KR20200117523A - Memory impairment animal model, method for producing the same and uses thereof - Google Patents
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Abstract
Description
기억 장애 동물 모델, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.It relates to an animal model of memory impairment, a method of making and using the same.
인간의 기억 체계는 감각 기억, 단기 기억(작업 기억), 장기 기억으로 구분될 수 있으며, 장기 기억은 서술 기억(의미 기억, 일화 기억)과 비서술 기억(절차기억, 내재기억)으로 나눌 수 있다. 이때, 기억 장애란 전반적인 지적 능력은 비교적 정상 범위에서 유지되는 반면에, 다양한 의학적 원인 또는 심리적 요인에 의해 현저한 기억력 손상을 보이며 이로 인해 직업적, 사회적 기능에 심각한 지장을 초래하는 경우를 일컫는다.Human memory system can be divided into sensory memory, short-term memory (working memory), and long-term memory, and long-term memory can be divided into descriptive memory (meaning memory, anecdotal memory) and non-narrative memory (procedural memory, internal memory). . At this time, memory impairment refers to a case in which the overall intellectual ability is maintained within a relatively normal range, while the memory is significantly impaired due to various medical or psychological factors, which causes serious obstacles to professional and social functions.
한편, 기억 장애 증상을 나타내는 동물 모델로서 알츠하이머병과 관련된 유전자를 과발현시킨 동물 모델이 널리 통용되고 있으며, 아직까지 기억 장애에 대한 신경회로의 작동 기전 및 이를 조절하는 인자들에 대한 이해가 부족한 상황이다. 또한, 기억 장애를 유도하는데 관여하는 것으로 알려진 뇌 영역들로는 해마, 시상, 전두엽, 전뇌 등이 알려져 있으나, 관련 신경회로에서 작동하는 시냅스 수준에서의 기전에 대해서는 아직까지 알려진 바 없다. 따라서, 사회적으로 큰 문제가 되고 잇는 치매 및 이와 관련된 인지 장애 등의 치료제 개발에 큰 어려움을 겪고 있다(한국등록특허 제10-1948066호). On the other hand, as an animal model showing symptoms of memory impairment, an animal model that overexpresses a gene related to Alzheimer's disease is widely used, and there is still a lack of understanding of the mechanism of operation of neural circuits for memory impairment and factors that regulate it. In addition, the hippocampus, thalamus, frontal lobe, and forebrain are known as brain regions known to be involved in inducing memory impairment, but the mechanism at the synaptic level that operates in related neural circuits has not yet been known. Therefore, there is a great difficulty in the development of treatments such as dementia and cognitive disorders related thereto, which is a major social problem (Korean Patent No. 10-1948066).
이러한 기술적 배경 하에서, 기억 장애의 효과적인 치료를 위한 동물 모델 및 이를 이용한 새로운 기억 장애 치료제의 개발이 필요한 실정이다.Under this technical background, there is a need to develop an animal model for effective treatment of memory disorders and a new therapeutic agent for memory disorders using the same.
일 양상은 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 기억 장애 동물 모델을 제공하는 것이다. One aspect is to provide an animal model of memory impairment in which the expression or activity of Clstn3 gene or protein is suppressed.
다른 양상은 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는 기억 장애 동물 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. Another aspect is to provide a method of manufacturing an animal model of memory impairment comprising the step of inhibiting the expression or activity of the Clstn3 gene or protein.
또 다른 양상은 상기 기억 장애 동물 모델에 기억 장애의 후보약물을 투여하는 단계; 및 기억 장애 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 기억 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다. Another aspect is the steps of administering a candidate drug for memory impairment to the animal model of memory impairment; And it provides a screening method for a memory disorder treatment comprising the step of determining whether the symptoms of the memory disorder are alleviated.
일 양상은 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된 기억 장애 동물 모델을 제공한다. One aspect provides an animal model of memory impairment in which the expression or activity of the Clstn3 gene or protein is suppressed.
본 명세서에서 사용된, 용어 "기억 장애"는 새롭게 알게 된 사실을 기억하지 못하거나, 과거의 경험을 생각해내는 일이 어렵거나 불가능한 상태를 의미할 수 있다. 상기 기억 장애는 기억력 저하(memory decline) 또는 기억력 상실(memory impairment)을 포함할 수 있다. 구체적으로는, 상기 기억 장애는 경도 인지 장애(mild cognitive impairment), 건망증, 치매, 알코올로 유발되는 코르사코프 증후군(korsakoff syndrome), 해리성 기억 상실(dissociative amnesia), 간뇌성 기억 상실(diencephalic amnesia), 해마성 기억 상실(hippocampal amnesia), 국소적 기억 상실(localized amnesia), 선택적 기억 상실(selective amnesia), 일반적 기억 상실(generalized amnesia), 체계적 기억 상실(systemized amnesia), 지속적 기억 상실(continuous amnesia), 순행성 기억 상실(anterograde amnesia), 역행성 기억 상실(retrograde amnesia) 등일 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 기억 장애는 훈련 또는 경험에 의한 기억이 손실되는 장기 기억 장애를 의미할 수 있다.As used herein, the term "memory disorder" may refer to a state in which it is difficult or impossible to remember a newly discovered fact or to recall a past experience. The memory impairment may include memory decline or memory impairment. Specifically, the memory disorder is mild cognitive impairment, forgetfulness, dementia, alcohol-induced Korsakoff syndrome (korsakoff syndrome), dissociative memory loss (dissociative amnesia), diencephalic amnesia (diencephalic amnesia), Hippocampal amnesia, localized amnesia, selective amnesia, generalized amnesia, systemized amnesia, continuous amnesia, It can be anterograde amnesia, retrograde amnesia, and the like. More specifically, the memory disorder may mean a long-term memory disorder in which memory is lost due to training or experience.
