KR20200105256A - 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 애기장대 유래 자이겐티아 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법에 관한 것으로, 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자 및 자이겐티아 돌연변이 유전자는 제초제 저항성 형질이 개선된 식물체의 육종에 이용될 수 있을 것이다.

Description

식물체의 제초제 저항성을 조절하는 애기장대 유래 자이겐티아 유전자 및 이의 용도{GIGANTEA gene from Arabidopsis thaliana for regulating herbicide resistance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 애기장대 유래 자이겐티아 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

자이겐티아(GIGANTEA) 단백질은 애기장대뿐만 아니라 대부분의 다른 식물에서 단일 유전자에 의해 코딩되고, 관속식물(vascular plants)에 매우 잘 보존되어 있으며 광주기적 개화시기를 매개하는 생체시계에 의해 조절된다. 자이겐티아는 저녁 시간대에 생체시계 주요인자인 TOC1(Timing of Cab expression 1) 및 PRR5(Pseudo-Response Regulator 5) 단백질의 표적화된 프로테오좀 관련 분해를 유도하는 F-박스 단백질인 ZTL(ZEITLUPE)과 결합하여 안정화시킨다. 자이겐티아는 또한 광 신호전달, 하배축(hypocotyl) 길이 신장, 당 신호전달, 전분 축적, 엽록소 축적, 증산(transpiration)과 같은 다양한 식물 생리 반응과 염, 저온 및 가뭄과 같은 비생물적학적 스트레스에 대한 내성 획득 등과 같은 다양한 식물내 생리반응에 관여한다. 그러나, 아직까지 자이겐티아 단백질내 보존된 도메인 및 분자 수준에서의 기능은 확인되지 않고 있다.

한편, 프로토포르피리노겐 옥시다아제 IX(protoporphyrinogen IX oxidase, 이하 PPO)는 프로토포르피리노겐 IX로부터 프로토포르피린 IX(protoporphyrin IX)로의 산화과정을 촉매한다. 프로토포르피리노겐 IX이 프로토포르피린 IX로 산화된 후 Mg-chelatase에 의해 마그네슘과 결합하면 엽록소가 합성되고, Fe-chelatase에 의해 철과 결합하면 헴(Heme)이 합성된다. PPO의 활성이 저해되면 엽록소와 헴의 합성이 억제되고, 기질인 프로토포르피리노겐 IX이 정상적인 포르피린 합성 경로에서 이탈하여 엽록체에서 세포질로 이동하여 빠르게 프로토포르피린 IX으로 산화되고 세포막에 축적된다. 이렇게 축적된 프로토포르피린 IX은 광과 산소 분자의 존재 하에서 활성이 높은 일중항산소(singlet oxygen, O₂)를 발생시켜 식물의 세포막을 파괴함으로써 급속한 식물 세포 사멸을 일으킨다. 이러한 원리를 이용하여 PPO 활성을 억제하는 제초제가 개발되었으며, 현재까지 화학 구조에 따라 피리미딘디온계(Pyrimidinediones), 디페닐에테르계(Diphenyl-ethers), 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles), 페닐프탈이미드계(Nphenylphthalimides), 티아디아졸계(Thiadiazoles), 옥사디아졸계(Oxadiazoles), 트리아졸리논계(Triazolinones), 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones) 및 기타의 9개 계통의 제초제가 사용되고 있다.

상기 제초제들을 사용하면서도 재배 대상 식물의 생장에는 영향을 미치지 않게 하기 위해서 재배 대상 식물에 상기 제초제들에 대한 저항성을 부여할 필요성이 대두되어 왔다. 이에 따라 원하는 식물체에 제초제 저항성을 부여한 후 제초제 저항성이 없는 경쟁 생물들의 성장을 저해할 수 있는 농도로 제초제를 처리하여 원하는 식물체를 대량으로 재배할 수 있는 기술이 필요하다.

실제 전세계적 다국적 화학회사들이 작물 육종 기업과 합병을 통해 자사의 제초제를 제초제 저항성 작물과 함께 패키지로 판매함으로써 이윤을 창출하고 있으며, 대표적으로 몬산토사의 비선택성 제초제인 라운드업 제초제(글리포세이트계, 전세계 시장 규모 약 60억 달러)와 '라운드업 레디' 농작물(콩, 면화, 옥수수등)을 동시에 판매함으로써 전세계 GMO 농작물의 90%를 석권하고 있다.

