KR20200120898A - 폴리펩타이드를 가수분해하기 위한 극한 미생물로부터 수득되는 tet 엑소프로테아제 조합물의 용도 - Google Patents

폴리펩타이드를 가수분해하기 위한 극한 미생물로부터 수득되는 tet 엑소프로테아제 조합물의 용도 Download PDF

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브루노 프란제띠
에릭 지라르
알렉산드르 아폴레르
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쌩뜨레 나티오날 데 라 르세르쉬 생띠끄 (씨. 엔. 알. 에스)
유니베르시떼 그르노블 알프스
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Abstract

본 발명은 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 하나 이상의 제2 아미노펩티다제를 포함하고 제1 아미노펩티다제가 조성물의 총 중량의 최대 40 중량%인, 조성물에 관한 것이다. 바람직하게는, 아미노펩티다제는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 (TET 아미노펩티다제)이다. 본 발명의 목적은 글루텐, 유청, 글리아딘 등과 같은 반-영양적인 (antinutritional) 단백질 및 펩타이드를 분해하는 것이다.

Description

폴리펩타이드를 가수분해하기 위한 극한 미생물로부터 수득되는 TET 엑소프로테아제 조합물의 용도
본 발명은 아미노펩티다제를 포함하는 조성물, 보다 상세하게는 "TET 아미노펩티다제"로도 지칭되는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 (tetrahedral aminopeptidase)들을 포함하는 조성물에 관한 것이다.
식품 산업에서, "컴플렉스"라고도 하는 "긴" 펩타이드는 원래 섭취할 음식에 존재한다. 이들 긴 펩타이드는 일반적으로 충분하지 않은 분해 프로세스의 결과로서, 때때로 독성이 있어, 이들 펩타이드를 함유한 식품에 대해 불내성 (intolerance) 또는 알레르기를 유발하며, 또한 이의 영양학적인 효과를 감소시킨다. 이러한 펩타이드는 또한 빵, 치즈, 절인 고기 등과 같은 다수 식품들에서 맛과 질감을 결정한다.
글루텐 불내성은 아마도 가장 흔한 음식 불내성 중 한가지이다. 이는 글루텐의 구성에 도입된 "글리아딘"으로 지칭되는 컴플렉스 단백질 패밀리에 의해 유발되는데, 이 단백질은 때로는 글루텐에 민감하거나 또는 불내성인 사람에게서 알레르기 반응을 유발하는 "면역우세 (immunodominant)"로 칭해지는 펩타이드를 함유하고 있다.
이러한 이유로, 식품 산업에서는 글루텐을 분해하여 면역원성을 낮출 목적으로 다수의 프로세스들에 단백질분해 효소를 사용한다. 효소는 기본적으로 단백질 및 긴 펩타이드를 단편으로 절단할 수 있는 엔도프로테아제이다. 이들 엔도프로테아제는, 특히 페이스트리, 치즈, 비스켓 제조에 사용되며, 또한 과일 주스 또는 맥주 제조에도, 심지어 특수 식품을 위해 고안된 단백질 가수분해물을 제조하는데도 사용된다. 이들 프로테아제는 일반적으로 박테리아 또는 진균으로부터 유래되며, 이의 정확한 특성은 일반적으로 기밀로 유지된다.
그러나, 현재 사용되는 프로테아제의 단점은, 식품 펩타이드의 독성 부분을 전부 없애기에 충분히 짧은 펩타이드를 생산하지 못하거나 또는 펩타이드를 효과적으로 소화시킬 수 없다는 것이다. 글루텐에 민감하거나 또는 불내성인 사람의 경우, 예를 들어, 글루텐의 불완전한 소화는 소화계에서 "면역우세" 펩타이드의 존재를 유발하며, 궁극적으로 셀리악 질환의 증상을 야기한다.
컴플렉스 식품 펩타이드를 분해하기 위한 중온성 아미노펩티다제 (mesophilic aminopeptidase)가 이미 개발되어 있지만, 이의 약한 촉매 활성과 이것이 활성인 생리화학적 조건으로 인해 식품의 맛을 변형시키는데에만 제한적으로 사용된다.
Asuncion Dura et al. (The structural and biochemical characterizations of a novel TET peptidase complex from Pyrococcus horikoshii reveal an integrated peptide degradation system in hyperthermophilic Archaea, Molecular Microbiology (2009) 72 (1), 26-40)는 아미노펩티다제 3종을 발현하는 피로코커스 호리코시 (Pyrococcus horikoshii)에 관한 것으로, 펩티다제 PhTET3의 특징을 규명하고, 이를 PhTET1 및 PhTET2와 비교하였다. 이는 극한 미생물 (extremophilic microorganism)로부터 유래된 아미노펩티다제를 포함하는 조성물이 아니며, 즉 극한 미생물로부터 분리된 아미노펩티다제를 포함하는 조성물이 아니며, 따라서 오리지날 미생물 자체부터 매우 다르다.
본 발명은 이러한 단점들을 모두 해결하는 것을 목적으로 한다. 이에, 본 발명은, 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 하나 이상의 제2 아미노펩티다제를 포함하며; 제1 아미노펩티다제와 제2 아미노펩티다제가 서로 상이하고; 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 극한 미생물로부터 유래된 것이고; 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 테트라헤드럴 아미노펩티다제 또는 TET 아미노펩티다제 패밀리에 속하는 아미노펩티다제이고; 제1 아미노펩티다제가 조성물의 총 중량에 대해 최대 40 중량%이고; 상기 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3와 다른 것이라면 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 50 중량%인, 조성물에 관한 것이다. 본 발명자들은, 2 이상의 TET 아미노펩티다제를 포함하는 조성물을 사용하여 특히 혼합물에서 펩타이드를 분해할 수 있으며, 각각의 TET 단백질의 개별 활성들의 상가 효과를 초과하는 상승적인 작용이 발휘된다는 것을, 놀랍게도 관찰하게 되었다. 실제, 본 발명자들은, 조성물에 존재하는 다양한 TET 아미노펩티다제 활성들의 조합에 해당하는 조성물의 전체 활성 (overall activity)을 관찰하는 대신, 조성물의 여러가지 TET 아미노펩티다제들 간의 상호작용/간섭에 의해 또는 반응 매질의 생리화학적 조건에 의해 조절될 수 있는 다른 전체 활성을 발견하게 되었다.
"아미노펩티다제"는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 말단부에서 아미노산 절단 활성을 나타내는 효소를 의미한다. 본 발명에 따른 "펩타이드"는 아미노산을 2개 이상 포함하는 아미노산 체인을 의미한다. 펩타이드는 단백질의 분해로부터 또는 화학 합성으로부터 수득할 수 있다. 본 발명에 따른 "폴리펩타이드"는 펩타이드의 아미노산 체인보다는 더 큰, 화학적 합성이 아닌 단백질 분해로부터 수득되는 아미노산 체인을 의미한다. 펩타이드 및 폴리펩타이드는 생물학적 기능을 가질 수 있다. 그러나, 펩타이드 및 폴리펩타이드가 세포 프로세스의 일환으로서 단독으로 이러한 기능을 발휘할 순 없다. 본 발명에 따른 "단백질"은 유기체에서 천연적으로 발견되는 생물학적 기능을 가진 아미노산 체인을 함유한 분자를 의미한다. 생물학적 기능은 세포의 자연적인 프로세스의 일부이다. 따라서, 본 조성물은 서로 다른 2종의 아미노펩티다제를 포함하며, 이들 각각은 서로 다른 아미노산 서열을 가진다. 다시 말해, 이들 아미노펩티다제들은 하나의 아미노산 차이가 있는 아미노산 서열을 가진다. 즉, 이들 2종의 아미노펩티다제들의 서열은 서로 하나 이상의 아미노산 차이를 가진다.
본 발명의 조성물에 사용되는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 또는 TET 아미노펩티다제는 극한 미생물로부터 분리된 것이며, 보다 구체적으로는 해양 극한 미생물로부터 분리된 것이다. 이들 테트라헤드럴 아미노펩티다제 또는 TET 아미노펩티다제는 MEROPS 분류에 따라 메탈로아미노펩티다제 패밀리 M42 및 M18에 속한다. 다시 말해, TET 아미노펩티다제는 전형적인 사면체 구조를 형성하는 구조로 자기-조립하는 특이성을 가진 12개의 서브유닛들을 포함하는 효소 복합체 형태이다. 이러한 형태가 높은 효소 안정성에 기여한다. "메탈로아미노펩티다제"는 이들 아미노펩티다제들 모두 공통적으로 활성 부위 안에 하나 이상의 금속 이온을 가지는 것을 의미한다.
"극한 미생물"은 현미경으로만 관찰할 수 있는 육안으로는 볼 수 없는 살아있는 유기체를 의미한다. 이들 미생물은 박테리아, 미세 진균, 고세균, 원생생물, 미세 녹조류, 플랑크톤 동물, 플라나리아, 아메바 및 바이러스 등의 다양한 생명 형태를 취할 수 있다. "극한"은 정상적인 생활 조건이 일반적으로 다른 대부분의 유기체에게는 치명적인 조건인 유기체를 설명한다. 이러한 생활 조건은 고온 또는 저온, 극도의 압력, 높은 염도, 유기체가 생활하는 환경의 산도 또는 염기성도, 방사능의 존재 또는 산소 또는 빛의 존재일 수 있다.
이들 TET 아미노펩티다제는, 특정 타입의 아미노산에 매우 특이적일 수 있다는 점에서 다른 아미노펩티다제와 차이가 있다. 즉, 펩타이드 또는 소위 컴플렉스 단백질을 충분히 짧은 펩타이드로 분해하기 위해, 본 발명에 따른 조성물을 이용하여, 여러가지 TET 아미노펩티다제들을 조합할 수 있다. 따라서, 모든 독성 부분을 분해하여, 효율적으로 소화되게 할 수도 있다. 이러한 최종 결과는 적용되는 조성물에 특이적인 아미노펩티다제 활성에 의해 달성된다. 이러한 아미노펩티다제 활성은 물질의 폴리펩타이드 함유물 (polypeptide content), 및 변형하거나 또는 심지어 완전히 분해하길 원하는 부분과 관련하여 확립된다. 이를 위해, 본 발명자들은, 본 발명의 조성물에서, 특정 아미노산에 대한 이의 특이성 및 활성 측면에서 상호 간의 상호작용/간섭에 따라, 조합되는 TET 아미노펩티다제들을 선정하였다. 또한, 본 발명자들은, 특정 TET 아미노펩티다제가 특정 조건에서 당해 기술 분야에 공지된 다른 TET 아미노펩티다제에 비해 특정 아미노산 타입이 풍부한 펩타이드를 분해하는데 우수한 활성을 나타낸다는 것도, 알게 되었다. 다시 말해, 다양한 TET 아미노펩티다제 조합들은 조성물로 조합된 TET 아미노펩티다제들의 공지된 활성들을 단순히 더한 것이 아니다.
본 발명에 따른 조성물에서, 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 40 중량%일 수 있다. "조성물의 총 중량에 대해 최대 40%"는, 제1 아미노펩티다제가 조성물의 총 중량에 대해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39% 또는 40%일 수 있는 것을 의미한다. 조성물이 TET 아미노펩티다제 2종으로만 구성되는 경우, 제2 아미노펩티다제는 따라서 조성물의 총 중량에 대해 적어도 60 중량%일 수 있으며, 이는 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 의미한다. 그래서, 제1 TET 아미노펩티다제와 제2 TET 아미노펩티다제는, 조성물의 총 중량에 대한 제1 아미노펩티다제의 중량으로서, 조성물의 총 중량에 대해 1:99에서 조성물의 총 중량에 대해 최대 40:60 범위의 중량비일 수 있다.
그러나, 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3가 아닌 경우에는, 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 50 중량%일 수 있다. 본 발명에서 "조성물의 총 중량에 대해 최대 50%"는, 제1 아미노펩티다제가 조성물의 총 중량에 대해 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22%, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49% 또는 50%일 수 있다는 것을 의미한다.
"제1 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3와 상이하다"는 것은, 제1 및 제2 아미노펩티다제가 서열 PhTET2 (서열번호 2) 또는 서열 PhTET3 (서열번호 3)와의 동일성이 65% 미만인 서열을 가진 아미노산 분자들을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성되는 것을, 의미한다. "2종의 서열들 간의 동일성 %"는, 이들 2종의 아미노산 서열을 당해 기술 분야의 당업자들에게 공지된 임의 수단에 의해 이를 비교하기 위해 정렬하였을 때, 이들 2종의 서열들에 아미노산 체인이 동일한 서열 영역이 존재하는 것을, 의미한다. 이들 영역들 모두 2종의 서열들 간에 동일성 %를 확립한다. "PhTET2 서열 (서열번호 2) 또는 PhTET3 서열 (서열번호 3)과의 동일성이 65% 미만"이라는 것은, PhTET2 서열 (서열번호 2) 또는 PhTET3 서열 (서열번호 3)과의 동일성이 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22 %, 23%, 24%, 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63% 또는 64%이라는 것을 의미한다.
