KR20200112073A

KR20200112073A - 종양 미세환경 감응형 나노복합체 및 이를 포함하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20200112073A
Application number: KR1020190031978A
Authority: KR
Inventors: 박인규; 산토쉬; 이용규; 비슈누
Original assignee: 한국교통대학교산학협력단; 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-03-20
Filing date: 2019-03-20
Publication date: 2020-10-05
Also published as: US20200297759A1; KR102184111B1; US11185559B2

Abstract

본 발명의 다양한 실시예에서는, 종양 미세환경을 재프로그램하여 항종양 치료에 대한 새로운 패러다임을 제시할 수 있는 종양 미세환경 감응형 나노복합체 및 이를 포함하는 항암용 조성물을 제공하고자 한다.

Description

종양 미세환경 감응형 나노복합체 및 이를 포함하는 항암용 조성물{Tumor microenvironment-responsive Nanocomplex and anticancer composition comprising the same}

본 발명의 다양한 실시예는 종양 미세환경 감응형 나노복합체 및 이를 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.

암이 전 세계적으로 사망율의 주요 원인 중 하나임에도 불구하고 대부분은 악성 종양 치료를 위한 기존의 방사선 요법, 화학 요법 및 기타 수술 매개 기술에 의존하고 있다. 암세포는 정상 세포에 비해 비정상적인 신진 대사를 나타내어 종양 형성 및 진행에 도움이 되는 미세환경을 만들어낸다. 암세포는 인접한 간질 세포와 소통하고 생존, 성장 및 전이를 촉진하기 위해 주변 조직의 세포 및 분자 이벤트를 조율하여 종양 미세환경 (tumor microenvironment, TME)에서 진화한다. TME의 중요성을 이해하면 암 세포를 죽일 뿐만 아니라 TMEs를 손상 시키거나 재프로그램 할 수 있는 효율적인 치료 기술을 개발할 수 있다.

한편, 종양 저산소증(Tumor hypoxia)은 과다 증식 암 세포를 둘러싼 왜곡된 종양 혈관 구조로 인해 대부분의 고형 종양 주위에 생체 외 산소 스트레스이다. 연구에 따르면 hypoxic 환경은 무혈성 저산소성 고형 종양에서 화학 요법 약물의 빈약한 침투로 인해 암세포에 화학 요법에 다약제 내성을 부여할뿐만 아니라 암세포에서 다약제 내성 P-GP1 (permeability glycoproteins) 수송체 단백질의 분비를 촉진한다. 또한, 저산소 암세포에 의해 고갈된 산소 레벨은 방사선 민감성 및 방사선 기반 치료 방법의 효능을 최대 3 배 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

이에 최근에는, 종양 저산소증을 잠재적인 항종양 치료법으로 목표로 삼는 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명의 다양한 실시예에서는, 종양 미세환경을 재프로그램하여 종양 치료에 대한 새로운 패러다임을 제시할 수 있는 종양 미세환경 감응형 나노복합체 및 이를 포함하는 항암용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 종양 미세환경 감응형 나노복합체는, 이산화망간(MnO₂) 시트; 및 상기 이산화망간 시트에 내장되는 카본 나노 어니언(Carbon Nano Onion, CNO)을 포함할 수 있다.

본 발명의 항암용 조성물은 상기 나노복합체를 포함할 수 있다.

본 발명의 종양 미세환경 감응형 나노복합체는 생물학적으로 안정적인 구조를 가지고 무독성이며, 저산소성 종양 미세환경에서 암세포에 의해 과도하게 분비되는 과산화수소의 불균형을 조절할 수 있다. 즉, 저산소증 종양 미세환경을 정상 산소 상태로 산소를 공급할 수 있다. 또한, 저산소증 유발 인자(HIF1-α)의 분비를 방해하여 암세포 증식을 억제할 수 있다.

또한, 본 발명의 나노복합체를 통해 영상 유도 광열 치료 효과를 극대화할 수 있다. 본 발명의 나노복합체는 카탈라아제 모방 활성을 통해 종양 미세환경에서 과산화수소에 노출 시 산소를 생성함으로써, 저산소증에 대한 종양 적응을 방해하여 Photothermal therapy(PTT)에 종양 세포를 민감하게 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 나노복합체와 PTT를 병용하여 종양 관련 저산소증을 완화하면 치료 효능이 강화될 수 있다. 즉, 본 발명의 나노복합체를 이용한 치료를 통해 종양의 재발 및 전이를 억제할 수 있다.