한편, 한국등록특허 제1827545호에는 '프로토포르피리노겐 옥시다아제를 이용한 식물 및/또는 조류의 제초제 저항성 부여 또는 증진 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0614221호에는 PAT(phosphinothricin acetyltransferase) 유전자를 이용한 '제초제 저항성 형질전환 도라지의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 애기장대 유래 자이겐티아 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해된 돌연변이체와 야생형 애기장대에 부타페나실 또는 티아페나실 제초제를 처리한 결과, 식물체의 생존율, 식물체 내 항산화 효소 활성 및 항산화 관련 유전자의 발현이 야생형 애기장대에 비해 돌연변이체에서 증가하는 것을 확인하였고, 제초제 처리에 의해 생성된 활성산소는 야생형 애기장대에 비해 돌연변이체에서 감소하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 제초제 저항성이 증가된 돌연변이 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 제초제 저항성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자는 피리미딘디온계 제초제인 부타페나실 및 티아페나실에 대한 저항성을 조절할 수 있으므로, 제초제 저항성이 증가된 식물체를 개발하는데 이용할 수 있다. 또한, 농산품, 가공식품 등의 시료에서 제초제 저항성 작물을 검출, 진단하는 데 유용한 정보를 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 야생형 애기장대(Col-0) 및 자이겐티아 돌연변이체(gi-1 및 gi-2)에 부타페나실 제초제(2mg/L)를 처리하고 7일 후 식물체의 생존 상태를 보여주는 사진(A) 및 생존율을 보여주는 그래프(B)이다.
도 2는 Col-0, gi-1, gi-2 및 GIOX(지이겐티아 과발현체)에 티아페나실 제초제(Terrad'o; 10mg/L)를 처리하고 7일 후 식물체의 생존율을 나타낸 사진(A) 및 식물체 내의 총 클로로필Ⅱ 함량을 나타낸 그래프(B)이다.
도 3은 Col-0, gi-1 및 gi-2에 부타페나실 제초제(10mg/L)를 처리하고 2시간 후 식물체 내에 축적된 과산화수소(H₂O₂; A)와 과산화물음이온(superoxide anion; B) 함량을 분석하기 위한 조직화학적 염색 사진 및 과산화수소의 함량을 정량하여 나타낸 그래프(C)이다.
도 4는 Col-0, gi-1 및 gi-2에 부타페나실 제초제(10mg/L)를 처리하고 2시간 후 식물체 내의 수퍼옥사이드 디스뮤타제(superoxide dismutase, SOD; A), 퍼옥시다아제(peroxidase, Prx; B) 및 카탈라아제(catalase, CAT; C) 활성을 측정한 결과이다.
도 5는 Col-0, gi-1 및 gi-2에 부타페나실 제초제(10mg/L)를 처리하고 2시간 후 식물체 내에 존재하는 항산화 관련 유전자인 CAT1(catalase1), CAT2(catalase2), CAT3(catalase3), CuZnSOD1(CuZn superoxide dismutase1), FeSOD3(Fe superoxide dismutase3), PrxQ(Plant-type peroxiredoxin Q) 및 APX(ascorbate peroxidase)의 발현량을 하우스키핑 유전자 At5g12240로 정량화하여 나타낸 그래프이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법은, 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키거나, 자이겐티아 돌연변이 유전자를 발현시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 증가시키는 것일 수 있거나, 또는 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 증가시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 감소시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제는 자이겐티아 단백질 코딩 유전자에 T-DNA 삽입, 내생 트랜스포존(transposon), X-레이 또는 γ-레이 조사를 통한 돌연변이 유발, RNAi 또는 안티센스 RNA, CRISPR/CAS9 유전자 교정 시스템을 이용하여 자이겐티아 단백질 코딩 유전자의 발현을 억제하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.

본 발명에 따른 자이겐티아 단백질의 범위는 애기장대로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 활성을 의미한다.

또한, 본 발명의 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자는 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 특징이 있으며, 상기 유전자의 범위는 자이겐티아 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서 있어서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 있어서, "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(dominant drug resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주세포가 원핵세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

