KR20200094106A

KR20200094106A - Gene carrier comprising exosome derived from human peripheral blood and uses thereof

Info

Publication number: KR20200094106A
Application number: KR1020200010039A
Authority: KR
Inventors: 정보영; 강지영; 윤누리; 김효은; 문다솜
Original assignee: 연세대학교 산학협력단
Priority date: 2019-01-29
Filing date: 2020-01-28
Publication date: 2020-08-06
Also published as: KR20220061920A

Abstract

The present invention relates to a gene delivery system containing exosomes derived from human peripheral blood and a use thereof. More specifically, the present invention can provide a delivery system for regulating gene expression of heart cells including exosomes derived from human peripheral blood, and a pharmaceutical composition for preventing or treating heart disease.

Description

Gene carrier comprising exosome derived from human peripheral blood and uses thereof}

인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 유전자 전달체 및 이의 용도에 관한 것이다.It relates to a gene delivery system comprising exosomes derived from human peripheral blood and uses thereof.

심장 질환 (cardiovascular disease: CVD)은 세계 최고 사망률을 기록하고 있는 질병으로 세계보건기구의 보고에 의하면 2030년까지 2360만명이 심장 질환으로 사망할 것으로 예상하고 있다. 또한, 심근 경색증 (myocardial infarction)은 성인 돌연사 원인 1위를 차지하는 치명적인 질환으로 계속 증가하는 추세에 있다. 심장 질환의 원인으로는 흡연, 섭식, 과체중, 비만, 혈당 대사 문제 등이 존재하며, 혈압 강하, 혈청 콜레스테롤 하강, 심리적 치료를 통하여 심장 질환을 예방 및 치료하고자 하는 연구가 지속되고 있다. Cardiovascular disease (CVD) is the world's highest mortality rate, and the World Health Organization reports that 23.6 million people will die from heart disease by 2030. In addition, myocardial infarction is a fatal disease that is the number one cause of sudden death in adults and continues to increase. Causes of heart disease include smoking, eating, overweight, obesity, and blood sugar metabolism problems, and studies to prevent and treat heart disease through blood pressure lowering, serum cholesterol lowering, and psychological treatment are continuing.

한편, 최근 연구들은 miR-21을 포함하는 일부 miRNA가 심근 경색의 병리학적 진행, 예를 들어, 심장 섬유화 수준을 조절함을 보고하고 있다. 그러나 상기 miRNA를 기반으로 한 치료법은 miRNA를 생체 내에서 안전하고, 효율적, 및 특이적으로 표적 세포에 전달하여야 한다는 기술적 한계를 지니고 있다. 이러한 기술적 배경 하에서, 심장 세포로의 우수한 전달 효율을 갖는 약물 또는 유전자 전달 시스템에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있으나(한국 등록특허 제10-1896082호), 아직은 미비한 실정이다. Meanwhile, recent studies have reported that some miRNAs, including miR-21, regulate the pathological progression of myocardial infarction, eg, cardiac fibrosis level. However, the miRNA-based therapy has a technical limitation that miRNA must be safely, efficiently and specifically delivered to target cells in vivo. Under this technical background, studies on drugs or gene delivery systems having excellent delivery efficiency to cardiac cells have been actively conducted (Korean Patent Registration No. 10-1896082), but they are still incomplete.

일 양상은 일 양상은 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀; 및 상기 엑소좀에 봉입된 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, 또는 cDNA로부터 선택되는 유전 물질을 포함하는, 심장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. One aspect is an exosome derived from human peripheral blood; And a genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA encapsulated in the exosome, to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of heart disease.

다른 양상은 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀; 및 상기 엑소좀에 봉입된 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, 또는 cDNA로부터 선택되는 유전 물질을 포함하는 심장 세포의 유전자 발현 조절용 전달체를 제공하는 것이다. Other aspects include exosomes derived from human peripheral blood; And a genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA encapsulated in the exosome.

본 출원의 다른 목적 및 이점은 첨부한 청구범위 및 도면과 함께 하기의 상세한 설명에 의해 보다 명확해질 것이다. 본 명세서에 기재되지 않은 내용은 본 출원의 기술 분야 또는 유사한 기술 분야 내 숙련된 자이면 충분히 인식하고 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.Other objects and advantages of the present application will become more apparent by the following detailed description in conjunction with the appended claims and drawings. The contents not described in this specification can be sufficiently recognized and inferred by those skilled in the technical field or similar technical field of the present application, and the description thereof will be omitted.