이는, 조성물이 제1 및 제2 TET 아미노펩티다제로만 구성되는 구현예에서, 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3가 아닌 경우, 제2 TET 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 50 중량% 이상, 즉 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%인 것을 의미한다.
유익하게는, 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 하나 이상의 제2 아미노펩티다제는 PhTET1, PhTET2, PhTET3, PhTET4 및 MjTET로 이루어진 군으로부터 유래되는 아미노펩티다제로부터 선택된다.
PhTET1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되고, PhTET2는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되고, PhTET3는 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되고, PhTET4는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되고, MjTET는 서열번호 5의 아미노산 서열로 표시된다.
다시 말해, 본 발명에 따른 조성물의 제1 TET 아미노펩티다제와 제2 TET 아미노펩티다제의 쌍들은 PhTET1-PhTET2, PhTET1-PhTET3, PhTET1-PhTET4, PhTET1-MjTET, PhTET2-PhTET3, PhTET2-PhTET4, PhTET2-MjTET, PhTET3-PhTET4, PhTET3-MjTET, PhTET4-MjTET로 이루어진 쌍 리스트로부터 선택될 수 있다.
유익하게는, 아미노펩티다제는 서열번호 1 내지 서열번호 5의 각각의 서열로 된 아미노산 분자, 또는 아미노펩티다제 활성을 나타내는 단백질을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되며, 단백질은 서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열들 중 어느 하나와의 동일성 %가 65% 이상인 서열의 아미노산 분자들을 포함하거나, 이로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성된다.
본 발명에서 "서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열들 중 어느 하나와의 동일성 %"는, 2가지 서열을 비교하기 위해, 서열번호 1 (PhTET1의 서열), 서열번호 2 (PhTET2의 서열), 서열번호 3 (PhTET3의 서열), 서열번호 4 (PhTET4의 서열) 또는 서열번호 5 (MjTET의 서열) 서열들 중 어느 하나와 정렬하였을 때, 아미노산 서열이 서로 동일한 서열 영역을 발견할 수 있게 하는 아미노산 서열을 단백질이 가지는 것을 의미한다. "서열번호 1 내지 서열번호 5 서열들 중 어느 하나와 65% 이상의 동일성"은, 동일성 퍼센트가 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%일 수 있다는 것을 의미한다. 다시 말해, 고려되는 단백질은, 서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열들 중 어느 하나와의 동일성 퍼센트가 전술한 것들 중 하나인 아미노산 서열을 가지며, 아미노펩티다제 활성, 즉 폴리머의 N-말단부에서 아미노산 절단 활성을 가진, 것이다.
구조 실험을 통해, 상동성 수준이 낮음에도 불구하고, 효소들을 구체적인 기준을 근거로 TET 패밀리로 할당할 수 있다는 것이, 명확하게 드러났다. 그러나, 다양한 효소 복합체들은 구조 상동성은 높지만, TET들 간의 서열 동일성 %이 매우 높은 것은 아니다. 예를 들어, PhTET1은 PhTET2 및 PhTET3와 약 37% 동일성 (상동성 55%)을 가지며, PhTET2와 PhTET3 간의 동일성은 48%이다 (상동성 70%).
본원에 원용에 의해 포함되는 Dr. Alexandre APPOLAIRE "Study of the large proteolytic assemblies of the TET family: oligomerization process and associated functional regulation."의 논문을 참조한 경우에서와 같이, 본 발명자들은 아미노펩티다제 활성을 나타내는 단백질을 특정화하기 위해 5가지 기준을 고수하였다:
1) 서열에 이합체화 도메인 (dimerization domain) 삽입: 아미노펩티다제를 코딩하는 유전자의 중간에 삽입된 특정 도메인이 TET 아미노펩티다제의 강력한 제1 구조 마커이다 (Schoehn, G., Vellieux, F.M.D., Asuncion Durα, M., Receveur-Brechot, V., Fabry, C.M.S., Ruigrok, R.W.H., Ebel, C., Roussel, A., and Franzetti, B., (2006) An archaeal peptidase assembles into two different quaternary structures: A tetrahedron and a giant octahedron The Journal of biological chemistry. 281: 36327-36337).
2) 이합체화 인터페이스 (dimerization interface): "IDIGAXXXE" 패턴의 존재가 TET 이량체 조립에 결정적인 것으로 보인다.
3) 12합체화 인터페이스 (dodecamerization interface): 이 부위는 상호작용이 충분히 정의되지 않은 영역으로, 극성, 소수성 상호작용, 수소 결합 및 염 브릿지 (salt bridge)를 포함한다. 긴 측쇄가 탑재된 잔기가 존재하는 적절한 입체 구조에서 모노머들 간의 인터페이스 위치에 α5 나선의 존재가 결정적인 것으로 보인다. 그러나, 게놈에서 동정할 수 있는 표준 서열을 파악하긴 어려워 보인다.
4) 촉매 도메인의 폴딩: 고도로 보존된 수개의 글리신의 존재가 TET의 촉매 도메인의 폴딩에 중요한 것으로 보인다.
5) 활성 부위: 이 부위의 보존이 M42 패밀리의 펩티다제 및 TET의 일부 특징이며, 다음과 같은 잔기들로 정의되며: PhTET3에서 H65XD67, D181, E213E214, E/D236 및 H319, 2가지 금속 이온의 배위를 수반한다. 이들 이온은, 일반적으로, Co2+ 또는 Zn2 + 이온이며, 일부 구조들을 다른 이온들로 특정된 바 있으며; 예를 들어, Q11Z05_CYTH3의 구조는 활성 부위에 Fe2+ 이온이 탑재된 것으로 특정되어 있다.
본 발명에서, 테트라헤드럴 TET 펩티다제로서 펩티다제를 동정하기 위해서는 이러한 5가지 기준을 충족하여야 한다.
유익하게는, 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 10 중량%이며, 특히 조성물의 총 중량에 대해 최대 5 중량%이다.
따라서, 제1 아미노펩티다제를 소량 첨가하여 조성물의 아미노펩티다제들의 작용을 매우 정확하게 조절할 수 있다. 따라서, 조성물에 TET 아미노펩티다제의 소량 첨가는, 기질의 폴리펩타이드 함유물을 본 발명의 조성물과 접촉시킨 후 수득되는 산물의 특성에 현저한 영향을 미치는 것을 가능하게 만든다.
유익하게는, 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 50 중량%이되, 제1 및 제2 아미노펩티다제는 PhTET2 및 PhTET3와는 다른 것이다.
다시 말해, 본 발명에 따른 조성물의 대안으로서, 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제로만 구성되는 경우, 이들 2가지 TET 아미노펩티다제들은 동일한 몰 비율일 수 있으며, 단 제1 및 제2 아미노펩티다제는 PhTET2 및 PhTET3와 다른 것이다.
유익하게는, 본 발명의 조성물은 적어도 제3 아미노펩티다제를 포함하며, 제3 아미노펩티다제는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 또는 TET 아미노펩티다제 패밀리로부터 유래되는 아미노펩티다제이다. 조성물이 TET 아미노펩티다제 3종을 포함하는 경우, 이들 트리플렛은 PhTET1-PhTET2-PhTET3, PhTET1-PhTET2-PhTET4, PhTET1-PhTET2-MjTET, PhTET1-PhTET3-PhTET4, PhTET1-PhTET3-MjTET, PhTET1-PhTET4-MjTET, PhTET2-PhTET3-PhTET4, PhTET2-PhTET3-MjTET, PhTET2-PhTET4-MjTET, PhTET3-PhTET4-MjTET로 이루어진 트리플렛 리스트로부터 선택될 수 있다. 또한, 조성물이 TET 아미노펩티다제 4종을 포함하는 경우, 콰드로플렛은 PhTET1-PhTET2-PhTET3-PhTET4, PhTET1-PhTET2-PhTET3-MjTET, PhTET2-PhTET3-PhTET-MjTE, PhTET1-PhTET3-PhTET4-MjTET로 이루어진 콰드로플렛 리스트로부터 선택될 수 있다. 또한, 조성물이 아미노펩티다제 5종을 포함하는 경우, 퀸터플렛은 PhTET1-PhTET2-PhTET3-PhTET4-MjTET일 수 있다.
따라서, 제1 TET 아미노펩티다제 및 제2 TET 아미노펩티다제와는 다른 제3 TET 아미노펩티다제의 작용을 추가할 수 있으며, 이로써 조성물의 작용 영역의 개선, 즉 타겟화된 식품 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질을 심지어 양호하게 변형시킬 수 있다. 결론적으로, 제1 TET 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 40 중량%일 수 있으며, 나머지 조성물의 총 중량에 대해 적어도 60 중량%는 제2 TET 아미노펩티다제와 제3 TET 아미노펩티다제에 배분될 수 있다.
그러나, 제1 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3와 다른 것일 경우, 조성물은, 제1 TET 아미노펩티다제가 조성물의 총 중량에 대해 최대 50 중량%이고, 나머지 조성물의 총 중량에 대해 적어도 50 중량%는 제2 TET 아미노펩티다제와 제3 TET 아미노펩티다제에 배분되는, 비율을 가질 수 있다.
따라서, 예를 들어, 제1 TET 아미노펩티다제, 제2 TET 아미노펩티다제 및 제3 TET 아미노펩티다제로 구성되는 조성물에 따른 구현예, 및 제1 및 제2 및 제3 아미노펩티다제로 된 조성물의 총 중량에 대한 중량 비율이 50/25/25, 40/30/30, 40/40/20, 10/10/80 또는 심지어 10/20/70인 구현예가 제시된다.
유익하게는, 제1 아미노펩티다제, 제2 아미노펩티다제 및 제3 아미노펩티다제는 동일한 몰 비로, 또는 실질적으로 동일한 몰 비로 존재한다.
"동일한 몰 비 또는 실질적으로 동일한 몰 비"는, 제1 아미노펩티다제, 제2 아미노펩티다제 및 제3 아미노펩티다제의 양이 동일하거나 또는 실질적으로 동일, 즉 서로 매우 비슷하다는 것을 의미한다. 이러한 정밀성은 조성물의 아미노펩티다제 활성들을 정확하게 규정할 수 있게 해주며, 따라서 분해할 펩타이드에 맞게 맞추는 것이 가능해진다.
유익하게는, 조성물은 또한 엔도펩티다제, 특히 서몰리신, 특히 서열번호 6의 서열의 서몰리신을 포함한다. 서몰리신은 메탈로프로테이나제 패밀리에 속하는 엔도펩티다제이다. 서몰리신은 다양한 바실러스 종들에 의해 생산되는 메탈로프로테이나제 패밀리에 속하는 가장 안정적인 구성원이다. 열 처리 및 변성 중에 형태적 변화를 겪는 다수의 단백질과 다르게, 서몰리신은 적어도 70℃까지 주요한 형태적 변화를 겪지 않는다. 따라서, 서몰리신은 TET 단백질이 가장 활성이 높은 온도에서 안정적이며 활성인 상태로 유지된다.
"엔도펩티다제"는 펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질의 비-말단 아미노산들 간의 결합을 파괴할 수 있는 효소를 의미한다.
이에, 본 조성물은 비-말단 아미노산의 절단 가능성으로 인해 보다 넓은 아미노펩티다제 활성을 나타낸다.
또한, 본 발명은 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는 기질의 폴리펩타이드 함유물 중 일부 또는 전체를 변형하기 위한, 본 발명에 따른 조성물의 용도에 관한 것이다.
"기질의 폴리펩타이드 함유물 중 일부 또는 전체의 변형"은 기질의 폴리펩타이드 함유물 일부에 대한 하나 이상의 변형을 의미한다. 다시 말해, 기질의 폴리펩타이드 함유물은, 본 발명에 따른 조성물과 접촉 후 수득되는 산물의 폴리펩타이드 함유물과 상이하다. 예를 들어, 3종의 단백질을 포함하는 폴리펩타이드 함유물의 경우에, 함유물 전체 변형은 3종의 단백질의 완전한 분해에 해당한다. 역으로, 이들 함유물의 일부에 대한 변형은 이들 3종의 단백질들 중 하나의 단백질의 완전한 분해에 해당하거나, 또는 3종의 단백질들 중 하나 또는 둘, 또는 심지어 기질의 단백질 3종에 대한 부분 변형에 해당할 수 있다. 당해 기술 분야의 당업자라면 단백질 함유물의 전체 또는 부분 변형을 확인할 수 있다.
본 발명에서, "기질의 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부에 대한 변형"과 "기질의 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부의 분해"라는 표현들에는 차이가 없다. 이들 표현은 본 발명의 내용과 관련하여 문제없이 서로 치환될 수 있다. 실제, 폴리펩타이드 함유물의 변형은 이 함유물의 하나 이상의 구성성분 (펩타이드, 폴리펩타이드 또는 단백질)이 분해된 결과이다.