본 발명의 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법에 있어서, 상기 제초제는 부타페나실(Butafenacil), 사플루페나실(Saflufenacil), 벤즈펜디존(Benzfendizone) 및 티아페나실(Tiafenacil) 등의 피리미딘디온계(Pyrimidinediones); 포메사펜(Fomesafen), 옥시플루오르펜(Oxyfluorfen), 아클로니펜(Aclonifen), 아시플루오르펜 (Acifluorfen), 비페녹스(Bifenox), 에톡시펜(Ethoxyfen), 락토펜(Lactofen), 클로메톡시펜(Chlomethoxyfen), 클로인트로펜(Chlorintrofen), 플루오로글리코펜-에틸(Fluoroglycofen-ethyl) 및 할로사펜(Halosafen) 등의 디페닐에테르계(Diphenyl-ethers); 피라플루펜-에틸(Pyraflufen-ethyl) 및 플루아졸레이트(Fluazolate) 등의 페닐피라졸계(Phenylpyrazoles); 플루미옥사진(Flumioxazin), 시니돈-에틸(Cinidon-ethyl) 및 플루미클로락-펜틸(Flumiclorac-pentyl) 등의 페닐프탈이미드계(N-Phenylphthalimides); 플루티아셋(Fluthiacet) 및 티디아지민(Thidiazimin) 등의 티아디아졸계(Thiadiazoles); 옥사디아길(Oxadiargyl) 및 옥사디아존(Oxadiazon)등의 옥사디아졸계(Oxadiazoles); 카펜트라존(Carfentrazone), 설펜트라존(Sulfentrazone) 및 아자페니딘(Azafenidin) 등의 트리아졸리논계(Triazolinones); 펜톡사존(Pentoxazone)등의 옥사졸리딘디온계(Oxazolidinediones); 및 피라클로닐(Pyraclonil), 플루펜피르-에틸(Flufenpyr-ethyl) 및 프로플루아졸(Profluazol) 등의 기타 제초제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있고, 바람직하게는 피리미딘디온계 제초제일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 부타페나실(Butafenacil) 및 티아페나실(Tiafenacil)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한,

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 애기장대 유래 자이겐티아 단백질은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함하며, 구체적인 내용은 전술한 것과 같다.

또한, 본 발명의 제조 방법에 있어서, 상기 식물세포를 형질전환시키는 방법은 전술한 바와 같으며, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 형질전환된 식물세포는 전식물로 재분화되어야 한다. 캘러스 또는 원형질체 배양으로부터 성숙한 식물의 재분화를 위한 기술은 수많은 여러 가지 종에 대해서 당업계에 주지되어 있다(Handbook of Plant Cell Culture, 1-5권, 1983-1989 Momillan, N.Y.).

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계 제초제일 수 있고, 더욱 바람직하게는 부타페나실 및 티아페나실일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 제조 방법에 있어서, 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시키면 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 증가시킬 수 있고, 또는 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 과발현시키면 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 감소시킬 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체는 자이겐티아 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시킨 경우에는 제초제 저항성이 증가된 것을 특징으로 하며, 자이겐티아 단백질 코딩 유전자의 발현을 증가시킨 경우에는 제초제 저항성의 감소를 특징으로 한다. 상기 자이겐티아 단백질 코딩 유전자의 발현을 저해시킨 경우 자이겐티아 돌연변이 유전자를 포함할 수 있다.

상기 식물체는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽 식물 또는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물일 수 있고, 바람직하게는 쌍자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 애기장대 식물체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 제초제 저항성이 증가된 돌연변이 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다. 상기 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 저해는 유전자에 X-레이를 처리하여 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 유전자의 발현을 저해하는 당업계의 통상의 방법이면 모두 가능할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 제초제 저항성 조절용 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 유효성분으로 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자 또는 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 포함하며, 상기 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자 또는 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환함으로써 식물체의 제초제 저항성을 조절할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물 재료 및 배양 조건

미국 오하이오주립대내 애기장대 생물학 연구 센터(Arabidopsis Biological Research Center, 이하 ABRC)에서 제공하는 자이겐티아 유전자 기능 상실 돌연변이 식물체 gi-1(ABRC 종자등록번호 CS3123)과 gi-2(CS3124)를 분양받아 본 발명에 이용하였다. 각 돌연변이 식물체 제작은 애기장대 야생형(Col-0 ecotype) 식물에 X-ray 조사를 통한 변이를 유도해 자이겐티아 유전자의 exon 11번 자리중 핵산서열 4327-4331에 있는 5bp를 인위적으로 결실시킨 gi-1 돌연변이 식물체와 동일한 방법으로 핵산서열 670-677 사이의 8bp를 결실시킨 gi-2 돌연변이 식물체는 야생형에 비해 약 50%(gi-1)와 25%(gi-2)의 자이겐티아 유전자 발현을 가지고 있는 자이겐티아 유전자 발현 억제 돌연변이 식물체들이다(Fowler S. et al., 1999, EMBO J. 18(17), 4679).

종자의 표면은 0.02%(v/v)의 트리톤(triton) X-100이 포함된 30%(v/v)의 표백제를 4분간 처리하여 소독하였고, 상기 소독된 종자를 4℃에서 2일 동안 보관한 후 MS 배지(Murashige and Skoog Medium)에 파종하였다. 식물체는 온도 22~23℃, 광주기 16/8시간(명/암)으로 설정된 성장 챔프에서 배양하였으며, 광원으로는 100μmol·m^-2·s^-1의 cool-white 형광램프를 사용하였다.

