KR20210001618A - 면역화학진단 세포 칩 구조체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암 오가노이드를 세포외기질과 함께 배양함과 동시에 암 오가노이드를 고정하고, 면역화학염색(Immunostaining)을 고속 대용량으로 할 수 있으며 반복되는 시약교체나 시료의 흡입 및 주입하는 과정 중 필라와 웰 사이의 버블 발생을 방지할 수 있는 구조의 면역화학진단 세포 칩에 관한 것이다.

Description

면역화학진단 세포 칩 구조체 {Immunochemistry diagnostic cell chip structure}

본 발명은 필라와 웰을 구비한 진단 칩에 관한 것으로, 자세하게는 암 오가노이드를 세포외기질과 함께 배양함과 동시에 암 오가노이드를 고정하고, 면역화학염색(Immunostaining)을 고속 대용량으로 할 수 있으며 반복되는 시약교체나 시료의 흡입 및 주입하는 과정 중 필라와 웰 사이의 버블 발생을 방지할 수 있는 구조의 면역화학진단 세포 칩에 관한 것이다.

도 1은 암 오가노이드 기반 약물효능분석의 개인 맞춤 의학 활용 개념도로, 위, 간 등 실제 장기 암 조직의 구조와 기능을 일부 닮았다는 의미인 암 오가노이드(Cancer Organoid)는 질병모형과 약물개발의 플랫폼을 구축하는데 활용되며, 차원 세포배양법을 통해 체외에서 형성된 암 오가노이드는 생체모방성이 뛰어나 항암제의 개발 또는 암환자 맞춤형 항암제 선정시에 중요한 보조자료로 사용될 가능성이 크다. 특히 4차산업 기술인 유전체분석, 바이오 프린팅 기술이 암 오가노이드에 사용되면서 정밀의료(맞춤형 치료)에 암 오가노이드 기술이 빠르게 적용될 전망이다.

따라서, 많은 연구 그룹들이 오가노이드 배양기법에 관한 연구를 진행하여 배양조건 및 방법에 대해서는 잘 알려졌으며, 이렇게 형성된 암 오가노이드에 항암제를 처리하여, 다양한 항암제의 효능을 고속 대용량으로 분석함으로써 암 오가노이드를 신약 개발 또는 맞춤형 의료, 정밀의료 등에 활용하는 시도가 많이 이루어지고 있다.

특히, 배양된 암 오가노이드의 단순 세포 활성을 측정하는 것을 넘어, 오가노이드 면역화학염색을 통해서 항암제에 따른 다양한 유전체 발현, 바이오 마커, 약물 기전의 변화를 측정하는 연구가 활발하다.

이때 면역화학염색은 많은 세부공정(세포고정, 투과, 블로킹, Antibody 염색)과 각 공정 사이에 세정과정을 거치게 되며, 이때 세포외기질과 암 오가노이드의 손상 없이 고속 대용량으로 면역화학염색을 하는 것이 암 오가노이드 면역화학진단에 중요한 기술이라할 수 있다.

하지만, 국내외 연구그룹들이 암 오가노이드 배양법을 개발하고 있으나, 막상 배양된 암 오가노이드의 분석은 단순히 활성 세포를 염색하여 크기를 측정하거나, 기존 2차원 세포배양 또는 생체조직에 사용되는 면역화학염색법을 채용하고 있어, 암오가노이드의 고속 대용량 면역화학염색이 어려운 실정이다.

암 오가노이드의 면역화학염색은 크게 절편 면역화학염색방식, 2차원 세포 면역화학연색방식이 있다.

첫 번째, 절편 면역화학염색방식은 세포외기질 내의 암 오가노이드를 수작업으로 파라핀블락 또는 OCT블락에 고정하고 절편을 만들어 염색하는 방법으로, 수 ㎜의 세포외기질의 두께 때문에 암오가노이드의 염색을 바로하지 않고 절편을 만들어서 하는 방식으로 기존 생체조직 면역화학염색법을 암 오가노이드에 적용한 방식이다.

이 방식은 암 오가노이드는 단면을 볼 수 있어 오가노이드의 내부구조를 볼 수 있는 장점이 있으나 암 오가노이드 이송시 쉽게 훼손되고, 오가노이드 단면이 아닌 전체의 분석이 어렵고, 다양한 항암제를 스크린 하기 위한 고속 대용량 스크린이 불가능하다.

두 번째, 2차원 세포 면역화학염색방식은 세포외기질내에 암 오가노이드를 바로 고정하고 투과(Permeabilization), 염색(Staining)과정을 웰에서 진행하는 기존 2차원으로 배양된 세포에 사용되는 면역화학염색방식을 암 오가노이드에 적용한 방식이다.

