KR20200136939A

KR20200136939A - 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법

Info

Publication number: KR20200136939A
Application number: KR1020207029275A
Authority: KR
Inventors: 탈랄 아민 샤틸라; 하니 하브; 밍컨 시아; 아미르 마수드
Original assignee: 더 칠드런스 메디칼 센터 코포레이션
Priority date: 2018-03-15
Filing date: 2019-03-15
Publication date: 2020-12-08
Also published as: BR112020018810A2; US20210278418A1; ZA202005720B; MX2020009496A; AU2019236244A1; CN112188901A; JP2021518345A; RU2020133768A; JP2024063095A; EP3765025A1; CA3094143A1; EP3765025A4; WO2019178488A1

Abstract

천식 또는 알레르기성 질환을 치료하기위한 방법 및 조성물이 본 명세서에 기재되어 있다. 본 발명의 양상은 Notch4를 표적으로 하는 작용제를 대상체에게 투여하는 것에 관한 것이다. 일 실시형태에서, 작용제는 항-Notch4 항체이다.

Description

천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법

관련 출원에 대한 상호 참조

본 국제 출원은 35 U.S.C. §119(e)에 따라 2018년 3월 15일에 출원한 미국 가출원 제62/643,476호, 2018년 4월 4일에 출원한 US 제62/652,630호 및 2018년 4월 18일에 출원한 US 제62/659,379호에 대한 이익을 주장하며, 이들 각각의 내용은 이들 전체로 참조로 본 명세서에 통합된다.

정부 지원

본 발명은 국립 보건원이 수여한 보조금 번호 2R01AI065617 및 R01AI115699에 따른 정부의 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대한 특정 권리를 갖는다.

배경

교통-관련 미립자 물질(PM; particulate matter)에 대한 노출은 천식과 알레르기성 질환을 촉진한다. 그러나, PM 노출이 이러한 효과를 매개하는 역할을 하는 정확한 세포 및 분자 메커니즘은 아직 명확하지 않다. 천식 및 알레르기성 질환을 치료하거나 예방하는 치료제를 개발하는 데 주변 초미세입자(UFP; ultra fine particles)에 의해 유도되는 알레르기성 기도 염증의 증강(augmentation)에 중요한 세포 표적 및 신호전달 경로에 대한 이해가 필수적이다.

요약

본 명세서에 기재된 본 발명은, 부분적으로, 초미세입자가 폐포 대식세포와 알레르겐-특이적 T 세포 사이의 Jag1-Notch4 의존적 상호 작용을 촉진하여, 증강된 Th 세포 분화를 야기함으로써 알레르기성 기도 염증을 악화시킨다는 발견과 관련이 있다. 따라서, 본 명세서에 기재된 본 발명의 일 양상은, 유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 또 다른 양상은 (a) 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체를 확인하는 단계; 및 (b) 유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 또 다른 양상은 천식 또는 알레르기성 질환 치료용 조성물을 제공하며, 이 조성물은 Notch4를 억제하는 작용제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 임의의 양상의 일 실시형태에서, 조성물은 흡입 투여용으로 제형화된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, 천식은 알레르기성 천식, 알레르기가 없는 천식, 아스피린 악화 호흡기 질환(aspirin exacerbated respiratory disease), 운동 유발 천식(exercise induced asthma), 기침 변이(cough variant), 및 직업성 천식(occupational asthma)으로 이루어진 목록에서 선택된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, 알레르기성 질환은 알레르기성 비염(allergic rhinitis), 부비동염(sinusitis), 중이염(otitis media), 아토피성 피부염(atopic dermatitis), 두드러기(urticaria), 혈관부종(angioedema) 및 아나필락시스(anaphylaxis)로 이루어진 목록으로부터 선택된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군으로부터 선택된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, 항체는 인간화 항체(humanized antibody)이다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, RNAi는 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA이다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 것은 Notch4의 발현 수준 및/또는 활성을 억제하는 것이다. 임의의 양상의 일 실시형태에서, Notch4의 발현 수준 및/또는 활성은 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 그 이상으로 억제된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, Notch4는 T 조절 세포 상에서 억제된다.

임의의 양상의 일 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 항-천식 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다. 임의의 양상의 일 실시형태에서, 방법은 적어도 하나의 추가 항- 알레르기성 질환 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일 양상은 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환을 예방하는 방법을 제공한다. 임의의 양상의 일 실시형태에서, 방법은 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 또 다른 양상은 (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플에서 Notch4의 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 대상체는 참조 수준과 비교하여 Notch 수준이 증가하면 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 것인 단계; 및 (c) Notch4를 억제하는 작용제를 위험에 처한 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.

임의의 측면의 일 실시형태에서, Notch4의 수준은 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 또는 그 이상 증가한다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 일 양상은 (a) 치료제의 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제1 수준을 결정하는 단계; (b) 상기 치료제 투여 후 환자에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제2 수준을 결정하는 단계; 및 (c) Notch4 발현 또는 활성의 상기 제1 및 제2 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 상기 치료제는 Notch4 발현 또는 활성의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준보다 낮으면 효과적인 것으로 간주되고, 여기서 (b)에서 투여되는 치료제는 Notch4 발현의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준과 동일하거나 더 높으면 비효과적인 것인, 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체의 치료에서 치료제의 효능을 결정하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 치료제는 Notch4를 억제하는 작용제이다.

정의

편의를 위해, 명세서, 실시예 및 첨부된 청구범위에서 사용된 일부 용어 및 어구의 의미가 아래에 제공된다. 달리 명시되지 않거나 문맥에서 암시하지 않는 한, 하기 용어 및 어구는 아래 제공된 의미를 포함한다. 본 정의는 특정 실시형태를 설명하는 데 도움을 주기위해 제공되며, 본 기술의 범위는 청구범위에 의해서만 제한되기 때문에 청구된 기술을 제한하려는 의도는 아니다. 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 해당 기술이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 해당 기술분야에서의 용어 사용량(usage)과 본 명세서에 제공된 정의 사이에 명백한 불일치가 있는 경우, 본 명세서에 제공된 정의가 우선한다.

본 명세서에 사용된, 용어 "치료하다", "치료", "치료하는" 또는 "개선"은 치료적 치료를 지칭하며, 여기서 목적은 천식 또는 알레르기성 질환과 관련된 상태의 진행 또는 중증도를 역전, 완화, 개선, 억제, 지연 또는 중단시키는 것이다. 용어 "치료하는"은 천식 또는 알레르기성 질환(예를 들어, 기도 염증)의 적어도 하나의 유해한 영향 또는 증상을 감소 또는 완화시키는 것을 포함한다. 하나 이상의 증상 또는 임상 마커가 감소되는 경우, 치료는 일반적으로 "효과적"이다. 달리, 질병의 진행이 감소하거나 중단되면 치료는 "효과적"이다. 즉, "치료"는 증상 또는 마커의 개선뿐만 아니라, 치료의 부재시 예상될 수 있는 것과 비교하여 증상의 진행 또는 악화의 중단, 또는 적어도 지연시키는 것을 포함한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 검출가능 여부에 관계없이, 하나 이상의 증상(들)의 경감, 질병 정도의 감소, 질병의 안정화된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 진행의 둔화 또는 지연, 질병 상태의 개선 또는 완화, 차도(부분적이든 전체적이든) 및/또는 사망률 감소를 포함한다. 질병의 "치료"라는 용어는 또한 질병의 증상 또는 부작용 경감(경감 치료 포함)를 제공하는 것을 포함한다.

본 명세서에 사용된 "예방하는" 또는 "예방"은 질병 상태 또는 장애(예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환)가 (예를 들어, Nocth4를 억제하는 작용제 또는 본 명세서에 기재된 조성물의 투여 등) 방법론의 작용으로 인해 발생되지 않는 임의의 방법론을 지칭한다. 일 양상에서, 예방은 또한 질병이, 치료되지 않은 대조군에서 발생하는 정도로 확립되지 않음을 의미할 수 있음이 이해된다. 예를 들어, 치료되지 않은 대조군에 비해 질병 빈도의 확립에서 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 또는 100% 감소가 있을 수 있다. 따라서, 질병의 예방은 치료되지 않은 대상체(예를 들어, 본 명세서에 기재된 것과 같은 미생물 컨소시엄을 포함하는 조성물로 치료되지 않은 대상체)에 비해, 대상체가 질병에 걸릴 가능성의 감소를 포함한다.

본 명세서에 사용된 용어 "투여하는"은 대상체로의 작용제의 적어도 부분적 전달을 초래하는 방법 또는 경로에 의해 본 명세서에 개시된 것과 같은 치료제(예를 들어, Notch4를 억제하는 작용제) 또는 약제학적 조성물을 대상체에 배치하는 것을 지칭한다. 본 명세서에 개시된 것과 같은 작용제를 포함하는 약제학적 조성물은 대상체에서 효과적인 치료를 초래하는 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다.

본 명세서에 사용된 "대상체"는 인간 또는 동물을 의미한다. 일반적으로 동물은 영장류, 설치류, 가축 또는 게임 동물과 같은 척추 동물이다. 영장류는, 예를 들어, 침팬지, 사이노몰구스 원숭이, 거미 원숭이 및 마카르, 예를 들어, 붉은털 원숭이를 포함한다. 설치류는, 예를 들어, 마우스, 래트, 우드 척, 흰 족제비, 토끼 및 햄스터를 포함한다. 애완 및 게임 동물은, 예를 들어 소, 말, 돼지, 사슴, 들소, 버팔로, 고양이 종, 예를 들어, 애완 고양이, 개 종, 예를 들어, 개, 여우, 늑대, 조류 종, 예를 들어, 닭, 에뮤, 타조, 및 어류, 예를 들어, 송어, 메기 및 연어를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 포유 동물, 예를 들어, 영장류, 예를 들어, 인간이다. 용어 "개체", "환자"및 "대상체"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

바람직하게는, 대상체는 포유 동물이다. 포유 동물은 인간, 비인간 영장류, 마우스, 래트, 개, 고양이, 말 또는 소일 수 있지만, 이들 예로만 제한되지 않는다. 인간 이외의 포유류는, 질환, 예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환의 동물 모델을 나타내는 대상체로서 유리하게 사용될 수 있다. 대상체는 남성 또는 여성일 수 있다. 대상체는 어린이(예를 들어, 18세 미만), 또는 성인(예를 들어, 18세 초과)일 수 있다.

대상체는 치료가 필요한 질환 또는 장애(예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환) 또는 이러한 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 합병증에 걸려 있거나 걸린 것으로 이전에 진단되거나 확인된 대상체일 수 있고, 그리고 선택적으로, 질병 또는 장애, 또는 이 질병 또는 장애와 관련된 하나 이상의 합병증에 대한 치료를 이미 받은 대상체일 수 있다. 대안적으로, 대상체는 또한 그러한 질환 또는 장애(예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환) 또는 관련 합병증에 걸린 것으로 이전에 진단되지 않은 대상체일 수 있다. 예를 들어, 대상체는 질환 또는 장애 또는 이 질환 또는 장애와 관련된 하나 이상의 합병증에 대한 하나 이상의 위험 인자를 나타내는 대상체 또는 위험 인자를 나타내지 않는 대상체일 수 있다.

본 명세서에 사용된 "작용제"는, 예를 들어, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현을 억제하거나, 폴리펩티드 또는 폴리 뉴클레오티드에 결합하여, 자극을 부분적으로 또는 전체적으로 차단하거나, 활성화를 감소, 억제, 지연시키거나, 이의 활성을 비활성화, 둔감화, 또는 하향 조절하는 분자, 단백질, 펩티드, 항체 또는 핵산을 지칭한다. Notch4를 억제하는 작용제는, 예를 들어, 폴리펩티드의 발현, 예를 들어, 이의 번역, 번역 후 가공, 안정성, 분해, 또는 핵 또는 세포질 국소화, 또는 폴리뉴클레오타이드의 전사, 전사 후 가공, 안정성, 또는 분해를 억제하거나, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오타이드에 결합하여, 자극, DNA 결합, 전사 인자 활성 또는 효소 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단하거나, 활성화를 감소, 억제, 지연시키거나, 이의 활성을 비활성화, 둔감화, 또는 하향 조절한다. 작용제는 직접 또는 간접적으로 작용할 수 있다.

본 명세에 사용된 용어 "작용제"는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 소분자, 핵산, 폴리펩티드, 펩티드, 약물, 이온 등과 같은 임의의 화합물 또는 물질을 지칭한다. "작용제"는 임의의 화학 물질, 실체(entity) 또는 모이어티일 수 있으며, 합성 및 자연-발생 단백질성 및 비단백질성 실체를 제한없이 포함한다. 일부 실시형태에서, 작용제는 핵산, 핵산 유사체, 단백질, 항체, 펩티드, 앱타머, 핵산의 올리고머, 아미노산, 또는 탄수화물이며, 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNA자임, 당단백질, siRNA, 지질단백질, 앱타머, 및 이들의 변형 및 조합 등을 제한없이 포함한다. 특정 실시형태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족, 또는 헤테로사이클일 모이어티를 포함하며, 마크로라이드(macrolides), 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 이들의 유사체를 포함한다. 화합물은 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지된 것일 수 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리에서 선택될 수 있다.

작용제는 유기금속 분자, 무기 분자, 유전 서열 등을 포함할 수 있는, 하나 이상의 화학적 부류, 예를 들어, 유기 분자로부터의 분자일 수 있다. 작용제는 또한 하나 이상의 단백질, 키메라 단백질(예를 들어, 관련된 또는 상이한 분자의 기능적으로 중요한 영역의 도메인 스위칭 또는 상동성 재조합), 합성 단백질 또는 치환, 결실, 삽입 및 기타 변이체를 포함하는 기타 단백질 변이체로부터의 융합 단백질일 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어 "소분자"는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 펩티드, 펩티드모방체, 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 유사체, 압타머, 뉴클레오티드, 뉴클레오티드 유사체, 약 10,000 그램/몰 미만인 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물(예를 들어, 이종유기 및 유기금속 화합물 포함), 약 5,000 그램/몰 미만인 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 1,000 그램/몰 미만인 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 약 500 그램/몰 미만인 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르, 및 기타 약제학적으로 허용가능한 형태를 포함할 수 있는 화학적 작용제를 지칭한다.

본 명세서에 사용된 용어 "RNAi"는 간섭 RNA 또는 RNA 간섭을 지칭한다. RNAi는, 예를 들어, mRNA 번역을 억제하거나, mRNA 분해를 초래하는 mRNA의 결합 및 가공을 억제하는 분자에 의한 특정 mRNA의 파괴에 의한 선택적 전사 후 유전자 침묵의 수단을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "RNAi"는 siRNA, shRNA, 내인성 마이크로RNA 및 인공 마이크로RNA를 포함하나, 이에 제한되지 않는 임의의 유형의 간섭 RNA를 지칭한다. 예를 들어, RNA의 다운스트림 가공 메커니즘에 관계없이 이전에 siRNA로 확인된 서열을 포함한다(즉, siRNA가 mRNA의 절단을 초래하는 특정 생체내(in vivo) 가공 방법을 가지고 있다고 여겨지지만, 이러한 서열은 본 명세서에 기재된 측접(flanking) 서열의 맥락에서 벡터 내에 통합될 수 있다).

본 명세서에 기재된 방법 및 조성물은 Notch4의 수준 및/또는 활성이 억제되는 것을 필요로 한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "Notch4"로도 알려진, 신경성 유전자좌 Notch 동족체 4는 타입 I 막관통(transmembrane) 단백질이며, 다중 표피 성장 인자 유사(EGF) 반복체로 이루어진 세포외 도메인, 및 여러 다른 도메인으로 구성된 세포내 도메인을 포함하는, 구조적 특징을 공유하는 패밀리의 구성원이다. Notch4 서열은 다수의 종, 예를 들어, 인간 Notch4(NCBI 유전자 ID: 4855) 폴리펩티드(예를 들어, NCBI 참조 서열 NP_004548.3) 및 mRNA(예를 들어, NCBI 참조 서열 NM_004557.3)에 대해 공지되어 있다. Notch4는 이들의 자연 발생 변이체, 분자, 및 대립 유전자를 포함하는, 인간 Notch4를 지칭할 수 있다. Notch4는, 예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 소, 말, 돼지 등의 포유류 Notch4를 지칭한다. 서열번호: 1의 핵산 서열은 Notch4를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

용어 "감소하다", "감소된", "감소"또는 "억제하다"는 모두 통계적으로 유의 한 양만큼 감소를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시형태에서, "감소하다", "감소된", "감소" 또는 "억제하다"는 전형적으로 적절한 대조군(예를 들어, 주어진 치료의 부재)과 비교하여 적어도 10% 감소를 의미하고, 예를 들어, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 그 이상의 감소를 포함할 수 있다. 본 명세서에 사용된, "감소" 또는 "억제"는 참조 수준과 비교하여 완전한 억제 또는 감소를 포함하지 않는다. "완전한 억제"는 적절한 대조군과 비교하여 100% 억제이다.

용어 "증가하다", "향상되다", 또는 "활성화하다"는 모두 재현가능한 통계적으로 유의한 양만큼 증가를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 일부 실시 양태에서, 용어 "증가하다", "향상되다" 또는 "활성화하다"는 참조 수준과 비교하여 적어도 10%의 증가, 예를 들어, 참조 수준과 비교하여 적어도 약 20%, 또는 적어도 약 30%, 또는 적어도 약 40%, 또는 적어도 약 50%, 또는 적어도 약 60%, 또는 적어도 약 70%, 또는 적어도 약 80%, 또는 적어도 약 90%, 또는 100%를 포함하는 최대의 증가 또는 10 내지 100% 사이의 임의의 증가, 또는 적절한 대조군과 비교하여 적어도 약 2배, 또는 적어도 약 3배, 또는 적어도 약 4배, 또는 적어도 약 5배 또는 적어도 약 10배 증가, 20배 증가, 30배 증가, 40배 증가, 50배 증가, 6배 증가, 75배 증가, 100배 증가 등, 또는 2배와 10배 이상 사이에서의 임의의 증가를 의미할 수 있다. 마커의 맥락에서 "증가하다"는 그러한 수준에서의 재현가능한 통계적으로 유의한 증가이다.

본 명세서에 사용된, "참조 수준"은 정상, 달리 영향을 받지 않는 세포 집단 또는 조직(예를 들어, 건강한 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 또는 이전 시점에 대상체로부터 얻은 생물학적 샘플, 예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단받기 전에 환자로부터 얻은 생물학적 샘플, 또는 본 명세서에 개시된 작용제와 접촉하지 않은 생물학적 샘플)을 의미한다.

본 명세서에 사용된, "적절한 대조군"은 비치료된, 달리 동일한 세포 또는 집단(예를 들어, 비-대조 세포와 비교하여, 본 명세서에 기재된 작용제를 투여받지 않았거나, 본 명세서에 기재된 작용제의 서브셋만 투여받은 환자)를 의미한다.

용어 "통계적으로 유의한" 또는 "유의하게"는 통계적 유의성을 지칭하며 일반적으로 2 표준편차(2SD) 이상의 차이를 의미한다.

본 명세서에 사용된 용어 "포함하는" 또는 "포함하다"는, 방법 또는 조성물에 필수적이며, 필수적이든 그렇지 않든, 특정되지 않은 요소의 포함에 대해 개방되어 있는, 조성물, 방법, 및 이의 각각의 성분(들)과 관련하여 사용된다.

단수 용어 "a", "an" 및 "the"는, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, 복수 지칭대상(referents)을 포함한다. 유사하게, "또는"이라는 단어는, 문맥에서 달리 명시하지 않는 한, "및(and)"을 포함하도록 의도된다. 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 재료를 본 개시의 실시 또는 시험에 사용할 수 있지만, 적합한 방법 및 재료가 아래에 기재되어 있다. 약어 "e.g."는 라틴어 exempli gratia에서 유래한 것으로 본 명세서에서 비제한적인 예를 나타내기 위해 사용된다. 따라서, 약어 "e.g."는 "예를 들어(for example)"라는 용어와 동의어이다.