2. 부타페나실 ( Butafenacil ) 및 티아페나실 ( Tiafenacil ) 제초제 처리

3주령 애기장대의 잎에 부타페나실(Sigma-Aldrich, 미국) 2mg/L(4μM) 또는 티아페나실(테라도 Terrad' o, 팜한농, 한국) 1μM을 각각 스프레이로 분사한 후 애기장대의 부타페나실 및 티아페나실에 대한 저항성 및 생존율을 분석하였다. 조직화학적 분석(Histochemical analysis), 과산화수소(H₂O₂) 함량 측정, 항산화 효소 활성 측정 및 항산화 유전자 발현 분석시에는 부타페나실을 10mg/L 농도로 애기장대에 처리하였다.

3. 조직화학적 염색

과산화물음이온(superoxide anion) 및 과산화수소 함량을 분석하기 위해 2시간 동안 10㎎/L의 부타페나실이 처리된 3주령 애기장대를 이용하여 조직화학적 염색을 수행하였다. 우선, 과산화물음이온의 함량을 분석하기 위해 부타페나실이 처리된 애기장대 잎을 NBT(nitroblue tetrazolium; 1 mM NBT, 10 mM sodium azide, 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.6) 용액에서 2시간 동안 염색시키고 클로로필Ⅱ를 제거하기 위해 에탄올로 2번 세척한 후 잎에 나타난 남색 부분을 육안으로 관찰하였다. 또한, 과산화수소 함량을 분석하기 위해서는 부타페나실이 처리된 애기장대 잎을 1㎎/㎖의 DAB(3,3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride; pH 3.8) 용액에서 염색시키고 클로로필Ⅱ를 제거하기 위해 에탄올로 2번 세척한 후 잎에 나타난 갈색 부분을 육안으로 관찰하였다.

4. 정량적 실시간 PCR(Quantitative real time PCR , qRT - PCR )

3주령 애기장대에 부타페나실 10㎎/L를 2시간 동안 분사한 후 액체질소를 이용하여 냉동분쇄하였다. 총 RNA는 HiGene^TM Total RNA Prep kit(Biofact, 한국)로 추출하였고, RevertAid First Strand cDNA synthesis kit(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 상기 추출된 총 RNA(3㎍)로부터 cDNA를 합성하였다. 유전자 발현을 확인하기 위해 TOPreal^TM qPCR PreMIX kit(Enzynomics, 한국)를 이용하여 CFX96 Touch^TM Real-Time PCR Detection System(Bio-Rad Laboratories, 미국)으로 qRT-PCR을 수행하였고, PCR 조건은 하기 표 1과 같다. 융해곡선(melt curve)은 특정 부위만 증폭되었는지 확인하기 위해 분석되었고, 모든 유전자의 발현량은 애기장대 하우스키핑 유전자 At5g12240를 이용하여 표준화후 정량하였다. 실험에 사용된 유전자는 CAT1(catalase1), CAT2(catalase2), CAT3(catalase3), CuZnSOD1(CuZn superoxide dismutase1), FeSOD3(Fe superoxide dismutase3), PrxQ(Plant-type peroxiredoxin Q) 및 APX(ascorbate peroxidase)이며, 상기 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 서열은 하기 표 2와 같다.

PCR 반응 조건

단계	온도(℃)	시간
전-변성	95	10분
변성	95	10초
결합	60	30초
신장	72	20초
변성 단계로 돌아가 45회 추가 반복
보관	4	∞

프라이머 서열 정보

유전자명	프라이머 명칭	프라이머 서열(5'→3') (서열번호)	Tm(℃)
CAT1	CAT1_F	AGGAGCCAATCACAGCC (3)	55.4
	CAT1_R	TCAAGACCAAGCGACCA (4)	54.5
CAT2	CAT2_F	AACTCCGCCTGCTGTCTG (5)	58.7
	CAT2_R	ATAGGGCATCAATCCATC (6)	49.9
CAT3	CAT3_F	TCACAGCCACGCCACTAA (7)	57.9
	CAT3_R	AGAACCAAGCGACCAACC (8)	56.6
CuZn SOD1	CuZn SOD_F	CCTCTACCAACCCCAAATCTC (9)	56.7
	CuZn SOD_R	GATCAGAAGTGAGAGCAGTCG (10)	57.3
FeSOD3	FeSOD_F	GGATGTGTGGGAGCACTCTT (11)	58.7
	FeSOD_R	GATTGGGATGTTGGGTTCAC (12)	55.7
APX1	APX1_F	TGACATTCCTTTCCACCCTG (13)	56.4
	APX1_R	CTTGGTAGCATCAGGAAGACG (14)	57.5
PrxQ	PrxQ_F	AGATGACTCTGCTTCTCACAAGGC (15)	61.7
	PrxQ_R	TCCCTGGCAATGCTCCAAACAG (16)	62.4
At5g12240	AT5G12240_F	AGCGGCTGCTGAGAAGAAAGT (17)	57.0
	AT5G12240_R	TCTCGAAAGCCTTGCAAAATCT (18)	56.9