이에, 본 발명에 따른 조성물을 사용해, 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는 기질의 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부를 변형시킬 수 있다. 이들 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질은 조성물 전체 또는 일부를 형성하는 TET 아미노펩티다제의 작용을 겪게 되며, 따라서 짧은 펩타이드로 변형되어, 조성물을 기질의 폴리펩타이드 함유물과 접촉시킨 후 수득되는 산물은 펩타이드 함유물의 우수한 소화성 및 이의 독성 부분의 제거가 달성된다.
유익하게는, 기질은 적어도 글루텐 및/또는 유청의 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함한다.
이에, 본 발명에 따른 조성물을 이용함으로써, 최종 소비자에게 식품 불내성 및 알레르기의 원인이 되는 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는, 2종의 단백질 어셈블리, 즉 글루텐 또는 유청의 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 변형시키는 것이 가능하다. 앞서 기술한 바와 같이, 글루텐은 2가지 단백질 패밀리, 즉 글리아딘과 글루테닌으로 주로 구성된다. 이들 단백질은 물에 불용성이며, 밀가루의 재수화 후 수득되는 반죽에 식품 산업에 사용되는 점탄성 특성을 부여하여 생산물에 어떤 형상을 구축한다. 유청은 우유의 물을 대부분 포함한다. 이는 물 94%, 4-5% 락토스, 용해성 단백질 (9% 건물량) 및 미네랄 염으로 구성된다. 유청 단백질은 필수 아미노산의 비율이 높아 실제 영양학적 가치가 높다. 가장 중요한 것은 β-락토글로불린 (β-LG), α-락트알부민 (α-LA), 보바인 면역글로불린 (IgG), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 보바인 락토페린 (LF)이다.
유익하게는, 기질은 하기 단백질들 중 하나 이상을 포함한다: 글리아딘, β-락토글로불린, α-락트알부민, 면역글로불린, 혈청 알부민 및 락토페린.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 조성물을 사용하여, 최종 소비자들에게 식품 불내성 및 알레르기의 원인이 되는 이들 단백질을 변형시킬 수 있다.
유익하게는, 조성물의 전체 또는 일부를 형성하는 아미노펩티다제들은 동시에 사용하거나, 분리하여 사용하거나 또는 경시적으로 확산 (spread over time)되는 방식으로 사용할 수 있다.
이들 아미노펩티다제들을 동시적으로, 분리하여 또는 경시적으로 확산되는 방식으로 사용할 가능성이 있으므로, 조성물이 사용되는 기질의 폴리펩타이드 함유물에 맞게 조성물의 전체 활성을 조정하는 것이 가능해진다. 실제, 경시적으로 기질 폴리펩타이드 함유물을 변형시키는 작용을 조정하기 위해, 조성물의 여러가지 아미노펩티다제 활성들, 특히 아미노펩티다제의 기능, 이들의 비율 및 활성 측면에서 서로 간의 상호작용에 의존할 수 있다. 조성물을 형성하는 아미노펩티다제들은 동시적으로 사용될 수 있다. 이와 같이, 이들은 변형될 기질이 포함된 매질에 동시적으로 첨가될 수 있다. 또한, 아미노펩티다제들은 분리하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 큰 체인의 경우, 아미노펩티다제들 중 일부는 체인의 한쪽 말단에 부가되고, 그외 일부는 체인의 다른 말단에 부가된다. 이러한 해법은 부가된 아미노펩티다제의 체인에서 보다 신속하게 균질한 분포를 달성하기 위한 목적으로 전개될 수 있다. 또한, 이러한 해법은, 체인의 한쪽 말단에 도입된 아미노펩티다제가 체인의 다른 말단에 부가된 다른 아미노펩티다제와 접촉하기에 적합해지기 전에, 매질 내에서 일부 적응 기간이 필요할 경우에, 또한 진행될 수 있다. 아미노펩티다제는 또한 시간 경과에 따라 사용될 수 있다. 따라서, 기질의 폴리펩타이드 함유물을 변형하기 위해, 일정 시간 동안 아미노펩티다제를 첨가할 수 있다. 이에, 신규 부가된 아미노펩티다제의 활성에 대한, 반응 매질에 이미 존재하는 제1 아미노펩티다제의 상호작용/간섭을 감안하여, 제1 아미노펩티다제에 의한 변형으로부터 발생되는 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부를 변형하기 위해, 하나 이상의 다른 아미노펩티다제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 유익한 측면에서, TET 단백질은 지지체, 특히 컬럼, 실리카 또는 자기 비드 상에, 또는 단백질을 고정하는데 적합한 임의의 기타 지지체 상에 고정될 수 있다.
특히, 효소는 가교된 효소 결정 형태 또는 CLEC (Cross-Linked Enzyme Crystals)로 사용될 수 있다.
이에, 본 발명은 조성물의 하나 이상의 아미노펩티다제, 바람직하게는 모든 아미노펩티다제들이 가교된 결정 (crosslinked crystal) 형태인 조성물에 관한 것이다.
따라서, 본 발명은 하나 이상의 아미노펩티다제, 바람직하게는 조성물의 아미노펩티다제들 모두가 고정된, 특히 가교된 결정 형태인 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한
- 기질을
- 본 발명에 따른 조성물과
접촉시키는 단계를 포함하며,
적어도 제1 아미노펩티다제 및 적어도 제2 아미노펩티다제가 80℃ 이상의 온도에서 활성화될 수 있으며, 선택적으로 접촉 단계 이전에 기질의 폴리펩타이드를 변성시키는 단계를 포함하는,
펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는 기질의 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부를 변형시키는 방법에 관한 것이다.
용어 "접촉 단계"는 기질의 폴리펩타이드 함유물을 변형하기 위한 목적으로, 기질의 폴리펩타이드 함유물과 조성물의 TET 아미노펩티다제가 서로 상호작용할 수 있는 단계를 의미한다.
"80℃ 이상의 온도에서 활성화될 수 있는 제1 아미노펩티다제 및 적어도 제2 아미노펩티다제"는, 기질의 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질의 아미노산을 절단하지 않는 상태에서 이들 아미노산을 절단하는 상태로 바뀔 수 있다는 것을 의미한다.
기질 폴리펩타이드는 먼저 변성 단계, 예를 들어 조성물의 아미노펩티다제에 의한 변형을 촉진하는 효과를 가진 프로판올을 이용한 변성을 겪을 수 있다. 이들 폴리펩타이드는 천연적으로 3차 구조를 가진다. 따라서, 프로판올과 같은 유기 용매는 비-공유 결합, 예를 들어, 폴리펩타이드의 내부 수소 결합의 파괴를 유발한다. 하지만, 이러한 결합이 폴리펩타이드의 3차 구조를 안정시킨다. 따라서, 이의 파괴는 폴리펩타이드의 탈안정화, 비-폴딩 또는 심지어 변성을 유발하게 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 수득할 수 있는 식품 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 글리아딘, β-락토글로불린, α-락트알부민, 면역글로불린, 혈청 알부민 및 락토페린과 같은 단백질들 중 하나 이상을 변형된 형태로 포함하며, 본 발명에 따른 조성물을 더 포함하는, 식품 화합물에 관한 것이다.
본 발명은 첨부된 도면을 참조하여 더 잘 이해될 것이나, 이는 예로서 제공되며, 어떤 방식으로 제한되는 것은 아니다.
후술한 도면들 모두 용출 시간 (초로 표현)에 따른 흡광도 (mAu로 표시)를 나타낸 크로마토그램이다.
- 도 1A, 1B 및 1C는 PhTET3 (도 1A 및 곡선 A) 및 PhTET2 (도 1B 및 곡선 C)와 15분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 2의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 곡선 B로 나타낸다. 도 1C는 크로마토그램 3개를 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 2A 및 2B는 PhTET4와 함께 15분 인큐베이션한 합성 펩타이드 4 (도 2A) 및 PhTET1과 함께 15분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 1 (도 2B)의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 3A, 3B, 3C 및 3D는 PhTET3 (도 3A 및 곡선 A), MjTET (도 3B 및 곡선 B) 또는 10% PhTET3/90% MjTET 혼합물 (도 3C 및 곡선 C)과 함께 15분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 5의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 곡선 D로 나타낸다. 도 3D는 크로마토그램 4개를 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 4A, 4B, 4C 및 4D는 PhTET3 (도 4A 및 곡선 A), MjTET (도 4B 및 곡선 B) 또는 5% PhTET3/95% MjTET 혼합물 (도 4C 및 곡선 C)과 함께 15분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 5의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 곡선 D로 나타낸다. 도 4D는 크로마토그램 4개를 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 5A, 5B 및 5C는 PhTET3 (도 5A), MjTET (도 5B) 또는 5% PhTET3/95% MjTET 혼합물 (도 5C)과 함께 15분간 여러가지 온도, 즉 40℃ (곡선 A) 또는 60℃ (곡선 B)에서 인큐베이션한 합성 펩타이드 5의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 도 5A, 5B 및 5C에서 볼 수 없다.
- 도 6A, 6B 및 6C는 PhTET4 (도 6A), MjTET (도 6B) 또는 50% PhTET4/50% MjTET 혼합물 (도 6C)과 5분, 15분 또는 30분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 7의 가수분해물의 카이네틱스를 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 곡선 A: 5분; 곡선 B: 15분; 곡선 C: 30분. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 곡선 D로 나타낸다.
- 도 7은 MjTET (곡선 A) 또는 50% PhTET4/50% MjTET 혼합물 (곡선 B)과 함께 30분간 인큐베이션한 합성 펩타이드 7의 가수분해물의 카이네틱스를 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 대조군 샘플, 즉 펩티다제 첨가없이 인큐베이션한 펩타이드는 곡선 C로 나타낸다.
- 도 8은 유청 단백질의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다.
- 도 9는 pH = 6.2 (실선) 및 pH = 9.5 (점선)에서 유청 단백질의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램을 겹쳐 도시한 것이다. 가수분해물들 간에 차이는 거의 존재하지 않는다.
- 도 10은 pH = 6.2 단독 (곡선 D)에서, 그리고 여러가지 TET와 함께 인큐베이션한 후 유청 단백질의 가수분해물을 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다 (크로마토그램의 일부만 도시함). 도 10A는 PhTET2와 단독 인큐베이션한 것이다 (곡선 A). 도 10B는 PhTET3와 단독 인큐베이션한 것이다 (곡선 B). 도 10C는 PhTET2 및 PhTET3를 동일한 몰 함량으로 사용해 함께 인큐베이션한 것이다 (곡선 C).
- 도 11은 여러가지 TET 아미노펩티다제 조성물들과 비교하여, 동일한 몰 함량의 PhTET2 및 PhTET3와 인큐베이션 (곡선 A)한 후 유청 단백질의 가수분해물을 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. (크로마토그램의 일부만 도시함). 도 11A는 PhTET2 단독과 인큐베이션 (곡선 B) 및 90% PhTET2/10% PhTET3 혼합물과 인큐베이션 (곡선 B1)한 것이다. 도 11B는 PhTET3 단독과 인큐베이션 (곡선 C) 및 10% PhTET2/90% PhTET3 조성물과 인큐베이션 (곡선 C1)한 것이다. 도 11C는 90% PhTET2/10% PhTET3 조성물 (곡선 B1) 및 10% PhTET2/90% PhTET3 조성물 (곡선 C1)과 인큐베이션한 것이다.
- 도 12는 도 11A, 11B 및 11C의 크로마토그램과 pH = 6.2 단독에서 유청 단백질의 가수분해물을 분석하여 수득한 크로마토그램 (곡선 D)을 겹쳐 도시한 것이다. 크로마토그램의 일부분만 도시된다.
- 도 13은 pH = 9.5 단독 (곡선 D)에서, 그리고 여러가지 TET 아미노펩티다제들과 인큐베이션한 후 유청 단백질의 가수분해물을 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. (크로마토그램의 일부만 도시됨).
- 도 13A는 PhTET4 단독과 인큐베이션 (곡선 A)한 것이다. 도 13B는 MjTET 단독과 인큐베이션 (곡선 B)한 것이다. 도 13C는 동일한 몰 함량의 PhTET4 및 MjTET 조성물과 함께 인큐베이션한 것이다.
- 도 14는 역상 HPLC (컬럼 ZORBAX SB-300 C18)에서 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 곡선 A: 유청을 서몰리신의 존재 하에 인큐베이션한 샘플. 곡선 B: 유청을 서몰리신 및 TET 아미노펩티다제의 존재 하에 인큐베이션한 샘플. 곡선 C: 유청을 단독 인큐베이션한 샘플. 사용한 컬럼은 작은 펩타이드를 분석할 수 있으며, 따라서, 작은 펩타이드의 "홀 (whole)" 단백질은 볼 수 없었다.