본 명세서에서 사용된, 용어 "Clstn3 (Calsyntenin-3)"은 카테린 상과(cadherin superfamily)에 속하는 타입 I 막관통 단백질로서, 칼슘에 결합하는 능력에 기인하여 "칼신테닌"이라고 명명된다. 칼신테닌은 시냅스 후(postsynaptic) 칼슘 농도를 조절하는 것으로 보고된 바 있으나, Clstn3 단백질이 기억 장애 조절의 핵심 인자로 작용함에 대해서는 알려진 바가 없다. As used herein, the term "Clstn3 (Calsyntenin-3)" is a type I transmembrane protein belonging to the cadherin superfamily, and is named "calcintenin" due to its ability to bind to calcium. Calcintenin has been reported to regulate postsynaptic calcium concentration, but it is unknown that Clstn3 protein acts as a key factor in regulating memory impairment.
용어 "Clstn3 유전자의 또는 단백질의 발현 또는 활성이 억제된"은 Clstn3 유전자 또는 Clstn3 단백질의 기능이 저해 또는 방해되는 것을 의미한다. 이와 같은 저해 또는 방해는 Clstn3 유전자의 전사를 방해하거나, 또는 Clstn3 유전자의 mRNA의 번역을 저해함으로써 이루어질 수 있다. 또는 Clstn3 단백질의 활성 부위에 특이적으로 결합하거나, 단백질 구조 변형을 일으킴으로써, Clstn3 단백질의 활성을 감소 또는 불활성화시킬 수 있다. The term "inhibited the expression or activity of Clstn3 gene or protein" means that the function of Clstn3 gene or Clstn3 protein is inhibited or disturbed. Such inhibition or interference may be achieved by interfering with the transcription of the Clstn3 gene or inhibiting the translation of the mRNA of the Clstn3 gene. Alternatively, the activity of the Clstn3 protein may be reduced or inactivated by specifically binding to the active site of the Clstn3 protein or causing a protein structure modification.
일 구체예에 있어서, 상기 동물 모델은 해마의 추상 세포층(pyramidal cell layer) 또는 개재 뉴런(interneuron)의 Clstn3 유전자가 넉다운 (knock-down) 또는 넉아웃 (knock-out)된 것일 수 있다. 여기에서, 용어, "넉아웃"은 유전자의 결손이 유발된 DNA를 외부에서 도입하여 정상 유전자에 완전 불활성화를 유도하는 것을 의미하며, 용어, "넉다운"은 예를 들어, RNAi 등을 이용해서 발현하는 mRNA를 퇴화(degradation)시켜서 유전자 발현량을 줄이는 것을 의미한다.In one embodiment, the animal model may be a pyramidal cell layer of the hippocampus or a Clstn3 gene of an interneuron is knocked down or knocked out. Here, the term "knockout" refers to inducing complete inactivation of a normal gene by introducing the DNA from which the gene is defective, and the term "knockdown" refers to, for example, RNAi, etc. It means reducing the amount of gene expression by degrading the expressed mRNA.
상기 동물은 인간에게 나타나는 각종 질환을 지닌 동물로, 몇 세대를 요하는 장기간의 유전 연구나 직접 인간을 대상으로 실험이 어려운 장기이식 실험 등 인체 질환 규명과 치료법 개발에 사용되는 동물 모델에 해당할 수 있는 인간을 제외한 동물을 제한 없이 포함한다. 구체적으로, 마우스, 랫트, 모르모트, 원숭이, 개, 고양이, 토끼, 소, 양, 돼지, 및 염소로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다. 상기 동물 중 마우스는 번식능력, 발육능력, 및 환경 적응능력이 좋고 자손의 수가 많아 실험군에 속하는 개체 수를 많이 확보할 수 있어 믿을만한 결과를 얻을 수 있으며, 조작이 간편한 장점이 있다.The above animals are animals with various diseases that appear in humans, and may correspond to animal models used to identify human diseases and develop treatments, such as long-term genetic studies that require several generations or organ transplant experiments that are difficult to directly experiment with humans. Animals other than humans are included without limitation Specifically, it may be selected from the group consisting of mice, rats, mormots, monkeys, dogs, cats, rabbits, cows, sheep, pigs, and goats. Among the above animals, mice have good reproductive ability, development ability, and environmental adaptation ability, and have a large number of offspring, so that a large number of individuals belonging to the experimental group can be secured, so that reliable results can be obtained, and manipulation is easy.
일 실시예에 따르면, 해마 CA1 영역의 다양한 층의 흥분성 및 억제성 시냅스들을 각각 소포성 글루타메이트 수송체 1(VGLUT1: vesicular glutamate transporter 1) 및 글루타메이트 탈탄산 효소 67(GAD67: Glutamate decarboxylase 67) 또는 감마아미노뷰티르산 수용체 γ2(GABARγ2: gamma-aminobutyric acid receptor γ2)에 대한 항체로 표지하여, 흥분성 및 억제성 시냅스들의 강도를 정량화한 결과, 상기 동물 모델은 흥분성(excitatory) 시냅스가 저해되는 것이고, 소포성 글루타메이트 수송체 1(VGLUT1) 반점의 밀도가 감소되는 것임을 확인하였다.According to an embodiment, the excitatory and inhibitory synapses of various layers of the hippocampal CA1 region are respectively vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1) and glutamate decarboxylase 67 (GAD67: Glutamate decarboxylase 67) or gammaamino. As a result of quantifying the strength of excitatory and inhibitory synapses by labeling with an antibody against butyric acid receptor γ2 (GABARγ2: gamma-aminobutyric acid receptor γ2), the animal model shows that excitatory synapses are inhibited, vesicular glutamate It was confirmed that the density of transporter 1 (VGLUT1) spots was reduced.