5. 항산화 효소 활성 분석

항산화 효소 활성의 분석을 위해 2시간 동안 부타페나실 10㎎/L가 처리된 3주령 애기장대 내의 SOD(superoxide dismutase) 활성, 과산화수소(hydrogen peroxide) 함량, 퍼옥시다아제(peroxidase) 활성 및 카탈라아제(catalase) 활성을 측정하였으며, SOD 활성은 SOD determination kit(Sigma-Aldrich)로, 과산화수소 함량 및 퍼옥시다아제 활성은 호스래디시 퍼옥시다아제(horseradish peroxidase; Invitrogen, 미국)가 혼합된 Amplex Red reagent로, 카탈라아제 활성은 Amplex Red Catalase Assay kit(Molecular Probes, 미국)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

실시예 1. 식물체의 부타페나실 및 티아페나실 제초제에 대한 저항성 분석

애기장대 식물체에서 부타페나실 제초제에 대한 저항성 분석에서는 야생형 애기장대(이하, Col-O)에 비해 자이겐티아 유전자가 50% 및 25% 수준으로 발현되는 자이겐티아 유전자의 각 기능상실 돌연변이체(gi-1 및 gi-2)를 사용하였다. 3주령 야생형 애기장대와 돌연변이체에 물과 부타페나실(2㎎/L)을 각각 처리하였고 처리 7일 후에 돌연변이체와 Col-O 간의 생존율을 비교한 결과, 물을 처리한 경우에는 돌연변이체와 Col-O가 유사한 수준의 생존율을 나타내었으나, 제초제를 처리한 경우에는 Col-O에 비해 돌연변이체의 생존율이 유의적으로 증가하였고 gi-1 및 gi-2 간에는 유의적 차이가 없는 것을 확인하였다(도 1).

또한, 3주령 Col-O, 자이겐티아 돌연변이체 및 35S 프로모터로 유도된 자이겐티아 과발현 식물체(GIOX; David K. M. et al., 2006, FEBS Letters 580, 1193)에 티아페나실 제초제인 테라도(팜한농)를 처리하고 처리 7일 후 식물체 내의 클로로필 함량을 측정한 결과, Col-O과 GIOX에 비해 돌연변이체에서 클로로필 함량이 증가한 것을 확인하였다(도 2). 기존 연구에 따르면, Col-O에 부타페나실을 1μM 농도로 처리하면 식물 전체가 사멸하였으나, 본 발명에서는 돌연변이체에 부타페나실을 2㎎/L(4μM) 농도로 처리하여도 식물체의 생존율이 우수함을 확인하였다.

상기 결과를 통해, 본 발명의 자이겐티아 유전자의 기능상실 돌연변이체가 부타페나실 및 티아페나실 제초제에 대한 저항성이 증가하였으므로, 자이겐티아 유전자가 음성 조절자로서 제초제 내성에 관여함을 알 수 있었다.

실시예 2. 식물체 내의 활성산소 생성 억제 효과, 항산화 효소 활성 및 항산화 관련 유전자들의 발현량 분석

자이겐티아 유전자의 기능상실 돌연변이체(gi-1 및 gi-2)를 이용하여 식물체 내 활성산소 생성 억제 효과, 항산화 효소 활성 및 항산화 관련 유전자들의 발현량을 분석하였다.

우선, 제초제가 처리된 식물체 내 축적된 활성산소 함량을 확인하기 위해 과산화물음이온이 축적된 부분을 염색시키는 NBT 용액과 과산화수소가 축적된 부분을 염색시키는 DAB 용액을 이용하여 부타페나실 제초제를 처리한 Col-O, 돌연변이체를 각각 염색시킨 결과, Col-O에서는 남색(도 3A) 또는 갈색(도 3B)으로 염색된 부분이 확인되었으나 돌연변이체에서는 염색된 부분이 관찰되지 않았다. 또한, 도 3C에 나타난 바와 같이, 식물체 내에 축적된 과산화수소의 함량을 측정한 결과, Col-O에 비해 돌연변이체에서 유의적으로 감소한 것을 확인하였다.