도 1은 종양 미세환경(tumor microenvironment, TME)을 재프로그램하고 효율적인 Photothermal therapy (PTT)를 위해 Carbon Nano-Onions (CNO)와 in situ 산소화 CNO- 망간 산화물 (iOCOM)의 사용에 관한 모식도이다.
도 2의 (a)는 DOCA의 열분해로부터 합성된 CNO 및 iOCOM (KMnO4 환원)의 합성에 관한 모식도이다. (b)는 CNO의 전계 방출 전자 현미경 (FE-TEM) 이미지 (화살표로 표시)이다. (c)는 (b)의 박스표시된 부분의 CNO의 다중 풀러렌 구조이다 (d)는 iOCOM의 FE-TEM 이미지이다. (e)는 CNO 및 iOCOM의 ATR-FTIR 스펙트럼이다. (f)는 iOCOM의 고해상도 XPS 망간 스펙트라이다. (g)는 증류수(DW), PBS 및 DMEM 배지에서 CNO, IOCOM 및 MnO₂의 안정성을 조사한 결과이다.
도 3의 (a)는 과산화수소(H₂O₂)의 존재 하에서 iOCOM으로부터의 산소 농도 증가뿐만 아니라 Mn² ⁺ 이온의 방출을 설명하기 위한 모식도이다. (b)는 H₂O₂에 민감한 형광 프로브인 iOCOM oxivision green에 의한 H₂O₂ quenching 평가 결과이다. (c)는 H₂O₂, CNO 및 iOCOM의 존재 하에서 oxivision green의 상대 형광 단위 (RFU)를 측정한 결과이다. (d)는 H₂O₂ 처리된 iOCOM 시료에서 산소 발생을 나타내는 메틸렌 블루에 의한 청색 병 실험결과이다. (e)는 H₂O₂의 존재 하에서 iOCOM의 T1 MRI 스펙트럼 결과이다. (f)는 H₂O₂의 존재 및 부재 하의 iOCOM의 농도 의존적 이완 속도 결과이다.
도 4의 (a)는 808 nm에서 CNO (1 mg/mL) 및 iOCOM (1 mg/mL)의 흡광도 단위 (AU)를 측정한 결과이다. (b)는 iOCOM의 농도 의존 흡광도 스펙트럼 결과이다. (c)는 NIR 레이저 (808 nm; 2W/cm² 15 분)를 조사한 후 CNO와 iOCOM의 열 발생을 나타내는 열 화상 이미지를 나타낸다. (d)는 NIR 레이저 (808 nm; 2W/cm2)를 조사한 후 CNO와 iOCOM의 농도 의존 열 발생 그래프이다. (a: dd H₂O(2 mg/mL), b: CNO (1mg/mL), c: CNO (2mg/mL), d: CNO (4mg/mL), e: iOCOM (1 mg/mL), f: iOCOM (2 mg/mL), g: iOCOM (4 mg/mL)) (e)는 IR 820, CNO 및 iOCOM 간의 열 프로파일을 비교한 결과이다. (f)는 NIR 조사 (808 nm, 2W/cm²) 하에서 IR 820, CNO 및 iOCOM 사이의 recycling 가열 프로파일을 비교한 결과이다.
도 5의 (a)는 암세포의 저산소 상태를 분석한 결과이다. (b)는 세포를 CNO로 처리하고 NIR 레이저 조사 시, 농도 의존 세포 사멸을 나타내는 MTT 분석결과이다. (c)는 세포를 iOCOM으로 처리하고 NIR 레이저 조사 시, 농도 의존 세포 사멸을 나타내는 MTT 분석결과이다. (d) 및 (e)는 NIR 레이저 조사 전후에 세포 사멸 프로파일을 분석한 결과이다.
도 6의 (a)는 iOCOM 주입 후 KB 종양 이종 이식 마우스에서 T1 MRI 이미징과 관련된 모식도이다. (b)는 iOCOM 주입 된 KB 종양 이종 이식으로부터 얻은 시점별 T1 MRI 이미징이다. (c)는 시점별 iOCOM의 T1 MRI 신호 강도이다. (d)는 iOCOM 주입 후 종양 이종 이식 삽입 누드 마우스의 열 화상과 관련된 모식도이다. (e)는 NIR 레이저를 CNO 및 iOCOM 주사 마우스에 조사한 후 종양 부위의 발열을 나타내는 열 화상이다.
도 7의 (a)는 PTT 처리를 설명하기 위한 모식도이다. (b)는 PTT 처리 후 Balb/c 누드 마우스로부터 종양 성장 및 상응하는 생체 외 종양을 모니터링한 결과이다. (c)는 종양 체적 및 (d)는 종양 보유 마우스의 체중을 측정한 결과이다.
도 8의 (a)는 iOCOM에 의한 TME 재프로그램과 암세포의 분자 메커니즘에 미치는 영향을 설명하기 위한 모식도이다. (b)는 PTT 처리 14일 후 종양의 조직학적 분석 결과이다.