일 실시예에 따르면, 상기 동물 모델은 오픈 필드 테스트, 고가식 십자 미로 테스트, 및 Y-미로 테스트를 통해 확인한 결과, 활동성, 불안 장애, 공간 인지 능력 등과 관련된 표현형에서는 변화가 없었으나, 신규 물체 인식 테스트를 통해 확인한 결과, 기억 장애, 특히 훈련 또는 경험에 의한 기억 장애 증상이 유발됨을 확인하였다.According to an embodiment, the animal model was confirmed through an open field test, a high-value cross maze test, and a Y-maze test, and as a result, there was no change in phenotypes related to activity, anxiety disorder, spatial cognitive ability, etc., but new object recognition As a result of checking through the test, it was confirmed that the symptoms of memory impairment, especially memory impairment caused by training or experience, were induced.
다른 양상은 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제시키는 단계를 포함하는 기억 장애 동물 모델을 제조하는 방법을 제공한다. Another aspect provides a method of preparing an animal model of memory impairment comprising the step of inhibiting the expression or activity of the Clstn3 gene or protein.
상기 기억 장애, Clstn3 유전자 또는 단백질, 및 동물의 종류 등에 대해서는 상기한 바와 같다. The memory disorder, Clstn3 gene or protein, and the type of animal are as described above.
상기 단계는 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성을 억제하는 물질을 이용하여 이루어질 수 있다. 상기 물질로는 Clstn3 유전자의 발현 또는 Clstn3 단백질의 활성을 감소 또는 방해하는 물질이라면, 화합물, 단백질, 아미노산, 펩티드, 바이러스, 탄수화물, 지질, 핵산 등 제한 없이 사용 가능하다.The above step may be performed using a substance that inhibits the expression or activity of the Clstn3 gene or protein. As the material, any material that reduces or interferes with the expression of the Clstn3 gene or the activity of the Clstn3 protein can be used without limitation, such as compounds, proteins, amino acids, peptides, viruses, carbohydrates, lipids, nucleic acids, and the like.
상기 Clstn3 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 mRNA의 번역을 억제하는 물질로서 저분자 화합물, 안티센스 핵산 서열의 제조나 RNAi 테크닉을 이용한 RNA, siRNA 또는 shRNA 등을 이용하는 것일 수 있다. 또한 상기 Clstn3 유전자의 발현을 억제하는 물질은 상기 Clstn3 유전자의 전사를 조절한다고 알려져 있는 프로모터, 인핸서 (enhancer), 또는 전사조절인자에 결합하는 단백질 또는 화합물을 이용하는 것일 수 있다. 구체적으로 상기 물질은 Clstn3 유전자 또는 그의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA), 두 가닥 RNA (double strand RNA) 및 마이크로 RNA (miRNA)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한, 구체적으로 Clstn3 단백질을 코딩하는 핵산에 대해 안티센스인 뉴클레오티드 분자를 저해제로 사용할 수 있다. '안티센스' 핵산은 Clstn3를 코딩하는 '센스' 핵산에 상보적인, 예를 들면 두 가닥 사슬 cDNA 분자의 코딩 가닥에 상보적이거나 mRNA 서열에 상보적인 핵산 서열을 포함할 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 전체 Clstn3 코딩 가닥 또는 단지 그들의 일부(예: 코딩영역)에 상보적일 수 있다. The substance that inhibits the expression of the Clstn3 gene may be a substance that suppresses the translation of the mRNA, and may be one using RNA, siRNA, or shRNA using RNAi techniques, preparation of a low molecular weight compound, an antisense nucleic acid sequence, or the like. In addition, the substance that suppresses the expression of the Clstn3 gene may be one using a promoter, an enhancer, or a protein or compound that binds to a transcriptional regulator known to regulate the transcription of the Clstn3 gene. Specifically, the substance is an antisense nucleotide complementary to the Clstn3 gene or its mRNA, a short interfering RNA, a short hairpin RNA, a double strand RNA, and a micro RNA. ) It may be one or more selected from the group consisting of. Further, specifically, a nucleotide molecule that is antisense against a nucleic acid encoding a Clstn3 protein may be used as an inhibitor. The'antisense' nucleic acid may comprise a nucleic acid sequence that is complementary to the'sense' nucleic acid encoding Clstn3, for example complementary to the coding strand of a two-stranded cDNA molecule or complementary to an mRNA sequence. The antisense nucleic acid may be complementary to the entire Clstn3 coding strand or only a portion of them (eg, a coding region).
Clstn3 단백질의 활성을 억제하는 물질은 예를 들면 Clstn3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 그의 항원 결합 특성을 갖는 항체 단편 및 그의 결합 활성을 갖는 폴리펩티드로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 또한 상기 물질은 Clstn3 단백질에 상보적으로 결합하는 앱타머, 화합물, 펩티드, 또는 펩티드 미메틱스를 포함할 수 있다. The substance that inhibits the activity of the Clstn3 protein may be, for example, one or more selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to the Clstn3 protein, an antibody fragment having its antigen-binding property, and a polypeptide having its binding activity. In addition, the material may include an aptamer, a compound, a peptide, or a peptide mimetics that complementarily bind to Clstn3 protein.
상기 항체는 Clstn3의 주입을 통해 제조된 것 또는 시판되어 구입한 것 모두 사용 가능하다. 또한, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 에피토프와 결합할 수 있는 단편 등을 포함할 수 있다. 다클론 항체는 상기 Clstn3을 동물에 주사하고 해당 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 종래의 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 당업계에 알려진 어떠한 방법에 의해서든 정제될 수 있고, 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 만들어질 수 있다. 또한 상기 단클론 항체 또는 에피토프와 결합할 수 있는 단편 모두 당해 기술 분야에서 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다.The antibody may be prepared through injection of Clstn3 or purchased from the market. In addition, the antibody may include a polyclonal antibody, a monoclonal antibody, and a fragment capable of binding to an epitope. The polyclonal antibody can be produced by a conventional method of injecting Clstn3 into an animal and collecting blood from the animal to obtain a serum containing the antibody. Such polyclonal antibodies can be purified by any method known in the art, and can be made from any animal species host, such as goat, rabbit, sheep, monkey, horse, pig, cow, dog, etc. In addition, all of the monoclonal antibodies or fragments capable of binding to the epitope can be produced by methods known in the art.