- 도 15는 카세인 가수분해물에 투입된 합성 펩타이드 7을 PhTET3 (도 15A), MjTET (도 15B), PhTET4 (도 15C) 또는 33% PhTET3/33% PhTET4/33% MjTET 조성물 (도 15D)과 인큐베이션한 후 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 곡선 A: 대조군 (효소 첨가없이 카세인 가수분해물에 펩타이드 7 첨가); 곡선 B: PhTET3; 곡선 C: MjTET; 곡선 D: PhTET4; 곡선 E: 33% PhTET3/33% PhTET4/33% MjTET 혼합물.
- 도 16은 인큐베이션하지 않은 대조군 (곡선 A), 효소 첨가없이 인큐베이션한 것 (곡선 B), 효소 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3를 동일 몰 함량으로 사용해 함께 인큐베이션한 (라인 VS) 글루텐 샘플을 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 2시간 인큐베이션한 후, 몇몇 흡수 피크들이 작아졌으며, 이는 수종의 글루텐 단백질의 현저한 분해를 나타낸다.
- 도 17은 글루텐 샘플의 가수분해물을 역상 크로마토그래피 (RP-HPLC)로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다. 곡선 A: 서폴리신의 존재 하에 인큐베이션한 전체 글루텐 샘플. 곡선 B: 서몰리신 및 TET 아미노펩티다제 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3의 존재 하에 인큐베이션한 전체 글루텐 샘플.
- 도 18은 각 믹스에 사용된 새로운 유청 단백질 가수분해물의 대조군 샘플들을 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 19는 여러가지 TET 혼합물 (믹스 1-5)에 의해 새로운 유청 단백질 가수분해물을 가수분해한 후, 샘플을 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 20은 유청 단백질 가수분해물의 TET (70% PhTET2, 15% PhTET3, 15% PhTET4) 혼합물 #1 (믹스 1)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 21은 유청 단백질 가수분해물의 TET (70% PhTET2, 15% PhTET4, 15% MjTET) 혼합물 #2 (믹스 2)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 22는 유청 단백질 가수분해물의 TET (90% MjTET, 10% PhTET4) 혼합물 #3 (믹스 3)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 23은 유청 단백질 가수분해물의 TET (70% MjTET, 15% PhTET1, 15% PhTET3) 혼합물 #4 (믹스 4)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 24는 유청 단백질 가수분해물의 TET (70% MjTET, 15% PhTET3, 15% PhTET4) 혼합물 #5 (믹스 5)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 25는 유청 단백질 가수분해물의 TET (100% PhTET4) 혼합물 #6 (TET4 - 1 또는 믹스 6)에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 26은 유청 단백질 가수분해물의 TET의 혼합물 #1 및 #2에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
- 도 27 및 28은 PhTET2 ("TET 2")와 비교하여, 유청 단백질 가수분해물의 TET의 혼합물 #1 및 #2에 의한 펩타이드 가수분해를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 것이다.
실시예 :
실시예 1
재료 및 방법
합성 펩타이드에 대한 TET 아미노펩티다제 활성 검사
합성 펩타이드에서 TET 아미노펩티다제의 활성을 검사하기 위해, 총 농도 50 ㎍/ml으로 여러가지 TET 아미노펩티다제 혼합물들을 최종 농도 0.5 mM의 다양한 펩타이드들과 최종 부피 100 ㎕으로 인큐베이션하였다. (크로마토그램에서 보이지 않는) 반응 종료시 실험에 내부 표준물질, 트립토판 샘플 50 μM을 첨가하였다. 이 내부 표준물질을 이용해 매질내 생산물 함량의 계산 정확도를 높였다. 즉, 컬럼에 주입된 표준물질의 양을 정확하게 알고 있으므로, 수득되는 반응 신호를 표준화 (normalization)할 수 있다. 표준물질은 실험에서 반응하지 않고, 신호에 대한 반응이 측정하는 생산물과 매우 비슷한, 화합물이다. 여기서, 선택한 내부 표준물질은 트립토판이다. 내부 표준물질은 RP-HPLC 분석 전에 샘플에 지정된 농도로 첨가된다. 활성 검사는 pH = 7.5에서 50 mM PIPES 완충제, 150 mM KCl 중에 수행하며, 단 PhTET4가 존재하는 실험은 50 mM CHES 완충제, 150 mM KCl 중에 pH = 9.5에서 수행한다. 이후, 반응 매질을 원하는 온도 (40℃ 또는 60℃)에서 교반 (500 rpm)하면서 수 시간 인큐베이션한다. 그런 후, 시험관을 얼음으로 옮겨 가수분해 반응을 정지시킨다. 이후, 반응 매질 80 ㎕를 2% 아세토니트릴 (ACN) 및 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)을 포함하는 용액 320 ㎕에 첨가한다. 샘플을 10분간 10,000 g에서 원심분리한 다음 분석을 위해 RP-HPLC 컬럼에 주입하기 전 바이얼로 옮긴다. RP-HPLC 분석과 더불어, 관찰되는 가수분해 산물의 크기를 정확하게 동정하기 위해, 이들 활성 검사의 반응 매질을 질량 분석법으로 분석하였다. 이로써 크로마토그램에서 관찰되는 여러가지 피크들을 동정하고, 가수분해 프로세스를 최적으로 추적할 수 있다.
소의 유청으로부터 단백질 가수분해물 제조
유청은 우유 응고 후 수득되는 액체 분획으로, 특히 치즈 산업에서 나오는 부산물이다. 이는 5가지의 주요 패밀리로 분류되는 단백질들을 약 10%로 함유하고 있다: β-락토글로불린 (50%), α-락트알부민 (20%), 면역글로불린 (10%), 소 혈청 알부민 (10%), 및 락토페린 (2.8%). 본 실험에서, 이들 다양한 단백질들을 가수분해하고, 형성되는 펩타이드를 모델 기질로 사용한다. 소의 유청 용액을 최종 농도 100 ㎍/ml의 서몰리신 (Sigma®)의 존재 하에 교반 (500 rpm)하면서 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 가수분해 후, 용액을 95℃에서 15분간 인큐베이션하여 서몰리신을 불활성화하였다. 그런 후, 유청 단백질 가수분해물을 분액하여, 사용시까지 -20℃에서 보관하였다.
유청 단백질 가수분해물에 대한 TET 아미노펩티다제 활성 검사
유청 단백질 가수분해물에 존재하는 펩타이드에 대한 TET 아미노펩티다제의 가수분해 활성을 검사하기 위해, 총 농도 50 ㎍/ml의 다양한 TET 단백질 혼합물을 최종 부피 100 ㎕로 가수분해물과 함께 인큐베이션하였다. 반응에 보조인자는 첨가하지 않았다. PhTET2 및 PhTET3의 활성 검사는 유청 단백질 가수분해물 자체의 pH 6.2에서 수행하였다. PhTET4 및 MjTET를 사용해 수행하는 일련의 검사들은 pH = 9.5에서 수행하였다. 그런 후, 반응 매질을 교반 (500 rpm)하면서 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이 후, 시험관을 얼음으로 옮겨, 가수분해 반응을 정지시켰다. 그런 다음 반응 매질 80 ㎕를, 2% 아세토니트릴 (ACN) 및 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 구성된 용액 320 ㎕에 첨가하였다. 이 샘플을 10분간 10,000 g에서 원심분리한 다음 바이얼로 옮기고, 분석을 위해 RP-HPLC 컬럼에 주입하였다.
역상 HPLC 분석 (RP- HPLC )
펩타이드 실험의 경우 μRPC C2/C18 컬럼 (4.6 mm x 100 mm) (GE healthcare®)에, 또는 유청 실험의 경우 Perkin Elmer® HPLC와 연결된 ZORBAX SB-300 C8 컬럼 (4.6 mm x 150 mm) (Agilent®)에, 각각의 샘플 100 ㎕를 주입하였다. A 상은 0.1% TFA 및 2% ACN이 첨가된 물이고, B 상은 0.1% TFA 및 80% ACN이 첨가된 물이다. 흡착된 단백질은 B 상 0-50%의 선형적인 농도구배를 이용해 1 ml/min으로 용출시키고, 펩타이드 실험의 경우에는 280 nm에서, 그외 실험에서는 214 nm에서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 단백질 피크들을 식별하고, TotalChrom software version 6.3.1 (Perkin Elmer®)을 이용해 분석하였다.
글루텐 단백질에 대한 TET 아미노펩티다제 활성 검사
5% 글루텐 단백질 현탁액 (Sigma®)은, 이의 용해 용액 (150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl, 50% 프로판올, pH = 7.5) 내에서 금속 교반기를 사용해 준비하였다. 이 기질 함유 용액 95 ㎕을 0.5 ml 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 이 튜브를 서모스탯이 장착된 오르비탈 교반기에 배치한 다음, 10분간 교반 (500 rpm)하면서 60℃에서 인큐베이션하였다. 3종의 효소 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3를 동일한 몰 함량으로 최종 농도 250 ㎍/ml로 포함하는 혼합물이 함유된 용액을 준비하고, 동일한 조건에서 인큐베이션하였다. 효소 혼합물 5 ㎕를 반응 매질에 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응은 2시간 후 샘플을 4℃에 두어 인큐베이션을 정지시켰다.
역상 HPLC (RP- HPLC ) 분석
절차는 상기 언급된 바와 동일하였다. 다만, 샘플을 Jupiter C18 컬럼 (4.6 mm x 200 mm) (Phenomenex) 컬럼에 주입한 다음 흡착된 단백질은 B 상 0-40%의 선형 농도구배에 의해 용출시켰다.
결과
이들 실험에 사용한 TET 효소들은 M42 패밀리 (MEROPS)의 메탈로-아미노펩티다제이다. 이들 효소는 모두 동일한 효소 패밀리에 속하며, 매우 높은 구조 동일성을 가진다. 하지만, 이들 효소는 실제 특이성이 서로 다른 상이한 효소들이다.
사용한 다양한 TET들의 3차원 구조는, 이들 모두 서로 다른 기질에 대해 특이성을 가짐에도 불구하고, 매우 비슷하였다. 즉, PhTET1은 글루타밀-아미노펩티다제이고, PhTET2는 일부 비-하전된 소수성 및 극성 잔기들에 대해 현저한 잔류 활성을 가진 루킬 (leukyl)-아미노펩티다제이고, PhTET3는 라이실-아미노펩티다제이고, PhTET4는 엄격한 글리실-아미노펩티다제이고, MjTET는 소수성 및 양으로 하전된 잔기들에 대해 현저한 활성을 가진 루시드 (leucid)이다. MjTET는 방향족 잔기에 대해 가수분해 활성을 가지는 유일한 종이다.
전술한 결과들 모두 모노아실-pNA (4-니트로아닐린) 또는 모노아실-AMC (7-아미노-4-메틸쿠마린) 타입의 기질을 이용해 수득되었다. 이들은 잔기 2개로 된 펩타이드로, 첫번째 잔기는 펩티다제의 활성을 측정하기 위한 것이고, 2번째 잔기는 분리되었을 때 가시적인 신호를 방출하는 발색단이다. 따라서, 각각의 기지의 잔기에 대해 펩티다제의 친화성을 측정할 수 있다.
이에, 특정 서열을 가진 수종의 펩타이드를 설계 및 합성하였다 (하기 표 1). 한편, 잔기 15개로 된 펩타이드 5종은 "농화형 (enriched)"으로 지칭되며, 즉 이들 펩타이드의 N-말단부에는 특정 타입의 잔기가 풍부하게 존재한다:
- 펩타이드 1: 음으로 하전된 잔기가 풍부함
- 펩타이드 2: 소수성 잔기가 풍부함
- 펩타이드 3: 양으로 하전된 잔기가 풍부함
- 펩타이드 4: 글리신이 풍부함
- 펩타이드 5: 방향족 잔기가 풍부함
Figure pct00001
이들 펩타이드 각각은 농화된 N-말단 서열을 가지고 있다. 그 다음으로 농화된 영역의 효과 (특히, 펩타이드의 용해성)를 보완하는 잔기 4개가 존재한다. C-말단부는 보존되어 있으며, 280 nm에서의 흡광도 및 이의 용해성을 고려해 선정된 동일한 잔기 7개로 된 시리즈를 가지고 있다: YTSWNSE (서열번호 7).
한편, 소위 "랜덤" 펩타이드 5종, 즉 이들은 동일한 잔기 15개를 포함하지만 다른 순서로 배치된다: 펩타이드 6; 펩타이드 7; 펩타이드 8; 펩타이드 9; 펩타이드 10.
상기 펩타이드를 기질로 사용하고 TET 아미노펩티다제를 사용하여 수행되는 다양한 실험들에서, 본 발명자들은 예상하지 못한 몇가지 활성들을 발견하였다.
아미노펩티다제 PhTET3는 양으로 하전된 잔기에 대해 최적의 활성을 나타내며; 이는 루신, 메티오닌, 글루타민 및 아스파르테이트에 대해 잔류 활성 (residual activity)을 가진 라이실-아미노펩티다제로서 분류된다. 그러나, 합성 펩타이드를 대상으로 한 검사에서, PhTET3의 현저한 활성은 소수성 잔기가 풍부한 펩타이드, 펩타이드 2에서 관찰되었다 (도 1A).