이하, 본 문서의 다양한 실시예들이 기재된다. 실시예 및 이에 사용된 용어들은 본 문서에 기재된 기술을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 해당 실시예의 다양한 변경, 균등물, 및/또는 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

도 1을 참고하면, 본 발명의 다양한 실시예에 따른 종양 미세환경 감응형 나노복합체(in situ oxygenic carbon nano-onion/manganese oxide nanopods, iOCOM)는, 이산화망간(MnO₂) 시트; 및 이산화망간 시트에 내장되는 카본 나노 어니언(Carbon Nano Onion, CNO)을 포함할 수 있다. 카본 나노 어니언(CNO)은, DOCA(deoxycholic acid)의 열분해를 통해 합성될 수 있다. 이러한 CNO 존재 하에서 과망간산 칼륨(KMnO₄)을 MnO₂ 나노 입자로 환원시킴으로써 본 발명의 나노복합체(iOCOM )가 합성될 수 있다.

본 발명의 다양한 실시예에 따른 항암용 조성물은 상술한 나노복합체를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명은 실시예 및 실험예에 의해서 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예 및 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다.

실시예- iOCOM의 합성

CNO는 열분해 방법에 따라 전구체로서 Sodium-deoxycholate(DOCA)를 사용하여 합성되었다. DOCA 500 mg을 50 mL 비커에 넣고 heating mantle에 넣고 400 °C에서 90 분간 가열하였다. 온도가 증가함에 따라 DOCA의 색은 흰색에서 암갈색으로 바뀌어 CNO의 합성을 나타내었다. 이어서, 40 mL의 이중 증류수 (ddH2O)를 상기 샘플에 첨가 한 후, 실온에서 30 분 동안 초음파 처리 하였다. 수득 된 암갈색 용액을 투석막 (분자량 컷오프, MWCO, 1 kD )을 6 시간마다 투석 배지 (ddH2O)로 교체하여 2 일간 배양하였다. 투석된 샘플을 동결 건조하였다.

iOCOM는 2 mL의 CNOs (2.5 mg/mL)에 KMnO₄ (2 mg/mL) 100 μL를 첨가하여 KMnO₄을 MnO₂로 환원시킴으로써 합성하였다. 샘플을 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다.

상기 실시예에 기재한 바와 같이, CNO는 열분해법에 따라 천연 담즙산인 DOCA (deoxycholic acid)를 사용하여 합성될 수 있다. DOCA 는 자연적으로 생성된 2 차 담즙산으로 간내 담즙에서 분비된다. 이러한 생체 분자는 상대적으로 경제적이고, 생물학적 시스템에서 무독성이다.

DOCA는 소수성 스테로이드 고리 전체에 수산기와 카르복실기가 분포되어있는 사 환형 스테로이드 고리 구조를 가지고 있다. 열분해 과정에서 탈알킬화, 탈수소화 및 DOCA (핵 형성)의 탈수소화는 스테로이드 구조의 방향족 구조로의 전환을 용이하게 한고, 그래핀 핵 구조의 성장을 돕는다. 그러나 다중층 고리의 형성에 대한 정확한 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았다.