일 구체예에 있어서, 상기 단계는 해마 추상 세포층(pyramidal cell layer) 또는 개재 뉴런(interneuron)의 Clstn3 유전자를 넉다운 또는 넉아웃시키는 것일 수 있다. 상기 단계에서는 Clstn3 유전자의 완전 불활성화 또는 발현량을 줄일 수 있다면, 당업계에 이미 알려져 다양한 기술 또는 방법이 적용될 수 있다. In one embodiment, the step may be to knock down or knock out the Clstn3 gene of a hippocampal abstract cell layer or interneuron. In the above step, if it is possible to completely inactivate the Clstn3 gene or reduce the expression level, various techniques or methods known in the art may be applied.
또 다른 양상은 상기 기억 장애 동물 모델에 기억 장애의 후보약물을 투여하는 단계; 및 기억 장애 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 기억 장애 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. Another aspect is the steps of administering a candidate drug for memory impairment to the animal model of memory impairment; And it provides a screening method for a memory disorder treatment comprising the step of determining whether the symptoms of the memory disorder are alleviated.
본 발명에서 "후보약물"은 새롭게 합성된 또는 공지된 화합물로, 기억 장애의 예방 또는 치료에 효과를 나타낼 것으로 기대되는 물질을 제한 없이 포함할 수 있다. In the present invention, the "candidate drug" is a newly synthesized or known compound, and may include, without limitation, substances expected to exhibit an effect on the prevention or treatment of memory disorders.
상기 후보약물을 투여하여 기억 장애의 증상의 완화가 관찰된다면 해당 후보약물이 기억 장애의 예방 또는 치료에 효과가 있는 물질로 판단할 수 있다.If alleviation of symptoms of memory disorder is observed by administering the candidate drug, it can be determined that the candidate drug is effective in preventing or treating memory disorder.
상기 후보약물의 "투여"는 적절한 방법으로 개체에 소정의 물질을 도입하는 것을 의미한다. 상기 후보약물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내, 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다."Administration" of the candidate drug means introducing a given substance into a subject in an appropriate manner. The administration route of the candidate drug may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue. Intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, topical administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, and rectal administration may be administered, but are not limited thereto.
상기 스크리닝 방법에서, 기억 장애 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 방법, 예컨대 상기 기억 장애 동물 모델의 혈액 중 기억 장애 관련 표지의 농도의 측정, 뇌파 (EEG, Electroencephalogram) 분석, 신규 물체 인식 테스트(Novel object recognition test), 또는 이들의 조합에 의해 수행될 수 있다.In the screening method, the step of determining whether symptoms of memory impairment are alleviated include methods known in the art, such as measurement of the concentration of a marker related to memory impairment in the blood of the memory impairment animal model, electroencephalogram (EEG) analysis, It may be performed by a novel object recognition test, or a combination thereof.
또 다른 양상은 Clstn3 유전자 또는 이의 단백질의 발현 또는 활성을 측정하는 제제를 포함하는 기억 장애 진단용 조성물, 그를 포함하는 기억 장애 진단용 키트, 및 기억 장애의 진단을 위한 정보제공방법을 제공한다. Another aspect provides a composition for diagnosing memory disorders comprising an agent measuring the expression or activity of Clstn3 gene or protein thereof, a kit for diagnosing memory disorders comprising the same, and a method of providing information for diagnosis of memory disorders.
본 명세서에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 기억 장애의 발병 여부 또는 발병 가능성 여부를 확인하는 것을 포함하는 의미일 수 있다.In the present specification, the term "diagnosis" refers to confirming the presence or characteristics of a pathological condition, and may mean to confirm whether or not a memory disorder is onset or a possibility of onset.
일 양상에 따른 기억 장애 동물 모델은 활동성 및 불안 장애와 관련된 표현형의 변화 없이, 기억 장애 증상만을 특이적으로 유발시킬 수 있으므로, 기억 장애 치료제의 개발 및 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.The animal model for memory impairment according to an aspect can specifically induce only symptoms of memory impairment without changes in phenotypes associated with activity and anxiety disorders, and thus may be usefully used in the development and screening of memory disorder therapeutics.
도 1은 Clstn3 넉아웃(Clstn3-KO) 마우스를 제작 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 마우스 뇌에서의 Clstn3 발현 양상을 분석하기 위한, Clstn3-특이적 프로브를 이용한 RNAscope-기반의 현장(in situ) 혼성화 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 Clstn3-KO 마우스, 및 대조군 한배 새끼(littermates) 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)의 출생률 및 체중의 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Clstn3-KO 마우스, 및 대조군 한배 새끼(littermates) 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)의 Nissl 염색에 의해 평가되는 육안에 의한 형태, 및 NeuN 염색에 의해 평가되는 뉴런 수 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Nestin-Cre; Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f 및 Clstn3 tm1a/tm1a 마우스의, 해마 CA1 영역의 다양한 층의 흥분성 및 억제성 시냅스들을 소포성 글루타메이트 수송체 1(VGLUT1: vesicular glutamate transporter 1)에 대한 항체로 표지하여, 흥분성 및 억제성 시냅스들의 강도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 Nestin-Cre; Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f 및 Clstn3 tm1a/tm1a 마우스의, 해마 CA1 영역의 다양한 층의 흥분성 및 억제성 시냅스들을 글루타메이트 탈탄산 효소 67(GAD67: Glutamate decarboxylase 67) 또는 감마아미노뷰티르산 수용체 γ2(GABARγ2: gamma-aminobutyric acid receptor γ2)에 대한 항체로 표지하여, 흥분성 및 억제성 시냅스들의 강도를 정량화한 결과를 나타낸 것이다
도 7은 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl), 및 Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )의 오픈 필드 테스트(Open field test)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl), 및 Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )의 고가식 십자 미로 테스트(elevated-plus maze test)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl), 및 Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )의 Y-미로 테스트(Y-maze test)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl), 및 Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )의 신규 물체 인식 테스트(Novel object recognition test)를 수행한 결과를 나타낸 것이다.1 shows the manufacturing process of Clstn3 knockout (Clstn3-KO) mice.
