KR20200128717A - 단백질 제형을 위한 부형제 화합물 - Google Patents

단백질 제형을 위한 부형제 화합물 Download PDF

Info

Publication number
KR20200128717A
KR20200128717A KR1020207028505A KR20207028505A KR20200128717A KR 20200128717 A KR20200128717 A KR 20200128717A KR 1020207028505 A KR1020207028505 A KR 1020207028505A KR 20207028505 A KR20207028505 A KR 20207028505A KR 20200128717 A KR20200128717 A KR 20200128717A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
protein
formulation
excipient
therapeutic
stability
Prior art date
Application number
KR1020207028505A
Other languages
English (en)
Other versions
KR102493469B1 (ko
Inventor
데이비드 에스. 소앤
필립 우쓰리치
로버트 피. 마호니
수바시찬드라 나익
티모시 트란
로사 카라도 포틸라
다니엘 쥐. 그린
Original Assignee
리폼 바이오로직스, 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 리폼 바이오로직스, 엘엘씨 filed Critical 리폼 바이오로직스, 엘엘씨
Priority to KR1020237002910A priority Critical patent/KR20230018549A/ko
Publication of KR20200128717A publication Critical patent/KR20200128717A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102493469B1 publication Critical patent/KR102493469B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/14—Esters of carboxylic acids, e.g. fatty acid monoglycerides, medium-chain triglycerides, parabens or PEG fatty acid esters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A61K47/183—Amino acids, e.g. glycine, EDTA or aspartame
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/20—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing sulfur, e.g. dimethyl sulfoxide [DMSO], docusate, sodium lauryl sulfate or aminosulfonic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/22—Heterocyclic compounds, e.g. ascorbic acid, tocopherol or pyrrolidones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/32—Macromolecular compounds obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. carbomers, poly(meth)acrylates, or polyvinyl pyrrolidone
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6845—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a cytokine, e.g. growth factors, VEGF, TNF, a lymphokine or an interferon
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C07K16/065—Purification, fragmentation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/42—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins
    • C07K16/4283—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig
    • C07K16/4291—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against immunoglobulins against an allotypic or isotypic determinant on Ig against IgE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

치료 단백질 및 안정성 개선량의 안정화 부형제를 포함하는 안정성 향상 제형이 본원에 개시되며, 여기서 안정성 향상 제형은 상기 안정성 향상 제형과 다른 면에서는 동일하나 안정화 부형제가 결여된 대조군 제형과 비교하여 개선된 안정성 파라미터를 특징으로 한다. 치료 제형의 안정성을 개선시키거나, 단백질-관련 공정의 파라미터를 개선시키는 방법이 본원에 추가로 개시된다.

