 분획을 합하고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]-2,3-디히드로-1H-이미다졸-1-일]프로파노에이트 73 g (84.76%)을 황색 오일로서 수득하였다.
Figure pct00179
3-L 둥근 바닥 플라스크에 에틸 (3R)-3-[4-(벤질옥시)-3-플루오로페닐]-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]-2,3-디히드로-1H-이미다졸-1-일]프로파노에이트 (73.00 g, 130.671 mmol, 1.00 당량), EtOH (1.50 L), Pd(OH)2/C (60.00 g, 427.259 mmol, 3.27 당량), H2 (50 atm)를 넣었다. 생성된 용액을 25℃에서 72시간 동안 교반하였다. 고체를 여과하였다. 잔류물을 디클로로메탄/메탄올 (9/1)과 함께 실리카 겔 칼럼 상에 적용하였다. 수집된 분획을 합하고, 농축시켰다. 이로써 에틸 (3R)-3-(3-플루오로-4-히드록시페닐)-3-[2-옥소-3-[3-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)프로필]이미다졸리딘-1-일]프로파노에이트 41.0415 g (66.75%)을 황색 오일로서 수득하였다.
LCMS-PH-ARP-052-0: [MS+1]+=471
회전 광학 [a]D 20.0 = +37.5o (C=1 g/100ml MeOH 중)
H-NMR: (300 MHz, DMSO-d6, ppm) δ 9.84 (s, 1H), 7.07 - 7.00 (m, 2H), 6.95 - 6.850 (m, 2H), 6.24 (d, 2H), 5.18 (t, 1H), 4.06 - 3.96 (m, 2H), 3.32 - 2.75 (m, 10H), 2.60 (t, 2H), 2.37 (t, 2H), 1.77 - 1.67 (m, 4H), 1.10 (t, 3H).
Figure pct00180
-10℃에서 THF 중 PPh3의 용액에 DEAD의 용액을 적가하였다. 혼합물을 실온으로 가온하고, 화합물 185 및 HO-PEG4-N3의 순수한 혼합물에 첨가하고, 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 감압 하에 농축시키고, 잔류물을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 정제하여 화합물 186을 수득하였다.
Figure pct00181
화합물 186에 EtOH 및 H2O, 이어서 LiOH를 첨가하였다. 혼합물을 30℃에서 밤새 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH=5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 페노메넥스 제미니 C18, 50 x 250 mm, 10 μm 칼럼을 사용하여 0.1%를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 역상 HPLC에 의해 정제하여, 화합물 187 (구조 2.11c)을 수득하였다.
구조 28c (화합물 118a) 구조 29c (화합물 118b), 구조 31c (화합물 119a), 및 구조 30c (화합물 119b)의 합성.
Figure pct00182
LHMDS (THF 중 1.0 M, 95 mL, 95 mmol) 및 THF (60 mL)의 용액에 THF (180 mL) 중 화합물 103 (2-메틸-[1,8]나프티리딘 (12.5 g, 86.7 mmol))의 용액을 -78℃에서 적가하였다. 30분 동안 교반한 후, THF (120 mL) 중 화합물 104 (5-브로모-1-펜텐 (19.4 g, 130 mmol))의 용액을 반응 혼합물에 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃로 가온하고, 4시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (100 mL) 및 탈이온수 (100 mL)로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (2 x 400 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 105를 콤비플래쉬(CombiFlash)®에 의해 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 105의 수율: 7.93 g (43%).
Figure pct00183
아세톤 (67.5 mL), 물 (7.5 mL), 및 2,6 루티딘 (2.74 mL, 23.6 mmol) 중 화합물 105 (2.50 g, 11.8 mmol)의 용액에 실온에서 4-메틸모르폴린 N-옥시드 (2.07 g, 17.7 mmol) 및 사산화오스뮴 (t-부탄올 중 2.5wt%, 2.40 g, 0.24 mmol)을 첨가하였다. 75분 동안 교반한 후, (디아세톡시아이오도)벤젠 (5.69 g, 17.7 mmol)을 반응 혼합물에 첨가하였다. 반응 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 포화 수성 티오황산나트륨 용액 (100 mL)으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (2 x 100 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 106을 콤비플래쉬®에 의해 에틸 아세테이트 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 106의 수율: 1.12 g (44%).
Figure pct00184
THF (9 mL) 중 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.185 g, 4.64 mmol)의 현탁액에 THF (5 mL) 중 화합물 107 (디에틸 (N-메톡시-N-메틸카르바모일메틸)포스포네이트) (1.06 g, 4.43 mmol)의 용액을 0℃에서 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, THF (9 mL) 중 화합물 106 (0.903 g, 4.21 mmol)의 용액을 적가하였다. 반응 혼합물을 0℃에서 10분 동안 교반한 다음, 포화 수성 NH4Cl 용액 (30 mL)으로 켄칭하고, 에틸 아세테이트 (3 x 30 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 반포화 수성 NaHCO3 용액으로 2회 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 화합물 108의 수율: 1.40 g (100% 수율로 가정하고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용함).
Figure pct00185
에틸 아세테이트 (20 mL) 중 화합물 108 (1.31 g, 4.38 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 0.466 g, 0.44 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기를 H2로 50 PSI까지 가압하였다. 3.5시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 메탄올로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 화합물 109를 콤비플래쉬®에 의해 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 109의 수율: 0.833 g (62%).
Figure pct00186
THF (10 mL) 중 화합물 109 (0.833 g, 2.73 mmol)의 용액에 DIEA (0.590 mL, 3.41 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (0.744 g, 3.41 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃로 5시간 동안 가열하였다. 반응은 LC/MS에 기초하면 불완전하였고, 추가의 부분의 DIEA (0.590 mL, 3.41 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (0.744 g, 3.41 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 추가로 16시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 화합물 110을 콤비플래쉬®에 의해 헥산 중 50-100% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 110의 수율: 0.934 g (84%).
Figure pct00187
n-부틸 리튬 (헥산 중 2.5 M, 0.70 mL, 1.8 mmol) 및 THF (1.5 mL)의 용액에 화합물 111 (5-브로모-2-(페닐메톡시)-피리딘) (0.465 g, 1.8 mmol)을 THF (0.8 mL) 중 용액으로서 -78℃에서 3분에 걸쳐 적가하였다. 이어서 화합물 110 (0.535 g, 1.3 mmol)을 THF (1 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 30분 동안 교반한 후, 반응물을 0℃로 가온하고, 포화 수성 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, 6 M 수성 HCl을 사용하여 pH 7로 추가로 산성화시켰다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. THF (8 mL) 중 조 물질의 용액에 DIEA (0.94 mL, 5.4 mmol) 및 디-tert-부틸 디카르보네이트 (1.18 g, 5.4 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 40℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 화합물 112를 콤비플래쉬®에 의해 헥산 중 0-40% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하였다. 화합물 112의 수율: 471 mg (50%).
Figure pct00188
디메톡시에탄 (2 mL) 중 수소화나트륨 (미네랄 오일 중 60% 분산액, 0.106 g, 2.65 mmol)의 현탁액에 0℃에서 화합물 113 (트리에틸 포스포노아세테이트) (0.593 g, 2.65 mmol)을 디메톡시에탄 (1 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 20분 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 디메톡시에탄 (2 mL) 중 화합물 112 (0.467 g, 0.88 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 70℃에서 4시간 동안 가열하였다. 반응물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (10 mL)으로 켄칭하고, 생성물을 에틸 아세테이트 (3 x 15 mL)로 추출하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 화합물 114를 헥산 중 0-30% 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 시스:트랜스 이성질체의 1:1 혼합물로서 단리하였다. 화합물 114의 수율: 392 mg (74%).
Figure pct00189
에탄올 (6 mL) 중 화합물 114 (390 mg, 0.65 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 69 mg, 0.07 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기를 H2로 50 PSI까지 가압하였다. 4시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 메탄올로 헹구었다. 여과물을 농축시키고, 화합물 115를 DCM 중 0-10% 메탄올의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 라세미 혼합물로서 단리하였다. 화합물 115의 수율: 95 mg (29%). 키랄 반정제용 HPLC (250 x 21 mm 키랄팩(Chiralpak)® AD 칼럼, 5 μm, 90/10 헥산/EtOH, 40 mL/분)를 사용하여 42 mg의 제1 용리 R-이성질체 (RT = 12-14 m, >99% ee, 화합물 115a) 및 40 mg의 제2 용리 S-이성질체 (RT = 15-18 m, >98% ee, 화합물 115b)를 단리하였다. R- 및 S-이성질체의 아이덴티티는 문헌 [Coleman et al. 47 J. Med. Chem. 4834 (2004)]에 보고된 구조적으로 유사한 화합물의 용리 순서에 기초하여 할당되었다.
구조 28c ((R)-3-(6-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 31c ((R)-3-(1-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)
Figure pct00190
DMF (0.5 mL) 중 화합물 115a (41 mg, 0.08 mmol) 및 N3-PEG4-OTs (61 mg, 0.16 mmol)의 용액에 탄산세슘 (53 mg, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액 (1 mL)으로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (3 x 3 mL)로 추출하였다. 유기 상을 감압 하에 농축시켰다. N- 및 O-알킬화된 위치이성질체의 조 혼합물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00191
THF (1.0 mL) 및 탈이온수 (1.0 mL) 중 화합물 116a 및 117a (58 mg, 0.08 mmol, 9a:10a의 4:6 혼합물)의 용액에 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반한 다음, 35℃에서 2시간 동안 교반하였다. 추가 부분의 수산화리튬 (4 mg, 0.16 mmol)을 첨가하고, 반응 온도를 40℃로 증가시켰다. 3시간 동안 교반한 후, 최종 부분의 수산화리튬 (4 mg, 0.25 mmol, 총 16 mg, 0.66 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 6 N 수성 HCl을 사용하여 pH 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 위치이성질체, 화합물 118a 및 119a를, 0.5% 아세트산을 함유하는 DCM 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 콤비플래쉬®에 의해 분리하였다. 화합물 118a를 역상 HPLC (써모 사이언티픽(Thermo Scientific)™ 아쿠아실(Aquasil)™ C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 20 mL/분, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에 의해 추가로 정제하여, 화합물 118a (구조 28c) 13 mg를 수득하였다. 화합물 119a를 동일한 조건 하에 정제하여, 16 mg의 화합물 119a (구조 31c)를 수득하였다.
구조 29c ((S)-3-(6-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 30c ((S)-3-(1-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에틸)-6-옥소-1,6-디히드로피리딘-3-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)