실험예 1- CNO 및 iOCOM의 특성 평가

도 2의 (b)를 참고하면, CNOs에서 6 개 내지 8 개의 동심 양파링을 가진 다중 풀러린 유사 구조의 존재를 확인했다. 도 2의 (c)를 참고하면, 합성된 CNOs의 평면간 d 격자 간격은 이전에 보고된 CNOs와 유사한 약 0.34 nm였다.

이러한 CNO의 표면은 망간 산화물로 코팅되어 과산화물 소거뿐만 아니라 TME 반응성 T1 MRI 영상화를 촉진시켰다. iOCOM은 CNO 존재 하에서 과망간산 칼륨(KMnO₄)을 MnO₂ 나노 입자로 환원시킴으로써 합성된다. 도 2의 (d)에 도시된 바와 같이, CNOs는 MnO₂ 시트에 내장된다.

도 2의 (e)를 참고하면, FT-IR 스펙트럼에서 525cm^-1의 새로운 피크를 통해 iOCOM에서 망간의 존재를 확인했다. 또한, 1698 cm^-1에서의 피크의 이동은 CNOs의 카르복실기가 MnO₂ 시트 상에서 CNOs의 결합에 관여할 뿐만 아니라 KMnO₄의 MnO₂ 로의 환원에 관여함을 보여준다.

도 2의 (f)를 참고하면, 고해상도 XPS 스펙트럼을 통해 iOCOM 에서 MnO₂의 존재를 확인할 수 있다. 도 2의 (g)는 상이한 생물학적 매질에서의 CNO 및 iOCOM의 안정성을 도시한다. iOCOM은 MnO₂에 비해 증류수, PBS 및 DMEM에서의 생물학적 안정성을 향상시켜, CNO가 KMnO₄를 MnO₂로 감소시켰을 뿐 아니라 생물학적 매체에서의 안정성을 향상시켰음을 나타낸다.

실험예 2- 산소 활성화 평가

도 3의 (a)를 참고하면, H₂O₂의 분해 동안, MnO₂ 기반의 나노 물질은 산소 생성을 돕는다. 하기 식 (1)은 MnO₂와 H₂O₂ 사이의 상호 작용 메커니즘을 나타낸다.

식 (1)

MnO₂ + H₂O₂--------->Mn²⁺+2H₂O+O₂

따라서 oxivision green을 H₂O₂ 반응 형광 나노 프로브로 사용하여 iOCOM의 H₂O₂ 퀀칭 기능을 조사하였다. 도 3의 (b)에 도시 된 바와 같이, CNO 및 H₂O₂ 모두 유사한 형광 강도를 나타내어, CNO 단독으로 H₂O₂를 퀀칭시킬 수 없음을 나타낸다. 그러나, 도 3의 (c)를 참고하면, H₂O₂ 용액에 iOCOM을 첨가하면 형광 강도가 현저하게 감소하였으며, 이는 증류수로 처리된 샘플(ddH₂O)과 유사하였다. 이 결과로부터, iOCOM이 생물계에서 H₂O₂를 효과적으로 감소시킬 수 있다는 것을 확인했다.

iOCOM의 in situ 산소화를 더 평가하기 위해, 메틸렌 블루 (MB)를 사용하는 청색 병 실험을 실시하였다. 청색 강도가 증가하면 용액의 산소 발생량이 증가하였다는 의미이다. MB는 스스로를 leucomethylene blue (LB)로 감소시킴으로써 포도당의 산화를 촉진시키는 중개자 역할을 한다. 도 3의 (d)에 도시된 바와 같이, CNO, iOCOM 또는 H₂O₂로 처리된 MB 용액은 MB가 LB로 환원되어 무색으로 변하였다. 흥미롭게도, iOCOM 및 H₂O₂로 처리된 MB 용액은 MB의 청색을 유지했다. iOCOM가 H₂O₂의 dismutation을 유도하는 동안 용해된 산소의 방출은 MB의 감소를 막았다. 또한 용액에서 iOCOM 농도가 감소하면 MB의 청색 농도가 감소하였다. 이 결과를 통해 iOCOM의 산소 활성을 확인할 수 있다.

다음으로 iOCOM의 H₂O₂ 반응 T1 MRI 이미징을 관찰했다. 도 3의 (e)에 도시된 바와 같이, iOCOM은 H₂O₂의 존재 하에서만 양성 T1 MRI 조영 영상을 보였다. 또한, 도 3의 (f)를 참고하면, 이완율은 H₂O₂의 존재 하에서 iOCOM의 순차적 농도 구배 하에서 선형 프로파일을 나타내었다.