Description

단백질 제형을 위한 부형제 화합물
관련 출원
본 출원은 2018년 3월 7일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/639,950호 및 2018년 6월 1일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/679,647호의 이익을 주장한다. 상기 출원 각각의 전체 내용은 참조로서 본원에 포함된다.
출원 분야
본 출원은 일반적으로 안정화 부형제를 갖는 단백질 제형과 같은 생체중합체 제형에 관한 것이다.
생체중합체는 치료적 또는 비-치료적 목적에 사용될 수 있다. 단백질, 항체 또는 효소를 포함하는 제형과 같은 생체중합체 기반 치료제는 질병 치료에 널리 사용된다. 효소, 펩티드 또는 구조 단백질을 포함하는 제형과 같은 비-치료적 생체중합체는 가정, 영양, 상업 및 산업 용도와 같은 비-치료적 적용에서 유용하다.
특히 흥미로운 것은 치료적 및 비-치료적 용도를 위한 단백질 생체중합체이다. 단백질은 각각 고유하게 폴딩된 3-D 구조 및 표면 에너지 맵(소수성/친수성 영역 및 전하)을 갖는 복잡한 생체중합체이다. 농축된 단백질 용액에서, 이들 거대분자는 이들의 정확한 형태 및 표면 에너지 분포에 따라 복잡한 방식으로 강력하게 상호작용하고 심지어 상호 연결될 수 있다. 강한 특정 상호작용을 위한 "핫-스팟(hot-spot)"은 단백질 클러스터링을 유발하여 용액 점도를 증가시킨다. 이들 문제를 해결하기 위해, 국소화된 상호작용 및 클러스터링을 방해함으로써 용액 점도를 감소시키는 것을 목표로 하는 다수의 부형제 화합물이 생체치료 제형에 사용된다. 이들 노력은 개별적으로 맞춤화되고, 종종 경험적으로 이루어지며, 때로는 인 실리코 시뮬레이션에 의해 안내된다. 부형제 화합물의 조합물이 제공될 수 있지만, 상기 조합물을 다시 최적화하는 것은 경험적으로 그리고 사례별로 기초하여 진행되어야 한다.
치료 적용에 사용되는 단백질과 같은 생체중합체는 질병의 치료를 위해 체내에 도입되는 것이 허용되도록 제형화되어야 한다. 예를 들어, 항체 및 단백질/펩티드 생체중합체 제형을 정맥 내(IV) 주사로 투여하는 대신 특정 상황하에서 피하(SC) 또는 근육 내(IM) 경로에 의해 이들 제형을 전달하는 것이 유리하다. 그러나, SC 또는 IM 주사로 더 나은 환자 순응도 및 편안함을 달성하기 위해, 제형이 기존 의료 장치 및 작은 구멍 바늘을 사용하여 전달될 수 있도록 주사기의 액체 부피는 전형적으로 2 내지 3 mL로 제한되고, 제형의 점도는 전형적으로 약 20 센티푸아즈(cP)보다 낮다. 이들 전달 파라미터는 전달되는 제형에 대한 투여량 요구사항에 항상 잘 맞지는 않는다.
예를 들어, 항체는 이들의 의도된 치료 효과를 발휘하기 위해 고용량 수준으로 전달될 필요가 있을 수 있다. 고용량 수준의 항체 제형을 전달하기 위해 제한된 액체 부피를 사용하는 것은 전달 비히클에 고농도의 항체를 필요로 할 수 있으며, 때로는 150 mg/mL의 수준을 초과한다. 이러한 투여량 수준에서, 단백질 용액의 점도 대 농도 플롯은 선형-비선형 전이를 넘어서서 농도가 증가함에 따라 제형의 점도가 급격히 증가한다. 그러나, 증가된 점도는 표준 SC 또는 IM 전달 시스템과 상용되지 않는다. 생체중합체 기반 또는 단백질 기반 치료제의 용액은 또한 침전, 단편화, 산화, 탈아미드화, 헤이징(hazing), 단백광, 변성 및 젤 형성, 가역적 또는 비가역적 응집과 같은 안정성 문제에 취약하다. 안정성 문제는 용액의 저장 수명을 제한하거나, 특별한 취급을 필요로 한다.
주사용 단백질 제형을 생성하는 한 가지 접근법은 치료 단백질 용액을 SC 또는 IM 전달에 적합한 현탁액을 형성하기 위해 재구성될 수 있는 분말로 변환시키는 것이다. 동결건조는 단백질 분말을 생성하는 표준 기술이다. 동결-건조, 분무 건조 및 심지어 침전 후 초임계 유체 추출이 후속 재구성을 위한 단백질 분말을 생성시키는 데 사용되어 왔다. 분말화된 현탁액은 재용해 전에 점도가 낮으며(동일한 전체 용량의 용액에 비함), 따라서 입자가 바늘을 통과하기에 충분히 작은 경우 SC 또는 IM 주사에 적합할 수 있다. 그러나, 분말에 존재하는 단백질 결정은 면역 반응을 촉발하는 내재적 위험을 갖는다. 재용해 후 불확실한 단백질 안정성/활성은 추가 우려를 제기한다. 단백질 분말 현탁액에 의해 도입된 제한을 피하면서 치료 목적을 위해 저 점도 단백질 제형을 생성하는 기술에 대한 당 분야의 필요가 여전히 남아 있다.
항체-약물 컨쥬게이트(ADC)와 같은 보다 복잡한 항체 제형은 특히 점도 및 안정성 문제에 취약하다. ADC는 화학적 링커를 통해 모노클로날 항체(mAb)에 소분자 약물을 연결하며; mAb는 비정상적인 "표적 세포" 상의 특정 항원을 표적으로 하고, 소분자 약물은 상기 표적 세포에 대해 특정 효과를 갖도록 선택된다. mAb가 표적 세포 항원과 접촉하는 경우, mAb 및 이의 부착된 약물은 세포에 의해 섭취되고, 세포 내부로 진입한다. 세포 내부에서, mAb 및/또는 링커는 분해되어, 약물이 세포에 대한 이의 생물학적 효과를 발휘하도록 방출된다. 전형적으로, 약물은 전신 방출되기에는 너무 독성이 있는 화학요법제이다. ADC는 화학요법제를 이의 표적인 암세포와 직접 접촉시킨다. mAb에 대한 소분자의 이러한 부착은 치료 단백질 제형에 영향을 미치는 점도 및 안정성 문제를 악화시킬 수 있다. 페이로드 화합물은 전형적으로 소수성 소분자이며, 이는 약물-항체 비율이 증가함에 따라 더 큰 ADC의 안정성, 용해도 및 용액 상호작용 특성에 유의한 영향을 발휘할 수 있다. 제형의 높은 염 농도는 ADC 복합체 간의 소수성 상호작용을 증가시켜, ADC의 용해도를 컨쥬게이션되지 않은 항체보다 염 효과에 더 민감하게 만들 수 있다. ADC 용액의 처리 또는 저장은 특히 높은 약물 대 항체 비율(DAR)에서 ADC 종의 응집 또는 침전을 자극할 수 있다. 약물 컨쥬게이션은 또한 mAb, 특히 이의 Fc 도메인의 입체형태적 안정성에 영향을 미칠 수 있다. 또한, 약물 컨쥬게이션은 mAb의 순 표면 전하를 감소시켜 ADC의 용해도에 영향을 또한 미칠 수 있다.
상기 기재된 단백질의 치료적 적용에 더하여, 효소, 펩티드 및 구조 단백질과 같은 생체중합체는 비-치료적 적용에 사용될 수 있다. 이들 비-치료적 생체중합체는, 예를 들어, 식물 공급원, 동물 공급원에서 유래되거나, 세포 배양으로부터 생성되는 다수의 상이한 경로로부터 생성될 수 있다.
비-치료 단백질은 과립 또는 분말화된 물질 또는 일반적으로 물 중 용액 또는 분산액으로 생성되고, 수송되고, 저장되고, 취급될 수 있다. 비-치료적 적용을 위한 생체중합체는 구형 또는 섬유질 단백질일 수 있으며, 이들 물질의 특정 형태는 물에 제한된 용해도를 갖거나 용해시 높은 점도를 나타낼 수 있다. 이들 용액 특성은 비-치료적 물질의 제형화, 취급, 저장, 펌핑 및 성능에 문제를 일으킬 수 있으므로, 비-치료 단백질 용액의 점도를 감소시키고, 용해도 및 안정성을 개선시키는 방법이 필요하다.
특히, 높은 단백질 농도에서 단백질 제형의 점도를 감소시키고/시키거나 안정성을 개선시키기 위한 진정한 보편적인 접근법이 당 분야에 필요하다. 단백질의 활성을 보존하면서 이러한 점도 감소를 달성하기 위한 당 분야의 추가 필요가 존재한다. 조정 가능 및 지속 방출 프로파일을 갖는 제형과 함께 사용하고, 데포 주사에 적합화된 제형과 함께 사용하기 위해 점도 감소 시스템을 적합화시키는 것이 추가로 바람직할 것이다. 또한, 단백질 및 기타 생체중합체 생성을 위한 공정을 개선하는 것이 바람직하다.
구현예에서, 힌더드 아민(hindered amine), 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 다중산(polyacid)으로 구성된 군으로부터 선택되는 부형제 화합물 및 단백질을 포함하는 액체 제형이 본원에 개시되며, 상기 부형제 화합물은 점도 감소량으로 첨가된다. 구현예에서, 단백질은 PEG화된 단백질이고, 부형제는 저분자량 지방족 다중산이다. 구현예에서, 제형은 약학적 조성물이고, 치료 제형은 치료 단백질을 포함하며, 여기서 부형제 화합물은 약학적으로 허용되는 부형제 화합물이다. 구현예에서, 제형은 비-치료 제형이고, 비-치료 제형은 비-치료 단백질을 포함한다. 구현예에서, 점도 감소량은 제형의 점도를 대조군 제형의 점도보다 적은 점도로 감소시킨다. 구현예에서, 제형의 점도는 대조군 제형의 점도보다 적어도 약 10% 더 적거나, 대조군 제형의 점도보다 적어도 약 30% 더 적거나, 대조군 제형의 점도보다 적어도 약 50% 더 적거나, 대조군 제형의 점도보다 적어도 약 70% 더 적거나, 대조군 제형의 점도보다 적어도 약 90% 더 적다. 구현예에서, 점도는 약 100 cP 미만이거나, 약 50 cP 미만이거나, 약 20 cP 미만이거나, 약 10 cP 미만이다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da, 또는 <1500 Da, 또는 <500 Da의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 제형은 적어도 약 25 mg/mL의 단백질, 또는 적어도 약 100 mg/mL의 단백질, 또는 적어도 약 200 mg/mL의 단백질, 또는 적어도 약 300 mg/mL의 단백질을 함유한다. 구현예에서, 제형은 약 5 mg/mL 내지 약 300 mg/mL의 부형제 화합물을 포함하거나, 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 부형제 화합물을 포함하거나, 약 20 mg/mL 내지 약 100 mg/mL를 포함하거나, 약 25 mg/mL 내지 약 75 mg/mL의 부형제 화합물을 포함한다. 구현예에서, 제형은 대조군 제형과 비교하는 경우 개선된 안정성을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 힌더드 아민이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 카페인, 테오필린, 티라민, 프로카인, 리도카인, 이미다졸, 아스파탐, 사카린 및 아세설팜 포타슘으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 힌더드 아민은 카페인이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 국소 주사 가능한 마취제 화합물이다. 힌더드 아민은 독립적인 약리학적 특성을 가질 수 있고, 힌더드 아민은 독립적인 약리학적 효과를 갖는 양으로 제형에 존재할 수 있다. 구현예에서, 힌더드 아민은 치료적 유효량보다 적은 양으로 제형에 존재할 수 있다. 독립적인 약리학적 활성은 국소 마취 활성일 수 있다. 구현예에서, 독립적인 약리학적 활성을 갖는 힌더드 아민은 제형의 점도를 추가로 감소시키는 제2 부형제 화합물과 조합된다. 제2 부형제 화합물은 카페인, 테오필린, 티라민, 프로카인, 리도카인, 이미다졸, 아스파탐, 사카린 및 아세설팜 포타슘으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, 제형은 보존제, 계면활성제, 당, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 히알루로니다제, 안정화제 및 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 추가 제제를 포함할 수 있다.
포유동물에게 액체 치료 제형을 투여하는 것을 포함하는 포유동물의 질병 또는 장애를 치료하는 방법이 본원에 추가로 개시되며, 상기 치료 제형은 치료적 유효량의 치료 단백질을 포함하고, 상기 제형은 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 다중산으로 구성된 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용되는 부형제 화합물을 추가로 포함하고, 상기 치료 제형은 질병 또는 장애의 치료에 효과적이다. 구현예에서, 치료 단백질은 PEG화된 단백질이고, 부형제 화합물은 저분자량 지방족 다중산이다. 구현예에서, 부형제는 힌더드 아민이다. 구현예에서, 힌더드 아민은 국소 마취제 화합물이다. 구현예에서, 제형은 피하 주사 또는 근육 내 주사 또는 정맥 내 주사에 의해 투여된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 점도 감소량으로 치료 제형에 존재하고, 점도 감소량은 치료 제형의 점도를 대조군 제형의 점도보다 적은 점도로 감소시킨다. 구현예에서, 치료 제형은 대조군 제형과 비교하는 경우 개선된 안정성을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 본질적으로 순수하다.
주사에 의해 액체 치료 제형을 투여하는 것을 포함하는 치료 단백질의 주사 부위에서 통증을 감소시키는 것을 필요로 하는 동물에서 치료 단백질의 주사 부위에서 통증을 감소시키는 방법이 본원에 추가로 개시되며, 상기 치료 제형은 치료적 유효량의 치료 단백질을 포함하고, 상기 제형은 국소 주사 가능한 마취제 화합물로 구성된 군으로부터 선택되는 약학적으로 허용되는 부형제 화합물을 추가로 포함하고, 상기 약학적으로 허용되는 부형제 화합물은 점도 감소량으로 제형에 첨가되고, 상기 포유동물은 대조군 치료 제형의 투여보다 부형제 화합물을 포함하는 치료 제형의 투여로 덜한 고통을 경험하고, 상기 대조군 치료 제형은 부형제 화합물을 함유하지 않고 다른 면에서는 치료 제형과 동일하다.
구현예에서, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드 및 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 다중산으로 구성된 군으로부터 선택되는 부형제 화합물 및 치료 단백질을 포함하는 액체 단백질 제형을 제조하는 것을 포함하는 액체 단백질 제형의 안정성을 개선시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 액체 단백질 제형은 대조군 액체 단백질 제형에 비해 개선된 안정성을 나타내고, 상기 대조군 액체 단백질 제형은 부형제 화합물을 함유하지 않고 다른 면에서는 액체 단백질 제형과 동일하다. 액체 제형의 안정성은 저온 저장 조건 안정성, 실온 안정성 또는 상승된 온도 안정성일 수 있다.
구현예에서, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산 및 저분자량 지방족 다중산으로 구성된 군으로부터 선택되는 부형제 화합물 및 단백질을 포함하는 액체 제형이 본원에 또한 개시되며, 여기서 제형 내의 부형제 화합물의 존재는 단백질 확산 상호작용 파라미터 kD 또는 제2 비리얼 계수 B22에 의해 측정시 개선된 단백질-단백질 상호작용 특징을 발생시킨다. 구현예에서, 제형은 치료 제형이고, 치료 단백질을 포함한다. 구현예에서, 제형은 비-치료 제형이고, 비-치료 단백질을 포함한다.
구현예에서, 상기 기재된 액체 제형을 제공하고, 이를 처리 방법에 사용하는 것을 포함하는 단백질-관련 공정을 개선시키는 방법이 본원에 추가로 개시된다. 구현예에서, 처리 방법은 여과, 펌핑, 혼합, 원심분리, 막 분리, 동결건조 또는 크로마토그래피를 포함한다. 구현예에서, 처리 방법은 세포 배양물 수확, 크로마토그래피, 바이러스 불활성화 및 여과로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 처리 방법은 크로마토그래피 공정 또는 여과 공정이다. 구현예에서, 여과 공정은 바이러스 여과 공정 또는 초여과/정용여과 공정이다.
힌더드 아민, 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 다중산 및 디온 및 설폰으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 부형제 화합물을 포함하는 점도 감소 부형제 첨가제를 제공하고, 점도 감소량의 적어도 하나의 부형제 화합물을 단백질-관련 공정을 위한 담체 용액에 첨가하고 이에 의해 파라미터를 개선시키는 것을 포함하는 단백질-관련 공정의 파라미터를 개선시키는 방법이 본원에 또한 개시되며, 상기 담체 용액은 관심 단백질을 함유한다. 구현예에서, 파라미터는 단백질 생산 비용, 단백질 생산량, 단백질 생산 속도 및 단백질 생산 효율로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 파라미터는 프록시 파라미터일 수 있다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 업스트림 처리 공정이다. 업스트림 처리 공정을 위한 담체 용액은 세포 배양 배지일 수 있다. 구현예에서, 담체 용액이 세포 배양 배지인 경우, 담체 용액에 부형제 첨가제를 첨가하는 단계는 보충 배지에 부형제 첨가제를 첨가하여 부형제 함유 보충 배지를 형성시키는 제1 하위단계 및 부형제 함유 보충 배지를 세포 배양 배지에 첨가하는 제2 하위단계를 포함한다. 다른 구현예에서, 단백질-관련 공정은 다운스트림 처리 공정이다. 다운스트림 공정은 크로마토그래피 공정일 수 있고, 크로마토그래피 공정은 단백질-A 크로마토그래피 공정일 수 있다. 구현예에서, 크로마토그래피 공정은 관심 단백질을 회수하며, 상기 관심 단백질은 대조군 용액과 비교시 개선된 순도, 개선된 수율, 더 적은 입자, 더 적은 미스폴딩 또는 더 적은 응집으로 구성된 군으로부터 선택되는 개선된 단백질-관련 파라미터를 특징으로 한다. 구현예에서, 개선된 단백질-관련 파라미터는 크로마토그래피 공정으로부터의 관심 단백질의 개선된 수율이다. 다른 구현예에서, 단백질-관련 공정은 여과, 주입, 주사, 펌핑, 혼합, 원심분리, 막 분리 및 동결건조로 구성된 군으로부터 선택되는 공정이며, 선택된 공정은 대조군 공정보다 더 적은 힘을 필요로 할 수 있다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 세포 배양 공정, 세포 배양물 수확 공정, 크로마토그래피 공정, 바이러스 불활성화 공정 및 여과 공정으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 단백질-관련 공정은 바이러스 불활성화 공정이고, 바이러스 불활성화 공정은 약 2.5 내지 약 5.0의 pH 수준에서 수행되거나, 바이러스 불활성화 공정은 대조군 공정보다 높은 pH에서 수행된다. 다른 구현예에서, 단백질-관련 공정은 여과 공정이다. 여과 공정은 바이러스 제거 여과 공정 또는 초여과/정용여과 공정일 수 있다. 여과 공정은 개선된 여과 관련 파라미터를 특징으로 할 수 있다. 개선된 여과 관련 파라미터는 대조군 용액의 여과 속도보다 빠른 여과 속도일 수 있다. 개선된 여과 관련 파라미터는 대조군 여과 공정에 의해 생성된 응집된 단백질의 양보다 적은 양의 응집된 단백질의 생성일 수 있다. 개선된 여과 관련 파라미터는 대조군 여과 공정의 물질 전달 효율보다 더 높은 물질 전달 효율일 수 있다. 개선된 여과 관련 파라미터는 대조군 여과 공정에 의해 생성된 표적 단백질의 농도 또는 수율보다 높은 농도 또는 높은 수율의 표적 단백질일 수 있다.
점도 감소 부형제 첨가제가 2개 이상의 부형제 화합물을 포함하는 상기 기재된 바와 같은 방법이 본원에 추가로 개시된다. 구현예에서, 적어도 하나의 부형제 화합물은 힌더드 아민이다. 구현예에서, 적어도 하나의 부형제 화합물은 카페인, 사카린, 아세설팜 포타슘, 아스파탐, 테오필린, 타우린, 1-메틸-2-피롤리돈, 2-피롤리디논, 니아신아미드 및 이미다졸로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 적어도 하나의 부형제 화합물은 카페인, 타우린, 니아신아미드 및 이미다졸로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 적어도 하나의 부형제 화합물은 음이온성 방향족 부형제이고, 일부 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제는 4-하이드록시벤젠설폰산일 수 있다. 구현예에서, 점도 감소량은 약 1 mg/mL 내지 약 100 mg/mL의 적어도 하나의 부형제 화합물이거나, 점도 감소량은 약 1 mM 내지 약 400 mM의 적어도 하나의 부형제 화합물이거나, 점도 감소량은 약 2 mM 내지 약 150 mM의 양이다. 구현예에서, 담체 용액은 보존제, 당, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 계면활성제, 안정화제 및 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 추가 제제를 포함한다. 구현예에서, 관심 단백질은 치료 단백질이고, 치료 단백질은 재조합 단백질일 수 있거나, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 항체 단편, 융합 단백질, PEG화 단백질, 항체-약물 컨쥬게이트, 합성 폴리펩티드, 단백질 단편, 지질단백질, 효소 및 구조적 펩티드로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 구현예에서, 상기 방법은 제2 점도 감소 부형제를 담체 용액에 첨가하는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 제2 점도 감소 화합물을 첨가하는 단계는 파라미터에 추가 개선을 추가한다.
또한, 관심 단백질이 용해되는 액체 배지, 및 점도 감소 첨가제를 포함하는 담체 용액이 본원에 개시되며, 상기 담체 용액은 대조군 용액의 점도보다 낮은 점도를 갖는다. 담체 용액은 보존제, 당, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 계면활성제, 안정화제 및 완충제로 구성된 군으로부터 선택되는 추가 제제를 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 개시는 치료 단백질 및 안정성 개선량의 안정화 부형제를 포함하는 안정성 향상 제형에 관한 것이며, 상기 안정성 향상 제형은 상기 안정성 향상 제형과 다른 면에서는 동일하나 안정화 부형제가 결여된 대조군 제형과 비교하여 개선된 안정성 파라미터를 특징으로 한다. 구현예에서, 치료 단백질은 항체이고, 항체는 항체-약물 컨쥬게이트일 수 있다. 안정화 부형제는 힌더드 아민 화합물, 음이온성 방향족 화합물, 기능화된 아미노산 화합물, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 다중산, 디온 화합물 또는 설폰 화합물, 쯔비터이온성 화합물, 또는 수소 결합 요소를 갖는 군집제(crowding agent)일 수 있다. 구현예에서, 안정화 부형제는 약 1mM 내지 약 500 mM의 양, 또는 약 5 mM 내지 약 250 mM의 양, 또는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 양, 또는 약 5mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 양으로 제형에 첨가될 수 있다. 개선된 안정성 파라미터는 열 저장 안정성일 수 있으며, 예를 들어, 열 저장 안정성은 약 10℃ 내지 30℃의 온도에서 개선된다. 구현예에서, 개선된 안정성 파라미터는 개선된 동결/해동 안정성 또는 개선된 전단 안전성이다. 구현예에서, 안정성 향상 제형은 대조군과 비교하여 감소된 수의 입자를 갖는다. 구현예에서, 안정성 향상 제형은 대조군과 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는다.
또한, 안정성 개선량의 안정화 부형제를 치료 제형에 첨가하고, 이에 의해 치료 제형의 안정성을 개선시키는 것을 포함하는 치료 제형의 안정성을 개선시키는 방법이 본원에 개시되며, 상기 치료 제형의 안정성은 상기 치료 제형과 다른 면에서는 동일하나 안정화 부형제가 결여된 대조군 제형의 안정성과 비교하여 측정된다. 안정화 부형제는 힌더드 아민, 음이온성 방향족 화합물, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 다중산, 디온, 설폰, 쯔비터이온성 화합물 또는 수소 결합 요소를 갖는 군집제일 수 있다. 구현예에서, 치료 제형의 안정성을 측정하는 단계는 안정성 관련 파라미터, 예를 들어, 열 저장 안정성, 동결/해동 안정성 및 전단 안정성으로 구성된 군으로부터 선택되는 파라미터를 측정하는 것을 포함할 수 있다. 구현예에서, 치료 제형은 치료 단백질을 포함하며, 이는 항체일 수 있고, 항체는 항체-약물 컨쥬게이트일 수 있다. 안정성 개선량의 안정화 부형제를 단백질 관련 공정을 위한 담체 용액에 첨가하는 것을 포함하는 단백질 관련 공정의 파라미터를 개선시키는 방법이 본원에 추가로 개시되며, 여기서 담체 용액은 관심 단백질을 함유하고, 이에 의해 파라미터를 개선시키고, 관심 단백질은 치료 단백질일 수 있다. 구현예에서, 파라미터는 단백질 생산 비용, 단백질 생산량, 단백질 생산 속도 및 단백질 생산 효율로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.
도 1은 동적 광 산란에 의해 평가된 스트레스 및 비-스트레스 조건하에서 모노클로날 항체의 용액에 대한 입자 크기 분포의 그래프를 제시한다. 도 1의 데이터 곡선은 비교를 가능하게 하는 기준선 오프셋을 가지며: Y-축에서 샘플 1-A에 대한 곡선은 100 강도 단위에 의해 오프셋되고, 샘플 1-FT에 대한 곡선은 200 강도 단위에 의해 오프셋된다.
도 2는 동적 광 산란에 의해 평가된 여러 분자 집단에 대한 샘플 직경 대 다중모드 크기 분포를 측정하는 그래프를 제시한다. 도 2의 데이터 곡선은 비교를 가능하게 하는 기준선 오프셋을 가지며: Y-축에서 샘플 2-A에 대한 곡선은 100 강도 단위에 의해 오프셋되고, 샘플 2-FT에 대한 곡선은 200 강도 단위에 의해 오프셋된다.
도 3은 8-10분 체류 시간에서 주요 단량체 피크를 갖는 모노클로날 항체 용액의 크기 배제 크로마토그램을 제시한다. 도 3의 데이터 곡선은 비교를 가능하게 하는 기준선 오프셋을 가지며: 샘플 2-C, 2-A 및 2-FT에 대한 곡선은 Y-축 방향으로 오프셋된다.
도 4는 치료 단백질, 예를 들어, 모노클로날 항체를 생성하기 위한 발효 공정("업스트림 처리")의 단계를 제시하는 블록 다이어그램을 제공한다.
도 5는 치료 단백질, 예를 들어, 모노클로날 항체를 생성하기 위한 정제 공정("다운스트림 처리")의 단계를 제시하는 블록 다이어그램을 제공한다.
농축된 단백질 용액의 전달을 허용하는 제형 및 이들의 생성을 위한 방법이 본원에 개시된다. 구현예에서, 본원에 개시된 접근법은 전통적인 단백질 용액과 비교하여 액체 제형에서 더 낮은 점도의 액체 제형 또는 더 높은 농도의 치료 또는 비치료 단백질을 생성할 수 있다.
구현예에서, 본원에 개시된 접근법은 전통적인 단백질 용액과 비교하는 경우 개선된 안정성을 갖는 액체 제형을 생성할 수 있다. 일 양태에서, 안정한 제형은 그 안에 함유된 단백질이 스트레스 조건에 대한 노출시 이의 물리적 및 화학적 안정성 또는 온전성 및 이의 치료적 또는 비치료적 효능을 실질적으로 유지하는 것이다. 또 다른 양태에서, 안정한 제형은 그 안에 함유된 단백질이 실질적으로 이의 가용성, 단량체성 또는 비-응집 상태를 유지하는 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같은 스트레스 조건은 제형 내의 단백질에 악영향을 미치는 물리적 또는 화학적 조건이다. 유리하게는, 안정한 제형은 또한 그 안에 용해된 단백질의 응집 또는 침전에 대한 보호를 제공할 수 있다.
물리적 스트레스 조건의 예는 기계적 전단, 공기/물 경계면과의 접촉, 동결-해동 주기, 저장 조건(저온 저장 조건이거나, 실온 조건이거나, 상승된 온도 저장 조건이건 간에) 하에서의 장기간 저장 또는 다른 변성 조건에 대한 노출과 같은 물리적 교란을 포함한다. 예를 들어, 저온 저장 조건은 냉장고 또는 냉동고에서의 저장을 수반할 수 있다. 일부 예에서, 저온 저장 조건은 10℃ 이하의 온도에서의 저장을 수반할 수 있다. 추가 예에서, 저온 저장 조건은 약 2℃ 내지 약 10℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 다른 예에서, 저온 저장 조건은 약 4℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 추가 예에서, 저온 저장 조건은 약 -20℃ 이하와 같은 동결 온도에서의 저장을 수반한다. 또 다른 예에서, 저온 저장 조건은 약 -80℃ 내지 약 0℃의 온도에서의 저장을 수반한다. 실온 저장 조건은, 예를 들어, 약 10℃ 내지 약 30℃의 주위 온도에서의 저장을 수반할 수 있다. 상승된 저장 조건은 약 30℃ 초과의 온도에서의 저장을 수반할 수 있다. 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 50℃의 온도에서의 상승된 온도 안정성은 전형적인 주위(10-30℃) 조건에서 장기 저장을 예측하기 위한 가속화된 노화 연구의 일부로 사용될 수 있다. 스트레스 조건은 또한 pH 변화와 같은 화학적 교란을 포함할 수 있으며, 이는, 예를 들어, 단백질의 3차 구조에 영향을 줌으로써 제형 내의 단백질의 안정성 또는 온전성에 영향을 미칠 수 있다.
용액 내 단백질은 얽힘을 형성하는 경향이 있으며, 이는 얽힌 사슬의 번역 이동성을 제한하고, 단백질의 치료적 또는 비치료적 효능을 방해할 수 있다는 것은 중합체 과학 및 공학 분야의 당업자에게 널리 공지되어 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 부형제 화합물은 용액 내 부형제 화합물 및 표적 단백질 사이의 특정 상호작용으로 인해 단백질 클러스터링을 억제할 수 있다. 본원에 개시된 바와 같은 부형제 화합물은 천연 또는 합성일 수 있으며, 바람직하게는 FDA가 일반적으로 안전한 것으로 인식하는 물질("GRAS")이다.
1. 정의
본 발명의 개시의 목적을 위해, 용어 "단백질"은 전형적으로 1-3000 kDa의 분자량을 갖는 별개의 3차 구조를 생성하기에 충분히 긴 사슬 길이를 갖는 아미노산의 서열을 나타낸다. 일부 구현예에서, 단백질의 분자량은 약 50-200 kDa이고; 다른 구현예에서, 단백질의 분자량은 약 20-1000 kDa 또는 약 20-2000 kDa이다. 용어 "단백질"과 대조적으로, 용어 "펩티드"는 별개의 3차 구조를 갖지 않는 아미노산의 서열을 나타낸다. 용어 "단백질"의 범위 내에 매우 다양한 생체중합체가 포함된다. 예를 들어, 용어 "단백질"은 항체, 앱타머, 융합 단백질, PEG화된 단백질, 합성 폴리펩티드, 단백질 단편, 지질단백질, 효소, 구조적 펩티드 등을 포함하는 치료 또는 비-치료 단백질을 나타낼 수 있다.
a. 치료 생체중합체 및 관련 정의
치료 효과를 갖는 단백질을 포함하는 이들 생체중합체는 "치료 생체중합체"로 언급될 수 있다. 치료 효과를 갖는 이들 단백질은 "치료 단백질"로 언급될 수 있다.
비제한적인 예로서, 치료 단백질은 포유동물 단백질, 예를 들어, 호르몬 및 프로호르몬(예를 들어, 인슐린 및 프로인슐린, 글루카곤, 칼시토닌, 갑상샘 호르몬(T3 또는 T4 또는 갑상샘-자극 호르몬), 부갑상샘 호르몬, 난포-자극 호르몬, 황체형성 호르몬, 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자 등); 응고 및 항-응고 인자(예를 들어, 조직 인자, 폰 빌레브란트 인자, 인자 VIIIC, 인자 IX, 단백질 C, 플라스미노겐 활성화제(우로키나제, 조직-유형 플라스미노겐 활성화제), 트롬빈); 사이토카인, 케모카인, 및 염증 매개체; 인터페론; 집락 자극 인자; 인터루킨(예를 들어, IL-1 내지 IL-10); 성장 인자(예를 들어, 혈관 내피 성장 인자, 섬유모세포 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, 전환 성장 인자, 신경영양 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자 등); 알부민; 콜라겐 및 엘라스틴; 조혈 인자(예를 들어, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴 등); 골유도 인자(예를 들어, 골 형태형성 단백질); 수용체(예를 들어, 인테그린, 카드헤린 등); 표면 막 단백질; 수송 단백질; 조절 단백질; 항원성 단백질(예를 들어, 항원으로서 작용하는 바이러스 성분); 및 항체를 포함할 수 있다.
특정 구현예에서, 치료 단백질은 항체일 수 있다. 용어 "항체"는 비제한적인 예로서 모노클로날 항체(예를 들어, 면역글로불린 Fc 영역을 갖는 전장 항체를 포함함), 단일쇄 분자, 이중특이적 및 다중특이적 항체, 디아바디(diabodies), 항체-약물 컨쥬게이트, 폴리에피토프 특이성을 갖는 항체 조성물, 폴리클로날 항체(예를 들어, 면역-손상 환자에 대한 치료제로서 사용되는 폴리클로날 면역글로불린), 및 항체의 단편(예를 들어, Fc, Fab, Fv, 나노바디(nanobodies) 및 F(ab')2를 포함함)을 포함하도록 이의 가장 넓은 의미로 본원에서 사용된다. 항체는 또한 "면역글로불린"으로 언급될 수 있다. 항체는 생물학적으로 중요한 물질인 특정 단백질 또는 비-단백질 "항원"에 대한 것으로 이해되며; 환자로의 치료적 유효량의 항체의 투여는 항원과 복합체를 형성하여 환자가 치료 효과를 경험하도록 이의 생물학적 특성을 변경시킬 수 있다.
구현예에서, 항체는 항체-약물 컨쥬게이트(ADC)일 수 있다. 항체-약물 컨쥬게이트는 항체의 고도로 특수화된 표적화 능력을 세포독성 화합물과 같은 치료적 활성 화합물과 조합하는 치료 단백질의 범주이며; ADC는 생물분해성 화학 링커를 통해 치료적 활성제에 연결되는 항체로 구성된다. 보다 상세하게는, ADC는 비정상 "표적" 세포 상에서 발현되지만, 정상 세포에서는 발현이 최소이거나 발현이 없는 항원에 특이적인 인간 또는 인간화 mAb를 포함할 수 있다. ADC는 표적 세포를 파괴할 수 있는 세포독성제와 같은 강력한 약학적 제제를 추가로 포함하며; 상기 제제는 전형적으로 전신적으로 독성이 있으므로 이들은 일반화된 전신 투여에 적합하지 않다. ADC의 mAb 성분의 표적화 능력은 약학적 제제가 전신적으로 분포됨이 없이 표적 세포에 특이적으로 지정되고, 표적 세포에 의해 흡수되고, 이들 세포 내에서 이의 효과를 발휘하는 것을 가능하게 한다. ADC를 형성시키기 위해, mAb는 세포 외 환경(예를 들어, 정맥 내 및 간질 순환)에서 안정하지만, ADC가 세포 내로 내재화되는 경우 분해되는 불안정한 결합을 갖는 약학적 제제에 연결된다. ADC와 약학적 제제 사이의 결합이 분해됨에 따라, 제제는 세포 내부에서 방출되어 세포에 대한 이의 영향을 발휘한다. ADC는 특히 세포독성제와 함께 사용하기에 적합하며, 특히 이들 화합물이 독립형 치료로 사용하기에 너무 독성이 있는 경우에 적합하다. 예를 들어, 암 화학요법에서, ADC에서 사용하기 위해 선택된 제제 중 일부는 전통적인 항암제보다 여러 크기 자릿수(several orders of magnitude) 더 독성이 있다. 예로는 항-미세관 제제, 알킬화제 및 DNA 마이너 그루브 결합제를 포함하는데, 이는 성공적으로 투여하기에는 너무 독성이 있을 수 있으나, 암세포에 의해서만 발현되는 항원과 결합하는 mAb의 특이성을 사용하여 암세포에 표적화될 수 있다. ADC가 종양에 국소화되고, 표면 상의 표적 세포 항원에 결합하면, 복합체는 소포의 세포 내로 내재화될 수 있다. 내재화된 소포는 서로 융합하고, 엔도솜-리소좀 경로에 진입하고, 여기서 이들은 mAb를 분해하는 프로테아제 및/또는 링커 분자와 조우하여 약학적 페이로드를 방출한다. 이후, 페이로드(예를 들어, 세포독성제)는 리소좀 막을 가로질러 세포질 및/또는 핵으로 진입하며, 여기서 이는 이의 약학적(예를 들어, 세포독성) 효과를 발휘한다. 매우 강력한 약학적 화합물의 이러한 집중된 전달은 이들의 의도된 치료 효과를 최대화하는 한편 이들 제제의 정상 조직의 노출을 최소화한다. ADC를 포함하는 제형은 ADC가 치료될 표적 세포에 도달하도록 정맥 내 또는 국소 투여에 적합하다.
특정 구현예에서, 치료 단백질은 PEG화되며, 이는 이들이 폴리(에틸렌 글리콜)("PEG") 및/또는 폴리(프로필렌 글리콜)("PPG") 단위를 포함하는 것을 의미한다. PEG화된 단백질 또는 PEG-단백질 컨쥬게이트는 용해도, 약동학, 약역학, 면역원성, 신장 청소율 및 안정성과 같은 이들의 이로운 특성으로 인해 치료 적용에서 유용하다. PEG화된 단백질의 비제한적인 예는 PEG화된 인터페론(PEG-IFN), PEG화된 항-VEGF, PEG 단백질 컨쥬게이트 약물, 안다겐(Adagen), 페그아스파르가세(Pegaspargase), 페그필그라스팀(Pegfilgrastim), 페그로티카세(Pegloticase), 페그비소만트(Pegvisomant), PEG화된 에포에틴-β, 및 세르톨리주맙 페골(Certolizumab pegol)이다.
PEG화된 단백질은 하나 이상의 반응성 작용기를 갖는 PEG 시약과 단백질의 반응과 같은 다양한 방법에 의해 합성될 수 있다. PEG 시약 상의 반응성 작용기는 리신, 히스티딘, 시스테인 및 N-말단과 같은 표적화된 단백질 부위에서 단백질과 연결을 형성할 수 있다. 전형적인 PEG화 시약은 단백질 상의 표적화된 아미노산 잔기와 특이적인 반응성을 갖는 알데하이드, 말레이미드 또는 숙신이미드 기와 같은 반응성 작용기를 갖는다. PEG화 시약은 약 1 내지 약 1000 PEG 및/또는 PPG 반복 단위의 PEG 사슬 길이를 가질 수 있다. PEG화의 다른 방법은 글리코-PEG화를 포함하는데, 여기서 단백질은 먼저 글리코실화된 후, 글리코실화된 잔기는 두 번째 단계에서 PEG화된다. 특정 PEG화 공정은 시알릴트랜스페라제 및 트랜스글루타미나제와 같은 효소에 의해 지원된다.
PEG화된 단백질은 고유한 PEG화되지 않은 단백질에 비해 치료적 이점을 제공할 수 있지만, 이들 물질은 정제하고, 용해시키고, 여과시키고, 농축시키고, 투여하는 것을 어렵게 만드는 물리적 또는 화학적 특성을 가질 수 있다. 단백질의 PEG화는 고유 단백질에 비해 높은 용액 점도를 발생시킬 수 있으며, 이는 일반적으로 더 낮은 농도에서 EPG화된 단백질 용액의 제형화를 필요로 한다.
단백질 치료제를 안정적이고, 저 점도 용액으로 제형화하여, 이들이 최소 주사 부피로 환자에 투여될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 약물의 피하(SC) 또는 근육 내(IM) 주사는 일반적으로 작은 주사 부피, 바람직하게는 2 mL 미만을 필요로 한다. SC 및 IM 주사 경로는 자가 투여 관리에 매우 적합하며, 이는 직접 의료 관리 하에서만 수행되는 정맥 내(IV) 주사에 비해 비용이 적게 들고 더욱 접근 가능한 치료 형태이다. SC 또는 IM 주사를 위한 제형은 좁은 게이지 바늘을 통한 치료 용액의 용이한 흐름을 허용하기 위해 일반적으로 30 cP 미만, 바람직하게는 20 cP 미만의 낮은 용액 점도를 필요로 한다. 이러한 작은 주사 부피 및 낮은 점도 요건의 조합은 SC 또는 IM 주사 경로에서 PEG화된 단백질 치료제의 사용에 난제를 제공한다.
치료적 유효량의 치료 단백질을 함유하는 제형은 "치료 제형"으로 언급될 수 있다. 치료 제형에 함유된 치료 단백질은 또한 이의 "단백질 활성 성분"으로 언급될 수 있다. 전형적으로, 치료 제형은 다른 선택적 성분을 갖거나 갖지 않는 치료적 유효량의 단백질 활성 성분 및 부형제를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "치료적"은 기존 장애의 치료 및 장애의 예방 둘 모두를 포함한다. 치료 단백질은, 예를 들어, 베바시주맙(bevacizumab), 트라스투주맙(trastuzumab), 아달리무맙(adalimumab), 인플릭시맙(infliximab), 에타너셉트(etanercept), 다르브에포에틴 알파(darbepoetin alfa), 에포에틴 알파(epoetin alfa), 세툭시맙(cetuximab), 필그라스팀(filgrastim) 및 리툭시맙(rituximab)과 같은 단백질을 포함한다. 다른 치료 단백질은 당업자에 친숙할 것이다.
"치료"는 증상의 발생을 예방하거나 지연시키고/시키거나, 장애의 증상을 완화시키거나 개선시키는 것을 포함하여 장애를 치료하거나, 치유하거나, 완화시키거나, 개선시키거나, 구제하거나, 달리 유익하게 영향을 미치기 위한 임의의 조치를 포함한다. 치료를 필요로 하는 환자는 이미 특정 장애를 갖는 환자 및 장애의 예방이 바람직한 환자 둘 모두를 포함한다. 장애는 급성 또는 만성 질병, 또는 포유동물이 급성 또는 만성 질병에 걸리기 쉬운 병리학적 상태를 포함하여 포유동물의 항상성 안녕을 변경하는 임의의 상태이다. 장애의 비제한적인 예는 암, 대사 장애(예를 들어, 당뇨병), 알레르기 장애(예를 들어, 천식), 피부과 장애, 심혈관 장애, 호흡 장애, 혈액 장애, 근골격 장애, 염증 또는 류마티스 장애, 자가면역 장애, 위장 장애, 비뇨기과 장애, 성 및 생식 장애, 신경 장애 등을 포함한다. 치료 목적을 위한 용어 "포유동물"은 인간, 가축, 애완 동물, 농장 동물, 스포츠 동물, 작업 동물 등을 포함하여 포유동물로 분류되는 임의의 동물을 나타낼 수 있다. 따라서, "치료"는 수의학 및 인간 치료 둘 모두를 포함할 수 있다. 편의상, 상기 "치료"를 받고 있는 포유동물은 "환자"로 언급될 수 있다. 특정 구현예에서, 환자는 자궁 내 태아 동물을 포함하여 임의의 연령일 수 있다.
구현예에서, 치료는 치료를 필요로 하는 포유동물에게 치료적 유효량의 치료 제형을 제공하는 것을 포함한다. "치료적 유효량"은 기존 장애의 치료 또는 예상되는 장애의 예방에 영향을 미치기 위해 치료 단백질을 필요로 하는 포유동물에 투여되는 치료 단백질의 적어도 최소 농도이다(상기 치료 또는 상기 예방은 "치료적 개입"이다). 치료 제형 내에 활성 성분으로서 포함될 수 있는 다양한 치료 단백질의 치료적 유효량은 당 분야에 친숙할 수 있거나; 이후에 발견되거나 치료적 개입에 적용되는 치료 단백질의 경우, 치료적 유효량은 일상적인 것을 넘어서지 않는 실험을 사용하여 당업자에 의해 수행되는 표준 기술에 의해 결정될 수 있다.
b. 비-치료 생체중합체 및 관련 정의
가정, 영양, 상업 및 산업 적용과 같은 비-치료적 목적(즉, 치료를 포함하지 않는 목적)에 사용되는 단백질은 "비-치료 단백질"로 언급될 수 있다. 비-치료 단백질을 함유하는 제형은 "비-치료 제형"으로 언급될 수 있다. 비-치료 단백질은 식물 공급원, 동물 공급원에서 유래될 수 있거나, 세포 배양으로부터 생성될 수 있으며; 이들은 또한 효소 또는 구조 단백질일 수 있다. 비-치료 단백질은 촉매, 인간 및 동물 영양, 가공 보조제, 세척제 및 폐기물 처리와 같은 가정, 영양, 상업 및 산업 적용에서 사용될 수 있다.
비-치료 생체중합체의 중요한 범주는 효소 범주이다. 효소는, 예를 들어, 촉매, 인간 및 동물 영양 성분, 가공 보조제, 세척제 및 폐기물 처리제와 같은 다수의 비-치료적 적용을 갖는다. 효소 촉매는 다양한 화학 반응을 가속화하는 데 사용된다. 비-치료적 용도를 위한 효소 촉매의 예는 카탈라제, 산화환원효소, 트랜스페라제, 하이드롤라제, 리아제, 이소머라제 및 리가제를 포함한다. 효소의 인간 및 동물 영양학적 용도는 뉴트라슈티컬(nutraceutical), 단백질의 영양 공급원, 미량영양소의 킬레이트화 또는 제어된 전달, 소화 보조제 및 보충제를 포함하며; 이들은 아밀라제, 프로테아제, 트립신, 락타제 등으로부터 유래될 수 있다. 효소 가공 보조제는 제빵, 양조, 발효, 주스 가공 및 포도주 양조와 같은 작업에서 식품 및 음료 제품의 생산을 개선시키는 데 사용된다. 이들 식품 및 음료 가공 보조제의 예는 아밀라제, 셀룰라제, 펙티나제, 글루카나제, 리파제 및 락타제를 포함한다. 효소는 또한 바이오연료의 생성에 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이오연료용 에탄올은 셀룰로스 및 리그노셀룰로스 물질과 같은 바이오매스 공급원료의 효소적 분해에 의해 지원될 수 있다. 셀룰라제 및 리그니나제를 이용한 상기 공급원료 물질의 처리는 바이오매스를 연료로 발효될 수 있는 기질로 변환시킨다. 다른 상업적 적용에서, 효소는 세탁, 식기 세척, 표면 청소 및 장비 청소 적용을 위한 세제, 세척제 및 얼룩 제거 보조제로서 사용된다. 이러한 목적을 위한 전형적인 효소는 프로테아제, 셀룰라제, 아밀라제 및 리파제를 포함한다. 또한, 비-치료적 효소는 셀룰라제를 사용한 직물 연화, 가죽 가공, 폐기물 처리, 오염된 침전물 처리, 수처리, 펄프 표백, 및 펄프 연화 및 디본딩(debonding)과 같은 다양한 상업 및 산업 공정에 사용된다. 이들 목적을 위한 전형적인 효소는 아밀라제, 자일라나제, 셀룰라제 및 리그니나제이다.
비-치료적 생체중합체의 다른 예는 케라틴, 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 피브로인, 액틴, 튜불린, 또는 이들의 가수분해, 분해 또는 유도체화된 형태와 같은 섬유질 또는 구조 단백질을 포함한다. 이들 물질은 젤라틴, 아이스크림, 요거트 및 과자와 같은 식품 성분의 제조 및 제형화에 사용되며; 이들은 또한 증점제, 레올로지 개질제, 식감 개선제 및 영양 단백질 공급원으로서 식품에 첨가된다. 화장품 및 개인 관리 산업에서, 콜라겐, 엘라스틴, 케라틴 및 가수분해된 케라틴은 피부 관리 및 모발 관리 제형의 성분으로서 널리 사용된다. 비-치료 생체중합체의 또 다른 예는 베타-락토글로불린, 알파-락트알부민 및 혈청 알부민과 같은 유장 단백질이다. 이들 유장 단백질은 낙농업에서 부산물로 대량 생성되며, 다양한 비-치료적 적용에 사용되어 왔다.
2. 측정
구현예에서, 본원에 기재된 단백질 함유 제형은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 의해 측정시 단량체 손실에 대해 내성이 있다. 본원에서 사용되는 바와 같은 SEC 분석에서, 주요 분석물 피크는 일반적으로 제형에 함유된 표적 단백질과 관련되며, 단백질의 이러한 주요 피크는 단량체 피크로 언급된다. 단량체 피크는 응집된(이량체, 삼량체, 올리고머 등) 또는 단편화된 상태와 반대로 단량체 상태의 표적 단백질, 예를 들어, 단백질 활성 성분의 양을 나타낸다. 단량체 피크 면적은 표적 단백질과 관련된 단량체, 응집체 및 단편 피크의 전체 면적과 비교될 수 있다. 따라서, 단백질 함유 제형의 안정성은 경과 시간 후 단량체의 상대량에 의해 관찰될 수 있으며; 따라서, 본 발명의 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 단량체 백분율과 비교하여 특정 경과 시간 후에 더 높은 단량체 백분율로 측정될 수 있다.
구현예에서, 이상적인 안정성 결과는 SEC 분석에 의해 결정시 98 내지 100% 단량체 피크를 갖는 것이다. 구현예에서, 본 발명의 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은, 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형이 동일한 스트레스 조건에 노출되는 경우의 상기 대조군 제형의 단량체 백분율과 비교하여 스트레스 조건에 노출 후 더 높은 단량체 백분율로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 빛에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 함유 제형은 동적 광 산란(DLS) 분석에 의해 측정시 단백질 입자 크기의 증가에 내성이 있다. 본원에서 사용되는 DLS 분석에서, 단백질 함유 제형의 단백질 입자 크기는 중앙 입자 직경으로 관찰될 수 있다. 이상적으로, 표적 단백질의 중앙 입자 직경은 입자 직경이 응집된(이량체, 삼량체, 올리고머 등) 또는 단편화된 상태와 반대로 단량체 상태에서 활성 성분을 나타내기 때문에 DLS 분석에 적용되는 경우 비교적 변하지 않아야 한다. 중앙 입자 직경의 증가는 응집된 단백질을 나타낼 수 있다. 따라서, 단백질 함유 제형의 안정성은 경과 시간 후 중앙 입자 직경의 상대적 변화에 의해 관찰될 수 있다.
구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 함유 제형은 DLS 분석에 의해 측정시 다분산 입자 크기 분포 형성에 내성이 있다. 구현예에서, 단백질 함유 제형은 콜로이드 단백질 입자의 단분산 입자 크기 분포를 함유할 수 있다. 구현예에서, 이상적인 안정성 결과는 제형의 초기 중앙 입자 직경과 비교하여 중앙 입자 직경이 10% 미만으로 변화하는 것이다. 구현예에서, 본 발명의 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 중앙 입자 직경과 비교하여 특정 경과 시간 후 중앙 입자 직경의 더 낮은 변화 백분율로서 측정될 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은, 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형이 동일한 스트레스 조건에 노출되는 경우의 상기 대조군 제형의 중앙 입자 직경의 변화 백분율과 비교하여 스트레스 조건에 노출 후 더 낮은 중앙 입자 직경의 변화 백분율로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 빛에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 단백질 함유 제형 치료 제형의 안정성의 개선은, 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형이 동일한 스트레스 조건에 노출되는 경우의 상기 대조군 제형의 입자 크기 분포의 다분산성과 비교하여 DLS에 의해 측정시 덜한 다분산 입자 크기 분포로서 측정될 수 있다.
구현예에서, 본원에 개시된 단백질 함유 제형은 혼탁도, 광 산란 및/또는 입자 계수 분석에 의해 측정시 입자 형성, 변성 또는 침전에 대해 내성이 있다. 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 분석에서, 더 낮은 값은 일반적으로 제형 내의 현탁 입자의 더 낮은 수를 나타낸다. 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수의 증가는 표적 단백질의 용액이 안정적이지 않음을 나타낼 수 있다. 따라서, 단백질 함유 제형의 안정성은 경과 시간 후 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수의 상대량에 의해 관찰될 수 있다. 구현예에서, 이상적인 안정성 결과는 낮고 비교적 일정한 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 값을 갖는 것이다. 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 값과 비교하여 특정 경과 시간 후 더 낮은 혼탁도, 더 낮은 광 산란 또는 더 낮은 입자 계수로 측정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 함유 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형이 동일한 스트레스 조건에 노출되는 경우 상기 대조군 제형의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수와 비교하여 스트레스 조건에 대한 노출 후 더 낮은 혼탁도, 더 낮은 광 산란 또는 더 낮은 입자 계수로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 빛에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 단백질 함유 제형은 대조군 제형과 비교하여 생물학적 활성의 더 높은 백분율을 보유한다. 생물학적 활성은 결합 검정 또는 포유동물에서 치료 효과를 통해 관찰될 수 있다.
3. 치료 제형
일 양태에서, 본원에 개시된 제형 및 방법은 치료적 유효량의 치료 단백질 및 부형제 화합물을 포함하는 개선되거나 감소된 점도의 안정한 액체 제형을 제공한다. 구현예에서, 제형은 허용 가능한 농도의 활성 성분 및 허용 가능한 점도를 제공하면서 안정성을 개선시킬 수 있다. 구현예에서, 제형은 대조군 제형과 비교하는 경우 안정성의 개선을 제공하며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 치료 제형과 모든 면에서 건조 중량 기준으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다. 구현예에서, 제형은 장기 저장의 스트레스 조건, 25-45℃와 같은 상승된 온도, 동결/해동 조건, 전단 또는 혼합, 주사, 희석, 기포 노출, 산소 노출, 빛 노출 및 동결건조 하에서의 안정성의 개선을 제공한다. 구현예에서, 단백질 함유 제형의 개선된 안정성은 대조군 제형과 비교하여 더 낮은 백분율의 가용성 응집체, 미립자, 육안으로 보이지 않는 입자 또는 젤 형성의 형태이다.