Figure pct00192
DMF (0.5 mL) 중 화합물 115b (40 mg, 0.08 mmol) 및 N3-PEG4-OTs (58 mg, 0.16 mmol)의 용액에 탄산세슘 (51 mg, 0.16 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 수성 NaHCO3 용액 (1 mL)으로 켄칭한 다음, 에틸 아세테이트 (3 x 3 mL)로 추출하였다. 유기 상을 감압 하에 농축시켰다. N- 및 O-알킬화된 위치이성질체의 조 혼합물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00193
THF (0.75 mL) 및 탈이온수 (0.75 mL) 중 화합물 116b 및 117b (56 mg, 0.08 mmol, 9a:10a의 4:6 혼합물)의 용액에 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 2.5시간 동안 교반하였다. 추가 부분의 수산화리튬 (6 mg, 0.25 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 2.5시간 동안 교반하였다. 반응 온도를 35℃로 낮추고, 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 6 N 수성 HCl을 사용하여 pH = 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 위치이성질체인 화합물 118b 및 119b를 콤비플래쉬에 의해 0.5% 아세트산을 함유하는 DCM 중 0-5% 메탄올의 구배로 용리시키면서 분리하였다. 화합물 118b를 역상 HPLC (써모 사이언티픽™ 아쿠아실™ C18, 250 x 21.2 mm, 5 μm, 20 mL/분, 물 중 0.1% TFA/ACN, 구배 용리)에 의해 추가로 정제하여, 화합물 118b (구조 29c) 14 mg를 수득하였다. 화합물 119b를 동일한 조건 하에 정제하여, 18 mg의 화합물 119b (구조 30c)를 수득하였다.
구조 32c ((R)-3-(4-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(N-메틸-5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜탄아미도)프로판산)의 합성
Figure pct00194
3Å 체 상의 톨루엔 (80 mL) 중 화합물 120 (2.75 g, 11.94 mmol)에 화합물 121 (5.79 g, 47.78 mmol)에 이어서 PPTS (300 mg, 1.19 mmol), 이어서 AcOH (683 uL, 11.94 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 밤새 환류하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 층을 2 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하였다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트 (0-30%)의 구배로 용리시키면서 단리하여 2.054 g (54%)을 수득하였다.
Figure pct00195
-78℃에서 THF (15 mL) 중 DIA (2.85 mL, 20.33 mmol)에 n-BuLi의 2.5M 용액 (7.76 mL, 19.41 mmol)을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 5분 동안 계속하고, 에틸 아세테이트 (1.81 mL, 18.48 mmol)를 적가하였다. -78℃에서 추가로 10분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 클로로 티타늄 트리이소프로폭시드 (9.27 mL, 38.381 mmol)의 용액을 적가하였다. -78℃에서 추가로 15분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 화합물 122 (2.054 g, 6.16 mmol)의 용액을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 1.5시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산암모늄의 첨가에 의해 켄칭하였다. 현탁액을 6 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 1.043 g (53%)을 수득하였다.
Figure pct00196
MeOH (3 mL) 중에서 교반 중인 화합물 123 (1.043 g, 2.47 mmol)에 디옥산 중 4M HCl 용액 (3.09 mL, 12.37 mmol)을 첨가하였다. 탈보호가 완결된 후, 용액을 물 (8 mL)로 희석하고, 디에틸 에테르 (6 mL)로 2회 세척하였다. 수성 층을 후속적으로 수산화나트륨을 사용하여 pH 11로 조정하였다. 침전물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 합한 유기 추출물을 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 생성물 124 0.616 g (78.5%)을 수득하였으며, 이를 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00197
0℃에서 THF (1.5 mL) 중 화합물 125 (92.1 mg, 0.275 mmol)에 DCC (68.1 mg, 0.331 mmol)를 첨가하였다. 5분 후, PNP (106.1 mg, 0.331 mmol)를 첨가하고, 빙조를 제거하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 현탁액을 -20℃로 1시간 동안 냉각시키고, 침전물을 여과에 의해 제거하였다. 상청액을 농축시켜 조 생성물 126 129 mg (103%)을 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00198
DMF (2 mL) 중 화합물 124 (148.6 mg, 0.468 mmol) 및 탄산칼륨 (129 mg, 0.937 mmol)을 함유하는 혼합물을 메틸 아이오다이드 (66.5 mg, 0.468 mmol)로 처리하고, 50℃에서 3시간 동안 교반하였다. 알킬화가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 생성물을 실리카 상에서 각각 1% TEA로 완충된 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 94.6 mg (61%)을 수득하였다.
Figure pct00199
DMF (2 mL) 중 화합물 127 (94.5 mg, 0.285 mmol)에 DIEA (149 uL, 0.856 mmol)에 이어서 화합물 126 (129.9 mg, 0.285 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 80℃에서 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 MeOH 중에 용해시키고, 탄소 상 10% 팔라듐 (20 mg)으로 처리하고, 플라스크에 60 PSI의 수소를 채웠다. 완결된 후, 현탁액을 여과하였다. 상청액을 농축시키고, 수득된 조 생성물을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00200
DMF (2 mL) 중 화합물 128 (159 mg, 0.285 mmol), 브로모-PEG2-아지드 (74.7 mg, 0.314 mmol) 및 탄산세슘 (204 mg, 0.627 mmol)을 함유하는 혼합물을 2시간 동안 60℃로 가열하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 디옥산 중 4M HCl (0.5 mL, 2 mmol)로 처리하고, 3시간 동안 40℃로 가열하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 THF (1 mL), MeOH (1.5 mL) 및 H2O (1.5 mL)의 혼합물 중에 현탁시키고, 수산화리튬 (83.5 mg, 3.48 mmol)으로 처리하고, 40℃로 16시간 동안 가열하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® 제미니® C18 칼럼 (21.2x250 mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 33.1 mg (20%)을 수득하였다.
구조 33c ((R)-1-아지도-13-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-12-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜타노일)-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데칸-15-산)의 합성
Figure pct00201
톨루엔 (45 mL) 중 화합물 130 (1.5 g, 9.73 mmol), (R) t-부틸 술핀아미드 (2.36 g, 19.46 mmol) 및 AcOH (0.14 mL)를 함유하는 혼합물을 딘-스타크 트랩이 장착된 플라스크에서 16시간 동안 환류하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 1.714 g (68.4%)을 수득하였다.
Figure pct00202
-78℃에서 THF (18 mL) 중 DIA (3.056 mL, 21.80 mmol)에 n-BuLi의 2.5M 용액 (8.324 mL, 20.81 mmol)을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 5분 동안 계속하고, 에틸 아세테이트 (1.94 mL, 19.82 mmol)를 적가하였다. -78℃에서 추가로 10분 동안 교반을 계속하고, THF (10 mL) 중 클로로 티타늄 트리이소프로폭시드의 용액 (9.94 mL, 41.62 mmol)을 적가하였다. -78℃에서 추가로 15분 동안 교반을 계속하고, THF (12 mL) 중 화합물 131 (1.70 g, 6.61 mmol)의 용액을 적가하였다. 교반을 -78℃에서 1.5시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산암모늄의 첨가에 의해 켄칭하였다. 현탁액을 7 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 단리하여 0.984 g (43%)을 수득하였다.
Figure pct00203
0℃에서 EtOH (6 mL) 중 화합물 132 (0.975 g, 2.82 mmol)에 디옥산 중 4 M HCl (2.12 mL, 8.47 mmol)을 첨가하고, 30분 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 물 (15 mL)로 희석하고, 디에틸 에테르로 세척하였다. 유기 층을 분리하고, 수산화나트륨을 사용하여 수성 층의 pH를 12로 조정하였다. 수성 층을 5 부피의 에틸 아세테이트로 세척하고, 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 0.434 g (64%)을 수득하였다.
Figure pct00204
3Å 분자체 상의 THF (2 mL) 중 화합물 133 (0.120 g, 0.497 mmol) 및 PEG (0.151 g, 0.696 mmol)의 혼합물에 STAB-H (0.253 g, 1.19 mmol)를 첨가하고, 현탁액을 실온에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 반응물을 포화 중탄산나트륨의 첨가에 의해 켄칭하고, 조 물질을 3 부분의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 분리된 유기 추출물을 합하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 수득된 조 물질을 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00205
DMF (2 mL) 중 화합물 134 (0.200 g, 0.597 mmol)를 HATU (0.227 g, 0.597 mmol)로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. 활성화된 에스테르에 DIEA (0.259 mL, 1.49 mmol)에 이어서 DMF (1 mL) 중 화합물 125 (0.220 g, 0.497 mmol)를 첨가하고, 생성된 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 모든 휘발물을 제거하고, 생성된 조 물질을 순수한 TFA (3.8 mL)로 처리하고, 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. BOC 제거가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 THF (4 mL), 물 (8 mL), 및 MeOH (8 mL)의 혼합물 중에 현탁시켰다. 생성된 혼합물을 LiOH (71.6 mg, 2.98 mmol)로 처리하고, 40℃로 16시간 동안 가열하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® 제미니® c18 칼럼 (21.2x250mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 56.2 mg (18%, 3-단계)을 수득하였다.
구조 34c ((S)-1-아지도-13-(3-플루오로-4-메톡시페닐)-12-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜틸)-3,6,9-트리옥사-12-아자펜타데칸-15-산)의 합성
Figure pct00206
0℃에서 THF (9.0 mL) 및 MeOH (0.5 mL)의 혼합물 중 화합물 136 (0.500 g, 1.45 mmol)을 수소화붕소리튬 (94.5 mg, 4.34 mmol)으로 처리하였다. 냉각을 제거하고, 기체 발생이 중지될 때까지 교반을 계속하였다. 반응 혼합물을 5 부피의 EtOAc로 희석하였다. 유기 층을 중탄산암모늄으로 세척하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 헥산 중 에틸 아세테이트의 구배를 사용하여 용리시킴으로써 단리하여 309 mg (67%)을 수득하였다.
Figure pct00207
0℃에서 DCM (9 mL) 중 화합물 137 (0.305 g, 0.952 mmol)을 함유하는 용액에 마르틴 시약을 여러 부분으로 첨가하였다. 여러 방울의 물을 첨가하고, 냉각을 제거하고, 반응물을 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 포화 중탄산나트륨에 이어서 포화 티오황산나트륨으로 세척하였다. 분리된 유기부를 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물 138을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리하여 140 mg (46%)을 수득하였다.
Figure pct00208
3Å 분자체 상의 THF (2.5 mL) 중 화합물 1 (85.2 mg, 0.353 mmol) 및 138 (134.9 mg, 0.424 mmol)을 함유하는 혼합물에 STAB-H (0.150 g, 0.706 mmol)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 16시간 동안 40℃로 가열하였다. 완결된 후, 반응물을 5 부피의 에틸 아세테이트로 희석하고, 포화 중탄산나트륨으로 처리하였다. 유기 층을 분리하고, 황산나트륨 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 실리카 상에서 1% TEA를 함유하는 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 64 mg (33%)을 수득하였다.