2 is for analyzing the Clstn3 expression pattern in the mouse brain,Clstn3-RNAscope-based field using specific probes (in situ) It shows the result of hybridization analysis.
3 shows Clstn3-KO mice, and control littermates mice (Clstn3 f/f ; Ctrl) shows the comparison result of birth rate and weight.
Figure 4 shows Clstn3-KO mice, and control littermates mice (Clstn3 f/f ; Ctrl) of the morphology evaluated by Nissl staining and the number of neurons evaluated by NeuN staining are compared.
5 is Nestin-Cre;Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f AndClstn3 tm1a/tm1a The excitatory and inhibitory synapses of various layers of the hippocampus CA1 region of the mouse were labeled with an antibody against vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1), and the results of quantifying the strength of the excitatory and inhibitory synapses were shown. will be.
6 is Nestin-Cre;Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f AndClstn3 tm1a/tm1a In mice, the excitatory and inhibitory synapses of various layers of the hippocampal CA1 region were labeled with an antibody against glutamate decarboxylase 67 (GAD67: Glutamate decarboxylase 67) or gamma aminobutyric acid receptor γ2 (GABARγ2: gamma-aminobutyric acid receptor γ2). Thus, it shows the results of quantifying the strength of excitatory and inhibitory synapses.
7 is a control mouse (Clstn3 f/f ; Ctrl), and Clstn3-KO Mouse (CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f ) Shows the result of the open field test.
8 is a control mouse (Clstn3 f/f ; Ctrl), and Clstn3-KO Mouse (CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f ) Shows the result of performing the elevated-plus maze test.
9 is a control mouse (Clstn3 f/f ; Ctrl), and Clstn3-KO Mouse (CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f ) Shows the results of the Y-maze test.
10 is a control mouse (Clstn3 f/f ; Ctrl), and Clstn3-KO Mouse (CaMKIIα-Cre;Clstn3 f/f ) Of the new object recognition test (Novel object recognition test).
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.
실시예 1. Clstn3 넉아웃(Clstn3-KO) 마우스 제작Example 1. Clstn3 knockout (Clstn3-KO) mouse production
1-1. 마우스 준비1-1. Mouse preparation
Clstn3 tm1a(EUCOMM)Hmgu 마우스는 유럽 유전자 변형 마우스 컨소시움(EUCOMM: European Mouse Mutagenesis Consortium)으로부터 수득하여 제작하였다. 조건부 Clstn3 넉아웃 마우스(Clsnt3 flox/flox )를 제작하기 위해, C57BL/6J 백그라운드의 Clsnt3 tm1a/tm1a 마우스는 Clsnt3 tmc1c/tm1c 를 제작하기 위한 FLPO 재조합효소 드라이버 마우스(driver mice) [C57BL/6N-Tg(CAG-Flpo)1Afst/Mmucd, MMRRC]로서 먼저 사육하였다. C57BL/6J 유전적 백그라운드 하의 수컷 동형 Clsnt3 tmc1c/tm1c 마우스는 Cre 이식 유전자를 가진 암컷 이형 Clsnt3 tm1c/+ 마우스(Nestin 및 CaMKIIα 조건부)와 교배하였다. 마우스는 대구 경북 과학 기술원(DGIST)의 동물 시설에서 사육하고, 이들의 실험적 용도는 DGIST의 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee of DGIST)에 의해 승인되었다. Clstn3 tm1a(EUCOMM)Hmgu Mice were produced and obtained from European Mouse Mutagenesis Consortium (EUCOMM). To produce conditional Clstn3 knockout mice ( Clsnt3 flox/flox ), Clsnt3 tm1a/tm1a mice with C57BL/6J background were FLPO recombinase driver mice for producing Clsnt3 tmc1c/tm1c [C57BL/6N-Tg (CAG-Flpo)1Afst/Mmucd, MMRRC] was bred first. Male isotype Clsnt3 tmc1c/tm1c under C57BL/6J genetic background Mice were female heterogeneous Clsnt3 tm1c/+ with Cre transgene Mice (conditional Nestin and CaMKIIα) were crossed. Mice are reared in the animal facility of Daegu Gyeongbuk Institute of Science and Technology (DGIST), and their experimental use was approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of DGIST.