액체 단백질 제형의 점도는 단백질 자체(예를 들어, 효소, 항체, 수용체, 융합 단백질 등)의 특성; 이의 크기, 3차원 구조, 화학적 조성 및 분자량; 제형에서의 이의 농도; 단백질 이외의 제형의 성분; 원하는 pH 범위; 제형에 대한 저장 조건; 및 환자에게 제형을 투여하는 방법을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있음이 이해된다. 본원에 기재된 부형제 화합물과 함께 사용하기에 가장 적합한 치료 단백질은 바람직하게는 본질적으로 순수하며, 즉, 오염 단백질을 비함유한다. 구현예에서, "본질적으로 순수한" 치료 단백질은 조성물 내의 치료 단백질 및 오염 단백질의 전체 중량을 모두 기초로 하여 적어도 90 중량%의 치료 단백질, 또는 바람직하게는 적어도 95 중량%, 또는 더욱 바람직하게는 적어도 99 중량%의 치료 단백질을 포함하는 단백질 조성물이다. 명확성의 목적을 위해, 부형제로서 첨가된 단백질은 이러한 정의에 포함되는 것으로 의도되지 않는다. 본원에 기재된 치료 제형은 약학적 등급 제형, 즉, 제형이 투여될 포유동물에 독성인 성분을 함유하지 않고 단백질 활성 성분의 원하는 치료적 효능이 달성될 수 있도록 하는 형태의 포유동물을 치료하는 데 사용하기 위해 의도된 제형으로 사용하기 위해 의도된다.
구현예에서, 치료 제형은 적어도 25 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 적어도 100 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 적어도 10 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 적어도 50 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 적어도 200 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 치료 제형 용액은 적어도 300 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 일반적으로, 본원에 개시된 부형제 화합물은 약 5 내지 약 300 mg/mL의 양으로 치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 10 내지 약 200 mg/mL의 양으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 20 내지 약 100 mg/mL의 양으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 부형제는 약 25 내지 약 75 mg/mL의 양으로 첨가될 수 있다.
다양한 분자량의 부형제 화합물은 제형에서 단백질 활성 성분과 조합되는 경우 특정한 유리한 특성을 위해 선택된다. 부형제 화합물을 포함하는 치료 제형의 예가 하기에 제공된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <1000 Da의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <500 Da의 분자량을 갖는다.
구현예에서, 본원에 개시된 부형제 화합물은 점도 감소량으로 치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 10% 감소시키는 부형제 화합물의 양이며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 치료 제형과 모든 면에서 건조 중량 기준으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 30% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 50% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 70% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 90% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다.
구현예에서, 점도 감소량은 100 cP 미만의 점도를 갖는 치료 제형을 생성한다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 50 cP 미만의 점도를 갖는다. 다른 구현예에서, 치료 제형은 20 cP 미만의 점도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 치료 제형은 10 cP 미만의 점도를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "점도"는 본원에 기재된 방법에 의해 측정되는 경우 동적 점도 값을 나타낸다.
본 발명의 개시에 따른 치료 제형은 제형의 안정성을 개선시키는 특정한 유리한 특성을 갖는다. 구현예에서, 치료 제형은 전단 분해, 상 분리, 혼탁, 산화, 탈아미드화, 응집, 침전 및 변성에 대해 내성이 있다. 구현예에서, 치료 제형은 대조군 제형과 비교하여 더 효과적으로 처리되고, 정제되고, 저장되고, 주사되고, 투여되고, 여과되고, 원심분리된다.
구현예에서, 치료 제형은 고농도의 치료 단백질로 환자에 투여된다. 구현예에서, 치료 제형은 치료 부형제가 결여된 유사한 제형에서 경험하는 것보다 작은 주사 부피 및/또는 덜한 불편함으로 환자에 투여된다. 구현예에서, 치료 제형은 치료 부형제가 결여된 유사한 제형에 필요한 것보다 좁은 게이지 바늘 또는 덜한 주사기 힘을 사용하여 환자에 투여된다. 구현예에서, 치료 제형은 데포 주사로 투여된다. 구현예에서, 치료 제형은 체내 치료 단백질의 반감기를 연장시킨다.
본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 이들 특징은 임상 상황, 즉, 근육 내 주사의 환자 수용이 IM/SC 목적을 위해 전형적인 작은 구멍 바늘의 사용 및 허용 가능한(예를 들어, 2-3 mL) 주사 부피의 사용을 포함하고, 이들 조건이 단일 주사 부위에서 단일 주사로 유효량의 제형의 투여를 발생시키는 상황에서 근육 내 또는 피하 주사에 의해 상기 제형의 투여를 허용할 것이다. 대조적으로, 통상적인 제형 기술을 사용한 치료 단백질의 동등한 투여량의 주사는 통상적인 제형의 더 높은 점도에 의해 제한될 것이며, 따라서 통상적인 제형의 SC/IM 주사는 임상 상황에 적합하지 않을 것이다.
본 발명의 개시에 따른 치료 제형은 개선된 안정성과 일치하는 특정한 유리한 특성을 가질 수 있다. 구현예에서, 치료 제형은 전단 분해, 상 분리, 혼탁, 침전, 산화, 탈아미드화, 응집 및/또는 변성에 대해 내성이 있다. 구현예에서, 치료 제형은 대조군 제형과 비교하여 더 효과적으로 처리되고/되거나, 정제되고/되거나, 저장되고/되거나, 주사되고/되거나, 투여되고/되거나, 여과되고/되거나, 원심분리된다.
구현예에서, 본원에 개시된 치료 제형은 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 의해 측정시 단량체 손실에 대해 내성이 있다. SEC 분석에서, 주요 분석물 피크는 일반적으로 제형의 활성 성분, 예를 들어, 치료 단백질과 관련되며, 활성 성분의 이러한 주요 피크는 단량체 피크로 언급된다. 단량체 피크는 응집된(이량체, 삼량체, 올리고머 등) 상태와 반대로 단량체 상태의 활성 성분의 양을 나타낸다. 본원에 기재된 부형제 화합물과 함께 제형화된 치료 단백질의 고농도 용액은 주사기 또는 미리 충전된 주사기를 사용하여 환자에 투여될 수 있다. 따라서, 치료 제형의 안정성은 경과 시간 후 단량체의 상대량에 의해 관찰될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 단량체 백분율과 비교하여 특정 경과 시간 후 더 높은 단량체 백분율로 측정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은 스트레스 조건에 대한 노출 후 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 단량체 백분율과 비교하여 스트레스 조건에 대한 노출 후 더 높은 단량체 백분율로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다.
구현예에서, 본 발명의 치료 제형은 동적 광 산란(DLS) 분석에 의해 측정시 단백질 입자 크기의 증가에 내성이 있다. DLS 분석에서, 치료 단백질의 입자 크기는 중앙 입자 직경으로 관찰될 수 있다. 이상적으로, 치료 단백질의 중앙 입자 직경은 상대적으로 변하지 않아야 한다. 따라서, 중앙 입자 직경의 증가는 응집된 단백질을 나타낼 수 있다. 따라서, 치료 제형의 안정성은 경과 시간 후 중앙 입자 직경의 상대적 변화에 의해 관찰될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형은 동적 광 산란(DLS) 분석에 의해 측정시 다분산 입자 크기 분포를 형성하는 데 내성이 있다. 구현예에서, 본 발명의 치료 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 중앙 입자 직경과 비교하여 특정 경과 시간 후 중앙 입자 직경의 더 낮은 변화 백분율로서 측정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은, 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 중앙 입자 직경의 변화 백분율과 비교하여 스트레스 조건에 노출 후 더 낮은 중앙 입자 직경의 변화 백분율로 측정될 수 있다. 다시 말하면, 구현예에서, 개선된 안정성은 광 산란에 의해 측정시 입자 크기의 증가를 방지한다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은, 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 입자 크기 분포의 다분산성과 비교하여 DLS에 의해 측정시 덜한 다분산 입자 크기 분포로서 측정될 수 있다.
구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형은 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 분석에 의해 측정시 침전에 대해 내성이 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수 값과 비교하여 특정 경과 시간 후 더 낮은 혼탁도, 더 낮은 광 산란 또는 더 낮은 입자 계수로 측정될 수 있다. 구현예에서, 본원에 개시된 바와 같은 치료 제형의 안정성의 개선은 부형제를 함유하지 않는 대조군 제형의 혼탁도, 광 산란 또는 입자 계수와 비교하여 스트레스 조건에 대한 노출 후 더 낮은 혼탁도, 더 낮은 광 산란 또는 더 낮은 입자 계수로 측정될 수 있다. 구현예에서, 스트레스 조건은 저온 저장, 고온 저장, 공기에 대한 노출, 기포에 대한 노출, 전단 조건에 대한 노출 또는 동결/해동 주기에 대한 노출일 수 있다.
구현예에서, 치료 부형제는 산화 손상에 대해 치료 단백질을 안정화시켜 이의 안정성을 개선시키는 항산화 특성을 갖는다. 구현예에서, 치료 제형은 치료 단백질의 인지 가능한 효능의 손실 없이 주위 온도에서 또는 냉장고 조건에서 연장된 기간 동안 저장된다. 구현예에서, 치료 제형은 필요할 때까지 저장을 위해 건조되고; 이후, 적절한 용매, 예를 들어, 물로 재구성된다. 유리하게는, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 제형은 수 개월 내지 수 년의 연장된 기간에 걸쳐 안정적일 수 있다. 예외적으로 장기간 저장이 필요한 경우, 단백질 변성에 대한 두려움 없이 제형은 냉장고에 보존(및 이후 재활성화)될 수 있다. 구현예에서, 제형은 냉장을 필요로 하지 않는 장기 저장을 위해 제조될 수 있다.
구현예에서, 본원에 개시된 부형제 화합물은 안정성 개선량으로 치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 10% 감소시키는 부형제 화합물의 양이며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 치료 제형과 중량 기준으로 실질적으로 유사한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 30% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 50% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 70% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 90% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다.
치료 제형을 제조하기 위한 방법은 숙련된 기술자에게 친숙할 수 있다. 본 발명의 치료 제형은, 예를 들어, 치료 단백질이 용액에 첨가되기 전 또는 후에 제형에 부형제 화합물을 첨가함으로써 제조될 수 있다. 예를 들어, 치료 제형은 치료 단백질과 부형제를 첫 번째(낮은) 농도로 조합한 후, 여과 또는 원심분리에 의해 처리하여 두 번째(높은) 농도의 치료 단백질을 생성함으로써 생성될 수 있다. 치료 제형은 카오트로프(chaotrope), 코스모트로프(kosmotrope), 하이드로트로프(hydrotrope) 및 염과 함께 부형제 화합물 중 하나 이상으로 제조될 수 있다. 치료 제형은 캡슐화, 분산, 리포솜, 비히클 형성 등과 같은 기술을 사용하여 부형제 화합물 중 하나 이상으로 제조될 수 있다. 본원에 개시된 부형제 화합물을 포함하는 치료 제형을 제조하기 위한 방법은 부형제 화합물의 조합을 포함할 수 있다. 구현예에서, 부형제의 조합은 더 낮은 점도, 개선된 안정성 또는 감소된 주사 부위 통증에서 이점을 발생시킬 수 있다. 보존제, 계면활성제, 당, 수크로스, 트레할로스, 다당류, 아르기닌, 프롤린, 히알루로니다제, 안정화제, 완충제 등을 포함하는 다른 첨가제가 제조 동안 치료 제형에 도입될 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 약학적으로 허용되는 부형제 화합물은 비독성이고, 동물 및/또는 인간 투여에 적합한 화합물이다.
4. 비-치료 제형
일 양태에서, 본원에 개시된 제형 및 방법은 유효량의 비-치료 단백질 및 부형제 화합물을 포함하는 개선되거나 감소된 점도의 안정한 액체 제형을 제공한다. 구현예에서, 제형은 허용 가능한 농도의 활성 성분 및 허용 가능한 점도를 제공하면서 안정성을 개선시킨다. 구현예에서, 제형은 대조군 제형과 비교하는 경우 안정성의 개선을 제공하며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 비-치료 제형과 모든 면에서 건조 중량 기준으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다.
액체 단백질 제형의 점도는 단백질 자체(예를 들어, 효소, 구조 단백질, 가수분해 정도 등)의 특성; 이의 크기, 3차원 구조, 화학적 조성 및 분자량; 제형에서의 이의 농도; 단백질 이외의 제형의 성분; 원하는 pH 범위; 및 제형에 대한 저장 조건을 포함하나, 이에 제한되지는 않는 다양한 요인에 의해 영향을 받을 수 있음이 이해된다.
구현예에서, 비-치료 제형은 적어도 25 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 비-치료 제형은 적어도 100 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 다른 구현예에서, 비-치료 제형은 적어도 200 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 또 다른 구현예에서, 비-치료 제형 용액은 적어도 300 mg/mL의 단백질 활성 성분을 함유한다. 일반적으로, 본원에 개시된 부형제 화합물은 약 5 내지 약 300 mg/mL의 양으로 비-치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 10 내지 약 200 mg/mL의 양으로 첨가된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 약 20 내지 약 100 mg/mL의 양으로 첨가된다. 구현예에서, 부형제는 약 25 내지 약 75 mg/mL의 양으로 첨가된다.
다양한 분자량의 부형제 화합물은 제형에서 단백질 활성 성분과 조합되는 경우 특정한 유리한 특성을 위해 선택된다. 부형제 화합물을 포함하는 비-치료 제형의 예가 하기에 제공된다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <5000 Da의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <1000 Da의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 <500 Da의 분자량을 갖는다.
구현예에서, 본원에 개시된 부형제 화합물은 점도 감소량으로 비-치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 10% 감소시키는 부형제 화합물의 양이며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 치료 제형과 모든 면에서 건조 중량 기준으로 동일한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 30% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 50% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 70% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 점도 감소량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 점도를 적어도 90% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다.
구현예에서, 점도 감소량은 100 cP 미만의 점도를 갖는 비-치료 제형을 생성한다. 다른 구현예에서, 비-치료 제형은 50 cP 미만의 점도를 갖는다. 다른 구현예에서, 비-치료 제형은 20 cP 미만의 점도를 갖는다. 또 다른 구현예에서, 비-치료 제형은 10 cP 미만의 점도를 갖는다. 본원에서 사용되는 용어 "점도"는 동적 점도 값을 나타낸다.
본 발명의 개시에 따른 비-치료 제형은 제형의 안정성을 개선시키는 특정한 유리한 특성을 가질 수 있다. 구현예에서, 비-치료 제형은 전단 분해, 상 분리, 혼탁, 산화, 탈아미드화, 응집, 침전 및 변성에 대해 내성이 있다. 구현예에서, 치료 제형은 대조군 제형과 비교하여 더 효과적으로 처리되고, 정제되고, 저장되고, 펌핑되고, 여과되고, 원심분리될 수 있다.
구현예에서, 비-치료 부형제는 산화 손상에 대해 비-치료 단백질을 안정화시켜 이의 안정성을 개선시키는 항산화 특성을 갖는다. 구현예에서, 비-치료 제형은 비-치료 단백질에 대한 인지 가능한 효능의 손실 없이 주위 온도에서 또는 냉장고 조건에서 연장된 기간 동안 저장된다. 구현예에서, 비-치료 제형은 필요할 때까지 저장을 위해 건조되고; 이후, 적절한 용매, 예를 들어, 물로 재구성될 수 있다. 유리하게는, 본원에 기재된 바와 같이 제조된 제형은 수 개월 내지 수 년의 연장된 기간에 걸쳐 안정적이다. 예외적으로 장기간 저장이 필요한 경우, 단백질 변성에 대한 두려움 없이 제형은 냉장고에 보존(및 이후 재활성화)된다. 구현예에서, 제형은 냉장을 필요로 하지 않는 장기 저장을 위해 제조된다.
구현예에서, 본원에 개시된 부형제 화합물은 안정성 개선량으로 비-치료 제형에 첨가된다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 10% 감소시키는 부형제 화합물의 양이며; 본 발명의 개시의 목적을 위해, 대조군 제형은 부형제 화합물이 결여된 것을 제외하고는 치료 제형과 건조 중량 기준으로 실질적으로 유사한 단백질 활성 성분을 함유하는 제형이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 30% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 50% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 70% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다. 구현예에서, 안정성 개선량은 대조군 제형과 비교하는 경우 제형의 분해를 적어도 90% 감소시키는 부형제 화합물의 양이다.
본원에 개시된 부형제 화합물을 포함하는 비-치료 제형을 제조하기 위한 방법은 숙련된 기술자에게 친숙할 수 있다. 예를 들어, 부형제 화합물은 비-치료 단백질이 용액에 첨가되기 전 또는 후에 제형에 첨가될 수 있다. 비-치료 제형은 첫 번째(낮은) 농도에서 생성된 후, 여과 또는 원심분리에 의해 처리되어 두 번째(높은) 농도를 생성할 수 있다. 비-치료 제형은 카오트로프, 코스모트로프, 하이드로트로프 및 염과 함께 부형제 화합물 중 하나 이상으로 제조될 수 있다. 비-치료 제형은 캡슐화, 분산, 리포솜, 비히클 형성 등과 같은 기술을 사용하여 부형제 화합물 중 하나 이상으로 제조될 수 있다. 보존제, 계면활성제, 안정화제 등을 포함하는 다른 첨가제가 제조 동안 비-치료 제형에 도입될 수 있다.
5. 부형제 화합물
각각 하나 이상의 치료 또는 비-치료 단백질과 함께 사용하기에 적합한 여러 부형제 화합물이 본원에 기재되며, 각각은 고농도의 단백질(들)을 함유하도록 제형이 구성되는 것을 가능하게 한다. 하기 기재되는 부형제 화합물의 범주 중 일부는 (1) 힌더드 아민; (2) 음이온성 방향족; (3) 기능화된 아미노산; (4) 올리고펩티드; (5) 단쇄 유기산; (6) 저분자량 지방족 다중산; (7) 디온 및 설폰; (8) 쯔비터이온성 부형제; 및 (9) 수소 결합 요소를 갖는 군집제이다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 본원에 기재된 부형제 화합물은 달리 입자간(즉, 단백질-단백질) 상호작용에 관여할 치료 단백질의 특정 단편, 서열, 구조 또는 섹션과 회합하는 것으로 생각된다. 이들 부형제 화합물과 치료 또는 비-치료 단백질의 회합은 단백질이 과도한 용액 점도를 유발하지 않고 고농도로 제형화될 수 있도록 단백질간 상호작용을 차폐할 수 있다. 구현예에서, 부형제 화합물은 보다 안정적인 단백질-단백질 상호작용을 발생시킬 수 있으며; 단백질-단백질 상호작용은 단백질 확산 파라미터 kD 또는 삼투성 제2 비리얼 계수 B22, 또는 숙련된 기술자에게 친숙한 다른 기술에 의해 측정될 수 있다.
부형제 화합물은 유리하게는 수용성일 수 있으므로 수성 비히클과 함께 사용하기에 적합하다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >1 mg/mL의 수 용해도를 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >10 mg/mL의 수 용해도를 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >100 mg/mL의 수 용해도를 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물은 >500 mg/mL의 수 용해도를 갖는다. 구현예에서, 부형제 화합물의 용해도를 증가시키기 위해 공존용질(cosolute) 또는 하이드로트로프가 부형제 화합물과 조합하여 첨가될 수 있다. 예를 들어, 특정 부형제는 치료 단백질을 함유하는 수용액에서 제한된 용해도를 가질 수 있으며, 이러한 용해도는 저온 저장 조건에서 훨씬 낮을 수 있다. 저온 저장 조건 또는 주위 실온 또는 상승된 온도 조건에서 용액 내의 부형제의 용해도를 증가시키기 위해 공존용질 또는 하이드로트로프가 첨가될 수 있다. 공존용질 및 하이드로트로프의 예는 벤조에이트 염, 벤질 알콜, 페닐알라닌, 니코틴아미드, 프롤린, 프로카인, 2,5-디하이드록시벤조에이트, 티라민 및 사카린을 포함한다. 치료 단백질의 경우, 유리하게는, 부형제 화합물은 생물학적으로 허용되고, 비-면역원성이고, 따라서 약학적 용도에 적합한 물질로부터 유래될 수 있다. 치료적 구현예에서, 부형제 화합물은 생물학적으로 양립되고 비-면역원성인 부산물을 생성하기 위해 체내에서 대사될 수 있다.
a. 부형제 화합물 범주 1: 힌더드 아민
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 부형제 화합물로서 힌더드 아민 소분자와 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "힌더드 아민"은 하기 예와 일치하는 적어도 하나의 부피가 큰 또는 입체 장애 그룹을 함유하는 소분자를 나타낸다. 힌더드 아민은 유리 염기 형태, 양성자화 형태 또는 이 둘의 조합으로 사용될 수 있다. 양성자화 형태에서, 힌더드 아민은 클로라이드, 하이드록시드, 브로마이드, 요오다이드, 플루오라이드, 아세테이트, 포르메이트, 포스페이트, 설페이트 또는 카르복실레이트와 같은 음이온성 반대이온과 회합될 수 있다. 부형제 화합물로서 유용한 힌더드 아민 화합물은 2차 아민, 3차 아민, 4차 암모늄, 피리디늄, 피롤리돈, 피롤리딘, 피페리딘, 모르폴린 또는 구아니디늄 기를 함유할 수 있어, 부형제 화합물이 중성 pH의 수용액에서 양이온 전하를 갖도록 한다. 힌더드 아민 화합물은 또한 적어도 하나의 부피가 큰 또는 입체 장애 기, 예를 들어, 사이클릭 방향족, 지환족, 사이클로헥실 또는 알킬기를 함유한다. 구현예에서, 입체 장애 기는 그 자체가 디알킬아민, 트리알킬아민, 구아니디늄, 피리디늄 또는 4차 암모늄 기와 같은 아민기일 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 힌더드 아민 화합물은 양이온 파이 상호작용에 의해 페닐알라닌, 트립토판 및 티로신과 같은 단백질의 방향족 섹션과 회합하는 것으로 생각된다. 구현예에서, 힌더드 아민의 양이온성 기는 단백질의 방향족 아미노산 잔기의 전자 풍부 파이 구조에 대한 친화성을 가질 수 있으므로, 이들은 단백질의 이들 섹션을 보호할 수 있으며, 이에 따라 상기 보호된 단백질이 회합하고 응집하는 경향을 감소시킬 수 있다.
구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 이미다졸, 이미다졸린, 또는 이미다졸리딘 기, 또는 이의 염, 예를 들어, 이미다졸, 1-메틸이미다졸, 4-메틸이미다졸, 1-헥실-3-메틸이미다졸륨 클로라이드, 1,3-디메틸-2-이미다졸리디논, 히스타민, 4-메틸히스타민, 알파-메틸히스타민, 베타히스틴, 베타-알라닌, 2-메틸-2-이미다졸린, 1-부틸-3-메틸이미다졸륨 클로라이드, 요산, 포타슘 우레이트, 베타졸, 카르노신, 아스파탐, 사카린, 아세설팜 포타슘, 잔틴, 테오필린, 테오브로민, 카페인, 및 안세린을 포함하는 화학 구조를 갖는다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 디메틸에탄올아민, 디메틸아미노프로필아민, 트리에탄올아민, 디메틸벤질아민, 디메틸사이클로헥실아민, 디에틸사이클로헥실아민, 디사이클로헥실메틸아민, 헥사메틸렌 비구아니드, 폴리(헥사메틸렌 비구아니드), 이미다졸, 리신, 메틸글리신, 사르코신, 디메틸글리신, 아그마틴, 디아자바이사이클로[2.2.2]옥탄, 폴리닌산 소듐 염, 폴리닌산 칼슘 염, 테트라메틸에틸렌디아민, N,N-디메틸에탄올아민, 에탄올아민 포스페이트, 글루코사민, 콜린 클로라이드, 포스포콜린, 니아신아미드, 이소니코틴아미드, N,N-디에틸 니코틴아미드, 니코틴산 소듐 염, 이소니코틴산 염, 티라민, 3-아미노피리딘, 2,4,6-트리메틸피리딘, 3-피리딘 메탄올, 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 비오틴, 모르폴린, N-메틸피롤리돈, 2-피롤리디논, 디피리다몰, 프로카인, 리도카인, 디시안디아미드-타우린 부가물, 2-피리딜에틸아민, 6-하이드록시피리딘-2-카르복실산, 디시안디아미드-벤질 아민 부가물, 디시안디아미드-알킬아민 부가물, 디시안디아미드-사이클로알킬아민 부가물, 및 디시안디아미드-아미노메탄포스폰산 부가물로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 1-(1-아다만틸) 에틸아민, 1-아미노벤조트리아졸, 2-디메틸아미노에탄올, 2-메틸-2-이미다졸린, 2-메틸이미다졸, 3-아미노벤즈아미드, 3-인돌아세트산, 4-아미노피리딘, 6-아미노-1,3-디메틸우라실, 아세틸콜린, 아그마틴 설페이트, 벤즈알코늄 클로라이드, 에틸 3-아미노벤조에이트, 설파세타미드, 부틸 안트라닐레이트, 아미노 히푸르산, 벤즈아미드 옥심, 벤제토늄 클로라이드, 벤질아민, 베르베린 클로라이드, 카스타노스퍼민, 클레미졸, 사이클로세린, 페닐세린, DL-3-페닐세린, 시스테아민, 시티딘, 디에탄올아민, 디펜히드라민, DL-노르에피네프린, 도파민, 엠트리시타빈, 에탄올아민, 구안파신, 이소니코틴아미드, 리튬 클로라이드, 메글루민, 메틸 시티딘, 미리스틸 감마 피콜리늄 클로라이드, 니아신아미드, 페닐에틸아민, 폴리에틸렌이민, 피리독신, 라사길린 메실레이트, 세로토닌, 시네프린, 네아민, 스퍼민, 스퍼미딘, 1,3-디아미노프로판, 아데노신, 클로로퀸 포스페이트, 시스타민, 피리딜 에틸아민, 테트라메틸에틸렌디아민, 트립타민, 티라민, 1-메틸이미다졸, 스펙티노마이신, 사이클로헥산 메틸아민, N,N-디메틸펜에틸아민, 펜에틸아민, 테트라에틸암모늄, 테트라메틸 암모늄 아세테이트, 디사이클로민, 호르데닌, 메틸아미노에틸피리딘, 니코틴아미드 리보시드, 1-부틸이미다졸, 1-헥실이미다졸, 1-메틸이미다졸, 2-에틸이미다졸, 2-n-부틸이미다졸, 2-메틸이미다졸, 1-도데실이미다졸, C1 내지 C12 탄화수소 사슬을 갖는 1 또는 2 위치에서 알킬화된 다른 이미다졸, 프리디놀 메탄설포네이트, 헤민, N,N-디메틸펜에틸아민, 보글리보스, N-에틸-L-글루타민, 니코틴, 피페라진, 데메클로사이클린, 및 이들의 염으로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 펜에틸아민 작용기, 예를 들어, 펜에틸아민, 디펜히드라민, N-메틸펜에틸아민, N,N-디메틸펜에틸아민, β,3-디하이드록시펜에틸아민, β,3-디하이드록시-N-메틸펜에틸아민, 3-하이드록시펜에틸아민, 4-하이드록시펜에틸아민, 티로시놀, 티라민, N-메틸티라민, 및 호르데닌을 가질 수 있다. 바람직하게는, 펜에틸아민 함유 구조는 비-정신활성 화합물이다.
힌더드 아민 구조의 적합한 염은 클로라이드, 브로마이드, 아세테이트, 시트레이트, 설페이트 및 포스페이트일 수 있다. 구현예에서, 본 발명의 개시와 일치하는 힌더드 아민 화합물은 양성자화 암모늄 염으로 제형화된다. 구현예에서, 본 발명의 개시와 일치하는 힌더드 아민 화합물은 반대이온으로서 무기 음이온 또는 유기 음이온과 함께 염으로 제형화된다.
구현예에서, 치료 또는 비-치료 단백질의 고농도 용액은 부형제 화합물로서 카페인과 벤조산, 하이드록시벤조산 또는 벤젠설폰산의 조합으로 제형화된다. 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 체내에서 대사되어 생물학적으로 양립되는 부산물을 생성한다. 일부 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 약 250 mg/mL 이하의 농도로 제형에 존재한다. 추가 구현예에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 약 10 mg/mL 내지 약 200 mg/mL의 농도로 제형에 존재한다. 또 다른 추가 양태에서, 힌더드 아민 부형제 화합물은 약 20 내지 약 120 mg/mL의 농도로 제형에 존재한다.
구현예에서, 이러한 힌더드 아민 범주의 점도 감소 부형제는 이들의 낮은 수 용해도로 인해 이들의 사용이 전형적으로 제한되었지만 카페인 및 테오필린과 같은 메틸잔틴을 포함할 수 있다. 일부 적용에서, 낮은 수 용해도에도 불구하고 이들 점도 감소 부형제의 고 농축 용액을 갖는 것이 유리할 수 있다. 예를 들어, 가공시, 부형제를 첨가하는 것은 단백질을 원하는 최종 농도 이하로 희석시키지 않으므로 농축된 단백질 용액에 첨가될 수 있는 농축된 부형제 용액을 갖는 것이 유리할 수 있다. 다른 경우에, 이의 낮은 수 용해도에도 불구하고, 최종 단백질 제형의 원하는 점도 감소, 안정성, 긴장성 등을 달성하기 위해 추가적인 점도 감소 부형제가 필요할 수 있다. 구현예에서, 고도로 농축된 부형제 용액은 (i) 유효 점도 감소량보다 1.5 내지 50배 더 높은 농도의 점도 감소 부형제, 또는 (ii) 298 K에서 순수한 물 중 이의 문헌에 보고된 용해도(예를 들어, 문헌[The Merck Index; Royal Society of Chemistry; Fifteenth Edition, (April 30, 2013)]에 보고된 바와 같음)보다 1.5 내지 50배 더 높은 농도의 점도 감소 부형제, 또는 둘 모두로서 제형화될 수 있다.
특정 공존용질은 이들 낮은 용해도 점도 감소 부형제의 용해도 한계를 실질적으로 증가시켜, 문헌에 보고된 용해도 값보다 여러 배 높은 농도의 부형제 용액을 허용하는 것으로 밝혀졌다. 이들 공존용질은 일반적인 하이드로트로프 범주로 분류될 수 있다. 이러한 적용에서 용해도에서 가장 큰 개선을 제공하는 것으로 밝혀진 공존용질은 일반적으로 주위 온도 및 생리학적 pH에서 물에서 매우 가용성이었고(> 0.25 M), 피리딘 또는 벤젠 고리를 함유하였다. 공존용질로서 유용할 수 있는 화합물의 예는 아닐린 HCl, 이소니아신아미드, 니아신아미드, n-메틸티라민 HCl, 페놀, 프로카인 HCl, 레조르시놀, 사카린 칼슘 염, 사카린 소듐 염, 소듐 아미노벤조산, 소듐 벤조에이트, 소듐 파라하이드록시벤조에이트, 소듐 메타하이드록시벤조에이트, 소듐 2,5-디하이드록시벤조에이트, 소듐 살리실레이트, 소듐 설파닐레이트, 소듐 파라하이드록시벤젠 설포네이트, 시네프린, 및 티라민 HCl을 포함한다.
구현예에서, 특정 힌더드 아민 부형제 화합물은 다른 약리학적 특성을 가질 수 있다. 예로서, 잔틴은 전신적으로 흡수되는 경우 자극제 특성 및 기관지확장제 특성을 포함하여 일반적으로 독립적인 약리학적 특성을 갖는 힌더드 아민의 범주이다. 대표적인 잔틴은 카페인, 아미노필린, 3-이소부틸-1-메틸잔틴, 파라잔틴, 펜톡시필린, 테오브로민, 테오필린 등을 포함한다. 메틸화 잔틴은 심장 수축, 심박수 및 기관지확장의 힘에 영향을 미치는 것으로 이해된다. 일부 구현예에서, 잔틴 부형제 화합물은 약 30 mg/mL 이하의 농도로 제형에 존재한다.
독립적인 약리학적 특성을 갖는 힌더드 아민의 또 다른 범주는 국소 주사 가능한 마취제 화합물이다. 국소 주사 가능한 마취제 화합물은 (a) 친지질성 방향족 고리, (b) 중간 에스테르 또는 아미드 결합, 및 (c) 2차 또는 3차 아민의 3-성분 분자 구조를 갖는 힌더드 아민이다. 힌더드 아민의 이러한 범주는 소듐 이온의 유입을 억제하여 국소 마취를 유도함으로써 신경 전도를 방해하는 것으로 이해된다. 국소 마취제 화합물에 대한 친지질성 방향족 고리는 탄소 원자(예를 들어, 벤젠 고리)로 형성될 수 있거나, 이는 헤테로원자(예를 들어, 티오펜 고리)를 포함할 수 있다. 대표적인 국소 주사 가능한 마취제 화합물은 아밀로카인(amylocaine), 아르티카인(articaine), 부피비카인(bupivicaine), 부타카인(butacaine), 부타닐리카인(butanilicaine), 클로르프로카인(chlorprocaine), 코카인(cocaine), 사이클로메티카인(cyclomethycaine), 디메토카인(dimethocaine), 에디토카인(editocaine), 헥실카인(hexylcaine), 이소부카인(isobucaine), 레보부피바카인(levobupivacaine), 리도카인(lidocaine), 메타부테타민(metabutethamine), 메타부톡시카인(metabutoxycaine), 메피바카인(mepivacaine), 메프릴카인(meprylcaine), 프로폭시카인(propoxycaine), 프릴로카인(prilocaine), 프로카인(procaine), 피페로카인(piperocaine), 테트라카인(tetracaine), 트리메카인(trimecaine) 등을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 국소 주사 가능한 마취제 화합물은 단백질 치료 제형에서 감소된 점도, 개선된 안정성 및 주사시 감소된 통증과 같은 다수의 이점을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 국소 마취제 화합물은 약 50 mg/mL 이하의 농도로 제형에 존재한다.
구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 갖는 힌더드 아민이 본원에 기재된 제형 및 방법에 따라 부형제 화합물로 사용된다. 일부 구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 갖는 부형제 화합물은 약리학적 효과를 갖지 않고/않거나 치료적으로 효과적이지 않은 양으로 존재한다. 다른 구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 갖는 부형제 화합물은 약리학적 효과를 갖고/갖거나 치료적으로 효과적인 양으로 존재한다. 특정 구현예에서, 독립적인 약리학적 특성을 갖는 힌더드 아민은 제형 점도를 감소시키기 위해 선택된 또 다른 부형제 화합물과 조합하여 사용되며, 여기서 독립적인 약리학적 특성을 갖는 힌더드 아민은 이의 약리학적 활성의 이점을 부여하기 위해 사용된다. 예를 들어, 제형 점도를 감소시키고, 또한 제형의 주사시 통증을 감소시키기 위해 국소 주사 가능한 마취제 화합물이 사용될 수 있다. 주사 통증의 감소는 마취 특성에 의해 야기될 수 있고; 또한, 부형제에 의해 점도가 감소되는 경우 더 낮은 주사 힘이 필요할 수 있다. 대안적으로, 국소 주사 가능한 마취제 화합물은 제형의 점도를 감소시키는 또 다른 부형제 화합물과 조합되는 동안 제형 주사 동안 감소된 국소 감각의 바람직한 약리학적 이점을 부여하기 위해 사용될 수 있다.
b. 부형제 화합물 범주 2: 음이온성 방향족
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 부형제 화합물로서 음이온성 방향족 소분자와 함께 제형화될 수 있다. 음이온성 방향족 부형제 화합물은 페닐, 벤질, 아릴, 알킬벤질, 하이드록시벤질, 페놀, 하이드록시아릴, 헤테로방향족 기 또는 융합된 방향족 기와 같은 방향족 작용기를 함유할 수 있다. 음이온성 방향족 부형제 화합물은 또한 카르복실레이트, 옥사이드, 페녹사이드, 설포네이트, 설페이트, 포스포네이트, 포스페이트 또는 설파이드와 같은 음이온성 작용기를 함유할 수 있다. 음이온성 방향족 부형제는 산, 소듐 염 또는 기타로 기재될 수 있지만, 부형제는 다양한 염 형태로 사용될 수 있음이 이해된다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 단백질의 양이온성 세그먼트와 회합할 수 있는 부피가 큰 입체 장애 분자인 것으로 생각되어, 이들은 단백질의 이들 섹션을 보호하여 단백질 함유 제형이 점성이 되도록 되거나 안정성 문제를 발생시키는 단백질 분자 사이의 상호작용을 감소시킬 수 있다.
구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물의 예는 살리실산, 아미노살리실산, 하이드록시벤조산, 아미노벤조산, 파라-아미노벤조산, 벤젠설폰산, 하이드록시벤젠설폰산, 4-페닐부티르산, 나프탈렌설폰산, 1,5-나프탈렌디설폰산, 2,6-나프탈렌디설폰산, 2,7-나프탈렌디설폰산, 하이드로퀴논 설폰산, 설파닐산, 바닐린산, 호모바닐린산, 바닐린, 바닐린-타우린 부가물, 아미노페놀, 안트라닐산, 신남산, 메나디온 소듐 바이설파이트, 4-하이드록시-3-메톡시신남산, 카페산, 클로로겐산, 겐티스산, 쿠마린산, 아데노신 모노포스페이트, 인돌 아세트산, 포타슘 우레이트, 푸란 디카르복실산, 푸란-2-아크릴산, 2-푸란프로피온산, 소듐 페닐피루베이트, 소듐 하이드록시페닐피루베이트, 트리메톡시벤조산, 디하이드록시벤조산, 페로센카르복실산, 트리하이드록시벤조산, 피로갈롤, 벤조산, 및 이들 산의 염과 같은 화합물을 포함한다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 이온화된 염 형태로 제형화된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 화합물은 디메틸사이클로헥실암모늄 하이드록시벤조에이트와 같은 힌더드 아민의 염으로 제형화된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 유기 양이온과 같은 다양한 반대이온으로 제형화된다. 구현예에서, 치료 또는 비-치료 단백질의 고농도 용액은 음이온성 방향족 부형제 화합물 및 카페인과 함께 제형화된다. 구현예에서, 음이온성 방향족 부형제 화합물은 체내에서 대사되어 생물학적으로 양립되는 부산물을 생성한다.
구현예에서, 방향족 부형제 화합물의 예는 페놀 및 폴리페놀을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "페놀"은 적어도 하나의 하이드록실 기에 결합된 적어도 하나의 방향족 기 또는 융합된 방향족 기로 구성되는 유기 분자를 나타내고, 용어 "폴리페놀"은 하나 초과의 페놀 기로 구성되는 유기 분자를 나타낸다. 상기 부형제는 특정 상황에서, 예를 들어, 용액 점도를 낮추기 위해 치료적 또는 비치료적 PEG화 단백질의 고농도 용액과 함께 제형에 사용되는 경우에 유리할 수 있다. 페놀의 비제한적인 예는 벤젠디올 레조르시놀(1,3-벤젠디올), 카테콜(1,2-벤젠디올) 및 하이드로퀴논(1,4-벤젠디올), 벤젠트리올 하이드록시퀴놀(1,2,4-벤젠트리올), 피로갈롤(1,2,3-벤젠트리올), 및 플로로글루시놀(1,3,5-벤젠트리올), 벤젠테트롤 1,2,3,4-벤젠테트롤 및 1,2,3,5-벤젠테트롤, 및 벤젠펜톨 및 벤젠헥솔을 포함한다. 폴리페놀의 비제한적인 예는 탄닌산, 엘라그산, 에피갈로카테킨 갈레이트, 카테킨, 탄닌, 엘라기탄닌 및 갈로탄닌을 포함한다. 보다 일반적으로, 페놀 및 폴리페놀 화합물은 플라보노이드, 리그난, 페놀산 및 스틸벤을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 플라보노이드 화합물은 안토시아닌, 칼콘, 디하이드로칼콘, 디하이드로플라바놀, 플라바놀, 플라바논, 플라본, 플라보놀 및 이소플라보노이드를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 페놀 산은 하이드록시벤조산, 하이드록시신남산, 하이드록시페닐아세트산, 하이드록시페닐프로판산 및 하이드록시페닐펜탄산을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 다른 폴리페놀 화합물은 알킬메톡시페놀, 알킬페놀, 커큐미노이드, 하이드록시벤즈알데하이드, 하이드록시벤조케톤, 하이드록시신남알데하이드, 하이드록시쿠마린, 하이드록시페닐프로펜, 메톡시페놀, 나프토퀴논, 하이드로퀴논, 페놀 테르펜, 레스베라트롤 및 티로솔을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 구현예에서, 폴리페놀은 탄닌산이다. 구현예에서, 페놀은 갈산이다. 구현예에서, 페놀은 피로갈롤이다. 구현예에서, 페놀은 레조르시놀이다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 예를 들어, 갈산, 피로갈롤 및 레조르시놀과 같은 페놀 화합물의 하이드록실 기는 PEG 사슬의 백본 내의 에테르 산소 원자와 수소 결합을 형성하며, 이에 따라 용액 점도가 감소되도록 PEG 용액 구조를 근본적으로 변화시키는 페놀/PEG 복합체를 형성한다. 탄닌산과 같은 폴리페놀 화합물은 갈산, 피로갈롤 및 레조르시놀과 같은 이들 각각의 페놀기 빌딩 블록으로부터의 이들의 점도 감소 특성이 유래된다. 폴리페놀 화합물 내의 페놀기의 특정 조직은 페놀 첨가에 의해 달성된 점도 감소가 각각의 폴리페놀의 더 적은 양의 첨가에 의해 향상되는 복잡한 거동을 발생시킬 수 있다.
c. 부형제 화합물 범주 3: 기능화된 아미노산
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 하나 이상의 기능화된 아미노산과 함께 제형화될 수 있으며, 여기서 단일한 기능화된 아미노산 또는 하나 이상의 기능화된 아미노산을 포함하는 올리고펩티드가 부형제 화합물로 사용될 수 있다. 구현예에서, 기능화된 아미노산 화합물은 아미노산을 생성하기 위해 가수분해되거나 대사될 수 있는 분자("아미노산 전구체")를 포함한다. 구현예에서, 기능화된 아미노산은 페닐, 벤질, 아릴, 알킬벤질, 하이드록시벤질, 하이드록시아릴, 헤테로방향족 기 또는 융합된 방향족 기와 같은 방향족 작용기를 함유할 수 있다. 구현예에서, 기능화된 아미노산 화합물은 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 벤질, 사이클로알킬, 글리세릴, 하이드록시에틸, 하이드록시프로필, PEG 및 PPG 에스테르와 같은 에스테르화된 아미노산을 함유할 수 있다. 구현예에서, 기능화된 아미노산 화합물은 아르기닌 에틸 에스테르, 아르기닌 메틸 에스테르, 아르기닌 하이드록시에틸 에스테르 및 아르기닌 하이드록시프로필 에스테르로 구성된 군으로부터 선택된다. 구현예에서, 기능화된 아미노산 화합물은 중성 pH에서 수용액 중의 하전된 이온 화합물이다. 예를 들어, 단일 아미노산은 아세테이트 또는 벤조에이트와 같은 에스테를 형성하여 유도체화될 수 있으며, 가수분해 생성물은 아미노산과 함께 아세트산 또는 벤조산(둘 모두는 천연 물질임)이 될 것이다. 구현예에서, 기능화된 아미노산 부형제 화합물은 체내에서 대사되어 생물학적으로 양립되는 부산물을 생성한다.
d. 부형제 화합물 범주 4: 올리고펩티드
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 부형제 화합물로서 올리고펩티드와 함께 제형화될 수 있다. 구현예에서, 올리고펩티드는 구조가 하전된 섹션 및 부피가 큰 섹션을 갖도록 설계된다. 구현예에서, 올리고펩티드는 2 내지 10개의 펩티드 서브유닛으로 구성된다. 올리고펩티드는 이기능성, 예를 들어, 비-극성의 것에 커플링된 양이온성 아미노산, 또는 비-극성의 것에 커플링된 음이온성 아미노산일 수 있다. 구현예에서, 올리고펩티드는 2 내지 5개의 펩티드 서브유닛으로 구성된다. 구현예에서, 올리고펩티드는 폴리글루탐산, 폴리아스파르트산, 폴리-리신, 폴리-아르기닌 및 폴리-히스티딘과 같은 호모펩티드이다. 구현예에서, 올리고펩티드는 순 양이온 전하를 갖는다. 다른 구현예에서, 올리고펩티드는 Trp2Lys3와 같은 헤테로펩티드이다. 구현예에서, 올리고펩티드는 ABA 반복 패턴과 같은 교대 구조를 가질 수 있다. 구현예에서, 올리고펩티드는 음이온성 및 양이온성 아미노산 둘 모두, 예를 들어, Arg-Glu, Lys-Glu, His-Glu, Arg-Asp, Lys-Asp, His-Asp, Glu-Arg, Glu-Lys, Glu-His, Asp-Arg, Asp-Lys 및 Asp-His를 함유할 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 올리고펩티드는 고점도 용액 및 안정성 문제를 발생시키는 분자간 상호작용을 감소시키는 방식으로 단백질과 회합할 수 있는 구조를 포함하며; 예를 들어, 올리고펩티드-단백질 회합은 전하-전하 상호작용일 수 있으며, 이는 단백질 주위의 수화 층의 수소 결합을 방해하여 점도를 낮추거나 안정성을 개선시키는 다소 비극성인 아미노산을 남긴다. 일부 구현예에서, 올리고펩티드 부형제는 약 50 mg/mL 이하의 농도로 조성물에 존재한다.
e. 부형제 화합물 범주 5: 단쇄 유기산
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 부형제 화합물로서 단쇄 유기산으로 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "단쇄 유기산"은 C2-C6 유기산 화합물 및 이의 염, 에스테르, 아미드 또는 락톤을 나타낸다. 이러한 범주는 포화 및 불포화 카르복실산, 하이드록시 기능화 카르복실산, 아미드, 및 선형, 분지형 또는 고리형 카르복실산을 포함한다. 구현예에서, 단쇄 유기산의 산 기는 카르복실산, 설폰산, 포스폰산 또는 이의 염이다.
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 부형제 화합물로서 단쇄 유기산, 예를 들어, 소르브산, 발레르산, 프로피온산, 카프로산 및 아스코르브산의 산 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 이러한 범주의 부형제 화합물의 예는 포타슘 소르베이트, 칼슘 글루코네이트, 글루쿠론산, 칼슘 락테이트, 2-하이드록시락테이트, 소듐 글리콜레이트, 포타슘 글리콜레이트, 암모늄 글리콜레이트, 소듐 발프로에이트, 타우린, 아세토하이드록삼산, 아세톤 소듐 바이설파이트 부가물, 아세틸 하이드록시프롤린, 칼슘 프로피오네이트, 마그네슘 프로피오네이트, 소듐 프로피오네이트, 소듐 아스코르베이트 및 이들의 염을 포함한다.
f. 부형제 화합물 범주 6: 저 분자량 다중산
치료 또는 비-치료 단백질 또는 PEG화 단백질의 용액은 용액 점도를 낮추거나 안정성을 개선할 수 있는 특정한 부형제 화합물과 함께 제형화될 수 있으며, 상기 부형제 화합물은 저분자량 다중산이다. 저분자량 다중산은 유기 다중산 또는 무기 다중산을 포함할 수 있다. 이들 저분자량 다중산 부형제는 또한 다른 부형제와 조합하여 사용될 수 있다.
구현예에서, 유기 다중산은 저분자량 지방족 다중산으로 구조화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "저분자량 지방족 다중산"은 약 1500 Da 미만의 분자량을 갖고, 적어도 2개의 산성 기를 갖는 유기 지방족 다중산을 나타내며, 여기서 산성 기는 양성자-공여 모이어티인 것으로 이해된다. 산성 기의 비제한적인 예는 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 니트레이트 및 니트라이트 기를 포함한다. 저분자량 지방족 다중산의 산성 기는 카르복실레이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설포네이트, 설페이트, 니트레이트 및 니트라이트와 같은 음이온성 염 형태로 존재할 수 있으며; 이들의 반대이온은 소듐, 포타슘, 리튬 및 암모늄일 수 있다. 본원에 기재된 바와 같이 PEG화 단백질과 상호작용하는 데 유용한 저분자량 지방족 다중산의 특정 예는 옥살산, 아디프산, 피멜산, 수베르산, 아젤라산, 세바스산, 숙신산, 말레산, 타르타르산, 글루타르산, 말론산, 이타콘산, 메틸 말론산, 아젤라산, 시트르산, 3,6,9-트리옥사운데칸디온산, 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA), 아스파르트산, 피롤리돈 카르복실산, 피로글루탐산, 글루탐산, 알렌드론산, 메드론산, 에티드론산 및 이들의 염을 포함한다.
다른 구현예에서, 저분자량 다중산은 무기 다중산이다. 음이온성 염 형태의 저분자량 다중산의 추가 예는 포스페이트(PO4 3-), 수소 포스페이트(HPO4 2-), 디하이드로겐 포스페이트(H2PO4 -), 설페이트, 바이설페이트(HSO4 -), 피로포스페이트(P2O7 4-), 헥사메타포스페이트, 보레이트, 카르보네이트(CO3 2-) 및 바이카르보네이트(HCO3 -)를 포함한다. 음이온성 염에 대한 반대이온은 Na, Li, K 또는 암모늄 이온일 수 있다.
구현예에서, 저분자량 지방족 다중산은 또한 알파 하이드록시 산일 수 있으며, 여기서 제1 산성 기에 인접한 하이드록실 기, 예를 들어, 글리콜산, 락트산 및 글루콘산 및 이들의 염이 존재한다. 구현예에서, 저분자량 지방족 다중산은 2개 초과의 산성 기를 보유하는 올리고머 형태, 예를 들어, 폴리아크릴산, 폴리포스페이트, 폴리펩티드 및 이들의 염이다. 일부 구현예에서, 저분자량 지방족 다중산 부형제는 약 50 mg/mL 이하의 농도로 조성물에 존재한다.
g. 부형제 화합물 범주 7: 디온 및 설폰
효과적인 점도 감소 또는 안정화 부형제는 298K에서 적어도 1 g/L로 순수한 물에 용해되고, pH7에서 순 중성 전하를 갖는 설폰, 설폰아미드 또는 디온 작용기를 함유하는 분자일 수 있다. 바람직하게는 분자는 1000 g/mol 미만, 더욱 바람직하게는 500 g/mol 미만의 분자량을 갖는다. 점도를 감소시키고/시키거나 안정성을 개선시키는 데 효과적인 디온 및 설폰은 다중 이중 결합을 갖고, 수용성이고, pH7에서 순 전하 또는 음이온성 전하를 갖지 않고, 강한 수소 결합 공여체가 아니다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 이중 결합 특성은 단백질과의 약한 파이-스태킹 상호작용을 허용할 수 있다. 구현예에서, 높은 단백질 농도 및 고농도에서 높은 점도만 발생하는 단백질에서, 하전된 부형제는 정정기적 상호작용이 더 긴 범위의 상호작용이므로 효과적이지 않다. 용매화된 단백질 표면은 주로 친수성이므로 이들을 수용성으로 만든다. 단백질의 소수성 영역은 일반적으로 3차원 구조 내에서 보호되지만, 상기 구조는 지속적으로 진화하고, 언폴딩되고, 재폴딩되며(때때로, "호흡(breathing)"이라고 언급됨), 인접한 단백질의 소수성 영역이 서로 접촉하게 되어 소수성 상호작용에 의한 응집을 발생시킬 수 있다. 디온 및 설폰 부형제의 파이-스태킹 특징은 상기 "호흡" 중에 노출될 수 있는 소수성 패치를 차폐할 수 있다. 부형제의 또 다른 다른 중요한 역할은 근접한 단백질 사이의 소수성 상호작용 및 수소 결합을 방해하는 것일 수 있으며, 이는 용액 점도를 효과적으로 감소시킬 것이다. 이러한 설명에 맞는 디온 및 설폰 화합물은 디메틸설폰, 에틸 메틸 설폰, 에틸 메틸 설포닐 아세테이트, 에틸 이소프로필 설폰, 소듐 사이클라메이트, 비스(메틸설포닐)메탄, 메탄 설폰아미드, 메티오닌 설폰, 1,2-사이클로펜탄디온, 1,3-사이클로펜탄디온, 1,4-사이클로펜탄디온 및 부탄-2,3-디온을 포함한다.