본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.Each description and embodiment disclosed in the present application can be applied to each other description and embodiment. That is, all combinations of the various elements disclosed in this application fall within the scope of this application. In addition, the scope of the present application cannot be considered to be limited by the specific descriptions described below.

일 양상은 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀; 및 상기 엑소좀에 봉입된 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, 또는 cDNA로부터 선택되는 유전 물질을 포함하는, 심장 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. One aspect is an exosome derived from human peripheral blood; And an genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA encapsulated in the exosome.

본 명세서에서 사용되는 용어, “예방”은 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 심장 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “prevention” refers to all actions that suppress heart disease or delay the onset of disease by administration of a pharmaceutical composition according to the present invention.

본 명세서에서 사용되는 용어, “치료”는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 심장 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.As used herein, the term “treatment” refers to all actions in which symptoms of heart disease are improved or beneficially altered by administration of a pharmaceutical composition according to the present invention.

상기 약학적 조성물에 의한 예방 또는 치료 대상 질병인 "심장 질환"은 허혈성 심장 질환일 수 있다. 상기 허혈성 심장 질환은 심장 세포 또는 심장 근육으로의 혈액 공급량 부족으로 인해 발생하는 질환으로서, 심근 세포 등의 세포사가 유발되어 조직이 영구적으로 손상되는 질환을 의미한다. 상기 심장 질환으로는 예를 들어, 협심증, 심근경색, 죽상동맥경화, 심장 부정맥, 심장마비, 또는 심장발작일 수 있다. The disease targeted for prevention or treatment by the pharmaceutical composition may be an ischemic heart disease. The ischemic heart disease is a disease that occurs due to a lack of blood supply to the heart cells or the heart muscle, and refers to a disease in which tissue death is permanently damaged by cell death such as cardiomyocytes. The heart disease may be, for example, angina pectoris, myocardial infarction, atherosclerosis, cardiac arrhythmia, heart attack, or heart attack.

본 명세서에서 사용되는 용어, "엑소좀(exosome)"은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭으로서, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 일 실시예에 따르면, 상기 엑소좀은 인간 말초 혈액으로부터 유래 또는 분리한 것일 수 있다. As used herein, the term "exosome (exosome)" is a small vesicle of a membrane structure secreted from various cells, refers to a vesicle that is released into the extracellular environment by fusion of the polycystic body and the plasma membrane. According to one embodiment, the exosome may be derived from or separated from human peripheral blood.

일 구체예에 있어서, 상기 엑소좀은 심장 질환의 치료 효과를 갖는 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, 또는 cDNA로부터 선택되는 유전 물질을 추가로 포함할 수 있으며, 예를 들어, 상기 엑소좀은 상기 유전 물질이 봉입되어 있을 수 있다. In one embodiment, the exosome may further include a genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA having a therapeutic effect of heart disease, for example, The exosome may contain the genetic material.

또한, 상기 유전 물질로는 당업계에 심장 질환의 치료 효과를 갖는 것으로 알려져 있는 다양한 물질이 적용될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전 물질은 FGF family, VEGF, PlGF, PDGF, EGF, GM-CSF, PGE2, TNF-α, TGF-β, 및 IL-1과 관련된 유전 물질일 수 있으며(Korean Circulation J 2000; 30(6):772-779). 또한, 상기 유전 물질은 심장 질환의 치료 효과를 갖는 miRNA과 관련된 유전 물질일 수 있으며, 예를 들어, 심장 세포의 STRN 유전자의 발현을 증가시키거나, 심장 세포의 STRN 및 NOS 유전자의 발현을 증가시키는 물질일 수 있다. 상기 유전 물질은 예를 들어, miR-21 inhibitor일 수 있고, 예를 들어, 서열 번호 1로 표시되는 유전 물질일 수 있다. In addition, as the genetic material, various materials known in the art to have a therapeutic effect for heart disease may be applied. For example, the genetic material may be FGF family, VEGF, PlGF, PDGF, EGF, GM-CSF, PGE2, TNF-α, TGF-β, and IL-1 related genetic material (Korean Circulation J 2000; 30(6):772-779). In addition, the genetic material may be a genetic material associated with miRNA having a therapeutic effect of heart disease, for example, to increase the expression of the STRN gene in heart cells, or to increase the expression of STRN and NOS genes in heart cells. It can be a substance. The genetic material may be, for example, a miR-21 inhibitor, for example, a genetic material represented by SEQ ID NO: 1.