이 방식은 웰의 바닥에 세포외기질과 오가노이드를 얇게 물방울 형태로 형성하고, 염색을 위한 다양한 시약을 교체하여 암 오가노이드를 염색하는 방식으로 어레이 방식으로 염색할 수 있어 절편 방식보다 고속 대용량 스크린이 가능한 장점이 있으나, 세포의 고정, 투과, 염색하는 과정에서 다음과 같은 문제점이 있다.

첫째, 염색시약(Antibody)량으로, 현재 24~384 well plate에서 오가노이드 배양이 주로 이루어 지고 있어 한 웰당 50ul~ 1㎖의 고가의 시약이 필요하다.

둘째, 어레이 집적도로 세포고정, 투과, 염색과정에서 많은 시약 교환을 위해 일정한 공간이 필요하므로 웰의 집적도를 높이지 못한다.

셋째, 세포외기질의 붕괴로 세포 고정, 투과과정에서 세포외기질이 붕괴되는 문제가 발생한다.

넷째, 세포외기질의 형광 노이즈 발생으로 암 오가노이드 염색시에 세포외기질이 염색되어 형광노이즈가 발생한다.

상술한 문제로 인해 암 오가노이드를 세포외기질과 함께 배양함과 동시에, 암 오가노이드를 고정하고, 면역화학염색(Immunostaining)을 고속 대용량으로 할 수 있는 암오가노이드 면역화학진단 세포 칩 개발이 요구되고 있었다.

도 2는 기존 웰 플레이트 방식 및 필라 칩 방식의 문제점을 나타낸 개념도, 도 3은 기존 세포칩에서 버블이 발생 모습을 나타낸 사진으로, 기존 웰 플레이트(Well Plate) 방식에서는 상용 웰 플레이트 바닥에 세포외기질과 암세포 혼합액을 고정하여 암오가노이드를 배양하고, 암오가노이드의 고정, 투과, 블로킹, 염색, 세정하는 과정을 웰에서 진행하여 어레이 기반으로 암 오가노이드를 염색한다.

하지만, 도 2와 같이 암오가노이드 염색 시, 웰당 고가의 Antibody 염색 시약을 최소 10㎕ 이상 사용하고, 오가노이드의 고정, 투과, 블로킹, 염색, 세정하는 과정에서 피펫 팁(Pipet tip)으로 시약교체를 하여 일정공간이 필요하므로 Array Density를 높이지 못한다.

특히, 오가노이드 염색은 최소 5회 이상의 시약 교체가 있으며, 피펫 팁으로 시료의 흡입과 주입을 반복하는 과정 중에 세포외기질과 암 오가노이드가 손상되어 유실되는 경우가 발생한다.

이를 해결하기 위해 기존 micropillar /microwell 칩을 면역화학염색에 적용하여 시료의 양을 줄이고 오가노이드의 손상을 막고자 시도하였지만, 염색 전 단계인 고정, 투과, 블로킹 단계에서 필라칩 전체가 시약에 젖게 되고, 젖은 필라칩을 염색시약이 든 웰 칩에 체결 시에 필라 옆면의 묻은 시약이 웰 벽면에 먼저 닿으면서 버블이 생성되고, 염색시약이 버블에 밀러 넘치면서 염색이 불균일하게 되는 문제가 있었다.

대한민국 공개특허 제10-2014-0146741호(2014.12.29)

본 발명은 상기와 같은 문제를 해결하기 위하여 창출된 것으로, 본 발명의 목적은 필라 칩에 통기공을 만들어 웰칩과 체결 시 생기는 압력이 밖으로 빠지고 젖은 필라가 잘 건조될 수 있게 하고, 웰칩을 2단 구조로 만들어 젖은 필라의 측면이 웰 벽면과 닿지 않게 하여 버블 발생을 방지할 수 있는 면역화학진단 세포 칩 구조체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 위해 본 발명은 세포 칩에 있어서, 끝 부분에 생체물질이 부착되는 복수의 필라가 일정간격으로 이격되어 하측으로 돌출 형성된 필라칩; 상기 필라칩 하측으로 결합하며, 상기 필라 단부에 부착된 생체물질에 제공되는 약액을 수용하는 웰이 복수로 형성된 웰칩; 으로 이루어지되, 상기 웰은 상단부가 상기 필라와 동일한 폭으로 형성되고, 인접한 웰 사이에 수평으로 형성된 제1격벽과, 상기 제1격벽 상측으로 좁아지는 형태로 돌출되되 필라와 설정된 간격으로 이격되는 제2격벽이 구비되는 것을 특징으로 한다.

이때 상기 필라칩은, 필라 사이를 상하 관통되는 형태로 형성되어 웰칩과의 결합에 따른 하부 압력을 낮추는 통기공이 형성되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 웰칩은 전후좌우 테두리 측에 상방으로 돌출된 가이드바를 구비하고, 상기 필라칩은 전후좌우 테두리 부분에서 상기 가이드바에 각각 접촉되되 상하방향으로 돌출된 정렬돌기를 구비하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 가이드바와 정렬돌기의 접촉면에는 각각 마찰력을 높이는 표면처리부가 형성되는 것이 바람직하다.

