KR20200111574A - Novel incubator for gamete and embryo - Google Patents

Novel incubator for gamete and embryo Download PDF

Info

Publication number
KR20200111574A
KR20200111574A KR1020190031455A KR20190031455A KR20200111574A KR 20200111574 A KR20200111574 A KR 20200111574A KR 1020190031455 A KR1020190031455 A KR 1020190031455A KR 20190031455 A KR20190031455 A KR 20190031455A KR 20200111574 A KR20200111574 A KR 20200111574A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
gas
culture
incubator
mixed gas
oxygen
Prior art date
Application number
KR1020190031455A
Other languages
Korean (ko)
Inventor
최규완
전진현
서호철
Original Assignee
주식회사 씨엔씨바이오텍
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 주식회사 씨엔씨바이오텍 filed Critical 주식회사 씨엔씨바이오텍
Priority to KR1020190031455A priority Critical patent/KR20200111574A/en
Publication of KR20200111574A publication Critical patent/KR20200111574A/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/34—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of gas
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/48—Automatic or computerized control

Abstract

The present invention provides an incubator for incubating germ cells, comprising: an incubation chamber which is for accommodating and incubating germ cells; a gas load device which contains oxygen, carbon dioxide, and nitrogen, separately, to be supplied to the incubation chamber; a gas mixing chamber which contains mixture gas in which the oxygen, carbon dioxide, and nitrogen are mixed; a gas sensor which measures the concentration of each of the oxygen, carbon dioxide, and nitrogen in the gas mixing chamber; a gas supply tube which supplies the mixture gas to the incubation chamber; and a computer which controls operations of the gas sensor and the gas mixing chamber. After a predetermined time is elapsed, the mixture gas in the gas mixing chamber changes from first mixture gas according to an incubation initial setting value, to second mixture gas having a composition different from the composition of the first mixture gas.

Description

신규 생식세포 배양기{Novel incubator for gamete and embryo} Novel incubator for gamete and embryo

본 발명은 신규 생식세포 배양기에 관한 것이다.The present invention relates to a novel germ cell incubator.

1980년대 임상적으로 배란유도 방법과 약제 및 초음파장비의 개발, 실험실에서의 배양액과 배양기술 및 수정란 동결에 대한 연구개발들에 성공하였으며, 1990년대에는 남성불임을 해결하기 위한 미세수정 기술에 대한 활발한 연구로 세포질내 정자주입술이 임상에 도입되어 남성불임의 수정 문제점들이 해결되었다. In the 1980s, he succeeded in clinically developing ovulation induction methods, pharmaceuticals, and ultrasound equipment, and research and development on culture medium and culture technology in the laboratory, and freezing of fertilized eggs. In the 1990s, active research on microfertilization technology to resolve male infertility As a study, intracytoplasmic sperm injection was introduced into the clinic to solve the problem of male infertility correction.

이러한 배아의 체외배양 시스템의 개선과 최적화 노력의 결과로 인간의 체외수정 및 배아이식술에서의 임신 성공률과 출산율은 각각 40%와 30%를 상회하고 있으며, 최근에는 가장 임신 가능성이 높은 하나의 배아만을 선택적으로 이식하여, 다태 임신에 따른 산모의 위험 요인을 최소화하고 임신 성공률과 출산율을 극대화하고자 하는 시도가 진행되고 있음. As a result of these efforts to improve and optimize the in vitro culture system of embryos, the pregnancy success rate and fertility rate in human in vitro fertilization and embryo implantation are over 40% and 30%, respectively, and recently, only one embryo with the highest fertility rate By selectively transplanting, attempts are being made to minimize the risk factors for mothers due to multiple pregnancy and to maximize the pregnancy success rate and fertility rate.

최초의 시험관아기 시술에서 성공한 1980년대 초창기의 인간을 포함한 포유류 초기 배아의 체외배양 시스템은 기존에 사용되던 일반적인 체세포배양 시스템을 적용하였으나, 포유류 초기 배아와 일반적인 체세포의 세포생리학적인 차이점을 인지함에 따라 배아의 체외배양 시스템의 개선과 최적화 필요성이 제기되었다. 체내 배아 발생 과정에서의 가스 조건에 대한 정보는 확보되어 있으나, 실제적으로 시험관아기 시술에서 진행되는 체외배양 조건에서 배아 발생에 최적화된 대사물질과 가스 조건은 명확하지 않다. 특히 현재 시판되고 있는 배양기에 공급되는 가스의 농도는 20% 또는 5% 산소로 배양기간 동안 정해진 농도로 일정하게 유지되도록 설계되어 있어, 체외배양 중인 배아가 실제로 필요로 하는 2% ~ 20%의 가변적이고 역동적인 산소 공급 조건을 제공 하는데 어려움이 있고 이에 따라 배아의 체외배양을 위한 최적의 환경을 제공하는데 한계가 있다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2019-0020899호는 수정란의 체외 배양기 및 이것의 제조방법에 대해 개시하고 있다. The in vitro culture system of early mammalian embryos including humans in the early 1980s, which was successful in the first in vitro procedure, applied the conventional somatic cell culture system, but recognized the difference in the cytophysiology between the early mammalian embryos and general somatic cells. The need for improvement and optimization of the in vitro culture system was raised. Although information on gas conditions in the process of embryonic development in the body has been secured, metabolites and gas conditions optimized for embryonic development in the in vitro culture conditions actually progressed in in vitro baby procedures are not clear. In particular, the concentration of gas supplied to the incubator currently available on the market is designed to be maintained at a constant concentration during the incubation period with 20% or 5% oxygen, so the 2% ~ 20% variable actually required by embryos in vitro culture There is a difficulty in providing a dynamic and dynamic oxygen supply condition, and accordingly, there is a limitation in providing an optimal environment for in vitro culture of embryos. In this regard, Korean Patent Application Publication No. 2019-0020899 discloses a fertilized egg in vitro incubator and a method for manufacturing the same.

그러나 상기 선행기술의 경우, 수정란을 체외 배양에 사용되던 플라스틱 기반 체외 배양 용기가 아닌 실리콘의 일종인 폴리디메틸실록산(PDMS, polydimethylsiloxane)을 배양용기로 사용한 것으로 수정란의 최적 배양환경을 제공하기에는 한계가 있다. However, in the case of the prior art, the fertilized eggs are not plastic-based in vitro culture vessels used for in vitro culture, but polydimethylsiloxane (PDMS), which is a kind of silicone, as the culture vessel, and there is a limit to providing an optimal culture environment for fertilized eggs. .

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 이중채널 가스공급시스템을 도입하여 수정란 및 배아를 포함하는 생식세포 배양에 최적화된 신규 생식세포 배양기를 제공한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The present invention provides a novel germ cell incubator optimized for culturing germ cells including fertilized eggs and embryos by introducing a dual channel gas supply system to solve various problems including the above problems. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.