일 구체예에 있어서, 상기 엑소좀은 50 내지 150nm의 직경을 갖는 것일 수 있다. 상기 엑소좀의 직경은 예를 들어, 50 내지 130nm, 50 내지 110nm, 50 내지 90nm, 50 내지70nm, 70 내지 130nm, 70 내지 110nm, 70 내지 90nm, 90 내지 130nm, 90 내지 110nm일 수 있다. In one embodiment, the exosome may have a diameter of 50 to 150nm. The diameter of the exosomes may be, for example, 50 to 130 nm, 50 to 110 nm, 50 to 90 nm, 50 to 70 nm, 70 to 130 nm, 70 to 110 nm, 70 to 90 nm, 90 to 130 nm, 90 to 110 nm.

일 구체예에 있어서, 상기 엑소좀은 Alix, LAMP2, CD9, CD63, CD81, 및 이의 조합으로부터 선택되는 단백질 마커를 발현하는 것일 수 있다. In one embodiment, the exosome may be to express a protein marker selected from Alix, LAMP2, CD9, CD63, CD81, and combinations thereof.

일 실시예에 따르면, 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀은 H9C2 및 HL-1 심장 세포주에 효과적으로 흡수(uptake)됨을 확인할 수 있었으며(실시예 1), 상기 엑소좀에 특정 유전 물질을 봉입시킨 뒤, 이를 심장 세포주 및 심근경색 동물 모델에 적용한 결과, 유의적인 치료 효능을 확인할 수 있었다(실시예 2 및 3). 또한, 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀은 생체 내에서 안전성을 보여주며, 심장 세포로의 우수한 흡수 및 유전 물질 전달능을 나타냄을 확인할 수 있었다(실시예 4 및 5). 아울러, 일 실시예에 따른 miR-21 inhibitor가 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀은 심근 경색 동물에서 유의적인 치료 효능을 보여 주었고, 이들의 세부적인 치료 기전 역시 실험적으로 확인할 수 있었다(실시예 6 및 7).According to one embodiment, it was confirmed that the exosomes derived from human peripheral blood are effectively uptake into H9C2 and HL-1 cardiac cell lines (Example 1), and after encapsulating a specific genetic material in the exosomes, As a result of applying this to animal model of cardiac cell line and myocardial infarction, significant treatment efficacy could be confirmed (Examples 2 and 3). In addition, it was confirmed that the exosomes derived from human peripheral blood show safety in vivo in human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, and exhibit excellent absorption and delivery of genetic material to heart cells (implementation) Examples 4 and 5). In addition, exosomes derived from human peripheral blood loaded with miR-21 inhibitor according to one embodiment showed significant therapeutic efficacy in myocardial infarction animals, and their detailed treatment mechanisms could also be confirmed experimentally (Example 6 and 7).

따라서, 일 실시예에 따른 약학적 조성물은 심장 질환의 치료를 위한 유효성분으로 활용될 수 있다. Therefore, the pharmaceutical composition according to an embodiment may be utilized as an active ingredient for the treatment of heart disease.

상기 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양의 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 심장 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 의미한다. 상기 엑소좀의 약학적으로 유효한 양은 5×10³ 내지 5×10¹⁰particles/day/체중(kg)일 수 있으며, 5×10⁹ particles/day/체중 kg일 수 있다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 심장 질환 증상의 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료 기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다. 또한, 상기 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 의미한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition may include exosomes derived from human peripheral blood in a pharmaceutically effective amount alone, or may include one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients, or diluents. The pharmaceutically effective amount in the above refers to an amount sufficient to prevent, ameliorate and treat the symptoms of heart disease. The pharmaceutically effective amount of the exosomes may be 5×10 ³ to 5×10 ¹⁰ particles/day/weight (kg), and may be 5×10 ⁹ particles/day/kg body weight. However, the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed according to the degree of heart disease symptoms, the patient's age, weight, health status, sex, administration route, and treatment period. In addition, the term "pharmaceutically acceptable" means a composition that is physiologically acceptable and does not cause an allergic reaction such as gastrointestinal disorder, dizziness or similar reaction when administered to a human. Examples of the carrier, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, Polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil. In addition, fillers, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.