본원은 컬러로 작도된 적어도 하나의 도면을 포함하고 있다. 컬러 도면이 있는 본 특허 출원 공개공보의 사본은 요청 및 필요한 비용 지불시 특허청에서 제공할 것이다.
도 1A-1G는 AM이 나노 입자를 차별적으로 흡수(uptake)하고 UFP에 반응하여 Jag1을 높게 발현하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 1A 및 도 1B. OVA+UFP-유도된 알레르기 기도 염증을 겪게 된 마우스에서의 상이한 폐 세포 집단에 의한 형광 나노 입자의 흡수에 대한 유세포 분석. 도 1C, 폐 대식세포(AM 및 IM), 수지상 세포(DC) 및 호중구(Neu) 중의 나노 입자 분포를 제시하는 막대 그래프. 도 1D 및 도 1E, Il4ra^R576 또는 Il4ra^R576Lyz2^CreAhr^△/△ 마우스에서 정제하고, PBS 또는 UFP(10 ㎍/㎖)를 처리한 폐 APC에서, RT-PCR로 정량화된, Jag1 전사체의 상대적 배수 변화(도 1D), 및 Jag1 발현의 유세포 분석기 분석(도 1E). 1F 및 1G, 도 1, D 및 F에 기재된 것과 같이, l4ra^R576 또는 Il4ra^R576Lyz2^CreJag1^△/△ 마우스에서 정제하고, PBS 또는 UFP를 처리한 폐 APC에서, Jag1 전사체의 상대적 배수 변화(도 1D), 및 Jag1 발현(도 1E). 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 3마리 마우스/그룹. *p <.05; **p <.01; ***p <.001, ***p <.0001, 사후 테스트 분석(패널 도 1C, 도 1D 및 도 1F) 또는 스튜던트의 쌍을 이루지 않은 양측 t-검정(패널 도 1F, CD11c⁺ DC 그룹 비교)을 이용한 일원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 2A-2B는 AM이 Jag1-의존적 방식으로 알레르겐 특이적 CD4 ⁺ T 세포에 의한 Th 세포 사이토카인 생산의 UFP-의존적 상향조절을 지지함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 2A, UFP(10 ㎍/㎖)의 존재하에 OVA_323-339 펩티드로 펄싱한 l4ra ^R576또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스에서 분리한 FACS-정제된 AM과 공동-배양된 무경험(naive) Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/-T 세포에 의한 IL-4, IL-13, IL-17 및 IFN-γ 사이토카인 생산에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면. 사이토카인 발현을 검문된(gated) CD4⁺Foxp3^- T 세포에서 분석했다. 도 2B, 샴(sham) 처치(PBS), 또는 단독 또는 UFP 존재 하에, OVA_323-339 펩타이드로 펄싱한 AM과 공동-배양시 각각의 사이토카인을 발현하는 CD4⁺Foxp3^- T 세포의 빈도. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P <.05, **P <.01, ***P <.001 및 ****P <.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 3A-3J는 UFP가 Jag1-의존적 방식으로 Th2/17 세포 유사 표현형에 대한 AM-의존성 iTreg 세포 분화를 왜곡하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 3A, UFP의 존재하에 OVA_323-339 펩티드로 펄싱한 l4ra ^R576또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리된 FACS-정제된 AM과 무경험 Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/-T 세포의 공동-배양시 CD4⁺Foxp3⁺ iTreg 세포의 빈도 및 이들의 IL-4, IL-13, IL-17 및 IFN-γ의 발현에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면. 도 3B, 샴 처치(PBS), 또는 단독 또는 UFP 존재 하에 OVA_323-339 펩타이드를 펄싱한, 각각의 사이토카인을 발현하는 Foxp3⁺ iTreg 세포 및 이들의 하위그룹의 빈도. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. **P <.01, ***P <.001 및 ****P <.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA).
도 4A-4O는 Jag 1의 골수 계통-특이적 결실이 알레르기성 기도 염증의 UFP-유발된 악화에 대한 보호를 제공함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 4A, PBS, OVA 또는 OVA + UFP 그룹(200X 배율)에서 Il4ra ^R576또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리된 폐의 PAS-염색된 절편을 나타내는 도면. 도 4B, 도 4A에 기재된 마우스 그룹으로부터 분리된 폐 조직의 염증 점수. 도 4C-4G, 도 4A에 기재된 마우스 그룹의 혈청에서의, 메타콜린에 대한 기도 과민반응(도 4C), BAL 유체 중의 호산구(도 4D) 및 T 세포(도 4E)의 절대 수, 총(도 4F) 및 OVA-특이적(도 4G) 수준. 4H-4K, 도 4A에 기재된 마우스 그룹에서, IL-4(도 4, H), IL13(도 4, I), IL-17(도 3, J) 및 IFN-γ(도 4K)를 분비하는 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 절대 수. 4L-4O, 도 4A에 기재된 마우스 그룹에서, IL-4(도 4L), IL13(도 4M), IL-17(도 4N) 및 IFN-γ(도 3O)을 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 5A-5O는 Jag1-충분 AM이 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스에서 UFP-매개된 알레르기 기도 염증을 구제함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 5A, 샴 처치(PBS), 또는 단독 또는 UFP와 함께(OVA+UFP) OVA_323-339 펩타이드를 로딩한 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 AM을 기관지내로(intra-tracheally) 보충한 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스의 폐 조직의 PAS-염색된 절편을 나타내는 도면. 도 5B, 도 5A에 기재된 마우스의 폐 조직의 염증 점수. C-G, 도 5A에 기재된 마우스의 혈청 중의, 기도 과민 반응(도 5C), BAL 유체 중의 호산구(도 5D) 및 T 세포(도 5E)의 수, 총(도 5F) 및 OVA-특이적(도 5G) 수준. 5H-5K, 도 5A에 기재된 마우스의 BAL 유체 중의, IL-4(도 5H), IL13(도 5I), IL-17(도 5J), 및 IFN-γ(도 5K)를 분비하는 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 수. 5L-5O, 도 5A에 기재된 마우스의 BAL 유체 중의, IL-4(도 5L), IL13(도 5M), IL-17(도 5N), 및 IFN-γ(도 5O)를 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 수. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 7-12마리 마우스/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 본페로니(Bonferroni) 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함. n.s.: 유의하지 않음.
도 6A-6B는 AM이 Notch4 의존적 방식으로 알레르겐 특이적 CD4 ⁺ T 세포에 의한 Th 세포 사이토카인 생산의 UFP-의존적 상향조절을 지원함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 6A, UFP(10 ㎍/㎖)의 존재 하에 OVA_323-339 펩타이드를 펄싱한 Il4ra ^R576또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 FACS 정제된 AM과 함께 공동-배양된 무경험 Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/-T 세포에 의한 IL-4, IL-13 및 IL-17 사이토카인 생산에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면. 공동-배양물을, 나타낸 것과 같이, 아이소타입 대조군(Iso) Ab 또는 항-Notch4 mAb로 처리했고, 사이토카인 분석을 검문된 CD4⁺ Foxp3^- T 세포에 대해 수행했다. 도 6B, 샴 처치(PBS), 또는 OVA^323-339 펩티드를 단독으로 또는 UFP(10 ㎍/㎖)와 조합하여 펄싱한 AM과의 공동-배양시 각각의 사이토카인을 발현하는 T 세포의 빈도. 항-Notch4 mAb 또는 아이소타입 대조군 Ab를 지시 된대로 첨가했다. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P <.05, **P <.01, ***P <.001 및 ****P <.0001, 사후 테스트 분석을 사용한 이원 분산분석(ANOVA).
도 7A-7P는 UFP가 Notch4-의존적 방식으로 알레르기성 기도 염증을 증대시킨다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 7A, 아이소타입 대조군(Iso) Ab 또는 항-Notch4 mAb의 존재하에 단독으로 또는 UFP와 함께 OVA로 감작시키고 공격한 Il4ra ^R576 마우스에서 분리한 폐 조직의 PAS 염색을 나타내는 도면. 도 7B, 도 7, A에 기재된 마우스 그룹의 폐 조직에서의 염증 점수. 7C-7H, 도 7A에 기재된 마우스 그룹의 혈청에서의 메타콜린에 대한 반응의 기도 과민 반응(도 7C), BAL 유체 중의 호산구(도 7D), T 세포(도 7E) 및 호중구(그림 7F)의 절대 수, 총(도 7G) 및 OVA-특이적(도 7H) 수준. 7I-7L, 도 7A에 기재된 마우스 그룹에서 IL-4(도 7I), IL13(도 7J), IL-17(도 7K) 및 IFN-γ(도 7L)을 분비하는 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 절대 수. 7M-7P, 도 7A에 기재된 마우스 그룹에서 IL-4(도 7L), IL13(도 7M), IL-17(도 7N) 및 IFN-γ(도 7O)를 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수. 결과는 2회의 독립적 인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 8A-8G는 샴(PBS), OVA 또는 OVA + UFP-유도된 알레르기성 기도 염증을 겪게 된 마우스의 상이한 폐 세포 하위집단에서의 형광 나노비드("플루오레스브라이트(Fluoresbrite) YG")의 배치를 보여주는 데이터를 제공한다. 마우스를 OVA로 감작시킨 다음 PBS(샴 처치), OVA 또는 OVA + UFP로 공격했다. 형광 나노비드를 모든 공격 그룹에서 비강내 점적주입(instillation)으로 도입했다. 도 8A 및 8B, 알레르기성 기도 염증을 겪게 된 마우스에서, CD45⁺ 폐 세포 집단(도 E1, A)에 의한, 그리고 마커 F4/80 및 CD11c(도 E1, A)에 이어 CD11b 및 CD11c(도 E1, B)에 의해 구분된 폐 대식세포 집단 내에서의 형광 나노입자 흡수에 대한 유세포 분석기 분석. 도 8C-8G, 표시된 마커와 각 검문에 의해 순차적으로 구분된, CD45⁺F4/80^- 세포 분획에서의 나노비드 분포. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 3마리 마우스/그룹/실험.
도 9A-9D는 플루오레스브라이트 YG 나노비드가 AM에서 Jag1 발현을 유도하지 않거나 마우스에서 알레르기성 기도 염증에 영향을 미치지 않음을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 9A, 24 시간 동안 시험관내 배양하고 PBS(샴 처치), 플루오레스브라이트 YG 나노비드 또는 UFP(각각, 10㎍/㎖)로 처치한, 세포-분류된 AM에서의 Jag1 발현에 대한 유세포 분석기 분석. 도 9B-9D, 알레르기성 기도 염증의 OVA 모델에서 형광 나노비드 "플루오레스브라이트 YG"의 배치 및 효과. 마우스를 OVA로 감작시킨 다음 PBS(샴 처치) 또는 OVA로 공격했다. 플루오레스브라이트 YG 나노비드를 별도의 OVA-감작 및 공격 그룹에서 비강내 주입으로 도입했다. 도 9B, 알레르기성 기도 염증을 겪은 마우스에서, CD45⁺ 폐 세포 집단에 의한, 그리고 마커 F4/80 및 CD11c(이어서 CD11b 및 CD11c)에 의해 구분된 폐 대식세포 집단에 의한 플루로레스브라이트 YG 나노비드의 흡수에 대한 유세포 분석기 분석. 도 9C, 9D, 각 마우스 그룹의 기도 과민 반응(RI) 및 폐 호산구 및 림프구 계수. N = 5마리 마우스/그룹.
도 10A-10C는 OVA+UFP-유도된 알레르기성 기도 염증을 겪은 마우스로부터의 형광 나노 입자-흡수 폐 대식세포의 특성화를 보여주는 데이터를 제공한다. 도 10A 및 10B, CD45⁺F4/80⁺CD11b^IntCD11c^Hi AM 세포(도 E2, A) 및 CD45⁺F4/80⁺CD11b^HiCD11c^Int IM 세포(도 9B)를, 나타낸 것과 같이, 마커 CD64, CD38, Egr2 및 MHC 클래스 II I-A^d에 대해 염색했다. 결과는 2회의 독립적인 실험을 대표하며, N = 3마리/그룹/실험을 나타낸다. 도 10C, 10 ㎍/㎖의 UFP로 48 시간 동안 시험관 내에서 처치한, 세포-분류된 AM에 의한 IL-6, IL-10, IL-12 p40 서브유닛, TNFα 및 CCL17의 생산. N = 5개 독립 배양물/사이토카인 분석. p<**** <0.0001, 스튜던트 양측 t 검정에 의함.
도 11A-11B는 다른 비-염증 조건 하(알레르기 감작 없음) 비강내 주입 후 마우스의 상이한 폐 세포 하위집단에서의 형광 마이크로입자의 배치를 보여주는 데이터를 제공한다. 도 11A, CD45⁺ 폐 세포 집단에 의한, 그리고 마커 F4/80 및 CD11c에 이어서 CD11b 및 CD11c에 의해 구분된, 폐 대식세포 집단에 의한 형광 마이크로 입자의 흡수에 대한 유세포 분석기 분석. 도 11B, 표시된 마커와 각 검문에 의해 순차적으로 구분된, CD45⁺F4/80^- 세포 분획에서 마이크로입자의 흡수에 대한 유세포 분석기 분석. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 3마리 마우스/그룹/실험.
도 12A-12B는 UFP가 BM-유래 대식세포에서 Jag1 발현을 상향조절하는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 12A, Il4ra ^R576 또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Ahr1 ^△/△ 마우스로부터 준비되고 PBS, UFP(10 ㎍/㎖), 6-FICZ(300 nM) 또는 CB(10 ㎍/㎖)로 시험관내(in vitro) 처리한 BM 유래 대식세포에서 Jag1 발현의 유세포 분석기 분석. 도 12B, PBS 또는 OVA로 감작시키고 OVA 또는 OVA+UFP로 공격한 Il4ra ^R576 또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Ahr1 ^△/△ 마우스의 폐의 AM, IM 및 DC에서의 Jag1 발현의 유세포 분석기 분석.
도 13A-13D는 AM이 Jag1-의존적 방식으로 알레르겐 특이적 CD4 ⁺ T 세포에 의한 Th 세포 사이토카인 생산의 UFP 의존적 상향조절을 지원함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 13A-13D, 샴-펄싱(PBS), 또는 OVA_323-339 펩티드를 단독으로(OVA) 또는 UFP의 존재하에 펄싱한 Il4ra ^R5766또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스에서 분리한 FACS-정제된 AM과 함께 공동-배양된 무경험 Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/- T 세포에 의한 IL-4(도 12A), IL-13(도 12B), IL-17(도 12C) 및 IFN-γ(도 12D) 사이토카인 생산에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면.
도 14A-14M은 Jag1의 골수 계통-특이적 결실이 DM에 의해 유도된 알레르기성 기도 염증의 UFP에 의한 악화에 대한 보호를 제공함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 14A, PBS, DM 또는 DM+UFP 그룹에서 Il4ra ^R5766또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스에서 분리한 폐의 과요오드산-스키프(PAS)-염색된 절편을 나타내는 도면. 도 14B, 도 E6, A에 기재된 마우스 그룹으로부터 분리한 폐 조직에서의 염증 점수. 도 14C-14E, 도 13A에 기재된 마우스 그룹에서 BAL 유체 중의 호산구(도 E6, C) 및 T 세포(도 E6, D)의 절대 수 및 혈청 총 IgE 농도(도 E6, E). 도 14F-14I, 도 13A에 기재된 마우스 그룹에서 IL-4(도 13F), IL13(도 13G), IL-17(도 13H) 및 IFN-γ(도 13I)을 분비하는 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 절대 수. 도 14J-14M, 도 13A 패널에 기재된 마우스 그룹에서 IL-4(도 13J), IL13(도 13K), IL-17(도 13L) 및 IFN-γ(도 13M)을 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 15A-15N은 Ahr 의 골수 계통-특이적 결실이 알레르기성 기도 염증의 UFP 유발 악화에 대한 보호를 제공함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 15A, PBS, OVA 또는 OVA+UFP 그룹에서 Il4ra ^R576 또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Ahr1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 폐의 과요오드산-스키프(PAS)-염색 절편을 나타내는 도면. 도 15B, 도 14A에 기재된 마우스 그룹으로부터 분리한 폐 조직에서의 염증 점수. 도 15C-15F, 도 14A에 기재된 마우스 그룹에서 BAL 유체 중의 호산구(도 14C) 및 T 세포(도 14D)의 절대 수 및 혈청 총(도 14E) 및 OVA-특이적(도 14F) IgE 농도. 도 15G-15J, 도 14A에 기재된 마우스 그룹에서 IL-4(도 14G), IL13(도 14H), IL-17(도 14I) 및 IFN-γ(도 14J)을 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수. 도 15K-15N, 도 14A 패널에 기재된 마우스 그룹에서, IL-4(도 14K), IL13(도 14L), IL-17(도 14M) 및 IFN-γ (도 14K)를 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. * p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 16A-16F는 Jag 1의 CD11c ^Cre -매개 결실이 DM에 의해 유도된 알레르기성 기도 염증의 UFP에 의한 악화에 대해 보호하지 못함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 16A, PBS, OVA 또는 OVA+UFP 그룹에서 Il4ra ^R576 또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Ahr1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 폐의 과요오드산-스키프(PAS)-염색 절편을 나타내는 도면. 도 16B, 도 15A에 기재된 마우스 그룹으로부터 분리한 폐 조직에서의 염증 점수. 도 16C-16F, 도 15A에 기재된 마우스 그룹에서 BAL 유체 중의 호산구(도 15C) 및 T 세포(도 15D)의 절대 수 및 혈청 총 및 OVA-특이적 IgE 농도(도 15E 및 15F). 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. * p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 테스트 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 17A-17L은 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Ahr1 ^△/△ 마우스에서 jag1-충분한 IM 및 DC가 UFP-매개된 알레르기성 기도 염증을 구제하지 못함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 17A-17F, IM 전달; 도 17G-17L, DC 전달. 메타콜린에 대한 반응으로의 기도 과민반응(도 16A 및 16G), 호산구의 절대 수(도 16B 및 16H), OVA-특이적 혈청 IgE 항체 농도(도 5C 및 5I), 폐 조직 CD4⁺ T 세포(도 5D 및 5J), IL13 및 IL-17을 분비하는 폐 CD4⁺Foxp3^- T 세포의 절대 수(도 5E 및 5K), IL13 및 IL-17을 분비하는 폐 Foxp3⁺CD4⁺ Treg 세포의 절대 수(도 16F 및 16L). N = 4마리 마우스/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 본페로니 사후 검정 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 18은 알레르기성 기도 염증에서 CD4 ⁺ T 세포에 대한 Notch 수용체 발현의 유세포 분석기 분석을 보여주는 데이터를 제공한다. 왼쪽 패널: PBS(샴) 또는 OVA로 감작시킨 마우스의 폐의 CD4⁺ T 세포 상의 Notch1-4 염색에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면. 오른쪽 패널: 각각의 Notch 수용체를 발현하는 CD4⁺ T 세포의 빈도. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. n = 4 마우스 / 그룹. *** P <.001 및 **** P <.0001, 사후 검정 분석을 이용한 일원 분산분석(ANOVA).
도 19A-19D는 OVA _323-339 +UFP-처치 AM에 의해 유도된 알레르겐-특이적 CD4 ⁺ Foxp3 ^- T 세포에 의한 Th 세포 사이토카인 생산의 상향조절을 중화하는 항 -Notch1-4 mAb 처치 효과를 보여주는 데이터를 제공한다. 도 19A-19D, 나타낸 것과 같이, 샴-펄스(PBS), 또는 OVA_323-339 펩타이드를 단독으로(OVA) 또는 UFP의 존재 하에(OVA+UFP) 펄싱한 l4ra ^R576또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 FACS-정제된 AM과 함께 공동-배양된 무경험 Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/-T 세포에 의한 IL-4(도 16A), IL-13(도 16B), IL-17(도 16C) 및 IFN-γ(도 16D) 사이토카인 생산의 분포를 나타내는 막대 그래프. 대조군 또는 항-Notch Ab를, 나타낸 것과 같이, 첨가했다. 결과는 2회의 독립적인 실험으로부터 유래된 6개의 복제실험(replicates)의 평균 + S.E.M을 나타낸다. ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 일원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 20A-20B는 알레르겐+UFP-펄싱한 AM과의 공동-배양시에 유도된 알레르겐-특이적 CD4+Foxp3+ Treg 세포에 의한 Th 세포 사이토카인 생산의 상향조절을 중화하는 항-Notch 4 mAb 처리 효과를 보여주는 데이터를 제공한다. 도 20A, 무경험 Il4ra ^R576CD4⁺DO11.10⁺Rag2^-/-T 세포와 OVA_323-339 및 UFP(10 ㎍/㎖)를 펄스하고 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^△/△ 마우스로부터 분리한 FACS-정제된 AM의 공동-배양시 유도된 CD4⁺Foxp3⁺ Treg 세포에 의한 IL-4, IL-13 및 IL-17 사이토카인 생산에 대한 유세포 분석기 분석을 나타내는 도면. 공동-배양은 나타낸 것과 같이 아이소타입 대조군 Ab(Iso Ab) 또는 항-Notch4 mAb로 처치했고, 사이토카인 분석을 검문된 CD4⁺Foxp3⁺ T 세포에 대해 수행했다. 도 20B, 샴 처치(PBS), 또는 OVA_323-339 펩티드를 단독으로 또는 UFP(10 ㎍/㎖)와 조합하여 펄싱한 AM과 공동-배양시 각각의 사이토카인을 발현하는 Treg 세포의 빈도. 항-Notch4 mAb 또는 아이소타입 대조군 Ab를 나타낸 것과 같이 첨가했다. 결과는 3회의 독립적인 실험을 나타낸다. *P <.05, **P <.01, ***P <.001 및 ****P <.0001, 사후 검정 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA).
도 21A-21C는 항-Notch 4 mAb 중화 처치에 의해 알레르겐+UFP로 자극된 T 세포에서의 Notch 표적 유전자 발현의 억제를 보여주는 데이터를 제공한다. DO11.10⁺ T 세포를 샴 처치(PBS + 대조군 Ab; 흰색 막대), 또는 대조군 Ab(검은 색 막대) 또는 항-Notch4 mAb(회색 막대)의 존재 하에 OVA_323-339펩타이드+UFP로 펄싱한 AM과 공동-배양한 다음, 실시간 PCR로 각 표적 유전자의 전사체의 발현에 대해 분석했다. 도 21A, Hes1 발현. 도 21B, Hey1 발현. 도 21C, Nrarp 발현 N = 4개 배양물/그룹. * <0.05, *** <0.001, 사후 검정 분석을 이용한 일원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 22A-22H는 Treg 세포에서 Notch 신호전달의 중단이 알레르기성 기도 염증에 대해 보호함을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 22A. Foxp3 ^GFPCre(대조군) 마우스 대비 표시된 Notch 성분의 Treg 세포-특이적 결실이 있는 마우스의 폐 절편의 PAS 염색. 도 22B. PBS/OVA 또는 OVA/OVA로 면역화/공격한 표시된 마우스 계통(strains)에서의 AHR. 22C. 총 및 OVA-특이적 IgE. 도 22D. 폐 조직 호산구 및 호중구. 22E-22H: 각 마우스 그룹의 폐 조직에서의 Foxp3⁺ Treg 세포(도 22E), IL-4⁺ 및 IL-13⁺(도 22F), IL-17⁺(도 22G) 및 IFN-γ⁺CD4⁺ T 세포의 빈도. N = 3회 실험에서 파생된 6-12개 복제실험/그룹. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 23은 Treg 세포에서 Notch 신호전달의 무능화가 알레르기성 기도 염증의 UFP-유발된 악화로부터 보호한다는 것을 보여주는 데이터를 제공한다. 표시된 마우스 그룹의 AHR은, 명시한 것과 같이 PBS-OVA, OVA-OVA 또는 OVA-OVA+UFP로 감작화시되고 공격받았다. 2회의 독립적인 실험으로부터의 5-6 마리의 마우스를 대표하는 결과. *p <0.05, ** <0.01, *** <0.001, 이원 분산분석(ANOVA) 및 본페로니 사후 검정 분석에 의함.
도 24A-24C는 Notch4 발현이 알레르기성 기도 염증에서 알레르기 항원 및 UFP에 의해 폐 Treg 세포에서 급격히 상향조절됨을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 24A. 폐 CD4⁺ Tconv 및 Treg 세포에서 Notch1-4 mRNA 발현. CD4⁺Foxp3⁺(YFP⁺) 및 CD4⁺Foxp3^-(YFP^-) 세포를, PBS(샴) 또는 OVA로 감작한 다음, 3일 동안 매일 1회 단독으로 또는 UFP(10 ㎍/d x3)의 비강내 점적주입과 함께 1%의 비내분무된(nebulized) OVA로 공격한 Foxp3 ^YFPCre 마우스의 폐에서 세포 분류에 의해 분리했다. Notch1/4 mRNA 전사체의 발현을 실시간 PCR로 분석하고 β 액틴 전사체에 대해 정규화했다. 도 24B. 샴-(PBS), OVA- 또는 OVA+UFP-유도된 알레르기성 기도 염증을 겪게 된 마우스에서 폐 Treg 및 Tconv 세포(각각, 상단 및 하단 열)에 대한 Notch4 발현의 유세포 분석기 분석을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 24C. 도 24B에 나타낸 상이한 세포 그룹에서 Notch4 발현을 나타내는 그래프. ***P <0.001 및 ****P <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 일원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 25A-25H는 Notch4 의 Treg 세포-특이적 결실이 알레르겐 및 UFP-유도된 알레르기성 기도 염증에 대한 보호를 제공함을 보여주는 데이터를 제공한다. 25A, PBS, OVA 또는 OVA+UFP 그룹(200X 배율)에서 Foxp3 ^YFPCre 또는 Foxp3 ^YFPCre Notch4 ^△/△ 마우스에서 분리한 폐의 PAS-염색 절편을 나타내는 도면. 도 25B, 패널 A에 기재된 마우스 그룹으로부터 분리된 폐 조직의 염증 점수. 25C-25G, 메타콜린에 대한 반응으로의 기도 과민반응(도 25C), 호산구 절대 수(도 25D), 혈청 OVA-특이적 IgE 수준(도 25E), 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포의 절대 수(도 25F), IL-13(도 25G) 및 IL-17(도 25H)을 분비하는 폐 Foxp3^-CD4⁺ T 세포. 결과는 2회의 독립적인 실험을 나타낸다. N = 5마리 마우스/그룹. p ** <0.01, *** <0.001, **** <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 이원 분산분석(ANOVA)에 의함.
도 26A-26D는 천식 대상체의 순환 T 조절 세포에서 Notch4 발현이 증가하는 것이 질병 중증도의 바이오 마커임을 보여주는 데이터를 제공한다. 도 26A-26B. 대조군 피험자와 경도 지속성(mild persistent), 중등도 지속성 및 고도 천식이 있는 대상체에서의 순환 CD4+Foxp3+ T 조절 세포 및 CD4+Foxp3- T 이펙터 세포에서 Notch4 발현. 도 26C-26D. 각 대상체 그룹의 CD4+Foxp3+ T 조절 세포 및 CD4+Foxp3- T 이펙터 세포에서의 Notch4 발현 세포의 세포 빈도 및 Notch4 발현의 평균 형광 강도(MFI). N = 6-10명의 대상체/그룹. *p <0.05, **p <0.01, ***p <0.001, ****p <0.0001, 사후 검정 분석을 이용한 일원 분산분석(ANOVA)에 의함.