본 발명의 일 관점에 따르면, 생식세포를 수용하고 배양하기 위한 배양챔버: 배양챔버에 공급되는 산소, 이산화탄소 및 질소를 각각 담고 있는 가스적재용기; 상기 산소, 이산화탄소 및 질소가 혼합된 혼합가스를 담지하는 가스혼합챔버; 상기 가스혼합챔버 내의 산소, 이산화탄소 및 질소의 각각의 농도를 측정하기 위한 가스센서; 및 상기 혼합가스를 배양챔버로 공급하는 가스공급관; 및 상기 가스센서 및 가스혼합챔버를 작동을 제어하는 컴퓨터를 포함하는, 생식세포 배양용 배양기에 있어서, 상기 가스혼합챔버 내의 혼합가스는 배양초기 타이머의 설정값에 따른 제1혼합가스에서 일정 시간 경과후 상기 제1혼합가스와 조성이 다른 제2혼합가스로 변경이 되도록 조절되는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 배양기가 제공된다.According to an aspect of the present invention, a culture chamber for receiving and culturing reproductive cells: a gas loading container each containing oxygen, carbon dioxide and nitrogen supplied to the culture chamber; A gas mixing chamber for supporting the mixed gas of oxygen, carbon dioxide, and nitrogen; A gas sensor for measuring respective concentrations of oxygen, carbon dioxide and nitrogen in the gas mixing chamber; And a gas supply pipe supplying the mixed gas to the culture chamber. And a computer for controlling the operation of the gas sensor and the gas mixing chamber, wherein the mixed gas in the gas mixing chamber passes a predetermined time in the first mixed gas according to the set value of the culture initial timer. Then, a germ cell incubator is provided, characterized in that it is adjusted to be changed to a second mixed gas having a different composition from the first mixed gas.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 신규 생식세포 배양기는, 가스의 농도가 일정하게 유지되도록 설계되어 있는 종래 배양기와는 달리 체외배양 중인 배아가 필요로 하는 산소 조건을 조절하여 공급함으로써 최적의 배양환경을 제공할 수 있고 이에 따라 높은 수정률, 배반포 형성률 등을 제공할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The novel germ cell incubator of the present invention made as described above, unlike conventional incubators, which are designed to maintain a constant gas concentration, the optimal culture environment is provided by controlling the oxygen conditions required by the embryos in vitro culture. Can be provided, and thus a high fertilization rate, blastocyst formation rate, and the like can be provided. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.

도 1은 수정 후 배아의 배반포 발달과정 시기에 따라 주로 소비되는 에너지원을 나타내고 있는 그림이다.
도 2는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 개략적인 형태를 나타내고 있는 개요도이다.
도 3은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 싱글 유닛의 형태를 나타내는 사진이다.
도 4는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 제조과정을 나타내는 사진이다.
도 5는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 시제품을 나타내는 사진이다.
도 6은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 이중채널 가스혼합 시스템을 개략적으로 나타내고 있는 개요도이다.
도 7은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 배아 독성 확인 실험를 나타내는 사진 및 그래프이다.
도 8은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 세포사멸 실험 결과를 나타내는 염색사진이다.
도 9는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 세포사멸 실험 결과를 나타내는 그래프이다.
도 10은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 포배기 배아의 외향성장 실험 결과를 나타내는 사진이다. 1 is a diagram showing the energy source mainly consumed according to the timing of the blastocyst development process of the embryo after fertilization.
2 is a schematic diagram showing a schematic form of a novel germ cell incubator 100 of the present invention.
3 is a photograph showing the form of a single unit of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
Figure 4 is a photograph showing the manufacturing process of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
5 is a photograph showing a prototype of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
6 is a schematic diagram schematically showing the dual channel gas mixing system of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
7 is a photograph and a graph showing an experiment to confirm embryo toxicity of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
8 is a stained picture showing the results of apoptosis experiment of the novel germ cell culture device 100 of the present invention.
9 is a graph showing the results of apoptosis experiment of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.
10 is a photograph showing the results of an outward growth experiment of blastocyst embryos of the novel germ cell incubator 100 of the present invention.

용어의 정의:Definition of Terms:

본 문서에서 사용되는 용어 "이중채널 가스공급(double channel gas supply, DCGS)"은 종래 생식세포용 배양기는 20% 또는 5%의 산소농도로 일정하게 공급되도록 설계되어 있어 실제 인체의 자궁과 유사한 산소 공급 조건을 제공하지 못하고 있으므로 이를 해결하기 위해 초기 배양단계와 그 이후의 가스 공급 조건을 인체에 맞게 재조정하여 제공하는 가스 공급 시스템을 의미한다. The term "double channel gas supply (DCGS)" used in this document is designed to provide a constant supply of oxygen at a concentration of 20% or 5% in conventional reproductive cell incubators. Since the supply conditions are not provided, it means a gas supply system that readjusts the initial culture stage and subsequent gas supply conditions to suit the human body to solve this problem.

발명의 상세한 설명:Detailed description of the invention:

본 발명의 일 관점에 따르면, 생식세포를 수용하고 배양하기 위한 배양챔버: 배양챔버에 공급되는 산소, 이산화탄소 및 질소를 각각 담고 있는 가스적재용기; 상기 산소, 이산화탄소 및 질소가 혼합된 혼합가스를 담지하는 가스혼합챔버; 상기 가스혼합챔버 내의 산소, 이산화탄소 및 질소의 각각의 농도를 측정하기 위한 가스센서; 및 상기 혼합가스를 배양챔버로 공급하는 가스공급관; 및 상기 가스센서 및 가스혼합챔버를 작동을 제어하는 컴퓨터를 포함하는, 생식세포 배양용 배양기에 있어서, 상기 가스혼합챔버 내의 혼합가스는 배양초기 타이머의 설정값에 따른 제1혼합가스에서 일정 시간 경과후 상기 제1혼합가스와 조성이 다른 제2혼합가스로 변경이 되도록 조절되는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 배양기가 제공된다.According to an aspect of the present invention, a culture chamber for receiving and culturing reproductive cells: a gas loading container each containing oxygen, carbon dioxide and nitrogen supplied to the culture chamber; A gas mixing chamber for supporting the mixed gas of oxygen, carbon dioxide, and nitrogen; A gas sensor for measuring respective concentrations of oxygen, carbon dioxide and nitrogen in the gas mixing chamber; And a gas supply pipe supplying the mixed gas to the culture chamber. And a computer for controlling the operation of the gas sensor and the gas mixing chamber, wherein the mixed gas in the gas mixing chamber passes a predetermined time in the first mixed gas according to the set value of the culture initial timer. Then, a germ cell incubator is provided, characterized in that it is adjusted to be changed to a second mixed gas having a different composition from the first mixed gas.

상기 배양기에 있어서, 상기 제1혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 3~6% 및 N2 75~90%이고 상기 제2혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 1~3% 및 N2 75~90%일 수 있다. In the incubator, the concentration of the first mixed gas is CO 2 3 to 7%, O 2 3 to 6% and N 2 75 to 90%, and the concentration of the second mixed gas is CO 2 3 to 7%, O 2 1 to 3% and N 2 may be 75 to 90%.