상기 약학적 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라 환자의 신체 내 투여에 적합한 단위 투여형의 제제로 제형화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여에 의해 심장 세포 또는 심근세포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함한다. 이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서 주사용 앰플과 같은 주사제 등이 바람직하다. 상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수 있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거액 등을 사용할 수 있다. The pharmaceutical composition may be formulated and administered as a unit dosage form suitable for administration in a patient's body according to a conventional method in the pharmaceutical field, and the preparation may be administered by cardiac cells or cardiomyocytes by single or multiple administrations. It contains effective doses that can develop. Suitable formulations for this purpose are parenteral administration preparations, such as injection ampoules. The ampoule for injection may be mixed with the injection solution immediately before use, and physiological saline, glucose, mannitol, Ringer's solution, etc. may be used as the injection solution.

상기 약학적 조성물에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그 이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를 들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는 안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base), 부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.In the pharmaceutical composition, in addition to the active ingredient, one or more pharmaceutically acceptable inert carriers, for example, in the case of injections, preservatives, painless agents, solubilizers or stabilizers, etc., in the case of preparations for topical administration The base may further include a base, an excipient, a lubricant, or a preservative.

상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여 방법은 당업계에서 통상적으로 사용하는 모든 방식에 의해 투여될 수 있다. 이에 제한되지는 않으나, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사 등에 의해 투여될 수 있다. The pharmaceutical composition may be administered to mammals such as rats, mice, livestock, and humans by various routes such as parenteral or oral administration, and the method of administration may be administered by any method commonly used in the art. Without being limited thereto, it may be administered by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dura mater or intracerebroventricular injection.

다른 양상은 상기 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 심장 질환의 치료방법을 제공할 수 있다. Another aspect may provide a method of treating heart disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual.

본 명세서에서 사용되는 용어, "개체"는 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는, 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.As used herein, the term "individual" refers to a subject in need of treatment of a disease, and more specifically, human or non-human primate, mouse, dog, cat, horse, and cow. It means mammal.

또 다른 양상은 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀; 및 상기 엑소좀에 봉입된 mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, 또는 cDNA로부터 선택되는 유전 물질을 포함하는 심장 세포의 유전자 발현 조절용 전달체를 제공할 수 있다.Another aspect is an exosome derived from human peripheral blood; And a genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA encapsulated in the exosome.

하기 유전자 발현 조절용 전달체서 언급된 용어 또는 요소 중 상기 약학적 조성물에 대한 설명에서 언급된 것과 같은 것은, 상기한 바와 같다. Among the terms or elements mentioned in the following gene expression regulating transporters, those mentioned in the description of the pharmaceutical composition are as described above.

일 실시예에 따르면, 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀은 H9C2 및 HL-1 심장 세포주에 효과적으로 흡수(uptake)됨을 확인할 수 있었으며(실시예 1), 상기 엑소좀에 특정 유전 물질을 봉입시킨 뒤, 이를 심장 세포주 및 심근경색 동물 모델에 적용한 결과, 심장 세포의 유전자 발현 수준을 효과적으로 조절할 수 있음을 확인할 수 있었다(실시예 2 및 3). 따라서, 일 실시예에 따른 전달체은 심장 세포의 유전자 발현 조절을 위하여 활용될 수 있다. According to one embodiment, it was confirmed that the exosomes derived from human peripheral blood are effectively uptake into H9C2 and HL-1 cardiac cell lines (Example 1), and after encapsulating a specific genetic material in the exosomes, As a result of applying this to the animal model of the heart cell line and myocardial infarction, it was confirmed that the gene expression level of the heart cells can be effectively controlled (Examples 2 and 3). Thus, the delivery vehicle according to one embodiment may be utilized for regulating gene expression of heart cells.

일 구체예에 있어서, 상기 유전 물질이 심장 질환의 치료 효과를 갖는 물질인 경우, 상기 전달체는 심장 질환의 유전자 치료에 적용되는 것일 수 있다. In one embodiment, when the genetic material is a substance having a therapeutic effect of heart disease, the carrier may be applied to gene therapy of heart disease.