Figure pct00209
3Å 분자체 상의 MeOH (1 mL) 중 화합물 140 (60 mg, 0.110 mmol), Ald-PEG3-N3 (71.9 mg, 0.331 mmol) 및 AcOH (3 μL, 0.0276 mmol)를 함유하는 혼합물에 소듐 시아노보로히드라이드 (28.9 mg, 0.276 mmol)를 첨가하고, 반응물을 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 혼합물을 0℃로 냉각시키고, 물을 첨가하고 (0.15 mL), 용액을 디옥산 중 HCl (4M)을 사용하여 pH 7로 산성화시켰다. 모든 메탄올을 후속적으로 제거하고, 디옥산 중 4M HCl (0.138 mL, 0.552 mmol)을 첨가하고, 혼합물을 40℃에서 2시간 동안 교반하였다. BOC 제거가 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 조 물질을 THF (1 mL), 물 (2 mL) 및 MeOH (2 mL)의 혼합물 중에 현탁시키고, 수산화리튬 (26.5 mg, 1.104 mmol)으로 처리하였다. 에스테르 제거가 완결된 후, TFA를 첨가하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스® (21.2x250mm) C18 칼럼 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 16.4 mg (24%, 3-단계)을 수득하였다.
구조 36c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)의 합성
Figure pct00210
DCM (30 mL) 및 MeOH (75 mL) 중 6-옥소헵탄산 (9.74 g, 68 mmol)의 용액에 실온에서 진한 H2SO4 (0.18 mL, 3.4 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 밤새 환류하였다. 이어서, 반응 혼합물을 오일로 농축시키고, DCM (150 mL) 중에 재용해시키고, 포화 수성 NaHCO3 (2 x 40 mL) 및 염수 (40 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 141의 수율: 10.2 g (95%).
1H NMR(400 MHz, DMSO-d6): δ 3.58 (s, 3H), 2.43 (t, 2H), 2.29 (t, 2H), 1.46 (m, 4H).
Figure pct00211
EtOH (80 mL) 중 화합물 141 (10.2 g, 65 mmol) 및 2-아미노-3-포르밀피리딘 (7.89 g, 65 mmol)의 용액에 L-프롤린 (3.72 g, 32 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 환류 하에 밤새 가열하였다. 이어서, 반응 혼합물을 농축시키고, EtOAc (50 mL) 중에 용해시키고, 물 (3 x 30 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 EtOAc (10-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 142의 수율: 6.08 g (39%). 질량 계산치 C14H16N2O2 [M+H]+: 245.13, 실측치: 245.21.
Figure pct00212
MeOH (50 mL) 중 화합물 142 (6.08 g, 24.9 mmol)의 용액에 Pd/C (10% 로딩, 데구사 유형, 1.99 g, 1.87 mmol)를 첨가하였다. 반응 플라스크에 질소를 채우고, 배기시키고, 질소로 3회 재충전하였다. 이 과정을 수소로 반복하고, 반응 용기에 최종적으로 수소 (1 atm)를 채우고, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트® 상에서 여과하고, 패드를 MeOH로 헹구고, 여과물을 농축시켰다. 생성물인 화합물 143을 100% 수율로 가정하여 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C14H20N2O2 [M+H]+: 249.16, 실측치: 249.08.
Figure pct00213
무수 THF (120 mL) 중 디메틸 메틸포스포네이트 (12.3 g, 100 mmol)의 용액에 n-BuLi 용액 (헥산 중 2.5 M, 40 mL, 100 mmol)을 -78℃에서 1시간에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 첨가하였다. THF (40 mL) 중 화합물 143 (6.175 g, 24.9 mmol)의 용액을 -78℃에서 45분에 걸쳐 반응 혼합물에 첨가하였다. 20분 동안 -78℃에서 교반한 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl 용액 (200 mL)으로 켄칭하고, 실온으로 가온하고, EtOAc (400 mL)로 추출하였다. 유기 층을 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 생성물을 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 144의 수율: 7.86 g (93%). 질량 계산치 C16H25N2O4P [M+H]+: 341.17, 실측치: 341.17.
Figure pct00214
THF (13.5 mL) 중 3-플루오로-4-(페닐메톡시)-벤즈알데히드 (0.38 g, 1.65 mmol), 화합물 144 (0.67 g, 1.98 mmol), 및 무수 탄산칼륨 (0.547 g, 3.96 mmol)의 현탁액을 환류 하에 밤새 가열하였다. 추가의 3-플루오로-4-(페닐메톡시)-벤즈알데히드 (0.19 g, 0.83 mmol) 및 탄산칼륨 (0.23 g, 1.65 mmol)을 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 4시간 동안 환류하였다. 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 물 (30 mL) 및 염수 (30 mL)로 세척하였다. 유기 상을 분리하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH (0-10%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 145의 수율: 446 mg (61%). 질량 계산치 C28H29FN2O2 [M+H]+: 445.23, 실측치: 445.41.
Figure pct00215
R-BINAL의 제조: LAH (0.396 g, 10.4 mmol, 0.98 당량) 건조 THF (34 mL)의 슬러리에 EtOH (0.492 g, 10.65 mmol, 1.00 당량)를 THF (3.2 mL) 중 용액으로서 10분에 걸쳐 첨가하면서 내부 온도를 < 35℃로 유지시켰다. 30분 동안 숙성시킨 후, 내부 온도를 < 35℃로 (대략 10분) 유지시키면서, R-BINOL (3.05 g, 10.65 mmol, 1.00 당량)을 THF (10 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 실온에서 2시간 동안 교반한 후, 반응 혼합물을 드라이 아이스/아세톤 조 상에서 -78℃로 냉각시켰다.
화합물 145 (1.18 g, 2.65 mmol)를 무수 톨루엔 (50 mL)으로 공비 건조시키고, 무수 THF (12 mL) 중에 용해시켰다. 화합물 145의 용액을 -78℃에서 45분에 걸쳐 시린지 펌프를 통해 R-BINAL의 용액에 적가하였다. 1.5시간 후, 반응 용기를 매우 큰 듀어로 옮기고, 드라이 아이스/아세톤을 충전하고, 알루미늄 호일로 덮었다. 반응 혼합물을 -78℃에서 밤새 교반하였다. 대부분의 환원이 처음 1.5시간 내에 일어났고, 단지 소량의 추가의 전환이 밤새 일어났다. 반응물을 포화 수성 NH4Cl (150 mL)의 첨가에 의해 켄칭하고, 실온으로 가온하였다. 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH = 7로 추가로 산성화시킨 다음, EtOAc (2 x 250 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 (125 mL) 및 염수 (125 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 146의 수율: 634 mg (53%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, EtOH 0.1% 디에틸아민 등용매, 1.75 mL/분에 의해 결정하였다. 제1 용리 R 이성질체는 86 면적% 순수하였으며, 이는 72% ee에 상응한다. 화합물 6을 키랄 반정제용 HPLC (키랄팩 AD-H 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, EtOH 0.1% 디에틸아민, 20 mL/분)에 의해 추가로 정제하였다. 화합물 146의 최종 수율: 445 mg (98% ee). 질량 계산치 C28H31FN2O2 [M+H]+: 447.25, 실측치: 447.30.
Figure pct00216
DCM (3 mL) 중 화합물 146 (0.325 g, 0.73 mmol) 및 말론산 모노메틸 에스테르 (0.103 g, 0.87 mmol)의 용액에 DCM 중 DMAP (9 mg, 0.073 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 0℃로 냉각시키고, DCC (0.180 g, 0.87 mmol)를 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응물을 실온에서 밤새 교반하였다. 이어서, 반응 혼합물을 DCM (10 mL)으로 희석하고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 DCM 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 147의 수율: 142 mg (37%). 질량 계산치 C32H35FN2O5 [M+H]+: 547.26, 실측치: 547.58.
Figure pct00217
NMP (0.5 mL) 중 화합물 147 (0.232 g, 0.42 mmol)의 용액에 실온에서 N,O-비스(트리메틸실릴)아세트아미드 (0.229 g, 1.12 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 60℃에서 30분 동안 가열하였다. 염수 (58 μL)를 5분에 걸쳐 2 부분으로 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 90℃에서 3시간 동안, 이어서 실온에서 밤새 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (12 mL)로 희석하고, 물 (3 mL)로 세척하였다. 수성 층을 EtOAc (12 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 층을 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, DCM 중 MeOH의 구배로 용리시켰다. 화합물 148의 수율: 140 mg (66%). 질량 계산치 C31H35FN2O3 [M+H]+: 503.27, 실측치: 503.29.
Figure pct00218
EtOH (3 mL) 중 화합물 148 (0.169 g, 0.34 mmol)의 용액에 EtOH (1 mL) 중 Pd/C (10% 로딩, 36 mg, 0.034 mmol)의 슬러리를 첨가하였다. 반응 용기를 가압하고, 수소로 3회 환기시켰다. 반응 용기를 3시간 동안 55 psi로 재가압하였다. 반응 혼합물을 MeOH (5 mL)로 희석하고, 여과하였다. 여과물을 농축시키고, 생성물, 화합물 149를 100% 수율로 가정하여 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C24H31FN2O3 [M+H]+: 415.24, 실측치: 415.07.
Figure pct00219
DMF (2.5 mL) 중 화합물 149 (139 mg, 0.34 mmol) 및 아지도-PEG4-토실레이트 (0.188 mg, 0.50 mmol)의 용액에 탄산세슘 (164 mg, 0.50 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 가열한 다음, 포화 수성 NaHCO3 (3 mL)으로 켄칭하였다. 혼합물을 EtOAc (3 x 10 mL)로 추출하였다. 합한 유기 상을 물 (2 x 5 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C32H46FN5O6 [M+H]+: 616.35, 실측치: 616.90.
Figure pct00220
THF (1.5 mL) 및 물 (1.5 mL) 중 화합물 150 (0.207 mg, 0.34 mmol)의 용액에 수산화리튬 (0.040 g, 1.68 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 밤새 가열하였다. 다음 날 아침 반응 혼합물을 6 N HCl을 사용하여 pH = 7로 산성화시키고, 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 H2O 중 35% ACN, 0.1% TFA 중에 용해시키고, RP-HPLC (써모 아쿠아실 C18, 250 x 21 mm, 5 μm, 20 mL/분, 0.1% TFA를 함유하는 H2O 중 ACN의 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 151 (SM 36)의 수율: 125 mg (3 단계에 걸쳐 52%). 질량 계산치 C31H44FN5O6 [M+H]+: 602.34, 실측치: 602.85.
구조 37c ((S)-3-(4-(2-(2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에톡시)에톡시)-3-플루오로페닐)-3-(5-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)펜탄아미도)프로판산)의 합성
Figure pct00221
DMF (1.5 mL) 중 화합물 169 (90 mg, 0.268 mmol)를 HATU (112 mg, 0.295 mmol)로 처리하고, 5분 동안 교반하였다. DMF (0.5) 중 화합물 170 (94 mg, 0.295 mmol) 및 DIEA (0.154 mL, 0.884 mmol)를 함유하는 혼합물을 후속적으로 첨가하고, 교반을 1시간 동안 계속하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 화합물 171을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 123 mg (72%)을 수득하였다.
Figure pct00222
MeOH (2 mL) 중 탄소 상 10% 팔라듐 (21 mg, 0.0194 mmol) 및 화합물 171 (123 mg, 0.194 mmol)을 함유하는 현탁액에 60 PSI 수소를 채우고, 1시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 현탁액을 셀라이트® 상에서 여과하고, 농축시켜 조 물질 88 mg (83%)을 수득하였으며, 이를 후속적으로 추가 정제 없이 사용하였다.
Figure pct00223
DMF (1 mL) 중 화합물 172 (87 mg, 0.160 mmol), Br-PEG3-N3 (50 mg, 0.176 mmol) 및 탄산세슘 (115 mg, 0.352 mmol)을 함유하는 현탁액을 60℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하고, 화합물 173을 실리카 상에서 DCM 중 MeOH의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 91 mg (76%)을 수득하였다.