상기 배양기에 있어서, 테이블탑(tabletop) 형태를 갖춘 배양기일 수 있고 상기 생식세포는 수정란 또는 배아일 수 있으며 제1혼합가스를 공급 후 48 내지 96 시간 경과시점에서 제2혼합가스를 공급할 수 있다. In the incubator, the incubator may be a tabletop type, and the reproductive cells may be fertilized eggs or embryos, and the second mixed gas may be supplied 48 to 96 hours after the first mixed gas is supplied.

현재 시판되고 있는 생식세포를 배양하는 배양기들은 공급되는 가스의 농도가 20% 또는 5% 산소 농도로 일정하게 공급하도록 설계되어 있다 그러나, 실제적으로 체외배양 중인 배아는 2% ~ 20% 산소 조건의 가변적이고 역동적인 가스 공급 조건을 필요로 한다. 그러나 현재 국내적으로 저산소농도 또는 가변적인 산소농도구배에 의한 배아발달에 관한 연구 자체도 국외와 비교하여 부족한 실정이며, 실질적으로 가변적인 산소변화 시스템을 적용할 수 있는 인큐베이터의 개발은 전무하다.Currently, commercially available incubators for culturing germ cells are designed to supply a constant supply of gas at a concentration of 20% or 5% oxygen. However, in practice, embryos in vitro cultured in vitro have a variable oxygen condition of 2% to 20%. It requires dynamic and dynamic gas supply conditions. However, at present, studies on embryo development by low oxygen concentration or variable oxygen enrichment vessels in Korea are also insufficient compared to foreign countries, and there is no development of an incubator that can apply a substantially variable oxygen change system.

이에 본 발명자들은 배아의 발생 시기에 최적화된 유동적이고 역동적인 가스 공급시스템을 가진 배양기를 개발하고자 예의 노력한 결과 세계 최초로 설정된 프로그램으로 조절 가능한 이중채널 가스공급(DCGS) 시스템을 갖춘 배양기를 개발하였고 이를 이용하여 생쥐 배아를 이용한 체외배양시스템에서 배아 독성 및 포배 발생률 검증한 결과, 배아 독성 10% 이하, 포배 발생률 90% 이상의 배양 효율을 확인하여 본 발명을 완성하였다. Accordingly, the inventors of the present invention made diligent efforts to develop an incubator with a fluid and dynamic gas supply system optimized for the embryonic development period, and as a result, developed an incubator equipped with a dual-channel gas supply (DCGS) system that can be adjusted with a program set for the first time in the world, and used it. Thus, as a result of verifying the embryo toxicity and blastocyst incidence rate in the in vitro culture system using mouse embryos, the present invention was completed by confirming the cultivation efficiency of less than 10% embryo toxicity and more than 90% incidence of blastocyst.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 바람직한 여러 실시예들을 상세히 설명하기로 한다. Hereinafter, various exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings.

본 발명의 실시예들은 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 본 발명을 더욱 완전하게 설명하기 위하여 제공되는 것이며, 하기 실시예는 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 오히려 이들 실시예들은 본 개시를 더욱 충실하고 완전하게 하고, 당업자에게 본 발명의 사상을 완전하게 전달하기 위하여 제공되는 것이다. 또한, 도면에서 각 층의 두께나 크기는 설명의 편의 및 명확성을 위하여 과장된 것이다.The embodiments of the present invention are provided to more completely describe the present invention to those of ordinary skill in the art, and the following examples may be modified in various other forms, and the scope of the present invention is as follows. It is not limited to the examples. Rather, these embodiments are provided to make the present disclosure more faithful and complete, and to completely convey the spirit of the present invention to those skilled in the art. In addition, in the drawings, the thickness or size of each layer is exaggerated for convenience and clarity of description.

명세서 전체에 걸쳐서, 막, 영역 또는 기판과 같은 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "상에", "연결되어", "적층되어" 또는 "커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 상기 하나의 구성요소가 직접적으로 다른 구성요소 "상에", "연결되어", "적층되어" 또는 "커플링되어" 접촉하거나, 그 사이에 개재되는 또 다른 구성요소들이 존재할 수 있다고 해석될 수 있다. 반면에, 하나의 구성요소가 다른 구성요소 "직접적으로 상에", "직접 연결되어", 또는 "직접 커플링되어" 위치한다고 언급할 때는, 그 사이에 개재되는 다른 구성요소들이 존재하지 않는다고 해석된다. 균일한 부호는 균일한 요소를 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 용어 "및/또는"은 해당 열거된 항목 중 어느 하나 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.Throughout the specification, when referring to one component such as a film, region or substrate positioned "on", "connected", "stacked" or "coupled" another component, the one component It can be interpreted that an element may be directly in contact with another element “on”, “connected”, “stacked” or “coupled”, or that there may be other elements interposed therebetween. On the other hand, when it is mentioned that one component is positioned "directly on", "directly connected", or "directly coupled" of another component, it is interpreted that there are no other components intervening therebetween. do. Uniform symbols refer to uniform elements. As used herein, the term “and/or” includes any and all combinations of one or more of the corresponding listed items.

본 명세서에서 제 1, 제 2 등의 용어가 다양한 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들을 설명하기 위하여 사용되지만, 이들 부재, 부품, 영역, 층들 및/또는 부분들은 이들 용어에 의해 한정되어서는 안됨은 자명하다. 이들 용어는 하나의 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 다른 영역, 층 또는 부분과 구별하기 위하여만 사용된다. 따라서, 이하 상술할 제 1 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분은 본 발명의 가르침으로부터 벗어나지 않고서도 제 2 부재, 부품, 영역, 층 또는 부분을 지칭할 수 있다.In the present specification, terms such as first and second are used to describe various members, parts, regions, layers and/or parts, but these members, parts, regions, layers and/or parts are limited by these terms. It is self-evident. These terms are only used to distinguish one member, component, region, layer or portion from another region, layer or portion. Accordingly, a first member, part, region, layer or part to be described below may refer to a second member, part, region, layer or part without departing from the teachings of the present invention.

또한, "상의" 또는 "위의" 및 "하의" 또는 "아래의"와 같은 상대적인 용어들은 도면들에서 도해되는 것처럼 다른 요소들에 대한 어떤 요소들의 관계를 기술하기 위해 여기에서 사용될 수 있다. 상대적 용어들은 도면들에서 묘사되는 방향에 추가하여 소자의 다른 방향들을 포함하는 것을 의도한다고 이해될 수 있다. 예를 들어, 도면들에서 소자가 뒤집어 진다면(turned over), 다른 요소들의 상부의 면 상에 존재하는 것으로 묘사되는 요소들은 상기 다른 요소들의 하부의 면 상에 방향을 가지게 된다. 그러므로, 예로써 든 "상의"라는 용어는, 도면의 특정한 방향에 의존하여 "하의" 및 "상의" 방향 모두를 포함할 수 있다. 소자가 다른 방향으로 향한다면(다른 방향에 대하여 90도 회전), 본 명세서에 사용되는 상대적인 설명들은 이에 따라 해석될 수 있다.Also, relative terms such as “top” or “above” and “bottom” or “below” may be used herein to describe the relationship of certain elements to other elements as illustrated in the figures. It may be understood that relative terms are intended to include other orientations of the device in addition to the orientation depicted in the figures. For example, if an element is turned over in the figures, elements depicted as being on the top side of other elements will have orientation on the bottom side of the other elements. Therefore, the term “top” as an example may include both “bottom” and “top” directions depending on the particular orientation of the drawing. If the device is oriented in a different direction (rotated 90 degrees with respect to the other direction), the relative descriptions used in this specification can be interpreted accordingly.