실험예 3- 열적 특성 분석

근적외선 레이저 매개 광열 치료 (PTT)를 위해, 물질은 근적외선 영역에서 충분한 에너지를 흡수할 뿐만 아니라 흡수된 에너지를 열 형태로 방출해야 한다. 흥미롭게도 Photoluminescence 특성을 연구하면서 CNO와 iOCOM이 근적외선 영역에서 흡광도를 갖는 것을 발견하였다. 두 나노 물질 모두 NIR 흡광도를 나타내지만 도 4의 (a)를 참고하면, 808 nm의 근적외선 파장에서 CNO의 흡광도 값이 iOCOM의 흡광도 값보다 낮음을 알 수 있다. 도 4의 (b)에 도시 된 바와 같이, iOCOM은 근적외선 영역 (700 nm 내지 900 nm)에서 흡광도 값의 농도 의존적인 감소를 확인할 수 있다. CNO와 iOCOM은 근적외선 영역에서 흡광도를 보였기 때문에, 실시예에 따른 나노 물질이 열 형태로 흡수된 에너지를 방출할 수 있으며 근적외선 레이저 조사 하에서 강력한 PTT 감광제로서 기능 할 수 있다고 가정할 수 있었다. 따라서 근적외선 조사 하에서 CNO와 iOCOM의 농도에 따른 열 발생을 실험 하였다. 도 4의 (c)를 참고하면, NIR 레이저 (여기 파장 808 nm, 노출 시간: 10 분)로 조사했을 때 CNO 및 iOCOM이 모두 근적외선 열이미징제로 사용될 수 있음을 확인하였다. CNO와 iOCOM의 발열을 기존의 NIR PTT 제제인 IR 820과 비교했다. 도 4의 (e)를 참고하면, iOCOM은 IR820에 비해 균일한 가열 프로파일을 나타냈다. IR 820은 향상된 열 신호를 얻기 위해 최소한의 시간이 필요하지만, 도 4의 (f)를 참고하면, 반복적인 열 발생 사이클 실험은 레이저 조사의 두 번째 사이클 이후에 IR 820에서 열 생산을 감소시키는 것으로 나타났다. 이것은 근적외선 조사 후 유기 염료의 분해로 인한 것일 수 있다. 그러나 CNO와 iOCOM은 4주기의 레이저 조사 후에도 일관된 열적 특성을 보였다. 이러한 결과로부터 CNT와 iOCOM이 PTT를위한 효율적인 광열 증감제(photothermal sensitizers)로 사용될 수 있음을 확인했다.

실험예 4- 저산소 상태 분석 및 NIR 레이저 조사에 따른 세포 사멸에 대한 in vitro 실험

미토콘드리아에서 전자 전달 사슬의 복합체 III은 저산소 상태에서 암 세포에서 H₂O₂의 분비를 촉진시킨다. 실시예에 따른 iOCOM이 H₂O₂ 존재 하에서 산소를 생성시키고 암세포에서 저산소 수준을 완화시키는 특징을 확인하기 위해, KB 세포를 CoCl₂로 24 시간 처리하여 in vitro 저산소증 모델을 만들었다. H₂O₂에 민감한 탐침인 Peroxy Orange 1은 암세포의 저산소 구역을 염색하는데 사용되었다.

5의 (a)에 도시된 바와 같이, 염수처리된 또는 CNO 처리 된 KB 세포는 PO1 형광이 강화되어 저산소 조건 하에서 암세포에서 H₂O₂의 분비가 강화되었음을 확인 하였다. iOCOM으로 처리된 KB 세포는 PO1 형광이 강하게 감소하여 iOCOM이 H₂O₂ 수준을 감소시킴으로써 암세포의 저산소 상태를 완화시킴을 확인하였다. iOCOM으로 iOCOM으로 처리한 KB 세포의 PO1 강도가 감소한 것은 정상 산소 농도의 KB 대조군과 유사하였다. 이 결과를 통해, iOCOM이 저산소의 암 환경을 정상 산소 상태로 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다.