Figure pct00224
디옥산 (0.5 mL) 중 화합물 173 (50 mg, 0.067 mmol)을 디옥산 중 4M HCl (0.671 mmol, 0.168 mL) 용액으로 처리하고, 40℃에서 3시간 동안 교반하였다. 완결된 후, 모든 휘발물을 제거하였다. 조 물질을 H2O (0.4 mL), THF (0.2 mL) 및 MeOH (0.4 mL)의 혼합물 중에 용해시키고, LiOH (8 mg, 0.356 mmol)로 처리하고, 40℃에서 16시간 동안 교반하였다. 완결된 후, TFA를 사용하여 pH를 3으로 조정하고, 생성물을 페노메넥스 제미니 C18 칼럼 (21.2x250mm, 5 마이크로미터) 상에서 0.1% TFA를 함유하는 물 중 아세토니트릴의 구배로 용리시키면서 분리에 의해 단리하여 25 mg (60%, 2-단계)을 수득하였다.
구조 38c ((S)-3-(2-(3-((2-(2-(2-아지도에톡시)에톡시)에틸)아미노)-3-옥소프로필)피리미딘-5-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산) 및 구조 39c ((S)-3-(2-(1-아지도-12-옥소-3,6,9-트리옥사-13-아자헥사데칸-16-일)피리미딘-5-일)-9-(5,6,7,8-테트라히드로-1,8-나프티리딘-2-일)노난산)의 합성
Figure pct00225
무수 THF (95 mL) 중 5-브로모-2-아이오도-피리미딘 (8.00 g, 28.1 mmol)의 용액에 THF 중 i-PrMgBr의 용액 (0.75 M, 56 mL, 42.0 mmol)을 -78℃에서 첨가하면서 내부 온도를 < -70℃로 (대략 15분) 유지시켰다. 이어서, 생성된 용액을 15분 동안 교반한 후, THF 중 CuCN
Figure pct00226
2LiCl 용액 (1 M, 31 mL, 31.0 mmol)에 이어서 알릴 브로마이드 (5.10 g, 42 mmol)를 THF (10 mL) 중 용액으로서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 1시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 MeOH (40 mL)로 켄칭하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-20%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 152의 수율: 4.13 g (74%). 질량 계산치 C7H7BrN2 [M+H]+: 198.99, 실측치: 199.05.
Figure pct00227
THF (115 mL) 중 화합물 152 (7.70 g, 38.7 mmol)의 용액에 THF 중 9-BBN의 용액 (0.5 M, 131 mL, 65.8 mmol)을 0℃에서 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물에 물 (100 mL) 중 NaHCO3 (48.7 g, 580 mmol)의 슬러리에 이어서 물 (100 mL) 중 NaBO3 1수화물 (46.3 g, 464 mmol)의 슬러리를 0℃에서 첨가하였다. 냉각 조를 제거하고, 혼합물을 1시간 동안 격렬히 교반하였다. 반응 혼합물을 분리 깔때기로 옮기고, 층을 분리하였다. 수성 층을 EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기 상을 합하고, 염수 (100 mL)로 세척하였다. 염수 층을 EtOAc (100 mL)로 역추출하였다. 합한 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켜 ~15 g의 조 황색 오일을 수득하였다. 조 물질을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (50-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 153의 수율: 3.44 g (41%). 질량 계산치 C7H9BrN2O [M+H]+: 217.00, 실측치: 216.97.
Figure pct00228
DCM (40 mL) 중 화합물 153 (3.44 g, 15.8 mmol)의 용액에 0℃에서 이미다졸 (1.73 g, 25.4 mmol) 및 DCM (12 mL) 중 TBDPSCl (5.23 g, 19.0 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 DCM (75 mL)으로 희석하고, 물 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-8%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 154의 수율: 5.56 g (77%). 질량 계산치 C23H27BrN2OSi [M+H]+: 455.12, 실측치: 455.44.
Figure pct00229
-75℃에서 THF (150 mL) 중 화합물 154 (6.07 g, 13.3 mmol)의 용액에, 내부 온도를 < -70℃로 (대략 10분) 유지시키면서, THF 중 nBuLi의 용액 (2.5 M, 5.6 mL, 14.0 mmol)을 적가하였다. 3분 후, 내부 온도를 < -70℃로 유지시키면, THF (5 mL) 중 에틸 포르메이트 (1.04 g, 1.13 mL, 14.0 mmol)의 용액을 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 20분 동안 교반한 다음, 디옥산 중 HCl (4 M, 3.67 mL, 14.7 mmol)로 켄칭하고, 내부 온도를 < -65℃로 유지시키면서 THF (5 mL)로 추가로 희석하였다. 냉각 조를 제거하고, 반응물을 주위 온도로 가온하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (0-20%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 155의 수율: 1.79 g (33%).
1H NMR(400 MHz, CDCl3): δ 10.09 (s, 1H), 9.06 (s, 2H), 7.64 (m, 4H), 7.38 (m, 6H), 3.77 (t, 2H), 3.20 (t, 2H), 2.17 (q, 2H), 1.03 (s, 9H).
Figure pct00230
THF (25 mL) 중 화합물 144 (1.68 g, 4.15 mmol) 및 화합물 155 (1.70 g, 4.98 mmol)의 용액에 K2CO3 (0.861 g, 6.23 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃로 2.5시간 동안 가열한 다음, 50℃로 12시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (100 mL)로 희석하고, 물 (50 mL) 및 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기 상을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 EtOAc (0-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 156의 수율: 2.04 g (79%). 질량 계산치 C38H46N4O2Si [M+H]+: 619.35, 실측치: 619.69.
Figure pct00231
R-BINAL의 제조: LAH (1.169 g, 30.8 mmol)를 건조 THF (90 mL) 중에 슬러리화하였다. Tint를 < 40℃로 유지시키면서 슬러리에 EtOH를 THF 중 용액 (6 M, 5.2 mL, 31.4 mmol)으로서 첨가하였다. 혼합물을 35℃에서 40분 동안 숙성시킨 다음, 30℃로 냉각시켰다. Tint를 < 40℃로 유지시키면서 THF (45 mL) 중 R-(BINOL) (9.00 g, 31.4 mmol)의 용액을 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 숙성시키고, 주위 온도로 냉각시킨 다음, 50℃로 가열하고, TMEDA (14.1 mL, 11.0 g, 94.3 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 50℃에서 1시간 동안 숙성시키고, 주위 온도로 냉각시킨 다음, 화합물 156과 함께 사용하였다.
THF 중 R-BINAL (~0.2 M, 110 mL, 22.0 mmol)의 용액에 THF (12 mL) 중 화합물 16 (1.16 g, 1.88 mmol)의 용액을 -78℃에서 5분에 걸쳐 첨가하였다. 30분 후, 반응 혼합물을 포화 수성 NH4Cl로 켄칭하고, 실온으로 가온하고, 생성물을 EtOAc (3 x 125 mL)로 추출하였다. 유기 층을 Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 1% 트리에틸아민을 함유하는 EtOAc 중 MeOH (0-5%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 157의 수율: 0.96 g (82%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, 25% EtOH, 75% 헥산, 0.1% 디에틸아민 등용매, 2 mL/분)에 의해 결정하였다. 제2 용리 R 이성질체는 ~95 면적% 순수하였으며, 이는 ~90% ee에 상응한다. 질량 계산치 C38H48N4O2Si [M+H]+: 621.36, 실측치: 621.71.
Figure pct00232
트리에틸오르토아세테이트 (9.25 mL) 중 화합물 157 (0.925 g, 1.49 mmol)의 용액에 트리메틸오르토아세테이트 중 프로피온산의 용액 (0.15 M, 0.55 mL, 0.08 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 밀봉된 바이알에서 140℃에서 1.5시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 1% 트리에틸아민을 함유하는 헥산 중 EtOAc (0-50%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 158의 수율: 0.898 g (87%). 질량 계산치 C42H54N4O3Si [M+H]+: 691.41, 실측치: 691.93.
Figure pct00233
EtOH (10 mL) 중 화합물 158 (0.893 g, 1.30 mmol)의 용액에 EtOH (4 mL) 중 Pd/C (로딩 정도: 10 wt%, 0.138 g, 0.13 mmol)의 슬러리를 첨가하였다. 반응 혼합물에 50 psi H2를 채우고, 4.5시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 159의 수율: 0.885 g (99%). 질량 계산치 C42H56N4O3Si [M+H]+: 693.42, 실측치: 693.82.
Figure pct00234
THF (2.5 mL) 중 Boc 무수물 (0.836 g, 3.83 mmol)의 용액에 화합물 159 (0.885 g, 1.28 mmol)에 이어서 DMAP의 용액 (THF 중 20 mg/mL, 155 uL, 0.0031 g, 0.026 mmol)을 첨가하였다. 혼합물을 60℃로 6시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 헥산 중 EtOAc (0-50%)의 구배로 용리시키면서 정제하였다. 화합물 160의 수율: 0.721 g (71%). 질량 계산치 C47H64N4O5Si [M+H]+: 793.47, 실측치: 794.28.
Figure pct00235
THF (6 mL) 중 화합물 160 (0.621 g, 0.783 mmol)의 용액에 THF 중 TBAF의 용액 (1 M, 1.2 mL, 1.2 mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 EtOAc (30 mL)로 희석하고, 포화 수성 NH4Cl (2 x 10 mL)로 세척하였다. 유기 층을 농축시켰다. 잔류물을 콤비플래쉬에 의해 고정상으로서 실리카 겔을 사용하여 정제하고, 헥산 중 EtOAc (50-100%)의 구배로 용리시켰다. 화합물 21의 수율: 0.362 g (83%). 키랄 순도를 분석용 키랄 HPLC, 키랄팩 AD-H 칼럼 4.6 x 250 mm, 5 마이크로미터, 20% EtOH, 80% 헥산, 0.1% 디에틸아민, 등용매, 1.5 mL/분에 의해 결정하였다. 제2 용리 R 이성질체는 93% 순수하였으며, 이는 86% ee.에 상응한다. 화합물 161을 키랄 반정제용 HPLC (키랄팩 AD-H 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 20% EtOH, 80% 헥산, 0.1% 디에틸아민, 60 mL/분)에 의해 추가로 정제하였다. 화합물 161의 최종 수율: 308 mg (99% ee). 질량 계산치 C31H46N4O5 [M+H]+: 555.36, 실측치: 555.72.
Figure pct00236
ACN (0.30 mL) 중 화합물 161 (0.030 g, 0.054 mmol)의 용액에 실온에서 BAIB (0.042 g, 0.130 mmol) 및 TEMPO (2.5 mg, 0.016 mmol)에 이어서 물 (0.30 mL)을 첨가하였다. 2시간 후, 반응 혼합물을 농축시켰다. 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 0.1% TFA 물/ACN, 30-80% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 162의 수율: 0.030 g (97%). 질량 계산치 C31H44N4O6 [M+H]+: 569.34, 실측치: 569.68.
Figure pct00237
DMF (0.5 mL) 중 화합물 162 (33 mg, 0.058 mmol) 및 아미노-PEG2-아지드 (15 mg, 0.087 mmol)의 용액에 TBTU (32 mg, 0.099 mmol)에 이어서 DIEA (35 μL, 26 mg, 0.203 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 30분 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 생성물인 화합물 163을 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C37H56N8O7 [M+H]+: 725.44, 실측치: 725.77.
Figure pct00238
THF (0.30 mL) 중 화합물 163 (42 mg, 0.058 mmol)의 용액에 LiOH의 1 M 용액 (0.174 mL, 0.174 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 1시간 동안 가열하였다. 추가 부분의 LiOH를 첨가하였다 (0.174 mL, 0.174 mmol). 3시간 후, 반응을 멈추고, LiOH의 추가의 부분 (0.174 mL, 0.174 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 추가로 2시간 동안 교반하였다 (9 당량 LiOH, 총 5시간). 반응 혼합물을 3 N HCl을 사용하여 pH = 5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 TFA:물 [95:5] 중에 용해시키고, 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 물/0.1% TFA를 함유하는 ACN, 20-50% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 164 (구조 38c)의 수율: 23 mg (66%). 질량 계산치 C30H44N8O5 [M+H]+: 597.35, 실측치: 597.85.
Figure pct00239