본 명세서에 기재된 본 발명은 Notch4 신호전달 경로의 활성화가 세포를 천식을 야기하는 T 헬퍼(Th) 세포로 분화하도록 유도하기에 충분하였다는 발견에 부분적으로 기초한다. 폐-유래된 항원 제시 세포와 알레르겐-특이적 T 세포, 및 알레르기성 기도 염증의 마우스 모델을 이용한 시험관내 세포 배양 분석을 사용하여 폐 폐포 대식세포(AM)가 기도 염증을 촉진하는 데 있어 UFP의 주요 세포 표적인 것을 밝혀냈다.

AM에서 Jag1(Jagged 1) 발현의 아릴 탄화수소 수용체(AhR)-의존적 유도는 UFP에 의한 알레르기성 기도 염증의 개시에 필요하고 충분했다. UFP는 Jag1 및 Notch4-의존적 방식으로 알레르겐-특이적 T 세포의 Th2 및 Th17 세포 분화를 촉진했다. 본 명세서에 제시된 데이터는 항-Notch 4 항체로의 마우스의 처치가 Th 세포의 분화를 방지함으로써 UFP에 의해 유도된 알레르기성 기도 염증의 악화를 폐기시켰음을 구체적으로 보여준다. 항-Notch4 항체가 천식 및 알레르기성 질환과 같은, 환경 자극물질(예를 들어, 초미세입자)에 대한 노출로 인한 질병을 치료 및/또는 예방하는 데 유용할 것으로 본 명세서에서 구체적으로 고려된다.

추가로, 1) 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하고, 2) 천식 또는 알레르기성 질환의 효능을 측정하는 방법이 본 명세서에 개시되어 있다. 이들 방법은 Notch4 발현 및/또는 활성의 풍부함이 질병 또는 장애의 유병률(prevalence)과 일치한다는 발견에 부분적으로 기초한다. 다양한 방법에서 천식 또는 알레르기성 질환에 대한 지표로서 Notch4 발현 또는 활성의 사용이 본 명세서에서 구체적으로 고려된다.

Notch4

Notch 신호전달 경로는 물리적으로 인접한 세포 사이의 상호작용을 조절하는 진화적으로 보존된 세포간 신호전달 경로이다. Notch 신호전달은 여러 세포 운명 결정을 조절하며; 각 Notch 패밀리 구성원은 다양한 발달 과정에서 역할을 한다. 포유류에서, Notch 패밀리는 4개의 Notch 수용체(Notch1 내지 Notch4)와 5개의 리간드[델타-유사 리간드 1(DLL1), DLL3, DLL4, Jagged(Jag) 1 및 Jag2]로 구성된다. 인접한 세포에서 Jagged 또는 델타-유사 리간드에 결합하면, 두 개의 순차적인 단백질분해 이벤트가 Notch의 세포내 도메인(NICD)을 방출시켜 핵으로의 이의 전위를 가능케한다. NICD는 DNA 결합 인자 RBP-J를 전사 억제자에서 MAML1-MAML3 결합 1을 통해 전사 활성화자로 전환시킨다¹.

notch 단백질은 트랜스-골지 네트워크에서 절단된 다음, 이종이량체로서 세포 표면에 제시된다. 이 단백질은 막 결합 리간드에 대한 수용체로 기능하며, 혈관, 신장, 및 간 발달에 역할을 할 수 있다.

서열번호: 1은 Notch 4를 코딩하는 핵산 서열을 포함한다.

천식 또는 알레르기성 질환의 치료 또는 예방

본 발명의 일 양상은 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여함으로써 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법이다. 또 다른 양상은 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체를 확인하고, 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여함으로써 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 명세서에 사용된 "천식"은 폐기도의 염증, 가역성 기도 폐쇄, 기관지경련(bronchospasms), 천명음(wheezing), 기침, 가슴 압박감 및 숨가쁨을 특징으로하는 질환을 지칭한다. 천식은, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 대기 오염물질 및 알레르겐, 아스피린 및 베타 차단제에 대한 노출, 및 천식 가족력을 포함하는, 환경적 및 유전적 요인에 의해 야기되는 것으로 생각된다.

천식은 증상의 빈도, 증상의 중증도, 1초간 최대호기량(FEV1; forced expiratory volume in one second) 및 최고호기유속으로 분류된다. 천식은 약물에 대한 대상체의 반응(예를 들어, 아토피성 또는 비-아토피성)에 따라 추가로 분류 될 수 있으며, 여기서 아토피성은 제1 형 과민증을 일으키는 소인을 나타낸다.

다양한 실시형태에서, 천식은 알레르기성 천식(예를 들어, 알레르겐에 대한 노출에 의해 유발되는 것), 알레르기가 없는 천식(예를 들어, 감기, 독감, 또는 라이노바이러스와 같은, 상기도 감염에 의해 유발되는 것), 아스피린 악화 호흡기 질환(예를 들어, 아스피린 섭취에 의해 유발되는 것), 운동-유발된 천식, 기침 변이(예를 들어, 마른 잔기침(dry, hacking cough)을 특징으로 하는 것) 또는 직업성 천식(예를 들어, 대상체가 직업상 노출되는 자극에 의해 유발되는 것, 예를 들어, 소방관은, 이들의 직업을 수행하면서, 연기에 노출되어, 연기-흡입을 경험할 수 있음)이다. 숙련된 임상의는 표준 기술을 사용하여, 대상체가 걸려 있거나, 걸릴 위험(예를 들어, 소방관은 직업성 천식에 걸릴 위험이 있음)이 있는 천식 유형을 확인할 수 있다.

본 명세서에 사용된, "알레르기성 질환"은 환경에서 달리 무해한 물질에 대한 면역계 반응을 특징으로 하는 질환이다. 예를 들어, 알레르기성 질환이 있는 대상체가 일반적인 환경 물질에 노출되면, 대상체의 B 림프구가 해당 물질에 대한 특정 항체를 생성하여, 면역 반응을 초래한다. 예를 들어, 알레르기성 질환을 야기할 수 있는 예시적인 물질에는 먼지 진드기, 꽃가루(예를 들어, 식물, 나무, 꽃, 또는 풀에서 나오는 것), 동물 비듬(예를 들어, 가축 또는 농장 동물에서 나오는 것), 곰팡이, 음식(예를 들어, 나무 견과류, 땅콩, 조개류, 생선, 우유, 계란, 또는 밀) 및 라텍스를 포함한다. 한쪽 부모, 또는 양쪽 부모가 알레르기가 있는 아동은 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 높다. 알레르기성 질환의 특정 원인(예를 들어, 알레르겐이 무엇인지)은 일반적인 기술, 예를 들어, 피부 단자 검사 및 방사선 알레르기 흡착 검사를 사용하여 숙련된 임상의에 의해 확인될 수 있다.

일 실시형태에서, 알레르기성 질환은 알레르기성 비염, 부비동염, 중이염, 아토피성 피부염(예를 들어, 습진), 두드러기, 혈관부종 및 아나필락시스이다.

대상체는 숙련된 임상의에 의해, 예를 들어, 천식 또는 알레르기 반응을 지니는 것으로 확인될 수 있다. 천식 또는 알레르기성 질환에 걸려 있는 대상체를 확인하는 데 유용한 진단 테스트는 해당 기술 분야에 공지되어 있으며, 아래에 추가로 설명된다.

본 발명의 또 다른 양상은 천식 또는 알레르기성 질환이 발생할 위험이 있는 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여함으로써 천식 또는 알레르기성 질환을 예방하는 방법이다. 일 실시형태에서, 본 방법은 작용제를 투여하기 전에 천식 또는 알레르기 반응이 발생할 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함한다.

본 명세서에 사용된 "천식 위험이 있는" 대상체는 공지된 천식 촉발인자(예를 들어, 천식 발병을 초래할 수 있는 인자)와 접촉하거나 잠재적으로 접촉하는 대상체를 지칭한다. 예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환의 발병을 촉발할 수 있는 비제한적 인자에는 공기 중 물질(예를 들어, 꽃가루, 먼지 진드기, 곰팡이 포자, 애완동물 비듬 또는 바퀴벌레 폐기물 입자); 호흡기 감염, (예를 들어, 일반적인 감기); 신체 활동(예를 들어, 운동-유발된 천식을 촉발할 수 있음); 차가운 공기; 대기 오염물질 및 자극제(예를 들어, 연기 및 담배 연기); 특정 약물(예를 들어, 차단제, 아스피린, 이부프로펜(Advil, Motrin IB 등) 및 나프록센(Aleve)); 강한 감정 또는 스트레스; 아황산염 및 방부제 첨가 식품 및/또는 음료(예를 들어, 새우, 말린 과일, 가공 감자, 맥주 및 와인에서 발견됨); 및 위식도 역류 질환(GERD; gastroesophageal reflux disease)을 포함한다. 대상체는 또한 천식 또는 알레르기성 질환의 가족력이 있는 경우(예를 들어, 직계 가족 구성원이 천식 또는 알레르기성 질환을 앓은 적이 있는 경우), 천식 또는 알레르기성 질환의 위험이 있는 것으로 간주된다.

작용제

일 양상에서, Notch4를 억제하는 작용제는 천식 또는 알레르기성 질환에 걸리거나 걸릴 위험이 있는 대상체에게 투여된다. 일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 소분자, 항체 또는 항체 단편, 펩티드, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 게놈 편집 시스템, 또는 RNAi이다.

작용제는, 예를 들어, 투여시, 세포내 Notch4의 존재, 양, 활성 및/또는 수준을 억제하는 경우 Notch4 억제에 유효한 것으로 간주된다.

일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 것은 Nocth4-발현 Treg 세포의 질병-촉진 Th 세포로의 분화를 억제한다.

작용제는, 예를 들어, 세포에서 Notch4의 전사 또는 번역을 억제할 수 있다. 작용제는 세포에서 (예를 들어, 활성이 더 이상 생성되지 않거나 감소된 속도로 생성되도록) Notch4의 활성(예를 들어, Notch4의 발현)을 억제하거나 활성을 변경할 수 있다.

일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 프로그램된 세포 사멸, 예를 들어, Notch4를 발현하는 세포, 예를 들어, T reg 세포를 사멸시키는 것을 촉진한다. 작용제가 Notch4를 억제하는 데 효과적인지 결정하기 위해, 주어진 표적(예를 들어, Notch4)의 mRNA 및 단백질 수준을, 각각 RT-PCR 및 웨스턴 블롯팅을 사용하여 평가할 수 있다. Notch4의 활성을 검출하는 생물학적 분석(예를 들어, Notch 수용체 및 리간드의 결합을 측정하는 Notch 리포터)을 사용하여 프로그램된 세포 사멸이 발생했는지 여부를 평가할 수 있다. 달리, 세포 사멸 마커(예를 들어, Caspase)와 조합하여 Notch4에 특이적인 항체를 사용하는 면역형광 검출을 사용하여 작용제 투여 후 세포 사멸이 발생했는지 여부를 결정할 수 있다.

일 실시형태에서, 작용제는 적절한 대조군과 비교하여 Notch4의 수준 및/또는 활성을 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 100% 또는 그 이상 억제한다. 본 명세서에 사용된, "적절한 대조군"은 작용제 투여 전 Notch4의 수준 및/또는 활성, 또는 작용제와 접촉하지 않은 세포 집단에서 Notch4의 수준 및/또는 활성을 지칭한다.

작용제는 투여되는 형태로 직접적으로 기능을 발휘할 수 있다. 대안적으로, 작용제는 세포내로의 핵산 서열의 도입 및 Notch4의 핵산 및/또는 단백질 억제자의 생산을 초래하는 이의 전사와 같은, Notch4를 억제하는 어떤 것을 생산하도록 세포내적으로(intracellularly) 변형되거나 활용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 작용제는 합성 및 자연-생성 비단백질성 물질을 제한없이 포함하는, 임의의 화학 물질, 실체 또는 모이어티이다. 특정 실시형태에서, 작용제는 화학적 모이어티를 갖는 소분자이다. 예를 들어, 화학적 모이어티는 마크로리드, 렙토마이신 및 관련 천연 생성물 또는 이들의 유사체를 포함하는 비치환 또는 치환된 알킬, 방향족 또는 헤테로사이클일 모이어티를 포함한다. 작용제는 원하는 활성 및/또는 특성을 갖는 것으로 공지된 것일 수 있거나, 다양한 화합물의 라이브러리에서 확인될 수 있다.

다양한 실시형태에서, 작용제는 Notch4를 억제하는 소분자이다. 소분자를 스크리닝하는 방법은 해당 기술분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 원하는 표적(예를 들어, Notch4)이 주어지면, 병원성 CD4 세포의 세포 사멸을 유도하는 데, 효율적인 소분자를 확인하는 데 사용할 수 있다.

다양한 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 Notch4에 특이적인 항체 시약이다. 본 명세서에 사용된, 용어 "항체 시약"은 적어도 하나의 면역글로불린 가변 도메인 또는 면역글로불린 가변 도메인 서열을 포함하고 주어진 항원에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 의미한다. 항체 시약은 항체 또는 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 항체 시약은 단일 클론 항체 또는 단일 클론 항체의 항원-결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체는 중쇄(H) 가변 영역(본 명세서에서 VH로 약칭됨), 및 경쇄(L) 가변 영역(본 명세서에서 VL로 약칭됨)을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 항체는 2개의 중쇄(H) 가변 영역 및 2개의 경쇄(L) 가변 영역을 포함한다. 용어 "항체 시약"은 항체의 항원 결합 단편(예를 들어, 단일 사슬 항체, Fab 및 sFab 단편, F(ab')2, Fd 단편, Fv 단편, scFv, CDR 및 도메인 항체(dAb) 단편(예를 들어, 문헌[de Wildt et al., Eur J. Immunol. 1996; 26 (3): 629-39] 참고; 상기 문헌은 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함됨)뿐만 아니라, 완전한 항체를 포괄한다. 항체는 IgA, IgG, IgE, IgD, 또는 IgM(뿐만 아니라 이들의 서브타입 및 조합)의 구조적 특징을 가질 수 있다. 항체는 마우스, 토끼, 돼지, 래트 및 영장류(인간 및 비인간 영장류) 및 영장류화된 항체를 포함하는, 임의의 공급원에서 유래할 수 있다. 항체는 또한 미디바디, 나노바디, 인간화 항체, 키메라 항체 등을 포함한다.

일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 인간화 단일 클론 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 항체 시약이다. 본 명세서에 사용된, "인간화"은 인간에서 자연적으로 생성되는 항체 변이체와의 유사성이 증가되도록 단백질 서열이 변형된 비인간 종(예를 들어, 마우스, 래트, 양 등)으로부터의 항체를 지칭한다. 일 실시형태에서, 인간화 항체는 인간화 단일 클론 항체이다. 일 실시형태에서, 인간화 항체는 인간화 다클론 항체이다. 일 실시형태에서, 인간화 항체는 치료적 사용을 위한 것이다.

일 실시형태에서, 항체 또는 항체 시약은 Notch4를 코딩하는 아미노산 서열 (서열번호: 2)에 상응하는 아미노산 서열에 결합한다.

또 다른 실시형태에서, 항-Notch4 항체 또는 항체 시약은 서열번호: 2의 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합하거나; 또는 서열번호: 2의 서열에 대해 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 그 초과의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 일 실시형태에서, 항-Notch4 항체 또는 항체 시약은 서열번호: 2의 전체 서열을 포함하는 아미노산 서열에 결합한다. 또 다른 실시형태에서, 항체 또는 항체 시약은 서열번호: 2의 서열의 단편을 포함하는 아미노산 서열에 결합하고, 여기서 단편은 그의 표적, 예를 들어, Notch4에 결합하기에 충분하며, Nocth4-발현 Treg 세포의 질병-촉진 Th 세포로의 분화를 억제한다.

일 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드이다. 본 명세서에서 사용된, "안티센스 올리고뉴클레오티드"는 DNA 또는 mRNA 서열, 예컨대 마이크로RNA의 서열에 상보적인 합성된 핵산 서열을 지칭한다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 전형적으로 표적에 결합하고, 전사, 번역, 또는 스플라이싱 수준에서 발현을 중단시킴으로써 DNA 또는 RNA 표적의 발현을 차단하도록 설계된다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 세포 조건 하에서 유전자, 예를 들어, Notch4에 혼성화하도록 설계된 상보적 핵산 서열이다. 따라서, 표적에 충분히 상보적인, 즉 원하는 효과를 제공하기 위해 세포 환경의 맥락에서 충분히 양호하게 그리고 충분한 특이성으로 혼성화되는 올리고뉴클레오티드가 선택된다. 예를 들어, Notch4를 억제하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 인간 Notch4 유전자(예를 들어, 서열번호: 1)의 코딩 서열의 일부에 상보적인 적어도 5개, 적어도 10개, 적어도 15개, 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개, 또는 그 이상의 염기를 포함할 수 있다.

일 실시형태에서, Notch4는 징크 핑거 뉴클레아제, TALENS, 메가 뉴클레아 제, 및 CRISPR/Cas 시스템을 포함하나, 이에 제한되지 않는, 임의의 게놈 편집 시스템을 사용하여 세포의 게놈으로부터 고갈된다. 일 실시형태에서, 하나 이상의 가이드 RNA를 코딩하는 핵산을 세포의 게놈에 통합하는 데 사용되는 게놈 편집 시스템은 CRISPR/Cas 시스템이 아니며; 이것은 소량의 Cas 효소/단백질을 보유하는 세포에서 바람직하지 않은 세포 사멸을 방지할 수 있다. 또한 Cas 효소 또는 sgRNA는 각각 상이한 유도성 프로모터의 제어하에 발현되고, 이에 의해 각각의 일시적 발현이 이러한 간섭을 방지하도록 허용하는 것이 본 명세서에서 고려된다.

하나 이상의 sgRNA를 코딩하는 핵산 및 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산이 각각 투여될 필요가 있는 경우, 아데노바이러스 관련 벡터(AAV)의 사용이 구체적으로 고려된다. 게놈 편집/단편화 시스템의 두 구성요소(예를 들어, sgRNA, RNA-가이드된 엔도뉴클레아제)에 핵산을 동시에 전달하기 위한 다른 벡터는 렌티바이러스 벡터, 예컨대, 엡스타인 바, 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 및 B형 간염 바이러스(HBV)를 포함한다. RNA-가이드된 게놈 편집 시스템(예를 들어, sgRNA 및 엔도뉴클레아제)의 각 성분은 해당 기술분야에 공지된 바와 같이 또는 본 명세서에 기재된 바와 같이 별도의 벡터로 전달될 수 있다.

일 실시형태에서, 작용제는 RNA 억제에 의해 Notch4를 억제한다. 주어진 유전자의 발현 억제제는 억제성 핵산일 수 있다. 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 억제성 핵산은 억제성 RNA(iRNA)이다. RNAi는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.

iRNA는 siRNA, shRNA, 내인성 마이크로RNA(miRNA) 또는 인공 miRNA일 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 iRNA는 표적, 예를 들어, Notch4의 발현 및/또는 활성의 억제에 영향을 미친다. 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 작용제는 Notch4를 억제하는 siRNA이다. 임의의 양상의 일부 실시형태에서, 작용제는 Notch4를 억제하는 shRNA이다.

해당 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 설계 도구를 사용하여 Notch4를 표적화하기 위해 siRNA, shRNA, 또는 miRNA를 설계할 수 있을 것이다. siRNA, shRNA 또는 miRNA는 일반적으로 Dharmacon(Layfayette, CO) 또는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)와 같은 회사를 이용하여 제조된다.

임의의 양상의 일부 실시형태에서, iRNA는 dsRNA일 수 있다. dsRNA는 dsRNA가 사용될 조건 하에서 이중나선 구조를 형성하도록 혼성화하기에 충분히 상보적인 두개의 RNA 가닥을 포함한다. dsRNA의 한 가닥(안티센스 가닥)은 표적 서열에 대해, 실질적으로 상보적이고 일반적으로 완전히 상보적인 상보성 영역을 포함한다. 표적 서열은 표적의 발현 동안 형성된 mRNA의 서열로부터 유래될 수 있다. 다른 가닥(센스 가닥)은 안티센스 가닥에 상보적인 영역을 포함하여, 두 가닥이 적절한 조건에서 결합될 때 이중나선 구조를 형성하고 혼성화하도록 한다.

iRNA의 RNA는 안정성 또는 기타 유익한 특성을 향상시키기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. 본 발명에서 특징으로 하는 핵산은 문헌["Current protocols in nucleic acid chemistry," Beaucage, S.L. et al. (Edrs.), John Wiley & Sons, Inc., New York, NY, USA]에 기재되어 있는 것과 같은, 해당 기술분야에 잘 확립된 방법에 의해 합성되고/되거나 변형될 수 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참고로 포함된다.

일 실시형태에서, 작용제는 Notch4를 억제하는 miRNA이다. 마이크로RNA는 평균 길이가 22개 뉴클레오티드인 작은 비코딩(non-coding) RNA이다. 이들 분자는 일반적으로 3'-비번역(3'UTR) 영역에서, mRNA 분자 내의 상보적 서열에 결합함으로써 작용하여, 표적 mRNA 분해를 촉진하거나 mRNA 번역을 억제한다. 마이크로RNA와 mRNA 간의 상호작용은 불완전한 왓슨-크릭 염기 짝지음을 통해 mRNA에 대한 서열 특이적 결합을 유도하는 마이크로RNA의 6-8개 뉴클레오티드 영역인 "시드 서열(seed sequence)"로 알려진 것에 의해 매개된다. 900개 이상의 마이크로RNA가 포유류에서 발현되는 것으로 알려져 있다. 이들 중 다수는 이들의 시드 서열에 기초하여 패밀리로 그룹화될 수 있고, 그로 인해 유사한 마이크로RNA의 "클러스터"를 확인할 수 있다. miRNA는 세포에서, 예를 들어, 네이키드 DNA로 발현될 수 있다. miRNA는 세포에서 발현되는 핵산에 의해, 예를 들어, 네이키드 DNA로 코딩되거나 벡터 내에 포함된 핵산에 의해 코딩될 수 있다.

작용제는, 예컨대, RNAi 분자(예를 들어, siRNA 또는 miRNA)와 함께, 표적 유전자(예를 들어, Notch4)의 유전자 침묵을 초래할 수 있다. 이것은 표적에 대한 세포내 mRNA 수준에서의 감소를 작용제의 부재시 세포에서 발견되는 mRNA 수준의 적어도 약 5%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%까지 초래한다. 하나의 바람직한 실시형태에서, mRNA 수준은 적어도 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95%, 약 99%, 약 100%까지 감소된다. 해당 기술분야의 통상의 기술자는, 예를 들어, siRNA, shRNA, 또는 miRNA를 세포 내로 형질감염시키고 웨스턴-블랏팅을 통해 세포 내부에서 발견되는 유전자(예를 들어, Notch4)의 수준을 검출함으로써, 예를 들어, Notch4가 하향조절을 위한 siRNA, shRNA, 또는 miRNA의 유효한 표적인지 여부를 쉽게 평가할 수 있을 것이다.