1-2. Clstn3-KO 마우스 제작1-2. Clstn3-KO mouse fabrication
Clstn3 넉아웃(Clstn3-KO) 마우스를 제작 과정을 도 1에 나타내었다. 구체적으로, FRT, lacZ, 및 loxP 사이트를 포함하는 타겟팅 카세트가 엑손 7 및 엑손 8 사이에 삽입되어, 조건부 잠재성을 갖는 lacZ-reporter-tagged Clstn3 tm1a 삽입 대립 유전자가 먼저 넉아웃된 Clstn3 tm1a(EUCOMM)Hmgu 마우스(Clstn3 tm1a/tm1a )를 이용하였다. 이후, 상기 Clstn3 tm1a/tm1a 를 오염시키는 이식 유전자 및 네오마이신 내성 카세트를 제거하기 위해, FLPe 넉-인(knock-in) 균주와 교배하여, Clstn3 tm1c(EUCOMM)Hmgu 마우스를 제작하였다. 이후, Cre 드라이버 마우스 주와 추가로 교배하였다. Cre 드라이버 마우스 주를 결정하기 전에, 마우스 뇌에서의 Clstn3 발현 양상을 분석하기 위해, Clstn3-특이적 프로브를 이용한 RNAscope-기반의 현장(in situ) 혼성화 분석을 수행하였다. 그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, Clstn3 mRNA는 마우스 해마의 추상 세포층(pyramidal cell layer) 및 개재 뉴런(interneuron)에서 강하게 검출되었다. 특히, CA3 영역에서의 추상 세포층에서의 Clstn3 발현이 두드러지게 나타났다. Clstn3 mRNA는 또한 해마의 파르브알부민(PV)-및 소마토스타틴-양성 GABA성 내재 뉴런에서 발현되었다. 또한, Clsnt3-특이적 항체(JK091)를 이용한 면역형광 분석 결과, Clstn3 단백질의 발현 양상은 해마에서의 Clstn3 mRNA 발현 양상과 유사함을 나타낸다. 상기 결과들을 기초로 하여, Clstn3-KO 마우스를 제작하기 위해, Nestin-Cre(Nestin-Clstn3) 또는 CaMKIIα-Cre(CaMKIIα-Clstn3) 드라이버 마우스를 선택하여 Clstn3 tm1c(EUCOMM)Hmgu 마우스와 교배시켰다. Fig. 1 shows the manufacturing process of Clstn3 knockout (Clstn3-KO) mice. Specifically, a targeting cassette containing FRT, lacZ, and loxP sites is inserted between exon 7 and
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, Clstn3-KO 마우스는 전반적으로 출생률 및 체중에 있어, 대조군인 한배 새끼(littermates) 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)와 비교하여 구별되지 않는다. 또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, Nissl 염색에 의해 평가되는 육안에 의한 형태, 및 NeuN 염색에 의해 평가되는 뉴런 수를 확인한 결과, Clstn3-KO 마우스는 대조군 한배 새끼 마우스와 유사한 형태 및 뉴런 수를 나타내었다.As a result, as shown in Figure 3, Clstn3-KO mice in terms of overall birth rate and body weight, compared with the control littermates mice ( Clstn3 f/f ; Ctrl) are not distinguished. In addition, as shown in FIG. 4, as a result of confirming the visual morphology evaluated by Nissl staining and the number of neurons evaluated by NeuN staining, Clstn3-KO mice showed similar morphology and number of neurons to control litter mice. Done.
실시예 2. Clstn3-KO 마우스의 흥분성 및 억제성 시냅스에 대한 효과 확인Example 2. Confirmation of the effect on excitatory and inhibitory synapses of Clstn3-KO mice
상기 실시예 1에서 제작된 Nestin-Cre; Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f 및 Clstn3 tm1a/tm1a 마우스를 이용하여, Clstn-KO에 따른 해마 CA1 영역의 다양한 층의 흥분성 및 억제성 시냅스들의 강도에 미치는 효과를 확인하기 위해 면역화학 분석법을 수행하였다. 이때, 흥분성 및 억제성 시냅스들은 각각 소포성 글루타메이트 수송체 1(VGLUT1: vesicular glutamate transporter 1) 및 글루타메이트 탈탄산 효소 67(GAD67: Glutamate decarboxylase 67) 또는 감마아미노뷰티르산 수용체 γ2(GABARγ2: gamma-aminobutyric acid receptor γ2)에 대한 항체로 표지하여, 흥분성 및 억제성 시냅스들의 강도를 정량화하였다.Nestin-Cre produced in Example 1; Clstn3 f/f , CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f And Clstn3 tm1a/tm1a Using mice, immunochemical analysis was performed to confirm the effect of Clstn-KO on the strength of excitatory and inhibitory synapses of various layers of the hippocampal CA1 region. At this time, the excitatory and inhibitory synapses are vesicular glutamate transporter 1 (VGLUT1: vesicular glutamate transporter 1) and glutamate decarboxylase 67 (GAD67: Glutamate decarboxylase 67) or gamma aminobutyric acid receptor γ2 (GABARγ2: gamma-aminobutyric acid), respectively. receptor γ2), the intensity of excitatory and inhibitory synapses was quantified.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, 해마 CA1 영역의 관찰된 모든 층(stratum oriens [S. oriens] 및 strarum radiatum [S. radiatum])에서, 대조군 Clstn3 tm1a/tm1a 마우스와 비교하여, Clstn3 조건부 넉아웃 Nestin-Cre; Clstn3 f/f 및 CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f 마우스 모두에서 VGLUT1 반점의 강도가 유의적으로 감소된 것으로 나타났다. 반대로, 도 6에 나타낸 바와 같이, 해마 CA1 영역의 관찰된 모든 층(stratum oriens [S. oriens] 및 strarum radiatum [S. radiatum])에서, GAD67 및 GABARγ2 반점의 강도는 차이가 없었다. As a result, as shown in Fig. 5, in all observed layers (stratum oriens [ S. oriens ] and strarum radiatum [ S. radiatum ]) of the hippocampal CA1 region, the control Clstn3 tm1a/tm1a Compared to mice, Clstn3 conditional knockout Nestin-Cre; Clstn3 f/f and CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f It was found that the intensity of the VGLUT1 spot was significantly reduced in all mice. Conversely, as shown in FIG. 6, in all observed layers of the hippocampal CA1 region (stratum oriens [ S. oriens ] and strarum radiatum [ S. radiatum ]), the intensity of GAD67 and GABARγ2 spots did not differ.