THF (150 μL) 중 화합물 161 (30 mg, 0.054 mmol)의 용액에 디페닐 포스포릴 아지드 (35 μL, 45 mg, 0.162 mmol)에 이어서 DBU (12 μL, 12 mg, 0.081 mmol)를 0℃에서 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온으로 가온하고, 밤새 교반하였다. 다음 날 아침, 반응 혼합물을 60℃에서 7시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 0.1% TFA 물/ACN, 32-60% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 165의 수율: 14 mg (44%). 질량 계산치 C31H45N7O4 [M+H]+: 580.36, 실측치: 580.66.
Figure pct00240
EtOH (100 μL) 중 화합물 165 (18 mg, 0.031 mmol)의 용액에 EtOH (170 μL) 중 Pd/C의 슬러리 (10% 로딩, 3.3 mg, 0.003 mmol)를 첨가하였다. 반응 용기에 H2를 채운 다음, 3회 배기시키고, 이어서 H2 (1 atm)를 채웠다. 30분 후, 반응 혼합물을 여과하고, 농축시키고, 후속 단계에 추가 정제 없이 사용하였다. 화합물 166의 수율: 17 mg (99%). 질량 계산치 C31H47N5O4 [M+H]+: 554.37, 실측치: 554.73.
Figure pct00241
DMF (170 μL) 중 화합물 166 (17 mg, 0.031 mmol) 및 아지도-PEG3-NHS 에스테르 (14 mg, 0.040 mmol)의 용액에 실온에서 DIEA (16 μL, 12 mg, 0.092 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하고, 농축시킨 다음, 후속 단계에 정제 없이 사용하였다. 질량 계산치 C40H62N8O8 [M+H]+: 783.48, 실측치: 783.84.
Figure pct00242
THF (180 μL) 중 화합물 167 (24 mg, 0.031 mmol)의 용액에 LiOH의 1 M 용액 (153 μL, 0.153 mmol)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 40℃에서 가열하였다. 1시간 후, 추가 부분의 LiOH를 첨가하였다 (153 uL, 0.153 mmol, 5 당량). 반응 혼합물을 40℃에서 3시간 동안 교반한 다음, 실온에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 3 N HCl을 사용하여 pH = 5로 중화시키고, 농축시켰다. 잔류물을 TFA:물 [95:5] 중에 용해시키고, 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 농축시키고, 잔류물을 RP-HPLC (페노메넥스 제미니 C18 21.2 x 250 mm, 5 마이크로미터, 물/0.1% TFA를 함유하는 ACN, 15-45% ACN 구배)에 의해 정제하였다. 화합물 168 (구조 39c)의 수율: 9.8 mg (49%). 질량 계산치 C33H50N8O6 [M+H]+: 655.40, 실측치: 656.01.
실시예 2. 세자리 인테그린 표적화 리간드, RNAi 작용제의 합성, 및 화물 분자 (RNAi 작용제)에의 인테그린 표적화 리간드의 접합.
인테그린 표적화 리간드는 인테그린을 발현하는 세포에서 1개 이상의 표적화된 유전자의 발현을 억제하는데 유용한 1개 이상의 RNAi 작용제에 접합될 수 있다. 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는 표적화된 세포 및/또는 조직으로의 RNAi 작용제의 전달을 용이하게 한다. 상기 실시예 1은 본원에 개시된 특정 인테그린 표적화 리간드의 합성을 기재하고 있다. 하기는 본원에 제시된 비제한적인 실시예에 예시된 특정 인테그린 표적화 리간드-RNAi 작용제 접합체의 합성에 대한 일반적인 절차를 기재한다.
A. RNAi 작용제의 합성. RNAi 작용제는 관련 기술분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 합성할 수 있다. 본원에 제시된 실시예에 예시된 RNAi 작용제의 합성을 위해, RNAi 작용제의 센스 및 안티센스 가닥을 올리고뉴클레오티드 합성에 사용되는 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. 규모에 따라, 머메이드96E(MerMade96E)® (바이오오토메이션(Bioautomation)), 머메이드12® (바이오오토메이션), 또는 OP 파일럿 100(OP Pilot 100) (지이 헬스케어(GE Healthcare))을 사용하였다. 합성은 제어된 세공 유리 (CPG, 500 Å또는 600Å, 미국 펜실베니아주 아스톤 소재의 프라임 신테시스(Prime Synthesis)로부터 입수함)로 제조된 고체 지지체 상에서 수행하였다. 모든 RNA 및 2'-변형된 RNA 포스포르아미다이트는 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific) (미국 위스콘신주 밀워키)에서 구입하였다. 구체적으로, 하기 2'-O-메틸 포스포르아미다이트를 사용하였다: (5'-O-디메톡시트리틸-N6-(벤조일)-2'-O-메틸-아데노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 5'-O-디메톡시-트리틸-N4-(아세틸)-2'-O-메틸-시티딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필-아미노) 포스포르아미다이트, (5'-O-디메톡시트리틸-N2-(이소부티릴)-2'-O-메틸-구아노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트, 및 5'-O-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-우리딘-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트. 2'-데옥시-2'-플루오로-포스포르아미다이트는 2'-O-메틸 RNA 아미다이트와 동일한 보호기를 보유하였다. 5'-디메톡시트리틸-2'-O-메틸-이노신-3'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 글렌 리서치(Glen Research) (버지니아주)에서 구입하였다. 역전된 무염기성 (3'-O-디메톡시트리틸-2'-데옥시리보스-5'-O-(2-시아노에틸-N,N-디이소프로필아미노) 포스포르아미다이트는 켐진스(ChemGenes) (미국 매사추세츠주 윌밍톤)에서 구입하였다. 하기 UNA 포스포르아미다이트를 사용하였다: 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N6-(벤조일)-2',3'-세코-아데노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-아세틸-2',3'-세코-시토신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소-프로필)]-포스포르아미다이트, 5'-(4,4'-디메톡시트리틸)-N-이소부티릴-2',3'-세코-구아노신, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포르아미다이트, 및 5'-(4,4'-디메톡시-트리틸)-2',3'-세코-우리딘, 2'-벤조일-3'-[(2-시아노에틸)-(N,N- 디이소-프로필)]-포스포르아미다이트. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트도 또한 상업적으로 구입하였다 (써모피셔).
일부 예에서, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드는, 성분을 트리-알킨 기를 포함하는 스캐폴드에, 또는 상기 표 B에 제시된 바와 같은 프로파르길 기를 포함하는 변형된 뉴클레오티드에 연결시킴으로써, RNAi 작용제에 접합된다. 일부 예에서, 트리-알킨 기는 RNAi 작용제의 센스 가닥의 5' 말단 단부에 부가될 수 있는 트리-알킨-함유 포스포르아미다이트를 사용함으로써 부가된다. 본원의 특정 실시예에 제시된 RNAi 작용제와 관련하여 사용되는 경우, 트리-알킨-함유 포스포르아미다이트는 무수 디클로로메탄 또는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키는 한편, 다른 모든 아미다이트는 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 미국 매사추세츠주 레민스터 소재의 폴리오르그, 인크.(PolyOrg, Inc.)로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하였다.
대안적으로, 포스포르아미다이트 접근법을 사용하는 대신 트리-알킨 스캐폴드를 통해 인테그린 표적화 리간드를 RNAi 작용제에 접합시키는 경우, 트리-알킨-함유 화합물이 합성 후에 도입될 수 있다 (예를 들어, 하기 섹션 E 참조). 본원에 제시된 특정 실시예에 제시된 RNAi 작용제와 관련하여 사용되는 경우, 센스 가닥의 5' 단부에 트리-알킨 기를 합성 후 부착시킬 때, 센스 가닥의 5' 말단 뉴클레오티드는 트리-알킨-함유 스캐폴드에 대한 부착이 용이하도록 5' 단부에 1급 아민을 포함하는 뉴클레오티드로 관능화된다. TFA 아미노연결 포스포르아미다이트를 무수 아세토니트릴 (50 mM) 중에 용해시키고, 분자체 (3Å)를 첨가하였다. 5-벤질티오-1H-테트라졸 (BTT, 아세토니트릴 중 250 mM) 또는 5-에틸티오-1H-테트라졸 (ETT, 아세토니트릴 중 250 mM)을 활성화제 용액으로서 사용하였다. 커플링 시간은 10분 (RNA), 90초 (2' O-Me), 및 60초 (2' F)였다. 포스포로티오에이트 연결을 도입하기 위해, 무수 아세토니트릴 중 3-페닐 1,2,4-디티아졸린-5-온 (POS, 미국 매사추세츠주 레민스터 소재의 폴리오르그, 인크.(PolyOrg, Inc.)로부터 입수함)의 100 mM 용액을 사용하였다.
본원에 제시된 예에서, 하기는 합성된 듀플렉스에 대한 변형된 뉴클레오티드 서열을 제시한다:
듀플렉스 AD04545:
변형된 안티센스 가닥 서열 (5' → 3): usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호(SEQ ID NO): 1)
변형된 센스 가닥 서열 (5' → 3): (NH2-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucaugaasa(invAb) (서열식별번호: 2)
듀플렉스 AD04546:
변형된 안티센스 가닥 서열 (5' → 3): usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 3)
변형된 센스 가닥 서열 (5' → 3):
(NH2-C6)scsaacguaaCfGfAfuuucaugaasa(invAb)(C6-S-Mal-X) (서열식별번호: 4)
듀플렉스 AD05971:
변형된 안티센스 가닥 서열 (5' → 3): usUfsusCfaUfgAfaAfuCfgUfuAfcGfuUfsg (서열식별번호: 5)
변형된 센스 가닥 서열 (5' → 3):
(NH2-C6)scsaacguaaCfGfAfuuuAlkcaAlkugAlkaaAlksa(invAb)(C6-S-Mal-C18 이산 모이어티) (서열식별번호: 6)
상기 열거된 변형된 뉴클레오티드 서열에 대해, a, c, g, 및 u는 각각 2'-O-메틸 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 나타내고; Af, Cf, Gf, 및 Uf는 각각 2'-플루오로 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 나타내고; aAlk, cAlk, gAlk, 및 uAlk는 각각 2'-O-프로파르길 아데노신, 시티딘, 구아노신, 또는 우리딘을 나타내고; (invAb)는 역전된 무염기성 잔기 (역전된 무염기성 데옥시리보뉴클레오티드)를 나타내고; s는 포스포로티오에이트 연결을 나타내고; (NH2-C6)s는
Figure pct00243
를 나타내고; (C6-S-Mal-L)은
Figure pct00244
를 나타내고, 여기서 L은 하기 실시예에 나타낸 바와 같은 PEG 쇄 또는 에틸이다. 본원의 실시양태의 경우, 각각의 가닥 5' → 3'을 볼 때, 역전된 무염기성은 데옥시리보스의 3' 위치가 각각의 가닥 상의 선행 단량체의 3' 단부에서 연결되도록 삽입된다.
B. 지지체 결합된 올리고머의 절단 및 탈보호. 고체 상 합성을 최종화한 후, 건조된 고체 지지체를 1:1 부피 용액의 물 중 40 중량% 메틸아민 및 28% 내지 31% 수산화암모늄 용액 (알드리치(Aldrich))으로 1.5시간 동안 30℃에서 처리하였다. 용액을 증발시키고, 고체 잔류물을 물 중에 재구성하였다 (하기 참조).
C. 정제. 조 올리고머를 음이온 교환 HPLC에 의해 TSK겔 슈퍼Q-5PW 13μm 컬럼 및 시마즈(Shimadzu) LC-8 시스템을 사용하여 정제하였다. 완충제 A는 20 mM 트리스, 5 mM EDTA, pH 9.0이었고, 20% 아세토니트릴을 함유하였으며, 완충제 B는 1.5 M 염화나트륨이 첨가된 완충제 A와 동일하였다. 260 nm에서의 UV 트레이스를 기록하였다. 적절한 분획을 풀링한 후, 100mM 중탄산암모늄, pH 6.7 및 20% 아세토니트릴 또는 여과수의 구동 완충제와 함께 세파덱스 G-25 파인(Sephadex G-25 fine)이 패킹된 지이 헬스케어 XK 16/40 칼럼을 사용하여 크기 배제 HPLC 상에서 전개시켰다.
D. 어닐링. 1x PBS (포스페이트 완충 염수, 1x, 코닝(Corning), 셀그로(Cellgro)) 중에서 등몰 RNA 용액 (센스 및 안티센스)을 조합함으로써 상보적 가닥을 혼합하여 RNAi 작용제를 형성하였다. 일부 RNAi 작용제를 동결건조시키고, -15 내지 -25℃에서 저장하였다. 1x PBS 중에서 UV-Vis 분광계 상에서 용액 흡광도를 측정함으로써 듀플렉스 농도를 결정하였다. 그 후, 260 nm에서의 용액 흡광도에 전환 인자 및 희석 배율을 곱하여 듀플렉스 농도를 결정하였다. 사용된 전환 인자는 0.037 mg/(mL·cm)이거나, 또는 대안적으로 일부 실험의 경우, 전환 인자는 실험적으로 결정된 흡광 계수로부터 계산되었다.
E. 트리-알킨 스캐폴드의 접합. 어닐링 전 또는 후에, RNAi 작용제의 5' 또는 3' 아민 관능화 센스 가닥을 트리-알킨 스캐폴드에 접합시킬 수 있다. 본원에 개시된 구축물을 형성하는데 사용될 수 있는 예시적인 트리-알킨 스캐폴드 구조는 다음을 포함한다:
Figure pct00245
다음은 어닐링된 듀플렉스에의 트리-알킨 스캐폴드의 접합을 기재한다: 아민 관능화된 듀플렉스를 90% DMSO/10% H2O 중에 ~50-70 mg/mL로 용해시켰다. 40 당량 트리에틸아민에 이어서 3 당량 트리-알킨-PNP를 첨가하였다. 완결되면, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매 시스템에서 2회 침전시키고, 건조시켰다.