본 발명을 통해 종래 면역화학염색에서 염색 시약의 높은 가격으로 작은 웰에 염색시약을 넣어서 염색함에 있어 필라와 웰이 체결될 때 버블이 발생하는 문제를 해결하여 시료가 닫는 부분은 웰구조를 하고 나머지 부분의 격벽은 넓혀서 공기 소통을 원활하게 하여 버블을 방지할 수 있다.

더불어 웰의 바닥부분의 염색약을 사용하므로 고가 염색 시료를 최소화 할 수 있으며, 어레이 집적도, 오가노이드 고정시 세포외기질의 붕괴, 염색시 세포외기질의 노이즈 문제를 개선할 수 있다.

도 1은 암 오가노이드 기반 약물효능분석의 개인 맞춤 의학 활용 개념도,
도 2는 기존 웰 플레이트 방식 및 필라 칩 방식의 문제점을 나타낸 개념도,
도 3은 기존 세포칩에서 버블이 발생 모습을 나타낸 사진,
도 4는 본 발명의 1 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 제1단면도,
도 5는 본 발명의 1 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 제2단면도이다.
도 6은 본 발명의 2 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 사시도이다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명 면역화학진단 세포 칩 구조체의 구조를 구체적으로 설명한다.

도 4는 본 발명의 1 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 제1단면도, 도 5는 본 발명의 1 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 제2단면도이다.

본 발명은 세포칩 구조체로 기본적으로 끝 부분에 생체물질이 부착되는 복수의 필라(11)가 일정간격으로 이격되어 하측으로 돌출 형성된 필라칩(1)과, 상기 필라칩(1) 하측으로 결합하며 상기 필라(11) 단부에 부착된 생체물질에 제공되는 약액(4)을 수용하는 웰(21)이 복수로 형성된 웰칩(2)으로 구성된다.

상기 필라(11)는 소형의 원기둥 형태의 구조체로 하단면이 평평한 상태에서 표면 거칠기 향상 등 접촉력 향상을 위한 표면처리가 이루어져 생체물질이 소량 부착될 수 있도록 구성된다. 본 발명에서 생체물질이라 함은 염색이나 약물반응의 대상이 되는 다양한 물질을 포함하게 되며, 특별히 암 오가노이드 분석을 위한 세포 및 세포외기질을 의미한다. 미세노즐 수단 등을 통해 세포 및 세포외기질을 필라(11) 단부에 로딩하며 이를 웰(21)에 수용된 약물에 접촉시켜 처리 현미경 등을 통해 확인 분석이 이루어질 수 있다.

이렇게 필라(11) 단부에 생체물질이 부착된 상태에서 필라칩(1)을 웰칩(2) 상측에 결합시켜 전체 구비된 필라(11) 단부가 하측에 대응하는 웰(21)에 각각 접촉하며, 생체물질(3)이 웰(21)에 수용된 약액(4)에 침지된다. 이때 약액(4)은 생체물질의 배양을 비롯하여 특히 오가노이드의 고정, 투과, 블로킹, 염색 등 약물처리를 위한 용액을 포함하게 된다.

기존에는 웰이 비교적 깊게 형성되어 필라 자체가 약액에 침지되는 형태로 이루어졌으나, 본 발명에서는 상기 웰(21)의 상단부가 상기 필라(11)와 동일한 폭으로 형성되어 필라(11) 단부의 생체물질(3)만 웰(21)의 약액(4)에 수용되고 필라(11)는 웰(21) 내부로 들어가지 않도록 구성되어 앞서 언급한 필라 주변 버블을 방지한다.

구체적으로 인접한 웰(21) 사이에 수평으로 형성된 제1격벽(22)을 통해 인접한 웰(21) 사이의 구분이 이루어지며 약액이 섞이지 않도록 하며, 상기 제1격벽(22) 상측으로 좁아지는 형태로 돌출되되 필라와 설정된 간격으로 이격되도록 제2격벽(23)이 구성되어 필라(11)에 약액(4)의 접촉을 구조적으로 방지하면서 생체물질(3)이 웰(21)에 수용된 약액(4)에 원활히 침지될 수 있으며, 생체물질에 공급되는 약액의 양을 최소화하며 고가의 약액을 절감할 수 있게 된다.