일 양상의 조성물에 따르면, 유전 물질이 봉입된 인간 말초 혈액으로부터 유래된 엑소좀은 상기 유전 물질에 대항 심장 세포로의 전달 효율을 유의적으로 향상시킬 수 있고, 이를 통하여, 심장 세포의 유전적 특성을 손쉽게 조절할 수 있다. 따라서, 일 양상에 따른 조성물은 심장 질환 치료 분야, 특히 유전자 치료 분야의 핵심 기술로 응용될 수 있다. According to one aspect of the composition, exosomes derived from human peripheral blood encapsulated with a genetic material can significantly improve the efficiency of delivery to the cardiac cells against the genetic material, through which genetic properties of the cardiac cells Can be easily adjusted. Therefore, the composition according to one aspect may be applied as a core technology in the field of treating heart disease, particularly in the field of gene therapy.

도 1은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 특성을 확인한 것으로서, 도 1의 A는 투과 전자 현미경으로 상기 엑소좀을 관찰한 결과이고, 도 1의 B는 나노 입자 추적 분석을 통하여 상기 엑소좀의 크기를 확인한 결과이며, 도 1의 C는 웨스턴 블로팅을 통하여 상기 엑소좀 내 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 2는 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀에 대하여, 심장 세포주로의 흡수를 공초점 현미경 검사로 확인한 것으로서, 도 2의 A는 H9C2 심장 세포주로의 흡수를 확인한 결과이고, 도 2의 B는 HL-1 심장 세포주로의 흡수를 확인한 결과이다.
도 3은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 각 H9C2 심장 세포주에서 miR-21의 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 4는 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 4의 A는 Smad7의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 4의 B는 Smad7의 단백질 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 5는 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 5의 A는 PTEN의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 5의 B는 PTEN의 단백질 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 6은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 HL-1 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 각 HL-1 심장 세포주에서 miR-21의 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 7은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 HL-1 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 7의 A는 Smad7의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 7의 B는 Smad7의 단백질 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 8은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 HL-1 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 8의 A는 PTEN의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 8의 B는 PTEN의 단백질 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 9는 심근 경색 동물모델에서, 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 9의 A는 Smad7의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 9의 B는 PTEN의 mRNA 수준을 정량적으로 비교한 결과이며, 도 9의 C는 PTEN의 단백질 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 10은 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀을 심근 경색 동물모델의 병변 부위에 처리한 후, 이에 따른 병리학적 변화를 확인한 결과이다.
도 11은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 생체 안전성을 확인한 것으로서, 도 11의 A는 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 처리 용량에 따른 세포 생존율의 변화를 확인한 결과이고, 도 11의 B는 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 처리 시간에 따른 세포 생존율의 변화를 확인한 결과이다.
도 12는 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀을 H9C2 심장 세포주에 첨가 또는 처리한 경우, 염증성 사이토카인의 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 13은 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀을 다양한 장기의 조직에 첨가 또는 처리한 경우, 염증 반응의 유도 여부를 조직학적으로 확인한 결과이다.
도 14는 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 특성을 확인한 것으로서, 도 14의 A는 투과 전자 현미경으로 상기 엑소좀을 관찰한 결과이고, 도 14의 B는 웨스턴 블로팅을 통하여 상기 엑소좀 내 발현 양상을 확인한 결과이다.
도 15는 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 심장 세포주로의 흡수를 공초점 현미경 검사로 확인한 결과이다.
도 16은 정상 및 저산소 조건 하에서, 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 유전 물질 전달 효과를 확인한 것으로서, 도 16의 A는 각 H9C2 심장 세포주에서 miR-21의 수준을 정량적으로 비교한 결과이고, 도 16의 B는 H9C2 심장 세포주에서 엑소좀의 처리 농도에 따른 miR-21의 수준을 정량적으로 비교한 결과이다.
도 17은 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 Rnase 저항률을 평가한 결과이다.
도 18은 심근 경색 동물모델에서, 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 첨가 또는 처리한 경우, 좌심실 구축률 변화를 확인한 결과이다.
도 19는 심근 경색 동물모델에서, 일 실시예에 따른 유전 물질이 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 첨가 또는 처리한 경우, 콜라겐 Ⅰ, 및 콜라겐 Ⅲ의 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 20은 STRN의 3'-UTR 부위와 miR-21가 결합 가능성을 miRNA 표적 예측 프로그램 (www.targetscan.org)을 통하여 확인한 결과이다.
도 21은 합성한 루시퍼라아제 벡터 시스템과 miR-21 mimic 또는 대조군으로 스크램블 miRNA를 심장 세포주에 처리한 경우, 루시퍼라아제 활성 변화를 확인한 결과이다.
도 22는 H9C2 심장 세포주에서 miR-21의 발현 수준에 따른 STRN 단백질 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 23은 H9C2 심장 세포주에 STRN-특이적 siRNA를 첨가 또는 처리한 경우, NOS3 단백질 발현 수준 변화를 확인한 결과이다.
도 24는 저 산소 조건에서, H9C2 심장 세포주에 miR-21 mimic 또는 miR-21 inhibitor를 처리한 경우, STRN 단백질 및 NOS 단백질 발현 수준 변화를 확인한 결과이다. 1 is to confirm the characteristics of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, A of FIG. 1 is a result of observing the exosomes through a transmission electron microscope, B of FIG. 1 is through the nanoparticle tracking analysis It is a result of confirming the size of the exosomes, and FIG. 1C shows the expression patterns in the exosomes through Western blotting.
Figure 2 is a human peripheral blood-derived exosome according to an embodiment, as confirmed by confocal microscopy absorption into the heart cell line, Figure 2A is the result of confirming the absorption into the H9C2 heart cell line, Figure 2 B is a result confirming the absorption into the HL-1 heart cell line.
Figure 3 confirms the effect of genetic material transfer on the H9C2 heart cell line of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, the result of quantitatively comparing the level of miR-21 in each H9C2 heart cell line.