본 명세서에서 사용된 용어는 특정 실시예를 설명하기 위하여 사용되며, 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 단수 형태는 문맥상 다른 경우를 분명히 지적하는 것이 아니라면, 복수의 형태를 포함할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 경우 "포함한다(comprise)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급한 형상들, 숫자, 단계, 동작, 부재, 요소 및/또는 이들 그룹의 존재를 특정하는 것이며, 하나 이상의 다른 형상, 숫자, 동작, 부재, 요소 및/또는 그룹들의 존재 또는 부가를 배제하는 것이 아니다.The terms used in this specification are used to describe specific embodiments, and are not intended to limit the present invention. As used herein, the singular form may include the plural form unless the context clearly indicates another case. Further, as used herein, "comprise" and/or "comprising" specifies the presence of the mentioned shapes, numbers, steps, actions, members, elements and/or groups thereof. And does not exclude the presence or addition of one or more other shapes, numbers, actions, members, elements and/or groups.

이하, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차(tolerance)에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명 사상의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings schematically showing ideal embodiments of the present invention. In the drawings, for example, depending on manufacturing techniques and/or tolerances, variations of the illustrated shape can be expected. Accordingly, the embodiments of the inventive concept should not be construed as being limited to the specific shape of the region shown in the present specification, but should include, for example, a change in shape caused by manufacturing.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, and the following embodiments make the disclosure of the present invention complete, and the scope of the invention to those of ordinary skill in the art. It is provided to fully inform you.

도 1은 수정 후 배아의 배반포 발달과정 동안에 시기에 따라 주로 소비되는 에너지원을 나타내고 있는 그림이다. 일반적으로 정자와 난자가 만나 수정란(fertilized egg)이 되면 수정 이후 3일까지 수란관(fallopian tube)에 머물다가 자궁(uterus)으로 이동하게 되는데 상기 수란관과 자궁의 환경이 다르고 수정란이 그때마다 사용하는 영양분(nutriments)이 다르다. 즉 수란관에 머물러있는 전핵(pronucleus) 시기부터 8세포기 까지는 파이루베이트(pyruvate)나 락테이트(lactate)를 주 에너지원으로 소비하다가 8세포기 이후 부터는 글루코스(glucose)를 주로 소비한다. 이렇게 영양분의 조건이 달라지면서 이에 따른 산소소모량(oxygen consumption)도 달라진다. 수란관은 자궁과 다르게 실제로는 거의 무산소(anaerobic) 상태이다. 이와 같이 초기 발달에서부터 배반포에 이르기까지 소비되는 에너지 원이 다르고 이에 따라 제공되는 산소 조건도 상이하다. 1 is a diagram showing energy sources mainly consumed according to time during the development of blastocysts of embryos after fertilization. In general, when sperm and egg meet and become a fertilized egg, it stays in the fallopian tube for 3 days after fertilization and then moves to the uterus. (nutriments) are different. In other words, pyruvate or lactate is consumed as the main energy source from the pronucleus period to the 8-cell stage, and then glucose (glucose) is mainly consumed after the 8-cell stage. As the nutrient conditions change in this way, the oxygen consumption also changes. Unlike the uterus, the oviduct is actually almost anaerobic. As such, the energy source consumed from the initial development to the blastocyst is different, and the oxygen conditions provided accordingly are different.

한편 배아를 체외배양을 통해 성공적으로 배양하기 위해서는 1) 기본 배양액 조건(chemical components, buffer system, osmolality), 2) 배양액 첨가물(amino acids, energy substrates, chelating agents, vitamins, proteins, macromolecules), 3) 온도와 공기 조건(temperature maintenance, carbon dioxide & oxygen concentration, VOCs), 4)정적인 배양법(open culture, microdrop culture, microwells, microchannels), 5)동적인 배양법(shaking/rotation, tiling, vibration, microfluidics), 6)배아의 관찰 방법(interval monitoring, real-time monitoring, morphokinetics) 등에 대한 개선과 최적화를 고려해야한다. 그러나 현재까지 국내외적으로 배아의 발생 시기에 최적화된 유동적이고 역동적인 가스 공급시스템을 가진 배양기는 보고된 바 없다. 상술한 바와 같이, 종래 상용화 되고 있는 배양기들은 20% 또는 5%의 산소 농도를 배양기간 동안 일정한 농도로 제공할 뿐이다. Meanwhile, in order to successfully culture embryos through in vitro culture, 1) basic culture medium conditions (chemical components, buffer system, osmolality), 2) culture medium additives (amino acids, energy substrates, chelating agents, vitamins, proteins, macromolecules), 3) Temperature and air conditions (temperature maintenance, carbon dioxide & oxygen concentration, VOCs), 4) static culture (open culture, microdrop culture, microwells, microchannels), 5) dynamic culture (shaking/rotation, tiling, vibration, microfluidics) , 6) Improvement and optimization of embryonic observation methods (interval monitoring, real-time monitoring, morphokinetics) should be considered. However, to date, no incubator has been reported domestically and internationally with a fluid and dynamic gas supply system optimized for embryonic development. As described above, conventionally commercialized incubators only provide an oxygen concentration of 20% or 5% at a constant concentration during the incubation period.