작용제는 벡터에 포함되고, 그리하여 이를 추가로 포함할 수 있다. 외인성 유전자를 표적 포유류 세포로 전달하는 데 유용한 많은 이러한 벡터가 이용가능하다. 벡터는, 에피솜, 예를 들어, 플라스미드, 사이토메갈로바이러스, 아데노바이러스 등과 같은 바이러스-유래 벡터일 수 있거나, 또는 상동성 재조합 또는 무작위 통합, 예를 들어, MMLV, HIV-1, ALV 등과 같은 레트로바이러스-유래 벡터를 통해 표적 세포 게놈에 통합될 수 있다. 일부 실시형태에서, 레트로바이러스 및 적절한 패키징 세포주의 조합이 또한 사용될 수 있으며, 여기서 캡시드 단백질은 표적 세포를 감염시키기 위해 기능할 것이다. 일반적으로, 세포와 바이러스는 배양 배지에서 적어도 약 24시간 동안 인큐베이션될 것이다. 그런 다음, 세포는 일부 응용에서 짧은 간격, 예를 들어, 24 내지 73 시간, 또는 적어도 2주 동안 배양 배지에서 성장하도록 허용되고, 분석 전에, 5주 이상 동안 성장하도록 허용될 수 있다. 흔히 사용되는 레트로바이러스 벡터는 "결함성"인데, 즉, 생산적인 감염에 필요한 바이러스 단백질을 생산할 수 없다. 벡터의 복제에는 패키징 세포주에서의 성장이 필요하다.

본 명세서에 사용된 용어 "벡터"는 숙주 세포로의 운반 또는 상이한 숙주 세포 사이의 전달을 위해 설계된 핵산 구축물을 지칭한다. 본 명세서에 사용된, 벡터는 바이러스성 또는 비바이러스성일 수 있다. 용어 "벡터"는 적절한 대조군 요소와 연관될 때 복제할 수 있고 유전자 서열을 세포로 전달할 수 있는 임의의 유전 요소를 포함한다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 인공 염색체, 바이러스, 비리온 등을 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "발현 벡터"는 벡터 상의 전사 조절 서열에 연결된 벡터 내에 포함된 핵산 서열로부터 RNA 또는 폴리펩티드(예를 들어, Notch4 억제제)의 발현을 유도하는 벡터를 지칭한다. 발현된 서열은 종종 세포에 대해 이종성일 수 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 발현 벡터는 추가 요소를 포함할 수 있으며, 예를 들어, 발현 벡터는 2가지 복제 시스템을 가질 수 있으며, 그래서 2종의 유기체, 예를 들어, 발현을 위한 인간 세포 및 클로닝 및 증폭을 위한 원핵 숙주에서 유지될 수 있다. 용어 "발현"은 RNA와 단백질의 생산, 적절한 경우 단백질의 분비에 관여하는 세포 과정을 지칭하며, 해당되는 경우, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 전사, 전사체 가공, 번역 및 단백질 접힘, 변형 및 가공을 포함한다. "발현 생성물"은 유전자로부터 전사된 RNA, 및 유전자로부터 전사된 mRNA의 번역에 의해 수득된 폴리펩티드를 포함한다. 용어 "유전자"는 적절한 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 때 시험관내(in vitro) 또는 생체내에서(in vivo) RNA로 전사(DNA)되는 핵산 서열을 의미한다. 유전자는, 예를 들어, 코딩 영역 앞뒤의 영역, 예를 들어, 5' 비번역(5' UTR) 또는 "리더" 서열 및 3' UTR 또는 "트레일러" 서열 뿐만 아니라, 개별 코딩 세그먼트(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함하거나 포함하지 않을 수 있다.

통합성 벡터는 이들이 운반하는 RNA/DNA를 숙주 세포 염색체에 영구적으로 통합시킨다. 비통합성 벡터는 에피솜으로 남아 있으며, 이는 그 안에 포함된 핵산이 숙주 세포 염색체로 통합되지 않음을 의미한다. 통합성 벡터의 예는 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 하이브리드 아데노바이러스 벡터, 및 단순 포진 바이러스 벡터를 포함한다.

비통합성 벡터의 일예는 비통합성 바이러스 벡터이다. 비통합성 바이러스 벡터는 이들의 게놈을 숙주 DNA에 통합시키지 않기 때문에, 통합성 레트로바이러스로 인한 위험을 제거한다. 일 예로는 엡스타인 바 oriP/핵 항원-1("EBNA1") 벡터가 있으며, 이것은 제한된 자가-복제가 가능하고 포유류 세포에서 기능하는 것으로 알려져 있다. 엡스타인-바 바이러스, oriP 및 EBNA1로부터의 2가지 요소를 포함하기 때문에, 바이러스 레플리콘 영역 oriP에 대한 EBNA1 단백질의 결합은 포유류 세포에서 플라스미드를 비교적 장기적으로 에피솜 존재로 유지시킨다. oriP/EBNA1 벡터의 이 특별한 특징은 통합-자유(integration-free) iPSC 생성에 이상적이다. 또 다른 비통합성 바이러스 벡터로는 아데노바이러스 벡터와 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터가 있다.

또 다른 비통합성 바이러스 벡터로는 RNA 센다이 바이러스 벡터가 있으며, 이것은 감염된 세포의 핵으로 진입없이 단백질을 생산할 수 있다. F-결핍 센다이 바이러스 벡터는 몇 번의 계대 동안 감염된 세포의 세포질에 남아 있지만, 수회 계대(예를 들어, 10회 계대) 후에는 빠르게 희석되어 완전히 소실된다.

비통합성 벡터의 또 다른 예로는 미니서클 벡터가 있다. 미니서클 벡터는 플라스미드 백본이 방출되어 발현될 진핵 프로모터 및 cDNA(들)만 남기는 원형화된 벡터이다.

본 명세서에 사용된, 용어 "바이러스 벡터"는 바이러스 기원의 하나 이상의 요소를 포함하고 바이러스 벡터 입자로 패키징될 수 있는 능력을 갖는 핵산 벡터 구축물을 지칭한다. 비필수 바이러스 유전자 대신 본 명세서에 기재된 것과 같은 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유할 수 있다. 벡터 및/또는 입자는 시험관내 또는 생체내에서 핵산을 세포로 전달하기 위한 목적으로 사용될 수 있다. 다양한 형태의 바이러스 벡터가 해당 기술분야에 공지되어 있다.

천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체 확인

본 명세서에 기재된 본 발명의 일 양상은 (a) 대상체로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 샘플에서 Notch4의 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 대상체는 참조 수준과 비교하여 Notch 수준이 증가하면 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 것인 단계; 및 (c) Notch4를 억제하는 작용제를 위험이 있는 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, Notch4의 수준은 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 적어도 100배, 또는 그 이상, 또는참조 수준과 비교하여 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 적어도 99% 또는 그 이상 증가된다. 참조 수준은 건강한 대상체, 예를 들어, 천식 또는 알레르기 반응의 위험이 없는 대상체로부터 얻은 샘플의 Notch4 수준일 수 있다.

일 실시형태에서, Notch4의 수준은 시험관내, 또는 생체외에서(ex vivo) 측정된다. 샘플의 Notch4 수준은 표준 기술, 예를 들어, FACS 분석 또는 면역 형광을 사용하여 측정할 수 있다. Notch4의 단백질 및 mRNA 수준은, 본 명세서에 기재된 것과 같이, 각각 웨스턴 블롯팅 또는 PCR 기반 분석을 사용하여 평가할 수 있다.

일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 말초 혈액 샘플, 객담 샘플, 폐 조직 샘플, 폐 생검 샘플, 또는 기관지 세척 샘플이다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 폐포 대식세포를 포함하는 임의의 샘플이다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 이전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단받은 적이 있는 대상체로부터 채취된다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 이전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단되고 치료받은 적이 있는 대상체로부터 채취된다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단받은 적이 없는 대상체로부터 채취된다. 대상체로부터 샘플을 수집하는 방법은 해당 기술분야에 알려져 있으며 숙련자에 의해 수행될 수 있다.

치료 효능 측정

본 발명의 일 양상은 (a) 치료제 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제1 수준을 결정하는 단계; (b) 치료제 투여 후 환자에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제2 수준을 결정하는 단계; 및 (c) Notch4 발현 또는 활성의 상기 제1 및 제2 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 치료제는 Notch4 발현 또는 활성의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준보다 낮으면 유효한 것으로 간주되고, 여기서 (b)에서 투여되는 치료제는 Notch4 발현의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준과 동일하거나 더 높으면 유효하지 않은 것인 단계,를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체의 치료에서 치료제의 효능을 결정하는 방법을 제공한다.

일 실시형태에서, Notch4 발현 또는 활성의 제2 수준이 Notch4 발현 또는 활성의 제1 수준과 비교하여 적어도 1%, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 99%, 또는 100% 감소하는 경우 치료제는 유효한 것으로 간주된다.

일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 혈액 샘플, 말초 혈액 샘플, 객담 샘플, 폐 조직 샘플, 폐 생검 샘플, 또는 기관지 세척 샘플이다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 폐포 대식세포를 포함하는 임의의 샘플이다. 대상체로부터 샘플을 수집하는 방법은 해당 기술분야에 알려져 있으며 숙련자에 의해 수행될 수 있다.

일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단받은 적이 있지만 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하기 위한 치료제를 투여받은 적이 없는 대상체로부터 채취된다. 일 실시형태에서, 생물학적 샘플은 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단받은 적이 있으며, 천식 또는 알레르기성 질환을 치료하기 위한 치료제를 투여받은 적인 있는 대상체로부터 채취된다.

일 실시형태에서, 치료제는 Notch4를 억제하는 작용제이다. 다른 실시형태에서, 치료제는 항-천식 또는 항-알레르기성 질환 치료제이다. 예시적인 항-천식 및 항-알레르기성 질환 치료제는 아래에서 추가로 설명된다.

투여

일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은 본 명세서에 기재된 Notch4를 억제하는 작용제를 투여하는 것을 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환에 걸려 있거나 걸린 것으로 진단된 대상체를 치료하는 것에 관한 것이다. 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체는 상태를 진단하는 현재의 방법을 사용하여 의사에 의해 확인될 수 있다. 이러한 질환을 특징짓고 진단을 돕는, 천식 또는 알레르기성 질환의 증상 및/또는 합병증은 해당 기술분야에 잘 알려져 있으며, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 지속적인 기침, 호흡 곤란, 쌕쌕거림(wheezing), 숨가쁨 및 피부 발진을 포함한다. 예를 들어, 천식의 진단에 도움이 될 수 있는 검사에는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 메타콜린 공격, 산화질소 검사, 알레르기 검사, 및 객담 호산구를 포함한다. 예를 들어, 천식의 가족력이 또한 대상체가 상기 상태에 걸릴 가능성이 있는지 여부를 결정하는 데 또는 천식 또는 알레르기성 질환을 진단하는 데 도움이 될 것이다.

본 명세서에 기재된 작용제(예를 들어, Notch4를 억제하는 작용제)는 천식 또는 알레르기성 질환에 걸려 있거나 걸린 것으로 진단된 대상체에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 방법은, 예를 들어, 천식의 적어도 하나의 증상을 완화시키기 위해 유효량의 작용제를 대상체에게 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에 사용된, "천식 또는 알레르기성 질환의 적어도 하나의 증상을 완화"는, 예를 들어, 천식(예를 들어, 지속적인 기침, 호흡 곤란, 쌕쌕거림, 숨가쁨 및 피부 발진)과 관련된 임의의 상태 또는 증상을 개선한다. 동등한 처리되지 않은 대조군과 비교하여, 그러한 감소는 임의의 표준 기술로 측정했을 때 적어도 5%, 10%, 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 95%, 99% 또는 그 이상이다. 본 명세서에 기재된 작용제를 대상체에게 투여하기위한 다양한 수단은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어있다. 일 실시형태에서, 작용제는 전신 또는 국소적으로(예를 들어, 폐에) 투여된다. 일 실시형태에서, 작용제는 정맥내로 투여된다. 일 실시형태에서, 작용제는 연속적으로, 일정 간격으로, 또는 산발적으로 투여된다. 작용제의 투여 경로는 전달되는 작용제의 유형(예를 들어, 항체, 소분자, RNAi)에 대해 최적화될 것이며, 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다.

일 실시형태에서, 작용제 또는 작용제를 포함하는 조성물은 흡입을 통해 투여된다.

본 명세서에 사용된, 용어 "유효량"은 예를 들어, 천식의 적어도 하나의 증상을 완화시키는 데 필요한 천식 또는 알레르기성 질환을 앓고 있거나 앓고 있는 것으로 진단된 대상체에게 투여되는 작용제(예를 들어, Notch4를 억제하는 작용제)의 양을 지칭한다. 따라서 용어 "치료적 유효량"은, 예를 들어, 전형적인 대상체에게 투여 될 때 특정 항-천식 효과를 제공하기에 충분한 작용제의 양을 지칭한다. 다양한 맥락에서, 본 명세서에 사용된 유효량은 또한, 예를 들어, 천식 증상의 발달을 지연시키고, 예를 들어, 천식 증상의 진행을 변경(예를 들어, 폐 기능 상실, 부적절한 호흡, 또는 쌕쌕거림의 진행을 늦추는 것), 예를 들어, 의 증상을 역전(예를 들어, 폐 기능 또는 호흡을 개선하는 것)시키기에 충분한 작용제의 양을 포함할 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 특정하는 것은 일반적으로 실용적이지 않다. 그러나, 임의의 주어진 경우에 대해, 적절한 "유효량"은 통상적인 실험만을 사용하여 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다.

일 실시형태에서, 작용제는 연속적으로 (예를 들어, 일정 기간에 걸쳐 일정한 수준으로) 투여된다. 작용제의 연속 투여는, 예를 들어, 표피 패치, 연속 방출 제형(formulations) 또는 체내 주입기(on-body injectors)에 의해 달성될 수 있다.

유효량, 독성, 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 제약 절차에 의해 평가될 수 있다. 투여량(dosage)은 채택되는 투여량 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 독성 효과와 치료 효과 사이의 용량비(dose ratio)는 치료 지수이며 LD₅₀/ED₅₀ 비로 나타낼 수 있다. 큰 치료 지수를 나타내는 조성물 및 방법이 바람직하다. 치료적 유효 용량은 세포 배양 분석으로부터 초기에 추정할 수 있다. 또한, 용량은 세포 배양에서 결정된대로 IC₅₀(즉, 증상의 최대 절반 억제를 달성하는, 작용제의 농도)을 포함하는 순환 혈장 농도 범위를 달성하기 위해 동물 모델에서, 또는 적절한 동물 모델에서 제형화될 수 있다. 예를 들어, 고성능 액체 크로마토그래피로 혈장내 수준을 측정할 수 있다. 임의의 특정 투여량의 효과는, 적합한 생체검사(bioassay), 예를 들어, 다른 것들 중에서, 신경학적 기능을 측정하거나 또는 혈액 작업에 의해 모니터링될 수 있다. 투여량은 의사가 결정하고 필요에 따라 치료의 관찰된 효과에 맞게 조정할 수 있다.

투여량

본 명세서에서 사용된 용어 "단위 투여량 형태"는 적합한 1회 투여를 위한 투여량을 지칭한다. 예시의 일환으로, 단위 투여량 형태는 전달 장치, 예를 들어, 주사기 또는 정맥내 드립 백에 할당된 치료제의 양일 수 있다. 일 실시형태에서, 단위 투여량 형태는 단일 투여로 투여된다. 다른 실시형태에서, 하나 이상의 단위 투여량 형태가 동시에 투여될 수 있다.

본 명세서에 기재된 작용제의 투여량은 의사에 의해 결정될 수 있고, 필요에 따라 관찰된 치료의 효과에 맞추어 조정될 수 있다. 치료 기간 및 빈도와 관련하여, 숙련된 임상의는 치료가 치료적 이점을 제공하는 시기를 결정하기 위해, 그리고 추가 세포(cells)를 투여할지, 치료를 중단할지, 치료를 재개할지, 또는 치료 섭생에 대한 다른 변경을 수행할지 여부를 결정하기 위해 대상체를 모니터링하는 것이 일반적이다. 투여량은 사이토카인 방출 증후군과 같은 부작용을 일으킬 정도로 커서는 안된다. 일반적으로, 투여량은 환자의 연령, 상태 및 성별에 따라 달라질 것이며 통상의 기술자에 의해 결정될 수 있다. 투여량은 합병증이 발생할 경우 개별 의사가 조정할 수도 있다.

조합 요법

일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작용제는 단일 요법으로 사용된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 작용제는 천식 또는 알레르기성 질환에 대한 다른 공지된 작용제 및 요법과 조합하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 사용된, "조합하여" 투여하는 것은 2가지(또는 그 이상의) 상이한 치료가 대상체가 장애에 따른 고통을 겪는 과정 동안 대상체에게 전달됨을 의미하며, 예를 들어, 2가지 이상의 치료는 대상체가 장애 또는 질병(천식 또는 알레르기성 질환)이 있는 것으로 진단된 후에 그리고 장애가 치료 또는 제거되거나 또는 다른 이유로 치료가 중단되기 전까지 전달된다. 일부 실시형태에서, 한 치료의 전달은 두번째의 전달이 시작될 때 여전히 발생하므로, 투여 측면에서 중복이 있다. 이는 본 명세서에서 "동시(simultaneous)" 또는 "동시 전달(concurrent delivery)"이라고도 지칭된다. 다른 실시형태에서, 한 치료의 전달은 다른 치료의 전달이 시작되기 전에 종료된다. 두 경우의 일부 실시형태에서, 치료는 조합된 투여로 인해 더 효과적이다. 예를 들어, 더 적은 두 번째 치료로 동등한 효과가 나타나거나, 두 번째 치료가 첫번째 치료의 부재 시에 투여된 경우에 나타날 수 있는 것에 비해 더 큰 정도로 증상을 감소시키거나, 유사한 상황이 첫번째 치료로 나타나면, 예를 들어, 두번째 치료가 더 유효하다. 일부 실시형태에서, 전달은 증상, 또는 장애와 관련된 다른 파라미터의 감소가 다른 것의 부재 하에 전달되는 한 치료로 관찰될 수 있는 것을 초과하도록 이루어진다. 두 치료의 효과는 부분적으로 상가이거나, 완전히 상가이거나, 상가를 초과할 수 있다. 전달은 전달된 첫 번째 치료의 효과가 두 번째가 전달 될 때 여전히 검출가능하도록 할 수 있다. 본 명세서에 기재된 작용제 및 적어도 하나의 추가 요법은 동시에, 동일하거나 별개의 조성물로, 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 순차 투여의 경우, 본 명세서에 기재된 작용제가 먼저 투여될 수 있고, 추가 작용제가 두 번째로 투여될 수 있거나, 투여 순서가 역전될 수 있다. 작용제 및/또는 다른 치료제, 절차 또는 양식은 장애의 활동 기간 동안, 또는 질병의 완화 또는 덜 활동적인 기간 동안 투여될 수 있다. 작용제는 다른 치료 전에, 치료와 동시에, 치료 후, 또는 장애의 완화 동안 투여될 수 있다.

천식 치료에 사용되는 예시적인 치료제는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 흡입된 코르티코스테로이드(예를 들어, 플루티카손(Flonase, Flovent HFA), 부데소니드(Pulmicort Flexhaler, Rhinocort), 플루니솔리드(Aerospan HFA), 시클레소니드(Alvesco, Omnaris, Zetonna), 베클로메타손(Qnasl, Qvar), 모메타손(Asmanex) 및 류코트리엔 변형제(예를 들어, 몬테루카스트(Singulair), 자피르루카스트(zafirlukast)(Accolate) 및 질레톤(zileuton)(Zyflo)), 지속성 베타 효능제(예를 들어, 살메테롤(Serevent) 및 포모테롤)(Foradil, Perforomist)); 복합 흡입제(예를 들어, 플루티카손-살메테롤(Advair Diskus), 부데소니드-포모테롤(Symbicort) 및 포모테롤-모메타손(Dulera)); 테오필린(예를 들어, 테오필린(Theo-24, Elixophylline)); 속효성 베타 효능제(예를 들어, 알부테롤(ProAir HFA, Ventolin HFA, 기타) 및 레발부테롤(Xopenex)); 이프라트로피움(예를 들어, Atrovent) 및 경구 및 정맥 내 코르티코스테로이드를 포함한다.

알레르기성 질환을 치료하기 위해 사용되는 예시적인 치료제는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 항-염증 치료제(예를 들어, 코르티코스테로이드, 글루코코르티코이드 또는 미네랄코르티코이드); 항히스타민제(예를 들어, 브롬페니라민(Dimetane), 세티리진(Zyrtec), 클로르페니라민(Chlor-Trimeton), 클레마스틴(Tavist), 디펜히드라민(Benadryl), 펙소페나딘(Allegra) 또는 로라타딘(Alavert, Claritin)); 및 아드레날린을 포함한다.

조합하여 투여되는 경우, 작용제 및 추가 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두는 각 작용제가 별개로, 예를 들어, 단일요법(monotherapy)으로 사용되는 양 또는 투여량에 비해 더 많거나, 더 적거나 또는 동일한 양 또는 용량으로 투여될 수 있다. 특정 실시형태에서, 작용제, 추가 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 투여되는 양 또는 투여량은 별개로 사용되는 각 작용제의 양 또는 투여량에 비해 더 적다(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50%). 다른 실시형태에서, 원하는 효과(예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환의 치료)를 초래하는 작용제, 추가 작용제(예를 들어, 제2 또는 제3 작용제), 또는 모두의 양 또는 투여량은 동일한 치료적 효과를 달성하기 위해 별개로 요구되는 각 작용제의 양 또는 투여량에 비해 더 적다(예를 들어, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 또는 적어도 50% 더 적음).

비경구 투여량 형태

본 명세서에 기재된 작용제의 비경구 투여량 형태는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 피하, 정맥내(볼루스 주사 포함), 근육내 및 동맥내를 포함하는, 다양한 경로에 의해 대상체에게 투여될 수 있다. 비경구 투여량 형태의 투여는 일반적으로 오염 물질에 대한 환자의 자연적 방어를 우회하기 때문에, 비경구량 투여 형태는 바람직하게는 멸균되거나 환자에게 투여하기 전에 멸균될 수 있다. 비경구 투여량 형태의 예는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 주사용으로 준비된 용액, 주사를 위한 약제학적으로 허용가능한 비히클에 용해되거나 현탁될 준비가 된 건조 제품, 주사용으로 준비된 현탁액, 제어-방출 비경구 투여량 형태, 및 에멀젼을 포함한다.

본 개시 내용의 비경구 투여량 형태를 제공하기 위해 사용될 수 있는 적합한 비히클은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 잘 알려져 있다. 예는, 제한됨이 없이, 하기를 포함한다: 멸균 수; USP 등급 주사용수; 생리 식염수; 포도당 용액; 이로만 제한되는 것은 아니지만, 염화나트륨 주사, 링거 주사, 덱스트로스 주사, 덱스트로스 및 염화나트륨 주사, 및 젖산 링거 주사와 같은 수성 비히클; 이로만 제한되는 것은 아니지만, 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 및 프로필렌 글리콜과 같은 수혼화성 비히클; 및 이로만 제한되는 것은 아니지만, 옥수수 유, 면실유, 땅콩 유, 참기름, 에틸 올레에이트, 이소프로필 미리스테이트, 및 벤질 벤조에이트와 같은 비수성 비히클.

에어로졸 제형

Notch4를 억제하는 작용제를 포함하는 조성물은 에어로졸 형태로 또는 분무에 의해 대상체의 기도에 직접 투여될 수 있다. 에어로졸로 사용하기 위해, 용액 또는 현탁액 중의 Notch4를 억제하는 작용제는 적합한 추진제, 예를 들어, 프로판, 부탄, 또는 이소부탄과 같은 탄화수소 추진제와 통상적인 아주번트와 함께 가압된 에어로졸 용기에 패키징될 수 있다. Notch4를 억제하는 작용제는 네뷸라이저(nebulizer) 또는 아토마이저(atomizer)와 같은 비가압 형태로 투여될 수도 있다.