F. 인테그린 표적화 리간드의 접합. 어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 세자리 알킨 관능화된 센스 가닥을 인테그린 표적화 리간드에 접합시켰다. 하기 실시예는 어닐링된 듀플렉스에의 αvβ3/5 인테그린 표적화 리간드의 접합을 기재한다: 0.5M 트리스(3-히드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA), 0.5M Cu(II) 술페이트 펜타히드레이트 (Cu(II)SO4 · 5 H2O) 및 나트륨 아스코르베이트 2M 용액의 원액을 탈이온수 중에서 제조하였다. 인테그린 표적화 리간드의 DMSO 중 75 mg/mL 용액을 제조하였다. 트리-알킨 관능화된 듀플렉스 (3mg, 75μL, 탈이온수 중 40mg/mL, ~15,000 g/mol)를 함유하는 1.5 mL 원심분리 튜브에, 25 μL의 1M Hepes pH 8.5 완충제를 첨가하였다. 볼텍싱 후, DMSO 35 μL를 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. 인테그린 표적화 리간드를 반응물 (6 당량/듀플렉스, 2 당량/알킨, ~15μL)에 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. pH 시험지를 사용하여 pH를 체크하고, pH ~8인 것을 확인하였다. 별개의 1.5 mL 원심분리 튜브에서, 0.5M THPTA 50 μL를 0.5M Cu(II)SO4 · 5 H2O 10uL와 혼합하고, 볼텍싱하고, 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 5분 후, THPTA/Cu 용액 (7.2 μL, 6 당량 5:1 THPTA:Cu)을 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 그 직후에, 2M 아스코르베이트 (5 μL, 듀플렉스당 50 당량, 알킨당 16.7)를 반응 바이알에 첨가하고, 볼텍싱하였다. 반응이 완결되면 (전형적으로 0.5-1시간 내에 완결됨), 비-변성 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 반응물을 즉시 정제하였다.
G. 시스테인 링커 상의 티올 기의 관능화. 일부 실시양태에서, RNAi 작용제에의 인테그린 표적화 리간드의 접합을 용이하게 하기 위해 시스테인 링커를 사용할 수 있다. 어닐링 전 또는 후에, 5' 또는 3' 세자리 알킨-Cys(Stbu)-PEG2 관능화된 센스 가닥을 말레이미드-함유 모이어티로 관능화하거나, 또는 하기 구조에 제시된 바와 같이 환원시켜 유리 티올로서 남길 수 있다:
Figure pct00246
하기 실시예는 트리-알킨-Cys(Stbu)-PEG2-듀플렉스의 N-에틸 말레이미드에 의한 변형을 기재한다: 트리-알킨-Cys(Stbu)-PEG2-듀플렉스 (35 mg)를 500 μL 탈이온 H2O 중에 용해시켰다. HEPES 완충제 (1M, pH 8.5, 82 μL)를 반응물에 첨가하고, 용액을 볼텍싱하였다. 1 M 디티오트레이톨 용액 (DTT, 100 당량, 236 μL)을 첨가하고, 용액을 볼텍스 진탕기 상에 3시간 동안 두었다. 변성 RP-HPLC에 의해 디술피드의 환원을 확인한 후, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매 시스템에서 3회 침전시켰다. 침전된 펠릿을 0.5 mL의 0.1 M HEPES, pH 6.5 중에 재구성하고, N-에틸 말레이미드 (3 mg, 10 당량)를 용액에 첨가하고, 볼텍스 혼합기 상에 ~15분 동안 두었다. 반응의 완결 후, 접합체를 1x 포스페이트 완충 염수/아세토니트릴 (1:14 비)의 용매 시스템에서 3회 침전시키고, 탈염시키고, 건조시켰다.
실시예 3. 인테그린 표적화 리간드의 결합 활성.
하기 표 1에 보고된 바와 같이, 구조 1c, 2c, 및 3c, 뿐만 아니라 RGD-모방체 펩티드의 인테그린 표적화 리간드에 대해 IC50 결합 데이터를 수득하였다:
표 1. IC50 결합 활성.
Figure pct00247
상기 표 1에 제시된 바와 같이, 구조 1, 2, 및 3은 각각 αvβ3 인테그린 및 αvβ5 인테그린에 대한 강력한 결합을 보여주었고, 구조 2 및 3은, 예를 들어, αvβ3 인테그린에 대한 결합을 특히 선호하는 것으로 나타났다 (각각 IC50 = 0.3 nM 및 0.8 nM). 추가로, 각각의 구조 1, 2, 및 3은 RGD-모방체 펩티드와 비교하여 αvβ3 인테그린에 대해 약간 증가된 결합 활성을 나타내었다 (예를 들어 미국 특허 번호 9,487,556에 개시된 RGD-모방체 리간드 구조 참조). 또한, RGD-모방체 리간드가 결합 활성을 갖는 것으로 나타났지만, 본 개시내용의 인테그린 표적화 리간드는 이러한 펩티드-기반 RGD-모방체 리간드와 비교하여 생체내 혈청 안정성 및 생체외 화학적 안정성 둘 다와 관련하여 증가된 안정성을 갖는다.
실시예 4. 신장 종양 보유 마우스 모델 (동소 이종이식편).
SEAP-발현 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) A498 세포의 생성.
CMV 프로모터 하에 리포터 유전자 분비된 알칼리성 포스파타제 (SEAP)를 발현하는 pCR3.1 발현 벡터를 클론테크(Clontech)의 pSEAP2-염기성 벡터로부터 PCR 증폭된 SEAP 코딩 서열의 방향성 클로닝에 의해 제조하였다. pCR3.1 벡터 (인비트로젠) 내로 클로닝하기 위한 SEAP 코딩 서열을 증폭시키는데 사용되는 프라이머에 편리한 제한 부위를 부가하였다. 생성된 구축물 pCR3-SEAP를 사용하여 SEAP-발현 A498 ccRCC 세포주를 생성하였다. 간략하게, pCR3-SEAP 플라스미드를 제조업체의 권장사항에 따라 전기천공에 의해 A498 ccRCC 세포 내로 형질감염시켰다. 안정한 형질감염체를 G418 저항성에 의해 선택하였다. 선택된 A498-SEAP 클론을 SEAP 발현 및 통합 안정성에 대해 평가하였다.
SEAP-발현 투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) A498 세포의 이식.
암컷 무흉선 누드 마우스를 ~3% 이소플루란으로 마취시키고, 우측 측와위 자세로 놓았다. 좌측 측복부에 작은 0.5-1cm의 종방향 복부 절개를 만들었다. 습윤 면봉을 사용하여, 좌측 신장을 복막 밖으로 들어올리고 서서히 안정화시켰다. 주사 직전에, 1.0 ml 시린지를 세포/매트리겔 혼합물로 충전하고, 27 게이지 니들 카테터를 시린지 팁에 부착시켰다. 이어서, 충전된 시린지를 시린지 펌프 (하버드 어패러투스(Harvard Apparatus), 모델 PHD2000)에 부착시키고, 프라이밍하여 공기를 제거하였다. 시린지에 부착된 27-게이지 니들 카테터의 팁을 미측 끝부분 근처의 신피막 바로 아래에 삽입하고, 이어서 니들의 팁을 피막 3-4 mm를 따라 두개로 조심스럽게 전진시켰다. 약 300,000개 세포를 함유하는 2:1 (vol:vol) 세포/매트리겔® 혼합물의 10 μl 분취물을 시린지 펌프를 사용하여 신장 실질 내로 천천히 주사하였다. 니들을 신장 내에 15-20초 동안 두어 주사가 확실하게 완료되게 하였다. 이어서, 니들을 신장으로부터 제거하고, 면봉을 주사 부위 위에 30초 동안 두어 세포의 누출 또는 출혈을 방지하였다. 이어서 신장을 복부 내로 서서히 되돌려 놓고, 복벽을 닫았다. 이식 후 7-14일마다 혈청을 수집하여, 상업적 SEAP 검정 키트를 사용하여 종양 성장을 모니터링하였다. 대부분의 연구의 경우, 이식 5-6주 후에, 종양 측정치가 전형적으로 약 4-8 mm일 때, 종양 마우스를 사용하였다.
HIF2 mRNA 발현의 결정.
본원의 실시예에 보고된 연구를 위해, 마우스를 주사 후 확인된 날에 안락사시키고, 제조업체의 권장사항에 따라 트리졸 시약을 사용하여 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 상대적 HiF2α mRNA 수준을 하기 기재된 바와 같이 RT-qPCR에 의해 결정하고, 전달 완충제 (등장성 글루코스)만으로 처리한 마우스와 비교하였다.
정량적 PCR을 준비하기 위해, 트리리에이전트(TriReagent) (몰레큘라 리서치 센터(Molecular Research Center), 오하이오주 신시내티)에서 균질화된 조직 샘플로부터 제조업체의 프로토콜에 따라 총 RNA를 단리하였다. 대략 500 ng RNA를 고용량 cDNA 역전사 키트 (라이프 테크놀로지스)를 사용하여 역전사시켰다. 인간 (종양) Hif2α (EPAS1) 발현에 대해, 택맨 유전자 발현 마스터 믹스 (라이프 테크놀로지스(Life Technologies)) 또는 베리퀘스트 프로브 마스터 믹스 (아피메트릭스(Affymetrix))를 사용하여 인간 Hif2α (카탈로그 # 4331182) 및 CycA (PPIA) 카탈로그 #: 4326316E)에 대해 사전-제조된 택맨 유전자 발현 검정을 바이플렉스 반응에서 삼중으로 사용하였다. 7500 패스트 또는 스텝원플러스 실시간 PCR 시스템 (라이프 테크놀로지스)을 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. ΔΔCT 방법을 사용하여 상대적 유전자 발현을 계산하였다.
실시예 5. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파 (EPAS1)를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 HIF-2 알파 (Hif2α 또는 EPAS1) 유전자에 대해 적어도 부분적으로 상보적인 핵염기 서열을 갖는 안티센스 가닥을 포함하였다. EPAS1은 HIF (저산소증 유도성 인자) 유전자 패밀리의 구성원이고, 산소에 의해 조절되는 유전자의 유도에 수반되는 전사 인자의 절반을 코딩하며, 이는 산소 수준이 떨어짐 (저산소증으로 공지된 상태)에 따라 유도되고, 투명 세포 신암종 세포에서 빈번하게 과다발현되는 것으로 공지되어 있다. Hif2α RNAi 작용제는 Hif2α의 메신저 RNA (mRNA) 전사체의 번역을 서열 특이적 방식으로 분해하거나 억제할 수 있도록 설계되어, EPAS1 유전자의 발현을 억제하였다. Hif2α RNAi 작용제는 변형된 뉴클레오티드 및 1개 초과의 비-포스포디에스테르 연결로 구성되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 2. 실시예 5에서의 신장 종양 보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00248
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 실시예 5의 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드 (또는, 군 3의 경우, RGD-모방체 펩티드-기반 리간드)에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. RNAi 작용제의 변형된 서열은 상기 실시예 2에 제시된다. 군 4 및 5의 경우, 단일 인테그린 표적화 리간드 (본원에서 "한자리" 리간드로 지칭됨)를 DBCO-PEG5-NHS 에스테르 링커 (브로드팜(BroadPharm))를 통해 RNAi 작용제에 접합시켰고, 이는 센스 가닥의 5' 말단 단부 상의 말단 1급 아민에 접합되었다. 아지드 반응성 기를 갖는 각각의 인테그린 표적화 리간드를 합성하고 (예를 들어, 실시예 1 참조), 이어서 이를 링커의 DBCO 성분에 접합시켰다.
하기 구조를 갖는 "20 kDA PEG 모이어티" 또는 "40 kDA PEG 모이어티"로 지칭되는 PK 조정제를 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고:
Figure pct00249
, 여기서
Figure pct00250
는 AD04546에 표시된 바와 같은 C6-S- 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타내고 (실시예 2 참조), PEG는 20 kDa 또는 40 kDa PEG 쇄를 나타낸다. PK 조정제를 표 A에 제시된 바와 같이 C6-SS-C6 기를 환원시킴으로써 센스 가닥의 3' 단부에 접합시켰고, 이어서 이를 하기 화합물:
Figure pct00251
(여기서, PEG는 20 kDa 또는 40 kDa PEG 쇄를 나타냄)과 마이클 첨가에 적용하였다.
군 6 및 7의 경우, 4개의 인테그린 표적화 리간드를 하기에 의해 나타내어지는 일반 구조를 갖는 DBCO 관능화된 PAMAM-G1 시스타민 코어를 포함하는 네자리 스캐폴드를 통해 접합시켰다:
Figure pct00252
상기 표 2에 표시된 바와 같이, 일부 군에서, 40 kDa 또는 20 kDa PEG 모이어티가 부착되어 약물 제품-접합체의 순환 시간을 증가시키는 PK 인핸서로서의 역할을 하였다. 하기 화학식의 시약을 사용하여 40kDa 또는 20kDa PEG 모이어티를 부착시켰다:
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 3. 실시예 5에서의 희생 시 평균 상대적 huHif2α mRNA 발현.
Figure pct00253
상기 표 3에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다. PK 인핸서로서의 40 kDa PEG 모이어티의 포함은 일반적으로 표적화된 유전자의 발현의 억제를 개선시켰다. 또한, 군 3, 4, 및 5의 비교는 본원에 기재된 구조 1a의 인테그린 표적화 리간드가 αvβ3에 대해 친화도를 갖는 것으로 공지된 RGD 모방체 펩티드-기반 리간드와 대등하고, 구조 2a의 리간드는 RGD 모방체 리간드에 비해 녹다운에서 거의 10% 개선을 나타낸다는 것을 보여주었다. 예를 들어, 군 3 (RGD 모방체)은 대략 60% 녹다운을 가졌고 (0.400); 군 4 (구조 1a)는 대략 61% 녹다운을 가졌고 (0.390); 군 5 (구조 2a)는 대략 69% 녹다운을 가졌다 (0.308).
중요한 것으로, 본원에 개시된 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 것이 리간드를 갖지 않는 동일한 구축물과 비교하여 개선을 나타내었기 때문에, 데이터는 또한 리간드 의존성을 보여주었다. 예를 들어, 군 6 (세자리 인테그린 표적화 리간드 구조 2a)은, 단지 대략 44% 녹다운 (0.563)을 나타낸 군 2 (인테그린 표적화 리간드 부재)와 비교하여, 대략 72% 녹다운 (0.289)을 나타내었다.
추가적으로, 군 6은 군 5에 비해 적은 개선을 보여주었고, 이는 한자리 리간드에 비해 다중자리 리간드에 대한 약간의 선호도를 나타내지만; 둘 다의 형태는 활성이고, RNAi 작용제를 신장으로 전달하였다 (RNAi 작용제에 의한 유전자 발현의 억제에 의해 제시된 바와 같음).
실시예 6. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 4. 실시예 6에서의 신장 종양 보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00254
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드 (또는, 군 2, 3 및 4의 경우, RGD 모방체 펩티드)에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. 군 5 및 6의 경우, 단일 인테그린 표적화 리간드 ("한자리" 리간드)를 하기 DBCO-PEG5-NHS 에스테르를 통해 RNAi 작용제에 접합시켰다.
Figure pct00255
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 5. 실시예 6에서의 희생 시 평균 상대적 인간 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00256
상기 표 5에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제는 대조군과 비교하여 mRNA 발현의 감소를 나타내었다. 또한, 본원에 개시된 구조 2a의 인테그린 표적화 리간드를 함유하는 군 5 및 6은, 군 2 및 3의 RGD-모방체 펩티드-기반 리간드와 비교하여 Hif2α mRNA의 녹다운에서 개선을 나타내었다 (예를 들어, 군 6 (15 mg/kg RNAi 작용제에서 대략 73% 녹다운 (0.271))과 군 3 (15 mg/kg RNAi 작용제에서 대략 67% 녹다운 (0.330))을 비교함).
실시예 7. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 6. 실시예 7에서의 신장 종양 보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00257
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. 군 2 내지 7의 경우, 하기 화합물을 사용하여 접합체를 세자리 스캐폴드로 관능화시켰다:
Figure pct00258