도 2는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 개략적인 형태를 나타내고 있는 개요도이다. 도시된 바와 같이 사각형의 배양기에는 생식세포를 수용하고 배양할 수 있는 복수의 배양챔버(150)가 구성되어 있다. 또한 디스플레이(155) 상기 배양챔버(150)에 수용된 생식세포는 최초 배양시점부터 컴퓨터(미도시)에 입력된 값에 따라 온도, 습도 및 가스가 공급되고 이를 디스플레이(155)를 통해 확인할 수 있다. 디스플레이(155)를 통해 배양챔버(150)에 공급되는 배양조건을 실시간으로 개별적으로 확인할 수 있으며 연구자의 목적에 따라 조정이 가능하다. 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)는 상술한 바와 같이 미리 프로그램된 일정 산소 농도만을 공급하는 것이 아닌 배양기간이 경과하고 배아 발달이 진행됨에 따라 산소 농도가 조절된 가스가 공급되는 것이 특징이다. 상기 최초 배양시점은 conventional IVF 또는 정자 미세주입술(intracytoplasmic sperm injection, ICSI)에 따라 다소 차이가 날 수 있으나 일반적으로 난자에 정자를 처리한 시점을 의미한다. 이때 상기 생식세포는 정모세포(spermatocyte), 정자(sperm), 난자(oocyte), 수정란(fertilized egg), 배아(embryo), 상실배(morular), 배반포(blastocyst)일 수 있다. 또한 신규 생식세포 배양기(100) 하부에는 VOC 필터(130)가 설치되어 가스 혼합기로부터 제공된 혼합가스에 포함되어 있는 휘발성 유기용매를 여과하여 깨끗한 가스를 배양챔버(150)에 공급한다. 2 is a schematic diagram showing a schematic form of a novel germ cell incubator 100 of the present invention. As shown, a plurality of culture chambers 150 capable of accommodating and culturing reproductive cells are configured in the rectangular incubator. In addition, the reproductive cells accommodated in the display 155 and the culture chamber 150 are supplied with temperature, humidity, and gas according to values input to a computer (not shown) from the initial culture point, and can be checked through the display 155. The culture conditions supplied to the culture chamber 150 can be individually checked in real time through the display 155 and can be adjusted according to the purpose of the researcher. The novel germ cell incubator 100 of the present invention is characterized in that, as described above, not only a predetermined oxygen concentration programmed in advance is supplied, but a gas whose oxygen concentration is adjusted as the culture period elapses and embryo development proceeds. The initial culture point may vary somewhat depending on conventional IVF or intrasperm microinjection (ICSI), but generally refers to the point at which sperm is treated in an egg. In this case, the reproductive cells may be spermatocytes, sperm, oocytes, fertilized eggs, embryos, morulars, and blastocysts. In addition, a VOC filter 130 is installed under the new germ cell incubator 100 to filter the volatile organic solvent contained in the mixed gas provided from the gas mixer to supply clean gas to the culture chamber 150.

상기 도 2는 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)는 본 발명의 형태적 특징을 용이하게 설명하기 위해 7개의 배양챔버(150)를 포함하는 배양기 형태를 도시하였으나 이는 연구자의 환경 및 실험 조건을 고려하여 증감하여 제조될 수 있다. 2 shows the form of the incubator including seven culture chambers 150 in order to easily describe the morphological features of the novel germ cell incubator 100 of the present invention, but this shows the environment and experimental conditions of the researcher. It can be manufactured by increasing or decreasing it in consideration.

도 3은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 제조과정을 나타내는 것으로 배양챔버(150)의 싱글 유닛을 나타내는 사진이다. 상기 싱글 유닛은 개폐형으로 내부에는 배양용기의 형태에 맞게 수용공간이 형성되어 있어 커버를 열고 생식세포가 포함되어 있는 배양용기를 안전하게 장착할 수 있다. 배양챔버(150)의 싱글 유닛에는 최대 2개의 배양용기를 수용할 수 있고 도 4 및 5를 참고 하면 신규 생식세포 배양기(100)는 7개의 싱글 유닛을 포함하고 있으므로 총 14개의 배양용기를 한번에 수용하여 배양할 수 있다. 또한 상기 배양챔버(150)의 배양조건을 동일하게 적용하여 배양할 수 있고 배양챔버(150) 각각의 배양조건을 달리하여 개별적으로 배양할 수 있다. 이때 상기 배양조건은 온도, 습도 및 가스 농도를 의미한다. 3 is a photograph showing a single unit of the culture chamber 150 as showing the manufacturing process of the novel germ cell incubator 100 of the present invention. The single unit is an open/closed type, and an accommodation space is formed therein according to the shape of the culture vessel, so that the cover can be opened and the culture vessel containing the reproductive cells can be safely mounted. A single unit of the culture chamber 150 can accommodate up to two culture vessels, and referring to Figs. 4 and 5, the new germ cell incubator 100 contains 7 single units, thus accommodating a total of 14 culture vessels at once. Can be cultured. In addition, the culture conditions of the culture chamber 150 may be applied and cultured, and the culture conditions of each culture chamber 150 may be changed and cultured individually. At this time, the culture conditions mean temperature, humidity and gas concentration.

아울러 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)는 종래 desk top이 아닌 table top 배양기이다. 최근 개발되고 있는 배양기의 추세는 시험관아기 시술에서는 일반 세포와 달리 소수의 배아만을 체외에서 배양하는 관계로 기존의 일반 세포배양에서 사용하던 대용량의 desk top 배양기 보다는 소형의 table top 배양기가 선호되고 있다. 따라서 생식세포를 배양하는 연구자의 연구환경 및 편의성을 고려하여 제조되었다. In addition, the novel reproductive cell incubator 100 of the present invention is a table top incubator rather than a conventional desk top. The trend of the recently developed incubator is that in vitro in vitro procedures, unlike normal cells, only a small number of embryos are cultured in vitro, so a small table top incubator is preferred over the large-capacity desk top incubator used in conventional cell culture. Therefore, it was manufactured in consideration of the research environment and convenience of researchers culturing germ cells.