상기 결과로부터, Clstn3은 해마 CA1 추상 뉴런에서 억제성 시냅스가 아니라, 흥분성 시냅스의 전개에 특별히 요구되는 것임을 알 수 있다.From the above results, it can be seen that Clstn3 is not an inhibitory synapse in the hippocampal CA1 abstract neuron, but is specifically required for the development of an excitatory synapse.
실시예 3. Clstn3-KO 마우스의 기억 장애 특이적 행동 결과 확인Example 3. Confirmation of specific behavioral results of memory impairment in Clstn3-KO mice
3-1. 오픈 필드 테스트3-1. Open field test
Clstn 유전자의 넉아웃에 의한 활동성(locomotor activity) 변화를 확인하기 위하여, 오픈 필드 테스트(Open field test)를 수행하였다. In order to confirm the change in locomotor activity due to knockout of the Clstn gene, an open field test was performed.
구체적으로, 마우스를 흰색의 아크릴로 된, 오픈 필드 테스트를 위한 상자(가로 40cm, 세로 40cm, 높이 40cm)에 놓았다. 이후, 0 lux의 어둠 속에서 60분 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 실험 시간 동안 움직인 총 거리와 중심 부위(center zone)에서 머문 시간을 평면-시점(top-view) 적외선 카메라로 기록하고, EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)를 사용하여 분석하였다. 마우스는 우울함의 수준이 감소하면 탐색 행동이 증가하게 되며, 우울함이 증가하면 운동 능력이 떨어지게 되어 오픈 필드에서 벽면에 가까이 머물러있게 된다.Specifically, the mouse was placed in a white acrylic box for open field testing (40 cm wide, 40 cm long, 40 cm high). Then, it was allowed to move freely for 60 minutes in the dark of 0 lux. The total distance traveled during the experiment and the time spent in the center zone were recorded with a top-view infrared camera and analyzed using
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)와 비교하여, Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )는 활동성에 있어 유의적인 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.As a result, as shown in Figure 7, compared with the control mouse ( Clstn3 f/f ; Ctrl), Clstn3-KO It was confirmed that mice (CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f ) did not show a significant difference in activity.
3-2. 고가식 십자 미로 테스트3-2. Elevated cross maze test
Clstn 유전자의 넉아웃에 의한 불안-유사 행동(anxiety-like behavior) 변화를 확인하기 위하여, 고가식 십자 미로 테스트(elevated-plus maze test)를 수행하였다. In order to confirm the change of anxiety-like behavior due to knockout of the Clstn gene, an elevated-plus maze test was performed.
구체적으로, 마우스가 임의로 내려올 수 없도록 지면으로부터 75cm 높이에 지면과 수평하게 십자형 미로를 설치하였다. 흰색의 아크릴로 된 십자의 각 팔(arm)은 마우스가 움직일 수 있는 통로로 이용되며, 각각 폭 5 cm, 길이 30 cm의 형태이다. 이 중 마주 보는 한 쌍의 팔에는 높이 30cm의 벽을 설치하여 패쇄된 팔(closed arm: CA)로, 나머지 마주 보는 한 쌍의 팔은 개방된 팔(open arm: OA)로 만들어졌다. 개방된 팔은 약 300 lux, 폐쇄된 팔은 약 30 lux로 각각 빛을 비추었다. 테스트를 위해 마우스는 고가식 십자 미로의 중앙에 놓았으며, 10분 동안 자유롭게 움직이게 하였다. 모든 행동은 평면-시점 적외선 카메라로 기록하였다. 각 팔에서 머문 시간, 각 팔의 진입 횟수를 측정하며, EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)을 사용하여 분석하였다. 상기 머문 시간과 진입 횟수는 실험쥐의 불안 행동에 대한 지표가 되었고, 결과적으로 마우스가 상기 측정 결과에서 폐쇄된 팔에 머문 시간과 진입 횟수가 클수록 해당 마우스가 불안을 많이 느끼는 것으로 평가하였다.Specifically, a cross-shaped maze was installed horizontally with the ground at a height of 75 cm from the ground so that the mouse could not descend arbitrarily. Each arm of the white acrylic cross is used as a passage through which the mouse can move, and is 5 cm wide and 30 cm long. Among them, a wall of 30cm in height was installed on the pair of arms facing each other to form a closed arm (CA), and the other pair of arms facing each other was made as an open arm (OA). The open arm is about 300 lux and the closed arm is about 30 lux, respectively. For testing, the mice were placed in the center of an elevated cross maze and allowed to move freely for 10 minutes. All actions were recorded with a flat-view infrared camera. The time spent in each arm and the number of entry into each arm were measured, and analyzed using
그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)와 비교하여, Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )는 불안-유사 행동에 있어 유의적인 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 8, compared with the control mouse ( Clstn3 f/f ; Ctrl), Clstn3-KO It was confirmed that mice (CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f ) did not show a significant difference in anxiety-like behavior.
3-3. Y-미로 테스트3-3. Y-maze test
Clstn 유전자의 넉아웃에 의한 공간 인지 능력(spatial working memory) 변화를 확인하기 위하여, Y-미로 테스트(Y-maze test)를 수행하였다. In order to confirm the change in spatial working memory due to knockout of the Clstn gene, a Y-maze test was performed.