군 8의 경우, 알킨-PEG4-NHS 에스테르를 사용하여 센스 가닥 상의 5' 아민에 한자리 인테그린 표적화 리간드를 연결시켰다. 본원에 제시된 바와 같이, 군 4 내지 7은 다양한 PEG 길이를 갖는 인테그린 표적화 리간드를 사용하였다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 7. 실시예 7에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00259
상기 표 7에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다. 예를 들어, 구조 2a의 세자리 인테그린 표적화 리간드에 접합된 7.5 mg/kg RNAi 작용제의 용량을 포함하는 군 2 (PEG4 기 포함)는 Hif2α의 대략 64% 녹다운을 나타내었다 (0.361). 추가적으로, PEG 기의 길이를 PEG36까지 증가시킨 구축물 (예를 들어, 군 6 및 7)은 모두 녹다운을 나타내었지만, 구조 2a에 존재하는 PEG4 기와 비교하여 어떠한 이익도 관찰되지 않았다.
실시예 8. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여의 용량 반응 연구.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 8. 실시예 8에서의 신장 종양 보유 마우스의 투여 군.
Figure pct00260
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다. 각각의 군은 하기 구조에 의해 도시된 바와 같은 구조 2a의 세자리 인테그린 리간드를 가졌다:
Figure pct00261
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 9. 실시예 8에서의 희생 시 평균 상대적 인간 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00262
상기 표 9에 제시된 바와 같이, 본원에 개시된 구조 2a의 인테그린 표적화 리간드에 접합된 Hif2α RNAi 작용제는 모든 투여량 수준에 걸쳐 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 9. 신장 종양 보유 마우스에서의 인테그린 표적화 리간드에 접합된 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제의 녹다운 지속기간.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다.
표 10. 실시예 9에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00263
군 1 및 2의 마우스를 주사 후 제5일에 안락사시키고; 군 3의 마우스를 주사 후 제8일에 안락사시키고; 군 4의 마우스를 주사 후 제15일에 안락사시키고; 군 1A 및 5의 마우스를 주사 후 제22일에 안락사시켰다.
비히클 대조군의 경우, 군 1에서는 2마리의 마우스에 투여하였고, 군 1A에서는 3마리의 마우스에 투여하였다. RNAi-작용제-인테그린 표적화 리간드 함유 군 (즉, 군 2, 3, 4, 및 5)의 경우, 각각의 군에서 4마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=4). 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 11. 실시예 9에서의 희생 시 평균 상대적 인간 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00264
상기 표 11에 제시된 바와 같이, Hif2α RNAi 작용제는 제22일에 대조군과 비교하여 mRNA 발현의 감소를 계속해서 나타내었다 (제22일에 대략 70% 녹다운 (0.299)).
실시예 10. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 12. 실시예 10에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00265
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 13. 실시예 10에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00266
상기 표 13에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다. 예를 들어, 구조 2a의 세자리 인테그린 표적화 리간드에 접합된 7.5 mg/kg RNAi 작용제의 용량을 포함하는 군 2는 Hif2α mRNA의 대략 65% 녹다운을 나타내었다 (0.351).
실시예 11. αvβ3 KO A498 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
투명 세포 신세포 암종 (ccRCC) A498 종양 세포는 αvβ3 및 αvβ5 인테그린 둘 다를 발현하며, 유동-세포측정 분석에 의하면 αvβ3 발현이 αvβ5보다 약 4-배 더 높다. 이 모델에서 αvβ5의 기여를 평가하기 위해, αvβ3 녹아웃 (KO) A498 세포를 유전자 편집 기술을 통해 합성하였다. 인테그린 αvβ3의 녹아웃을 αvβ3의 게놈 서열분석 및 면역조직화학 염색에 의해 확인하였고, 이는 염색이 αvβ3 KO A498 세포에서 음성임을 나타내었다. A498 WT (αvβ3 및 αvβ5 둘 다 존재) 및 αvβ3 KO A498 세포를 갖는 신장 종양 보유 마우스를 상기 실시예 4에 기재된 바와 같이 제조하였다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스에 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. 하기 표 13에 제시된 각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 바와 같이 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 제시된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 14. 실시예 11에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00267
상기 표 14에 제시된 바와 같이, Hif2α RNAi 작용제-인테그린 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 A498 WT (야생형) 종양에서 Hif2α mRNA 발현의 감소를 나타내었다 (약 71% (0.295) 녹다운). 대조적으로, 예상된 바와 같이, Hif2α mRNA 발현의 감소는 A498 αvβ3 KO 종양에서 덜 효율적이었지만; 그럼에도 불구하고 감소는 38% (0.621) 녹다운으로 상당하였다. 이는 인테그린 αvβ3 및 인테그린 αvβ5 둘 다가 RNAi 작용제 전달에 기여한다는 것을 보여준다.
실시예 12. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 15. 실시예 12에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00268
인간 Hif2α 유전자를 표적화하도록 지시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고, 이는 인테그린 표적화 리간드에의 접합을 용이하게 하기 위해 센스 가닥의 5' 말단 단부에 관능화된 아민 반응성 기 (NH2-C6)를 포함하였다.
하기 구조를 갖는 "Mal-C18-이산 모이어티"로 지칭되는 PD 조정제를 갖는 RNAi 작용제를 합성하였고:
Figure pct00269
여기서
Figure pct00270
는 AD05971에 표시된 바와 같은 C6-S- 기에서의 RNAi 작용제에 대한 부착 지점을 나타낸다 (실시예 2 참조). PD 조정제를 표 A에 제시된 바와 같이 C6-SS-C6 기를 환원시킴으로써 센스 가닥의 3' 단부에 접합시켰고, 이어서 이를 하기 화합물:
Figure pct00271
과 마이클 첨가에 적용하였다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 16. 실시예 12에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00272
상기 표 16에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 13. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 17. 실시예 13에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00273
Figure pct00274
(i) avb3 표적화 리간드는 2'-O-프로파르길 뉴클레오티드 (변형된 센스 가닥 서열에서 aAlk, gAlk, 및 uAlk에 의해 나타내어짐)에 연결되며, 이는 센스 가닥 서열 상에서 5' → 3'로 보았을 때 센스 가닥 상의 뉴클레오티드 14, 16, 18, 및 20에서 이루어졌다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 18. 실시예 13에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00275
상기 표 18에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었고, 구조 2a 및 구조 32a의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 구축물은 가장 큰 억제 활성을 나타내었다.
실시예 14. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 19. 실시예 14에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00276
(i) avb3 표적화 리간드는 2'-O-프로파르길 뉴클레오티드 (변형된 센스 가닥 서열에서 aAlk, gAlk, 및 uAlk에 의해 나타내어짐)에 연결되며, 이는 센스 가닥 서열 상에서 5' → 3'로 보았을 때 센스 가닥 상의 뉴클레오티드 14, 16, 18, 및 20에서 이루어졌다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 20. 실시예 14에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00277
상기 표 20에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 15. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 21. 실시예 15에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00278
Figure pct00279
Figure pct00280
(i) avb3 표적화 리간드는 2'-O-프로파르길 뉴클레오티드 (변형된 센스 가닥 서열에서 aAlk, gAlk, 및 uAlk에 의해 나타내어짐)에 연결되며, 이는 센스 가닥 서열 상에서 5' → 3'로 보았을 때 센스 가닥 상의 뉴클레오티드 14, 16, 18, 및 20에서 이루어졌다.
각각의 군에서 3마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=3). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 22. 실시예 15에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00281
Figure pct00282
상기 표 22에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
실시예 16. 신장 종양 보유 마우스에서 HIF-2 알파를 표적화하는 RNAi 작용제에 접합된 인테그린 표적화 리간드의 생체내 투여.
센스 가닥 및 안티센스 가닥을 포함하는 RNAi 작용제를 관련 기술분야에 공지되어 있고 본원의 실시예 2에 제시된 바와 같이 올리고뉴클레오티드 합성에 통상적으로 사용되는 일반적 절차에 따라 고체 상 상에서 포스포르아미다이트 기술에 따라 합성하였다. RNAi 작용제는 본원의 실시예 2에 제시된 각각의 변형된 뉴클레오티드 서열을 가졌고, Hif2α (EPAS1)를 표적화하도록 설계되었다.
연구 제1일에, 신장 종양 보유 마우스 (실시예 4 참조)에 꼬리 정맥 주사를 통해 하기 투여 군에 따라 투여하였다:
표 23. 실시예 16에서의 마우스의 투여 군.
Figure pct00283
Figure pct00284
Figure pct00285
(i) avb3 표적화 리간드는 2'-O-프로파르길 뉴클레오티드 (변형된 센스 가닥 서열에서 aAlk, gAlk, 및 uAlk에 의해 나타내어짐)에 연결되며, 이는 센스 가닥 서열 상에서 5' → 3'로 보았을 때 센스 가닥 상의 뉴클레오티드 14, 16, 18, 및 20에서 이루어졌다.
1마리의 마우스에서 주사 오류가 있었던 것으로 여겨져 단지 3마리의 마우스만을 갖는 군 4를 제외하고, 각각의 군에서 4마리의 종양 보유 마우스에 투여하였다 (n=4). 마우스를 주사 후 연구 제8일에 희생시키고, 실시예 4에 제시된 절차에 따라 신장 종양으로부터 총 RNA를 단리하였다. 이어서, 프로브-기반 정량적 PCR (RT-qPCR)에 의해 상대적 인간 HIF2α mRNA 발현을 정량화하고, 인간 시클로필린 A (PPIA) 발현에 대해 정규화하고, 실시예 4에 설명된 바와 같이 비히클 대조군 (등장성 글루코스)의 분율 (기하 평균, +/-95% 신뢰 구간)로서 표현하였다.
표 24. 실시예 16에서의 희생 시 평균 상대적 Hif2α mRNA 발현.
Figure pct00286
상기 표 24에 제시된 바와 같이, 각각의 Hif2α RNAi 작용제-인테그린 표적화 리간드 접합체는 대조군과 비교하여 마우스에서 mRNA 발현의 감소를 나타내었다.
다른 실시양태
본 발명이 그의 상세한 설명과 함께 기재되었지만, 상기 설명은 예시하기 위한 것이며, 첨부된 청구범위의 범주에 의해 정의되는 본 발명의 범주를 제한하지 않도록 의도되는 것으로 이해되어야 한다. 다른 측면, 이점 및 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 있다.
SEQUENCE LISTING <110> ARROWHEAD PHARMACEUTICALS, INC. <120> Integrin Targeting Ligands and Uses Thereof <130> 30657-WO1 <150> 62/663,763 <151> 2018-04-27 <150> 62/790,372 <151> 2019-01-09 <160> 6 <210> 1 <211> 21 <212> RNA <213> Homo sapiens <220> <223> RNAi agent antisense strand modified sequence <400> 1 uuucaugaaa ucguuacguu g 21 <210> 2 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 2 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand modified sequence <400> 3 uuucaugaaa ucguuacguu g 21 <210> 4 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 4 caacguaacg auuucaugaa a 21 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent antisense strand modified sequence <400> 5 uuucaugaaa ucguuacguu g 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> RNAi agent sense strand modified sequence <400> 6 caacguaacg auuucaugaa a 21