도 6의 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 특징인 이중채널 가스공급(double channel gas supply, DCGS) 시스템에 대해 개략적으로 나타내고 있는 개요도이다. 도시한 바와 같이 배양챔버에 공급되는 산소(O2), 이산화탄소(CO2) 및 질소(N2)를 각각 담고 있는 가스적재용기가 있고 상기 산소, 이산화탄소 및 질소가 혼합된 혼합가스를 담지하는 가스혼합챔버(170)가 구성되어 있다. 또한 상기 가스혼합챔버(170) 내의 산소, 이산화탄소 및 질소의 각각의 농도를 측정하기 위한 가스센서가 구성되어 있고 가스혼합챔버(170)에서 혼합된 혼합가스는 VOC 필터(130)를 통해 여과되고 가스공급관(160)을 통해 배양챔버(150)에 공급된다. 상기 가스혼합챔버(170)의 특징은 가스혼합챔버(170) 내의 혼합가스는 배양초기 설정값에 따른 제1혼합가스에서 일정 시간 경과 후 상기 제1혼합가스와 조성(가스 농도)이 다른 제2혼합가스로 변경이 되도록 조절되는 것을 특징이다. 최초 배양시점에서 타이머에 설정된 일정 시간이 경과한 후에 상기 제1혼합가스의 농도는 가스센서(175)에 의해 감지되고 혼합가스 농도를 재조정한 후 제2혼합가스를 다시 배양챔버(150)에 공급하게 된다. 이때 상기 제1혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 3~6% 및 N2 75~90%일 수 있고 제2혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 1~3% 및 N2 75~90%일 수 있으며 상기 재조정되는 시간은 최초 배양시점에서 48 내지 96 시간일 수 있고 바람직하게는 72시간일 수 있다. 상기 혼합가스의 제공은 상기와 같이 가스센서 및 가스혼합챔버를 작동을 제어하는 컴퓨터의 설정에 따라 산소, 이산화탄소 및 질소를 각각 담고 있는 가스적재용기로부터 혼합가스를 배양챔버(150)로 공급하는 것도 가능하고 컴퓨터의 작동에 따라 가스를 설정값에 맞게 혼합하는 것이 아닌 산소, 이산화탄소 및 질소의 농도가 혼합된 제1혼합가스 적재용기 및 제2혼합가스 적재용기를 준비하여 배양시기에 맞게 순차적으로 공급하는 방법도 가능하다. 이는 연구자의 연구 목적 및 실험 환경에 적절히 조절될 수 있다. 6 is a schematic diagram schematically showing a double channel gas supply (DCGS) system that is a characteristic of the novel germ cell incubator 100 of the present invention. As shown, there is a gas loading container each containing oxygen (O 2 ), carbon dioxide (CO 2 ) and nitrogen (N 2 ) supplied to the culture chamber, and a gas that supports the mixed gas of the oxygen, carbon dioxide and nitrogen The mixing chamber 170 is configured. In addition, a gas sensor for measuring the respective concentrations of oxygen, carbon dioxide and nitrogen in the gas mixing chamber 170 is configured, and the mixed gas mixed in the gas mixing chamber 170 is filtered through the VOC filter 130 and It is supplied to the culture chamber 150 through the supply pipe 160. The characteristic of the gas mixing chamber 170 is that the mixed gas in the gas mixing chamber 170 is a second mixed gas having a different composition (gas concentration) from the first mixed gas after a certain period of time has elapsed in the first mixed gas according to the initial set value of culture. It is characterized in that it is controlled to be changed to a mixed gas. The concentration of the first mixed gas is sensed by the gas sensor 175 after a certain period of time set in the timer has elapsed from the initial cultivation time, and the second mixed gas is supplied to the culture chamber 150 again after the concentration of the mixed gas is readjusted. Is done. At this time, the first concentration of the gas mixture is CO 2 3 ~ 7%, O 2 3 ~ may be 6% and N 2 75 ~ 90% and the concentration of the second gas mixture is CO 2 3 ~ 7%, O 2 1 ~ 3% and N 2 may be 75 to 90%, and the readjusted time may be 48 to 96 hours from the time of the initial culture, and preferably 72 hours. The supply of the mixed gas may also supply the mixed gas to the culture chamber 150 from a gas loading container each containing oxygen, carbon dioxide, and nitrogen according to the settings of the computer that controls the operation of the gas sensor and the gas mixing chamber as described above. It is possible to prepare the first mixed gas loading container and the second mixed gas loading container in which the concentrations of oxygen, carbon dioxide and nitrogen are mixed instead of mixing the gas according to the set value according to the operation of the computer, and supply them sequentially according to the culture period. It is also possible to do it. This can be appropriately adjusted to the research purpose and experimental environment of the researcher.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but may be implemented in various different forms, and the following embodiments make the disclosure of the present invention complete, and the scope of the invention to those of ordinary skill in the art. It is provided to fully inform you.

실시예 1: 배아 독성 확인 실험 Example 1: Embryo toxicity confirmation experiment

본 발명자들은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 효용성을 검증하기 위해 마우스 배아를 이용하여 배아 독성 확인 실험을 수행하였다. 구체적으로 BDF마우스 PN세포기 배아를 배양한 후 24시간 후에 관찰하였을 때, 2-세포기로 난할이 진행되어 있음을 확인하여 배아독성 여부를 판정하였고 실험은 5회 반복하였다. In order to verify the effectiveness of the novel germ cell incubator 100 of the present invention, the present inventors performed an embryotoxicity test using mouse embryos. Specifically, when observed 24 hours after culturing the BDF mouse PN cell-based embryos, it was confirmed that the two-cell stage had progressed to determine whether the embryo was toxic, and the experiment was repeated 5 times.

그 결과, 하기 표 1과 같이 대조군인 20% 산소농도의 경우 86.87 ±5.77%, 5% 산소농도의 경우 87.92 ±3.51%의 평균 난할율을 나타내었으나 조정된 산소농도(5 -> 2%, hCG 주사 3일 후 5%에서 2%로 변경))는 93.14 ±2.00%로 상기 실험군 간의 유의적인 차이를 나타내지 않았다. 실제적인 배아독성은 5% 산소농도 12.08%, 20% 산소농도 13.13% 및 본 5 -> 2% 산소농도에서 6.86%를 나타내어 배아 독성은 없는 것으로 사료된다. 상기 배아 독성 확인 실험 결과를 하기 표 1에 요약하였다. As a result, as shown in Table 1 below, in the case of the control 20% oxygen concentration, 86.87 ±5.77%, and in the case of 5% oxygen concentration, 87.92 ±3.51% were averaged, but the adjusted oxygen concentration (5 -> 2%, hCG 3 days after injection, 5% to 2%)) was 93.14±2.00%, which did not show a significant difference between the experimental groups. The actual embryotoxicity was 6.86% at 5% oxygen concentration 12.08%, 20% oxygen concentration 13.13%, and this 5 -> 2% oxygen concentration, so there is no embryo toxicity. The results of the embryo toxicity confirmation experiment are summarized in Table 1 below.

배아 독성 확인 실험 결과 Embryo toxicity confirmation experiment result 2cell 2cell
cleavage rate(%)cleavage rate(%) 1차Primary 2차Secondary 3차3rd 4차4th 5차5th MeanMean S.E.MS.E.M 5%5% 83.33%83.33% 81.25%81.25% 91.67%91.67% 83.33%83.33% 100%100% 87.92%87.92% 3.51%3.51% 5%->2%5%->2% 93.33%93.33% 94%94% 100%100% 88.37%88.37% 90%90% 93.14%93.14% 2.00%2.00% 20%20% 89.29%89.29% 89.58%89.58% 65.22%65.22% 90.24%90.24% 100%100% 86.87%86.87% 5.77%5.77%

실시예 2: 배아 발생율 확인 실험 Example 2: Embryo incidence confirmation experiment

본 발명자들은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 효용성을 검증하기 위해 마우스 배아를 이용하여 배아 발생율 확인 실험을 수행하였다. 구체적으로 BDF마우스 PN세포기 배아를 배양한 후 96시간 후에 관찰하였을 때, 포배기로 발생된 배아의 비율을 확인하여 배아 발생율을 확인하였고 실험은 5회 반복 수행하였다. In order to verify the effectiveness of the novel germ cell incubator 100 of the present invention, the present inventors performed an experiment to confirm the incidence of embryos using mouse embryos. Specifically, when observed 96 hours after culturing BDF mouse PN cell embryos, the percentage of embryos generated by blastocyst was confirmed to confirm the embryo incidence rate, and the experiment was repeated 5 times.

그 결과, 하기 표 2와 같이 대조군인 20% 산소농도의 경우 53.99 ±2.33%, 5% 산소농도의 경우 75.71 ±2.18%의 평균 발달율을 나타내었으며 실험군(5 -> 2%, hCG 주사 3일 후 5%에서 2%로 변경)의 경우 75.58 ±4.63%의 평균 발달율을 나타내었다. 20% 산소농도의 대조군과 실험군의 발달율은 유의적 차이가 있었으나 5% 대조군과는 유의적 차이가 나타나지 않았다(도 7). 상기 배아 발생율 확인 실험 결과를 하기 표 2에 요약하였다. As a result, as shown in Table 2 below, the control group 20% oxygen concentration showed an average development rate of 53.99 ±2.33%, 5% oxygen concentration was 75.71 ±2.18%, and the experimental group (5 -> 2%, 3 days after hCG injection). Changed from 5% to 2%) showed an average development rate of 75.58 ± 4.63%. There was a significant difference in the development rate between the control group and the experimental group at 20% oxygen concentration, but there was no significant difference from the 5% control group (Fig. 7). The results of the embryo incidence confirmation experiment are summarized in Table 2 below.