구체적으로, Y자형의 흰색 아크릴 미로를 준비하였다. Y자형의 각 팔은 40cm길이로, 3개의 팔이 각각 120°의 각도로 분리된 형태이다. 마우스는 미로의 중앙에 놓여지며, 8분동안 자유롭게 움직이게 하였다. 마우스의 네 다리가 모두 팔의 안으로 진입할 때마다 그 숫자를 카운트 하였다. 마우스의 움직임은 평면-시점 적외선 카메라로 녹화되며, EthoVision XT 10 소프트웨어(Noldus)를 사용하여 분석되었다. 마우스는 일반적으로 이전에 들어갔던 팔로 가기보다는 미로의 새로운 팔을 탐험하려는 경향이 있다. 따라서, 마우스가 이전에 들어갔던 팔로 다시 들어갈수록 공간 인지 능력이 감소한 것으로 평가하였다.Specifically, a Y-shaped white acrylic maze was prepared. Each Y-shaped arm is 40cm long, and the three arms are separated at an angle of 120° each. The mouse was placed in the center of the maze and allowed to move freely for 8 minutes. Whenever all four legs of the mouse entered the arm, the number was counted. Mouse movements were recorded with a flat-view infrared camera and analyzed using
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)와 비교하여, Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )는 공간 인지 능력에 있어 유의적인 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 9, compared to the control mouse ( Clstn3 f/f ; Ctrl), Clstn3-KO It was confirmed that mice (CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f ) did not show a significant difference in spatial cognitive ability.
3-4. 신규 물체 인식 테스트3-4. New object recognition test
Clstn 유전자의 넉아웃에 의한 기억 장애 유발 효과를 확인하기 위하여, 신규 물체 인식 테스트(novel object recognition test)를 수행하였다. In order to confirm the effect of inducing memory impairment by knockout of the Clstn gene, a novel object recognition test was performed.
구체적으로, 신규 물체 인식 테스트는 적응기, 탐색기 및 신규물체 인식기로 이루어져 있다. 이틀간 마우스를 10분씩 흰색 아크릴로 만들어진 상자 안에 넣고 적응을 시킨 후, 두 개의 동일한 물체를 일정한 간격으로 설치한다. 마우스를 3분간 자유롭게 탐색하도록 하며 각 물체에서 머무르는 시간을 측정하였다. 30분 후, 설치한 물체 중 하나를 신규 물체로 대체하고 마우스의 움직임을 3분 동안 측정하였다. 물체의 선호도는 전체 탐색한 시간 중에서 각 물체에 머무르는 시간을 EthoVision으로 분석하였다.Specifically, the new object recognition test consists of an adaptor, a searcher, and a new object recognizer. For two days, the mouse is placed in a box made of white acrylic for 10 minutes to acclimate, and then two identical objects are placed at regular intervals. The mouse was allowed to navigate freely for 3 minutes, and the dwell time in each object was measured. After 30 minutes, one of the installed objects was replaced with a new object, and the movement of the mouse was measured for 3 minutes. The preference of objects was analyzed by EthoVision to determine the time spent at each object among the total search time.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 훈련 단계(training phase)에서는 O1 및 O2를 모두 신규 물체로 인식하므로, 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl), 및 Clstn3-KO 마우스(CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f )는 O1 및 O2 인식에 필요한 시간에 있어 차이를 나타내지 않음을 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 10, since both O1 and O2 are recognized as new objects in the training phase, the control mice ( Clstn3 f/f ; Ctrl), and Clstn3-KO It was confirmed that mice (CaMKIIα-Cre; Clstn3 f/f ) did not show a difference in the time required for O1 and O2 recognition.
24시간 후의 시험 단계(testing phase)에서는, 대조군 마우스(Clstn3 f/f ; Ctrl)는, 기존 물체(O1)의 인식에 필요한 시간 보다, 신규 물체(O3)의 인식에 필요한 시간이 유의적으로 더 길게 필요한 것을 확인할 수 있으며, 이를 통해, 대조군 마우스는 경험에 의해 기존 물체(O1)을 기억하는 능력을 가짐을 확인할 수 있다. In the testing phase after 24 hours, the control mice ( Clstn3 f/f ; Ctrl) had significantly more time required to recognize a new object (O3) than the time required to recognize the existing object (O1). It can be confirmed that what is needed for a long time, through this, it can be confirmed that the control mouse has the ability to remember the existing object (O1) by experience.
그러나, 이와 달리, Clstn3 넉아웃 Nestin-Cre; Clstn3 f/f 마우스는 기존 물체(O1)의 인식에 필요한 시간과 신규 물체(O3)의 인식에 필요한 시간에 있어 유의적인 차이가 나타나지 않음을 확인할 수 있으며, 이를 통해, Clstn 넉아웃 마우스는 기존 물체(O1)을 기억하는 능력을 상실했음을 확인할 수 있다.However, in contrast to the Clstn3 knockout Nestin-Cre; It can be seen that the Clstn3 f/f mouse does not show a significant difference between the time required to recognize the existing object (O1) and the time required to recognize the new object (O3).Through this, the Clstn knockout mouse is an existing object. It can be seen that the ability to remember (O1) has been lost.
상기 결과를 종합해보면, 본 발명의 동물 모델은 행동학적으로 활동성, 공간지각 능력, 불안과 같은 다른 표현형에는 영향을 미치지 않으나, 기억 장애(특히, 경험 또는 훈련에 의한 기억 장애)가 유발됨을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 동물 모델은 Clstn3 유전자 또는 단백질의 발현 또는 활성의 억제를 통한, 기억 장애 동물 모델을 구축할 수 있다.Taking the above results together, it can be seen that the animal model of the present invention behaviorally does not affect other phenotypes such as activity, spatial perception, and anxiety, but memory disorders (in particular, memory disorders due to experience or training) are induced. have. Accordingly, the animal model of the present invention can construct a memory disorder animal model through inhibition of the expression or activity of Clstn3 gene or protein.
Claims (10)
기억 장애 증상이 완화되는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 기억 장애 치료제의 스크리닝 방법.Administering a candidate drug for memory disorder to the animal model of memory disorder of claim 1; And
A method of screening for a therapeutic agent for memory disorder comprising the step of determining whether symptoms of memory disorder are relieved.
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| X091 | Application refused [patent] | ||
| AMND | Amendment | ||
| X701 | Decision to grant (after re-examination) |