선행 기술에 따라 소수성 잔기에 대해 가장 효과적인 아미노펩티다제 PhTET (즉, 초호열균 (thermococcal)으로부터 기원하는 아미노펩티다제)인 아미노펩티다제 PhTET2를 사용해 동일한 검사를 수행하였다 (도 1B).
놀랍게도 PhTET3가 PhTET2보다 소수성 잔기가 풍부한 펩타이드에 대해 더 높은 활성을 나타내었다 (도 1C). 실제, 15분간 활성 검사 후, 펩타이드의 첫번째 잔기는 PhTET2의 존재시 보다 PhTET3 존재시 더 빨리 가수분해되었다.
이러한 유형의 "예상치 못한" 활성은 또한 글루탐산 및 글리신 잔기가 풍부한 펩타이드 1 및 펩타이드 4 각각에서도 관찰되었다. 이를, 이론상 농화된 말단을 가진 잔기에 대해 최대 가수분해 활성을 나타내는 펩티다제의 존재 하에 인큐베이션하였을 때, 가수분해 활성이 관찰되지 않았다 (도 2A 및 2B).
PhTET3의 활성은 N-말단부에 방향족 잔기가 풍부한 펩타이드에서 측정하였으며, 예상치못한 다른 결과가 관찰되었다 (도 3A). 문헌에서 입수가능한 데이터를 감안해, PhTET3에 의한 방향족 잔기의 가수분해 관찰은 매우 놀라운 결과이다. 실제, 질량 분석법에 의해 용출된 여러가지 단백질 피크를 분석한 결과, N-말단부에서 티로신이 가수분해된 펩타이드가 현저하게 축적된 것으로 관찰되었다.
지금까지, TET 아미노펩티다제의 효소 특이성 특징이 다이펩타이드에 대한 활성 분석에 의해 규명되었으며, 그 데이터는 문헌에서 입수가능하다. 합성 펩타이드 2 및 5에서 PhTET3 활성 검사 결과, 실제, TET 아미노펩티다제의 활성이 기질 펩타이드의 특성에 의존적일 있다는 것이 확인되었다. 사실상, PhTET3는 Tyr-pNA 다이펩타이드에 탑재된 티로신 잔기를 가수분해할 수 없음에도 불구하고, 이것은 펩타이드 5에서 이들 잔기에 대해 높은 가수분해 효율을 나타내었다. 지금까지, 이와 동일한 타입의 예상치못한 활성은 아직까지 확인된 바 없으며; 대규모 검사, 즉 매우 다양한 기질을 이용한 검사에서 다른 활성이 드러날 가능성도 배제할 수 없다.
도 1A, 1B, 1C, 2A 및 2B의 결과들은, 이들 효소들 중 일부가 개시되어 있음에도 불구하고, 효소학적 조성물로의 조합이 사소한 작업이 아님을 보여준다. 실제, 이들 아미노펩티다제들의 이론적인 특이성과 더불어, 변형시킬 식품 펩타이드 및 변형시킬 부위의 주변 잔기들의 특성을, 반응 매질의 생리-화학적 파라미터와 함께, 특이적인 효소 조성물을 설계할 때 고려하여야 한다. 이러한 결론뿐 아니라 본 발명에 따른 조성물의 사용 이점은 후술한 실험들에서 더욱 부각된다.
가속화 가수분해 (accelerated hydrolysis) 및 조절
MjTET 90%/ TET3 10%
펩타이드의 가수분해 개선과 관련된 TET 아미노펩티다제 조성물의 목적을 입증하기 위해, 10% PhTET3 및 90% MjTET로 된 조성물의 활성을 방향족 잔기가 풍부한 펩타이드 5에서 검사하였다 (도 3A-3D). 각각의 아미노펩티다제를 기질 펩타이드와 함께 인큐베이션하고; 반응 매질을 RP-HPLC에 의해 분석한 결과, 2종의 아미노펩티다제가 이 펩타이드에 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. 반응 매질에서는 분해 산물 4종이 온전한 기질 (pep-0)과 함께 동정되었으며, 분해 산물은 기질 펩타이드로부터 가수분해되는/가수분해된 1 (pep-1), 2 (pep-2), 3 (pep-3) 또는 4 (pep-4)개의 잔기였다.
PhTET3 (도 3A)의 경우, 펩타이드 pep-1이 축적되었으며, 온전한 기질 펩타이드는 매질에 더 이상 존재하지 않았다.
펩타이드 MjTET (도 3B)의 경우, 반응 매질에는 온전한 펩타이드가 일부 여전히 존재하였으며, 가수분해 산물의 잔기들은 거의 동일한 함량으로 존재하였다. 최종 가수분해 산물, 즉 펩타이드 pep-4는 약간 축적되어 있었다.
2종의 아미노펩티다제로 구성된 조성물의 존재 하에 펩타이드를 인큐베이션한 후, 기질 펩타이드는 더 이상 매질에 존재하지 않았으며, 펩타이드 pep-4가 상당히 축적되었는데, 이는 펩타이드 5의 가수분해가 아미노펩티다제를 단독으로 사용한 경우보다 TET 아미노펩티다제들을 포함하는 조성물의 존재시 더 효과적이라는 것을 의미한다 (도 3C). 이러한 3가지 실험으로부터 수득한 크로마토그램들을 도 3D에 겹쳐 도시하며, 이로써 아미노펩티다제 PhTET3 (단독)를 10%로 혼합물에 첨가하면, 펩타이드에 대해 최적의 활성은 아님에도 불구하고, 펩타이드의 가수분해를 현저하게 가속화할 수 있음을, 명확하게 관찰할 수 있다.
MjTET 95%/ TET3 5%
TET3/MjTET 혼합물의 비율을 수정하여 동일한 실험을 수행하였으며; 이때 펩타이드는 95% MjTET 및 5% PhTET3 조성물의 존재 하에 인큐베이션하였다.
재차, PhTET3의 경우, 기질 펩타이드를 아미노펩티다제와 15분간 인큐베이션한 후 펩타이드 pep-1이 상당히 축적되었다 (도 4A). 반응 매질에는 온전한 펩타이드 pep-0도 여전히 높은 함량으로 존재하였다. 95%로 제공된 MjTET에 의한 펩타이드 5의 가수분해 프로파일 (도 4B)은 90%에서 수득한 프로파일 (도 3B)과 비슷하였다.
이들 데이터는, 95% MjTET 및 5% PhTET3 조성물을 이용해 수득한 결과 (도 4C)와 비교해, 반응 혼합물에 아미노펩티다제 PhTET3의 첨가에 의한 펩타이드의 가수분해의 가속화를 다시 보여준다 (도 4D). 이들 효소를 단독으로 사용하였을 경우에는, 반응의 중간산물 pep-1, pep-2 및 pep-3의 축적이 관찰되었다. 마지막 실험에서는, 이들 중간산물의 농도는 감소하고, 최종 산물 pep-4의 농도는 증가하였다. 즉, 펩타이드 PhTET3를 5%로 첨가하여 펩타이드의 가수분해 과정의 속도를 높일 수 있다.
이러한 특수 사례에서, 이론적으로는 가수분해하고자 하는 잔기에 대해 특이성이 없는 아미노펩티다제의 첨가가, TET 아미노펩티다제 조성물의 전반적인 효과를 높일 수 있다는 것은 매우 흥미로운 결과이다.
마지막으로, 비율이 수정된 TET 아미노펩티다제 조성물 예 2가지는 가수분해 조절 측면에서 본 발명에 따른 조성물에 의해 제공되는 잠재성을 입증해주는데, 이 사례에서 펩타이드 기질을 완전히 분해하기보다는 펩타이드 기질을 변형시킬 수 있다는 것을 보여준다.
전술한 실험들은 60℃에서 수행하였다. 실험들은 또한 40℃에서도 수행하였으며, 수득한 데이터를 이전 데이터와 비교하였다 (도 6).
PhTET3 아미노펩티다제를 단독으로 기질 펩타이드와 40℃에서 인큐베이션한 경우, 현저한 가수분해 감소가 관찰되었다. 실제, 이 경우에 펩타이드 pep-1만 매우 소량으로 볼 수 있었다 (도 5A).
한편, 동일한 효과는 MjTET 경우에서도 관찰되었는데, 모든 펩타이드 중간산물뿐 아니라 최종 산물 pep-4가 관찰되었으며, 단지 가수분해가 현저하게 느리게 진행되었다 (도 5B).
95% MjTET 및 5% PhTET3 조성물의 경우 (도 5C), 최종 산물 pep-4의 농도는 크게 감소하였다. 한편, 흥미롭게도 다양한 중간산물 pep-1, pep-2 및 pep-3가 60℃에서 가수분해물에 거의 비슷한 함량으로 존재한다. 즉, TET 조성물을 사용한 경우, 첫번째 티로신, 즉 티로신에서의 가수분해는 60℃에서와 마찬가지로 40℃에서 효과적인 반면, 아미노펩티다제를 단독 사용한 경우에는 크게 감소하였다. 또한, 나머지 가수분해 과정은 느려지는 것으로 보이며, 따라서 기질 펩타이드는 여전히 다량으로 존재하고 최종 산물은 거의 축적되지 않은 결과가 관찰되었다.
본 실시예는, 본 발명에 따른 기질의 폴리펩타이드 함유물을 변형시키는 방법에 적용가능한 변형을 또다시 입증해준다. 이 파트에서, 함량 (TET 아미노펩티다제의 여러가지 비율) 및 온도의 조절이 확인되었다. 또한, 더 세밀하고 정확한 펩타이드 변형을 달성하기 위해 pH 및 시간 조절을 통합할 수도 있다. 이들 실시예는 2종의 TET 아미노펩티다제를 사용해 수행하였다. 그러나, 다른 TET 아미노펩티다제를 첨가하여 대상 펩타이드를 더 광범위하게 또는 보다 정확하게 타겟팅하는 것으로 가능하다.
랜덤 펩타이드에 대한 MjTET / PhTET4 조성물
아미노펩티다제 MjTET 및 PhTET4 조성물에 의한 랜덤 펩타이드 7의 가수분해 카이네틱스를 측정하였다 (도 6). 5분, 15분 및 30분 후, 펩타이드의 가수분해를 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 펩타이드 7은 N-말단부에 글리신이 존재하는 특이성을 가지고 있다.
아미노펩티다제 PhTET4의 특징 규명을 통해 글리신-아미노펩티다제인 것으로 확인되었다. 그 이유는, 이의 활성을 펩타이드 7에서 조사하였을 때, 첫번째 글리신 잔기의 가수분해만 관찰되었기 때문이다 (도 6A). 이에, 본 발명자들은 펩타이드 pep-1의 축적을 관찰할 수 있었다.
아미노펩티다제 MjTET에 의해 펩타이드를 가수분해한 경우, 본 발명자들은 펩타이드 pep-1 외에도, 펩타이드 pep-2 및 pep-3, 그리고 pep-4에 해당되는 산물을 관찰하였다 (도 6B). 한편, 15분에서 30분 사이에, 기질 펩타이드 pep-0의 농도는 감소하는 것으로 관찰되지 않았다. 동시에, 본 발명자들은 pep-2의 농도는 감소하는 반면 pep-3 농도는 증가한다는 사실에 주목하였다. 여기서 관찰되는 이러한 현상은, 가수분해 산물에 대한 아미노펩티다제의 친화성이 출발 물질에 대한 친화성보다 높기 때문이다.
2종의 아미노펩티다제 PhTET4 및 MjTET를 동일한 몰 비율로 포함하는 조성물을 기질 펩타이드와 접촉시켜 인큐베이션하였을 경우, 펩타이드 가수분해가 현저히 개선되는 것으로 관찰되었다 (도 6C). 온전한 펩타이드 pep-0의 농도는 5분 - 30분 사이에 점진적으로 감소하였다. 한편, 펩타이드 pep-1의 농도는 처음에 5분-15분 사이에 증가한 다음 15분-30분 사이에 급격하게 감소하였다.
MjTET 단독 또는 MjTET 및 PhTET4 조성물과 30분간 인큐베이션한 후 수득한 크로마토그램을 도 7에 겹쳐 도시한다. 여기서, 최종 펩타이드들은 상대적으로 비슷한 함량으로 존재하는 반면, 기질 펩타이드는 거의 완전히 가수분해된 것으로 관찰되었다. 2종의 펩티다제 중 어느 것도 실험 중에 펩타이드의 첫번째 잔기를 완전히 가수분해할 수 없다는 사실에 주목하였다.