h. 부형제 화합물 범주 8: 쯔비터이온성 부형제
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 안정성을 개선하거나 점도를 감소시키기 위해 부형제로서 특정한 쯔비터이온성 화합물과 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "쯔비터이온성"은 양이온 하전된 섹션 및 음이온 하전된 섹션을 갖는 화합물을 나타낸다. 구현예에서, 쯔비터이온성 부형제 화합물은 아민 옥사이드이다. 구현예에서, 반대 전하는 2-8개의 화학 결합에 의해 서로 분리된다. 구현예에서, 쯔비터이온성 부형제 화합물은 약 50 내지 약 500 g/mol의 분자량을 갖는 것과 같은 소분자일 수 있거나, 약 500 내지 약 2000 g/mol의 분자량을 갖는 것과 같은 중간 분자량 분자일 수 있거나, 약 2000 내지 약 100,000 g/mol의 분자량을 갖는 폴리머와 같은 고분자량 분자일 수 있다.
쯔비터이온성 부형제 화합물의 예는 (3-카르복시프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드, 1-아미노사이클로헥산 카르복실산, 호모사이클로류신, 1-메틸-4-이미다졸아세트산, 3-(1-피리디노)-1-프로판설포네이트, 4-아미노벤조산, 알렌드로네이트, 아미노에틸 설폰산, 아미노히푸르산, 아스파탐, 아미노트리스 (메틸렌포스폰산)(ATMP), 칼코부트롤, 칼테리돌, 코카미도프로필 베타인, 코카미도프로필 하이드록시설테인, 크레아틴, 시티딘 모노포스페이트, 디아미노피멜산, 디에틸렌트리아민펜타아세트산, 디메틸 페닐알라닌, 메틸글리신, 사르코신, 디메틸글리신, 쯔비터이온성 디펩티드(예를 들어, Arg-Glu, Lys-Glu, His-Glu, Arg-Asp, Lys-Asp, His-Asp, Glu-Arg, Glu-Lys, Glu-His, Asp-Arg, Asp-Lys, Asp-His), 디에틸렌트리아민 펜타(메틸렌 포스폰산)(DTPMP), 디팔미토일 포스파티딜콜린, 엑토인, 에틸렌디아민 테트라(메틸렌포스폰산)(EDTMP), 폴레이트 벤조에이트 혼합물, 폴레이트 니아신아미드 혼합물, 젤라틴, 하이드록시프롤린, 이미노디아세트산, 이소구바신, 레시틴, 미리스타민 옥사이드, 니코니아미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), N-메틸 아스파르트산, N-메틸프롤린, N-트리메틸 리신, 오르니틴, 옥솔린산, 리센드로네이트, 알릴 시스테인, S-알릴-L-시스테인, 소마파시탄, 타우린, 테아닌, 트리고넬린, 비가바트린, 엑토인, 4-(2-하이드록시에틸)-1-피페라진에탄설포네이트, o-옥틸포스포릴 콜린, 니코틴아미드 모노뉴클레오티드, 트리글리신, 테트라글리신, β-구아니디노프로피온산, 5-아미노레불린산 하이드로클로라이드, 피콜린산, 리도페닌, 포스포콜린, 1-(5-카르복시펜틸)-4-메틸피리딘-1-윰 브로마이드, L-안세린 니트레이트, 환원된 L-글루타티온, N-에틸-L-글루타민, N-메틸 프롤린, (Z)-1-[N-(2-아미노에틸)-N-(2-암모니오에틸)아미노]디아젠-1-윰-1,2-디올레이트(DETA-NONOate), (Z)-1-[N-(3-아미노프로필)-N-(3-암모니오프로필)아미노]디아젠-1-윰-1,2-디올레이트(DPTA-NONate) 및 졸레드론산을 포함한다.
이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 쯔비터이온성 부형제 화합물은 단백질과의 상호작용, 예를 들어, 단백질이 응집에 대해 더욱 내성이 되도록 하는 전하 상호작용, 소수성 상호작용 및 입체 상호작용에 의해, 또는 전해질 분포, 표면 장력 감소, 이용 가능한 결합되지 않은 물의 양의 변화 또는 유전 상수의 변화와 같은 단백질 제형에서 물의 벌크 특성에 영향을 줌으로써 점도 감소 또는 안정화 효과를 발휘할 수 있다.
i. 부형제 화합물 범주 9: 수소 결합 요소를 갖는 군집제
치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 안정성을 개선하거나 점도를 감소시키기 위해 부형제로서 수소 결합 요소를 갖는 군집제와 함께 제형화될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "군집제"는 용액에서 단백질을 용해시키는 데 이용 가능한 물의 양을 감소시켜 유효 단백질 농도를 증가시키는 제형 첨가제를 나타낸다. 구현예에서, 군집제는 단백질 입자 크기를 감소시키거나, 용액에서 언폴딩되는 단백질의 양을 감소시킬 수 있다. 구현예에서, 군집제는 수소 결합 및 수화 효과에 의해 물의 구조화를 야기시키는 용매 개질제로서 작용할 수 있다. 구현예에서, 군집제는 용액에서 단백질 사이의 분자간 상호작용의 양을 감소시킬 수 있다. 구현예에서, 군집제는 산소, 황 또는 질소 원자에 부착된 수소와 같은 적어도 하나의 수소 결합 공여체 요소를 함유하는 구조를 갖는다. 구현예에서, 군집제는 약 6 내지 약 11의 pKa를 갖는 적어도 하나의 약한 산성 수소 결합 공여체 요소를 함유하는 구조를 갖는다. 구현예에서, 군집제는 약 2 내지 약 50개의 수소 결합 공여체 요소를 함유하는 구조를 갖는다. 구현예에서, 군집제는 루이스 염기와 같은 적어도 하나의 수소 결합 수용체 요소를 함유하는 구조를 갖는다. 구현예에서, 군집제는 약 2 내지 약 50개의 수소 결합 수용체 요소를 함유하는 구조를 갖는다. 구현예에서, 군집제는 약 50 내지 500 g/mol의 분자량을 갖는다. 구현예에서, 군집제는 약 100 내지 350 g/mol의 분자량을 갖는다. 다른 구현예에서, 군집제는 라피노스, 이눌린, 풀루란 또는 시니스트린과 같은 500 g/mol 이상의 분자량을 가질 수 있다.
수소 결합 요소를 갖는 군집제 부형제의 예는 1,3-디메틸-3,4,5,6-테트라하이드로-2(1H)-피리미디온, 15-크라운-5, 18-크라운-6, 2-부탄올, 2-부타논, 2-페녹시에탄올, 아세트아미노펜, 알란토인, 아라비노스, 아라비톨, 벤질 아세톤아세테이트, 벤질 알콜, 클로로부탄올, 콜레스탄올테트라아세틸-b-글루코시드, 신남알데하이드, 사이클로헥사논, 데옥시리보스, 디에틸 카르보네이트, 디메틸 카르보네이트, 디메틸 이소소르바이드, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 디메틸올 에틸렌 우레아, 디메틸우라실, 에피락토스, 에리트리톨, 에리트로스, 에틸 락테이트, 에틸 말톨, 에틸렌 카르보네이트, 포름아미드, 푸코스, 갈락토스, 제니스테인, 겐티스산 에탄올아미드, 글루코노락톤, 글리세르알데하이드, 글리세롤, 글리세롤 카르보네이트, 글리세롤 포르말, 글리세롤 우레탄, 글리시리즈산, 고시핀, 하르파고사이드, 헤데라코시드 C, 이코덱스트린, 이디톨, 이미다졸리돈, 이노시톨, 이눌린, 이소말티톨, 코직산, 락티톨, 락토비온산, 락토스, 락툴로스, 릭소스, 마데카소사이드, 말토트리오스, 망기페린, 만노스, 멜지토스, 메틸 락테이트, 메틸피롤리돈, 모그로시드 V, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸글루코사민, N-아세틸뉴라민산, N-메틸 아세트아미드, N-메틸 포름아미드, N-메틸 프로피온아미드, 펜타에리트리톨, 피노레시놀 디글루코시드, 피라세탐, 프로필 갈레이트, 프로필렌 카르보네이트, 프시코스, 풀룰란, 피로갈롤, 퀸산, 라피노스, 레바우디오시드 A, 람노스, 리비톨, 리보스, 리불로스, 사카린, 세도헵툴로스, 시니스트린, 솔케탈, 스타키오스, 수클랄로스, 타가토스, t-부탄올, 테트라글리콜, 트리아세틴, N-아세틸-d-만노사민, 니스토스, 케스토스, 투라노스, 아카르보스, D-사카린산 1,4-락톤, 티오디갈락토시드, 푸코이단, 하이드록시사플로르 옐로우 A, 시키미산, 디오스민, 프라바스타틴 소듐 염, D-알트로스, L-굴로닉 감마-락톤, 네오마이신, 루부소사이드 디하이드로아르테미시닌, 플로로글루시놀, 나린긴, 바이칼레인, 헤스페리딘, 아피게닌, 피로갈롤, 모린, 살살레이트, 카엠프페롤, 미리세틴, 3',4',7-트리하이드록시이소플라본, (±)-탁시폴린, 실리빈, 페르세이톨 디포르말, 4-하이드록시페닐피루브산, 설파세타미드, 이소프로필 β-D-1-티오갈락토피라노시드, 에틸 2,5-디하이드록시벤조에이트, 스펙티노마이신, 레스베라트롤, 퀘르세틴, 카나마이신 설페이트, 1-(2-피리미딜)피페라진, 2-(2-피리딜)에틸아민, 2-이미다졸리돈, DL-1,2-이소프로필리덴글리세롤, 메트포르민, m-자일릴렌디아민, 데메클로사이클린, 트리프로필렌 글리콜, 투베이모시드 I, 베르베날로시드, 자일리톨 및 자일로스를 포함한다.
6. 단백질/부형제 용액: 특성 및 공정
특정 구현예에서, 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이의 조합물(이하, "부형제 첨가제"), 예를 들어, 힌더드 아민, 음이온성 방향족, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 다중산, 디온 및 설폰, 쯔비터이온성 부형제 및 수소 결합 요소를 갖는 군집제와 함께 제형화된 치료 또는 비-치료 단백질의 용액은 단백질 확산 상호작용 파라미터, kD 또는 제2 비리알 계수 B22에 의해 측정시 개선된 단백질-단백질 상호작용 특징을 발생시킨다. 본원에서 사용되는 바와 같은, 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이의 조합물을 사용하는 시험 제형에 의해 달성된 하나 이상의 단백질-단백질 상호작용 파라미터에서의 "개선"은 시험 제형이 부형제 화합물 또는 부형제 첨가제를 함유하지 않는 동등한 제형을 이용하여 동등한 조건하에서 비교되는 경우 끌어당기는 단백질-단백질 상호작용의 감소를 나타낼 수 있다. 상기 개선은 전체 공정 또는 이의 양태에 적용되는 특정 파라미터를 측정하여 확인될 수 있으며, 여기서 파라미터는 변경이 정량될 수 있고, 이전 상태 또는 대조군과 비교될 수 있는 공정에 속하는 임의의 메트릭이다. 파라미터는 공정 자체, 예를 들어, 이의 효율, 비용, 수율 또는 속도와 관련될 수 있다. 처리 동안 단백질 함유 제형의 안정성을 개선시키는 것은 제형에서의 개선된 수율, 증가된 생물학적 활성 및 미립자의 감소된 존재의 장점을 가질 수 있다.
파라미터는 또한 특징 또는 더 큰 공정의 양태와 관련된 프록시 파라미터일 수 있다. 예로서, kD 또는 B22 파라미터와 같은 파라미터는 프록시 파라미터로 언급될 수 있다. kD 및 B22의 측정은 상기 산업의 표준 기술을 사용하여 제조될 수 있으며, 개선된 용액 특성 또는 용액에서의 단백질의 안정성과 같은 공정 관련 파라미터의 지표일 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 고도로 음의 kD 값은 단백질이 강한 끌어당기는 상호작용을 가짐을 나타낼 수 있으며, 이는 응집, 불안정성 및 레올로지 문제를 발생시킬 수 있음이 이해된다. 특정한 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이의 조합물의 존재하에서 제형화되는 경우, 동일한 단백질은 더 적은 음의 kD 값 또는 0에 가깝거나 이를 초과하는 kD 값의 개선된 프록시 파라미터를 가질 수 있으며, 이러한 개선된 프록시 파라미터는 공정-관련 파라미터에서의 개선관 관련된다.
구현예에서, 특정한 상기 기재된 부형제 화합물 또는 이의 조합물, 예를 들어, 힌더드 아민, 음이온성 방향제, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 지방족 다중산, 디온 및 설폰, 쯔비터이온성 부형제 및 수소 결합 요소를 갖는 군집제는 여과, 주사, 전달, 펌핑, 혼합, 열 전달에 의한 가열 또는 냉각, 기체 전달, 원심분리, 크로마토그래피, 막 분리, 원심분리 농축, 접선 흐름 여과, 방사 흐름 여과, 축류 여과, 동결건조 및 젤 전기영동과 같은 처리 방법을 사용하여 단백질 함유 용액의 제조, 처리, 살균 충전, 정제 및 분석과 같은 단백질 관련 공정을 개선시키는 데 사용된다. 이들 및 관련 단백질-관련 공정에서, 관심 단백질은 처리 장치를 통해 이를 전달하는 용액에 용해된다. 본원에서 "담체 용액"으로 언급되는 상기 용액은 세포 배양 배지(예를 들어, 관심 분비 단백질을 함유함), 숙주 세포의 용해 후의 용해질 용액(관심 단백질이 용해질에 존재하는 경우), 용리 용액(크로마토그래피 분리 후 관심 단백질을 함유함), 전기영동 용액, 처리 장치의 도관을 통해 관심 단백질을 운반하기 위한 수송 용액 등을 포함할 수 있다. 관심 단백질을 함유하는 담체 용액은 또한 단백질 함유 용액 또는 단백질 용액으로 언급될 수 있다. 하기에 보다 상세히 기재되는 바와 같이, 하나 이상의 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이의 조합이 처리의 다양한 양태를 개선시키기 위해 단백질 함유 용액에 첨가될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "개선시키다", "개선" 등은 파라미터가 대조군 용액에서 측정된 것과 동일한 파라미터와 비교되는 경우 담체 용액에서의 관심 파라미터에서의 유리한 변화를 나타낸다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "대조군 용액"은 점도 감소 부형제가 결여되지만, 다른 면에서는 담체 용액과 실질적으로 유사한 용액을 의미한다. 본원에서 사용되는 "대조군 공정", 예를 들어, 대조군 여과 공정, 대조군 크로마토그래피 공정 등은 관심 단백질-관련 공정과 실질적으로 유사하고 담체 용액 대신 대조군 용액과 함께 수행되는 단백질-관련 공정이다.
예를 들어, 단백질 함유 용액이 도관(예를 들어, 유동 챔버, 배관 또는 관류)을 통해 펌핑되는 공정에서, 점도를 감소시키기 위해 상기 확인된 부형제 화합물 또는 조합물을 첨가하는 것이 유리하다. 펌핑 공정 전 또는 동안 상기 기재된 바와 같이 단백질 용액에 점도 저하 부형제를 첨가하는 것은 용액을 펌핑하는 데 필요한 힘 및 동력을 실질적으로 감소시킬 수 있다. 유체는 일반적으로 흐름에 대한 저항, 즉, 점도를 나타내고, 흐름을 유도하고 전파하기 위해 이러한 점도를 극복하기 위해 유체에 힘이 적용되어야 하는 것이 이해된다. 펌핑에 필요한 동력 P는 하기 방정식에 제시된 것처럼 헤드 H 및 용량 Q로 스케일링된다:
P ~ HQ (방정식 1)
점성 유체는 펌프에 대한 동력 요구사항을 증가시키고, 펌프 효율을 낮추고, 펌프 헤드 및 용량을 감소시키고, 배관의 마찰 저항을 증가시키는 경향이 있다. 펌핑 전 또는 펌핑 동안 단백질 용액에 상기 기재된 점도 저하 부형제를 첨가하는 것은 헤드(H, 방정식 1) 또는 용량(Q, 방정식 1) 또는 둘 모두를 감소시킴으로서 처리 비용을 실질적으로 낮출 수 있다. 감소된 점도의 이점은, 예를 들어, 개선된 처리량, 증가된 수율 또는 감소된 처리 시간으로 나타날 수 있다. 또한, 도관을 통한 유체의 전달로부터의 마찰 손실은 상기 유체 전달과 관련된 비용의 유의한 부분을 차지할 수 있다. 펌핑 전 또는 펌핑 동안 단백질 용액에 상기 기재된 바와 같은 점도 저하 부형제를 첨가하는 것은 펌핑 공정에 수반되는 마찰을 감소시킴으로써 처리 비용을 실질적으로 낮출 수 있다. 처리 비용의 측정은 점도 감소 부형제를 사용하여 개선될 수 있는 처리 파라미터를 나타낸다.
단백질 용액에 대한 이러한 공정 및 처리 방법은 제조, 처리, 정제 및 분석 단계 동안 용액 내의 단백질의 낮은 점도, 개선된 용해도 또는 개선된 안정성으로 인해 효율적으로 개선될 수 있다. 처리 효율의 측정 또는 용액 중의 단백질의 점도, 용해도 또는 안정성과 같은 프록시 파라미터의 측정은 점도 감소 부형제를 사용하여 개선될 수 있는 처리 파라미터를 나타낸다. 처리 동안 단백질 점도, 용해도 및 안정성에 부정적으로 영향을 미치는 여러 상이한 요인이 이해된다. 예를 들어, 단백질 함유 용액은 펌핑, 혼합, 원심분리 및 여과를 포함하나, 이에 제한되지는 않는 전형적인 처리 작업을 통해 단백질 용액을 조작하여 유도되는 유의한 전단 스트레스를 포함하여 제조 및 정제 동안 다양한 물리적 스트레스인자에 적용된다. 또한, 이들 처리 단계 동안, 단백질이 흡착할 수 있는 유체 내에 기포가 혼입될 수 있다. 처리 동안 조우되는 전형적인 전단 스트레스와 커플링된 상기 계면 장력은 흡착된 단백질 분자가 언폴딩되고 응집되도록 할 수 있다. 또한, 펌프 공동화 사건 동안 및 초여과 및 정용여과 막과 같은 제조 동안의 고체 표면에 대한 노출 동안 유의한 단백질 언폴딩이 발생할 수 있다. 상기 사건은 단백질 폴딩 및 생성 품질을 손상시킬 수 있다.
뉴턴 유체의 경우, 제공된 공정에 의해 부과되는 스트레스 τ는 하기 방정식에 제시된 바와 같이 전단 속도
Figure pct00001
, 및 유체의 점도
Figure pct00002
로 스케일링된다:
Figure pct00003
(방정식 2)
상기 기재된 부형제 화합물 또는 이의 조합물 중 하나 이상으로 단백질 용액을 제형화함으로써, 용액 점도는 감소될 수 있고, 따라서 단백질 용액이 조우하는 전단 스트레스를 감소시킬 수 있다. 감소된 전단 스트레스는, 예를 들어, 처리 파라미터의 더 낫거나 더 바람직한 측정에 의해 나타나는 바와 같이 처리되는 제형의 안정성을 개선시킬 수 있다. 이러한 개선된 처리 파라미터는 단백질 응집체, 입자 또는 눈에 보이지 않는 입자(혼탁도처럼 육안으로 나타남)의 감소된 수준, 감소된 생성물 손실 또는 개선된 전체 수율과 같은 메트릭을 포함할 수 있다. 개선된 처리 파라미터의 또 다른 예로서, 단백질 함유 용액의 점도를 감소시키는 것은 용액에 대한 처리 시간을 감소시킬 수 있다. 제공된 단위 작업에 대한 처리 시간은 일반적으로 전단 속도와 반비례한다. 따라서, 제공된 특징적 스트레스에 대해, 상기 기재된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물의 첨가에 의한 단백질 용액 점도의 감소는 전단 속도(
Figure pct00004
, 방정식 2 참조)의 증가 및 이에 따라 처리 시간의 감소와 관련된다. 또한, 상기 확인된 특정한 부형제 화합물 또는 이의 조합물의 첨가는 상이한 처리 단계 동안 단백질 용액의 안정성을 개선시킬 수 있다.
처리 동안, 용액 내의 단백질은 원하는 단백질 활성 성분, 예를 들어, 치료 또는 비-치료 단백질일 수 있음이 이해된다. 본원에 기재된 부형제를 사용하여 상기 단백질 활성 성분의 처리를 촉진하는 것은 단백질 활성 성분의 수율 또는 생성 속도를 증가시키거나, 특정 공정의 효율을 개선시키거나, 에너지 사용을 감소키거나 기타 등등일 수 있으며, 이들 결과 중 어느 것도 점도 감소 부형제의 사용에 의해 개선된 처리 파라미터를 나타낸다. 또한, 단백질 오염물질은 특정 처리 기술 동안, 예를 들어, 생물공정의 발효 및 정제 단계 동안 형성될 수 있음이 이해된다. 오염물질을 더 신속하거나, 더 완전하거나, 더 효율적으로 제거하는 것은 또한 원하는 단백질, 즉, 단백질 활성 성분의 처리를 개선시킬 수 있으며; 이들 결과는 점도 감소 부형제 화합물 또는 첨가제의 사용에 의해 개선된 처리 파라미터를 나타낸다. 본원에 기재된 바와 같이, 용액 점도를 낮추고/낮추거나, 단백질 안정성을 개선시키고/시키거나, 단백질 용해도를 증가시킴에 의해 본원에 기재된 바와 같은 특정 부형제는 원하는 단백질 활성 성분의 수송을 개선시킬 수 있고, 원하지 않는 단백질 오염물질의 제거를 개선시킬 수 있으며; 점도 감소 부형제 또는 첨가제의 사용에 의해 개선된 처리 파라미터를 나타내는 둘 모두의 효과는 이들 부형제 또는 첨가제가 단백질 제조의 전체 공정을 개선시키는 것을 나타낸다. 용액 중의 미스폴딩된 단백질, 미립자, 변성된 단백질 또는 분안정화된 단백질의 기타 인공물의 감소는 처리 단계 동안 안정화 부형제의 사용에 의해 달성될 수 있다.
치료 단백질 생성 및 정제를 위한 특정 플랫폼 단위 작업은 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물의 유리한 사용의 추가 예, 및 이들 부형제 또는 첨가제의 개선 처리 파라미터의 추가 예를 제공한다. 예를 들어, 하기 기재되는 바와 같이 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물 중 하나 이상을 이들 생성 및 정제 공정에 도입하는 것은 분자 안정성 및 회수의 실질적인 개선 및 작업 비용의 감소를 제공할 수 있다.
모노클로날 항체와 같은 치료 단백질을 생성하고 정제하기 위해 널리 실시되는 기술은 일반적으로 발효 공정에 이어 정제 처리를 위한 일련의 단계로 구성되는 것이 당 분야에서 이해된다. 발효 또는 업스트림 처리(USP)는 전형적으로 박테리아 또는 포유동물 세포주를 사용하여 생물반응기에서 치료 단백질이 성장되는 단계를 포함한다. USP는, 구현예에서, 도 4에 제시된 것과 같은 단계를 포함할 수 있다. 정제 또는 다운스트림 처리(DSP)는, 구현예에서, 도 5에 제시된 것과 같은 단계를 포함할 수 있다.
도 4에 제시된 바와 같이, USP는 마스터 세포 은행(MCB)으로부터 바이알을 해동하는 단계(102)로 시작할 수 있다. MCB는 단계(104)에 제시된 바와 같이 확장되어 작업 세포 은행(제시되지 않음)을 형성하고/하거나 추가 생성을 위한 작업 스톡을 생성할 수 있다. 세포 배양은 단계(108 및 110)에 제시된 바와 같이 일련의 시드 및 생성 생물반응기에서 발생하여 단계(114)에 제시된 바와 같이 원하는 치료 단백질이 수확될 수 있는 생물반응기 생성물(112)을 생성한다. 수확(114) 후, 생성물은 추가 정제(즉, 하기에 더 상세히 설명되고 도 5에 도시되는 바와 같은 DSP)에 제공될 수 있거나, 이들 생성물은 전형적으로 대략 -80℃의 온도에서의 동결 및 저장에 의해 벌크 상태로 저장될 수 있다.
구현예에서, 세포 배양 기술에 의한 단백질 생성은 공정-관련 파라미터의 개선에 의해 나타난 바와 같이 상기 확인된 부형제의 사용에 의해 개선될 수 있다. 구현예에서, 원하는 부형제는 USP 동안 세포 배양 배지의 점도를 적어도 20%만큼 감소시키는 데 효과적인 양으로 첨가될 수 있다. 다른 구현예에서, 원하는 부형제는 USP 동안 세포 배양 배지의 점도를 적어도 30%만큼 감소시키는 데 효과적인 양으로 첨가될 수 있다. 구현예에서, 원하는 부형제는 약 1 mM 내지 약 400 mM의 양으로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 구현예에서, 원하는 부형제는 약 20 mM 내지 약 200 mM의 양으로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 구현예에서, 원하는 부형제는 약 25 mM 내지 약 100 mM의 양으로 세포 배양 배지에 첨가될 수 있다. 원하는 부형제 또는 부형제의 조합물은 세포 배양 배지에 직접 첨가될 수 있거나, 이는 더 복잡한 보충 배지의 성분으로서, 예를 들어, 별도로 제형화되고 세포 배양 배지에 첨가되는 영양소 함유 용액 또는 "급송 용액"으로서 첨가될 수 있다. 구현예에서, 제2 부형제, 예를 들어, 점도 감소 화합물은 직접 또는 보충 배지를 통해 담체 용액에 첨가될 수 있으며, 여기서 제2 점도 감소 화합물은 특정 관심 파라미터에 추가 개선을 추가한다.
하기 기재되는 바와 같이, 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물 중 하나 이상의 사용에 의해 개선될 수 있는 USP 동안 많은 공정 관련 파라미터가 존재한다. 예를 들어, 구현예에서, 점도 감소 부형제의 사용은 접종물 확장(104) 및 세포 배양(108 및 110)과 같은 단계 동안 세포 성장 속도 및/또는 정도와 같은 파라미터를 개선시킬 수 있고/있거나 다양한 공정 파라미터에서의 개선과 관련되는 프록시 파라미터를 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 생성 생물반응기 단계(110)와 같은 단계에서 USP 공정에 상기 확인된 특정 부형제를 첨가하는 것은 세포 배양 배지의 점도를 감소시킬 수 있으며, 이는 이후 열 전달 효율 및 기체 전달 효율을 개선시킬 수 있다. 세포 배양 공정은 단백질 발현을 가능하게 하기 위해 세포에 산소 주입을 필요로 하고, 따라서 세포로의 산소의 확산은 속도 제한 단계가 될 수 있으므로, 용액 점도를 감소시켜 기체 전달 효율을 개선시킴으로써 산소 흡수율을 개선시키는 것은 단백질 발현의 속도 또는 양 및/또는 이의 효율을 개선시킬 수 있다. 이러한 맥락에서, 산소 흡수율 및 기체 전달 효율의 비율과 같은 파라미터는 개선이 개선된 단백질 발현 또는 개선된 처리 효율의 공정 파라미터의 개선과 상관 관계가 있는 프록시 파라미터로 간주될 수 있다. 또 다른 예로서, 점도 감소 부형제의 이용 가능성은, 예를 들어, 단백질 발현에 필요한 단백질 성장 인자의 용해도와 같은 프록시 파라미터를 개선시킴으로써 접종물 확장 단계(104) 동안 및 세포 배양 단계(108 및 110) 동안 처리를 개선시킬 수 있으며, 개선된 성장 인자 용해도와 함께, 이들 물질은 세포에 더욱 이용 가능하게 되어 세포 성장을 촉진할 수 있다.
구현예에서, USP 동안 단백질 회수량 또는 단백질 회수율과 같은 공정 파라미터는 여러 메커니즘에 의해 USP 동안 점도를 감소시킴으로써 개선될 수 있다. 예를 들어, 완성된 세포 배양으로부터의 수확(114) 동안 용해 단계의 끝에서 치료 단백질의 수확은 더 효율적일 수 있거나, 상기 확인된 부형제의 사용으로 달리 개선될 수 있다. 이론으로 제한하고자 하는 것은 아니지만, 발현된 단백질의 점도를 개선시킴으로써, 이들 점도 감소 부형제는 다른 용해질 성분으로부터 멀리 떨어진 치료 단백질의 확산 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 단백질 함유 상층액으로부터의 막 및 기타 세포 파편의 분리는 점도 감소 부형제의 사용으로 더 신속한 분리 속도 또는 더 높은 상층액 순도의 정도로 달성될 수 있어 이에 의해 USP 효율의 공정 파라미터를 개선시킬 수 있다. 더욱이, 원심분리 또는 여과 단계를 사용하는 단백질 분리 단계는 점도 감소 부형제의 사용으로 더 신속하게 달성될 수 있는데, 이는 상기 부형제가 배지의 점도를 감소시키기 때문이다. 부형제는 또한 치료 단백질 용액의 안정성을 개선시킬 수 있으므로, 단백질의 업스트림 및 다운스트림 처리는 이들 부형제의 사용으로부터 이익을 얻을 수 있다. 구현예에서, 부형제는 처리 동안 단백질의 스트레스 내성을 개선시킬 수 있으며, 이는 처리 단계 동안 단백질의 응집 또는 변성의 양을 감소시킬 수 있다.
구현예에서, 추가 이점으로서, 상기 기재된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물, 예를 들어, 점도 감소 부형제의 세포 배양에서의 사용은 단백질 미스폴딩 및 응집이 감소되기 때문에 USP 동안 단백질 수율과 같은 공정 파라미터를 증가시킬 수 있다. 세포 배양이 재조합 단백질의 최대 수율을 생성하도록 최적화됨에 따라, 생성된 단백질은 고도로 농축된 방식으로 발현되고, 이는 미스폴딩을 발생시킬 수 있으며; 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물, 예를 들어, 점도 감소 부형제를 첨가하는 것은 미스폴딩 및 응집을 발생시키는 끌어 당기는 단백질-단백질 상호작용을 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 수확(114)에 이용 가능한 온전한 재조합 단백질의 양을 증가시킬 수 있음이 이해된다.
예시적 구현예에서 도 5에 도시된 다운스트림 처리(DSP)는 치료 단백질, 예를 들어, 모노클로날 항체, 바이오의약품, 백신 및 다른 생물학적 제제의 회수 및 정제를 발생시키는 일련의 단계를 포함한다. USP의 끝에서, 숙주 세포에서 분비된 관심 치료 단백질은 세포 배양 배지에 용해될 수 있다. 치료 단백질은 또한 USP 순서의 끝에서 숙주 세포의 용해 후에 유체 배지에 용해될 수 있다. DSP는 용해된 용액(예를 들어, 배양 배지 또는 숙주 세포 용해질 배지)에서 관심 단백질을 회수하고, 이를 정제하기 위해 수행된다. DSP 동안, (i) 다양한 오염물질(예를 들어, 불용성 세포 파편 및 미립자)이 배지로부터 제거되고, (ii) 단백질 생성물이 추출, 침전, 흡착 또는 초여과와 같은 기술을 통해 분리되고, (iii) 단백질 생성물이 친화성 크로마토그래피, 침전 또는 결정화와 같은 기술을 통해 정제되고, (iv) 생성물이 추가로 연마되고, 바이러스가 제거된다.
도 5에 제시된 바와 같이, 세포 배양물 수확(200)(또한 도 4에 기재된 바와 같음)로부터의 공급원료는 전형적으로 단백질-A 크로마토그래피 또는 다른 유사한 크로마토그래피 단계를 포함하는 친화성 크로마토그래피(204)에 초기에 적용된다. 바이러스 불활성화 단계(208)는 전형적으로 공급원료를 낮은 pH 유지에 적용시키는 것을 수반한다. 하나 이상의 연마 크로마토그래피 단계(210 및 212)는 숙주 세포 단백질(HCP), DNA, 전하 변이체 및 응집체와 같은 불순물을 제거하기 위해 수행된다. 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피는 일반적으로 초기 연마 크로마토그래피 단계(210)로 사용되지만, 선행 또는 후속하는 제2 크로마토그래피 단계(212)가 동반될 수 있다. 제2 크로마토그래피 단계(212)는 숙주 세포 관련 불순물(예를 들어, HCP 또는 DNA) 또는 응집체와 같은 생성물 관련 불순물을 추가로 제거한다. 음이온 교환(AEX) 크로마토그래피 및 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 제2 크로마토그래피 단계(212)로 사용될 수 있다. 바이러스 여과(214)가 바이러스 제거를 수행하기 위해 수행된다. 최종 정제 단계(218)는 초여과 및 정용여과, 및 제형에 대한 제조를 포함할 수 있다.
상기에서 일반적으로 기재되는 바와 같이, 발효 공정 이후의 정제 공정 또는 DSP는 (1) 세포 배양물 수확, (2) 크로마토그래피(예를 들어, 단백질-A 크로마토그래피 및 이온 교환 및 소수성 상호작용 크로마토그래피를 포함하는 크로마토그래피 연마 단계), (3) 바이러스 불활성화 및 (4) 여과(예를 들어, 단백질을 농축하고, 단백질을 제형 완충액으로 교환하기 위한 바이러스 여과, 살균 여과, 투석, 및 초여과 및 정용여과 단계)를 포함할 수 있다. 이들 정제 공정과 관련된 공정 파라미터를 개선시키기 위해 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물, 예를 들어, 점도 감소 부형제를 사용하는 것으로부터의 이점을 예시하기 위해 실시예가 하기에 제공된다. 상기 확인된 부형제 화합물 또는 이들의 조합물, 예를 들어, 점도 감소 부형제는 이를 담체 용액에 첨가하거나, 임의의 다른 방식으로 관심 단백질과 용해성이거나 안정화된 형태이건 간에 부형제의 접촉을 조작함으로써 DSP의 임의의 단계에서 도입될 수 있음이 이해된다. 구현예에서, 제2 부형제, 예를 들어, 점도 감소 화합물은 DSP 동안 담체 용액에 첨가될 수 있으며, 여기서 제2 화합물은 특정 관심 파라미터에 추가 개선을 추가한다.
(1) 세포 배양물 수확: 세포 배양물 수확은 일반적으로 세포 파편이 단백질 함유 용액으로부터 물리적으로 제거되는 원심분리 및 심층 여과 작업을 포함한다. 원심분리 단계는 점도 감소 부형제의 이점으로 세포 파편으로부터 가용성 단백질의 보다 완전한 분리를 제공할 수 있다. 배치(batch)에 의해 수행되든 연속 처리에 의해 수행되는 간에, 원심분리기 분리는 표적 단백질의 회수를 최대화하기 위해 가능한 한 많이 통합시키기 위해 밀집 상을 필요로 한다. 구현예에서, 상기 확인된 부형제 또는 이들의 조합물의 첨가는, 예를 들어, 원심분리기 분리 공정의 밀집 상으로부터 멀리 떨어져 유동하는 단백질 함유 센트레이트(centrate)의 수율을 증가시킴으로써 단백질 수율의 공정 파라미터를 증가시킬 수 있다. 심층 여과 단계는 점도 제한 단계이고, 따라서 용액 점도를 감소시키는 부형제를 사용하여 보다 효율적이 될 수 있다. 이들 공정은 또한 단백질 용액에 기포를 도입할 수 있으며, 이는 전단 유도 스트레스와 커플링되어 정제되는 치료 단백질 분자를 불안정화시킬 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 세포 배양물 수확 전 및/또는 동안 단백질 함유 용액에 점도 감소 부형제를 첨가하는 것은 이들 스트레스로부터 단백질을 보호할 수 있으므로 단백질 응집의 가능성을 감소시키고, 정량화된 생성물 회수의 공정 파라미터를 개선시킬 수 있다.
(2) 크로마토그래피: 원심분리 또는 여과에 의한 세포 배양물 수확 후, 크로마토그래피는 전형적으로 발효 브로쓰로부터 치료 단백질을 분리하는 데 사용된다. 단백질 A 크로마토그래피는 치료 단백질이 항체인 경우에 사용되며: 단백질 A는 IgG 항체에 대해 선택적이며, 이는 높은 유량 및 용량으로 동적으로 결합할 것이다. 양이온 교환(CEX) 크로마토그래피는 단백질 A 크로마토그래피의 비용 효율적인 대안으로 사용될 수 있다. CEX가 사용되는 경우, 동적 결합 능력을 최적화하기 위해 컬럼에 로딩하기 전에 공급물의 pH는 조정되어야 하고 이의 전도도는 감소되어야 한다. 모방 수지가 또한 단백질 A 크로마토그래피에 대한 대안으로 사용될 수 있다. 이들 수지는 면역글로불린에 결합하는 리간드, 예를 들어, 단백질 G 또는 단백질 L과 같은 Ig-결합 단백질, 합성 리간드 또는 단백질 A-유사 다공성 중합체를 제공한다.
다른 크로마토그래피 공정이 DSP 동안 사용될 수 있다. 이온 교환 크로마토그래피(IEC)는 이전 공정 동안 도입된 불순물, 예를 들어, 세포주에서 침출된 단백질 A, 내독소 또는 바이러스, 나머지 숙주 세포 단백질 또는 DNA, 또는 배지 성분을 제거하는 데 사용될 수 있다. IEC는 CEX 또는 음이온 교환 크로마토그래피 여부에 관계 없이 단백질 A 크로마토그래피 직후에 적용될 수 있다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC)는 일반적으로 응집체를 제거하기 위한 연마 단계로서 사용되는 IEC를 보완할 수 있다. 구현예에서, 상기 확인된 부형제의 사용은 크로마토그래피 컬럼 로딩 단계 동안 숙주 세포 단백질의 용해도를 증가시키고 이의 점도를 감소시킬 수 있다. 구현예에서, 상기 확인된 부형제의 사용은 크로마토그래피 컬럼 로딩 단계 및 용리 단계 동안 치료 단백질의 용해도를 증가시키고 이의 점도를 감소시킬 수 있다.
단백질 정제 동안 크로마토그래피 공정은 (a) 단백질-A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리 동안 낮은 pH 조건, (b) 크로마토그래피 수지의 포어-공간 내에서의 상승된 국소 단백질 농도(종종 약 300-400 mg/mL), (c) 이온 교환 크로마토그래피 동안 상승된 염 농도, 및 (d) HIC 컬럼으로부터의 용리 동안 염석 제제의 상승된 농도와 같은 가혹한 조건을 단백질 제형에 부과한다. 상기 기재된 바와 같이 크로마토그래피 전 및/또는 동안 단백질 함유 용액에 점도 감소 부형제를 첨가하는 것은 크로마토그래피 컬럼을 통한 단백질의 이동을 촉진하여 이들이 크로마토그래피 처리 단계에 의해 부과되는 잠재적인 손상 조건에 덜 노출될 수 있도록 한다. 또한, 컬럼 포어-공간 내에서의 상승된 국소 단백질 농도는 이러한 공간 내에서 매우 점성인 물질을 생성할 수 있으며, 이는 컬럼에 유의한 역압을 가할 수 있다. 이러한 역압을 완화시키기 위해, 비교적 큰 포어를 갖는 매질이 전형적으로 사용된다. 그러나, 큰-포어 매질의 분해능은 작은-포어 대응물보다 낮다. 상기 기재된 바와 같은 점도 개질 부형제의 혼입은 크로마토그래피 매질에서 더 작은 포어의 사용을 가능하게 할 수 있다. 구현예에서, 단백질-A 크로마토그래피로부터의 용리 단계는 치료 단백질을 용해도를 감소시키고 표적 단백질의 응집을 증가시킬 수 있는 낮은 pH 조건에 노출시키며; 부형제의 첨가는 단백질-A 크로마토그래피 단계로부터의 회수 수율이 개선되도록 표적 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있다. 다른 구현예에서, 부형제의 사용은 더 높은 pH에서 단백질-A 수지로부터 표적 단백질의 용리를 가능하게 할 수 있고, 이는 표적 단백질에 대한 화학적 스트레스를 감소시킬 수 있어, 결과적으로 처리 동안 단백질 분해의 양을 감소시킴으로써 단백질 수율의 공정 파라미터를 개선시킬 수 있다.
(3) 바이러스 불활성화: 바이러스 불활성화 공정은 전형적으로 단백질 용액을 연장된 기간 동안 낮은 pH, 예를 들어, 4 미만의 pH에서 유지하는 것을 포함한다. 그러나, 이러한 환경은 치료 단백질을 불안정하게 만들 수 있다. 예를 들어, 바이러스 불활성화 공정 전 및/또는 동안 점도 감소 부형제를 첨가하여 점도 감소 부형제의 존재하에 단백질을 제형화하는 것은 단백질의 안정성 또는 용해도, 또는 이의 순 수율과 같은 공정 파라미터를 개선시킬 수 있다.
(4) 여과: 여과 공정은 바이러스 입자를 제거하기 위한 바이러스 여과 공정(나노여과), 및 단백질 용액을 농축시키고 완충 시스템을 교환하기 위한 초여과/정용여과 공정을 포함한다.
(a) 바이러스 여과는 재조합 인간 모노클로날 항체 크기의 약 2배일 수 있는 바이러스 입자를 제거하여 단백질 용액을 정제한다. 따라서, 바이러스 여과를 위한 여과 막은 나노 크기의 포어를 필요로 할 수 있다. 단백질이 통과해야 하는 작은 포어 크기의 결과로서, 이러한 여과 단계는 단백질에 스트레스를 도입할 수 있으며, 단백질 응집 입자로부터의 유의한 수준의 막 오염을 수반한다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 여과 전 및/또는 동안 점도 감소 부형제의 첨가는 집합적 확산성을 증가시킴으로써 여과 시스템에서 역압과 같은 측정 가능한 파라미터를 감소시킬 수 있으며, 이를 발생시키는 단백질-단백질 상호작용을 완화시킴으로써 막 오염에 대한 경향을 감소시킬 수 있다. 최종 결과는 단백질 정제 동안 바이러스 여과 장치의 개선된 성능을 나타내는 이들 파라미터의 개선이다.
(b) 초여과 및 정용여과(UF/DF) 공정은 단백질 함유 용액을 관심 단백질보다 작은 특징적인 분자량 컷오프를 갖는 필터 막을 통해 통과시킴으로써 단백질 용액을 농축시키고 완충 시스템을 교환한다. 이러한 단계에서, 단백질 용액은 필터 장치 내에서 높은 전단 스트레스, 상승된 단백질 농도 및 UF/DF 공정 동안 전형적으로 사용되는 소수성 막에 대한 단백질의 흡착에 직면하며, 이들 모두는 단백질 응집을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 상기 기재된 바와 같이 UF/DF 공정 전 및/또는 동안 점도 감소 부형제의 첨가는 집합적 확산성을 증가(예를 들어, kD 증가에 의해 측정됨)시킴으로써 여과 시스템의 역압을 감소시킬 수 있다. 이는 막을 가로지르는 전단 스트레스를 감소시킬뿐만 아니라 필터 막으로부터 떨어진 역 확산을 촉진하며, 이에 따라 막 경계면에서 유효 단백질 농도를 낮추고, 투과 플럭스를 증가시킨다. 결과적으로, 점도 감소 부형제의 사용은 이들 여과 공정 동안 더 높은 처리량과 관련된 파라미터를 개선시켜 생성물 손실을 감소시키고 순 수율을 증가시킬 수 있다. 또한, 점성 유체를 초여과기 및 정용여과기를 통해 통과시키는 것은 필터 장치 전체에 큰 압력 하락을 발생시켜 분리를 비효율적으로 만들 수 있다. 상기 기재된 바와 같이 점도 감소 부형제의 존재하에서 단백질 용액을 제형화하는 것은 필터 장치에 걸친 압력 하락을 실질적으로 감소시킬 수 있으며, 이에 의해 작업 비용 및 처리 시간의 공정 파라미터 둘 모두를 감소시킴으로써 이 둘을 개선시킬 수 있다.
첨가된 부형제로 업스트림 단백질 처리 또는 다운스트림 정제가 완료된 후, 부형제는 약물 물질 혼합물의 일부로 남아 있을 수 있거나, 이는 단백질 활성 성분으로부터 분리될 수 있다. 완충액 교환, 이온 교환, 초여과 및 투석과 같은 전형적인 소분자 분리 방법이 단백질 활성 성분으로부터 부형제를 분리시키는 데 사용될 수 있다. 상기 설명된 바와 같이 단백질 정제 공정에 대한 유리한 효과에 더하여, 상기 확인된 부형제의 사용은 단백질 제조, 처리 및 정제에 사용되는 장비를 보호하고 보존할 수 있다. 예를 들어, 감소된 오염, 감소된 변성, 낮은 점도 및 단백질의 개선된 용해도로 인해 상기 확인된 부형제의 사용에 의해 단백질 처리 장비의 정화, 살균 및 유지와 같은 장비 관련 공정이 촉진될 수 있으며, 이들 공정의 개선과 관련된 파라미터도 유사하게 개선된다.
업스트림 및/또는 다운스트림 처리를 개선하기 위한 부형제 화합물의 사용이 본원에 광범위하게 기재되었으나, 원하는 효과, 예를 들어, 관심 파라미터의 개선을 달성하기 위해 부형제의 조합물이 함께 첨가될 수 있음이 이해된다. 용어 "부형제 첨가제"는 원하는 효과 또는 개선된 파라미터를 발생시키는 단일 부형제 화합물, 또는 조합이 원하는 효과 또는 개선된 파라미터를 담당하는 부형제 화합물의 조합물을 나타낼 수 있다.
실시예
재료:
· 소 감마 글로불린(BGG), >99% 순도, 카탈로그 #G5009, Sigma Aldrich
· 히스티딘, Sigma Aldrich
· 하기 실시예에 기재된 다른 재료는 달리 명시되지 않는 한 Sigma Aldrich로부터의 것이다.
실시예 1: 부형제 화합물 및 시험 단백질을 함유하는 제형의 제조
부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였으며, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제형에 사용될 비-치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 상이한 부형제 화합물과 함께 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드에서 제조하였다. 히스티딘 하이드로클로라이드를 먼저 증류수 내에 1.94 g 히스티딘을 용해시키고, 1 M 염산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 pH를 약 6.0으로 조정한 후, 부피 플라스크에서 증류수를 이용하여 250 mL의 최종 부피로 희석시킴으로써 제조하였다. 이후, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해시켰다. 부형제의 목록은 하기 실시예 4, 5, 6 및 7에 제공된다. 일부 경우에, 부형제 화합물은 50 mM 히스티딘 HCl에 용해시키기 전에 pH 6으로 조정되었다. 이러한 경우, 부형제 화합물을 먼저 약 5 wt%로 탈이온수에 용해시키고, pH를 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 약 6.0으로 조정하였다. 이후, 제조된 염 용액을 약 65℃의 대류 실험실 오븐에 넣어 물을 증발시키고, 고체 부형제를 분리하였다. 50 mM 히스티딘 HCl 중 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 1 mL 부형제 용액 당 약 0.336 g BGG의 비율로 용해시켰다. 이는 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 발생시켰다. 부형제와 함께 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
실시예 2: 점도 측정
실시예 1에 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다.
실시예 3: 단백질 농도 측정
실험 용액 중의 단백질 농도를 UV/VIS 분광계(Perkin Elmer Lambda 35)에서 280 nm 파장에서 단백질 용액의 광 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 먼저, 기기를 pH 6에서 50 mM 히스티딘 완충액을 사용하여 0 흡광도로 보정하였다. 다음으로, 단백질 용액을 동일한 히스티딘 완충액으로 300배 희석하고, 280 nm에서의 흡광도를 기록하였다. 용액 중의 단백질의 최종 농도를 1.264 mL/(mg x cm)의 흡광 계수 값을 사용하여 계산하였다.
실시예 4: 힌더드 아민 부형제 화합물을 사용한 제형
280 mg/mL BGG를 함유하는 제형을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 일부 샘플은 첨가된 부형제 화합물을 함유하였다. 이들 시험에서, 디메틸사이클로헥실아민(DMCHA), 디사이클로헥실메틸아민(DCHMA), 디메틸아미노프로필아민(DMAPA), 트리에탄올아민(TEA), 디메틸에탄올아민(DMEA) 및 니아신아미드의 하이드로클로라이드 염을 힌더드 아민 부형제 화합물의 예로서 시험하였다. 또한, 힌더드 아민 부형제 화합물의 예로서 DMCHA의 하이드록시벤조산 염 및 타우린-디시안디아미드 부가물을 시험하였다. 각각의 단백질 용액의 점도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과는 하기 표 1에 제시되며, 이는 점도 감소에 있어서 첨가된 부형제 화합물의 이익을 제시한다.
표 1
Figure pct00005
실시예 5: 음이온성 방향족 부형제 화합물을 사용한 제형
280 mg/mL BGG의 제형을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 일부 샘플은 첨가된 부형제 화합물을 함유하였다. 각각의 용액의 점도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과는 하기 표 2에 제시되며, 이는 점도 감소에 있어서 첨가된 부형제 화합물의 이익을 제시한다.
표 2
Figure pct00006
실시예 6: 올리고펩티드 부형제 화합물을 사용한 제형
올리고펩티드(n=5)는 N 말단을 유리 아민으로 및 C 말단을 유리 산을 갖도록 하여 >95% 순도로 NeoBioLab Inc.(Woburn, MA)에 의해 합성되었다. 디펩티드(n=2)는 95% 순도로 LifeTein LLC(Somerset, NJ)에 의해 합성되었다. 280 mg/mL BGG의 제형을 실시예 1에 기재된 바와 같이 제조하였으며, 일부 샘플은 첨가된 부형제 화합물로서 합성 올리고펩티드를 함유하였다. 각각의 용액의 점도를 실시예 2에 기재된 바와 같이 측정하였고, 그 결과는 하기 표 3에 제시되며, 이는 점도 감소에 있어서 첨가된 부형제 화합물의 이익을 제시한다.
표 3
Figure pct00007
실시예 7: 구아닐 타우린 부형제의 합성
구아닐 타우린을 미국 특허 번호 2,230,965호에 기재된 방법에 따라 제조하였다. 타우린(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 3.53 부를 1.42부의 디시안디아미드(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)와 혼합하고, 균질한 혼합물이 획득될 때까지 유발 및 유봉에서 분쇄하였다. 다음으로, 혼합물을 플라스크에 넣고, 4시간 동안 200℃에서 가열하였다. 생성물을 추가 정제 없이 사용하였다.
실시예 8: 부형제 화합물을 함유하는 단백질 제형
부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였으며, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제형에 사용될 비-치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 상이한 부형제 화합물과 함께 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 완충 수용액에서 제조하였다. 히스티딘 하이드로클로라이드 완충액을 먼저 증류수 내에 1.94 g 히스티딘을 용해시키고, 1 M 염산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 pH를 약 6.0으로 조정한 후, 부피 플라스크에서 증류수를 이용하여 250 mL의 최종 부피로 희석시킴으로써 제조하였다. 이후, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl 완충액에 용해시켰다. 부형제 화합물의 목록은 표 4에 제공된다. 일부 경우에, 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl 완충액에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH6을 달성하였다. 일부 경우에, 부형제 화합물은 50 mM 히스티딘 HCl에 용해시키기 전에 pH 6으로 조정되었다. 이러한 경우, 부형제 화합물을 먼저 약 5 wt%로 탈이온수에 용해시키고, pH를 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 약 6.0으로 조정하였다. 이후, 제조된 염 용액을 약 65℃의 대류 실험실 오븐에 넣어 물을 증발시키고, 고체 부형제를 분리하였다. 50 mM 히스티딘 HCl 중 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 용해시켰다. 부형제와 함께 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다.
표 4
Figure pct00008
실시예 9: 부형제 조합물 및 시험 단백질을 함유하는 제형의 제조
1차 부형제 화합물, 2차 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였으며, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제형에 사용될 비-치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 1차 부형제 화합물은 하기 표 5에 나열된 바와 같이 음이온성 및 방향족 작용기 둘 모두를 갖는 화합물로부터 선택되었다. 2차 부형제 화합물은 하기 표 5에 나열된 바와 같이 pH6에서 비이온성 또는 양이온성 전하 및 이미다졸린 또는 벤젠 고리를 갖는 화합물로부터 선택되었다. 이들 부형제의 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 50 mM 히스티딘 하이드로클로라이드 완충액에서 제조하였다. 히스티딘 하이드로클로라이드를 먼저 증류수 내에 1.94 g 히스티딘을 용해시키고, 1 M 염산(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 이용하여 pH를 약 6.0으로 조정한 후, 부피 플라스크에서 증류수를 이용하여 250 mL의 최종 부피로 희석시킴으로써 제조하였다. 이후, 개별 1차 또는 2차 부형제 화합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해시켰다. 1차 및 2차 부형제의 조합물을 50 mM 히스티딘 HCl에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 상기 기재된 바와 같이 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 각각의 시험 용액에 용해시켰다. 부형제와 함께 50 mM 히스티딘 HCl 중의 BGG 용액을 20 mL 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었고, 하기 표 5에 요약되었다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다. 본 실시예는 1차 및 2차 부형제의 조합물이 단일 부형제보다 나은 결과를 제공할 수 있음을 제시한다.
표 5
Figure pct00009
실시예 10: 부형제 조합물 및 시험 단백질을 함유하는 제형의 제조
1차 부형제 화합물, 2차 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였으며, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에 사용될 치료 단백질 또는 비-치료 제형에 사용될 비-치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 1차 부형제 화합물은 하기 표 6에 나열된 바와 같이 음이온성 및 방향족 작용기 둘 모두를 갖는 화합물로부터 선택되었다. 2차 부형제 화합물은 하기 표 6에 나열된 바와 같이 pH 6에서 비이온성 또는 양이온성 전하 및 이미다졸린 또는 벤젠 고리를 갖는 화합물로부터 선택되었다. 이들 부형제의 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 증류수에서 제조하였다. 1차 및 2차 부형제의 조합물을 증류수에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 증류수 중 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 용해시켰다. 부형제와 함께 증류수 중의 BGG 용액을 20 mL 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었고, 하기 표 6에 요약되었다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다. 본 실시예는 1차 및 2차 부형제의 조합물이 단일 부형제보다 나은 결과를 제공할 수 있음을 제시한다.
표 6
Figure pct00010
실시예 11: 부형제 화합물 및 PEG를 함유하는 제형의 제조