배아 발생율 확인 실험 결과Embryo generation rate confirmation experiment Blastocyst rate(%)Blastocyst rate(%) 1차Primary 2차Secondary 3차3rd 4차4th 5차5th MeanMean S.E.MS.E.M 5%5% 70.00%70.00% 70.83%70.83% 79.17%79.17% 78.57%78.57% 80.00%80.00% 75.71%75.71% 2.18%2.18% 5%->2%5%->2% 63.33%63.33% 84.00%84.00% 88.46%88.46% 72.09%72.09% 70.00%70.00% 75.58%75.58% 4.63%4.63% 20%20% 50.00%50.00% 47.92%47.92% 56.52%56.52% 60.98%60.98% 54.55%54.55% 53.99%53.99% 2.33%2.33%

실시예 3: 세포사멸 실험 Example 3: cell death experiment

본 발명자들은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)의 효용성을 검증하기 위해 마우스 배아를 이용하여 생쥐 배반포의 세포사멸 실험을 수행하였다. 구체적으로 총 3차에 걸친 반복 실험을 진행 하였으며, BDF 마우스 PN세포기 배아를 배양한 후 96시간 후에 포배기 단계의 배아를 확인하고 이를 포름알데하이드를 사용하여 고정하였다. 고정된 포배기는 TUNEL kit를 사용하여 염색하였으며, 실험과정은 다음과 같다. Permiablization을 위해 0.2% triton x-100에 1시간 반응 시켰으며, PBS 워싱 후 Equilibration buffer에 10분 반응하였다. 반응 후, TdT reaction mix를 사용하여 암실 및 37℃조건에서 1시간 반응시켰다. PBS washing 후 DAPI를 사용하여 카운터 염색을 한 뒤 형광현미경 하에서 관찰하였다. The present inventors performed apoptosis experiments of mouse blastocysts using mouse embryos to verify the effectiveness of the novel germ cell incubator 100 of the present invention. Specifically, a total of three repeated experiments were carried out, and 96 hours after culturing BDF mouse PN cell-stage embryos, the embryos in the blastocyst stage were identified and fixed using formaldehyde. The fixed blastocyst was dyed using the TUNEL kit, and the experiment procedure is as follows. For permiablization, it was reacted in 0.2% triton x-100 for 1 hour, and after washing with PBS, it was reacted in Equilibration buffer for 10 minutes. After the reaction, it was reacted for 1 hour in the dark and at 37°C using a TdT reaction mix. After washing with PBS, counter staining was performed using DAPI and observed under a fluorescence microscope.

그 결과, 하기 표 3과 같이 대조군(20%)과 비교하여 실험군(5%, 5->2%)의 세포사멸이 유의적으로 낮게 발생하는 것을 확인하였다(도 8 및 9). 상기 세포사멸 실험 결과를 하기 표 3에 요약하였다. As a result, it was confirmed that apoptosis of the experimental group (5%, 5->2%) was significantly lower than that of the control group (20%) as shown in Table 3 below (FIGS. 8 and 9). The results of the apoptosis experiment are summarized in Table 3 below.

세포사멸 실험 결과Cell death test result 세포사멸 지수(%)Apoptosis Index (%) 20%(N=50)20% (N=50) 5%(N=83)5% (N=83) 5 to 2%(N=76)5 to 2% (N=76) mean ± S.E.Mmean ± S.E.M 8.7 ± 0.8a 8.7 ± 0.8 a 4.5 ± 0.5b 4.5 ± 0.5 b 4.1 ± 0.3b 4.1 ± 0.3 b

실시예 4: 외향성장 실험 Example 4: Outward growth experiment

본 발명자들은 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)를 이용하여 배양한 배아의 발달 후 포배기의 peri-implantation 능력을 확인하기 위해 포배기 배아의 outgrowth 능력을 평가하였다. 구체적으로 BDF마우스 PN세포기의 배아를 배양한 후 96시간 후에 포배기 단계의 배아를 확인하고, 확인된 포배기의 투명대를 제거하기 위해 Thyrodes solution 제품에 1분 반응 후, 투명대가 제거 된 포배기를 10% FBS가 포함된 DMEM배지에서 배양한다. 배양 후 3일째 되는 날 배양접시에 부착되어 자라는 outgrowth 비율 및 면적을 평가하였다. 포배기 배아의 외향성장(outgrowth) 면적은 image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다. The present inventors evaluated the outgrowth ability of the blastocyst embryo to confirm the peri-implantation capability of the blastocyst after development of the embryo cultured using the novel germ cell incubator 100 of the present invention. Specifically, 96 hours after culturing the embryos of the BDF mouse PN cell stage, the embryos at the blastocyst stage were identified, reacted with the Thyrodes solution for 1 minute to remove the confirmed blastocyst stage, and then the blastocyst was removed by 10%. Incubate in DMEM medium containing FBS. On the third day after cultivation, the outgrowth ratio and area grown by attaching to the culture dish were evaluated. The outgrowth area of blastocyst embryos was measured using image J software.

그 결과, 하기 표 4와 같이 대조군인 20% 산소농도의 경우 가장 낮은 0.70 ±0.07 mm2, 5% 산소농도의 경우 1.05 ±0.05 mm2의 외향성장 면적을 나타내었으나 실험군(5 -> 2%, hCG 주사 3일 후 5%에서 2%로 변경)의 경우 가장 높은 1.11 ±0.07 mm2의 면적을 나타내었다(도 10). 상기 외향성장 실험 결과를 하기 표 4에 요약하였다. As a result, as shown in Table 4 below, in the case of the 20% oxygen concentration as the control group, the lowest 0.70 ±0.07 mm 2 , in the case of the 5% oxygen concentration, the outward growth area was 1.05 ±0.05 mm 2 , but the experimental group (5 -> 2%, 3 days after the injection of hCG, it was changed from 5% to 2%), showing the highest area of 1.11 ±0.07 mm 2 (FIG. 10 ). The results of the outward growth experiment are summarized in Table 4 below.