또한, 제초제가 처리된 식물체 내 항산화 효소의 활성을 분석하기 위해 부타페나실 제초제가 처리된 Col-O, 돌연변이체 내의 수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD; Superoxide Dismutase), 퍼옥시다아제(peroxidase) 및 카탈라아제(catalase) 활성을 측정한 결과, Col-O에 비해 돌연변이체에서 항산화 효소들의 활성이 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 4).

또한, 제초제가 처리된 식물체 내 항산화 관련 유전자들의 발현량을 분석하기 위해 부타페나실 제초제가 처리된 Col-O, 돌연변이체 내에 존재하는 항산화 관련 유전자인 CAT1, CAT2, CAT3, CuZnSOD1, FeSOD3, PrxQ 및 APX의 발현량을 측정하였으며, 모든 유전자의 발현량은 애기장대 하우스키핑 유전자 AT5G12240로 표준화후 정량하였다.

그 결과, APX 및 PrxQ 유전자의 발현량은 Col-O에 비해 돌연변이체 gi-1 및 gi-2에서 유의적으로 증가하였고, FeSOD3, CuZnSOD1, CAT1 및 CAT3 유전자의 발현량은 Col-O에 비해 돌연변이체 gi-1에서만 유의적으로 증가하였으며, CAT2 유전자의 발현량은 Col-O에 비해 돌연변이체 gi-2에서만 유의적으로 증가하였다(도 5).