재료: 모든 재료는 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO에서 구입하였다. 제형을 부형제 화합물 및 PEG를 사용하여 제조하였으며, 여기서 PEG는 치료 제형에 사용될 치료적 PEG화 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 동일한 부피의 PEG의 용액과 부형제의 용액을 혼합하여 제조하였다. 둘 모두의 용액을 pH 7.3에서 10 mM Tris, 135 mM NaCl, 1 mM 트랜스-신남산으로 구성된 트리스 완충액에서 제조하였다. PEG 용액을 평균 Mw 약 1,000,000의 3 g의 폴리(에틸렌 옥사이드)(Aldrich 카탈로그 # 372781)와 97 g의 트리스 완충액을 혼합하여 제조하였다. 혼합물을 완전한 용해를 위해 밤새 교반하였다.
부형제 용액 제조의 예는 다음과 같다: 5 mL의 트리스 완충액에 0.4 g의 시트르산(Aldrich cat. # 251275)을 용해시켜 대략 80 mg/mL의 트리스 완충액 중 시트르산 용액을 제조하고, 최소량의 10 M NaOH 용액으로 pH를 7.3으로 조정하였다. 0.5 mL의 PEG 용액과 0.5 mL의 부형제 용액을 혼합하여 PEG 부형제 용액을 제조하고, 몇 초 동안 볼텍스를 사용하여 혼합하였다. 0.5 mL의 PEG 용액과 0.5 mL의 트리스 완충액을 혼합하여 대조군 샘플을 제조하였다.
실시예 12: 부형제 화합물 및 PEG를 함유하는 제형의 점도 측정
제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다.
표 7에 제시된 결과는 점도 감소에서 첨가된 부형제 화합물의 효과를 제시한다.
표 7
Figure pct00011
실시예 13: BSA 분자 당 1개의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 BSA의 제조
비커에 200 mL의 인산염 완충 염수(Aldrich Cat. # P4417) 및 4 g의 BSA(Aldrich Cat. # A7906)를 첨가하고, 자기 막대로 혼합하였다. 다음으로, 400 mg의 메톡시 폴리에틸렌 글리콜 말레이미드, MW=5,000(Aldrich Cat. # 63187)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 밤새 반응시켰다. 다음날, 20 점적의 HCl 0.1 M을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 반응 생성물을 PEG화된 BSA를 명백히 나타내는 SDS-Page 및 SEC에 의해 특성규명하였다. 반응 혼합물을 30 kDa의 분자량 컷오프(MWCO)를 갖는 Amicon 원심분리기 튜브에 넣고, 수 밀리리터로 농축시켰다. 다음으로, 샘플을 대략 6의 pH에서 히스티딘 완충액 50 mM로 20배 희석시킨 후, 고점도 유체가 획득될 때까지 농축시켰다. 280 nm에서 흡광도를 측정하고, 0.6678의 BSA에 대한 흡광 계수를 사용하여 단백질 용액의 최종 농도를 획득하였다. 결과는 용액 내 BSA의 최종 농도가 342 mg/mL인 것을 나타내었다.
실시예 14: BSA 분자 당 다수의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 BSA의 제조
pH 7.2의 인산염 완충액 25 mM 중 BSA(Aldrich A7906)의 5 mg/mL 용액을 0.5 g의 BSA와 100 mL의 완충액을 혼합하여 제조하였다. 다음으로, 1 g의 메톡시 PEG 프로피온알데하이드 Mw=20,000(JenKem Technology, Plano, TX 75024)을 첨가한 후, 0.12 g의 소듐 시아노보로하이드라이드(Aldrich 156159)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 진행시켰다. 다음날 반응 혼합물을 트리스 완충액(pH=7.3에서 10 mM Tris, 135 mM NaCl)으로 13배 희석시키고, 대략 150 mg/mL의 농도에 도달할 때까지 30 kDa의 Amicon 원심분리기 튜브 MWCO를 사용하여 농축시켰다.
실시예 15: 리소자임 분자 당 다수의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 리소자임의 제조
pH 7.2의 인산염 완충액 25 mM 중 리소자임(Aldrich L6876)의 5 mg/mL 용액을 0.5 g의 리소자임과 100 mL의 완충액을 혼합하여 제조하였다. 다음으로, 1 g의 메톡시 PEG 프로피온알데하이드 Mw=5,000(JenKem Technology, Plano, TX 75024)을 첨가한 후, 0.12 g의 소듐 시아노보로하이드라이드(Aldrich 156159)를 첨가하였다. 반응을 실온에서 밤새 진행시켰다. 다음날, 반응 혼합물을 pH 7.2에서 인산염 완충액 25 mM으로 49배 희석시키고, 30 kDa의 Amicon 원심분리 튜브 MWCO를 사용하여 농축시켰다. 280 nm에서 흡광도를 측정하고, 2.63의 리소자임에 대한 흡광 계수를 사용하여 단백질 용액의 최종 농도를 획득하였다. 용액 내 리소자임의 최종 농도는 140 mg/mL였다.
실시예 16: BSA 분자 당 1개의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 BSA의 점도에 대한 부형제의 효과
부형제와 함께 PEG화 BSA(상기 실시예 13으로부터)의 제형을 0.3 mL의 PEG화 BSA 용액에 6 또는 12 밀리그램의 부형제 염을 첨가하여 제조하였다. 용액을 가볍게 진탕시켜 혼합하고, 점도를 A10 채널(100-마이크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc로 500s-1의 전단 속도에서 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료되었다. 표 8에 제시된 결과는 점도 감소에서 첨가된 부형제 화합물의 효과를 제시한다.
표 8
Figure pct00012
실시예 17: BSA 분자 당 다수의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 BSA의 점도에 대한 부형제의 효과
부형제로서 시트르산 Na 염과 함께 PEG화 BSA(상기 실시예 14로부터)의 제형을 0.2 mL의 PEG화 BSA 용액에 8 밀리그램의 부형제 염을 첨가하여 제조하였다. 용액을 가볍게 진탕시켜 혼합하고, 점도를 A10 채널(100 마이크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc로 500 s-1의 전단 속도에서 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료되었다. 표 9에 제시된 결과는 점도 감소에서 첨가된 부형제 화합물의 효과를 제시한다.
표 9
Figure pct00013
실시예 18: 리소자임 분자 당 다수의 PEG 사슬을 갖는 PEG화 리소자임의 점도에 대한 부형제의 효과
부형제로서 포타슘 아세테이트와 함께 PEG화 리소자임(상기 실시예 15로부터)의 제형을 0.3 mL의 PEG화 리소자임 용액에 6 밀리그램의 부형제 염을 첨가하여 제조하였다. 용액을 가볍게 진탕시켜 혼합하고, 점도를 A10 채널(100 마이크론 깊이)이 장착된 RheoSense microVisc로 500 s-1의 전단 속도에서 측정하였다. 점도계 측정은 주위 온도에서 완료되었다. 다음 표(표 10)에 제시된 결과는 점도 감소에서 첨가된 부형제 화합물의 이점을 제시한다.
표 10
Figure pct00014
실시예 19: 부형제 조합물을 함유하는 단백질 제형
부형제 화합물 또는 2개의 부형제 화합물의 조합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였고, 여기서 시험 화합물은 치료 제형에서 사용될 치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 상이한 부형제 화합물과 함께 20 mM 히스티딘 완충액에서 제조하였다. 부형제 조합물을 20 mM 히스티딘에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 이러한 실시예에 대한 부형제 화합물은 하기 표 11에 나열되어 있다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 용해시켰다. 부형제 용액 중 BGG의 용액을 5 mL 살균 폴리프로필렌 튜브에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 80-100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 약 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었고, 결과는 하기 표 11에 제시된다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다.
표 11
Figure pct00015
실시예 20: 점도 및 주사 통증을 감소시키기 위한 부형제를 함유하는 단백질 제형
부형제 화합물, 제2 부형제 화합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였고, 여기서 시험 화합물은 치료 제형에서 사용될 치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 제1 부형제 화합물인 부형제 A는 국소 마취 특성을 갖는 화합물의 군으로부터 선택되었다. 제1 부형제인 부형제 A 및 제2 부형제인 부형제 B는 표 12에 나열되어 있다. 이들 제형을 이들의 점도가 측정될 수 있도록 하는 하기 방식으로 부형제 A 및 부형제 B를 사용하여 20 mM 히스티딘 완충액에서 제조하였다. 표 12에 개시된 양의 부형제를 20 mM 히스티딘에 용해시키고, 생성된 용액을 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 pH 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 부형제 용액에 용해시켰다. 부형제 용액 중 BGG의 용액을 5 mL 살균 폴리프로필렌 튜브에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 80-100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG-부형제 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 약 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었고, 결과는 하기 표 12에 제시된다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다.
표 12
Figure pct00016
실시예 21: 부형제 화합물 및 PEG를 함유하는 제형
제형을 부형제 화합물 및 PEG를 사용하여 제조하였으며, 여기서 PEG는 치료 제형에 사용될 치료적 PEG화 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었고, 부형제 화합물은 표 13에 나열된 양으로 제공되었다. 이들 제형을 동일한 부피의 PEG의 용액과 부형제의 용액을 혼합하여 제조하였다. 둘 모두의 용액을 탈이온수(DI)에서 제조하였다. PEG 용액을 평균 Mw 약 100,000의 16.5 g의 폴리(에틸렌 옥사이드)(Aldrich 카탈로그 # 181986)와 83.5 g의 탈이온수를 혼합하여 제조하였다. 혼합물을 완전한 용해를 위해 밤새 교반하였다.
부형제 용액을 이러한 일반적 방법에 의해 제조하였으며, 이는 하기 표 13에 상술되어 있다: 대략 20 mg/mL의 탈이온수 중 포타슘 포스페이트 트리베이직(Aldrich 카탈로그 # P5629) 용액을 5 mL의 탈이온수에 0.05 g의 포타슘 포스페이트를 용해시켜 제조하였다. 0.5 mL의 PEG 용액과 0.5 mL의 부형제 용액을 혼합하여 PEG 부형제 용액을 제조하고, 몇 초 동안 볼텍스를 사용하여 혼합하였다. 0.5 mL의 PEG 용액과 0.5 mL의 탈이온수를 혼합하여 대조군 샘플을 제조하였다. 점도를 측정하였고, 결과는 하기 표 13에 기록되어 있다.
표 13
Figure pct00017
실시예 22: 부형제를 사용한 단백질 용액의 개선된 처리
0.25 g의 고체 BGG와 4 mL의 완충액을 혼합하여 2개의 BGG 용액을 제조하였다. 샘플 A의 경우: 완충액은 20 mM 히스티딘 완충액(pH=6.0)이었다. 샘플 B의 경우: 완충액은 15 mg/mL의 카페인을 함유하는 20 mM 히스티딘 완충액(pH=6)이었다. 고체 BGG의 용해는 샘플을 100 rpm으로 설정된 오비탈 쉐이커에 배치하여 수행되었다. 카페인 부형제를 함유하는 완충액 샘플은 단백질을 더 신속히 용해시키는 것으로 관찰되었다. 카페인 부형제를 갖는 샘플(샘플 B)의 경우, BGG의 완전한 용해는 15분 내에 달성되었다. 카페인이 없는 샘플(샘플 A)의 경우, 용해에는 35분이 필요하였다. 다음으로, 샘플을 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 2개의 별도의 Amicon Ultra 4 원심분리 필터 장치에 넣고, 샘플을 10분 간격으로 2,500 rpm에서 원심분리하였다. 각각의 10분 원심분리 실행 후 회수된 여과액 부피를 기록하였다. 표 14의 결과는 샘플 B에 대한 여과액의 더 신속한 회수를 제시한다. 또한, 샘플 B는 추가 실행시마다 계속 농축되었지만, 샘플 A는 최대 농도 지점에 도달하였으며, 추가 원심분리는 추가의 샘플 농축을 발생시키지 않았다.
표 14
Figure pct00018
실시예 23: 다수의 부형제를 함유하는 단백질 제형
본 실시예는 부형제로서 카페인 및 아르기닌의 조합이 BGG 용액의 점도 감소에 어떻게 이로운 영향을 미치는지 제시한다. pH 6에서 0.18 g의 고체 BGG와 0.5 mL의 20 mM 히스티딘 완충액을 혼합함으로써 4개의 BGG 용액을 제조하였다. 각각의 완충액은 하기 표(표 15)에 기재된 바와 같이 상이한 부형제 또는 부형제의 조합물을 함유하였다. 용액의 점도는 이전 실시예에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과는 힌더드 아민 부형제인 카페인이 아르기닌과 같은 공지된 부형제와 조합될 수 있으며, 조합이 개별 부형제 자체보다 나은 점도 감소 특성을 갖는 것을 제시한다.
표 15
Figure pct00019
아르기닌을 pH 6에서 280 mg/mL의 히스티딘 완충액 중 BGG의 용액에 첨가하였다. 50 mg/mL 이상의 수준에서, 더 많은 아르기닌을 첨가해도 표 16에 제시된 바와 같이 점도를 추가로 감소시키지 않았다.
표 16
Figure pct00020
카페인을 pH 6에서 280 mg/mL의 히스티딘 완충액 중 BGG의 용액에 첨가하였다. 10 mg/mL 이상의 수준에서, 더 많은 카페인을 첨가해도 표 17에 제시된 바와 같이 점도를 추가로 감소시키지 않았다.
표 17
Figure pct00021
실시예 24: TFF 농축 공정 동안의 카페인 효과
본 실시예에서, 소 감마 글로불린(BGG) 용액을 접선 흐름 여과(TFF)를 사용하여 카페인의 존재 및 부재하에서 농축하였다. EMD Millipore(Billerica, MA)에서 생산된 Labscale TFF 시스템을 사용하여 실험을 수행하였다. 상기 시스템에는 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Ultracel 막을 함유하는 Pellicon XL TFF 카세트(EMD Millipore, Billerica, MA)가 장착되었다. 명목 막 표면적은 50 cm2였다. 카세트에 대한 공급 압력은 30 psi에서 유지된 한편, 보유 압력은 10 psi로 유지되었다. 여과액 플럭스는 시간의 함수로서 질량을 측정하여 실험 과정 전체에 걸쳐 모니터링되었다. 대략 12 그램의 BGG를 pH 6으로 조정된 15 mg/mL 카페인, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘을 함유하는 500 mL의 완충액에 용해시켰다. 대조군 샘플을 12 그램의 BGG를 pH 6으로 조정된 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘을 함유하는 500 mL의 완충액에 용해시켜 제조하였다. 완충액 성분을 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 둘 모두의 용액을 TFF 처리 전에 0.2 μm 폴리에테르설폰(PES) 필터(VWR, Radnor, PA)를 통해 여과시켰다. TFF 동안 시험 샘플 및 대조군 샘플의 성능은 질량 전달 계수로 측정되었다. 질량 전달 계수는 하기 방정식을 사용하여 각각의 샘플에 대해 결정되었다(문헌[J. Hung, A. U. Borwankar, B. J. Dear, T. M. Truskett, K. P. Johnston, High concentration tangential flow ultrafiltration of stable monoclonal antibody solutions with low viscosities. J. Memb. Sci. 508, 113-126 (2016)]에 기재된 바와 같음):
J = kcln(Cw/Cb) (방정식 3)
방정식 3은 여과액 플럭스 J를 기재하며, 여기서 kc는 물질 전달 계수이고, Cw는 막 주변의 단백질 농도이고, Cb는 액체 벌크 내의 농도이고, 이에 의해 방정식 3은 물질 전달 계수 kc의 계산을 가능하게 한다. ln(Cb)에 대한 계산된 플럭스 J의 그래프는 -kc의 기울기를 갖는 선형 플롯을 생성한다. 여기서, 플럭스 J는 시간에 관한 여과액 질량의 도함수를 취하여 계산되고, Cb는 질량 균형을 사용하여 계산된다. 최적 질량 전달 계수는 표 18에 나열되어 있다. 15 mg/mL 카페인의 도입은 물질 전달 계수 값을 22.5에서 25.4 Lm-2hr-1(LMH)로 약 13% 증가시켰다.
표 18
Figure pct00022
실시예 25: TFF 농축 공정 동안의 카페인 효과
본 실시예에서, 소 감마 글로불린(BGG) 용액을 접선 흐름 여과(TFF)를 사용하여 카페인의 존재 및 부재하에서 농축하였다. EMD Millipore(Billerica, MA)에서 생산된 Labscale TFF 시스템을 사용하여 실험을 수행하였다. 상기 시스템에는 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Ultracel 막을 함유하는 Pellicon XL TFF 카세트(EMD Millipore, Billerica, MA)가 장착되었다. 명목 막 표면적은 50 cm2였다. 대조군 샘플을 14.6 그램의 BGG를 pH 6으로 조정된 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘을 함유하는 582 mL의 완충액에 용해시켜, 초기 BGG 농도가 명목상 25.1 mg/mL가 되도록 제조하였다. 물질을 0.2 μm PES 필터(VWR, Radnor, PA)를 통해 여과시킨 후, TFF 장치에서 처리하였다. 공급 압력이 초기에 30 psi가 되도록 펌프 속도를 조정하고, 보유 압력이 초기에 10 psi가 되도록 보유 밸브(retentate valve)를 조정하였다. 펌프 속도 또는 보유 밸브를 4.1시간 동안 조정하지 않고 재료를 농축시켰다. 초기 및 최종 농도는 하기 표 19에 제시된 바와 같이 브래드포드(Bradford) 검정에 의해 각각 25.4 ± 0.6 및 159 ± 6 mg/mL로 결정되었다. 카페인 함유 샘플을 14.2 g의 BGG를 pH 6으로 조정된 15 mg/mL 카페인, 150 mM NaCl 및 20 mM 히스티딘을 함유하는 566 mL의 완충액에 용해시켜, 초기 BGG 농도가 명목상 25.1 mg/mL가 되도록 제조하였다. 물질을 0.2 μm PES 필터(VWR, Radnor, PA)를 통해 여과시킨 후, TFF 장치에서 처리하였다. 펌프 속도 및 보유 밸브를 이전과 동일한 수준으로 설정하였다. 공급 및 보유 압력은 이전과 같이 각각 30 psi 및 10 psi인 것으로 확인되었다. 펌프 속도 또는 보유 밸브를 4.1시간 동안 조정하지 않고 재료를 농축시켰다. 초기 및 최종 농도는 하기 표 19에 제시된 바와 같이 브래드포드 검정에 의해 각각 24.4 ± 0.5 및 225 ±10 mg/mL로 결정되었다. TFF 처리 동안 카페인의 사용은 대조군과 비교하는 경우 159에서 225 mg/mL로 최종 단백질 농도를 대략 42%만큼 증가시켰다.
표 19
Figure pct00023
실시예 26: BGG 용액의 살균 여과 동안 카페인 효과
소 감마 글로불린(BGG), L-히스티딘 및 카페인은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, 각각 제품 번호 G5009, H6034 및 C7731)에서 구입하였다. 탈이온수(DI)는 EMD Millipore(Billerica, MA)의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템을 사용하여 수돗물에서 생성되었다. 0.2-μm 포어를 갖는 25-mm 폴리에테르설폰(PES) 필터는 GE Healthcare(Chicago, IL, 카탈로그 번호 6780-2502)에서 구입하였다. 1-mL Luer-Lok 주사기는 Becton, Dickinson and Company(Franklin Lakes, NJ, 참조 번호 309628)에서 구입하였다. 20-mM 히스티딘 완충액, pH 6.0은 L-히스티딘, 탈이온수를 사용하여 제조하였고, 1 M HCl을 이용하여 pH 6.0으로 적정하였다. 15 mg/mL의 카페인 용액을 히스티딘 완충액을 사용하여 제조하였다. 카페인 비함유 및 카페인 함유 완충액을 사용하여 BGG를 약 280 mg/mL의 최종 농도로 재구성하였다. 단백질 농도 c는 하기를 사용하여 계산하였다:
Figure pct00024
(방정식 4)
여기서, m p 는 단백질 질량이고, b는 첨가된 완충액의 부피이고, v는 BGG의 부분적 비체적이며, 여기서 0.74 mL/g이다. 각각의 샘플의 점도는 23℃의 온도 및 250 s-1의 전단 속도에서 microVisc 검류계(RheoSense, San Ramon, CA)를 사용하여 측정하였다. 살균 필터를 통해 BGG 용액을 통과시키는 데 필요한 에너지는 100 N 로드 셀(Instron, Needham, MA, 부품 번호 2519-103)이 장착된 인장 압축 시험기(TCT, Instron, Needham, MA, 부품 번호 3343)를 사용하여 측정되었다. 주사기 플런저는 50 mm의 거리에 대해 159 mm/min의 속도로 압축되었다. 에너지 요구량은 TCT로 측정된 부하-대-확장 곡선을 통합하여 계산하였으며, 결과는 하기 표 20에 요약되어 있다.
표 20
Figure pct00025
실시예 27: 단백질-A 크로마토그래피 용리를 개선하기 위한 부형제
4개의 정제된 연구 등급 바이오시밀러 항체인 이필리무맙(ipilimumab), 우스테키누맙(ustekinumab), 오말리주맙(omalizumab) 및 토실리주맙(tocilizumab)을 Bioceros(Utrecht, The Netherlands)에서 구입하였다. 이들은 pH 5.5에서 수성 40 mM 소듐 아세테이트, 50 mM 트리스-HCl 완충액에서 각각 20, 26, 15 및 23 mg/mL의 단백질 농도로 동결된 분취량으로 제공되었다. 단백질 용액을 측정 전에 실온에서 해동하고, 이후 0.2 μm 폴리에테르설폰 필터를 통해 여과시켰다. 여과된 단백질 스톡 용액을 1:1 비율의 단백질 스톡 용액 대 결합 완충액 중에서 혼합하였다. 단백질-A 수지에 대한 항체의 결합을 촉진하는 데 사용되는 결합 완충액은 탈이온수(DI)에서 pH 7.2의 0.1 M 소듐 포스페이트 및 0.15 소듐 클로라이드로 구성되었다. 탈이온수는 EMD Millipore(Billerica, MA)의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템을 사용하여 수돗물을 정제하여 생성되었다. 이들 용액은 IgG 스크리닝을 위한 PIERCE™ 단백질-A 회전 플레이트(ThermoFisher Scientific 카탈로그 # 45202)를 사용하여 단백질-A 결합 및 용리 연구를 수행하는 데 사용되었다. 플레이트는 50 μL의 단백질-A 수지를 각각 함유하는 96웰을 가졌다. 각각의 웰에 200 μL의 결합 완충액을 첨가하고, 플레이트를 1분 동안 1000 x g에서 원심분리하고, 통과액을 폐기함으로써 수지를 결합 완충액으로 세척하였다. 모든 후속 원심분리 단계를 1분 동안 1000 x g에서 수행하였다. 이러한 세척 절차를 1회 반복하였다. 이들 초기 세척 단계 후, 희석된 단백질 샘플, 즉, 이필리무맙, 우스테키누맙, 오말리주맙 및 토실리주맙을 함유하는 샘플을 플레이트의 웰(웰 당 200 μL)에 첨가하였다. 이후, 플레이트를 Daigger Scientific(Vernon Hills, IL) Labgenius 오비탈 쉐이커에 놓고, 30분 동안 260 rpm에서 진탕한 후, 플레이트를 원심분리하고 통과액을 폐기하였다. 이후, 500 μL의 결합 완충액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 원심분리하고, 통과액을 폐기함으로써 웰을 세척하였다. 이러한 세척 단계를 2회 반복하였다. 이들 세척 단계 후, 상이한 부형제가 첨가된 용리 완충액을 사용하여 단백질을 플레이트로부터 용리시켰다. 각각의 용리의 경우, pH 7의 1 M 소듐 포스페이트로 구성된 50 μL의 중화 완충액을 수집 플레이트의 각각의 웰에 첨가한 후, 200 μL의 용리 완충액을 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 1분 동안 260 rpm에서 진탕한 후, 원심분리하였다. 분석을 위해 통과액을 회수하였다. 이러한 용리 단계를 1회 반복하였다. 부형제가 없는 대조군 완충액은 20 mM 시트레이트를 함유하였고, 2.6의 pH를 가졌다. 단백질-A 용리 완충액은 종종 약간의 양의 염을 함유하므로, 시트레이트 완충액 중 100 mM NaCl의 용리 완충액을 2차 대조군으로서 제조하였다.
표 21에는 본 실시예에서 사용된 부형제 용액, 이의 농도 및 용리 완충액의 최종 pH가 나열되어 있다. Herb Store USA(Los Angeles, CA)에서 구입한 아스파탐, Cascade Analytical Reagents and Biochemicals(Corvallis, OR)에서 구입한 트레할로스, 및 Research Products International(Mt. Prospect, IL, 제품 번호 S24060)에서 구입한 수크로스를 제외하고는 모든 부형제를 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 적절한 양의 부형제와 대략 10 mL의 무염 시트레이트 완충액 대조군을 혼합함으로써 모든 부형제 함유 용리 완충액을 제조하였다. 용리 완충액을 대략 100 mM 부형제에서 제조하였다. 그러나, 모든 부형제가 이러한 수준에서 가용성인 것은 아니며; 따라서 표 21에는 사용된 모든 부형제 농도가 나열되어 있다. 각각의 용리 완충액의 pH는 필요에 따라 하이드로클로라이드 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 약 2.6 ± 0.1로 조정되었다.
각각의 단백질 샘플에 대해, HPLC 워크스테이션(Agilent HP 1100 시스템)에 연결된 TSKgel SuperSW3000 컬럼(30 cm x 4.6 mm ID, Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA)을 사용하여 ASD 고성능 크기-배제 크로마토그래피(SEC) 분석을 수행하였다. 분리는 실온에서 0.35 mL/min의 흐름으로 수행되었다. 이동상은 100 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, pH 7의 수성 완충액이었다. 단백질 농도는 Agilent 1100 Series G1315B 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 각각의 단백질, 즉, 이필리무맙, 우스테키누맙, 오말리주맙 및 토실리주맙에 대한 단백질-A 수지로부터 용리된 단백질의 전체량은 크로마토그램을 통합하여 추정되었다. 각각의 단백질, 즉, 이필리무맙, 우스테키누맙, 오말리주맙 및 토실리주맙에 대한 통합 피크 면적은 표 22-25에 나열되어 있다. 표 22-25는 또한 실험 피크 면적을 무염 및 염 함유 대조군의 피크 영역과 비교한다. 100%보다 큰 값은 용리 완충액이 대조군보다 단백질-A 수지로부터 더 많은 단백질을 회수했음을 나타내는 반면, 100% 미만의 값은 용리 완충액이 대조군보다 단백질-A 수지로부터 더 적은 단백질을 회수했음을 나타낸다.
표 21
Figure pct00026
표 22. 단백질-A 수지로부터의 이필리무맙 회수
Figure pct00027
표 23. 단백질-A 수지로부터의 우스테키누맙 회수
Figure pct00028
표 24. 단백질-A 수지로부터의 오말리주맙 회수
Figure pct00029
표 25. 단백질-A 수지로부터의 토실리주맙 회수
Figure pct00030
실시예 28: 단백질-A 크로마토그래피 용리를 개선하기 위한 부형제
본 실시예에서 사용된 시험 단백질은 실시예 27의 것, 즉, 이필리무맙, 우스테키누맙, 오말리주맙 및 토실리주맙과 동일하다. 단백질-A 결합 및 용리 연구를 실시예 27에서의 것과 동일한 플레이트를 사용하여 수행하였다. 단백질-A 플레이트로부터 항체를 로딩하고 용리하기 위한 방법은 용리 단계를 제외하고는 실시예 27의 것과 동일하였다. 실시예 27에서, 2회의 용리 세척을 수행하였다. 그러나, 이러한 실시예에서, 단지 1회의 세척이 수행된다. 실시예 27에서와 같이, 용리 완충액을 20 mM 시트레이트, pH 2.6 대조군 완충액으로부터 제조하였다. 부형제는 하기 표 26에 나열되어 있다. 모든 부형제는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 회수된 단백질을 실시예 27의 것과 동일한 방식으로 HPLC에 의해 분석하였으며, 각각의 단백질, 즉, 이필리무맙, 우스테키누맙, 오말리주맙 및 토실리주맙에 대한 단백질 회수의 결과는 하기 표 26-30에 기록되어 있다.
표 26. 실시예 28에서 사용된 부형제
Figure pct00031
표 27. 단백질-A 수지로부터의 이필리무맙 회수
Figure pct00032
표 28. 단백질-A 수지로부터의 우스테키누맙 회수
Figure pct00033
표 29. 단백질-A 수지로부터의 오말리주맙 회수
Figure pct00034
표 30. 단백질-A 수지로부터의 토실리주맙 회수
Figure pct00035
실시예 29: 단백질-A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 오말리주맙 용리를 개선하는 부형제
연구 등급 오말리주맙을 Bioceros(Utrecht, The Netherlands)에서 구입하였고, 수성 40 mM 소듐 아세테이트, 50 mM 트리스-HCl 완충액, pH 5.5에서 15 mg/mL로 동결 제공되었다. 단백질을 실험 전에 실온에서 해동하고, 0.2 μm 폴리에테르설폰 필터를 통해 여과시켰다. 여과된 물질을 탈이온수 중 20 mM 소듐 포스페이트, pH 7로 구성된 결합 완충액과 1:1 비율로 혼합하였다. 수돗물을 EMD Millipore의 Direct-Q 3 UV 정제 시스템(Billerica, MA)으로 정제하여 탈이온수를 생성시켰다. GE Healthcare의 HiTrap 단백질-A HP 1 mL 컬럼(Chicago, IL, 제품 번호 29048576)을 사용하여 단백질-A 정제를 수행하였다. 각각의 실험에 대해, 컬럼을 먼저 10 mL의 결합 완충액으로 평형화시켰다. 평형화 후, 30 mg의 단백질을 단백질-A 컬럼에 로딩하였다. 이후, 컬럼을 5 mL의 결합 완충액으로 세척하였다. 컬럼을 세척한 후, 결합된 오말리주맙을 하기 표 31에 나열된 부형제를 함유하는 용리 완충액 중 하나의 분획을 사용하여 컬럼으로부터 용리시켰다. 용리 완충액은 20 mM 시트레이트 완충액, pH 4.0에 표시된 부형제를 용해시킴으로써 제조하였다. 모든 용리 완충액을 pH 4.0으로 조정하였다. 5개의 1-mL 분획을 수집하였다. 최종적으로, 5 mL의 100 mM 시트레이트, pH 3.0 완충액으로 컬럼을 세척하여 단백질-A를 재생시켰다. 각각의 단계에 대한 유량은 1 mL/min이었으며, 이는 Fusion 100 주입 펌프(Chemyx, Stafford, TX)에 의해 유지되었다. 10-mL NormJect Luer Lok 주사기를 사용하였다(Henke Sass Wolf, Tuttlingen, Germany, 참조 번호 4100-000V0).
용리 분획 E1, E2, E3, E4 및 E5는 고성능 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 분석에 의해 전체 단백질 함량에 대해 검정되었다. HPLC 워크스테이션(Agilent HP 1100 system)에 연결된 TSKgel SuperSW3000 컬럼(30 cm x 4.6 mm ID, Tosoh Bioscience, King of Prussia, PA)을 사용하여 SEC 분석을 수행하였다. 분리는 실온에서 0.35 mL/min의 흐름으로 수행되었다. 이동상은 100 mM 소듐 포스페이트, 300 mM 소듐 클로라이드, pH 7의 수성 완충액이었다. 단백질 농도는 Agilent 1100 Series G1315B 다이오드 어레이 검출기를 사용하여 280 nm에서의 흡광도에 의해 모니터링하였다. 단백질-A 수지에서 용리된 단백질의 전체량은 크로마토그램을 통합하여 추정하였다.
시트레이트는 단백질-A 크로마토그래피에 사용되는 일반적인 부형제이며, 따라서 본원에서 대조군으로 사용되었다. 대조군 샘플에 대한 용리액 분획은 침전 상의 형성에 의해 입증된 바와 같이 4℃에서 밤새 저장시 불용성 응집체를 나타내었따. 따라서, 하기 표 31에 보고된 피크 면적은 용리액 분획의 전체 가용성 단백질 양을 나타낸다. 본 발명자는 불용성 응집체가 대조군 샘플에서만 관찰되었으며, 다른 샘플에서는 상기 응집체를 나타내지 않은 것을 주목한다. 대조군(시트레이트 부형제 사용)의 것보다 큰 피크 면적은 시험 부형제의 사용이 컬럼으로부터 단백질의 보다 효율적인 분리를 가능하게 할 수 있음을 나타낸다.
표 31
Figure pct00036
실시예 30: 상이한 양의 카페인 부형제를 사용한 BGG 제형
상이한 몰 농도의 카페인(하기 표 32에 나열된 농도) 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였고, 여기서 시험 화합물은 치료 제형에서 사용될 치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 본 실시예에 대한 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 20 mM 히스티딘 완충액에서 제조하였다. 0 및 80 mM 카페인의 스톡 용액을 20 mM 히스티딘에서 제조하고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 다양한 카페인 농도의 추가 용액을 하기 표 32에 나열된 농도로 일련의 카페인 함유 용액을 제공하기 위해 다양한 부피 비율로 2개의 스톡 용액을 블렌딩하여 제조하였다. 이들 부형제 용액이 제조되면, 0.25 g의 동결건조된 BGG 분말에 0.7 mL의 각각의 부형제 용액을 첨가하여 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 각각의 시험 용액에 용해시켰다. BGG 함유 용액을 5 mL 살균 폴리프로필렌 튜브에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 100 rpm에서 진탕하였다. 이후, 이들 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2400 rpm으로 약 5분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 microVisc 점도계(RheoSense, San Ramon, CA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계는 100 마이크론의 채널 깊이를 갖는 A-10 칩이 장착되었고, 250 s-1의 전단 속도 및 25℃에서 작동되었다. 점도를 측정하기 위해, 피펫으로부터 모든 기포를 제거하도록 주의하면서 시험 제형을 점도계에 로딩하였다. 로딩된 샘플 제형을 함유하는 피펫을 기기에 넣고, 약 5분 동안 측정 온도에서 인큐베이션하였다. 이후, 안정한 점도 판독에 의해 표시되는 채널이 시험 유체로 완전히 평형이 될 때까지 기기를 실행한 후, 점도를 센티푸아즈로 기록하였다. 획득된 점도 결과는 하기 표 32에 제시된다.
표 32
Figure pct00037
실시예 31: 탈이온수에서의 공존용질의 용액 제조
물 중 카페인 용해도를 증가시키기 위해 공존용질로서 사용되는 화합물은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 획득하였으며, 이는 니아신아미드, 프롤린, 프로카인 HCl, 아스코르브산, 2,5-디하이드록시벤조산, 리도카인, 사카린, 아세설팜 K, 티라민 및 아미노벤조산을 포함하였다. 건조 고체를 탈이온수에 용해시키고, 일부 경우에 필요에 따라 5 M 염산 또는 5 M 소듐 하이드록시드를 사용하여 pH를 약 6의 pH와 약 8의 pH 사이의 값으로 조정하여 각각의 공존용질의 용액을 제조하였다. 이후, 클래스 A 부피 플라스크를 사용하여 용액을 25 mL 또는 50 mL의 최종 부피로 희석시키고, 용해된 화합물의 질량 및 용액의 최종 부피를 기초로 하여 농도를 기록하였다. 제조된 용액은 순수하거나 탈이온수로 희석하여 사용되었다.
실시예 32: 카페인 용해도 시험
주위 온도(약 23℃)에서 카페인의 용해도에 대한 상이한 공존용질의 영향은 다음과 같은 방식으로 평가되었다. 건조 카페인 분말(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에 첨가하고, 카페인의 질량을 기록하였다. 특정 경우에 실시예 31에 따라 제조된 10 mL의 공존용질 용액을 카페인 분말에 첨가하였고; 다른 경우에, 공존용질 용액 및 탈이온수의 블렌드를 카페인 분말에 첨가하여 10 mL의 최종 첨가 부피를 유지하였다. 건조 카페인 분말의 부피 기여는 이들 혼합물 중 어느 것에서도 무시할 수 있는 것으로 가정되었다. 작은 자기 교반 막대를 바이알에 첨가하고, 용액을 약 10분 동안 교반 플레이트에서 강하게 혼합하였다. 약 10분 후, 건조 카페인 분말의 용해에 대해 바이알을 관찰하였으며, 결과는 하기 표 33에 제공된다. 이들 관찰은 니아신아미드, 프로카인 HCl, 2,5-디하이드록시벤조산 소듐 염, 사카린 소듐 염 및 티라민 클로라이드 염 모두가 보고된 카페인 용해도 한계(Sigma-Aldrich에 따른 실온에서 약 16 mg/mL)의 적어도 약 4배의 카페인의 용해를 가능하게 함을 나타내었다.
표 33
Figure pct00038
실시예 33: HUMIRA ® 의 프로파일
HUMIRA®(AbbVie Inc., Chicago, IL)은 류마티스 관절염, 건선성 관절염, 강직성 척추염, 크론병, 궤양성 대장염, 중등증 내지 중증 만성 건선 및 소아 특발성 관절염과 같은 자가면역 질병의 염증 반응을 감소시키기 위해 전형적으로 처방되는 TNF-알파 차단제인 치료 모노클로날 항체 아달리무맙(adalimumab)의 상업적으로 이용 가능한 제형이다. HUMIRA®은 40 mg 아달리무맙, 4.93 mg 소듐 클로라이드, 0.69 mg 소듐 포스페이트 일염기성 이수화물, 1.22 mg 소듐 포스페이트 이염기성 이수화물, 0.24 mg 소듐 시트레이트, 1.04 mg 시트르산 모노하이드레이트, 9.6 mg 만니톨 및 0.8 mg 폴리소르베이트 80을 함유하는 0.8 mL 단일 용도 용량으로 시판된다. 이러한 제형의 점도 대 농도 프로파일은 하기 방식으로 생성되었다. 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기(EMD-Millipore, Billerica, MA)를 약 15 mL의 탈이온수로 충전하고, 10분 동안 4000 rpm에서 Sorvall Legend RT(ThermoFisher Scientific)에서 원심분리하여 막을 헹구었다. 이후, 잔여 물을 제거하고, 2.4 mL의 HUMIRA® 액체 제형을 농축기 튜브에 첨가하고, 25℃에서 60분 동안 4000 rpm에서 원심분리하였다. 잔류물의 농도는 10 μL의 잔류물을 1990 μL의 탈이온수로 희석시키고, 280 nm에서 희석된 샘플의 흡광도를 측정하고, 1.39 mL/mg-cm의 희석 계수 및 흡광 계수를 사용하여 농도를 계산함으로써 결정되었다. 농축된 샘플의 점도는 23℃에서 250 s-1의 전단 속도에서 A05 칩(RheoSense, San Ramon, CA)이 장착된 microVisc 점도계로 측정되었다. 점도 측정 후, 샘플을 소량의 여과액으로 희석시키고, 농도 및 점도 측정을 반복하였다. 이러한 공정은 하기 표 34에 기재된 바와 같이 다양한 아달리무맙 농도에서 점도 값을 생성하는 데 사용되었다.
표 34
Figure pct00039
실시예 34: 점도 감소 부형제를 사용한 HUMIRA ® 의 재제형화(reformulation)
하기 예는 HUMIRA®이 점도 감소 부형제와 함께 완충액에서 재제형화되는 일반적인 공정을 기재한다. 탈이온수에 약 0.15 g의 히스티딘 및 0.75 g의 카페인(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 용해시켜 점도 감소 부형제의 용액을 20 mM 히스티딘에서 제조하였다. 생성된 용액의 pH를 5 M 염산으로 약 5로 조정하였다. 이후, 용액을 탈이온수를 갖는 부피 플라스크에서 50 mL의 최종 부피로 희석하였다. 이후, 생성된 완충 점도 감소 부형제 용액을 사용하여 높은 mAb 농도에서 HUMIRA®을 재제형화하였다. 다음으로, 약 0.8 mL의 HUMIRA®을 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 헹궈진 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브에 첨가하고, Sorvall Legend RT에서 8-10분 동안 4000 rpm 및 25℃에서 원심분리하였다. 이후, 약 14 mL의 상기 기재된 바와 같이 제조된 완충 점도 감소 부형제 용액을 원심분리 농축기 내의 농축된 HUMIRA®에 첨가하였다. 가볍게 혼합 후, 샘플을 약 40-60분 동안 4000 rpm 및 25℃에서 원심분리하였다. 잔류물은 점도 감소 부형제와 함께 완충액에서 재제형화된 HUMIRA®의 농축 샘플이었다. 샘플의 점도 및 농도를 측정하고, 일부 경우에, 이후 낮은 농도에서 점도를 측정하기 위해 소량의 여과액으로 희석시켰다. 점도 측정은 이전 실시예에서 농축된 HUMIRA® 제형과 동일한 방식으로 microVisc 점도계로 완료되었다. 농도를 탈이온수에 희석된 HUMIRA® 스톡 용액으로부터 생성된 표준 곡선을 사용하여 브래드포드 검정으로 결정하였다. 점도 감소 부형제를 이용한 HUMIRA®의 재제형화는 하기 표 35에 기재되는 바와 같이 재제형화 없이 상업적인 완충액에 농축된 HUMIRA®의 점도 값에 비해 30% 내지 60%의 점도 감소를 제공하였다.
표 35
Figure pct00040
실시예 35: 부형제로서 카페인을 사용한 아달리무맙 용액의 개선된 안정성
카페인 부형제를 갖거나 갖지 않는 아달리무맙 용액의 안정성을 샘플을 2개의 상이한 스트레스 조건인 진탕 및 동결-해동에 노출시킨 후 평가하였다. 아달리무맙 약물 제형 HUMIRA®(AbbVie)을 사용하였으며, 이는 실시예 33에 보다 상세히 기재되는 특성을 갖는다. HUMIRA® 샘플을 실시예 38에 기재된 바와 같이 원래의 완충액에서 200 mg/mL 아달리무맙 농도로 농축하였으며; 이러한 농축된 샘플은 "샘플 1"로 지정된다. 실시예 40에 기재된 바와 같이 약 200 mg/mL의 아달리무맙 및 15 mg/mL의 첨가된 카페인을 이용하여 제2 샘플을 제조하였으며; 첨가된 카페인을 갖는 이러한 농축된 샘플은 "샘플 2"로 지정된다. 둘 모두의 샘플을 다음과 같은 희석제를 사용하여 1 mg/mL의 아달리무맙의 최종 농도로 희석시켰다: 샘플 1 희석제는 원래의 완충액이고, 샘플 2 희석제는 20 mM 히스티딘, 15 mg/mL 카페인, pH=5이다. 둘 모두의 HUMIRA® 희석액을 0.22 μm 주사기 필터를 통해 여과시켰다. 모든 희석된 샘플에 대해, 층류 후드의 2 mL 에펜도르프 튜브에서 각각 300 μL의 3 배치(batch)를 제조하였다. 샘플을 다음과 같은 스트레스 조건에 적용시켰다: 진탕을 위해, 샘플을 91시간 동안 300 rpm에서 오비탈 쉐이커에 배치하였고; 동결-해동을 위해, 샘플을 조건 당 평균 6시간 동안 -17에서 30℃로 7번 순환시켰다. 표 36은 제조된 샘플을 기재한다.
표 36
Figure pct00041
실시예 36: 동적 광 산란(DLS)에 의한 안정성 평가
Brookhaven Zeta Plus 동적 광 산란 기기를 사용하여 실시예 35로부터의 샘플에서 아달리무맙 분자의 유체역학적 반경을 측정하였고, 응집체 집단 형성의 증거를 찾았다. 표 37은 실시예 35에 따라 제조된 6개의 샘플에 대한 DLS 결과를 제시한다: 이들 중 일부(1-A, 1-FT, 2-A 및 2-FT)는 스트레스 조건에 노출되었고("스트레스 샘플"), 나머지(1-C 및 2-C)는 스트레스가 가해지지 않았다. 표 37의 DLS 데이터 및 첨부된 도 1, 2 및 2는 카페인을 함유하지 않는 스트레스 샘플에서 모노클로날 항체의 다중모드 입자 크기 분포를 제시한다. 부형제로서 카페인의 부재하에서, 스트레스 샘플 1-A 및 1-FT는 비-스트레스 샘플 1-C보다 높은 유효 직경을 나타내었고, 또한 이들은 유의하게 더 높은 직경의 입자의 제2 집단을 나타내었으며; 이러한 더 큰 직경을 갖는 입자의 새로운 그룹화는 눈에 보이지 않는 입자로의 응집의 증거이다. 카페인을 함유하는 스트레스 샘플(샘플 2-A 및 2-FT)은 비-스트레스 샘플 2-C와 유사한 입자 직경에서 하나의 입자 집단만 표시한다. 이들 결과는 이들 샘플에 카페인을 첨가하는 것이 응집체 또는 눈에 보이지 않는 입자의 형성을 감소시켰음을 입증한다.
표 37
Figure pct00042
표 38A 및 표 38B는 입자 크기 분포를 제시하는 실시예 36의 아달리무맙 샘플의 DLS 미가공 데이터를 제시한다. 이들 표에서, G(d)는 강도 가중치 차별적 크기 분포이다. C(d)는 누적 강도 가중치 차별적 크기 분포이다.
표 38A
Figure pct00043
표 38B
Figure pct00044
실시예 37: 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의한 안정성 평가
크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 실시예 36에 기재된 스트레스 및 비-스트레스 아달리무맙 샘플로부터 크기가 약 0.1 마이크론 미만의 눈에 보이지 않는 미립자를 검출하였다. SEC를 수행하기 위해, 가드 컬럼이 있는 TSKgel SuperSW3000 컬럼(Tosoh Biosciences, Montgomeryville, PA)을 사용하였고, 용리를 280 nm에서 모니터링하였다. 실시예 36으로부터의 각각의 스트레스 및 비-스트레스 샘플의 전체 10 μL를 0.35 mL/min의 유량에서 pH 6.2 완충액(100 mM 포스페이트, 325 mM NaCl)으로 등용매적으로 용리시켰다. 아달리무맙 단량체의 체류 시간은 대략 9분이었다. 카페인 부형제를 함유하는 샘플에서는 검출 가능한 응집체가 확인되지 않았으며, 3개 샘플 모두에서의 단량체의 양은 일정하게 유지되었다.
실시예 38: HERCEPTIN ® 제형의 점도 감소
모노클로날 항체 트라스투주맙(Genentech으로부터의 HERCEPTIN®)은 동결건조된 분말로 받았고, 탈이온수 중 21 mg/mL로 재구성되었다. 생성된 용액을 1.5시간 동안 3500 rpm에서의 원심분리에 의해 Amicon Ultra 4 원심분리 농축기 튜브(분자량 컷오프, 30 kDa)에서 그대로 농축하였다. 샘플을 적절한 완충액에 200배 희석시키고, 1.48 mL/mg의 흡광 계수를 사용하여 280 nm에서 흡광도를 측정하여 농도를 측정하였다. 점도는 RheoSense microVisc 점도계를 사용하여 측정하였다.
증류수에 히스티딘 및 부형제를 용해시킨 후, pH를 적절한 수준으로 조정함으로써 살리실산 및 카페인을 단독으로 또는 조합하여 함유하는 부형제 완충액을 제조하였다. 완충 시스템 1 및 2의 조건은 표 39에 요약되어 있다.
표 39
Figure pct00045
HERCEPTIN® 용액을 약 1:10의 비율로 부형제 완충액에 희석시키고, Amicon Ultra 15(MWCO 30 kDa) 농축기 튜브에서 농축시켰다. 농도를 브래드포드 검정을 사용하여 결정하고, 스톡 HERCEPTIN® 샘플로부터 제조된 표준 교정 곡선과 비교하였다. 점도는 RheoSense microVisc 점도계를 사용하여 측정하였다. 다양한 HERCEPTIN® 용액의 농도 및 점도 측정은 하기 표 40에 제시되며, 여기서 완충 시스템 1 및 2는 표 39에 기재된 완충액을 나타낸다.
표 40
Figure pct00046
살리실산 및 카페인 둘 모두를 함유하는 완충 시스템 1은 대조군 샘플과 비교하여 215 mg/mL에서 76%의 최대 점도 감소를 가졌다. 카페인만 함유하는 완충 시스템 2는 200 mg/mL에서 최대 59% 점도 감소를 가졌다.
실시예 39: AVASTIN ® 제형의 점도 감소
AVASTIN®(Genentech에 의해 판매되는 모노클로날 항체 베바시주맙 제형)은 히스티딘 완충액에서 25 mg/mL 용액으로 받았다. 샘플을 3500 rpm의 Amicon Ultra 4 원심분리 농축기 튜브(MWCO 30 kDa)에서 농축하였다. 점도는 RheoSense microVisc로 측정하였고, 농도는 280 nm에서의 흡광도에 의해 결정하였다(흡광 계수, 1.605 mL/mg). 25 mM 히스티딘 HCl과 함께 10 mg/mL 카페인을 첨가하여 부형제 완충액을 제조하였다. AVASTIN® 스톡 용액을 부형제 완충액으로 희석시킨 후, Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브(MWCO 30 kDa)에서 농축하였다. 부형제 샘플의 농도를 브래드포드 검정에 의해 결정하였고, 점도를 RheoSense microVisc를 사용하여 측정하였다. 결과는 하기 표 41에 제시된다.
표 41
Figure pct00047
AVASTIN®은 대조군 AVASTIN® 샘플과 비교하는 경우 10 mg/mL의 카페인을 이용하여 213 mg/mL로 농축되는 경우 73%의 최대 점도 감소를 나타내었다.
실시예 40: 카페인, 2차 부형제 및 시험 단백질을 함유하는 제형의 제조
부형제 화합물로서 카페인 또는 카페인 및 제2 부형제 화합물의 조합물 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였고, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에서 사용될 치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 상이한 부형제 화합물과 함께 20 mM 히스티딘 완충액에서 제조하였다. 부형제 조합물(하기 표 42에 기재되는 바와 같은 부형제 A 및 B)을 20 mM 히스티딘에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 모델 단백질의 용해 전에 pH 6을 달성하였다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 최종 단백질 농도를 달성하기 위한 비율로 용해시켰다. 부형제 용액 중 BGG의 용액을 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 80-100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 약 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 하기 표 42에서 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었다. 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다.
표 42
Figure pct00048
실시예 41: 디메틸 설폰 및 시험 단백질을 함유하는 제형의 제조
부형제 화합물로서 디메틸 설폰(Jarrow Formulas, Los Angeles, CA) 및 시험 단백질을 사용하여 제형을 제조하였고, 여기서 시험 단백질은 치료 제형에서 사용될 치료 단백질을 시뮬레이션하도록 의도되었다. 상기 제형을 하기 방식으로 점도 측정을 위해 20 mM 히스티딘 완충액에서 제조하였다. 디메틸 설폰을 20 mM 히스티딘에 용해시키고, 생성된 용액 pH를 소량의 소듐 하이드록시드 또는 염산으로 조정하여 pH 6을 달성한 후, 모델 단백질의 용해 전에 0.22 마이크론 필터를 통해 여과시켰다. 부형제 용액이 제조되면, 시험 단백질 소 감마 글로불린(BGG)를 약 280 mg/mL의 농도로 용해시켰다. 부형제 용액 중 BGG의 용액을 20 mL 유리 신틸레이션 바이알에서 제형화하고, 밤새 오비탈 쉐이커 테이블에서 80-100 rpm에서 진탕하였다. 이후, BGG 용액을 2 mL 미세원심분리기 튜브로 옮기고, IEC MicroMax 미세원심분리기에서 2300 rpm으로 약 10분 동안 원심분리하여 점도 측정 전에 동반된 공기를 제거하였다.