본 실시예에서, 기질 펩타이드의 첫번째 잔기의 가수분해는 최적의 활성을 보이지 않았던 펩티다제 조성물에 첨가하였을 때, 가속화되었다. TET 아미노펩티다제 타입, 이들의 비율, 온도 또는 심지어 pH를 특이적인 방식으로 조절함으로써, 펩타이드의 혼합물을 관찰된 가수분해 중간산물들 중 어느 한가지로 농화되게 만들 수 있다 (이 경우에는, pep-2 펩타이드가 15분에 농화됨, 도 6B).
복합 혼합물에서 펩타이드의 가수분해 조절
유청 단백질 가수분해물
유청은 우유 응고 후 수득되는 액체 분획이다. 유청에는 5가지의 주요 패밀리로 분류되는 단백질들을 약 10%로 함유한다: β-락토글로불린 (50%), α-락트알부민 (20%), 면역글로불린 (10%), 소 혈청 알부민 (10%), 및 락토페린 (2.8%).
아래 검사에서 사용한 기질은 전술한 방법에 따른 유청 단백질 가수분해물이다. 가수분해물의 상대적인 펩타이드 구성을 분석하기 위해, HPLC 시스템에서 역상 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 대조군 가수분해물을 분석하여 수득한 크로마토그램은 도 9에 도시한다.
최적 활성 조건에서 펩타이드에 대한 TET 효소들의 활성을 분석할 수 있도록 하기 위해 여러가지 pH 조건에서 2종의 가수분해물을 준비하였다. 크로마토그램 2개를 도 9에 겹쳐 도시한다.
이에, 크로마토그램의 전체적인 형태는 변화없이 유지되는 것으로 관찰되었다. 따라서, pH 변화에 따른 펩타이드의 구성에는 큰 폭의 변화는 없었다. 그러나, 용출 프로파일에서 미세한 변화가 관찰되었다. 이러한 즉석 변화를 결과 분석시 고려하였다.
PhTET2 / PhTET3 조성물 (50/50%, 90/10% 및 10/90%)
이제, 복합 혼합물에서 특정 펩타이드의 가수분해를 조절할 가능성을, TET 아미노펩티다제를 본 발명의 조성물과 비슷한 특징의 조성물에 사용해, 입증하였다.
아미노펩티다제를 단독으로 사용해, PhTET2와 PhTET3의 활성을 먼저 측정하였다 (도 10). TET 아미노펩티다제들이 모든 펩타이드를 취하진 않는 것으로 관찰되었는데, 이는 사용한 2종의 TET 아미노펩티다제가 서로 다른 구분되는 기질 특이성을 가지고 있기 때문이다. 본 실험에 사용된 펩타이드 혼합물은 복합 혼합물로서, 아미노펩티다제에 의해 뒷받침되는 여러가지 펩타이드들의 가수분해 수준 차이도 관찰되었다. 크로마토그램의 일부만 명확하게 하기 위해 도시하였지만, 제시된 결과는 크로마토그램 전체에서 관찰할 수 있다.
가수분해물을 동일 몰 함량의 아미노펩티다제 2종으로 된 조성물과 함께 인큐베이션하였을 경우, 용액내 대부분의 펩타이드에서 가수분해 활성 개선이 관찰되었다. 예상치 못하게도, 가수분해의 정도는, 조성물에서 여러가지 TET들의 비율 수정에 따라 달라졌다 (도 11).
도 12는 PhTET2 및 PhTET3가 여러가지 비율로 조합된 조성물 3종에서 수득한 크로마토그램을 도시한 것이다. 먼저, "동일 몰" 혼합물은 각각의 TET가 50%인 것으로, 이는 도 10에서 볼 수 있다. 점선으로 나타낸 크로마토그램은 각각의 TET 아미노펩티다제가 여러가지 비율로 포함된 혼합물로서, 하나가 90%이면 다른 하나는 10%이고, 그 역도 마찬가지이다. 이에, 가수분해 프로파일이 달라졌으며, 즉 혼합물내 각각의 TET 아미노펩티다제의 비율 변화가 용액내 펩타이드의 가수분해 수준 차이를 야기하는 것을 의미한다. 여러가지 크로마토그램들을 모두 겹쳐 도 12에 도시하며, 펩타이드에서 가능한 가수분해 조절을 명확하게 관찰할 수 있다.
이는 예측하기 불가능한 놀라운 결과이다. 또한, 펩타이드에 따라 가수분해의 조절이 달라지며; 따라서, 조성물에서 각각의 TET 아미노펩티다제들의 비율을 미세하게 수정하여, 다양한 펩타이드들의 가수분해를 조절할 수 있다. 종래 기술에 따른 정보로는, 혼합물내 여러가지 TET의 농도를 달리함으로써, 타겟화된 방식으로 펩타이드의 가수분해를 조절할 수 있음은, 제시할 수 없었다.
MjTET / PhTET4 조성물 (50/50%)
후술한 일련의 2차 검사들은 아미노펩티다제 MjTET 및 PhTET4에 관한 것이다. 수득한 크로마토그램의 일부를 겹쳐 도 13에 도시한다. 여기서, 글리신 잔기에 특이적인 아미노펩티다제 PhTET4가 단독 사용시 펩타이드를 가수분해할 수 없는 것으로 관찰되었다. PhTET4와 인큐베이션한 후 수득한 대조군 크로마토그램을 매우 명확하게 겹쳐 도시한다. 이와는 대조적으로, MjTET는 펩타이드 혼합물에 존재하는 수종의 펩타이드를 가수분해하지 못하였다.
이러한 일련의 검사에서 주목할만한 결과는, MjTET 및 PhTET4를 조성물 형태로 혼합하였을 경우, 기질 펩타이드의 가수분해가 현저하게 증가한다는 사실과 연결된다.
재차, 이러한 예측하지 못한 결과는, 특정 TET 아미노펩티다제 조성물을 사용해 혼합물에서 다양한 펩타이드의 가수분해를 특이적으로 어느 범위까지 조절가능한지를 보여준다. 지금까지 수득한 다양한 결과들은, 반응 매질의 생리화학적 조건에 따라 TET 아미노펩티다제의 활성을 조절할 수 있음을 보여준다. 이에, 본 발명자들은 이들 효소들의 예외적인 특성을 기반으로 프로세스를 제안한다.
조성물 PhTET1 / PhTET2 / PhTET3 / 서몰리신
실험에 사용되는 유청은 오트사부아의 치즈 공장에서 나온 것이다. 유청을 4℃로 옮긴 다음 샘플 1 ml로 나누어 -20℃에서 보관하였다.
서몰리신과 인큐베이션한 후 (도 14), 서몰리신에 의한 유청 단백질의 가수분해 결과로 샘플에 소형 펩타이드가 다량 존재하였다.
서몰리신을 TET와 함께 인큐베이션한 후, 이들 펩타이드 거의 대부분이 분해된다는 사실에 특히 주목하였다. 본 발명자들은 TET 아미노펩티다제의 활성과 관련된 분해 산물인 일부 펩타이의 농화에 주목하였다.
카세인 가수분해물에서 특정 펩타이드의 가수분해
조성물 PhTET3 , MjTET 및 PhTET4 (33/33/33%)
본 실험에서, 합성 펩타이드 7을 복합 펩타이드, 즉 카세인 가수분해물 (Sigma)에 첨가하였다. 아미노펩티다제 PhTET3, MjTET 및 PhTET4 조성물과 함께 인큐베이션한 후, 반응 매질을 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 수행한 다양한 실험들의 결과를 도 15에 도시한다. 펩타이드는 애매모호함 없이 동정되었으며, 이의 분해 제1 단계를 관찰할 수 있었다. 환경의 복합성은 짧은 단편의 분석을 더 복잡하게 만든다.
카세인 가수분해물과 펩타이드 7의 혼합물을 아미노펩티다제 PhTET3 또는 MjTET와 인큐베이션하였을 경우, 대상 펩타이드는 거의 가수분해되지 않는 것으로 관찰되었다 (도 15A 및 B). 그러나, 예상한 바와 같이, 혼합물의 카세인 가수분해로부터 유래되는 적은 수의 펩타이드가 TET 아미노펩티다제에 의해 적어도 일부 가수분해되었다.
혼합물을 PhTET4의 존재 하에 인큐베이션하였을 경우, 대상 펩타이드만 아미노펩티다제 PhTET4에 의해 가수분해되었으며, 이는 거의 완전히 분해되어 (도 15C), 유일하게 관찰되는 펩타이드는 펩타이드 pep-1이었다.
온전한 대상 펩타이드 pep-0은, 펩타이드 혼합물을 3종의 TET 아미노펩티다제 조성물의 존재 하에 인큐베이션하였을 경우, 완전히 존재하지 않았다 (도 15D). 한편, 후자의 경우, 펩타이드 pep-1의 농도가 PhTET4 단독의 경우와 비교해 현저하게 감소하였으므로, pep-1 자체가 가수분해되었다고 볼 수 있다.
본 실험에서, 이러한 방법으로 펩타이드를 변형 또는 제거하기 위해, 혼합물에서 펩타이드를 정확하게 타겟팅할 수 있다는 것이, 입증되었다.
천연 글루텐 단백질 부분에 대한 특이적인 가수분해
조성물 PhTET1 / PhTET2 / PhTET3 (33/33/33%)
글루텐은 글루테닌 및 글리아딘 2가지 주요 패밀리로 분류되는 다양한 단백질들로 된 혼합물이다. 일부 글리아딘은, 글루텐 민감 또는 불내성 사람에서 알레르기 반응을 유발하는, "면역우위"로 지칭되는 펩타이드를 가지고 있으며; 이러한 증후군은 셀리악 질환으로 더 잘 알려져 있다.
도 16에 도시된 크로마토그램에서, 프로판올에 용해된 전체 글루텐 샘플을, 아미노펩티다제 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3가 동일 몰 함량으로 포함된 조성물과 인큐베이션한 후, 현저한 농도 감소는 샘플의 글리아딘에서 현저하게 관찰되었다.
본 사례에서, 아미노펩티다제 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3 단독 조성물, 즉 엔도펩티다제가 첨가되지 않은 조성물이, 프로판올 50% 용액에 용해된 전체 글루텐 샘플에서 면역우세 펩타이드를 가진 단백질의 농도를 감소시킬 수 있었다.
조성물 PhTET1 / PhTET2 / PhTET3 / 서몰리신
도 17에서, 글루텐을 서몰리신 엔도프로테아제와 인큐베이션한 후, 샘플내 소형 펩타이드들 다수가 글루텐 단백질의 엔도프로테아제에 의해 매우 효율적인 가수분해를 통해 관찰되었다. 아미노펩티다제 PhTET1, PhTET2 및 PhTET3를 조성물에 첨가하였을 경우, 거의 대부분의 흡광 피크들이 감소하였으며, 이들 피크들 대부분이 아미노펩티다제에 의해 가수분해물로 변환되었다.
또한, 본 발명자들은 아미노펩티다제의 분해 산물인 일부 피크들의 농화에도 주목하였다.
실시예 2
펩타이드 프로파일의 변형 결과
재료 및 방법
유청 단백질 가수분해물에 대한 TET 아미노펩티다제 활성 검사
유청 단백질 가수분해물에 존재하는 펩타이드에 대해 다양한 TET 아미노펩티다제 조합물들의 가수분해 활성을 검사하기 위해, 총 농도 50 ㎍/ml의 다양한 TET 단백질 혼합물들을 가수분해물과 최종 부피 100 ㎕로 인큐베이션하였다. 반응에 보조인자는 첨가하지 않았다. 활성 검사는 pH = 7.5에서 수행하였으며, 단, PhTET4를 사용한 경우에는 pH = 9.5에서 수행하였다. 반응 매질은 이후 교반 (500 rpm)하면서 60℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 시험관을 얼음으로 옮겨 가수분해 반응을 정지시켰다. 그런 후, 반응 매질 80 ㎕를 2% 아세토니트릴 (ACN) 및 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 구성된 용액 320 ㎕에 첨가하였다. 이후, 샘플을 10분간 10,000 g로 원심분리한 다음 바이얼로 옮기고, 분석을 위해 RP-HPLC 컬럼에 주입하였다.
역상 HPLC (RP- HPLC ) 분석
Perkin Elmer® HPLC 시스템과 연결된 ZORBAX SB-300 C8 컬럼 (4.6 mm x 150 mm) (Agilent®)에, 각각의 샘플 100 ㎕를 주입하였다. A 상은 0.1% TFA 및 2% ACN이 첨가된 물이고, B 상은 0.1% TFA 및 80% ACN이 첨가된 물이다. 흡착된 단백질은 B 상 0-50%의 선형적인 농도구배를 이용해 1 ml/min으로 용출시키고, 펩타이드 실험의 경우에는 280 nm에서, 그외 실험에서는 214 nm에서 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 단백질 피크들을 식별하고, TotalChrom software version 6.3.1 (Perkin Elmer®)을 이용해 분석하였다.