외향성장 실험 결과Outward Growth Experiment Results 20%20% 5%5% 5 to 2%5 to 2% %of outgrowth embryos on 7.5 dpc%of outgrowth embryos on 7.5 dpc 38.43 ± 0.4638.43 ± 0.46 58.32 ± 2.26b 58.32 ± 2.26 b 71.30 ± 6.48b 71.30 ± 6.48 b mean area of TE, mm2 mean area of TE, mm 2 0.70 ± 0.05a 0.70 ± 0.05 a 1.05 ± 0.07b 1.05 ± 0.07 b 1.11 ± 0.07b 1.11 ± 0.07 b

결론적으로 본 발명의 신규 생식세포 배양기(100)는 시험관아기 시술에 최적화된 이중채널 가스공급(DCGS) 시스템이 장착되어 높은 배아 발달율, 배반포 발달 율 및 외향성장 효과를 나타내므로 시험관아기 시술의 임신성공율을 높이고 우리나라의 저출산 문제를 해결하는데 기여할 것으로 사료된다. In conclusion, the novel germ cell incubator 100 of the present invention is equipped with a dual-channel gas supply (DCGS) system optimized for in vitro in vitro procedures to exhibit high embryonic development rate, blastocyst development rate, and outward growth effect. It is believed that it will contribute to raising the level of children and solving the problem of low fertility in Korea.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.The present invention has been described with reference to the above-described embodiments, but these are merely exemplary, and those of ordinary skill in the art will appreciate that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom. Therefore, the true technical protection scope of the present invention should be determined by the technical spirit of the appended claims.

100:신규 생식세포 배양기
130, 173:VOC 필터
150:배양챔버
155:디스플레이
170:가스혼합챔버
175:가스센서
160:가스공급관100: new germ cell incubator
130, 173: VOC filter
150: culture chamber
155: display
170: gas mixing chamber
175: gas sensor
160: gas supply pipe

Claims (5)

생식세포를 수용하고 배양하기 위한 배양챔버:
배양챔버에 공급되는 산소, 이산화탄소 및 질소를 각각 담고 있는 가스적재용기;
상기 산소, 이산화탄소 및 질소가 혼합된 혼합가스를 담지하는 가스혼합챔버;
상기 가스혼합챔버 내의 산소, 이산화탄소 및 질소의 각각의 농도를 측정하기 위한 가스센서; 및
상기 혼합가스를 배양챔버로 공급하는 가스공급관; 및
상기 가스센서 및 가스혼합챔버를 작동을 제어하는 컴퓨터를 포함하는, 생식세포 배양용 배양기에 있어서,
상기 가스혼합챔버 내의 혼합가스는 배양초기 타이머의 설정값에 따른 제1혼합가스에서 일정 시간 경과후 상기 제1혼합가스와 조성이 다른 제2혼합가스로 변경이 되도록 조절되는 것을 특징으로 하는, 생식 세포 배양기.Culture chamber for receiving and culturing germ cells:
A gas loading container each containing oxygen, carbon dioxide and nitrogen supplied to the culture chamber;
A gas mixing chamber for supporting the mixed gas in which the oxygen, carbon dioxide and nitrogen are mixed;
A gas sensor for measuring concentrations of oxygen, carbon dioxide, and nitrogen in the gas mixing chamber; And
A gas supply pipe supplying the mixed gas to the culture chamber; And
In the incubator for germ cell culture comprising a computer for controlling the operation of the gas sensor and the gas mixing chamber,
The mixed gas in the gas mixing chamber is controlled to be changed to a second mixed gas having a composition different from that of the first mixed gas after a certain period of time from the first mixed gas according to the set value of the culture initial timer. Cell incubator. 제1항에 있어서,
상기 제1혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 3~6% 및 N2 75~90%이고 상기 제2혼합가스의 농도는 CO2 3~7%, O2 1~3% 및 N2 75~90%인, 배양기. The method of claim 1,
The concentration of the first mixture gas is CO 2 3 ~ 7%, O 2 3 ~ 6% and N 2 75 ~ 90% and the second concentration of the gas mixture is CO 2 3 ~ 7%, O 2 1 ~ 3% And N 2 75-90%, incubator. 제1항에 있어서,
테이블탑(tabletop) 형태를 갖춘, 배양기. The method of claim 1,
A tabletop type, incubator. 제1항에 있어서,
상기 생식세포는 수정란 또는 배아인, 배양기 The method of claim 1,
The germ cells are fertilized eggs or embryos, incubator 제1항에 있어서,
제1혼합가스를 공급 후 48 내지 96 시간 경과시점에서 제2혼합가스를 공급하는 배양기.



The method of claim 1,
An incubator for supplying the second mixed gas 48 to 96 hours after supplying the first mixed gas.
KR1020190031455A 2019-03-19 2019-03-19 Novel incubator for gamete and embryo KR20200111574A (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190031455A KR20200111574A (en) 2019-03-19 2019-03-19 Novel incubator for gamete and embryo

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020190031455A KR20200111574A (en) 2019-03-19 2019-03-19 Novel incubator for gamete and embryo

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20200111574A true KR20200111574A (en) 2020-09-29

Family

ID=72661275

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020190031455A KR20200111574A (en) 2019-03-19 2019-03-19 Novel incubator for gamete and embryo

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR20200111574A (en)

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Conaghan et al. Effects of pyruvate and glucose on the development of human preimplantation embryos in vitro
US20020009803A1 (en) Method and apparatus for culturing cells and tissues
Sutton et al. Effects of in-vivo and in-vitro environments on the metabolism of the cumulus–oocyte complex and its influence on oocyte developmental capacity
CN104017728B (en) Inseminate for mankind's ovum and sperm in vitro and the culture apparatus of early embryo development, nutrient solution and culture system
Swain et al. New pH-buffering system for media utilized during gamete and embryo manipulations for assisted reproduction
CN111073848A (en) Cleavage stage embryo culture composition and cleavage stage embryo culture solution
Ali et al. Effect of culture systems on mouse early embryo development
CN104812887A (en) Humidity control in chemical reactors
KR100420492B1 (en) High-density cultivating apparatus for phytoplankton
KR101855191B1 (en) Oocytes and early embryos culture dish
KR101640480B1 (en) Bioreactor for the cultivation of plant cells and tissues
Hyslop et al. A novel isolator-based system promotes viability of human embryos during laboratory processing
KR101459022B1 (en) Semicontinuous cultivation system for photo organism and the method thereof
KR20200111574A (en) Novel incubator for gamete and embryo
KR101772151B1 (en) Time lapse incubator
JPH01174373A (en) Laboratory dish, laboratory dish system, cell culture apparatus using thereof and culturing method
WO1998030676A1 (en) Method and apparatus for culturing cells and tissues
CN112940934A (en) In-vitro life-sustaining perfusion culture system and control method thereof
CN112831417A (en) In-vitro life-sustaining perfusion culture system and control method thereof
Kobayashi et al. Low oxygen and glucose improves the development of fertilized bovine oocytes in defined medium without somatic cells
CN201933085U (en) Cell-exposure oxygen-deficient environment experimental device
DE102010010293A1 (en) Solid-phase fermenter, useful for contamination-free culturing of microorganisms on a solid substrate, comprises rotationally symmetric reactor, outer and inner drums in heating chamber, septum integrated in nozzle and viewing glasses
CN216237091U (en) Auxiliary device for appearance inspection of oocyte and embryo incubator
Tan et al. Generation of 2C-like mouse embryonic stem cells in vivo to evaluate developmental potency
Turner Embryo culture

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
E601 Decision to refuse application