상기 기재된 바와 같이 제조된 제형의 점도 측정은 DV-IIT LV 콘 및 플레이트 점도계(Brookfield Engineering, Middleboro, MA)를 사용하여 이루어졌다. 점도계에는 CP-40 콘이 장착되었으며, 3 rpm 및 25℃에서 작동되었다. 제형을 0.5 mL의 부피로 점도계에 로딩하고, 제공된 전단 속도 및 온도에서 3분 동안 인큐베이션한 후, 20초의 측정 수집 기간을 두었다. 그 다음 1분의 전단 인큐베이션 및 후속 20초 측정 수집 기간으로 구성되는 2개의 추가 단계가 후속되었다. 이후, 수집된 3개의 데이터 포인트를 평균화하고, 샘플에 대한 점도로 기록하였다. 부형제를 갖는 용액의 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도로 표준화되었다. 표 43에 기록된 표준화된 점도는 부형제가 없는 모델 단백질 용액의 점도에 대한 부형제를 갖는 모델 단백질 용액의 점도의 비율이다.
표 43
Figure pct00049
실시예 42: 완충액의 제조
90 mL의 Milli-Q 초순수에 0.392 g MES 모노하이드레이트, 0.374 g 글리신 및 0.682 g 카페인을 용해시킴으로써 20 mM 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산(MES), 50 mM 글리신 및 35 mM 카페인의 완충액을 제조하였다. 모든 내용물을 용해시킨 후, 부피 플라스크에 Milli-Q 초순수를 첨가하여 용액 pH를 5.5로 조정하고, 100 mL의 최종 부피로 조정하였다. 이후, 완충액을 병 상부 필터 장치를 사용하여 0.2 μm PES 필터를 통해 진공 여과시켰다. 20 mM 히스티딘, 50 mM 글리신 및 35 mM 카페인을 함유하는 유사한 완충액을 또한 동일한 방식으로 제조하였다.
450 mL의 Milli-Q 초순수에 1.211 g TRIS, 2.938 g 소듐 클로라이드, 2.098 g 만니톨 및 0.019 g DTPA를 용해시켜 20 mM 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄(TRIS), 100 mM 소듐 클로라이드, 55 mM 만니톨 및 0.1 mM 디에틸렌트리아민펜타아세트산(DTPA)의 대조군 완충액을 제조하였다. 모든 내용물을 용해시킨 후, 부피 플라스크에 Milli-Q 초순수를 첨가하여 용액 pH를 7.0으로 조정하고, 부피를 500 mL로 조정하였다. 완충액을 병 상부 필터 장치를 사용하여 0.2 μm PES 필터를 통해 진공 여과시켰다.
실시예 43: 이필리무맙 제형
모노클로날 항체 이필리무맙의 샘플을 Bioceros(The Netherlands)로부터 획득하고, 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브(EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 실시예 42의 3개의 제조된 완충액으로 완충액 교환하였다. 표적 최종 단백질 농도는 20 mg/mL였고, 최종 농도는 Synergy HT 플레이트 판독기(BioTek, Winooski, VT)를 사용하여 280 nm(A280)에서의 흡광도로 측정하였다. 단백질 용액의 흡광도는 블랭크 완충액의 흡광도로부터 공제되었다. 블랭크 공제된 단백질 용액 흡광도는 보고된 흡광 계수로 나눈 후, 단백질 희석 인자(20x)를 곱하여 최종 단백질 농도를 결정하였다. 카페인은 280 nm에서 흡광도 측정을 방해하므로, 카페인을 함유하는 용액의 단백질 농도는 A280 측정 단백질 용액에 대한 질량 균형에 의해 결정하였다. 이는 질량을 기준으로 측정된 A280 단백질 용액에 가까운 대략적인 농도를 제공하였다.
이후, 제조된 단백질 용액을 384 마이크로웰 플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)에 첨가하였다. 각각의 용액을 웰 당 35 μL로 3개의 웰에 로딩하였다. 이후, 마이크로웰 플레이트를 Sorvall Legend RT 원심분리기에서 400 x g에서 원심분리하여 임의의 캡슐화된 공기 주머니를 제거하였다. 미리 절단된 감압 밀봉 테이프(Thermo Scientific)를 마이크로웰 플레이트 상부에 적용시켜 DLS 기기(DynaPro II DLS 플레이트 판독기, Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)로의 배치 전에 증발을 방지하였다. DLS 기기 샘플 구획을 65℃에서 유지하고, 단백질 용액의 입자 크기를 9시간 동안 기록하였다. 표 44는 1시간 측정에서 3개의 상이한 제형의 이필리무맙에 대한 반경 크기를 제시한다.
표 44
Figure pct00050
실시예 44: 우레아 변성에 의한 단백질 제형의 안정성 시험
우레아는 용액에서 단백질을 변성시켜 이들을 언폴딩시키는 것으로 공지되어 있다. 본 실시예의 스크리닝 방법론은 우스테키누맙과 같은 치료 단백질 용액에 특정 농도의 우레아를 첨가하는 것을 포함하였다. 이러한 시험 예는 보호 부형제가 우레아의 존재하에서 치료 단백질의 언폴딩을 방지하거나 감소시킬 것이라는 가설을 기반으로 하였으며, 언폴딩된 단백질의 양을 측정하는 것은 우레아의 존재하에서 단백질을 안정화시키는 데 효과적인 부형제를 확인하는 것을 가능하게 할 것이다. 단백질 언폴딩을 추적하는 한 가지 방법은 Sypro orange와 같은 외인성 형광 염료의 사용을 포함한다. Sypro orange는 언폴딩된 단백질 구조의 소수성 영역에 결합하여, 관찰된 형광 신호의 증가를 발생시킨다. 따라서, 상이한 부형제의 존재하에서 언폴딩된 단백질-Sypro orange 복합체의 형광 강도의 차이를 측정하는 것은 임의의 안정화 효과를 확인하는 것을 가능하게 한다.
하기 표 45에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. 20 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0에 100 mg/mL 농도의 각각의 부형제를 용해시켜 부형제의 스톡 용액을 제조하였다. 0.500 L Milli-Q 물에 1.55 g의 히스티딘을 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하여 히스티딘 완충액을 제조하였다. 이후, 5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 부형제 제조물을 1 mg/mL의 최종 농도로 우스테키누맙과 조합하여 부형제 함유 단백질 제형을 제조하였다. 동일 히스티딘 완충액에 27 g의 우레아를 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하여 본 실시예에서 사용하기 위한 9M 우레아의 스톡 용액을 제조하였다. 이후, 이러한 우레아 스톡 용액을 6M의 최종 농도로 첨가하여 시험 용액(부형제 + 단백질 + 우레아)을 생성하였다. 이후, 스톡 용액(5000X)으로부터의 Sypro orange 염료를 각각에 대해 20X의 최종 농도로 스파이킹하였다. 혼합물의 pH를 재확인하고, pH 6.0인 것을 확인하였다. 시험 용액을 30분 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 200 μL의 샘플을 Greiner CellStar 흑색 웰 투명 편평 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 각각의 샘플의 형광을 485 nm의 여기 및 590/20 nm의 방출 필터를 갖는 BioTek Synergy HT 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 상이한 시험 제형의 형광 강도를 대조군 제형(임의의 부형제가 없는 단백질 및 우레아)의 것과 비교하였고, 감소된 형광을 나타내는 시험 제형은 안정화 부형제를 포함하는 것으로 간주되었다. 하기 표 45에 제시된 바와 같이, 다수의 부형제는 이의 형광을 대조군의 것과 비교한 경우에 대조군에 비해 증가된 안정성을 반영하였다. 이들 결론은 단백질을 안정화시키는 부형제의 능력이 실험 동안 측정된 형광을 감소시키는 이의 능력과 관련이 있으므로 도출되었다: 안정화 부형제는 단백질 언폴딩을 방지하거나 감소시킬 것이며, 이는 단백질-Sypro orange 상호작용의 감소를 발생시킬 것이며, 이는 차례로 감소된 형광 강도로 나타날 것이다. 이들 시험의 결과는 하기 표 45에 요약되어 있다.
표 45
Figure pct00051
실시예 45: 낮은 pH에서의 단백질 제형의 안정화
치료 단백질, 특히 항체는 상이한 단계의 처리, 특히 정제 및 바이러스 청소 동안 낮은 pH 용액 조건에 노출된다. 산성 pH 조건에 대한 이러한 노출은 입체형태적 변화를 발생시킬 수 있으며, 이는 차례로 단백질의 언폴딩 및 응집을 발생시킬 수 있다. 안정화 부형제를 확인하기 위한 스크리닝 방법론은 산성 pH에서 오말리주맙과 같은 치료 단백질을 인큐베이션하는 것을 포함하였다. 보호 부형제는 낮은 pH에서 치료 단백질의 언폴딩을 방지하거나 감소시킬 것이며, 따라서 언폴딩된 단백질의 양을 측정하는 것은 낮은 pH의 존재하에서 단백질을 안정화시키는 데 효과적인 부형제를 확인하는 것을 가능하게 할 것이다. 산성 pH에서 치료 단백질의 언폴딩은 Sypro orange와 같은 외인성 형광 염료를 사용하여 추적될 수 있다. 본 실시예에서 수행된 바와 같은 Sypro orange(Thermo-Fisher, Waltham MA)의 첨가는 염료가 언폴딩된 단백질 내의 소수성 영역에 결합하는 것을 가능하게 하며, 이는 형광 신호의 증가를 발생시킨다. 따라서, 상이한 부형제의 존재하에서 언폴딩된 단백질-Sypro orange의 형광 강도의 차이를 측정하는 것은 안정화제를 확인하는 것을 가능하게 한다.
하기 표 46에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. 0.15 M 글리신 완충액 pH 2.6에 100 mg/mL 농도의 각각의 부형제를 용해시켜 부형제의 스톡 용액을 제조하였다. 0.09 L Milli-Q 물에 1.65 g의 히스티딘을 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 2.6으로 조정하고, 부피를 0.100 L로 만들어 산성화 완충액을 제조하였다. 이후, 5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 부형제 제조물을 1 mg/mL의 최종 농도로 우스테키누맙과 조합하여 각각의 부형제 함유 단백질 제형을 제조하였다. 이후, 글리신 산성화 완충액을 부형제-단백질 혼합물에 첨가한 후, 스톡 용액(5000X)으로부터의 Sypro orange 염료에서 20X의 최종 농도로 스파이킹하였다. 200 μL의 샘플을 Greiner CellStar 흑색 웰 투명 편평 바닥 96 웰 플레이트로 옮기고, 각각의 샘플의 형광을 485 nm의 여기 파장 및 590/20 nm의 방출 필터 파장을 갖는 BioTek Synergy HT 플레이트 판독기를 사용하여 측정하였다. 상이한 시험 제형의 형광 강도를 대조군 제형(임의의 부형제가 없는 단백질 및 글리신 완충액)의 것과 비교하였고, 감소된 형광을 나타내는 것은 안정화 부형제를 포함하는 것으로 간주되었다. 표 46에 제시된 바와 같이, 다수의 부형제는 이들의 형광을 대조군의 것과 비교한 경우에 대조군에 비해 증가된 안정성을 반영하였다. 이들 결론은 단백질을 안정화시키는 부형제의 능력이 실험 동안 측정된 형광을 감소시키는 이의 능력과 관련이 있으므로 도출되었다: 안정화 부형제는 단백질 언폴딩을 방지하거나 감소시킬 것이며, 이는 단백질-Sypro orange 상호작용의 감소를 발생시킬 것이며, 이는 차례로 감소된 형광 강도로 나타날 것이다. 이들 시험의 결과는 하기 표 46에 요약되어 있다.
표 46
Figure pct00052
Figure pct00053
실시예 46: 열 안정화제로서의 부형제의 시험
치료 단백질은 3차 및 2차 구조 요소의 변화를 발생시킬 수 있는 온도에서의 변동에 자주 적용된다. 이는 단백질의 응집을 발생시킬 수 있고, 활성 고유 단백질의 양을 감소시킬 수 있다. 열 스트레스에 대해 보호하는 부형제는 하기 표 47에 기재된 부형제의 존재 또는 부재하에서 열 분해 연구에 의해 본 실시예에서 확인되었다. 하기 표 47에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. pH 6.0의 20 mM 히스티딘 완충액에 100 mg/mL 농도의 각각의 부형제를 용해시켜 부형제의 스톡 용액을 제조하였다. 0.500 L Milli-Q 물에 1.55 g의 히스티딘을 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하여 히스티딘 완충액을 제조하였다. 이후, 5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 부형제 제조물을 1 mg/mL의 최종 농도로 우스테키누맙과 조합하여 부형제 함유 단백질 제형을 제조하였다. 제형을 0.2 mL 미세원심분리기 튜브에 분취하고, 120분 동안 가열 블록에서 65℃에서 인큐베이션하였다. 분취액을 0, 15, 30, 60, 90 및 120분에 회수하였다. 샘플을 5분 동안 얼음 상에서 켄칭시키고, 10분 동안 5000 rpm에서 회전시켰다. 이후, 상층액을 TSKgel SW3000 컬럼(30 cm x 4.8 mm ID) 및 280 nm로 설정된 Agilent G1351B 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템에 로딩한 크기 배제-HPLC로 샘플을 분석하였다. pH 6.5의 50 mM 포스페이트 완충액, 100 mM NaCl의 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 사용하였다. 단량체 분획을 단량체 피크 면적을 적분하여 계산하고, 적분 피크 면적의 변화를 시간의 함수로 작도하였다. 열 안정성은 2시간 인큐베이션의 종료시에 남아 있는 단량체의 분획과 관련이 있었다.
표 47
Figure pct00054
실시예 47: 기계적 전단 스트레스에 대한 안정화제로서의 부형제의 시험
치료 단백질은 종종 진탕, 교반 등에 의해 기계적 스트레스에 적용되고, 부여된 전단 스트레스는 단백질의 응집을 발생시킬 수 있다. 전단 스트레스에 대한 보호를 제공하는 부형제는 시험 부형제(하기 표 48에 나열됨)의 존재하에서 치료 단백질 용액을 진탕시키고, 응집된 입자 수의 임의의 변화를 관찰하여 확인되었다. 하기 표 48에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. Milli-Q 물에 100 mg/mL 농도로 각각의 부형제를 용해시켜 부형제의 스톡 용액을 제조하였다. 이후, 0.5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 부형제 제조물을 2 mg/mL의 최종 농도로 오말리주맙과 조합하여 부형제 함유 단백질 제형을 제조하였다. 샘플을 0.5 mL 냉동 바이알(ThermoFisher, Waltham MA)로 옮기고, 오비탈 쉐이커에 고정시켰다. 이후, 이들을 300 rpm으로 설정된 진탕과 함께 72시간 동안 22℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 종료시, 100 μL의 각각의 샘플을 96-웰 플레이트로 옮기고, 흡광도를 350 nm에서 측정하였다. 응집의 임의의 증가를 350 nm에서 광 산란의 변화를 관찰하고, 대조군 제형(시험 샘플과 동일하게 제조되나, 부형제의 첨가가 없음)의 350 nm에서의 광 산란에 대한 변화를 비교하여 측정하였다. 본질적으로 보호성인 부형제는 진탕 단계 후 응집 속도를 늦추고, A350 흡광도 값을 감소시키는 능력에 의해 확인되었다.
표 48
Figure pct00055
실시예 48: 부형제를 사용한 단백질 용액의 동결-해동 안정성
하기 표 49에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. pH 6.0의 20 mM 히스티딘 완충액에 100 mg/mL 농도의 각각의 부형제를 용해시켜 시험 부형제(표 49에 나열됨)의 스톡 용액을 제조하였다. 0.500 L Milli-Q 물에 1.55 g의 히스티딘을 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하여 완충액을 제조하였다. 이후, 5 mg/mL의 최종 농도로 각각의 부형제 제조물을 5 mg/mL의 최종 농도로 오말리주맙과 조합하여 부형제 함유 단백질 제형을 제조하였다. 0.4 mL의 각각의 제형을 96-웰 폴리프로필렌 플레이트(Advangene, IL) 내의 웰로 옮겼다. 샘플을 적어도 5주기 동안 냉동고에서 -80℃로 냉동시킨 후, 실온에서 해동시키고, 이후 100 μL의 샘플을 Greiner CellStar 흑색 웰 투명 편평-바닥 96-웰 플레이트로 옮겼다. 부형제의 안정화 효과를 350 nm에서 광 산란 분석을 사용하여 단백질 응집의 형성을 측정하고, 대조군 제형(시험 샘플과 동일하게 제조되나, 부형제의 첨가가 없음)의 350 nm에서의 광 산란에 대한 변화를 비교하여 분석하였다. 본질적으로 보호성인 부형제는 진탕 단계 후 응집 속도를 늦추고, A350 흡광도 값을 감소시키는 능력에 의해 확인되었다.
표 49
Figure pct00056
실시예 49: DLS 확산 상호작용 파라미터 k D 에 의한 부형제 시험
타입 1 초순수에 3.1 g의 히스티딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 용해시켜 부형제 및 단백질 용액을 제형화하는 데 사용하기 위해 20 mM 히스티딘 하이드로클로라이드(His HCl) 완충액의 스톡 용액을 제조하였다. 생성된 용액을 1 M 염산의 적가에 의해 pH 6으로 적정하였다. pH 조정 후, 완충액을 타입 1 초순수를 갖는 부피 플라스크에서 1 L의 최종 부피로 희석시켰다. 하기 표 50에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다.
일련의 6개의 시험 단백질 용액을 표 50에 기재된 단백질을 사용하여 제조하였으며, 단백질 농도는 약 4 mg/mL 내지 약 20 mg/mL 범위이며, 모두 pH 6에서 20 mM His HCl 완충액에서 제조하였다. 384-웰 마이크로플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)에서, 15 μL의 단백질 용액을 표 50에 기재된 부형제를 사용하여 pH 6의 20 mM His HCl 완충액에서 제조된 15 μL의 스톡 부형제 용액과 조합하였고, 각각의 부형제는 6개의 상이한 단백질 농도에서 시험되었다. 단백질-부형제 조합물을 함유하는 마이크로플레이트를 Sorvall Legend RT 원심분리기에서 400 x g에서 원심분리한 후, 플레이트 쉐이커에서 진탕하여 샘플을 적절히 혼합하였다. 두 번째 원심분리 단계를 완료하여 기포를 제거하였다. 이들 단백질-부형제 제형의 확산 상호작용 파라미터(kD)를 단백질-단백질 상호작용(PPI)에 대한 부형제의 영향을 탐지하는 방식으로 희석 용액에서 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정하였다. DLS 연구를 수행하기 위해, 상기 제조된 마이크로플레이트를 DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technologies Corp., Goleta, CA)에 로딩하고, 각각의 샘플의 확산 계수를 25℃에서 측정하였다. 각각의 부형제 함유 시험 용액에 대해, 측정된 확산 계수를 단백질 농도의 함수로 작도하고, 데이터의 선형 적합 기울기를 kD로서 기록하였다. 더 음의 kD는 더 강한 순 끌어당김 PPI를 나타내고, 더 양의 kD는 더 강한 순 반발 PPI를 나타내었다. 표 50은 각각의 부형제 함유 시험 용액의 kD 값을 나타내며, 여기서 각각의 부형제에 대한 이들 시험 값은 대조군 용액(히스티딘 완충액에 단백질을 함유하나 부형제는 함유하지 않음)의 kD 값과 비교할 수 있다.
표 50
Figure pct00057
Figure pct00058
실시예 50: 점도 감소에 대한 부형제 시험
Bioceros(The Netherlands)에서 획득한 바이오시밀러 모노클로날 항체인 오말리주맙 및 우스테키누맙을 pH 6의 20 mM His HCl 완충액으로 완충액 교환하였고, 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브(EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 농축시켰다. 생성된 농축된 제형을 20 mM His HCl에서 농축된 제형의 연속 희석액을 제조하고, 100 μL의 각각의 희석액을 UV 투명 96 하프-웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One, Austria)에 로딩하고, Synergy HT 플레이트 판독기(BioTek, Winooski, VT)로 280 nm에서 흡광도를 측정함으로써 단백질 농도에 대해 280 nm에서의 흡광도에 의해 분석하였다. 이후, 블랭킹된 경로-길이 보정된 흡광도 측정을 각각의 흡광 계수로 나누고, 희석 계수를 곱하여 단백질 농도를 결정하였다. 원하는 최종 농도 또는 화합물의 용해도 한계의 10배에서 20 mM HisHCl pH 6에서 부형제 용액을 제조하고, 농축된 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 필요에 따라 pH를 6으로 조정하였다. 이후, 농축된 단백질 제형을 384-웰 마이크로플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)에서 하기 표 51에 나열된 부형제의 10배 부형제 용액(9부 단백질, 1부 부형제 용액 또는 완충액)과 조합하였다. 하기 표 51에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. 각각의 샘플이 동일 부피로 희석되었으므로 각각의 샘플의 단백질 농도는 동일하다. 이후, 마이크로플레이트를 Sorvall Legend RT 원심분리기에서 400 x g에서 원심분리하고, 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 진탕 후, 2 μL의 20 mM His HCl 중 폴리에틸렌 글리콜 표면-개질 금 나노입자(nanoComposix, San Diego, CA)의 5배 희석액을 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 2회 진탕시켜 금 나노입자를 샘플에 혼합한 후, DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)에 배치하여 25℃에서 금 나노입자의 겉보기 입자 크기를 측정하였다. 단백질 제형 내의 금 나노입자의 겉보기 입자 크기 대 물 중 금 나노입자의 공지된 입자 크기의 비율을 사용하여 스톡스-아인슈타인 방정식(Stokes-Einstein equation)에 따라 단백질 제형의 점도를 결정하였다. 본 실시예에서, 금 나노입자의 겉보기 반경 대 실제 반경의 비율에 25℃에서의 물의 점도를 곱하여 센티푸아즈(cP) 단위의 단백질 제형의 점도를 계산하였다. 이들 시험의 결과는 하기 표 51에 요약되어 있다.
표 51
Figure pct00059
Figure pct00060
실시예 51: 인플릭시맙을 사용한 열 분해 검정
REMICADE® 인플릭시맙을 Clinigen Group에서 획득하였고, Janssen 패키지 삽입물의 설명서에 따라 재구성하여 50 mg/mL 수크로스 및 0.05 mg/mL 폴리소르베이트 80을 갖는 5 mM 포스페이트 완충액, pH 약 7 중 10 mg/mL 인플릭시맙 용액을 생성시켰다. 이후, 재구성된 약물 생성물을 pH 5에서 50 mM 소듐 아세테이트 완충액과 1:1 부피로 조합하였다. 이후, 생성된 용액을 소규모 분취 양이온 교환 컬럼(GE Healthcare, Chicago, IL)에 주입하였다. 인플릭시맙을 컬럼에 로딩한 후, 컬럼을 10 컬럼 부피의 50 mM 소듐 아세테이트 완충액, pH 5로 세척하였다. 이후, 인플릭시맙을 pH 5에서 250 mM 소듐 클로라이드, 50 mM 소듐 아세테이트 완충액의 5 컬럼 부피로 컬럼으로부터 용리시켰다. 이후, 용리된 인플릭시맙을 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Amicon Ultra 15(EMD Millipore, Billerica, MA) 원심분리 농축기를 사용하여 pH 7에서 20 mM 포스페이트 완충액으로 완충액 교환하였다. 이후, pH 7에서 20 mM 포스페이트 완충액 중 4 또는 8 mg/mL 인플릭시맙의 스톡 용액을 후속 시험에서 사용하였다.
하기 표 52에 나열된 본 실시예에서 사용된 모든 부형제는 가장 높은 순도였으며, Sigma Aldrich(St. Louis, MO) 또는 Cayman Chemical(Ann Arbor, MI)로부터 획득하였다. 스톡 인플릭시맙 용액을 각각의 샘플에서 약 2 mg/mL의 최종 인플릭시맙 농도를 달성하기 위해 20 mM 포스페이트 완충액, pH 7에서 제형화된 표 52에 나열된 부형제를 함유하는 스톡 부형제 용액과 혼합하였다. 이후, 인플릭시맙 용액 및 스톡 부형제 용액을 함유하는 샘플을 PCR 튜브에 5개의 100 μL 분취량으로 분취하였다. 분취액을 열적으로 스트레스를 주기 위해 15분 내지 약 3시간 범위의 상이한 기간 동안 건조 배쓰(Benchmark Scientific, Sayreville, NJ)에서 55℃에서 인큐베이션하였고; 이후, 샘플을 건조 배쓰에서 제거한 후 얼음 위에 두어 열 응집을 켄칭시켰다. 이후, 이들 스트레스 샘플을 280 nm에서 흡광도를 모니터링하는 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 시리즈 HPLC를 사용하여 고성능 크기 배제 크로마토그래피(HP-SEC)로 단량체 함량에 대해 분석하였다. HPLC를 TSKgel SuperSW3000 4.6 mm x 30 cm 컬럼(Tosoh Bioscience, Tokyo, Japan)을 통해 0.35 mL/min의 유량으로 pH 7에서 100 mM 포스페이트, 300 mM NaCl의 이동상으로 25℃의 컬럼 온도에서 수행하였다. 각각의 샘플에 대해, 단량체 피크 면적을 동일하지만 스트레스가 가해지지 않은 샘플에서 획득된 단량체 피크 면적으로 나누어 열 스트레스에 대한 노출 후 남아 있는 단량체 백분율을 획득하였다. 이후, 비-스트레스 샘플의 백분율로서 남아 있는 단량체를 인큐베이션 시간의 함수로 작도하고, 데이터에 대한 선형 적합 기울기의 절대 값을 단량체 손실률로 기록하였다. 이후, 부형제가 없는 완충액 대조군의 단량체 손실률로 단량체 손실률을 나누어 결정된 단량체 손실률을 표준화시켰으며, 결과는 하기 표 52에 제시된다.
표 52
Figure pct00061
실시예 52: 니코틴아미드 모노뉴클레오티드 및 이타콘산을 사용한 농축 오말리주맙의 DLS 점도 측정
니코틴아미드 모노뉴클레오티드(NMN)를 Genex Formulas(Orlando, FL)에서 구입한 영양 보충제 캡슐에서 수집하였으며, 이타콘산을 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 이들 물질을 하기 실험에서 부형제로 사용하였다.
Bioceros(The Netherlands)에서 획득한 모노클로날 항체 오말리주맙의 바이오시밀러를 20 mM His HCl pH 6 완충액으로 완충액 교환하였고, 30 kDa 분자량 컷오프를 갖는 Amicon Ultra 15 원심분리 농축기 튜브(EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 농축시켰다. 0.5 L Milli-Q 물에 1.55 g의 히스티딘을 용해시키고, 1 M HCl을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하여 완충액을 제조하였다. 생성된 농축된 제형을 20 mM His HCl에서 농축된 제형의 연속 희석액을 제조하고, 100 마이크로리터의 각각의 희석액을 UV 투명 96 하프-웰 마이크로플레이트(Greiner Bio-One, Austria)에 로딩하고, Synergy HT 플레이트 판독기(BioTek, Winooski, VT)로 280 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 단백질 농도에 대한 A280로 분석하였다. 이후, 각각의 샘플에 대한 블랭킹된 경로-길이 보정된 A280 측정을 각각의 흡광 계수로 나누고, 희석 계수를 곱하여 단백질 농도를 결정하였다. 스톡 부형제 용액을 1 M 또는 화합물의 용해도 한계에서 상기 언급된 부형제를 사용하여 20 mM HisHCl pH 6에서 제조하였으며, 농축된 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 필요에 따라 pH를 6으로 조정하였다. 이후, 농축된 단백질 제형을 스톡 부형제 용액 또는 대조군과 9부 단백질 제형:1부 부형제 용액 또는 완충액(대조군에 대함)의 비율로 조합하고, 분취량을 384 웰 마이크로플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)의 웰에 첨가하였다. 이후, 마이크로플레이트를 Sorvall Legend RT에서 400 x g에서 원심분리하고, 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 마이크로플레이트를 진탕시킨 후, 2 마이크로리터의 20 mM His HCl 중 100 nm의 직경을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 표면-개질 금 나노입자(nanoComposix, San Diego, CA)의 5배 희석액을 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 2회 진탕시켜 금 나노입자를 샘플에 혼합한 후, DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)에 배치하여 25℃에서 금 나노입자의 겉보기 입자 크기를 측정하였다. 단백질 제형 내의 금 나노입자의 겉보기 입자 크기 대 완충액(단백질 없음) 중 금 나노입자의 겉보기 입자 크기의 비율을 사용하여 스톡스-아인슈타인 방정식에 따라 단백질 제형의 점도를 결정하였다. 본 실시예에서, 금 나노입자의 겉보기 반경 대 실제 반경의 비율에 25℃에서의 물의 점도를 곱하여 센티푸아즈(cP) 단위의 단백질 제형의 점도를 계산하였다. 2개의 상이한 부형제를 사용한 결과는 하기 표 53에 제시된다.
표 53
Figure pct00062
실시예 53: 농축된 오말리주맙의 DLS 점도 측정
4-(2-하이드록시에틸)피페라진-1-에탄설폰산(HEPES), 디사이클로민 하이드로클로라이드, 프리디놀 메탄설포네이트, 1-부틸이미다졸 및 1-헥실이미다졸을 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였으며, 본 실시예에서 부형제 용액을 제조하는 데 사용하였다. O-(옥틸포스포릴)콜린을 1 M 용액으로서 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였고, 본 실시예에서 스톡 부형제 용액으로 사용하였다.
Bioceros(The Netherlands)에서 획득한 모노클로날 항체 오말리주맙의 바이오시밀러의 농축 제형을 실시예 52에 기재된 바와 같이 제조하고, 이를 실시예 52에 기재된 바와 같이 단백질 농도에 대해 분석하였다. 상기 언급된 부형제를 사용한 스톡 부형제 용액을 1 M 또는 화합물의 용해도 한계에서 20 mM HisHCl pH 6 완충액에서 제조하였으며(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨), 농축된 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 필요에 따라 pH를 6으로 조정하였다. O-(옥틸포스포릴)콜린을 추가 제조 없이 스톡 부형제로 사용하였다. 이후, 농축된 단백질 제형을 스톡 부형제 용액 또는 대조군과 9부 단백질 제형:1부 부형제 용액 또는 완충액(대조군에 대함)의 비율로 조합하고, 분취량을 384 웰 마이크로플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)의 웰에 첨가하였다. 이후, 마이크로플레이트를 Sorvall Legend RT에서 400 x g에서 원심분리하고, 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 마이크로플레이트를 진탕시킨 후, 2 마이크로리터의 20 mM His HCl 중 100 nm의 직경을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 표면-개질 금 나노입자(nanoComposix, San Diego, CA)의 5배 희석액을 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 2회 진탕시켜 금 나노입자를 샘플에 혼합한 후, DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)에 배치하여 25℃에서 금 나노입자의 겉보기 입자 크기를 측정하였다. 단백질 제형 내의 금 나노입자의 겉보기 입자 크기 대 완충액(단백질 없음) 중 금 나노입자의 겉보기 입자 크기의 비율을 사용하여 스톡스-아인슈타인 방정식에 따라 단백질 제형의 점도를 결정하였다. 본 실시예에서, 금 나노입자의 겉보기 반경 대 실제 반경의 비율에 25℃에서의 물의 점도를 곱하여 센티푸아즈(cP) 단위의 단백질 제형의 점도를 계산하였다. 5개의 상이한 부형제를 사용한 결과는 하기 표 54에 제시된다.
표 54
Figure pct00063
실시예 54: 농축된 오말리주맙의 DLS 점도 측정
다음 화학물질을 사용하여 본 실시예를 위한 스톡 부형제 용액을 제조하였다: 테트라에틸암모늄 클로라이드, 테트라메틸암모늄 아세테이트, 1-메틸이미다졸, 1-부틸이미다졸, 1-헥실이미다졸, 2-에틸이미다졸, 2-메틸이미다졸 및 스펙티노마이신을 Sigma Aldrich(St. Louis, MO)에서 구입하였다. 트리글리신, 테트라글리신 및 2-부틸이미다졸을 Chem-Impex(Wood Dale, IL)에서 구입하였다. 호르데닌 HCl을 Bulk Supplements(Henderson, NV)에서 구입하였다.
Bioceros(The Netherlands)에서 획득한 모노클로날 항체 오말리주맙의 바이오시밀러의 농축 제형을 실시예 52에 기재된 바와 같이 제조하고, 이를 실시예 52에 기재된 바와 같이 단백질 농도에 대해 분석하였다. 상기 언급된 부형제를 사용한 스톡 부형제 용액을 1 M 또는 화합물의 용해도 한계에서 20 mM HisHCl pH 6 완충액에서 제조하였으며(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨), 농축된 염산 또는 소듐 하이드록시드를 사용하여 필요에 따라 pH를 6으로 조정하였다. 이후, 농축된 단백질 제형을 스톡 부형제 용액 또는 대조군과 9부 단백질:1부 부형제 용액 또는 완충액(대조군에 대함)의 비율로 조합하고, 분취량을 384 웰 마이크로플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)의 웰에 첨가하였다. 이후, 마이크로플레이트를 Sorvall Legend RT에서 400 x g에서 원심분리하고, 플레이트 쉐이커에서 진탕하였다. 마이크로플레이트를 진탕시킨 후, 2 마이크로리터의 20 mM His HCl 중 100 nm의 직경을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 표면-개질 금 나노입자(nanoComposix, San Diego, CA)의 5배 희석액을 각각의 샘플 웰에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 2회 진탕시켜 금 나노입자를 샘플에 혼합한 후, DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)에 배치하여 25℃에서 금 나노입자의 겉보기 입자 크기를 측정하였다. 단백질 제형 내의 금 나노입자의 겉보기 입자 크기 대 완충액(단백질 없음) 중 금 나노입자의 겉보기 입자 크기의 비율을 사용하여 스톡스-아인슈타인 방정식에 따라 단백질 제형의 점도를 결정하였다. 본 실시예에서, 금 나노입자의 겉보기 반경 대 실제 반경의 비율에 25℃에서의 물의 점도를 곱하여 센티푸아즈(cP) 단위의 단백질 제형의 점도를 계산하였다. 12개의 상이한 부형제를 사용한 결과는 하기 표 55에 제시된다.
표 55
Figure pct00064
실시예 55: 열 안정성을 증가시키는 부형제
치료 단백질은 이들의 3차 및 2차 구조 요소의 변화를 발생시킬 수 있는 온도에서의 변동에 자주 적용된다. 이는 단백질의 응집을 발생시키며, 활성 고유 종의 감소를 발생시킨다. 열 스트레스에 대해 보호하는 부형제를 부형제의 존재 또는 부재하에서 열 분해 연구에 의해 시험하였다. 부형제 스톡을 20 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0에서 100 mg/mL의 농도로 하기 표 56에 나열된 부형제를 용해시켜 제조하였다(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨). 각각의 시험 샘플을 완충액에 부형제 스톡을 첨가하여 최종 농도 5 mg/mL의 부형제를 획득하고, 히스티딘 완충액(실시예 51에 기재된 바와 같이 제조됨)에서 20 mg/mL 우스테키누맙 스톡으로부터의 단백질을 1 mg/mL의 최종 농도로 희석시켜 제조하였다. 제형을 0.2 mL 미세원심분리기 튜브에 분취하고, 120분 동안 가열 블록에서 65℃에서 인큐베이션하였다. 분취액을 0분, 30분, 60분, 90분 및 120분에서 회수하였다. 이후, 샘플을 5분 동안 얼음 상에서 켄칭시키고, 10분 동안 9000 rpm에서 회전시켰다. 이후, 상층액의 샘플을 다음과 같이 SE-HPLC로 분석하였다: 상층액을 TSKgel SW3000 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(30 cm x 4.8 mm ID) 및 280 nm에서 모니터링하는 Agilent G1351B 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템에 로딩하였다. 0.5% 인산, 150 mM NaCl, pH 3.5 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 사용하였다. 각각의 샘플에 대해, 단량체 피크 하의 피크 면적 및 시간의 함수로서 작도된 통합 피크 면적의 변화를 적분하여 단량체 분획을 계산하였다. 열 안정성은 2시간 인큐베이션의 종료시에 남아 있는 단량체의 분획과 관련이 있었고, 대조군(부형제가 첨가되지 않음)과 비교하여 단량체 백분율의 증가가 기록되었다. 7개의 시험된 부형제에 대한 결과는 하기 표 56에 요약되어 있다.
표 56
Figure pct00065
실시예 56: ADC의 열 안정성을 개선시키는 부형제
항체-약물 컨쥬게이트(ADC)는 소분자 약물의 부위 특이적 전달을 허용하는 화학적 링커를 통한 모노클로날 항체로의 소분자의 컨쥬게이션을 통해 생성되는 치료 단백질이다. 컨쥬게이션된 링커 및 소분자 조합물은 이의 단백질 전구체와 비교하여 ADC의 화학적 및 물리적 특성(전하, 소수성 등)을 변경하고, 추가적인 안정성 문제를 도입시킨다. 실시예 59의 화합물 우스테키누맙-FITC을 이들 시험을 위한 모델 ADC 화합물로 사용하였다. 열 스트레스에 대해 모델 ADC를 보호하는 부형제는 부형제의 존재 또는 부재하에서 열 분해 연구에 의해 시험하였다. 부형제 스톡을 20 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨)에서 100 mg/mL의 농도로 하기 표 57에 나열된 부형제를 용해시켜 제조하였다. 각각의 시험 샘플을 완충액에 부형제 스톡을 첨가하여 5 mg/mL의 최종 농도를 획득하고, 히스티딘 완충액에 우스테키누맙-FITC(하기 실시예 59에 기재된 바와 같음)를 1 mg/mL의 우스테키누맙-FITC의 최종 농도로 첨가하여 제조하였다. 제형을 0.2 mL 미세원심분리 튜브에 분취하고, 120분 동안 가열 블록에서 65℃에서 인큐베이션하였다. 분취액을 0분, 30분, 60분, 90분 및 120분에서 회수하였다. 이후, 샘플을 5분 동안 얼음 상에서 켄칭시키고, 10분 동안 9000 rpm에서 회전시켰다. 상층액을 TSK gel SW3000 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(30 cm x 4.8 mm ID) 및 280 nm에서 모니터링하는 Agilent G1351B 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템에 로딩하는 SE-HPLC로 샘플을 분석하였다. 0.5% 인산, 150 mM NaCl, pH 3.5 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 사용하였다. 단량체 피크 하의 피크 면적 및 시간의 함수로서 작도된 통합 피크 면적의 변화를 적분하여 단량체 분획을 계산하고, 대조군(부형제가 첨가되지 않음)에 비한 단량체 백분율의 증가를 기록하였다. 열 안정성은 2시간 인큐베이션의 종료시에 남아 있는 단량체의 분획과 관련이 있었다.
표 57
Figure pct00066
실시예 57: 동결/해동 스트레스에 대해 보호하는 부형제
치료 단백질은 이들의 운동 안정성을 개선하고 단백질 응집 및 활성 고유 종 감소를 발생시킬 수 있는 구조적 교란을 최소화하기 위해 종종 저온에서 유지된다. 특정 경우에, 이는 사용할 때까지 제형을 동결시켜 수행될 수 있다. 그러나, 저온, 농도 구배 및 반복된 동결 및 해동 동안의 얼음 형성은 단백질에 스트레스를 줄 수 있다. 열 스트레스에 대해 보호하는 부형제를 부형제의 존재 또는 부재하에서 열 분해 연구에 의해 시험하고 확인하였다. 부형제 스톡을 실시예 52에 기재된 바와 같이 제조된 20 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0에서 1 M의 농도로 하기 표 58에 나열된 부형제를 용해시켜 제조하였다. 각각의 시험 샘플을 부형제 스톡을 100 mM의 부형제의 최종 농도로 첨가하고, 히스티딘 완충액(실시예 50에 기재된 바와 같이 제조됨)에서 20 mg/mL 오말리주맙 스톡으로부터의 단백질을 2 mg/mL의 최종 농도로 희석시켜 제조하였고; 대조군을 동일한 방식이나 부형제 스톡 첨가 없이 제조하였다. 이후, 제형을 0.5 mL 크라이오바이알에 분취하고, 120분 동안 -80℃에서 냉동시켰다. 이후, 샘플을 실온으로 유지시킨 수조를 사용하여 해동시켰다. 이러한 동결-해동 주기를 6회 반복하였고, 그 후 각각의 샘플을 0.2 mL 마이크로원심분리기 튜브에 분취하고, 10분 동안 9000 rpm에서 회전시켰다. 상층액을 TSK gel SW3000 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(30 cm x 4.8 mm ID) 및 280 nm에서 모니터링하는 Agilent G1351B 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템에 로딩하는 SE-HPLC로 샘플을 분석하였다. 0.5% 인산, 150 mM NaCl, pH 3.5 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 사용하였다. 단량체 피크 하의 피크 면적 및 시간의 함수로서 작도된 통합 피크 면적의 변화를 적분하여 단량체 분획을 계산하였다.
표 58
Figure pct00067
실시예 58: 가속된 노화 연구
열 스트레스에 대해 보호하는 부형제를 부형제의 존재 또는 부재하에서 열 분해 연구에 의해 시험하였다. 부형제 스톡을 20 mM 히스티딘 완충액, pH 6.0(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨)에서 1 M의 농도로 하기 표 59에 나열된 부형제를 용해시켜 제조하였다. 각각의 시험 샘플을 부형제를 100 mM의 최종 농도로 첨가하고, 히스티딘 완충액에서 20 mg/mL 우스테키누맙 스톡으로부터의 단백질을 2 mg/mL의 최종 농도로 희석시켜 제조하였고; 대조군을 동일한 방식이나 부형제 스톡 첨가 없이 제조하였다. 1 mL의 각각의 샘플을 2 mL 유리 바이알(West Pharmaceutical services, PA)에 분취하고, 4주 동안 40℃에서 인큐베이션하였다. 분취액을 0, 1, 2, 3 및 4주 후에 회수하였다. 상층액을 TSKgel SW3000 크기 배제 크로마토그래피 컬럼(30 cm x 4.8 mm ID) 및 280 nm에서 모니터링하는 Agilent G1351B 다이오드 어레이 검출기가 장착된 Agilent 1100 HPLC 시스템에 로딩하는 SE-HPLC로 샘플을 분석하였다. 0.5% 인산, 150 mM NaCl, pH 3.5 이동상을 0.35 mL/min의 유량으로 사용하였다. 단량체 피크 하의 피크 면적 및 시간의 함수로서 작도된 통합 피크 면적의 변화를 적분하여 단량체 분획을 계산하였다. 열 안정성은 4주 인큐베이션의 종료시에 남아 있는 단량체의 분획과 관련이 있었다.
표 59
Figure pct00068
실시예 59: 우스테키누맙 FITC의 합성
항체 약물 컨쥬게이트(ADC)를 나타내는 모델 화합물을 다음과 같이 합성하였다. 우스테키누맙을 Bioceros(Utrecht, The Netherlands)에서 pH 5.5의 수성 40 mM 소듐 아세테이트, 50 mM 트리스-HCl 완충액 중 26 mg/mL의 mAb 농도로 동결 분취액으로서 구입하였다. 샘플을 pH 9.2에서 카르보네이트 완충액으로 완충액 교환한 후, 무수 디메틸 설폭사이드에 용해된 5 당량의 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC)와 함께 인큐베이션하여 우스테키누맙의 당량 당 1.6 당량의 FITC의 통합을 발생시켰다. FITC 대 우스테키누맙의 평균 몰비는 280 nm에서의 흡광도(단백질 + FITC를 나타냄) 및 495 nm에서의 흡광도(FITC를 나타냄)를 측정함으로써 결정하였다. 계산은 280 nm에서 mAb의 흡광 계수로서 1.61 L/g.cm, mAb의 MW로서 148,600, 및 495 nm에서 FITC에 대한 흡광 계수로서 68,000 L/g.cm을 사용하였다. 과량의 미반응된 FITC는 pH 6에서 20 mM 히스티딘 완충액으로 투석하여 제거하였다. 다음으로, Amicon 30 kDa MWCO 원심분리기 튜브를 사용하여 샘플을 15 mg/mL로 농축하였다.
실시예 60: 우스테키누맙-FITC의 안정성
실시예 59의 ADC 모델 화합물을 pH 6에서 20 mM 히스티딘 완충액(실시예 52에 기재된 바와 같이 제조됨)에 1 mg/mL의 mAb 농도로 희석시켰다. 샘플을 하기 표 60에 나열된 첨가된 부형제로 제조하였으며, 기계적 전단 스트레스로부터 모델 ADC 화합물을 보호하는 이들의 능력에 대해 시험하였다. 샘플을 23℃에서 72시간 동안 300 rpm의 쉐이커 테이블에 배치하여 기계적으로 스트레스를 가하였다. 용액에 스트레스를 가한 후, ADC 복합체의 입자 크기를 동적 광 산란에 의해 결정하였다. 전단 후 대조군 샘플은 143 nm의 입자 반경을 가졌으며, 이는 비-스트레스 샘플(반경 5.5 nm)에 비해 유의한 응집을 나타낸다. 부형제 함유 샘플은 비-스트레스 대조군 샘플(반경 5.5 nm)에 비해 입자 반경의 유의한 증가를 나타내지 않았으며, 이는 기계적 전단 스트레스에 대한 보호 효과를 입증한다. 결과는 하기 표 60에 제시된다.
표 60
Figure pct00069
실시예 61: 냉장 저장 동안 수성 완충액에서 카페인 용해도에 대한 공존용질의 영향
Milli-Q 타입 1 물에 0.387 g의 히스티딘을 용해시키고, 염산을 이용하여 pH 6으로 적정하고, Milli-Q 물을 이용하여 100 mL의 최종 부피로 희석시켜 25 mM 히스티딘 완충액, pH 6을 제조하였다. 이후, 완충액을 사용하여 소듐 벤조에이트, 1-메틸-2-피롤리돈, 프롤린, 페닐알라닌, 아르기닌 모노하이드로클로라이드, 벤질 알콜 및 니코틴아미드의 부형제를 사용하여 50 mM 공존용질 용액을 제조하였다. 각각의 생성된 용액의 5 mL 분취액에 약 0.1 g 카페인을 용해시켜 20 mg/mL의 카페인 농도를 달성하였다. 상이한 부피 비의 20 mg/mL 카페인과 공존용질 및 부형제 용액을 함유하나 카페인이 없는 상응하는 용액을 모든 경우에 300 μL의 전체 웰 부피를 유지하면서 96 웰 마이크로플레이트에서 삼중으로 제조하였다. 이후, 생성된 마이크로플레이트를 마이크로플레이트 테이프로 밀봉하고, 온도를 2 내지 5℃ 범위로 유지한 상태로 냉장고에 저장하였다. 저장 과정에 걸쳐, 마이크로플레이트를 웰 내의 침전물의 증거에 대해 시각적으로 관찰하였다. 각각의 조건에 대해 3개의 웰에서 가장 먼저 관찰된 침전물을 기록하였고, 결과는 하기 표 61에 요약되어 있다.
표 61
Figure pct00070
Figure pct00071
실시예 62: 항체 용액의 점도를 감소시키기 위한 부형제 시험
타입 1 초순수에 1.55 g의 히스티딘(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 용해시켜 20 mM 히스티딘-HCl pH 6.0(His HCl)의 스톡 완충액을 제조하였다. 내용물을 완전히 용해시키고, 염산 용액을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. pH 조정 후, 최종 부피는 부피 플라스크에서 최대 0.5 L가 되었다. 모든 부형제를 His HCl에 용해시키고, 10x 농도(1M) 또는 화합물의 용해도 한계로 제조하였다. 부형제 용액을 pH 측정하고, 필요한 경우 pH 6.0으로 조정하였다.
본 실시예에서, 0.1M 이하의 부형제 농도를 갖는 단백질 용액을 점도에 대해 측정하였다. Bioceros(The Netherlands)에서 구입한 바이오시밀러 모노클로날 항체 오말리주맙을 His HCl로 완충액 교환하고, 30 kDa 분자량 컷오프 한계를 갖는 미리 헹궈진 Amicon-15 원심분리 장치(EMD Millipore, Billerica, MA)를 사용하여 대략 200 mg/mL로 농축시켰다. 폴리에틸렌 글리콜 표면 개질 금 나노입자(nanoComposix, San Diego, CA)의 분산액을 완전히 혼합하고, His HCl로 5배 희석시켰다. 별도의 PCR 튜브에서, 2.1 μL의 금-나노입자, 5.3 μL의 10x 부형제 용액 및 47.6 μL의 농축 오말리주맙을 조합하고, 완전히 혼합하였다. 각각의 용액을 384-웰 플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)에 25 μL의 부피로 두 번 옮기고, 1분 동안 400 x g에서 원심분리(Sorvall Legend RT)하였다. 샘플의 증발을 방지하기 위해 테이프 밀봉을 사용하였다. 이후, 플레이트를 DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technology Corp., Goleta, CA)로 옮겨 25℃에서 금 나노입자의 겉보기 입자 크기를 측정하였다. 측정된 겉보기 반경 대 공지된 반경 입자 크기의 비율을 계산하여 스톡스-아인슈타인 방정식에 따라 단백질 제형의 점도를 결정하였다.
본 실시예에서, 희석 단백질 용액의 확산 상호작용 파라미터(kD)는 0.1M 이하의 부형제의 존재하에서 DLS에 의해 측정되었다. 이전에 제조된 부형제 스톡 용액에서, 0.2M의 부형제 용액을 별도로 제조하였다. kD는 0.1M 부형제의 존재하에서 10 mg/mL 내지 0.6 mg/mL 범위의 5개의 상이한 단백질 농도를 사용하여 측정하였다. 15 μL의 단백질 용액을 384-웰 플레이트(Aurora Microplates, Whitefish, MT)로 15 μL의 0.2M 부형제 용액(1:1 혼합물)과 조합하였다. 샘플을 로딩한 후, 웰 플레이트를 플레이트 쉐이커에서 진탕하여 5분 동안 내용물을 혼합하였다. 혼합시, 웰 플레이트를 1분 동안 Sorvall Legend RT에서 400 x g로 원심분리하여 임의의 공기 주머니를 제거하였다. 이후, 웰 플레이트를 DynaPro II DLS 플레이트 판독기(Wyatt Technologies Corp., Goleta, CA)에 로딩하고, 각각의 샘플의 확산 계수를 25℃에서 측정하였다. 각각의 부형제에 대해, 측정된 확산 계수를 단백질 농도의 함수로 작도하고, 데이터의 선형 적합 기울기를 kD로서 기록하였다. 결과는 2개의 상이한 시리즈의 시험에 대해 하기 표 62A 및 62B에 요약되어 있다.
표 62A
Figure pct00072
표 62B
Figure pct00073
동등물
본 발명의 특정 구현예가 본원에 개시되었으나, 상기 명세서는 예시적이며, 제한적이지 않다. 본 발명은 특히 이의 바람직한 구현예를 참조로 하여 제시되고 기재되었으나, 첨부된 청구항에 의해 포함되는 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 형태 및 세부사항에 있어서의 다양한 변화가 그 안에서 이루어질 수 있음이 당업자에 의해 이해될 것이다. 본 명세서의 검토시 본 발명의 많은 변형이 당업자에게 명백해질 것이다. 달리 나타내지 않는 한, 본 명세서 및 청구항에서 사용되는 반응 조건, 성분의 양 등을 나타내는 모든 숫자는 모든 경우에 용어 "약"에 의해 변형되는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 반대로 나타내지 않는 한, 본원에 기재된 수치 파라미터는 본 발명에 의해 획득하고자 하는 원하는 특성에 따라 달라질 수 있는 근사치이다.