크로마토그램의 "윈도우" (도 18 - 28)는 의도적으로 한정한 것으로; 즉, 480초에서 4080초까지의 범위에서 용출 농도구배를 도시한다. 실험에서 처음 수분은 주입 후 컬럼의 세척 (0-480초) 및 농도구배 후 세척 종료 (4080-6000 sec)에 해당한다.
도 18-28은 RP-HPLC 분석을 통해 수득한 크로마토그램을 겹쳐 도시한 것이다.
전술한 혼합물 ("믹스" 또는 "조합물")을 사용해 수행한 다양한 검사들을 아래에 기술한다.
사용 기질의 대조군
새로운 유청 단백질 가수분해물의 분석에서 균일성 및 재현성을 확립하기 위해, 다양한 "대조군" 샘플들을 겹쳐 도시하여 비교하였다 (도 18).
공교롭게도, 믹스 3 대조군 샘플은 기술적인 문제로 인해 생략되었다.
따라서, 이론적으로 펩타이드의 말단에 많은 다양성을 가진 새로운 사용 가수분해물은, 이의 분석 결과를 완벽하게 재현가능하므로, 완전히 균일하고 안정적인 것으로 보인다.
여러가지 믹스에 의한 펩타이드 가수분해
이 유청 단백질 가수분해물을 다양한 TET 혼합물들과 인큐베이션하였다. 새로운 유청 단백질 가수분해물을 다양한 TET 혼합물에 의해 가수분해한 후, 샘플을 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도 19에 도시하였다.
도 19에 겹쳐 도시된 크로마토그램으로, 여러가지 TET 혼합물에 의한 가수분해 후 수득되는 펩타이드들의 유의한 변화들을 관찰할 수 있다. 이러한 일련의 실험들에서 검사한 혼합물에서, 사용한 펩티다제 대부분이 PhTET2 또는 MjTET이었다. 따라서, 여러가지 TET 믹스를 사용해 수득할 수 있는 잠재적인 가변성을 더 넓힐 수 있을 것이다.
이로써, 펩타이드의 미세 변형을 통해 수득되는 "펩타이드 프로파일의 개조 (reshaping)"가 달성된다.
도 20-28은 여러가지 TET 혼합물로 가수분해한 후 반응 매질을 RP-HPLC로 분석하여 수득한 여러가지 크로마토그램을 도시한 것이다. 믹스 번호와 이의 조건은 캡션으로 표시한다.
다양한 혼합물에 대한 관찰 결과는, 본 발명에 따른 기술로 펩타이드 프로파일을 "구축 (shape)"할 수 있는 방법을 명확하게 보여준다.
그러나, 펩타이드를 완전히 분해하지 않으면서도 펩타이드의 성질을 상당히 변형시킬 수 있다: 믹스 1, 2. 또한, 매질내 펩타이드를 보다 미세하게 변형시키는 것도 가능하다: 믹스 5, 6.
여러가지 효소들 간의 혼합 이점을 더 잘 이해하기 위해, 다양한 혼합물에 의한 또는 효소 단독 및 혼합물로서 가수분해를 통해 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 나타낸다.
믹스 1 및 믹스 2
도 26은 유청 단백질의 가수분해물을 TET 혼합물 #1 및 #2 (믹스 #1: 70% PhTET2, 15% PhTET3, 15% PhTET4; 믹스 #2: (70% PhTET2, 15% PhTET4, 15% MjTET)에 의해 가수분해한 펩타이드 가수분해물을 RP-HPLC에서 분석하여 수득한 크로마토그램들 중 하나를 도시한다.
2번 수행하였으며, 이들 간에 약간의 차이가 존재하였다.
펩티다제 대부분이 PhTET2였으며, 이는 2종의 믹스에서 최대 70%로 존재하였다. 이러한 펩티다제의 함량 우위성은 크로마토그램들 간에 관찰될 수 있는 유사성을 해명해준다. 이는 매우 유사하였지만, 동일하진 않았다. 유일한 차이는 PhTET3의 경우와 MjTET의 경우에 존재하였다.
합성 펩타이드에 대한 실험을 통해, 펩타이드 PhTET3 및 MjTET가 펩타이드 구성 측면에서 유사한 거동성을 가지는 것으로, 시사되었다. 주목할만한 차이는 여전히 존재하였으며, 2종의 펩티다제는 상호 대체하여 사용할 수 있는 것으로 드러났다.
비교 검사 2 VS 믹스 1 및 2
전술한 바와 같이, 다수를 차지하는 펩티다제, 여기서는 PhTET2는 전체적인 펩타이드 프로파일에 크게 영향을 미친다. 이는, 양쪽 경우에 단독 펩티다제로 가수분해하여 수득한 펩타이드 프로파일이 펩티다제 혼합물로 가수분해하여 수득한 프로파일과 매우 비슷하므로, 본 실험에서 매우 명백하며, 특히 유청 단백질 가수분해물의 펩타이드를 TET 혼합물 #1 및 #2 (믹스 #1: 70% PhTET2, 15% PhTET3, 15% PhTET4; 믹스 #2: 70% PhTET2, 15% PhTET4, 15% MjTET)로 가수분해하고 이를 RP-HPLC로 분석하여 수득한 크로마토그램들을 겹쳐 도시한 도 27 및 도 28에서 매우 명백하게 드러났다.
"소수"에 해당하는 펩티다제로 인해 몇가지 차이가 관찰되었다. 흥미롭게도, 이 경우, 이러한 차이는 다수를 차지하는 펩티다제에 의해 행해진 변형과 비교해 상대적으로 작았다.
실시예 3
효소 PhTET3의 결정화
브랜드 Greiner Bio-One의 24웰 ComboPlate 플레이트에 현탁 액적 방법을 사용해, 단백질 PhTET3의 결정을 수득하였다. 실험에 사용하는 결정은 다음과 같은 모액을 사용해 일정 조건 하에서 형성하였다: 100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 100 mM (NH4)SO4, 43% 2-메틸-2,4-펜탄다이온, pH = 8. 결정화를 위해, 모액 1 ml을 결정화 플레이트의 웰에 배치하고, 20 mg/ml 농도의 PhTET3 단백질 용액 1.5 ㎕와 모액 1.5 ㎕를 혼합하여, 실란 처리된 (silanized) 커버슬립 위에 액적을 형성시켰다.
결정의 가교
PhTET3 결정을 가교하기 위해, 최종 1% 글루타르알데하이드 (v/v)로 함침된 모액으로부터 가교 용액을 준비하였다. 가교액 1 ㎕씩 수방울을 실란 처리된 커버슬립 위에 증착시키고, 앞서 수득한 다양한 결정들을 이들 액적으로 이동시켰다. 이를 하룻밤 인큐베이션하여 가교를 수행하였으며; 사용을 위해 대기하면서 가교된 결정을 회수하여 초기 모액 수방울에 배치하였다. 수득된 가교된 결정의 큰 치수는 적어도 0.5 mm이었다.
가교된 효소 활성 검사
가교된 효소 결정을 산업적인 효소 프로세스에 사용가능하게 할 목적으로, 효소가 가교된 후에도 여전히 활성인 상태인지를 체크하기 위한 실험들을 수행하였다.
결정의 활성 관찰을 용이하게 하기 위해, 발색성 기질을, 이 경우에는 Lys-pNA를 사용하였다. 가교된 PhTET3 결정을, Lys-pNA 기질이 5 mM 농도로 첨가된, 150 mM NaCl 및 50 mM PIPES, pH = 7.5로 구성된 소위 활성 완충제에서, 인큐베이션하였다. 이 기질은, 특히 효소 PhTET3가 아미노산 라이신에 대해 가장 높은 활성을 나타내어, 선택하였다.
PhTET3의 가교 결정을 10분간 실온에서 인큐베이션한 활성 완충제 한 방울 1 ㎕은, 실질적으로 수 mm, 전형적으로 6-7 mm의 직경을 가지는 것으로 관찰할 수 있다 (pHTET3의 가교 결정과 실온에서 10분간 인큐베이션한 후 5 mM Lys -pNA 기질 한 방울 1 ㎕에서 관찰됨). 따라서, 본 발명자들은, Lys-pNA 기질의 유의한 가수분해 신호로서 연노란색 액적을 뚜렷하게 관찰할 수 있었다. 이러한 실험으로, 효소 PhTET3가 결정화 및 가교되더라도 여전히 활성인 상태라는 것이 입증되었다. 이는 가교 후에도 여전히 활성을 나타내는 더 큰 효소 복합체의 드문 예이다.
가교된 결정의 안정성 검사
전술한 프로세스에 이들 결정을 사용할 수 있도록 하기 위해, 이의 기계적 강도 및 물리-화학적 안정성을 조사하였다.
결정에 대해, 150 mM NaCl, 50 mM PIPES를 포함하는 완충액 (pH = 7.5) 중에서 16,000 g 원심분리-현탁 (centrifugation-suspension) 사이클을 10회 수행하였으며, 결정에는 완전성 또는 활성에 어떠한 손실도 관찰되지 않았다.
동일한 결정들을 동일한 완충제에서 1시간 동안 90℃에서 인큐베이션하였으며, 인큐베이션 후 재차 결정의 완전성 또는 활성에서도 감소는 관찰되지 않았다.
또한, milli-Q 증류수에서 7일간 인큐베이션하였으며, 결정의 완전성 또는 활성 감소는 관찰되지 않았다. 동일한 비-결정 효소로는 이러한 안정성을 관찰할 수 없으므로, 마지막 실험은 특히 흥미롭다.
결론
이러한 결과들은, TET 효소로부터 가수분해 활성을 발휘하는 CLEC를 생산할 수 있다는 것을, 보여준다. 또한, 이들 결정은 기계적 내성 및 물리화학적 안정성에 매우 주목할만한 특성을 가진다. 산업적인 측면에서, 이들 육안으로 관찰가능한 크기의 결정은 기질과 인큐베이션 한 후 쉽게 여과할 수 있다. 따라서, 이는 산업적이고, 원론적인 관점에서 전적으로 실현가능한 효소 고정 전략이다.