용어 "분무"는 액체를 미세 스프레이로 감소시키는 것을 포함하는 것으로 해당 기술분야에 잘 알려져있다. 바람직하게는, 그러한 분무에 의해 균일한 크기의 작은 액적이 제어된 방식으로 더 큰 액체 몸체로부터 생성된다. 따라서, 현재 알려져 있고 유통되는 다수의 분무기를 사용하는 것을 포함하는, 임의의 적절한 수단으로 분무를 수행할 수 있다. 예를 들어, 일리노이 주 닐스(Niles) 소재 Inhalation Plastic, Inc.에서 입수할 수 있는 AEROMIST 공압 네뷸라이저. 활성 성분이 네뷸라이저(들)를 통해, 함께 또는 개별적으로, 투여되도록 조정된 경우, 이들은, 단위 용량 또는 다중 용량 장치로서, 적당한 pH 또는 장성(tonicity)으로 조절되거나 조절되지 않은체, 비내분무되는 수성 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다.

잘 알려진 바와 같이, 비내분무 중에 압력을 가하기 위해 임의의 적합한 가스를 사용할 수 있으며, 현시점에서 바람직한 가스는 Notch4를 억제하는 작용제의 조절자(modulator)에 대해 화학적으로 불활성인 것들이다. 이로만 제한되는 것은 아니지만, 질소, 아르곤 또는 헬륨을 포함하는 예시적인 가스가 높은 이점을 위해 사용될 수 있다.

일부 실시형태에서, Notch4를 억제하는 작용제는 또한 건조 분말 형태로 기도에 직접 투여될 수 있다. 건조 분말로 사용하는 경우, 흡입기를 사용하여 GHK 트리 펩타이드를 투여할 수 있다. 예시적인 흡입기에는 정량 흡입기 및 건조 분말 흡입기가 포함된다.

정량 용량 흡입기 또는 "MDI"는 액화 추진제에 용해된 약제학적 조성물 또는 액화 추진제에 현탁된 미세화된 입자와 같은 제품으로 충진된 내압성 캐니스터 또는 용기이다. 사용될 수 있는 추진제는 클로로플루오로카본, 탄화수소 또는 하이드로플루오로알칸을 포함한다. 특히 바람직한 추진제는 P134a(테트라플루오로에탄) 및 P227(헵타플루오로 프로판)이며, 이들 각각은 단독으로 또는 조합하여 사용될 수 있다. 이들은 선택적으로 하나 이상의 다른 추진제 및/또는 하나 이상의 계면 활성제 및/또는 하나 이상의 다른 부형제, 예를 들어, 에탄올, 윤활제, 항산화제 및/또는 안정화제와 조합하여 사용된다. 정확한 투여량의 조성물이 환자에게 전달된다.

건조 분말 흡입기(즉, Turbuhaler(Astra AB))는 매우 작은 부피로 압축되는 약제학적 조성물의 건조 분말 입자를 생성하기 위해 압축 공기 공급원으로 작동할 수 있는 시스템이다.

흡입 요법용 건조 분말 에어로졸은 일반적으로 주로 <5㎛ 범위의 평균 직경으로 생산된다. 입자의 직경이 3μm를 초과함에 따라, 대식세포에 의한 식균 작용이 점점더 줄어 든다. 그러나 입자 크기를 증가시키는 것은 구강인두 또는 비강 영역내의 과도한 침착으로 인해 (표준 질량 밀도를 보유한) 입자의 기도 및 선봉(acini)으로의 진입 가능성을 최소화시키는 것으로 밝혀졌다.

적합한 분말 조성물은, 예시의 일환으로, 락토스, 또는 기관지내 투여에 허용가능한 다른 불활성 분말과 완전히 혼합된 Notch4를 억제하는 작용제의 분말 제조물을 포함한다. 분말 조성물은 에어로졸 디스펜서를 통해 투여되거나, 캡슐에 구멍을 뚫고 흡입에 적합한 정상 스트림으로 분말을 불어내는 장치로 환자에 의해 삽입될 수 있는 파손가능한 캡슐 내에 보관될 수 있다. 이 조성물은 추진제, 계면활성제 및 보조-용매를 포함할 수 있고, 적절한 계량 밸브에 의해 폐쇄되는 통상적 인 에어로졸 용기에 충전될 수 있다.

호흡기로 전달하기 위한 에어로졸은 해당 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 하기 문헌 참조: Adjei, A. and Garren, J. Pharm. Res., 1: 565-569 (1990); Zanen, P. and Lamm, J.-W. J. Int. J. Pharm., 114: 111-115 (1995); Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract," in Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990); Anderson et al., Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989)) and have potential for the systemic delivery of peptides and proteins as well (Patton and Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992)); Timsina et. al., Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995); and Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4:26-29 (1994); French, D. L., Edwards, D. A. and Niven, R. W., Aerosol Sci., 27: 769-783 (1996); Visser, J., Powder Technology 58: 1-10 (1989)); Rudt, S. and R. H. Muller, J. Controlled Release, 22: 263-272 (1992); Tabata, Y, and Y. Ikada, Biomed. Mater. Res., 22: 837-858 (1988); Wall, D. A., Drug Delivery, 2: 10 1-20 1995); Patton, J. and Platz, R., Adv. Drug Del. Rev., 8: 179-196 (1992); Bryon, P., Adv. Drug. Del. Rev., 5: 107-132 (1990); Patton, J. S., et al., Controlled Release, 28: 15 79-85 (1994); Damms, B. and Bains, W., Nature Biotechnology (1996); Niven, R. W., et al., Pharm. Res., 12(9); 1343-1349 (1995); and Kobayashi, S., et al., Pharm. Res., 13(1): 80-83 (1996)(이들 모두의 내용은 그 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다).

제어 및 지연 방출 투여량 형태

본 명세서에 기재된 양상의 일부 실시형태에서, 작용제는 제어- 또는 지연-방출 수단에 의해 대상체에게 투여된다. 이상적으로, 의료적 치료에서 최적으로 설계된 제어 방출 제제의 사용은 최소한의 시간 내에 상태를 치료하거나 제어하기 위해 사용되는 최소한의 약물 물질을 특징으로 한다. 제어-방출 제제의 장점은 다음을 포함한다: 1) 약물의 활성 연장; 2) 투여량 빈도 감소; 3) 환자 순응도 증가; 4) 더 적은 총 약물 사용; 5) 국소 또는 전신 부작용 감소; 6) 약물 축적 최소화; 7) 혈중 수준 요동 감소; 8) 치료 효능의 개선; 9) 약물 활성의 강화작용 또는 손실의 감소; 및 10) 질병 또는 상태의 제어 속도 개선. (Kim, Cherng-ju, Controlled Release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000). 제어 방출 제형은 화학식 I의 화합물의 작용 개시, 작용 지속 기간, 치료 윈도우 내의 혈장 수준, 및 최고 혈중 수준을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 제어 또는 연장 방출 투여량 형태 또는 제형을 사용하여 약물의 과소-투여(즉, 최소 치료 수준 미만으로의 투약)를 비롯한 약물 독성 수준 초과 둘 다로 인해 발생할 수 있는, 잠재적인 부작용 및 안전성 문제를 최소화하면서 작용제의 최대 효과(effectiveness)가 달성되는 것을 보장할 수 있다.

다양한 공지된 제어- 또는 연장-방출 투여량 형태, 제형 및 장치를 본 명세서에 기재된 임의의 작용제와 함께 사용을 위해 조정될 수 있다. 예로는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 미국 특허 제3,845,770호; 제3,916,899호; 제3,536,809호; 제3,598,123호; 제4,008,719호; 제5674,533호; 제5,059,595호; 제5,591,767호; 제5,120,548호; 제5,073,543호; 제5,639,476호; 제5,354,556호; 제5,733,566호; 및 제6,365,185호에 기재된 것들을 포함하며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참고로 포함된다. 이러한 투여량 형태는 다양한 비율로 원하는 방출 프로파일을 제공하기 위해, 예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로스, 기타 중합체 매트릭스, 겔, 투과성 막, 삼투 시스템(예컨대, OROS®(Alza Corporation, Mountain View, 미국 캘리포니아)), 다층 코팅, 마이크로 입자, 리포솜, 또는 마이크로스피어 또는 이들의 조합을 사용하여 하나 이상의 활성 성분의 지연 또는 제어 방출을 제공하는 데 사용될 수 있다. 추가로, 이온 교환 물질은 개시된 화합물의 고정(immobilized), 흡착된 염 형태를 제조하는 데 사용될 수 있으며, 따라서 약물의 제어된 전달에 영향을 미친다. 특정 음이온 교환기의 예는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, DUOLITE® A568 및 DUOLITE® AP143(immobilized)을 포함한다.

효능

예를 들어, 천식 또는 알레르기성 질환의 치료를 위한 본 명세서에 기재된 작용제의 효능은 숙련된 의사에 의해 결정될 수 있다. 그러나, 예를 들어, 천식의 징후 또는 증상 중 하나 이상이 유익한 방식으로 변경되거나, 다른 임상적으로 허용되는 증상이 개선되거나, 더 개선되는 경우, 또는 원하는 반응이, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 따른 치료 후 적어도 10% 유도되는 경우, 치료는, 본 명세서에서 사용된 용어와 같은, "유효한 치료"로 간주된다. 효능은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 치료되는 상태의 마커, 지표, 증상, 및/또는 발병률 또는 적절한 임의의 다른 측정 가능한 파라미터, 예를 들어, 기도 염증 감소, 폐 기능 증가, 정상적인 호흡 회복을 측정함으로써 평가될 수 있다. 효능은 또한 입원, 또는 의료 개입의 필요성(즉, 폐 기능 감소, 호흡과의 합병증, 천식 발작 빈도의 진행)에 의해 평가되는 것과 같이 개체가 악화되지 않는 것으로 측정될 수 있다. 이들 지표를 측정하는 방법은 해당 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있고/있거나 본 명세서에 기재되어 있다.

효능은 본 명세서에 기재된 상태의 동물 모델, 예를 들어, 마우스 모델 또는, 경우에 따라, 천식 또는 알레르기성 질환의 적절한 동물 모델에서 평가될 수 있다. 실험 동물 모델을 사용하는 경우, 마커에서의 통계적으로 유의한 변화, 예를 들어, 기도 염증 감소, 폐 기능 증가, 정상 호흡 회복이 관찰되는 경우, 치료 효능은 입증된 것이다.

Notch4를 억제하는 작용제의 효능은 본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 추가로 평가될 수 있다.

본 명세서에 개시된 본 발명의 대안적인 요소 또는 실시형태의 그룹화는 제한으로 해석되어서는 안된다. 각 그룹 구성원은 개별적으로 또는 그룹의 다른 구성원 또는 본 명세서에서 발견되는 다른 요소와 임의의 조합으로 지칭되고 청구될 수 있다. 그룹의 하나 또는 그 이상의 구성원은 편의성 및/또는 특허가능성을 이유로 그룹에 포함되거나, 삭제될 수 있다. 임의의 그러한 포함 또는 삭제가 일어난 경우, 명세서는 본 명세서에서 수정된 그룹을 포함하는 것으로 간주되며, 그리하여 첨부된 청구범위에 사용된 모든 마쿠쉬(Markush) 그룹의 서면 기재를 충족한다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 출원과 관련하여 사용되는 과학 및 기술 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 가질 것이다. 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약 등에 제한되지 않으며, 그 자체로 다양할 수 있음을 이해해야한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시형태를 설명하기 위한 것이며, 청구범위에 의해서만 정의되는, 본 발명의 범위를 제한하려는 의도가 아니다. 면역학 및 분자생물학의 공통 용어에 대한 정의는 하기 문헌에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 모두 전문으로 본 명세서에 참조로 포함된다: The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 20th Edition, published by Merck Sharp & Dohme Corp., 2018 (ISBN 0911910190, 978-0911910421); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Cell Biology and Molecular Medicine, Blackwell Science Ltd. 출간, 1999-2012 (ISBN 9783527600908); 및 Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8); Immunology by Werner Luttmann, Elsevier 출간, 2006; Janeway's Immunobiology, Kenneth Murphy, Allan Mowat, Casey Weaver (eds.), W. W. Norton & Company, 2016 (ISBN 0815345054, 978-0815345053); Lewin's Genes XI, published by Jones & Bartlett Publishers, 2014 (ISBN-1449659055); Michael Richard Green and Joseph Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2012) (ISBN 1936113414); Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (2012) (ISBN 044460149X); Laboratory Methods in Enzymology: DNA, Jon Lorsch (ed.) Elsevier, 2013 (ISBN 0124199542); Current Protocols in Molecular Biology (CPMB), Frederick M. Ausubel (ed.), John Wiley and Sons, 2014 (ISBN 047150338X, 9780471503385), Current Protocols in Protein Science (CPPS), John E. Coligan (ed.), John Wiley and Sons, Inc., 2005; 및 Current Protocols in Immunology (CPI) (John E. Coligan, ADA M Kruisbeek, David H Margulies, Ethan M Shevach, Warren Strobe, (eds.) John Wiley and Sons, Inc., 2003 (ISBN 0471142735, 9780471142737).

다른 용어는 본 발명의 다양한 양상의 설명 내에서 정의된다.

본 출원 전체에서 인용된, 문헌 참조, 발행된 특허, 공개된 특허 출원, 및 동시 계류중인 특허 출원을 포함하는, 모든 특허 및 기타 간행물은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 기술과 관련하여 사용될 수 있는 그러한 간행물에 기재된 방법론을 기재하고 개시할 목적으로 본 명세서에 의도적으로 포함된다. 이들 간행물은 본 출원의 출원일 이전에 그들의 개시만을 위해 제공된다. 이와 관련하여 어떠한 것도 본 발명자들이 선행 발명에 의해 또는 임의의 다른 이유로 그러한 개시를 앞당길 자격이 없다는 것을 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다. 이들 문헌의 내용에 대한 날짜 또는 제시에 관한 모든 진술은 신청자가 이용할 수 있는 정보를 기반으로 한 것이며 이들 문헌의 날짜 또는 내용의 정확성에 대한 임의의 인정을 의미하지 않는다.

본 개시의 실시형태에 대한 설명은 개시된 정확한 형태로 본 개시를 철저하게 하거나 제한하려는 것이 아니다. 본 개시의, 특정 실시형태들, 및 이에 대한 실시예들은 예시적인 목적으로 본 명세서에 기술되어 있지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 본 개시의 범위 내에서 다양한 균등한 수정이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 방법 단계들 또는 기능들이 주어진 순서로 제시되지만, 대안적인 실시형태들은 다른 순서로 기능들을 수행할 수 있거나, 기능들이 실질적으로 동시에 수행될 수 있다. 본 명세서에 제공된 개시의 가르침은 적절한 다른 절차 또는 방법에 적용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 다양한 실시형태는 추가 실시형태를 제공하기 위해 조합될 수 있다. 본 개시의 양상은, 필요하다면, 본 개시의 또 다른 실시형태를 제공하기 위해 상기 참조 및 적용의 조성물, 기능 및 개념을 채용하도록 수정될 수 있다. 또한, 생물학적 기능적 동등성 고려사항으로 인해, 생물학적 또는 화학적 작용의 종류 또는 양에 있어서 영향을 미치지 않으면서 단백질 구조에서 일부 변화가 이루어질 수 있다. 상세한 설명에 비추어 본 개시에 대한 이들 및 기타 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 수정은 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되도록 의도된다.

전술한 실시형태 중 임의의 것의 특정 요소는 다른 실시형태에서의 요소로 조합되거나 대체될 수 있다. 더욱이, 본 개시의 특정 실시형태와 관련된 이점은 이들 실시형태의 맥락에서 설명되었지만, 다른 실시형태도 그러한 이점을 나타낼 수 있으며, 모든 실시형태가 본 개시의 범위 내에 속하기 위해 이러한 이점을 반드시 나타내어야 하는 것은 아니다.

본 명세서에 기재된 기술은 하기 실시예에 의해 추가로 예시되며, 이는 추가 제한으로 해석되어서는 안된다.

본 명세서에 기재된 기술의 일부 실시형태는 아래 번호매겨진 단락 중 임의의 단락에 따라 정의될 수 있다:

1) 유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환의 치료 방법.

2) 하기를 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 치료 방법:

a. 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체를 확인하는 단계; 및

b. 유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 단계.

3) 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 천식이 알레르기성 천식, 알레르기 없는 천식, 아스피린 악화 호흡기 질환, 운동 유발 천식, 기침 변이, 및 직업성 천식으로 이루어진 목록에서 선택되는 것인 방법.

4) 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 알레르기성 질환이 알레르기성 비염, 부비동염, 중이염, 아토피성 피부염, 두드러기, 혈관부종, 및 아나필락시스로 이루어진 목록에서 선택되는 것인 방법.

5) 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 Notch4를 억제하는 작용제가 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.

6) 단락 5에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인 방법.

7) 단락 5에 있어서, 상기 RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 방법.

8) 단락 1 내지 7중 어느 하나에 있어서, Notch4를 억제하는 것이 Notch4의 발현 수준 및/또는 활성을 억제하는 것인 방법.

9) 단락 8에 있어서, Notch4의 발현 수준 및/또는 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 그 이상 억제되는 방법.

10) 단락 1 또는 2에 있어서, 상기 Notch4가 T 조절 세포 상에서 억제되는 방법.

11) 단락 1 및 2에 있어서, 적어도 하나의 추가 항-천식 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

12) 단락 1 및 2에 있어서, 적어도 하나의 추가 항-알레르기성 질환 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

13) 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 방법.

14) 단락 13에 있어서, 투여 전에, 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.

15) Notch4를 억제하는 작용제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환 치료용 조성물.

16) 단락 15에 있어서, 상기 Notch4를 억제하는 작용제가 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.

17) 단락 15에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인 조성물.

18) 단락 15에 있어서, 상기 RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 조성물.

19) 단락 15에 있어서, 상기 조성물이 흡입 투여용으로 제형화되는 것인 조성물.

20) 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,

a. 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계;

b. 후보 세포 집단에서 Notch4 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 대상체는 참조 수준과 비교하여 Notch 수준이 증가하면 천식 또는 알레르기성 질환을 앓을 위험이 있는 것인 단계; 및

c. 위험에 처한 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여하는 단계,를 포함하는 방법.

21) 단락 20에 있어서, 상기 Notch4의 수준이 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 또는 그 이상 증가하는 방법.

22) 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체의 치료에서 치료제의 효능을 결정하는 방법으로서,

a) 치료제의 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제1 수준을 결정하는 단계;

b) 상기 치료제 투여 후 환자에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제2 수준을 결정하는 단계; 및

c) Notch4 발현 또는 활성의 상기 제1 및 제2 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 상기 치료제는 Notch4 발현 또는 활성의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준보다 낮으면 유효한 것으로 간주되고, 여기서 (b)에서 투여되는 치료제는 Notch4 발현의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준과 동일하거나 더 높으면 유효하지 않은 것인 단계를 포함하는, 방법.

23) 단락 22에 있어서, 상기 치료제가 Notch4를 억제하는 작용제인 방법.

실시예

실시예 1

개요

대기 오염, 특히 연소 공급원에 의해 방출되는 미립자 물질(PM)에 대한 노출이 최근 몇십년 동안 천식 발생률과 유병률을 증가시키는 데 중요한 역할을 한다는 것은 잘 인식되어 있다^1-6. 대기 오염물질 중, PM에 대한 노출이 호흡기 건강 악영향과 가장 강한 상관관계를 나타낸다^7-10. 이들 입자는 노출된 숙주에서 Th2 및 Th17 세포 반응을 촉진하고 IgE 생산을 상향조절하는 것으로 밝혀졌다^11-15. 흡입된 PM은 크기에 따라 계층화되는 차등적 기도 관통력을 나타낸다. 비인두 부위에서 포획되는 거친 입자(CP; ≥ 직경 2.5 μm)와 달리, 미세 입자(FP; ≤ 직경 2.5 μm)와 초미세입자(UFP; ≤ 직경 0.2 μm)는 하부 기도 내로 침투할 수 있으며, 여기서 이들은 항원 제시 세포(APC)에 의해 섭취되어 국소 및 전신 염증을 매개하게 된다¹⁶. APC 기능의 PM 조절은 알레르겐에 대한 면역 반응을 촉진하는 PM의 아주번트-유사 효과와 특히 관련이 있을 수 있다^{13, 17}. 최근 연구에서는, APC에서 Notch 수용체 리간드 Jagged1(Jag1)의 유도를 포함하는, 알레르기 반응을 증강시키는 UFP 및 FP 둘 다에 공통적인 주요 메커니즘을 확인했다¹⁵. 이 유도는 아릴 탄화수소 수용체(AhR; aryl hydrocarbon receptor)의PM-관련 다환 방향족 탄화수소(PAH)에 의한 활성화에 의해 매개되며, 이는 차례로 Jag1의 전사 활성화를 매개한다. Jag1은 알레르겐-특이적 T 세포 상의 Notch 수용체와 결합하여, 이들의 증강된 질병-촉진 Th 세포로의 분화를 초래한다. 이들 연구는 이 과정에 관여하는 관련 APC 종이나, PM-유도된 Jag1에 대한 반응을 매개하는 표적 Notch 수용체를 정확하게 확인하지 못했다.

폐 대식세포는 이전에 PM의 섭취 및 반응과 연루되어 왔다^18-20. 이들은 두 가지 주요 서브셋을 포함한다: 높은 수준의 β2 인테그린 CD11c(CD11c^hi)를 발현하는, 폐포 대식세포(AM) 및 중간 수준의 CD11c(CD11c^int)를 발현하는 간질성 대식세포(IM)^{21, 22}. 연구는 두 집단 모두 무경험 T세포가 Treg 세포의 분화를 유도함으로써 안정된 상태에서 면역 내성을 촉진하는 것으로 밝혔냈다^23,24. 그러나, 알레르겐과 내독소를 포함한, 염증성 자극은 공동-자극 분자의 발현을 조절하고 항원 제시 세포로서 폐 대식세포의 효능을 변경한다^{25, 26}. 유사한 맥락에서, PM에 대한 AM의 노출은 이들의 기능을 변경하여, 이들을 향-염증성(pro-inflammatory)으로 만든다²⁷. 폐 대식세포를 표적으로 하는 것 외에도, PM은 폐 수지상 세포(DC)의 항원 제시 기능을 강화하는 것으로 밝혀졌다²⁸. PM에 의해 유도된 알레르기 기도 염증 반응에 대한 각 APC 유형의 상대적 기여도는 완전히 규명되어야 한다.

PM 노출이 폐 APC를 표적으로 하여 알레르기성 질환을 촉진할 수 있는 메커니즘을 조사하기 위해, 다양한 유전적, 면역학적 및 전체 동물 접근법을 채용했다. 본 명세서에서는 Notch4-의존성 알레르겐-특이적 T 헬퍼 세포 분화와 관련된 프로세스에 의해 알레르기 기도 염증을 촉진하는 데 있어서 AM이 PM-매개, AhR-의존성 Jag1 유도에 중요한 역할을 하는 것에 대한 증거를 제공한다.

방법 및 재료

마우스. Il4ra ^R576 및 Foxp3 ^EGFP 마우스는 전술했다^{15, 29, 30}. 하기 마우스를 Jax Lab에서 입수했다: BLAB/c(WT), Ahr ^fl/fl (Ahr ^tm3.1Bra )³¹, Lyz2 ^Cre(CreB6.129P2-Lyz2 ^tm1(cre)Ifo /J) 및 CD11c ^Cre(B6.Cg-Tg(Itgax-cre)1-1Reiz/J)³². DO11.10Rag2 ^-/- 마우스를 타코닉(Taconic) 농장에서 입수했다. 이들을 Il4ra ^R576 마우스와 교배하여 DO11.10Rag2 ^-/- Il4ra ^R576 Foxp3 ^EGFP 마우스를 생성시켰다³⁰. Jag1 ^fl/fl 마우스를 Freddy Radtke 박사가 친절하게 제공해 주었다³³.