Claims (32)

  1. 치료 단백질 및 안정성 개선량의 안정화 부형제를 포함하는 안정성 향상 제형으로서, 상기 안정성 향상 제형이 상기 안정성 향상 제형과 다른 면에서는 동일하나 안정화 부형제가 결여된 대조군 제형과 비교하여 개선된 안정성 파라미터를 특징으로 하는, 안정성 향상 제형.
  2. 제1항에 있어서, 치료 단백질이 항체인 안정성 향상 제형.
  3. 제2항에 있어서, 항체가 항체-약물 컨쥬게이트인 안정성 향상 제형.
  4. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 힌더드 아민(hindered amine) 화합물인 안정성 향상 제형.
  5. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 음이온성 방향족 화합물인 안정성 향상 제형.
  6. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 기능화된 아미노산 화합물인 안정성 향상 제형.
  7. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 올리고펩티드인 안정성 향상 제형.
  8. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 단쇄 유기산인 안정성 향상 제형.
  9. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 저분자량 다중산(polyacid)인 안정성 향상 제형.
  10. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 디온 화합물 또는 설폰 화합물인 안정성 향상 제형.
  11. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 쯔비터이온성 화합물인 안정성 향상 제형.
  12. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 수소 결합 요소를 갖는 군집제(crowding agent)인 안정성 향상 제형.
  13. 제1항에 있어서, 안정화 부형제가 약 1 mM 내지 약 500 mM의 양으로 첨가되는 안정성 향상 제형.
  14. 제13항에 있어서, 안정화 부형제가 약 5 mM 내지 약 250 mM의 양으로 첨가되는 안정성 향상 제형.
  15. 제14항에 있어서, 안정화 부형제가 약 10 mM 내지 약 100 mM의 양으로 첨가되는 안정성 향상 제형.
  16. 제15항에 있어서, 안정화 부형제가 약 5 mg/mL 내지 약 50 mg/mL의 양으로 첨가되는 안정성 향상 제형.
  17. 제1항에 있어서, 개선된 안정성 파라미터가 열 저장 안정성인 안정성 향상 제형.
  18. 제17항에 있어서, 열 저장 안정성이 약 10℃ 내지 30℃의 온도에서 개선되는 안정성 향상 제형.
  19. 제1항에 있어서, 개선된 안정성 파라미터가 개선된 동결/해동 안정성인 안정성 향상 제형.
  20. 제1항에 있어서, 개선된 안정성 파라미터가 개선된 전단 안정성인 안정성 향상 제형.
  21. 제1항에 있어서, 제형이 대조군 제형과 비교하여 감소된 입자 수를 갖는 안정성 향상 제형.
  22. 제1항에 있어서, 제형이 대조군 제형과 비교하여 개선된 생물학적 활성을 갖는 안정성 향상 제형.
  23. 안정성 개선량의 안정화 부형제를 치료 제형에 첨가하고, 이에 의해 치료 제형의 안정성을 개선시키는 것을 포함하는 치료 제형의 안정성을 개선시키는 방법으로서, 상기 치료 제형의 안정성이 상기 치료 제형과 다른 면에서는 동일하나 안정화 부형제가 결여된 대조군 제형의 안정성과 비교하여 측정되는, 방법.
  24. 제23항에 있어서, 안정화 부형제가 힌더드 아민, 음이온성 방향족 화합물, 기능화된 아미노산, 올리고펩티드, 단쇄 유기산, 저분자량 다중산, 디온, 설폰, 쯔비터이온성 화합물 및 수소 결합 요소를 갖는 군집제로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  25. 제23항에 있어서, 대조군 제형의 안정성과 비교하여 치료 제형의 안정성을 측정하는 단계가 안정성-관련 파라미터를 측정하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 안정성-관련 파라미터가 열 저장 안정성, 동결/해동 안정성 및 전단 안정성으로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  27. 제23항에 있어서, 치료 제형이 치료 단백질을 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 치료 단백질이 항체인 방법.
  29. 제28항에 있어서, 항체가 항체-약물 컨쥬게이트인 방법.
  30. 안정성 개선량의 안정화 부형제를 단백질 관련 공정을 위한 담체 용액에 첨가하고, 이에 의해 파라미터를 개선시키는 것을 포함하는 단백질 관련 공정의 파라미터를 개선시키는 방법으로서, 상기 담체 용액이 관심 단백질을 함유하는, 방법.
  31. 제30항에 있어서, 파라미터가 단백질 생산 비용, 단백질 생산량, 단백질 생산 속도 및 단백질 생산 효율로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  32. 제31항에 있어서, 관심 단백질이 치료 단백질인 방법.
KR1020207028505A 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물 KR102493469B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020237002910A KR20230018549A (ko) 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862639950P 2018-03-07 2018-03-07
US62/639,950 2018-03-07
US201862679647P 2018-06-01 2018-06-01
US62/679,647 2018-06-01
PCT/US2019/020751 WO2019173338A1 (en) 2018-03-07 2019-03-05 Excipient compounds for protein formulations