SEQUENCE LISTING <110> CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> Use of enzymes to modify polypetides <130> BR82390 <160> 17 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 332 <212> PRT <213> Pyrococcus horikoshii <400> 1 Met Met Ser Met Ile Glu Lys Leu Lys Lys Phe Thr Gln Ile Pro Gly 1 5 10 15 Ile Ser Gly Tyr Glu Glu Arg Ile Arg Glu Glu Ile Ile Arg Glu Ile 20 25 30 Lys Asp Phe Ala Asp Tyr Lys Val Asp Ala Ile Gly Asn Leu Ile Val 35 40 45 Glu Leu Gly Glu Gly Glu Glu Arg Ile Leu Phe Met Ala His Met Asp 50 55 60 Glu Ile Gly Leu Leu Ile Thr Gly Ile Thr Asp Glu Gly Lys Leu Arg 65 70 75 80 Phe Arg Lys Val Gly Gly Ile Asp Asp Arg Leu Leu Tyr Gly Arg His 85 90 95 Val Asn Val Val Thr Glu Lys Gly Ile Leu Asp Gly Val Ile Gly Ala 100 105 110 Thr Pro Pro His Leu Ser Leu Glu Arg Asp Lys Ser Val Ile Pro Trp 115 120 125 Tyr Asp Leu Val Ile Asp Ile Gly Ala Glu Ser Lys Glu Glu Ala Leu 130 135 140 Glu Leu Val Lys Pro Leu Asp Phe Ala Val Phe Lys Lys His Phe Ser 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Lys Tyr 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Asp Ala Asn Val Met Gln Ile 290 295 300 Asn Lys Glu Gly Val Ala Thr Ala Val Leu Ser Ile Pro Ile Arg Tyr 305 310 315 320 Met His Ser Gln Val Glu Leu Ala Asp Ala Arg Asp Val Asp Asn Thr 325 330 335 Ile Lys Leu Ala Lys Ala Leu Leu Glu Glu Leu Lys Pro Met Asp Phe 340 345 350 Thr Pro <210> 4 <211> 336 <212> PRT <213> PYROCOCCUS HORIKOSHII <400> 4 Met Glu Arg Ile Val Lys Ile Leu Arg Glu Ile Leu Glu Ile Pro Ser 1 5 10 15 Pro Thr Gly Tyr Thr Lys Glu Val Met Ser Tyr Leu Glu Lys Phe Leu 20 25 30 Lys Glu Asn Glu Val Asn Phe Tyr Tyr Thr Asn Lys Gly Ala Leu Ile 35 40 45 Ala Gly Asn His Pro Lys Pro Glu Leu Val Val Ile Ala His Val Asp 50 55 60 Thr Leu Gly Ala Met Val Lys Glu Ile Leu Pro Asp Gly His Leu Ala 65 70 75 80 Phe Ser Arg Ile Gly Gly Leu Val Leu Pro Thr Phe Glu Gly Glu Tyr 85 90 95 Cys Thr Ile Ile Thr Arg Lys Gly Lys Lys Phe Arg Gly Thr Leu Leu 100 105 110 Leu Arg Asn Pro Ser Ala His Val Asn Arg Glu Val Gly Lys Lys Glu 115 120 125 Arg Lys Glu Glu Asn Met Tyr Ile Arg Leu Asp Glu Leu Val Glu Lys 130 135 140 Arg Glu Asp Thr Glu Lys Leu Gly Ile Arg Pro Gly Asp Phe Ile Ala 145 150 155 160 Phe Asp Pro Lys Phe Glu Tyr Val Asn Gly Phe Val Lys Ser His Phe 165 170 175 Leu Asp Asp Lys Ala Ser Val Ala Ala Ile Leu Asp Leu Ile Ile Asp 180 185 190 Met Lys Asp Glu Leu Glu Lys Tyr Pro Val Ala Phe Phe Phe Ser Pro 195 200 205 Tyr Glu Glu Val Gly His Gly Gly Ser Ala Gly Tyr Pro Pro Thr Thr 210 215 220 Lys Glu Leu Leu Val Val Asp Met Gly Val Val Gly Glu Gly Val Ser 225 230 235 240 Gly Lys Glu Thr Ala Val Ser Ile Ala Ala Lys Asp Thr Thr Gly Pro 245 250 255 Tyr Asp Tyr Asp Met Thr Asn Arg Leu Ile Glu Leu Ala Glu Glu Asn 260 265 270 Asn Ile Pro Tyr Val Val Asp Val Phe Pro Tyr Tyr Gly Ser Asp Gly 275 280 285 Ser Ala Ala Leu Arg Ala Gly Trp Asp Phe Arg Val Ala Leu Ile Gly 290 295 300 Pro Gly Val His Ala Ser His Gly Met Glu Arg Thr His Val Lys Gly 305 310 315 320 Leu Leu Ala Thr Lys Glu Leu Ile Arg Ala Tyr Ile Lys Trp Lys Gly 325 330 335 <210> 5 <211> 350 <212> PRT <213> METHANOCALDOCOCCUS JANNASCHII <400> 5 Met Ser Val Val Glu Tyr Leu Lys Lys Leu Ser Lys Leu His Gly Ile 1 5 10 15 Ser Gly Arg Glu Asp Ser Val Arg Glu Phe Met Lys Lys Glu Leu Glu 20 25 30 Lys Tyr Cys Asp Ser Val Glu Ile Asp Asn Phe Gly Asn Leu Ile Ala 35 40 45 Lys Arg Gly Asn Lys Gly Lys Lys Ile Met Ile Ala Ala His Met Asp 50 55 60 Glu Ile Gly Leu Met Val Lys Tyr Ile Asp Asp Asn Gly Phe Leu Lys 65 70 75 80 Phe Thr Lys Ile Gly Gly Ile Tyr Asp Pro Thr Ile Leu Asn Gln Lys 85 90 95 Val Val Val His Gly Ser Lys Gly Asp Leu Ile Gly Val Leu Gly Ser 100 105 110 Lys Pro Pro His Arg Met Lys Glu Glu Glu Lys Thr Lys Ile Ile Lys 115 120 125 Tyr Glu Asp Met Phe Ile Asp Ile Gly Ala Glu Ser Arg Glu Glu Ala 130 135 140 Ile Glu Met Gly Val Asn Ile Gly Thr Trp Val Ser Phe Leu Ser Glu 145 150 155 160 Val Tyr Asp Leu Gly Lys Asn Arg Leu Thr Gly Lys Ala Phe Asp Asp 165 170 175 Arg Val Gly Cys Ala Val Leu Leu Glu Val Met Lys Arg Leu Ser Glu 180 185 190 Glu Asp Ile Asp Cys Gln Val Tyr Ala Val Gly Thr Val Gln Glu Glu 195 200 205 Val Gly Leu Lys Gly Ala Arg Val Ser Ala Phe Lys Ile Asn Pro Asp 210 215 220 Val Ala Ile Ala Leu Asp Val Thr Ile Ala Gly Asp His Pro Gly Ile 225 230 235 240 Lys Lys Glu Asp Ala Pro Val Asp Leu Gly Lys Gly Pro Val Val Gly 245 250 255 Ile Val Asp Ala Ser Gly Arg Gly Leu Ile Ala His Pro Lys Val Leu 260 265 270 Asp Met Ile Lys Ala Val Ser Glu Lys Tyr Lys Ile Asp Val Gln Trp 275 280 285 Glu Val Gly Glu Gly Gly Thr Thr Asp Ala Thr Ala Ile His Leu Thr 290 295 300 Arg Glu Gly Ile Pro Thr Gly Val Ile Ser Val Pro Ala Arg Tyr Ile 305 310 315 320 His Thr Pro Val Glu Val Ile Asp Lys Arg Asp Leu Glu Lys Thr Val 325 330 335 Glu Leu Val Tyr Asn Cys Ile Lys Glu Val Asn Asn Phe Phe 340 345 350 <210> 6 <211> 551 <212> PRT <213> GEOBACILLUS STEAROTHERMOPHILUS <400> 6 Met Lys Arg Lys Met Lys Met Lys Leu Val Arg Phe Gly Leu Ala Ala 1 5 10 15 Gly Leu Ala Ala Gln Val Phe Phe Leu Pro Tyr Asn Ala Leu Ala Ser 20 25 30 Thr Glu His Val Thr Trp Asn Gln Gln Phe Gln Thr Pro Gln Phe Ile 35 40 45 Ser Gly Asp Leu Leu Lys Val Asn Gly Thr Ser Pro Glu Glu Leu Val 50 55 60 Tyr Gln Tyr Val Glu Lys Asn Glu Asn Lys Phe Lys Phe His Glu Asn 65 70 75 80 Ala Lys Asp Thr Leu Gln Leu Lys Glu Lys Lys Asn Asp Asn Leu Gly 85 90 95 Phe Thr Phe Met Arg Phe Gln Gln Thr Tyr Lys Gly Ile Pro Val Phe 100 105 110 Gly Ala Val Val Thr Ala His Val Lys Asp Gly Thr Leu Thr Ala Leu 115 120 125 Ser Gly Thr Leu Ile Pro Asn Leu Asp Thr Lys Gly Ser Leu Lys Ser 130 135 140 Gly Lys Lys Leu Ser Glu Lys Gln Ala Arg Asp Ile Ala Glu Lys Asp 145 150 155 160 Leu Val Ala Asn Val Thr Lys Glu Val Pro Glu Tyr Glu Gln Gly Lys 165 170 175 Asp Thr Glu Phe Val Val Tyr Val Asn Gly Asp Glu Ala Ser Leu Ala 180 185 190 Tyr Val Val Asn Leu Asn Phe Leu Thr Pro Glu Pro Gly Asn Trp Leu 195 200 205 Tyr Ile Ile Asp Ala Val Asp Gly Lys Ile Leu Asn Lys Phe Asn Gln 210 215 220 Leu Asp Ala Ala Lys Pro Gly Asp Val Lys Ser Ile Thr Gly Thr Ser 225 230 235 240 Thr Val Gly Val Gly Arg Gly Val Leu Gly Asp Gln Lys Asn Ile Asn 245 250 255 Thr Thr Tyr Ser Thr Tyr Tyr Tyr Leu Gln Asp Asn Thr Arg Gly Asn 260 265 270 Gly Ile Phe Thr Tyr Asp Ala Lys Tyr Arg Thr Thr Leu Pro Gly Ser 275 280 285 Leu Trp Ala Asp Ala Asp Asn Gln Phe Phe Ala Ser Tyr Asp Ala Pro 290 295 300 Ala Val Asp Ala His Tyr Tyr Ala Gly Val Thr Tyr Asp Tyr Tyr Lys 305 310 315 320 Asn Val His Asn Arg Leu Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Ala Ala Ile Arg 325 330 335 Ser Ser Val His Tyr Ser Gln Gly Tyr Asn Asn Ala Phe Trp Asn Gly 340 345 350 Ser Gln Met Val Tyr Gly Asp Gly Asp Gly Gln Thr Phe Ile Pro Leu 355 360 365 Ser Gly Gly Ile Asp Val Val Ala His Glu Leu Thr His Ala Val Thr 370 375 380 Asp Tyr Thr Ala Gly Leu Ile Tyr Gln Asn Glu Ser Gly Ala Ile Asn 385 390 395 400 Glu Ala Ile Ser Asp Ile Phe Gly Thr Leu Val Glu Phe Tyr Ala Asn 405 410 415 Lys Asn Pro Asp Trp Glu Ile Gly Glu Asp Val Tyr Thr Pro Gly Ile 420 425 430 Ser Gly Asp Ser Leu Arg Ser Met Ser Asp Pro Ala Lys Tyr Gly Asp 435 440 445 Pro Asp His Tyr Ser Lys Arg Tyr Thr Gly Thr Gln Asp Asn Gly Gly 450 455 460 Val His Ile Asn Ser Gly Ile Ile Asn Lys 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<213> Artificial sequence <220> <223> synthetic peptide <400> 17 Leu Asn Glu Gly Phe Thr Glu Lys Gln Ser Val Ala Arg Ile Tyr 1 5 10 15

Claims (16)

  1. 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 하나 이상의 제2 아미노펩티다제를 포함하고,
    상기 제1 아미노펩티다제와 상기 제2 아미노펩티다제는 서로 다른 것이고,
    상기 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제는 극한 미생물 (extremophilic microorganisms)로부터 분리된 것이고,
    상기 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 (tetrahedral aminopeptidase) 또는 TET 아미노펩티다제 패밀리로부터 유래되는 아미노펩티다제이고,
    상기 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 40 중량%이고,
    상기 제1 아미노펩티다제 및 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3와 다를 경우, 상기 제1 아미노펩티다제는 조성물의 총 중량에 대해 최대 50 중량%인, 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 상기 하나 이상의 제2 아미노펩티다제가 PhTET1, PhTET2, PhTET3, PhTET4 및 MjTET로 이루어진 군으로부터 유래되는 아미노펩티다제로부터 선택되는, 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 아미노펩티다제가 서열번호 1 내지 서열번호 5의 각각의 서열의 아미노산 분자들 또는 아미노펩티다제 활성을 나타내는 단백질을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이로 구성되고,
    상기 단백질이 서열번호 1 내지 서열번호 5의 서열들 중 하나와 65% 이상 동일한 서열의 아미노산 분자들을 포함하거나, 이들로 필수적으로 구성되거나 또는 이들로 구성되는, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 아미노펩티다제가 상기 조성물의 총 중량에 대해 최대 10 중량%이고, 특히 상기 조성물의 총 중량에 대해 최대 5 중량%인, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 아미노펩티다제 및 상기 제2 아미노펩티다제가 PhTET2 및 PhTET3와 다른 것인 경우, 상기 제1 아미노펩티다제는 상기 조성물의 총 중량의 50 중량%인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    적어도 제3 아미노펩티다제를 포함하며,
    상기 제3 아미노펩티다제는 테트라헤드럴 아미노펩티다제 또는 TET 아미노펩티다제의 패밀리로부터 유래되는 아미노펩티다제인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 제1 아미노펩티다제, 제2 아미노펩티다제 및 제3 아미노펩티다제가 동일한 몰 비율 또는 실질적으로 동일한 몰 비율로 존재하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    엔도펩티다제, 특히 서몰리신 (thermolysin), 특히 서열번호 6의 서열의 서몰리신을 더 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 아미노펩티다제가 가교된 결정 형태 (crosslinked crystal form)인, 조성물.
  10. 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는 기질의 폴리펩타이드 함유물 (polypeptide content) 전체 또는 일부를 변형하기 위한, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물의, 용도.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 기질이 글루텐 및/또는 유청 (whey)의 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 적어도 포함하는, 용도.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서,
    상기 기질이 하기 단백질 중 하나 이상을 포함하는, 용도:
    글리아딘 (gliadin), β-락토글로불린, α-락트알부민, 면역글로불린, 혈청 알부민 및 락토페린.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아미노펩티다제들이 동시에 사용되거나, 분리하여 사용되거나 또는 경시적으로 확산 (spread over time)되는 방식으로 사용되는, 용도.
  14. 펩타이드, 폴리펩타이드 및/또는 단백질을 포함하는 기질의 폴리펩타이드 함유물 전체 또는 일부를 변형하는 방법으로서,
    - 상기 기질을,
    - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하며,
    상기 하나 이상의 제1 아미노펩티다제 및 상기 하나 이상의 제2 아미노펩티다제가 80℃ 이상의 온도에서 활성화될 수 있으며, 선택적으로 상기 접촉 단계 이전에 상기 기질의 폴리펩타이드를 변성시키는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제14항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있는 식품 화합물 (food compound).
  16. 하기 단백질들 중 하나 이상을 변형된 형태로 포함하며,
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 더 포함하는 식품 화합물:
    글리아딘, β-락토글로불린, α-락트알부민, 면역글로불린, 혈청 알부민 및 락토페린.
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