Figure 4 confirms the effect of genetic material delivery on H9C2 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes according to one embodiment, A of Figure 4 is the result of quantitatively comparing the mRNA level of Smad7, Figure 4 B This is a result of quantitatively comparing the protein level of Smad7.
Figure 5 confirms the effect of genetic material delivery on H9C2 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes according to one embodiment, A of Figure 5 is a result of quantitatively comparing the mRNA level of PTEN, B of Figure 5 This is a result of quantitatively comparing protein levels of PTEN.
FIG. 6 shows the effect of genetic material delivery on HL-1 cardiac cell lines of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, and is a result of quantitatively comparing the level of miR-21 in each HL-1 cardiac cell line.
Figure 7 is to confirm the effect of genetic material delivery to the HL-1 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, Figure 7 A is the result of quantitatively comparing the mRNA level of Smad7, Figure 7 B is a result of quantitatively comparing the protein level of Smad7.
Figure 8 is to confirm the effect of genetic material delivery to the HL-1 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, Figure 8 A is a result of quantitatively comparing the mRNA level of PTEN, Figure 8 B is a result of quantitatively comparing protein levels of PTEN.
9 is a myocardial infarction animal model, confirming the effect of genetic material delivery of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, FIG. 9 A is a result of quantitatively comparing mRNA levels of Smad7, and FIG. 9 B Is a result of quantitatively comparing mRNA levels of PTEN, and C of FIG. 9 is a result of quantitatively comparing protein levels of PTEN.
Figure 10 is a result of confirming the pathological changes according to the treatment of the lesion site of the myocardial infarction animal model of human peripheral blood-derived exosomes loaded with genetic material according to one embodiment.
Figure 11 is to confirm the biosafety of human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment, Figure 11 A is a result of confirming the change in cell viability according to the treatment capacity of human peripheral blood-derived exosomes, B of Figure 11 Is a result confirming the change in cell viability according to the treatment time of human peripheral blood-derived exosomes.
12 is a result of confirming a change in expression level of inflammatory cytokines when exosomes derived from human peripheral blood according to an embodiment are added or treated to the H9C2 heart cell line.
13 is a result of histologically confirming the induction of an inflammatory response when human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment are added or treated to tissues of various organs.
14 is to confirm the characteristics of the human peripheral blood-derived exosomes loaded with genetic material according to an embodiment, A of FIG. 14 is a result of observing the exosomes through a transmission electron microscope, B of FIG. 14 is Western blow It is a result of confirming the expression pattern in the exosomes through Ting.
FIG. 15 shows the effect of genetic material delivery on the H9C2 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes loaded with genetic material according to an embodiment, and is a result of confirming absorption into a cardiac cell line by confocal microscopy.
FIG. 16 confirms the effect of genetic material delivery on H9C2 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes loaded with genetic material according to Examples under normal and hypoxic conditions, and FIG. 16A shows miR- in each H9C2 cardiac cell line The level of 21 is quantitatively compared, and FIG. 16B is a result of quantitatively comparing the level of miR-21 according to the concentration of exosome treatment in the H9C2 heart cell line.
17 is a result of evaluating Rnase resistivity of exosomes derived from human peripheral blood loaded with genetic material according to an embodiment.
18 is a result of confirming a change in the rate of left ventricular contraction when an exosome derived from human peripheral blood loaded with a genetic material according to an embodiment is added or treated in an animal model of myocardial infarction.
19 is a result of confirming a change in expression levels of collagen Ⅰ and collagen Ⅲ when an exosome derived from human peripheral blood loaded with a genetic material according to an embodiment is added or treated in an animal model of myocardial infarction.
20 is a result of confirming the possibility of binding the 3'-UTR site of the STRN and miR-21 through the miRNA target prediction program (www.targetscan.org).
21 is a result of confirming a change in luciferase activity when a scrambled miRNA is treated with a synthesized luciferase vector system and miR-21 mimic or a control in a cardiac cell line.
22 is a result of confirming a change in the expression level of STRN protein according to the expression level of miR-21 in the H9C2 heart cell line.
23 is a result of confirming a change in the NOS3 protein expression level when STRN-specific siRNA is added or treated to the H9C2 heart cell line.
24 is a result of confirming a change in the expression level of STRN protein and NOS protein when a miR-21 mimic or miR-21 inhibitor is treated in an H9C2 heart cell line under low oxygen conditions.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.Hereinafter, the present invention will be described in more detail through examples. However, these examples are for illustrative purposes only, and the scope of the present invention is not limited to these examples.