입자 . 이전에 보고된 바와 같이, UFP(≤0.18 μm)를 로스앤젤레스 시내의 도심지에서 수집했다¹⁵. 입자의 구성 성분을 기재한 것과 같이 분석했다³⁴. 각각의 입자를 수용액에 현탁시켰으며, 이 때 친수성 성분은 용액의 일부가 되고, 한편 고체 불용성 UFP 코어는 현탁 상태로 남아 있다. 전체 혼합물을, 아래 나타낸 것과 같이, 비강내로 투여했다.

폐 대식세포 및 DC와 T 세포 공동-배양. 무경험 CD4⁺DO11.10⁺ 세포를 플루오레세인-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 CD4⁺ DO11.10 ⁺ RAG2 ^-/- Il4ra ^R576 Foxp3 ^EGFP 마우스의 비장으로부터 분리했다. AM 및 IM을 FACS로 분리하고 48웰 플레이트에서 2x10⁴개 세포로 분취하고, 그 후 샴 처치하거나 UFP를 10 ㎍/㎖로 밤새 처치했다. 아넥신(Annexin) V 염색에 의해 평가된 바와 같이, UFP 처치는 샴 처치에 비해 증가된 아폽토시스를 유도하지 않았다(데이터 미제시). APC를 PBS로 2회 세척하여 잔류 UFP를 제거하고, 그런 다음 T 세포를 최종 부피 0.5 ml의 10% 우태아 혈청/RPMI 배양 배지에 4x10⁵개 세포/웰로 첨가했다. 나타낸 것과 같이, 배양물에 OVA_323-339 펩티드를 1 μM로 처치했다. 항-뮤린 Notch Ab를, 나타낸 것과 같이, 각각 10 ㎍/㎖로 첨가했다.

알레르기 감작 및 유발(challenge). 마우스를 100 ㎕ PBS 중의 100 ㎍ OVA의 복강내(i.p.) 주사로 OVA에 감작시키고, 그런 다음 2주 후에 두 번째 PBS 중의 OVA i.p. 주사로 부스팅했다. 대조군 마우스를 샴 감작시키고 PBS 만으로 부스팅했다. 29일에 시작하여, OVA 및 샴-감작된 마우스 둘 다에 1%의 에어로졸화된 OVA로, 3일 동안 매일 30분 동안 유발시켰다. 각 OVA 에어로졸 노출 2시간 전에, 마우스의 서브그룹에 10 ㎍/100 ㎕ PBS/점적주입으로 PBS 또는 UFP 중 어느 하나를 비내로 (i.n.) 제공했다. 항-Notch4 항체 차단을 위해, 150 ㎍ 아르메니아 햄스터 항-마우스 Notch4 IgG mAb(클론 HMN4-14; Bio X Cell)³⁵, 또는 대조군 아르메니아 햄스터 IgG 폴리클로 날 항체(Ab)(Bio X cell)를 100 ㎕ PBS 버퍼에 현탁시키고 OVA 에어로졸 유발 진행 중에 연속 3일 동안 매일 투여했다. 감작 후 32일째에 마우스를 안락사시키고 분석했다. 집먼지 진드기-유도된 알레르기 기도 염증의 경우, 마우스에 프로토콜 시작시 3일 동안 100 ㎕ PBS 중의 5 ㎍의 동결건조된 D. 프테로니스시누스(Pteronyssinus) 추출물(Greer)을 비강내로 투여한 다음, 15-17일째에 UFP가 있거나 없는 동일한 용량의 D. 프테로니스시누스 추출물로 유발시켰다. 마우스를 18일째에 안락사시키고 기도 염증 측정을 위해 분석했다. 기관지폐포세척(BAL) 유체 및 폐 조직을 확보하고 이전에 공개된 방법에 따라 세포 성분 및 T 세포 사이토카인 발현에 대해 분석했다^15,30.

AM, IM 및 DC 세포 전달 연구를 위해, 세포를 FACS에 의해 Il4ra ^R576 또는 Il4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^/ 공여자 마우스로부터 분리했다. 세포를 밤새 배양하고 샴 처치하거나 OVA_323-339 펩티드를 5 nM 펩티드 농도로 단독으로 또는 10 ㎍/㎖의 UFP와 함께 로딩했다. 세포를 2일에 걸쳐 2회 반복하여 10⁵개 세포/마우스로 OVA-감작된 l4ra ^R576 Lyz2 ^Cre Jag1 ^Δ/Δ 마우스의 기관지내로 전달했다. 3일째에 마우스를 안락사시키고 알레르기 기도 염증의 다른 파라미터에 대해 분석했다.

폐 조직병리 염색. 파라핀-포매된 폐 절편을 기재된 바와 같이 헴톡실린과 에오신(H & E)으로 염색했다³⁶. 폐 병리학은 맹검 수술자에 의해 채점되었다. 염증을 혈관 및 기도 주변의 세포 침윤에 대해 별도로 점수를 매겼다: 0, 침윤 없음; 1, 소수의 염증 세포; 2, 1 세포층 깊이의 염증 세포의 고리; 3, 2-4 세포 깊이의 염증 세포의 고리; 4, > 4 세포 깊이의 염증 세포의 고리³⁷. 복합 점수를 혈관 및 기도 둘 다에 대한 염증 점수를 더하여 결정했다. 잔모양(goblet) 세포의 수와 분포는 뮤신 과립의 과요오드산 스키프(PAS) 염색으로 평가했다. 개별 기도(기관지/세기관지)를 다음 척도에 따라 잔모양 세포 증식(hyperplasia)에 대해 점수를 매겼다: 0, PAS 양성 세포 없음; 1, <5% PAS-양성 세포; 2, 5 내지 10% PAS-양성 세포; 3, 10 내지 25% PAS-양성 세포; 및 4, > 25% PAS-양성 세포³⁸.

통계 분석. 나타낸 것과 같이, 그룹에 대한 스튜던트의 양측 t-검정, 일원 및 이원 분산분석(ANOVA) 및 본페로니(Bonferroni) 사후-검정 분석을 이용한 반복 측정 이원 분산분석(ANOVA)을 사용하여 테스트 그룹을 비교했다. p 값 <0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.

연구 승인. 모든 동물 연구는 보스턴 아동병원 동물보호자원 사무국(Boston Children 's Hospital Office of Animal Care Resources)에 의해 검토되고 승인되었다.

기타 방법. 실시간 PCR 분석, 유세포 분석(Fluoresbrite® 노란색 녹색(YG) 마이크로스피어 및 나노비드 포함), 세포내 염색 시약, Ab 및 방법, IgE ELISA 및 기도-과민반응의 측정에 관한 정보는 본 문헌(article)의 온라인 저장소의 방법 섹션에 제공되어 있으며, 예를 들어, 월드와이드웹 상의 www.jacionline.org에서 찾을 수 있다.

결과

폐 대식세포는 기저 및 염증 조건 하에서 폐에서 UFP의 주요 세포 표적이다. UFP에 의한 기도 염증의 촉진에 있어서 Jag1-AhR-Notch 경로의 역할을 추가로 규명하기 위해, 우선 기저 및 특히 알레르기 염증 조건 둘 다에서, 본 명세서에 제시된 연구 모델에서 PM에 의해 표적화된 APC의 상세한 면역표현형적 특성결정을 확립하고자 했다. UFP에 대한 연구는 주로 이들의 깊은 침투력, 큰 표면적 대 크기 비율, PAH 질량 당 더 높은 함량 및 산화 스트레스를 유발하는 더 큰 용량으로 인한 특히 독성이 있는 것에 초점을 맞추었다^39,40. Il4raR576 마우스를 사용한 OVA-유도된 알레르기 기도 염증 모델을 사용했다. 이들 마우스는 IL-4R-의존성 혼합 Th2/Th17 세포 염증을 매개함으로써, 단독으로 또는 UFP와 함께 알레르겐에 대한 과다 알레르기 기도 염증을 매개하는 IL-4 수용체 알파 사슬(IL-4Rα-R576) 변이체를 가지고 있다^15,30. 마우스를 OVA의 복강내 주사에 의해 감작시키고 그런 다음 PBS(샴 공격) 또는 1% 에어로졸화된 OVA를 반복적으로 흡입시켜 공격했다. 마우스의 서브그룹을 OVA 에어로졸 공격 2시간 전에 Fluoresbrite® YG 나노비드(0.05 ㎛ 유효 직경) 또는 마이크로스피어(1 ㎛ 유효 직경)와 조합된 UFP로 비강내로 처치했다⁴¹. 나노비드 형광 양성 세포 집단을 유세포 분석으로 분석했다(도 1A 및 1B). 염증이 없는 경우(PBS-감작된, OVA-처치군), ≥95% 나노비드-흡수 세포는 CD45+F4/80+CD64+MHCII+CD11bIntCD11cHi 폐포 대식세포인 반면 CD45+F4/80+CD64+MHCII+CD11bHiCD11cInt 간질성 대식세포는 전체 마이크로스피어 양성 세포의 2-3%를 나타냈다(도 8A-8G, 9A-9D 및 10A-10C)⁴². OVA 및 특히 OVA + UFP에 의해 유발된 알레르기성 기도 염증의 맥락에서, 나노비드-섭취 세포의 약 85%는 대식세포였으며, AM(검문 G3)과 IM(검문 G4) 사이에 70:30 비율로 분포했다(도 1A-1C). 입자-흡수 AM 집단은 CD38IntEgr2Hi(M2 유사)이었고, 한편 IM 집단은 CD38HiEgr2Int(M1 유사)이었다(도 10A 및 10B)⁴³. M2-유사 표현형과 일치하여, UFP로의 세포-분류된 AM의 시험관내 처치는 사이토카인 IL-10, CCL17, IL-6 및 TNF-α의 생산을 급격히 상향조절시켰으나 IL-12의 기준 생산에는 거의 변화를 유발하지 않았다(도 10C)^44,45. 나머지 비드 중(15%), 약 2/3는 CD11chiCD11bintCD8α+CD103+B220-PDCA1- 클래식(c) DCs⁴⁶에 의해 포집되었고, 나머지는 Gr1+SiglecFlow 호중구에 의해 포집되었다(도 1B, 1C 및 8A-8G). 이들 결과는 폐포 및 간질성 대식세포가 알레르기성 기도 염증의 맥락에서 흡입된 UFP의 제거를 담당하는 주요 세포 서브셋임을 나타낸다. 나노비드 대신 Fluoresbrite® YG 마이크로스피어 비드를 사용했을 때 유사한 세포 국재화 결과가 얻어졌으며, 이는 FP와 UFP가 알레르기 기도 염증을 촉진하는 데 동일한 AhR-Notch-Jag1 작용 메커니즘을 공유한다는 것을 보여주는 이전에 발표된 데이터와 일치한다(도 11A-11B).

UFP는 폐 AM에서 Jag1 발현을 차별적으로 유도한다. UFP는 골수-유래 수지상 세포¹⁵ 및 대식세포에서 AhR 의존적 방식으로 Jag1 발현을 유도한다(도 12A). Jag1 전사체의 발현을, Il4raR576 마우스의 폐에서 분리하고 샴 처치 또는 UFP로 시험관내에서 처치한 상이한 APC 집단에서 조사했다. Jag1 발현은 IM 및 DC와 비교하여 AM의 기준선에서 가장 높았다(도 1D). UFP로의 시험관내 처치는 AM에서 Jag1 전사체 발현을 과다-유도(super-induction)했으며, 반면 동일한 처치는 IM 및 DC에서의 소폭의 증가와 관련이 있었다(도 1D). 대조적으로, Fluoresbrite® YG 나노비드 처치는 AM에서 Jag1 발현을 유도하지 못했다(도 9A). 또한 비강내 투여시 Fluoresbrite® YG 나노비드가 AM에 국한되었음에도 불구하고 OVA에 의해 유도된 기도 염증에 영향을 미치지 못했다(도 9B-9D). 골수-계통 세포에서 활성인, 리소자임 2 유전자 프로모터(Lyz2Cre)에 의해 구동되는 Cre 재조합효소에 의한 floxed Ahr 대립유전자의 결실은 Il4raR576Lyz2CreAhr^△/△ 마우스의 AM에서 Jag1 전사체의 기준선 발현을 크게 감소시키고 UFP에 의한 이의 과다-유도를 폐기시켰다. 유사한 경향이 다른 세포 유형에서도 나타났지만, DC에서 Jag1 발현은 부분적으로 보존(sparing)되었다. 유세포 분석기 분석으로 다른 세포 유형과 비교하여 AM에서 Jag1의 고조된 발현과 Ahr 결실시의 하향조절을 확인했다(도 1E). 골수 유래 대식세포에서 UFP-유도 Jag1 발현은 Lyz2Cre-구동 Ahr 결실에 의해 유사하게 영향을 받았다(도 12A-12B). 더욱이, OVA로의 생쥐 감작에 이어 OVA 및 UFP로의 공격는 IM과 DC에 비해 AM에서 Jag1의 우선적 유도를 초래했고, 이 유도는 Lyz2Cre-driven Ahr 결실에 의해 바로 역전되었다(도 12B).

이러한 결과는 Lyz2Cre(Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△)를 사용하여 골수 계통에서 floxed Jag1 유전자의 결실에 의해 추가로 확인되었다(도 1F 및 1G). Jag1 전사체 발현 및 Jag1 표면 염색은 기준선 및 UFP 처치 후 AM에서 완전히 폐기되었다. 감소된 Jag1 전사체 발현 및 Jag1 단백질 염색은 IM에서 지속되었지만, DC에서 이들의 수준은 영향을 받지 않았다. 이러한 발견은 AM이 기준선 및 UFP 처치 후 둘 다에서 Jag1을 발현하는 주요 APC 세포 유형인 것을 확인했고, 또 이 발현이 Ahr-의존성 메커니즘에 의해 진행됨을 확인했다. 이들은 또한 Lyz2Cre가 대식세포, 특히 AM에서, Jag1을 우선적으로 표적으로 삼는 반면, DC에서는 크게 보존되는 것으로 나타났는데, 이는 대식세포 대 수지상 세포에서 Lyz2Cre의 활성에 대한 이전의 계통 추적 분석과 일치한다⁴⁷.

UFP-처치된 AM은 Jag1-의존성 메커니즘에서 Th 세포 분화를 촉진한다. UFP에 의한 AM에서 Jag1 발현의 유도가 알레르겐-유도 Th 세포 분화를 증강시키는지 조사하기 위해, DO11.10+Rag2-/- 마우스로부터 유래된, 무경험 Il4raR576DO11.10+CD4+ 세포를 포함하는 시험관내 Th 세포 분화 시스템을 채용했다. 무경험 DO11.10+CD4+ 세포를 Il4R576 또는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스에서 분리한 FACS-정제된 AM과 함께 배양했다. AM은 PBS로 샴 펄싱되거나 OVA 펩타이드 OVA323-339로 단독으로 또는 UFP와 함께 펄싱되었다. 인큐베이션 기간의 종료 시점에, Th 세포 사이토카인 발현을 검문된 CD4+Foxp3-(비조절) T 세포에서 분석했다. OVA_323-339 펩타이드-펄싱된 IL4RR576 AM과의 공동-배양은 DO11.10+CD4+Foxp3- 세포에 의한 IL-17, IL-13 및 IL-4의 생산 증가를 초래했고, 유세포 분석 염색에 의해 드러난 것과 같이, IFN-γ는 훨씬 더 적게 생산되었다(도 2A, 2B 및 13A-13D). 처음 3개의 사이토카인의 발현은 UFP(10 ㎍/㎖)의 첨가에 의해 현저하게 상향조절된 반면, IFN-γ의 발현은 하향조절되었는데, 이는 과장된 Th2/Th17 왜곡과 일치한다³⁰. 대조적으로, OVA323-339에 의한 DO11.10+CD4+ T 세포에서의 IL-17, IL-13 및 IL-4 발현의 유도는 적당히 억제되었고, Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ AM을 APC로 사용했을 때 UFP에 의한 이들의 과다-유도는 완전히 폐기되었다. 이러한 공동-배양물에서의 IFN-γ 발현도 심하게 손상되었다(도 2A 및 2B).

DO11.10 세포 시험관내 Th 세포 분화 시스템을 채용하여 무경험 알레르겐-특이적 T 세포의 유도된 Treg 세포로의 분화를 지원하는 AM의 능력에 대한 UFP 처치의 영향을 조사했다. UFP의 부재시, OVA323-339-로딩된 AM은 무경험 Il4raR576DO11.10+CD4+ T 세포의 Foxp3+ 유도된 T 조절(iTreg) 세포로의 분화를 최대 40% 유도했다. UFP로의 처치는 Jag1 발현과 무관하게 iTreg 세포 분화를 부분적으로 억제했다(도 3A 및 3B). 중요하게는 그렇지만, OVA323-339 펩타이드-제시 AM의 UFP 처치는 형성된 iTreg 세포를 IL-4, IL-13 및 IL-17을 포함하나, Th1 사이토카인인 IFN-γ를 포함하지 않는, 사이토카인을 분비하는 Th2/17 세포로 왜곡시켰다. 이 왜곡은 AM에서 Jag1의 결실에 의해 크게 역전되었다(도 3C 및 3D). 이러한 결과는 UFP가, 부분적으로 Jag1 의존적 방식으로 Th2/17 세포 분화를 향해 새롭게 형성된 iTreg 세포를 불안정화함으로써, 알레르겐-특이적 iTreg 세포 분화에 악영향을 미친다는 것을 나타냈다.

골수 계통의 Jag1 결실은 UFP에 의한 알레르기 기도 염증의 증강을 폐기시킨다. 생체내에서 알레르기 기도 염증의 UFP 상향조절을 지원하는 AM에 대한 Jag1 발현의 역할을 결정하기 위해, Lyz2Cre를 우선 채용하여 골수 계통 세포에서 Ahr-Jag1 유전자 회로의 구성 유전자를 결실시켰다. 따라서, Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스와 Il4raR576 마우스를 OVA의 복강내 주사에 의해 감작시키고, 그런 다음 1% 에어로졸화된 OVA의 흡입으로 공격했다. 대조군 마우스를 PBS로 샴 감작시키고 에어로졸화된 OVA로 공격했다. 마우스의 서브그룹을 OVA 에어로졸 공격 2시간 전에 UFP(10 ㎍/점적) 또는 PBS로 비강내로 처치했다⁴¹. OVA로의 Il4raR576 마우스의 감작 및 공격는 기도 염증 및 과민-반응성, 호산구증가증 및 BAL 유체의 T 세포 침윤, 전체 및 OVA-특이 혈청 IgE 반응 증가, Th2 및 Th17 세포 반응 증가를 트징으로 하는, 강력한 기도 염증 반응을 초래했다(도 4A-4K). 이러한 모든 파라미터는 OVA 공격 단계 동안 UFP 노출에 의해 현저하게 증강되었다. Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스의 OVA 감작 및 공격은 또한 OVA 감작 및 공격을 받은 Il4raR576 마우스에서 언급된 것과 유사하게 강력한 알레르기성 기도 염증 반응을 초래했다. 그러나, 앞서 언급한 알레르기 기도 염증의 모든 파라미터의 UFP에 의한 증가는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스에서 완전히 폐기되었으며, 이는 UFP가 기도에서 향-염증 효과를 발휘하기 위해 골수 계통에서의 Jag1 발현이 필수 요건임을 나타낸다(도 4A-4I).

Il4raR576 마우스의 비강내 치료시 유도된 알레르기 기도 염증의 UFP에 의한 증강를 매개하기 위한 골수 계통 세포에서의 Jag1 발현의 역할은 또한, 일반적이고 유력한 인간 알레르겐인 집 진드기(D. pteronyssinus)의 추출물로 조사했다. 결과는 OVA 감작 및 공격에서 관찰된 결과와 일치했다. UFP가 저용량의 집 진드기(D. pteronyssinus)(5 ㎍)로 Il4raR576 마우스를 처치하여 유도된 기도 염증을 증강시켰지만, 이 효과는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스에서 폐기되었다(도 14A-14M). Il4raR576 마우스(Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△)에서 Ahr의 골수 계통-특이적 결실은 UFP에 의해 유도된 알레르기 기도 염증의 다양한 파라미터를 증강시키는 UFP의 능력을 폐기시켰으며, 이는 UFP에 의한 Jag1 발현 유도를 위한 AhR 신호전달에 대한 요구조건과 일치했다(도 15A-15N). 대조적으로, CD11cCre를 사용하는 모든 CD11c+ APC 계통에서 Jag1의 결실은 UFP에 의한 기도 염증의 촉진을 억제하지 못했고, 사실상 이를 악화시켰으며, 이는 이들 계통의 향-염증 기능 획득을 위해 AM에서 UFP에 의한 Jag1 유도에 대한 독특하고 특이적인 요구조건을 나타낸다(도 16A-16F).

AM에서의 Jag1 발현은 알레르기 기도 염증의 UFP 상향조절을 매개하기에 충분하다. UFP에 의한 알레르겐-유발 기도 염증의 악화에서 AM에서 Jag1 발현의 역할을 구체적으로 확인하기 위해, Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스로 전달하였을 때 UFP 효과를 구제하는 AM의 능력을 조사했다. 그에 따라, AM을 샴 처치하거나 또는 UFP의 부재 또는 존재하에 OVA323-339 펩티드를 로딩한 Il4raR576 또는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스로부터 분리했다. 세포를 OVA로 감작시킨 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스의 기도로 전달하여 알레르기성 기도 염증의 유도를 조사했다. 결과는 Jag1-충분 OVA323-339 펩티드-펄싱 및 UFP-처치된 Il4raR576 AM의 OVA-감작된 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스로의 전달이 증강된 조직 염증, 증가된 기도 과민-반응, 혈청 총 및 OVA-특이적 IgE, BAL 유체 CD4+ T 세포 침윤 및 호산구증가증을 포함하는, UFP에 의해 유도된 악화된 알레르기 기도 염증의 모든 증상(stigmata)을 재현시키는 것으로 나타났다(도 5A-5G). 또한 Th 세포 사이토카인 생산과 Th 세포 유사 표현형으로의 Treg 세포 불안정화가 증강되었다(도 5H-5O). 대조적으로, 유사하게 처치된 Jag1-결핍 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ AM의 전달은 그렇게 하지 못했으며, 이는 AM의 Jag1 발현이 알레르겐-유도된 기도 염증을 증강시키는 UFP의 능력을 회복시키기에 충분하다는 것을 나타낸다.

Il4raR576 또는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스의 폐로부터 분리하고 샴 처치 또는 OVA323-339 또는 OVA323-339+UFP를 로딩한 IM 및 DC가 기도 염증을 촉진하는 능력을 또한 OVA-감작된 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ 마우스의 기관지내로 전달한 경우에 조사했다. 그러나, Jag1-충분 AM의 경우와는 달리, 전달된 IM은 이들의 처치 방식(modality)에 관계없이 알레르기성 기도 염증을 촉진하지 못했다(도 17A-17F). 전달된 DC도 또한 기도 과민 반응을 유도하지 못했다. OVA323-339-로딩 DC는 AM과 비교하여 호산구 및 Th 세포로의 준최적(suboptimal) 조직 침윤을 유도했으며, UFP 처치에 의해 증강되지 않았다. 이러한 결과는 기도 염증을 촉진하는 데 있어서 그리고 UFP에 의한 과다-유도에서의 Jag1-충분 AM의 독특한 역할과 일치한다(도 17G-17L).