기존에 사용된 부타페나실 및 티아페나실 제초제는 클로로필/헴 합성기작의 핵심 효소인 PPO(protoporphyrinogen oxidase)의 활성을 억제하여 세포 내 활성산소를 증가시키고 세포막 기능을 억제하는 제초제 활성으로 식물체를 사멸시켰으나, 본 발명의 애기장대 유래 자이겐티아 유전자의 기능상실 돌연변이체는 제초제 처리에 의해 유발되는 활성산소의 생성을 억제하고 항산화 효소의 활성을 증가시킬 뿐만 아니라 항산화관련 유전자들의 발현을 증가시킴으로써 항산화 스트레스에 대한 음성 조절자 역할을 하여 제초제 저항성을 나타내는 것임을 알 수 있었다. 이를 통해, 본 발명의 자이겐티아 유전자 결핍은 PPO 억제용 제초제에 대한 저항성을 획득할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> GIGANTEA gene from Arabidopsis thaliana for regulating herbicide resistance of plant and uses thereof <130> PN19060 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 3522 <212> DNA <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 atggctagtt catcttcatc tgagagatgg atcgatggtc ttcagttctc ttccttgtta 60 tggcctccgc cacgagatcc tcaacaacat aaggatcaag tcgttgctta tgttgaatat 120 tttggtcaat ttacatcaga gcaattccca gatgacattg ctgagttggt ccggcatcag 180 tatccatcaa ctgagaagcg acttttagac gatgtgctgg cgatgtttgt ccttcatcat 240 ccggagcatg gtcatgcagt cattcttcca atcatttcat gtcttattga tggctcgttg 300 gtgtacagca aggaagctca tccgtttgcc tctttcatat ctttagtttg cccaagtagt 360 gagaatgact attcggagca atgggctttg gcatgtggag aaatccttcg cattttgact 420 cattacaacc gtcccattta taaaactgag cagcaaaatg gagatacaga gagaaattgt 480 ctgagcaaag ctacaactag tggttctccg acttcagagc ctaaggctgg atcaccaaca 540 cagcatgaaa ggaaaccttt aaggcctttg tctccatgga tcagtgatat actacttgct 600 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Lys Glu Ala His Pro Phe Ala Ser Phe 100 105 110 Ile Ser Leu Val Cys Pro Ser Ser Glu Asn Asp Tyr Ser Glu Gln Trp 115 120 125 Ala Leu Ala Cys Gly Glu Ile Leu Arg Ile Leu Thr His Tyr Asn Arg 130 135 140 Pro Ile Tyr Lys Thr Glu Gln Gln Asn Gly Asp Thr Glu Arg Asn Cys 145 150 155 160 Leu Ser Lys Ala Thr Thr Ser Gly Ser Pro Thr Ser Glu Pro Lys Ala 165 170 175 Gly Ser Pro Thr Gln His Glu Arg Lys Pro Leu Arg Pro Leu Ser Pro 180 185 190 Trp Ile Ser Asp Ile Leu Leu Ala Ala Pro Leu Gly Ile Arg Ser Asp 195 200 205 Tyr Phe Arg Trp Cys Ser Gly Val Met Gly Lys Tyr Ala Ala Gly Glu 210 215 220 Leu Lys Pro Pro Thr Ile Ala Ser Arg Gly Ser Gly Lys His Pro Gln 225 230 235 240 Leu Met Pro Ser Thr Pro Arg Trp Ala Val Ala Asn Gly Ala Gly Val 245 250 255 Ile Leu Ser Val Cys Asp Asp Glu Val Ala Arg Tyr Glu Thr Ala Thr 260 265 270 Leu Thr Ala Val Ala Val Pro Ala Leu Leu Leu Pro Pro Pro Thr Thr 275 280 285 Ser Leu Asp Glu His Leu Val Ala Gly Leu Pro Ala Leu Glu Pro Tyr 290 295 300 Ala Arg Leu Phe His Arg Tyr Tyr Ala Ile Ala Thr Pro Ser Ala Thr 305 310 315 320 Gln Arg Leu Leu Leu Gly Leu Leu Glu Ala Pro Pro Ser Trp Ala Pro 325 330 335 Asp Ala Leu Asp Ala Ala Val Gln Leu Val Glu Leu Leu Arg Ala Ala 340 345 350 Glu Asp Tyr Ala Ser Gly Val Arg Leu Pro Arg Asn Trp Met His Leu 355 360 365 His Phe Leu Arg Ala Ile Gly Ile Ala Met Ser Met Arg Ala Gly Val 370 375 380 Ala Ala Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Phe Arg Ile Leu Ser Gln Pro 385 390 395 400 Ala Leu Leu Phe Pro Pro Leu Ser Gln Val Glu Gly Val Glu Ile Gln 405 410 415 His Ala Pro Ile Gly Gly Tyr Ser Ser Asn Tyr Arg Lys Gln Ile Glu 420 425 430 Val Pro Ala Ala Glu Ala Thr Ile Glu Ala Thr Ala Gln Gly Ile Ala 435 440 445 Ser Met Leu Cys Ala His Gly Pro Glu Val Glu Trp Arg Ile Cys Thr 450 455 460 Ile Trp Glu Ala Ala Tyr Gly Leu Ile Pro Leu Asn Ser Ser Ala Val 465 470 475 480 Asp Leu Pro Glu Ile Ile Val Ala Thr Pro Leu Gln Pro Pro Ile Leu 485 490 495 Ser Trp Asn Leu Tyr Ile Pro Leu Leu Lys Val Leu Glu Tyr Leu Pro 500 505 510 Arg Gly Ser Pro Ser Glu Ala Cys Leu Met Lys Ile Phe Val Ala Thr 515 520 525 Val Glu Thr Ile Leu Ser Arg Thr Phe Pro Pro Glu Ser Ser Arg Glu 530 535 540 Leu Thr Arg Lys Ala Arg Ser Ser Phe Thr Thr Arg Ser Ala Thr Lys 545 550 555 560 Asn Leu Ala Met Ser Glu Leu Arg Ala Met Val His Ala Leu Phe Leu 565 570 575 Glu Ser Cys Ala Gly Val Glu Leu Ala Ser Arg Leu Leu Phe Val Val 580 585 590 Leu Thr Val Cys Val Ser His Glu Ala Gln Ser Ser Gly Ser Lys Arg 595 600 605 Pro Arg Ser Glu Tyr Ala Ser Thr Thr Glu Asn Ile Glu Ala Asn Gln 610 615 620 Pro Val Ser Asn Asn Gln Thr Ala Asn Arg Lys Ser Arg Asn Val Lys 625 630 635 640 Gly Gln Gly Pro Val Ala Ala Phe Asp Ser Tyr Val Leu Ala Ala Val 645 650 655 Cys Ala Leu Ala Cys Glu Val Gln Leu Tyr Pro Met Ile Ser Gly Gly 660 665 670 Gly Asn Phe Ser Asn Ser Ala Val Ala Gly Thr Ile Thr Lys Pro Val 675 680 685 Lys Ile Asn Gly Ser Ser Lys Glu Tyr Gly Ala Gly Ile Asp Ser Ala 690 695 700 Ile Ser His Thr Arg Arg Ile Leu Ala Ile Leu Glu Ala Leu Phe Ser 705 710 715 720 Leu Lys Pro Ser Ser Val Gly Thr Pro Trp Ser Tyr Ser Ser Ser Glu 725 