CNO와 iOCOM의 농도를 다르게 하여 세포를 배양하고 NIR 레이저 (여기 파장 808 nm)를 3 분간 조사한 후 CNO와 iOCOM의 NIR PTT 활성을 조사 하였다. 도 5의 (b)에 도시된 바와 같이, 저농도에서는, CNO 처리 시 적어도 50 %의 세포가 죽었으며, 도 5의 (c)에 도시한 바와 같이, iOCOM 처리 시 40 %의 세포가 죽었다.

라이브(Live) 및 데드(dead) 분석법을 사용하여 PTT 활성을 정량적으로 결정 하였다. 도 5의 (d)를 참고하면, CNO와 iOCOM 처리된 그룹에서 NIR 레이저 조사 전에는 세포사가 거의 없음을 확인할 수 있다. 그러나 도 5의 (e)를 참고하면, 세포가 NIR 레이저 (808nm, 2W/cm²)로 3 분간 조사되었을 때 CNO 그룹에 비해 iOCOM 처리된 세포의 사멸 세포 프로파일의 증가가 관찰되었다. 이러한 결과는 CNO와 iOCOM이 PTT를위한 효과적인 나노 물질이 될 수 있음을 시사한다.

실험예 5- T1 MRI 이미징 및 열화상 측정에 대한 in vivo 실험

iOCOM의 in vivo 실험은 Balb/C 누드 마우스에서 KB 세포 이종 이식 모델을 개발함으로써 수행되었다. 도 6의 (a)를 참고하면, 종양 보유 마우스에 iOCOM의 종양내(Intratumoral, IT) 주사를 투여하여 나노 물질의 T1 MRI 이미징을 확인하였다. 도 6의 (b)에 도시된 바와 같이, T1 MRI 콘트라스트 이미징은 iOCOM의 시간 의존적 균질 분포를 나타냈다. 또한, 도 6의 (c)를 참고하면, 종양 부위의 평균 T1 MRI 신호 강도는 투여 24 시간 후에 증가하였다. T1 MRI 콘트라스트에서 이러한 유의한 향상의 이유는 국부적인 H₂O₂ 환경에서의 iOCOM으로부터 MnO₂가 Mn² ⁺ 이온으로 분해되는 속도가 즉시 주입 후 보다 24 시간 후에 더 높았기 때문이다. 이것은 저산소 환경이 iOCOM 나노 물질로부터 T1 MRI 콘트라스트 및 저산소 반응 T1 MRI 이미징을 생성하는 데 필요하다는 것을 알 수 있다. 이 결과는 24 시간 동안 종양 부위에서 나노 물질의 잔류가 확인되었다.

이후, 도 6의 (d)를 참고하면, NIR 레이저(여기 파장: 808 nm, 전력: 2 W/ cm²) 15분 조사 후 CNO 및 iOCOM 주사 마우스에서 생성된 열을 적외선 열 화상 카메라로 기록하였다. 도 6의 (e)에 도시된 열 화상은 iOCOM 처리 동물이 CNO 처리 동물과 비교하여 향상된 열 발생을 나타냄을 보여준다. iOCOM으로 처리한 동물은 53 ℃의 최대 열을 발생시켰는데, 이는 CNO로 처리한 동물에서보다 6 ℃ 높았다. 이러한 iOCOM의 열 발생은 PTT 후에 DNA에 돌이킬 수 없는 손상을 일으키고 단백질을 변성시키며 종양 재발을 방지하기에 충분하다.