Claims (39)

  1. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드.
    Figure pct00287

    여기서
    X는 -C(R3)2-, -NR3-,
    Figure pct00288
    이고;
    Y는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    Z는 O, NR3, 또는 S이고;
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 임의로 치환된 아릴인 표적화 리간드.
  3. 제2항에 있어서, R1이
    Figure pct00289
    로 이루어진 군으로부터 선택되고, 여기서
    Figure pct00290
    는 부착 지점을 나타내고, CM은 화물 분자를 포함하는 것인 표적화 리간드.
  4. 제1항에 있어서, Y가 C1 내지 C6 알킬렌인 표적화 리간드.
  5. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00291

    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 R1 또는 R2 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  6. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00292

    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    R3은 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  7. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00293

    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    R3은 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  8. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00294

    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  9. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00295

    여기서
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 R1, R2 및 R3 중 적어도 1개는 화물 분자를 포함한다.
  10. 제1항 및 제5항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 하기로 이루어진 군으로부터 선택되며:
    Figure pct00296

    여기서
    Figure pct00297
    는 부착 지점을 나타내고, CM은 화물 분자를 포함하는 것인 인테그린 표적화 리간드.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 화물 분자가 활성 제약 성분 또는 전구약물인 인테그린 표적화 리간드.
  12. 제11항에 있어서, 화물 분자가 소분자, 항체, 항체 단편, 이뮤노글로불린, 모노클로날 항체, 표지 또는 마커, 지질, 천연 또는 변형된 올리고뉴클레오티드, 변형된 올리고뉴클레오티드-기반 화합물 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 작용제), 천연 또는 변형된 핵산, 펩티드, 압타머, 중합체, 폴리아민, 단백질, 독소, 비타민, 폴리에틸렌 글리콜, 합텐, 디곡시게닌, 비오틴, 방사성 원자 또는 분자, 또는 형광단을 포함하는 것인 인테그린 표적화 리간드.
  13. 하기로부터 선택된 화학식을 포함하는 인테그린 표적화 리간드 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    Figure pct00298

    Figure pct00299

    Figure pct00300

    Figure pct00301

    Figure pct00302

    Figure pct00303

    Figure pct00304

    여기서
    Figure pct00305
    는 화물 분자를 포함하는 모이어티에의 연결 지점을 나타낸다.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 인테그린 표적화 기이며, 한자리 형태이고, 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 기.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 인테그린 표적화 기이며, 두자리 형태이고, 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 기.
  16. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 인테그린 표적화 기이며, 세자리 형태이고, 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 기.
  17. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드를 포함하는 인테그린 표적화 기이며, 네자리 형태이고, 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 기.
  18. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 포함하는 화물 분자에 접합된 인테그린 표적화 리간드.
  19. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 화물 분자가 RNAi 작용제를 포함하는 것인 인테그린 표적화 리간드.
  20. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 2-20개의 에틸렌 옥시드 단위를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 링커를 추가로 포함하는 인테그린 표적화 리간드.
  21. 하기 화학식의 인테그린 표적화 리간드 전구체.
    Figure pct00306

    여기서,
    X는 -C(R3)2-, -NR3-,
    Figure pct00307
    이고;
    Y는 임의로 치환된 알킬렌이고;
    Z는 O, NR3, 또는 S이고;
    n은 1 내지 8의 정수이고;
    R1은 임의로 치환된 아릴, 임의로 치환된 헤테로아릴, 임의로 치환된 헤테로시클릴, 임의로 치환된 시클로알킬이거나, 또는 R1은 화물 분자를 포함하고;
    R2는 H, 임의로 치환된 알킬이거나, 또는 R2는 화물 분자를 포함하고;
    각 경우의 R3은 독립적으로 H 및 임의로 치환된 알킬로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 또는 R3은 화물 분자를 포함하고;
    R4는 H 또는 임의로 치환된 알킬이고;
    여기서 Y, R1, R2, 임의의 경우의 R3, 및 R4 중 적어도 1개는 반응성 기를 포함한다.
  22. 제21항에 있어서, 반응성 기가 아지드인 인테그린 표적화 리간드 전구체.
  23. 구조 1b, 구조 1c, 구조 2b, 구조 2c, 구조 2.1b, 구조 2.1c, 구조 2.2b, 구조 2.2c, 구조 2.3b, 구조 2.3c, 구조 2.4b, 구조 2.4c, 구조 2.5b, 구조 2.5c, 구조 2.6b, 구조 2.6c, 구조 2.7b, 구조 2.8c, 구조 2.8b, 구조 2.8c, 구조 2.9b, 구조 2.9c, 구조 2.10b, 구조 2.10c, 구조 2.11b, 구조 2.11c, 구조 28b, 구조 28c, 구조 29b, 구조 29c, 구조 30b, 구조 30c, 구조 31b, 구조 31c, 구조 32b, 구조 32c, 구조 33b, 구조 33c, 구조 34b, 구조 34c, 구조 36b, 구조 36c, 구조 37b, 구조 37c, 구조 38b, 구조 38c, 구조 39b, 구조 39c, 구조 40b, 구조 40c, 구조 41b, 및 구조 41c로 이루어진 군에 의해 나타내어지는 구조를 갖는 인테그린 표적화 리간드 전구체.
  24. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드에 연결된 올리고뉴클레오티드-기반 치료제를 포함하는 접합체.
  25. 제24항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-기반 치료제가 RNAi 작용제인 접합체.
  26. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 조성물.
  27. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기를 포함하며, 여기서 인테그린 표적화 리간드 또는 표적화 기는 인테그린을 발현하는 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 올리고뉴클레오티드-기반 화합물에 접합된 것인 조성물.
  28. 제27항에 있어서, 인테그린 표적화 리간드 또는 표적화 기가 인테그린을 발현하는 세포에서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있는 RNAi 작용제에 접합된 것인 조성물.
  29. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 인테그린이 인테그린 αvβ3, αvβ5, 또는 αvβ3 및 αvβ5 둘 다인 조성물.
  30. (i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기를 포함하며, 여기서 인테그린 표적화 리간드 또는 표적화 기는 1개 이상의 화물 분자에 접합된 것인 조성물, 또는 (ii) 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체에서 인테그린 αvβ3, αvβ5, 또는 αvβ3 및 αvβ5 둘 다를 발현하는 세포로 1개 이상의 화물 분자를 전달하는 방법.
  31. (i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기를 포함하며, 여기서 인테그린 표적화 리간드 또는 표적화 기는 1개 이상의 화물 분자에 접합된 것인 조성물, 또는 (ii) 제26항 내지 제29항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 대상체의 세포 또는 조직으로 1개 이상의 화물 분자를 생체내 전달하는 방법.
  32. 제30항 또는 제31항에 있어서, 1개 이상의 화물 분자가 올리고뉴클레오티드-기반 화합물을 포함하는 것인 방법.
  33. 제32항에 있어서, 올리고뉴클레오티드-기반 화합물이 RNAi 작용제인 방법.
  34. 유효량의 (i) 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기에 접합된 RNAi 작용제를 포함하는 조성물, 또는 (ii) 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 인테그린 αvβ3, 인테그린 αvβ5, 또는 인테그린 αvβ3 및 αvβ5 둘 다를 발현하는 세포에서 표적 유전자의 발현을 생체내 억제하는 방법.
  35. 제34항에 있어서, 표적 유전자가 EPAS1 (HIF2 알파)인 방법.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 세포가 투명 세포 신암종 종양 세포인 방법.
  37. αvβ3, αvβ5, 또는 αvβ3 및 αvβ5 둘 다를 포함하는 세포로 화물 분자를 전달하기 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항의 인테그린 표적화 리간드 또는 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항의 표적화 기 또는 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  38. 제37항에 있어서, 세포가 신세포인 용도.
  39. αvβ3, αvβ5, 또는 αvβ3 및 αvβ5 둘 다를 포함하는 세포로의 화물 분자의 전달에 의해 치료되거나 호전될 수 있는 질환 또는 장애의 치료를 위한 의약의 제조를 위한, 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
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