730 735 Ile Val Ala Ala Ala Met Val Ala Ala His Ile Ser Glu Leu Phe Arg 740 745 750 Arg Ser Lys Ala Leu Thr His Ala Leu Ser Gly Leu Met Arg Cys Lys 755 760 765 Trp Asp Lys Glu Ile His Lys Arg Ala Ser Ser Leu Tyr Asn Leu Ile 770 775 780 Asp Val His Ser Lys Val Val Ala Ser Ile Val Asp Lys Ala Glu Pro 785 790 795 800 Leu Glu Ala Tyr Leu Lys Asn Thr Pro Val Gln Lys Asp Ser Val Thr 805 810 815 Cys Leu Asn Trp Lys Gln Glu Asn Thr Cys Ala Ser Thr Thr Cys Phe 820 825 830 Asp Thr Ala Val Thr Ser Ala Ser Arg Thr Glu Met Asn Pro Arg Gly 835 840 845 Asn His Lys Tyr Ala Arg His Ser Asp Glu Gly Ser Gly Arg Pro Ser 850 855 860 Glu Lys Gly Ile Lys Asp Phe Leu Leu Asp Ala Ser Asp Leu Ala Asn 865 870 875 880 Phe Leu Thr Ala Asp Arg Leu Ala Gly Phe Tyr Cys Gly Thr Gln Lys 885 890 895 Leu Leu Arg Ser Val Leu Ala Glu Lys Pro Glu Leu Ser Phe Ser Val 900 905 910 Val Ser Leu Leu Trp His Lys Leu Ile Ala Ala Pro Glu Ile Gln Pro 915 920 925 Thr Ala Glu Ser Thr Ser Ala Gln Gln Gly Trp Arg Gln Val Val Asp 930 935 940 Ala Leu Cys Asn Val Val Ser Ala Thr Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala 945 950 955 960 Val Val Leu Gln Ala Glu Arg Glu Leu Gln Pro Trp Ile Ala Lys Asp 965 970 975 Asp Glu Glu Gly Gln Lys Met Trp Lys Ile Asn Gln Arg Ile Val Lys 980 985 990 Val Leu Val Glu Leu Met Arg Asn His Asp Arg Pro Glu Ser Leu Val 995 1000 1005 Ile Leu Ala Ser Ala Ser Asp Leu Leu Leu Arg Ala Thr Asp Gly Met 1010 1015 1020 Leu Val Asp Gly Glu Ala Cys Thr Leu Pro Gln Leu Glu Leu Leu Glu 1025 1030 1035 1040 Ala Thr Ala Arg Ala Ile Gln Pro Val Leu Ala Trp Gly Pro Ser Gly 1045 1050 1055 Leu Ala Val Val Asp Gly Leu Ser Asn Leu Leu Lys Cys Arg Leu Pro 1060 1065 1070 Ala Thr Ile Arg Cys Leu Ser His Pro Ser Ala His Val Arg Ala Leu 1075 1080 1085 Ser Thr Ser Val Leu Arg Asp Ile Met Asn Gln Ser Ser Ile Pro Ile 1090 1095 1100 Lys Val Thr Pro Lys Leu Pro Thr Thr Glu Lys Asn Gly Met Asn Ser 1105 1110 1115 1120 Pro Ser Tyr Arg Phe Phe Asn Ala Ala Ser Ile Asp Trp Lys Ala Asp 1125 1130 1135 Ile Gln Asn Cys Leu Asn Trp Glu Ala His Ser Leu Leu Ser Thr Thr 1140 1145 1150 Met Pro Thr Gln Phe Leu Asp Thr Ala Ala Arg Glu Leu Gly Cys Thr 1155 1160 1165 Ile Ser Leu Ser Gln 1170 <210> 3 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 aggagccaat cacagcc 17 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tcaagaccaa gcgacca 17 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aactccgcct gctgtctg 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 atagggcatc aatccatc 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tcacagccac gccactaa 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 agaaccaagc gaccaacc 18 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 cctctaccaa ccccaaatct c 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gatcagaagt gagagcagtc g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ggatgtgtgg gagcactctt 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 gattgggatg ttgggttcac 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tgacattcct ttccaccctg 20 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 cttggtagca tcaggaagac g 21 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 agatgactct gcttctcaca aggc 24 <210> 16 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 tccctggcaa tgctccaaac ag 22 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 agcggctgct gagaagaaag t 21 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tctcgaaagc cttgcaaaat ct 22

Claims (10)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환시켜 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 제초제 저항성을 조절하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(Pyrimidinediones) 제초제인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물세포를 형질전환하는 단계; 및
   상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계를 포함하는 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 제초제는 피리미딘디온계(Pyrimidinediones) 제초제인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 애기장대 유래 자이겐티아 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 식물세포에서 저해시켜 야생형 식물체에 비해 식물체의 제초제 저항성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체의 제조 방법.
7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 제초제 저항성이 조절된 형질전환 식물체.
8. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이 저해되어 제초제 저항성이 증가된 돌연변이 식물체.
9. 제7항 또는 제8항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 애기장대 유래 자이겐티아(GIGANTEA) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 함유하는 식물체의 제초제 저항성 조절용 조성물.

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