실험예 6- PTT 처리 후 종양 체적 및 체중 측정

도 7의 (a)를 참고하면, PTT 처리 후, 종양 체적 및 동물의 체중을 14 일 동안 모니터링 하였다. KB 종양 이종 이식 물에서 iOCOM (2 mg/kg)을 투여하고 NIR 레이저 (2 W/cm²)로 15 분간 종양을 조사 하였다. 도 7의 (b)에 도시된 바와 같이, 레이저 조사 없이 CNO 및 iOCOM으로 처리된 동물은 식염수 처리 동물과 유사한 연속적인 종양 성장을 나타내었다. CNO 및 레이저 조사로 처리된 동물은 대조군에 비해 종양 성장이 감소되었다. 특히, 도 7의 (c)를 참고하면, 레이저 조사의 단회 투여로 iOCOM (2 mg/kg)으로 처리한 동물에서 완전한 종양 절제가 관찰되었다. 일반적으로 고출력 레이저 조사는 돌이킬 수 없는 피부 손상과 면역 활성화를 유발하여 PTT 후 종양 재발을 야기한다. 그러나, 도 7의 (b)에 도시된 바와 같이, iOCOM으로 처 된 동물에서 무시할 수 있는 흔적의 피부 절제뿐만 아니라 정상 상태로 완전히 회복되었다. 또한, 도 7의 (d)를 참고하면, 레이저 조사 및 비 조사 동물 군에서 동물 체중의 유의한 변화는 관찰되지 않았다. 이 결과를 통해 종양의 재발을 막고 무시할 수 있는 피부 손상을 일으킴으로써 PTT에서 iOCOM의 효능을 확인할 수 있었다.

실험예 7- iOCOM에 의한 TME 재프로그램과 암세포의 분자 메커니즘에 미치는 영향 측정

도 8의 (a)를 참고하면, 저산소증은 TME에서 여러 매개 변수의 강력한 조절 인자로 알려져 있으며 종양 형성 및 암세포의 전이성 행동 촉진에 중요한 역할을 한다. 따라서 본 실험예에서는 암세포의 분자 경로를 조절하는 iOCOM에 의한 in-situ oxygenation-mediated hypoxia reprogramming의 영향을 관찰했다. 처음에는 종양의 hematoxylin & eosin (H & E) 염색법을 사용하여 PTT 후 종양 조직의 조직 학적 변화를 조사 하였다. 도 8의 (b)에 도시 된 바와 같이, 종양 보유 동물을 NIR 레이저 조사 하에 CNO 및 iOCOM으로 처리한 경우, 종양 조직에서 세포 핵의 소멸과 함께 종양 세포의 파괴가 관찰되었다. 또한, 과량의 조직 손상 및 완전한 종양 괴사가 CNO 처리 동물에 비해 iOCOM 처리 동물에서 관찰되었다. 흥미롭게도, 조직 손상의 크기는 PTT 후 1 일째에 비해 15 일째에 유의하게 증가 하였다.

주요 주요 기관 (간, 비장, 폐, 신장 및 열)의 구조에 명백한 병리학적 변화가 관찰되지 않았기 때문에 iOCOM의 무시할 만한 독성과 생체 적합성이 증명되었다.

종양 조직에서 암 세포 증식의 속도는 항원 Ki-67 분석을 사용하여 연구되었다. 도 8의 (b)에 도시 된 바와 같이, iOCOM으로 처리 된 동물은 다른 대조군과 비교하여 종양 세포 증식을 억제하였다.

또한, Terminal deoxynucleotidyl transferase - mediated dUTP nick end labeling(TUNEL) 분석은 종양 조직 레이저 방사선 후 종양 아포토시스(apoptosis)의 수준을 연구하기 위해 수행되었다. 도 8의 (b)에 도시 된 바와 같이, 레이저 조사 하에서 iOCOM으로 처리된 종양 절편에서 증가된 녹색 형광 (세포 사멸 신호로 사용됨)이 관찰되었다.

H₂O₂의 불변화(dismutation)는 저산소 세포를 정상 산소로 변환시킬 수 있는 TME에서 용존 산소의 in situ production을 초래할 수 있다. 따라서 먼저 절제된 종양 조직에서 저산소 TME에 암세포를 적응시키는 전사 인자인 HIF1-α의 발현을 조사했다. 흥미롭게도, 도 8의 (b)를 참고하면, 레이저 조사가 있거나 없는 iOCOM 처리 동물은 종양 조직에서 HIF1-α 발현의 현저한 감소를 보였다. 정상적인 생리 조건에서 산소는 HIF1-α에서 프롤린 잔기 (Prolyl hydroxylases, PHD에 의한)의 수산기를 도와 세포의 유비퀴틴화(ubiquitination) 및 감소된 발현을 유도한다. 그러나 저산소 TME는 PHD의 유비퀴틴화를 돕고 암세포에서 HIF1-α의 발현을 촉진시킨다. iOCOM의 불변화 동안 증가된 산소 수준과 함께 H₂O₂의 감소는 암 조직에서 HIF1-α 분해를 촉진하여 PHD의 유비퀴틴화를 예방할 수 있었다.