이때 개별 필라(11) 대비 큰 면적을 갖는 필라칩(1)을 필라(11)가 하측으로 향하도록 웰칩(2) 상측에 덮는 작업에 있어 인접한 필라(11) 사이의 공간에서 제2격벽(23)의 체적 등으로 인한 미세한 압력이 형성됨에 따라 상기 필라칩(1)은 필라(11) 사이를 상하 관통되는 형태로 형성되어 웰칩(2)과의 결합에 따른 하부 압력을 낮추는 통기공(12)을 구비하는 것이 바람직하다. 더불어 상기 통기공(12)은 생체물질(3)이 약액(4)과 반응함으로써 발생하는 가스와 공기의 이동통로로 활용될 수도 있으며 가급적 인접한 필라 사이마다 다수 설치된다.

도 6은 본 발명의 2 실시예에 따른 세포칩의 구조를 나타낸 사시도이다.

앞서 언급한 바와 같이 필라칩(1)을 웰칩(2) 상부에 결합함에 있어 각 필라(11)가 대응하는 하측의 웰(21)에 정확하게 위치해야 하며, 필라(11) 단부의 생체물질(3)이 상기 제2격벽(23) 등에 접촉하지 않도록 이를 가이드해 주는 것이 바람직하다.

이를 위해 본 발명의 2 실시예에서 상기 웰칩(2)은 전후좌우 테두리(24) 측에 상방으로 돌출된 가이드바(25)를 구비하고, 상기 필라칩(1)은 전후좌우 테두리 부분에서 상기 가이드바(25)에 각각 접촉되되 상하방향으로 돌출된 정렬돌기(13)를 구비하는 것이 바람직하다.

이때 가이드바(25)가 정렬돌기(13)를 일부 감싸는 형태로 구성함으로 필라칩(1)과 웰칩(2)의 결합이 정위치에서 안정적으로 이루어질 수 있으며, 하측으로 돌출된 정렬 돌기가 웰칩(2) 상부 면에 접촉함으로 필라(11)의 하단이 웰(21)의 상단에 정확하게 위치하며 생체물질(3)만 약액(4)에 접촉될 수 있는 길이로 구성하는 것이 바람직하다.

또한, 상기 가이드바(25)와 정렬돌기(13)의 접촉면에는 각각 마찰력을 높이도록 거칠기를 향상시킨 표면처리부(S)가 형성되어 필라칩(1)의 하강시 자중에 의해 빠르게 떨어지지 않고 마찰력에 의해 내려가는 속도를 다소 낮춰 생체물질(3)이 약액(4)에 침지시 발생할 수 있는 충격을 줄여 세포외기질의 손상이나 약액이 튀는 것을 방지할 수 있다.

본 발명의 권리는 위에서 설명된 실시 예에 한정되지 않고 청구범위에 기재된 바에 의해 정의되며, 본 발명의 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 청구범위에 기재된 권리범위 내에서 다양한 변형과 개작을 할 수 있다는 것은 자명하다.

1: 필라칩 11: 필라
12: 통기공 13: 정렬돌기
2: 웰칩 21: 웰
22: 제1격벽 23: 제2격벽
24: 테두리 25: 가이드바
S: 표면처리부 3: 생체물질
4: 약액

Claims (4)

1. 세포 칩에 있어서,
   끝 부분에 생체물질(3)이 부착되는 복수의 필라(11)가 일정간격으로 이격되어 하측으로 돌출 형성된 필라칩(1);
   상기 필라칩(1) 하측으로 결합하며, 상기 필라(11) 단부에 부착된 생체물질에 제공되는 약액(4)을 수용하는 웰(21)이 복수로 형성된 웰칩(2); 으로 이루어지되,
   상기 웰(21)은 상단부가 상기 필라(11)와 동일한 폭으로 형성되고, 인접한 웰 사이에 수평으로 형성된 제1격벽(22)과, 상기 제1격벽(22) 상측으로 좁아지는 형태로 돌출되되 필라(11)와 설정된 간격으로 이격되는 제2격벽(23)이 구비되는 것을 특징으로 하는 면역화학진단 세포 칩 구조체.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 필라칩(1)은,
   필라(11) 사이를 상하 관통되는 형태로 형성되어 웰칩(2)과의 결합에 따른 하부 압력을 낮추는 통기공(12)이 형성되는 것을 특징으로 하는 면역화학진단 세포 칩 구조체.
   
3. 제1항에 있어서,
   상기 웰칩(2)은 전후좌우 테두리 측에 상방으로 돌출된 가이드바(25)를 구비하고,
   상기 필라칩(1)은 전후좌우 테두리 부분에서 상기 가이드바(25)에 각각 접촉되되 상하방향으로 돌출된 정렬돌기(13)를 구비하는 것을 특징으로 하는 면역화학진단 세포 칩 구조체.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 가이드바(25)와 정렬돌기(13)의 접촉면에는 각각 마찰력을 높이는 표면처리부(S)가 형성되는 것을 특징으로 하는 면역화학진단 세포 칩 구조체.

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