UFP에 의한 알레르겐-유도된 Th 세포 분화 촉진은 Jag1-Notch4 상호작용을 포함한다. UFP 처치시 AM에 의해 발현되는 Jag1의 향-염증 효과를 매개하는 각 Notch 수용체의 역할을 다음으로 결정했다. 따라서, 상이한 Notch 수용체의 생체외(ex-vivo) 발현을 I4raR576Foxp3EGFP 마우스로부터 분리된, FACS-정제된 CD4+EGFP- T 통상적 세포 및 CD4+EGFP+ Treg 세포에서 우선 분석하였다. 세포를 조작되지 않은 마우스의 비장과, UFP를 공동-처치하지 않거나 처치한 알레르기성 기도 염증을 겪게 된 마우스의 폐에서 분리했다. 비장 CD4+ T 세포는 주로 Notch1 및 Notch2(데이터 미제시)를 발현했으며, 이는 이전 결과와 일치한다⁴⁸. 대조적으로, Notch4 발현은 OVA로 감작시키고 OVA+UFP를 공격한 마우스의 폐에서 분리한 CD4+ T 세포에서 상향조절되었으며, 4개의 Notch 수용체 중 가장 높게 나타났다(도 18). Notch1 및 Notch2 발현도 이 보다 정도는 덜하지만 상향조절되었으며, 반면 Notch3의 발현은 감소했다.

상기 결과로부터 알 수있는 바와 같이, 도 2A 및 2B에 기재된 시험관내 공동-배양 시스템을 채용하여 그 다음으로 OVA323-339 펩티드-제시 AM에 대한 UFP 처치에 의한 DO11.10 T 세포와의 반응에 의해 Th 세포 사이토카인 생산을 증강시키는 것을 역전시키는 중화 Notch1, 2 및 4 Ab의 능력을 결정했다. FACS-정제된 Jag1-충분(Il4raR576) 또는 -결핍(Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△) AM을 샴 처치하거나, OVA323-339 펩티드를 단독으로 또는 UFP와 함께 처치했다. 이들은 아이소타입 대조군 mAb 또는 개별 Notch 수용체에 특이적인 중화 mAb의 존재하에 무경험 Il4raR576DO11.10+CD4+ T 세포와 공동-배양하였고, T 세포를 Th 세포 사이토카인 발현에 대해 조사했다. 예상대로, OVA323-339 펩타이드 펄싱한 Il4raR576 AM에 대한 UFP 처치는 DO11.10+CD4+Foxp3- T 세포에 의한 IL-17, IL-13 및 IL-4, 그리고 훨씬 더 적은 정도이지만 IFN-γ의 생산을 상향조절한 반면, 이 효과는 Il4raR576Lyz2CreJag1^△/△ AM을 APC로 사용한 경우 폐기되었다. 중요하게는, IL-4, IL-13 및 IL-17을 포함한, UFP에 의한 Th 세포 사이토카인 발현의 상향조절은 고도로 특이적인 중화 항-Notch4 mAb와의 공동-처치에 의해 일정하게 억제되었다(도 6A 및 6B 및 19A-19D)⁴⁹. 항-Notch4 mAb는 또한 OVA, 단독 또는 UFP에 의해 유도된 잔류 IFN-γ 생산을 억제했다. 대조적으로, 다른 Notch 수용체에 특이적인 중화 mAb로의 처치는 부분적 및/또는 선택적 억제 결과를 제공했다(도 19A-19D). 항-Notch4 mAb는 또한 UFP로 처치한 OVA323-339 펩타이드-제시 AM과 함께 배양했을 때 Th 세포 사이토카인의 DO11.10+CD4+Foxp3+ iTreg 세포에 의한 생산을 억제했다(도 20A-20B). 참고로, 항-Notch4로의 처치는 때때로 Jag1 활성화에 의해 설명될 수 있는 것을 넘어서서 잔류 Th 세포 사이토카인 생산(예를 들어, IL-4 생산)을 억제했으며, 이는 이러한 Th 세포 반응을 지원하는 데 Notch4를 통해 작용하는 다른 Notch 리간드에 의한 추가 기여를 시사한다.

알레르겐-특이적 T 세포에서 Notch 신호전달을 차단하는데 있어서 항 -Notch4 mAb의 특이성 및 효능을 OVA323-339 및 UFP-처치된 AM과 Il4raR576CD4+DO11.10+Rag2-/- T 세포의 시험관내 공동-배양물에서 추가로 확인했으며, 항-Notch4 mAb로의 처치는 T 세포는 Notch 표적 유전자인 Hes1, Hey1 및 Nrarp의 전사 상향조절을 차단했다(도 21A-21C). 전체적으로, 본 명세서에 제시된 이러한 발견은 Notch4가 핵심 Notch 수용체로서 이를 통해 Jag1이 Th 세포 분화를 촉진함으로써 UFP에 대한 염증 반응을 매개한다는 것을 나타냈다.

Notch4 억제는 UFP에 의한 알레르기성 기도 염증의 악화를 억제한다. 알레르겐 펩티드-제시 AM의 UFP 처치에 의해 유도된 알레르겐-특이적 Th 세포의 증강된 시험관내 분화를 역전시키는 중화 항-Notch4 mAb의 효능을 고려할 때, UFP에 의해 유도된 알레르기성 기도 염증 반응의 악화에 미치는 Notch4 억제의 영향을 조사했다. 그에 따라, OVA 단독으로 또는 UFP와 함께 감작되고 공격된 Il4raR576 마우스를, 공격 시기 동안 항-Notch4 또는 아이소타입 대조군 mAb로 처치한 다음, 기도 알레르기성 염증 반응의 다양한 파라미터에 대해 분석했다. 항-Notch4 mAb로의 처치는 조직 염증, 기도 과민반응, BAL 체액 호산구증가증, 혈청 총 및 OVA-특이적 IgE 반응, 기도 Th2 및 Th17 세포 반응 측면에서 OVA-유도된 알레르기 기도 염증에 거의 또는 전혀 영향을 미치지 않았다. 대조적으로, 이것은 UFP에 의해 유도된 전술한 파라미터의 강화(potentiation)를 완전히 억제하였으며, 따라서 이는 Notch4가 알레르기 기도 염증에 대한 UFP의 강화 효과를 매개함을 나타낸다(도 7A-7G).

고찰

이전 연구는, UFP 및 FP를 포함한, 교통-관련 PM이 AhR-의존적 방식으로 APC 상의 Jag1 발현을 유도하여 알레르기 기도 염증을 촉진하고, 이는 차례로 Notch 신호전달을 활성화하여 알레르겐-특이적 T 세포에 의한 Th 사이토카인 발현을 증가 시킨다는 것을 입증했다¹⁵. 그러나, 이들 연구는 Notch4가 기도 염증을 약화시키기위한 잠재적인 치료적 표적인 것을 가르치지 않는다. 본 명세서에 제시된 데이터는 다른 폐 APC와 비교하여 나노 및 마이크로 입자의 열렬한 흡수 및 PM 흡수시 Jag1 발현의 과다-유도로 인해 AM이 PM의 주요 표적인 것을 확인했다. 또한, UFP-처치된 AM에 의한 알레르겐-특이적 Th 세포 분화 및 iTreg 세포 불안정화에 의한 Jag1-의존적 상향조절의 주요 매개자(mediator)로서 T 세포에 대한 Notch4의 확인이 본 명세서에 제시되어 있다. 중화 항-Notch4 mAb에 의한 Notch4 억제는 UFP에 의한 알레르기 기도 염증의 상향조절을 완전히 폐기했다. 그리하여, 이들 연구는, AM 및 알레르겐-특이적 CD4+ Th 및 Treg 세포를 포함하는, 세포 요소 및, 알레르기 기도 염증에서 PM-활성화 AhR-Jag1-Notch 회로의 향-염증 효과를 매개하는 데 관여하는, Jag1 및 Notch4를 포함하는, 분자 이펙터를 확립시켰다.

AM은 DC⁵⁰의 항원 제시 능력에 대한 하향조절⁵⁰ 뿐만 아니라, iTreg 세포 분화에 대한 촉진²³으로 인해 기도 내에서의 내성의 항상적 유지에 필요한 것으로 제시되어 왔다. AM은 또한 DC와 비교하여 항원 제시에 있어 덜 효과적인데, 이 결함은 CD28 또는 IL-2와 T 세포의 공동-자극과 같은 보조 신호의 제공으로 극복될 수 있다^51,52. AhR의 PM-매개된 활성화에 의한 AM에서의 Jag1 발현의 상향조절은 Th 세포 사이토카인 생산을 증폭시키는 공동-수용체 쌍으로 작용하는 Jag1-Notch를 이용한 효율적인 항원 제시를 가능하게 할 수 있다⁵³. 본 명세서에 제시된 결과는 골수 계통 내의 Jag1 결핍 마우스에서 UFP에 의한 알레르기 기도 염증의 증강을 구제하는 데 Jag1-충분 AM의 필요 충분적 역할을 명백히 입증한다. 염증 조건 하에서, IM에 의한 나노입자의 흡수 증가가 주목되었으며, 이것은 아마도 부분적으로 염증이 있는 폐 조직에서 후자의 세포의 풍부도 증가 및/또는 이들 입자에 대한 이들의 결합력 증가를 반영할 가능성이 있다. 그럼에도 불구하고, IM 또는 DC 중 어느 하나로의 Il4ra^R576Lyz2^CreJag1^△/△ 마우스의 재구성은 UFP에 대한 염증 반응을 구제하지 못했으며, 이는 이 과정에서 Jag1-충분 AM의 필수적 역할을 시사한다.

AM에서 Jag1의 결실은 UFP-유도된 알레르기 기도 염증의 증강을 역전시켰지만, 이것은 또한 폐 조직에서 CD4⁺ T 세포의 이동(mobilization)과 같은, UFP 부재시 알레르겐-유도된 기도 염증에 관한 몇몇 파라미터를 약화시켰다(도 4A-4O 및 5A-5O). 이러한 발견은 UFP 처치 부재시 AM 상의 잔여 Jag1 발현이 알레르겐-유도된 기도 염증에 기여할 수 있으며, UFP는 이 과정을 현저하게 증폭시키는 역할을 한다는 것을 분명히 보여준다.

놀랍게도, 본 명세서에 제시된 발견으로 Notch4가 주요 Notch 수용체로서 이를 통해 알레르기성 기도 염증을 상향조절하는데 UFP-매개된 효과를 나타냄을 확인했다. Notch4 억제는 알레르겐-특이적 T 세포의 상이한 Th 세포 서브세트로의 UFP 및 AM-의존성 시험관내 분화에 대한 효과적이고 일정한 억제를 제공했다. 대조적으로, Notch1 및 Notch2를 포함하는, 다른 Notch 수용체의 억제는 Th 세포 사이토카인 발현의 선택적 및/또는 부분적 억제를 제공했다. Notch4 억제는 또한 마우스에서 UFP에 의한 알레르기성 기도 염증의 악화를 억제했다. NOTCH4 유전자좌는 이전에 중증 천식과 관련지어져 왔으며⁵⁴, 이는 이 경로가, 특히 UFP와 같은 환경적 노출과 관련되어 있기 때문에, 질병 중증도를 조절할 수 있음을 나타낸다.

AM 상에서 발현된 Jag1은 다른 Notch 수용체에 비해 Notch4와 우선적으로 상호작용할 수 있다. 대안적으로 또는 병행하여, Notch4는 Notch 표준 및 비표준 신호전달 메커니즘을 통해 다른 Notch 수용체와 비교하여, Th 세포 사이토카인의 생산을 차등적으로 증폭시키는 역할을 할 수 있거나, 이들의 특이적 생산을 지시할 수 있다^53,55. Notch4 신호전달은 또한 iTreg 세포의 분화를 불안정하게 하여, Th 세포 사이토카인의 생산을 야기했다. 이러한 iTreg 세포 표현형은 감소된 억제 기능 및 계통 불안정성과 연관되어 있으며, 이는 잠재적으로 Treg 세포의 Th 세포 계통으로의 최종적 분화를 야기한다^{30, 56}. 알레르기 기도 염증에서 Th와 Treg 세포 집단의 상이한 Natch 수용체들의 차별화되고, 전용적인 기능은 표적 치료적 개입의 기회를 제공할 수 있다. 마지막으로, T 세포를 표적화하는 것 외에도, 중화 Notch4 mAb는, 기도 염증 반응을 동원하는 데 관여하는, 혈관 내피와 같은, 추가 세포 요소를 조절하는 역할을 할 수 있다^{57, 58}.

참고문헌

1. Brandt EB, Myers JM, Ryan PH, Hershey GK. Air pollution and allergic diseases. Curr Opin Pediatr 2015; 27:724-35.

2. Bowatte G, Lodge C, Lowe AJ, Erbas B, Perret J, Abramson MJ, et al. The influence of childhood traffic-related air pollution exposure on asthma, allergy and sensitization: a systematic review and a meta-analysis of birth cohort studies. Allergy 2015; 70:245-56.

3. Gehring U, Wijga AH, Hoek G, Bellander T, Berdel D, Bruske I, et al. Exposure to air pollution and development of asthma and rhinoconjunctivitis throughout childhood and adolescence: a population-based birth cohort study. Lancet Respir Med 2015; 3:933-42.

4. Adar SD, Filigrana PA, Clements N, Peel JL. Ambient Coarse Particulate Matter and Human Health: A Systematic Review and Meta-Analysis. Curr Environ Health Rep 2014; 1:258-74.

5. Khreis H, Kelly C, Tate J, Parslow R, Lucas K, Nieuwenhuijsen M. Exposure to traffic-related air pollution and risk of development of childhood asthma: A systematic review and meta-analysis. Environ Int 2017; 100:1-31.

6. Brunst KJ, Ryan PH, Brokamp C, Bernstein D, Reponen T, Lockey J, et al. Timing and Duration of Traffic-related Air Pollution Exposure and the Risk for Childhood Wheeze and Asthma. Am J Respir Crit Care Med 2015; 192:421-7.

7. Dockery DW, Pope CA, 3rd. Acute respiratory effects of particulate air pollution. Annu Rev Public Health 1994; 15:107-32.

8. Brunekreef B, Holgate ST. Air pollution and health. Lancet 2002; 360:1233-42.

9. Saxon A, Diaz-Sanchez D. Air pollution and allergy: you are what you breathe. Nat Immunol 2005; 6:223-6.

10. Nel A. Atmosphere. Air pollution-related illness: effects of particles. Science 2005; 308:804-6.

11. Diaz-Sanchez D, Dotson AR, Takenaka H, Saxon A. Diesel exhaust particles induce local IgE production in vivo and alter the pattern of IgE messenger RNA isoforms. J Clin Invest 1994; 94:1417-25.

12. Diaz-Sanchez D, Tsien A, Fleming J, Saxon A. Combined diesel exhaust particulate and ragweed allergen challenge markedly enhances human in vivo nasal ragweed-specific IgE and skews cytokine production to a T helper cell 2-type pattern. J Immunol 1997; 158:2406-13.

13. Li N, Harkema JR, Lewandowski RP, Wang M, Bramble LA, Gookin GR, et al. Ambient ultrafine particles provide a strong adjuvant effect in the secondary immune response: implication for traffic-related asthma flares. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2010; 299:L374-83.

14. Brandt EB, Kovacic MB, Lee GB, Gibson AM, Acciani TH, Le Cras TD, et al. Diesel exhaust particle induction of IL-17A contributes to severe asthma. J Allergy Clin Immunol 2013; 132:1194-204 e2.

15. Xia M, Viera-Hutchins L, Garcia-Lloret M, Noval Rivas M, Wise P, McGhee SA, et al. Vehicular exhaust particles promote allergic airway inflammation through an aryl hydrocarbon receptor-notch signaling cascade. J Allergy Clin Immunol 2015.

16. Oberdorster G. Pulmonary effects of inhaled ultrafine particles. Int Arch Occup Environ Health 2001; 74:1-8.

17. Brandt EB, Biagini Myers JM, Acciani TH, Ryan PH, Sivaprasad U, Ruff B, et al. Exposure to allergen and diesel exhaust particles potentiates secondary allergen-specific memory responses, promoting asthma susceptibility. J Allergy Clin Immunol 2015; 136:295-303 e7.

18. Hiraiwa K, van Eeden SF. Contribution of lung macrophages to the inflammatory responses induced by exposure to air pollutants. Mediators Inflamm 2013; 2013:619523.

19. Hardy CL, Lemasurier JS, Mohamud R, Yao J, Xiang SD, Rolland JM, et al. Differential uptake of nanoparticles and microparticles by pulmonary APC subsets induces discrete immunological imprints. J Immunol 2013; 191:5278-90.

20. Blank F, Stumbles PA, Seydoux E, Holt PG, Fink A, Rothen-Rutishauser B, et al. Size-dependent uptake of particles by pulmonary antigen-presenting cell populations and trafficking to regional lymph nodes. Am J Respir Cell Mol Biol 2013; 49:67-77.

21. Garbi N, Lambrecht BN. Location, function, and ontogeny of pulmonary macrophages during the steady state. Pflugers Arch 2017; 469:561-72.

22. Kopf M, Schneider C, Nobs SP. The development and function of lung-resident macrophages and dendritic cells. Nat Immunol 2015; 16:36-44.

23. Coleman MM, Ruane D, Moran B, Dunne PJ, Keane J, Mills KH. Alveolar macrophages contribute to respiratory tolerance by inducing FoxP3 expression in naive T cells. Am J Respir Cell Mol Biol 2013; 48:773-80.

24. Soroosh P, Doherty TA, Duan W, Mehta AK, Choi H, Adams YF, et al. Lung-resident tissue macrophages generate Foxp3+ regulatory T cells and promote airway tolerance. J Exp Med 2013; 210:775-88.

25. Duan W, So T, Croft M. Antagonism of airway tolerance by endotoxin/lipopolysaccharide through promoting OX40L and suppressing antigen-specific Foxp3+ T regulatory cells. J Immunol 2008; 181:8650-9.

26. Moon KA, Kim SY, Kim TB, Yun ES, Park CS, Cho YS, et al. Allergen-induced CD11b+ CD11c(int) CCR3+ macrophages in the lung promote eosinophilic airway inflammation in a mouse asthma model. Int Immunol 2007; 19:1371-81.

27. Miyata R, van Eeden SF. The innate and adaptive immune response induced by alveolar macrophages exposed to ambient particulate matter. Toxicol Appl Pharmacol 2011; 257:209-26.

28. de Haar C, Kool M, Hassing I, Bol M, Lambrecht BN, Pieters R. Lung dendritic cells are stimulated by ultrafine particles and play a key role in particle adjuvant activity. J Allergy Clin Immunol 2008; 121:1246-54.

29. Tachdjian R, Mathias C, Al Khatib S, Bryce PJ, Kim HS, Blaeser F, et al. Pathogenicity of a disease-associated human IL-4 receptor allele in experimental asthma. J Exp Med 2009; 206:2191-204.

30. Massoud AH, Charbonnier LM, Lopez D, Pellegrini M, Phipatanakul W, Chatila TA. An asthma-associated IL4R variant exacerbates airway inflammation by promoting conversion of regulatory T cells to TH17-like cells. Nat Med 2016; 22:1013-22.

31. Walisser JA, Glover E, Pande K, Liss AL, Bradfield CA. Aryl hydrocarbon receptor-dependent liver development and hepatotoxicity are mediated by different cell types. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102:17858-63.

32. Clausen BE, Burkhardt C, Reith W, Renkawitz R, Forster I. Conditional gene targeting in macrophages and granulocytes using LysMcre mice. Transgenic Res 1999; 8:265-77.

33. Mancini SJ, Mantei N, Dumortier A, Suter U, MacDonald HR, Radtke F. Jagged1-dependent Notch signaling is dispensable for hematopoietic stem cell self-renewal and differentiation. Blood 2005; 105:2340-2.

34. Shirmohammadi F, Hasheminassab S, Saffari A, Schauer JJ, Delfino RJ, Sioutas C. Fine and ultrafine particulate organic carbon in the Los Angeles basin: Trends in sources and composition. Sci Total Environ 2016; 541:1083-96.

35. Murata A, Yoshino M, Hikosaka M, Okuyama K, Zhou L, Sakano S, et al. An evolutionary-conserved function of mammalian notch family members as cell adhesion molecules. PLoS One 2014; 9:e108535.

36. Blaeser F, Bryce PJ, Ho N, Raman V, Dedeoglu F, Donaldson DD, et al. Targeted inactivation of the IL-4 receptor alpha chain I4R motif promotes allergic airway inflammation. J Exp Med 2003; 198:1189-200.

37. Ford JG, Rennick D, Donaldson DD, Venkayya R, McArthur C, Hansell E, et al. Il-13 and IFN-gamma: interactions in lung inflammation. J Immunol 2001; 167:1769-77.

38. McMillan SJ, Xanthou G, Lloyd CM. Manipulation of allergen-induced airway remodeling by treatment with anti-TGF-beta antibody: effect on the Smad signaling pathway. J Immunol 2005; 174:5774-80.

39. Li N, Wang M, Bramble LA, Schmitz DA, Schauer JJ, Sioutas C, et al. The adjuvant effect of ambient particulate matter is closely reflected by the particulate oxidant potential. Environ Health Perspect 2009; 117:1116-23.

40. Li N, Georas S, Alexis N, Fritz P, Xia T, Williams MA, et al. A work group report on ultrafine particles (American Academy of Allergy, Asthma & Immunology): Why ambient ultrafine and engineered nanoparticles should receive special attention for possible adverse health outcomes in human subjects. J Allergy Clin Immunol 2016; 138:386-96.

41. Whitekus MJ, Li N, Zhang M, Wang M, Horwitz MA, Nelson SK, et al. Thiol antioxidants inhibit the adjuvant effects of aerosolized diesel exhaust particles in a murine model for ovalbumin sensitization. J Immunol 2002; 168:2560-7.

42. Misharin AV, Morales-Nebreda L, Mutlu GM, Budinger GR, Perlman H. Flow cytometric analysis of macrophages and dendritic cell subsets in the mouse lung. Am J Respir Cell Mol Biol 2013; 49:503-10.

43. Jablonski KA, Amici SA, Webb LM, Ruiz-Rosado Jde D, Popovich PG, Partida-Sanchez S, et al. Novel Markers to Delineate Murine M1 and M2 Macrophages. PLoS One 2015; 10:e0145342.

44. Mantovani A, Sica A, Sozzani S, Allavena P, Vecchi A, Locati M. The chemokine system in diverse forms of macrophage activation and polarization. Trends Immunol 2004; 25:677-86.

45. Katakura T, Miyazaki M, Kobayashi M, Herndon DN, Suzuki F. CCL17 and IL-10 as effectors that enable alternatively activated macrophages to inhibit the generation of classically activated macrophages. J Immunol 2004; 172:1407-13.

46. Merad M, Sathe P, Helft J, Miller J, Mortha A. The dendritic cell lineage: ontogeny and function of dendritic cells and their subsets in the steady state and the inflamed setting. Annu Rev Immunol 2013; 31:563-604.

47. Abram CL, Roberge GL, Hu Y, Lowell CA. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J Immunol Methods 2014; 408:89-100.

48. Charbonnier LM, Wang S, Georgiev P, Sefik E, Chatila TA. Control of peripheral tolerance by regulatory T cell-intrinsic Notch signaling. Nat Immunol 2015; 16:1162-73.

49. Moriyama Y, Sekine C, Koyanagi A, Koyama N, Ogata H, Chiba S, et al. Delta-like 1 is essential for the maintenance of marginal zone B cells in normal mice but not in autoimmune mice. Int Immunol 2008; 20:763-73.

50. Holt PG, Oliver J, Bilyk N, McMenamin C, McMenamin PG, Kraal G, et al. Downregulation of the antigen presenting cell function(s) of pulmonary dendritic cells in vivo by resident alveolar macrophages. J Exp Med 1993; 177:397-407.

51. Blumenthal RL, Campbell DE, Hwang P, DeKruyff RH, Frankel LR, Umetsu DT. Human alveolar macrophages induce functional inactivation in antigen-specific CD4 T cells. J Allergy Clin Immunol 2001; 107:258-64.