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237002910A Division KR20230018549A (ko) 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20200128717A true KR20200128717A (ko) 2020-11-16
KR102493469B1 KR102493469B1 (ko) 2023-02-07

Family

ID=67847477

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237002910A KR20230018549A (ko) 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물
KR1020207028505A KR102493469B1 (ko) 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237002910A KR20230018549A (ko) 2018-03-07 2019-03-05 단백질 제형을 위한 부형제 화합물

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP3761962A4 (ko)
JP (2) JP7256816B2 (ko)
KR (2) KR20230018549A (ko)
CN (1) CN112040931A (ko)
CA (1) CA3091931A1 (ko)
WO (1) WO2019173338A1 (ko)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2015196091A1 (en) 2014-06-20 2015-12-23 Reform Biologics, Llc Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations
US10478498B2 (en) 2014-06-20 2019-11-19 Reform Biologics, Llc Excipient compounds for biopolymer formulations
CN111732951B (zh) * 2020-07-06 2022-05-20 山西大学 一种氮掺杂绿色荧光碳量子点及其制备方法和应用
CN116359513A (zh) * 2023-03-27 2023-06-30 浙江夸克生物科技有限公司 一种用于检测尿转铁蛋白的试剂盒

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170232103A1 (en) * 2014-06-20 2017-08-17 Reform Biologics, Llc Excipient compounds for biopolymer formulations
US20180015168A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 Reform Biologics, Llc Stabilizing excipients for therapeutic protein formulations

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2683364B1 (en) * 2011-03-10 2017-01-18 Xeris Pharmaceuticals, Inc. Stable formulations for parenteral injection of peptide drugs
WO2015038811A2 (en) * 2013-09-11 2015-03-19 Arsia Therapeutics, Inc. Liquid protein formulations containing ionic liquids
WO2015196091A1 (en) * 2014-06-20 2015-12-23 Reform Biologics, Llc Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations
US11357857B2 (en) * 2014-06-20 2022-06-14 Comera Life Sciences, Inc. Excipient compounds for protein processing
US9649364B2 (en) * 2015-09-25 2017-05-16 Xeris Pharmaceuticals, Inc. Methods for producing stable therapeutic formulations in aprotic polar solvents
KR102572453B1 (ko) * 2017-02-16 2023-08-29 코메라 라이프 사이언시스, 인코포레이티드 단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20170232103A1 (en) * 2014-06-20 2017-08-17 Reform Biologics, Llc Excipient compounds for biopolymer formulations
US20180015168A1 (en) * 2016-07-13 2018-01-18 Reform Biologics, Llc Stabilizing excipients for therapeutic protein formulations

Also Published As

Publication number Publication date
KR20230018549A (ko) 2023-02-07
JP2021515766A (ja) 2021-06-24
KR102493469B1 (ko) 2023-02-07
JP7256816B2 (ja) 2023-04-12
EP3761962A1 (en) 2021-01-13
CN112040931A (zh) 2020-12-04
CA3091931A1 (en) 2019-09-12
WO2019173338A1 (en) 2019-09-12
JP2023082134A (ja) 2023-06-13
EP3761962A4 (en) 2021-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102493469B1 (ko) 단백질 제형을 위한 부형제 화합물
US11806399B2 (en) Excipient compounds for biopolymer formulations
EP3160484B1 (en) Viscosity-reducing excipient compounds for protein formulations
WO2021072050A1 (en) Excipient compounds for protein formulations
US20230270864A1 (en) Excipient compounds for protein formulations
CA3129181C (en) Excipient compounds for biopolymer formulations
KR102572453B1 (ko) 단백질 가공 처리를 위한 부형제 화합물
US20230065872A1 (en) Excipient compounds for protein processing
WO2022056220A2 (en) Excipient compounds for protein formulations
KR20210096633A (ko) 단백질 처리를 위한 부형제 화합물
CA3159377A1 (en) Excipient compounds for biopolymer formulations
US20230027396A1 (en) Excipient compounds for biopolymer formulations
US20220062423A1 (en) Excipient compounds for protein formulations
US20220401559A1 (en) Excipient compounds for protein formulations
WO2023091370A1 (en) Excipient compounds for biopolymer formulations

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
A107 Divisional application of patent