암 전이가 시작되는 동안 암세포는 세포 부착 분자 (cadherin과 같은)의 발현을 변화시켜 원발 종양으로부터 분리된다. N- 카데린(N-cadherin)은 암세포의 이동성과 운동성을 유리하게 만들 수 있는 전이성 암 세포에서 고도로 발현되는 막 통과 단백질 중 하나이며, 암 전이의 특징으로 간주된다. 암세포에서 N-cadherin의 발현을 활성화시킴으로써 저산소 환경과 HIF1-α 신호 전달 계통의 활성화가 암세포의 전이를 촉진시킨다. 도 8의 (b)에 도시 된 바와 같이, N-cadherin의 분비 증가는 대조군 또는 CNO 처리된 종양에서 관찰되었다. 그러나, 저산소 TME에서 iOCOM에 의한 급속 종양 산소화는 암 세포에서 HIF1α의 발현을 감소 시켰고, 이는 레이저 및 비 레이저 처리 동물 모두에서 N-cadherin 발현을 더욱 하향 조절 하였다.

상피 세포 부착 분자(Ep-CAM1)의 이소성 발현은 상피 간엽 전이(epithelial to mesenchymal transition, EMT) 및 암 조직에서 줄기 세포 유사 표현형 특성의 유도와 관련이 있다. 레이저 조사의 존재 또는 부재 하에서 iOCOM 처리 동물의 종양 부분에서 Ep-CAM1 발현의 상당한 감소가 관찰되었다. 이러한 결과는 iOCOM에 의한 신속한 in situ 산소화가 TME를 재프로그램할 수 있고 암세포의 생리학적 거동에 주된 영향을 줄 수 있음을 보여준다.

상술한 실시예에 설명된 특징, 구조, 효과 등은 본 발명의 적어도 하나의 실시예에 포함되며, 반드시 하나의 실시예에만 한정되는 것은 아니다. 나아가, 각 실시예에서 예시된 특징, 구조, 효과 등은 실시예들이 속하는 분야의 통상의 지식을 가지는 자에 의하여 다른 실시예들에 대해서도 조합 또는 변형되어 실시 가능하다. 따라서 이러한 조합과 변형에 관계된 내용들은 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

또한, 이상에서 실시예들을 중심으로 설명하였으나 이는 단지 예시일 뿐 본 발명을 한정하는 것이 아니며, 본 발명이 속하는 분야의 통상의 지식을 가진 자라면 본 실시예의 본질적인 특성을 벗어나지 않는 범위에서 이상에 예시되지 않은 여러 가지의 변형과 응용이 가능함을 알 수 있을 것이다. 예를 들어, 실시예들에 구체적으로 나타난 각 구성 요소는 변형하여 실시할 수 있는 것이다. 그리고 이러한 변형과 응용에 관계된 차이점들은 첨부한 청구 범위에서 규정하는 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

이산화망간(MnO₂) 시트; 및
상기 이산화망간 시트에 내장되는 카본 나노 어니언(Carbon Nano Onion, CNO)을 포함하는 종양 미세환경 감응형 나노복합체.
제1항에 있어서,
상기 카본 나노 어니언은,
DOCA(deoxycholic acid)의 열분해를 통해 합성되는 종양 미세환경 감응형 나노복합체.
제1항에 있어서,
상기 나노복합체는,
상기 카본 나노 어니언의 존재 하에서 과망간산 칼륨(KMnO₄)을 MnO₂로 환원시킴으로 합성되는 종양 미세환경 감응형 나노복합체.
종양 미세환경 감응형 나노복합체를 포함하는 항암용 조성물로써,
상기 나노복합체는,
이산화망간(MnO₂) 시트; 및
상기 이산화망간 시트에 내장되는 카본 나노 어니언(Carbon Nano Onion, CNO)을 포함하는 종양 미세환경 감응형 항암용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 카본 나노 어니언은,
DOCA(deoxycholic acid)의 열분해를 통해 합성되는 종양 미세환경 감응형 항암용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 나노복합체는,
상기 카본 나노 어니언의 존재 하에서 과망간산 칼륨(KMnO₄)을 MnO₂로 환원시킴으로 합성되는 종양 미세환경 감응형 항암용 조성물.