52. Chelen CJ, Fang Y, Freeman GJ, Secrist H, Marshall JD, Hwang PT, et al. Human alveolar macrophages present antigen ineffectively due to defective expression of B7 costimulatory cell surface molecules. J Clin Invest 1995; 95:1415-21.

53. Bailis W, Yashiro-Ohtani Y, Fang TC, Hatton RD, Weaver CT, Artis D, et al. Notch simultaneously orchestrates multiple helper T cell programs independently of cytokine signals. Immunity 2013; 39:148-59.

54. Hirota T, Takahashi A, Kubo M, Tsunoda T, Tomita K, Doi S, et al. Genome-wide association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in the Japanese population. Nat Genet 2011; 43:893-6.

55. Tindemans I, Peeters MJW, Hendriks RW. Notch Signaling in T Helper Cell Subsets: Instructor or Unbiased Amplifier? Front Immunol 2017; 8:419.

56. Komatsu N, Okamoto K, Sawa S, Nakashima T, Oh-hora M, Kodama T, et al. Pathogenic conversion of Foxp3+ T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nat Med 2014; 20:62-8.

57. Uyttendaele H, Closson V, Wu G, Roux F, Weinmaster G, Kitajewski J. Notch4 and Jagged-1 induce microvessel differentiation of rat brain endothelial cells. Microvasc Res 2000; 60:91-103.

58. Miniati D, Jelin EB, Ng J, Wu J, Carlson TR, Wu X, et al. Constitutively active endothelial Notch4 causes lung arteriovenous shunts in mice. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2010; 298:L169-77.

실시예 2

T 헬퍼 세포 분화의 Notch 신호전달. 면역 세포에서, Notch는 다양한 T 세포 계통의 발달 및 분화의 여러 단계에서 활성화된다^2,3. 예를 들어, 무경험 CD8+ T 세포의 활성화는 Notch1 또는 Notch2에 의한 항원-제시 세포 상에 DLL1의 결합을 필요로하며, 에오메스(Eomes), 그랜자임(Granzyme) B 및 IFNγ의 발현을 야기한다. Norch 신호전달은 또한 T 헬퍼(Th) 세포 서브셋의 분화를 유도한다^2,3. 무경험 CD4+ T 세포에서, DLL1 및 DLL4는 Th1 세포 전사 조절 인자인 T-bet을 코딩하는, Tbx21의 Notch 신호 및 전사를 활성화한다. Th2 세포의 분화 동안, Jagged1 및 Jagged2에 의한 Notch1 및 Notch2의 활성화는 GATA3 및 IL-4의 발현을 선호한다. Notch1 신호전달은 RORγt 및 IL-9의 발현을 촉진함으로써 헬퍼 T 세포의 Th17 및 Th9 서브셋의 분화에 중요한 것으로 보고되어 있다^4,5.

마우스에서의 연구로, γ-세크레타제 억제제를 사용한, Notch 가공, 또는 우성 음성 MAML1이 있는 CD4+ T 세포에서의 Notch 기능의 억제가 위장관 연충(gastrointestinal helminth)인, 트리추리스 뮤리스(Trichuris muris)와 알레르겐 공격에 대한 폐 알레르기 반응에 대한 보호 Th2 면역력을 감소시킬 뿐만 아니라 Th1-매개된 염증을 억제하는 것을 밝혀냈다⁶. 또한 최근 연구는 Treg 분화 및 기능에서 Notch 신호전달의 역할에 초점을 맞추어 왔다. Treg 세포에서 Notch 신호전달의 억제는 초(super) 조절 표현형을 유도하는 것으로 보이며, Foxp3+ T 세포에서 RBPJ 또는 Notch1 또는 Pofut1의 표적화된 손실을 지닌 마우스는 치명적인 GvHD로부터 보호된다. 대조적으로, Notch1, N1c의 구성적 활성 형태를 과발현하는 Treg 세포는 Treg 세포를 보다 Th1-유사한 표현형으로 극성화하여, 자가면역 표현형을 유도하는 것으로 보인다. 알레르기 기도 염증을 부정적으로 조절하는 데 있어서 Notch 신호전달의 역할은 거의 알려져 있지 않다. 아래에 자세히 설명된 바와 같이, 본 발명자들의 연구는 기도 염증을 촉진하는 데 있어서 Notch4의 유도성 Treg 세포-특이적 발현의 중요한 역할을 밝혀냈다. 이 경로의 특성과 치료적 개입의 표적으로서의 잠재력이 본 제안의 주제이다.

혁신

기도 염증에서 Notch4 신호전달의 역할의 발견은 천식에서 치료적 개입의 표적으로서 유망한, 지금까지 인식되지 못한 질병 발병기전에서의 새로운 경로를 정의한다. 더욱이, 본 명세서에 제시된 데이터를 통해, 이 경로가 주로 기도 염증에서 Treg 세포 기능을 무력화시키는 작용을 한다는 것에 대한 입증은 이의 표적화가 효과적인 알레르겐-특이적 Treg 세포 반응 및 가능한 장기간의 면역관용(tolerogenic) 효과를 허용할 것임을 시사한다. 인간 천식에서 Notch4 역할의 범위와 이 경로가 어떻게 Treg 세포 하위집단을 표적화하여 이들의 기능을 무력화시키는지에 대한 자세한 내용이 본 명세서에 기재되어 있다.

Treg 세포에서 노치 신호전달은 기도 염증에 악영향을 미친다.

말초 내성을 제어하는 데 있어서 Treg 세포-내인성 Notch 신호전달에 대한 부정적 기능은 이전에 설명되었다⁸. 기도 염증에서 Treg 세포에서 Notch 신호전달의 역할을 결정하기 위해, Foxp3 유전자 구동 Cre 재조합효소(Foxp3 ^GFPCre Pofut1 ^Δ/Δ )를 사용하여 효소 Pofut1을 코딩하는 유전자의 세포 계통-특이적 결실에 의해 Notch 신호전달이 Treg 세포에서 특이적으로 비활성화된 마우스를 채용했다⁸. Pofut1은 Notch 수용체의 o-푸코실화를 매개하는데, 이는 이들의 글리코실화에 필수적인 사건이며 이들의 기능에 필수적이다⁹. 이의 결핍은 모든 Notch 수용체를 통한 신호 전달을 폐기시킨다¹⁰. OVA로 감작되고 공격된 Foxp3 ^GFPCre Pofut1 ^Δ/Δ 마우스는 유사하게 감작되고 공격된 Pofut1-충분 대조군 Foxp3 ^GFPCre 마우스와 비교하여 현저하게 감소된 조직 염증 및 기도 과민반응(AHR), 폐 조직 호산구증가증 및 호중구증가증(neutorphilia), 총 및 OVA 특이 적 IgE 반응, 폐 조직 Th2 및 Th17 세포 침윤을 나타냈다(도 22A-22H). 다른 Foxp3-구동 Cre 재조합효소(Foxp3 ^YFPCre ; 데이터는 미제시)를 사용한 경우에 유사한 결과가 확인되었다.

기도 염증에서 Treg 세포에 대한 Notch 신호전달의 효과를 매개하는 데 있어서 표준 경로 대 비표준 경로의 역할을 결정하기 위해, 기도 반응에 대한 Treg 세포에서, 표준 Notch 인자 RBPJ를 코딩하는, Rbpj의 결실에 따른 영향을 조사했다^8,11. 그 결과 Rpbj의 Treg 세포 특이적 결실을 지니는 마우스(Foxp3 ^YFPCre Rpbj ^Δ/Δ )가 Foxp3 ^Cre Pofut1 ^Δ/Δ 및 Foxp3 ^YFPCre 마우스 사이에 위치하는 감소된 AHR 및 조직 호산구증가증의 중간 표현형을 나타내는 것으로 드러났다(도 22A-22H). 중요하게도, RBPJ-결핍된 Treg 세포는 기도 호산구증가증을 억제했지만 호중구증가증을 억제하지 못했으며 Th2는 억제했지만 Th17 세포 반응은 억제하지 못했으며, 이는 기도 Th17 세포 반응을 제어하기 위한 Treg 세포-특이적 표준(RBPJ-의존적) Notch 신호전달이 필요함을 나타낸다. 기도 염증에서 Treg 세포 기능을 조절하는 데 있어서 개별 Notch 수용체의 역할을 조사했다. Treg 세포에서 Notch1 결실이 Th1 반응의 조절을 가능하게 한다는 것이 이전에 발견되었지만⁸, 플록스된(floxed) Notch1 또는 Notch2 대립유전자의 Treg 세포-특이적 결실은 알레르기성 기도 염증에 영향을 미치지 않았다(도 22A-22H). 따라서, Treg 세포에서 Notch 표준 및 비표준 경로 둘 모두가, Notch3 및/또는 Notch4 신호전달을 통해, 알레르기성 기도 염증을 촉진할 공산이 가장 크다(도 23을 또한 참조).

마지막으로, Treg 세포-특이적 Pofut1 결실은 OVA 단독의 경우와 유사한 방식으로 UFP에 의한 OVA-유도된 알레르기 기도 염증의 악화를 아주 많이 억제했다(도 23), 다시, Treg 세포-특이적 Rbpj 결실은 중간 표현형을 제공하였으며, 한편 Notch1 결실은 효과가 없었다. 각각의 마우스 균주에서 Th 세포 사이토카인 발현은도 22A-22H에서 관찰된 것과 유사했다. 이러한 결과는 Treg 세포에서 Notch 신호전달의 활성화가 알레르겐과 PM에 의해 공유되는 기도 염증을 촉진하는 일반적인 메커니즘임을 나타낸다(도 23).

Notch4는 기도 염증에서 Treg 세포 반응을 제어한다.

Notch1/Notch2는 T 세포에서 발현되는 우세한 수용체인 것으로 보이지만, Notch1 또는 Notch2 KO 동물의 표현형뿐만 아니라 g-세크레타제 억제제의 관찰된 독성은 염증성 질환에 관한 이러한 축(axes)에 대한 임상적 개입을 제한했다. 대조적으로 Notch4 KO 마우스의 표현형은 현저하게 양성(benign)이며, 몇 가지 데이터는 발달 및 생리학에서 이 수용체에 대한 설득력있는 역할을 뒷받침한다. 샤틸라(Chatila) 실험실에서 최근에 발표한 데이터에 따르면 기도의 알레르겐 공격에 대한 반응으로 단독으로 또는 차량 연소 엔진에 의해 생성된 주변 초미세입자 물질(UFP)과의 시너지 효과로 OVA/UFP 공격 Notch 4 발현이 폐 거주 Treg 세포에서 우선적으로 상승하는 것으로 나타나는데, 이는 GATA3 발현과 기도 염증에 필수적인 역할을 하는 Th2 세포-유사 표현형을 유도한다.

연소 엔진에 의해 생성된 초미세입자(UFP)(및 또한 더 거친 미립자)는 폐의 항원 제시 세포에 Jag1(Jagged 1) 발현을 유도하여 알레르기 기도 염증을 촉진하는 것으로 이전에 밝혀졌다¹². Jag1은 차례로 알레르기 항원 특이적 T 세포 상의 Notch 수용체와 상호작용하여 알레르기성 기도 염증을 악화시킨다.

UFP의 작용 부위로서 폐포 대식세포의 확인은 특별히 관심의 대상이었으며, 이러한 세포 유형이 기도에서 알레르겐-특이적 Treg 세포의 유도를 매개하기 때문이다¹³. 이 발견은 UFP에 의한 염증 반응의 악화에 대한 근본적인 메카니즘으로서 Treg 세포의 손상을 시사했다. Treg 세포에서 Notch1 또는 Notch2의 결실은 알레르겐 오발부민(OVA)으로의 감작 및 이의 단독으로 또는 UFP와 함께 공격에 의해 유도된 기도 염증에 영향을 미치지 않는 반면, Pofut1, 즉 그들의 신호전달 기능에 필수적인 Notch 푸코실화 효소의 결실은 알레르겐 및 UFP-유도 기도 염증 둘 다를 거의 완전히 폐기했다. 기도 염증의 OVA 모델을 사용하여 샴 감작시킨 것들과 비교하여 OVA-감작되고 OVA 또는 OVA+UFP로 공격한 마우스의 세포-분류된 폐 상주 CD4⁺Foxp3⁺ Treg 세포 및 CD4⁺Foxp3^-Tconv 세포에서 Notch1-4 전사체를 조사했다. 결과는 Notch4 전사체가 폐 상주 CD4⁺Foxp3⁺ Treg 세포에서 현저하게 상향조절되었지만 OVA-감작되고 OVA 또는 특히 OVA+UFP로 공격한 마우스의 CD4⁺Foxp3^- Tconv 세포에서는 그렇지 않은 것으로 드러났다(도 24A). 대조적으로, 다른 Notch 수용체의 전사체는 Notch4의 전사체와 비교하여 변하지 않았거나 약간 증가했다(데이터는 제시하지 않음). 항-Notch4 mAb로 염색으로, Treg 세포에 대한 Notch4 발현이 상주 Treg 세포에서 유사하게 상향조절되었지만 OVA 및 OVA+UFP 처치된 마우스의 상주 Tconv 세포에서는 단지 미미하게 상향조절된 것으로 드러났다(도 24B-24C).

기도 염증에서 Treg 세포에서 Notch4 상향조절의 기능적 중요성을 Foxp3-구동 Cre 재조합효소(Foxp3 ^YFPCre)를 사용하여 Treg 세포에서 플록스된 Notch4 대립유전자가 특이적으로 결실된 유전자 마우스 모델을 사용하여 조사했다. Treg 세포에서 Notch4가 결실된 OVA-감작된 마우스(Foxp3 ^YFPCre Notch4^Δ/Δ)는, Notch4-충분 Treg 세포를 지닌 마우스와 비교하여, OVA로 감작시킨 다음 OVA 또는 OVA/UFP로 공격한 경우, 기도 내성, 조지 염증, 호산구증가증 및 OVA-특이적 IgE 반응 감소와 함께, 현저하게 약화된 기도 염증 반응이 나타났다(도 23). Foxp3 ^YFPCre Notch4^Δ/Δ마우스의 약화된 기도 염증 반응은 본 발명자들이 이전에 Foxp3 ^YFPCre Pofut1 ^Δ/Δ 마우스에 대한 연구 제안서에서 밝힌 것과 유사했으며, Treg 세포에서의 Notch 신호전달은 푸코실화 효소 Pofut1의 결핍으로 인해 폐기되었으며, 이는 모든 면역 조절이상 효과가 기도 염증에 있어서 Treg 세포에서의 Notch 신호전달에 의한 것은 아니더라도, Notch4를 통한 신호전달이 대부분을 차지했음을 나타낸다. 중요하게는, OVA 또는 OVA/UFP에 의해 유도된 기도 염증은 Treg 세포에서 Notch4 결실시 동일한 수준으로 낮아졌으며, 이는 Notch4 신호전달이 알레르겐 및 UFP-매개 기도 염증과 관련된 공통 경로임을 시사한다. 폐포 대식세포에서 Jag1 결실은 UFP에 의한 기도 염증의 증강을 폐기시켰으나, 알레르겐 유도된 기도 염증에 매우 미미한 영향을 미쳤으며, 이는 현재 그 정체를 조사하고 있는 OVA에 의해 유도된, 다른 Notch 리간드와, UFP에 의해 유도된 다른 하나인 Jag1이 Tre 세포에서 Notch4와 상호작용하여 기도 염증을 매개함을 시사한다.

전반적으로, 본 명세서에 제시된 이러한 결과는 Notch4가 알레르겐 및 주변 미립자 물질 오염물질 둘 다에 공통적인 알레르기성 염증을 유발하는 중요한 경로이며, 조직 Treg 세포에 소성 변화(plastic changes)에 영향을 미쳐, 알레르겐에 대한 내성 상실을 야기시키는 작용을 한다는 것을 나타낸다. 또한, 소아 중증 천식 환자에 대한 예비 데이터는 Notch4 발현이 정상적인 건강한 대조군과 비교하여 말초 혈액 Treg 세포에서 상승했음을 나타냈으며, 이는 천식 환자에서 질병의 바이오 마커와 치료적 목적 둘 다에 관해 모니터링할 수 있는 누출(spill-over) 효과를 나타낸다. 종합하면, 이러한 데이터는 Notch4를 표적으로 삼는 것이 천식을 지닌 환자의 정상적인 기도 항상성을 회복시키고 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 다른 질병으로 확장될 가능성이 있는 접근 방식일 수 있음을 시사한다.

참고문헌

1. Siebel, C. & Lendahl, U. Notch Signaling in Development, Tissue Homeostasis, and Disease. Physiol Rev 97, 1235-1294 (2017).

2. Amsen, D., Helbig, C. & Backer, R.A. Notch in T Cell Differentiation: All Things Considered. Trends Immunol 36, 802-814 (2015).

3. Tindemans, I., Peeters, M.J.W. & Hendriks, R.W. Notch Signaling in T Helper Cell Subsets: Instructor or Unbiased Amplifier? Frontiers in immunology 8, 419 (2017).

4. Meyer Zu Horste, G., et al. RBPJ Controls Development of Pathogenic Th17 Cells by Regulating IL-23 Receptor Expression. Cell reports 16, 392-404 (2016).

5. Elyaman, W., et al. Notch receptors and Smad3 signaling cooperate in the induction of interleukin-9-producing T cells. Immunity 36, 623-634 (2012).

6. Tu, L., et al. Notch signaling is an important regulator of type 2 immunity. J Exp Med 202, 1037-1042 (2005).

7. Hirota, T., et al. Genome-wide association study identifies three new susceptibility loci for adult asthma in the Japanese population. Nat Genet 43, 893-896 (2011).

8. Charbonnier, L.M., Wang, S., Georgiev, P., Sefik, E. & Chatila, T.A. Control of peripheral tolerance by regulatory T cell-intrinsic Notch signaling. Nat Immunol 16, 1162-1173 (2015).

9. Stanley, P. & Guidos, C.J. Regulation of Notch signaling during T- and B-cell development by O-fucose glycans. Immunol Rev 230, 201-215 (2009).

10. Shi, S. & Stanley, P. Protein O-fucosyltransferase 1 is an essential component of Notch signaling pathways. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 5234-5239 (2003).

11. Han, H., et al. Inducible gene knockout of transcription factor recombination signal binding protein-J reveals its essential role in T versus B lineage decision. Int Immunol 14, 637-645 (2002).

12. Xia, M., et al. Vehicular exhaust particles promote allergic airway inflammation through an aryl hydrocarbon receptor-notch signaling cascade. J Allergy Clin Immunol (2015).

13. Soroosh, P., et al. Lung-resident tissue macrophages generate Foxp3+ regulatory T cells and promote airway tolerance. J Exp Med 210, 775-788 (2013).

SEQUENCE LISTING <110> THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER CORPORATION <120> METHOD FOR TREATING ASTHMA OR ALLERGIC DISEASE <130> 701039-091780WOPT <140> PCT/US2019/022493 <141> 2019-03-15 <150> 62/659,379 <151> 2018-04-18 <150> 62/652,630 <151> 2018-04-04 <150> 62/643,476 <151> 2018-03-15 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5912 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcagcccc cttcactgct gctgctgctg ctgctgctgc tgctgctatg tgtctcagtg 60 gtcagaccca gagggctgct gtgtgggagt ttcccagaac cctgtgccaa tggaggcacc 120 tgcctgagcc tgtctctggg acaagggacc tgccagtgtg cccctggctt cctgggtgag 180 acgtgccagt ttcctgaccc ctgccagaac gcccagctct gccaaaatgg aggcagctgc 240 caagccctgc ttcccgctcc cctagggctc cccagctctc cctctccatt gacacccagc 300 ttcttgtgca cttgcctccc tggcttcact ggtgagagat gccaggccaa gcttgaagac 360 ccttgtcctc cctccttctg ttccaaaagg ggccgctgcc acatccaggc ctcgggccgc 420 ccacagtgct cctgcatgcc tggatggaca ggtgagcagt gccagcttcg ggacttctgt 480 tcagccaacc catgtgttaa tggaggggtg tgtctggcca cataccccca gatccagtgc 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Claims

유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환의 치료 방법.
하기를 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환의 치료 방법:
a. 천식 또는 알레르기성 질환을 앓고 있는 대상체를 확인하는 단계; 및
b. 유효량의 Notch4를 억제하는 작용제를 천식 또는 알레르기성 질환에 걸린 대상체에게 투여하는 단계.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 천식이 알레르기성 천식, 알레르기 없는 천식, 아스피린 악화 호흡기 질환, 운동 유발 천식, 기침 변이, 및 직업성 천식으로 이루어진 목록에서 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 알레르기성 질환이 알레르기성 비염, 부비동염, 중이염, 아토피성 피부염, 두드러기, 혈관부종, 및 아나필락시스로 이루어진 목록에서 선택되는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 Notch4를 억제하는 작용제가 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템(genome editing system), 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인 방법.
제5항에 있어서, 상기 RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Notch4를 억제하는 것이 Notch4의 발현 수준 및/또는 활성을 억제하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 Notch4의 발현 수준 및/또는 활성이 적절한 대조군과 비교하여 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 또는 그 이상 억제되는 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, Notch4가 T 조절 세포 상에서 억제되는 방법.
제1항 및 제2항에 있어서, 적어도 하나의 추가 항-천식 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항 및 제2항에 있어서, 적어도 하나의 추가 항-알레르기성 질환 치료제를 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는, 천식 또는 알레르기성 질환의 예방 방법.
제13항에 있어서, 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 확인하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
Notch4를 억제하는 작용제 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 천식 또는 알레르기성 질환 치료용 조성물.
제15항에 있어서, 상기 Notch4를 억제하는 작용제는 소분자, 항체, 펩티드, 게놈 편집 시스템, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 RNAi로 이루어진 군에서 선택되는 것인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 항체가 인간화 항체인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 RNAi가 마이크로RNA, siRNA, 또는 shRNA인 조성물.
제15항에 있어서, 상기 조성물은 흡입 투여용으로 제형화되는 것인 조성물.
천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 대상체를 치료하는 방법으로서,
a. 대상체로부터 생물학적 샘플을 획득하는 단계;
b. 후보 세포 집단에서 Notch4 수준을 측정하는 단계로서, 여기서 대상체는 참조 수준과 비교하여 Notch 수준이 증가하면 천식 또는 알레르기성 질환에 걸릴 위험이 있는 것인 단계; 및
c. 위험에 처한 대상체에게 Notch4를 억제하는 작용제를 투여하는 단계를 포함하는 방법.
제20항에 있어서, 상기 Notch4의 수준이 참조 수준과 비교하여 적어도 2배, 적어도 3배, 적어도 4배, 적어도 5배, 적어도 6배, 적어도 7배, 적어도 8배, 적어도 9배, 적어도 10배, 또는 그 이상 증가하는 방법.
천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체의 치료에서 치료제의 효능을 결정하는 방법으로서,
d) 치료제의 투여 전에 천식 또는 알레르기성 질환으로 진단된 대상체에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제1 수준을 결정하는 단계;
e) 상기 치료제 투여 후 환자에 의해 제공된 샘플에서 Notch4 발현 또는 활성의 제2 수준을 결정하는 단계; 및
f) Notch4 발현 또는 활성의 상기 제1 및 제2 수준을 비교하는 단계로서, 여기서 상기 치료제는 Notch4 발현 또는 활성의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준보다 낮으면 유효한 것으로 간주되고, 여기서 (b)에서 투여되는 치료제는 Notch4 발현의 상기 제2 수준이 상기 제1 수준과 동일하거나 그 보다 더 높으면 유효하지 않은 것인 단계를 포함하는, 방법.
제22항에 있어서, 상기 치료제가 Notch4를 억제하는 작용제인 방법.