실시예 1. 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀 분리 및 이의 특성 확인 Example 1. Isolation of exosomes derived from human peripheral blood and confirmation of their properties

본 실시예에서는 Exoquick exosome precipitation kit를 이용하여, 제조사의 지침에 따라 인간 말초 혈액(250㎕)으로부터 엑소좀을 분리하였다. 이후, 투과 전자 현미경 검사, 나노 입자 추적 분석 및 웨스턴블로팅 분석을 통하여, 상기 분리한 엑소좀의 세부 특성을 규명하였다. 또한, PKH26 형광 염색(적색) 및 공초점 현미경 검사를 통하여, 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀이 H9C2 및 HL-1 심장 세포주로 흡수(uptake)되는지를 확인하고자 하였다. In this example, using the Exoquick exosome precipitation kit, exosomes were isolated from human peripheral blood (250 μl) according to the manufacturer's instructions. Then, through transmission electron microscopy, nanoparticle tracking analysis, and Western blotting analysis, detailed characteristics of the separated exosomes were identified. In addition, through PKH26 fluorescence staining (red) and confocal microscopy, it was attempted to confirm whether exosomes derived from human peripheral blood are uptake into H9C2 and HL-1 cardiac cell lines.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀은 약 104nm의 평균 직경을 갖는 원형의 구조물로서 확인되었고, 상기 엑소좀으로부터 Alix, LAMP2, CD9, CD63, 및 CD81과 같은 단백질 마커를 검출하였다. 또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 엑소좀은 H9C2 및 HL-1 심장 세포주 모두에 효과적으로 흡수됨을 확인하였다. As a result, as shown in Fig. 1, the human peripheral blood-derived exosomes were identified as circular structures having an average diameter of about 104 nm, and proteins such as Alix, LAMP2, CD9, CD63, and CD81 from the exosomes Markers were detected. In addition, as shown in Figure 2, it was confirmed that the exosomes are effectively absorbed by both H9C2 and HL-1 cardiac cell lines.

실시예 2. 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀을 이용한 유전 물질의 전달 Example 2. Delivery of genetic material using exosomes derived from human peripheral blood

본 실시예에서는 상기 실시예 1의 엑소좀의 유전 물질 전달 효과, 구체적으로 심장 세포주로의 유전 물질 전달 효과를 확인하고자 하였다. 이를 위하여, Exo-Fect^TM Exosome Transfection Kit (SBI System Biosciences, USA)를 사용하여 인간 말초 혈액으로부터 분리한 엑소좀에 negative control miRNA, miR-21 mimic, miR-21 inhibitor를 각각 로딩하였다. 상기 miRNA (SMC-2003), miR-21 mimic (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3', SMM-002, 서열번호 2), miR-21 inhibitor (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'; SMI-002, 서열번호 1)는 Bioneer (대전, 한국)로부터 수득하였다. In this example, the effects of the genetic material delivery of the exosomes of Example 1 above, specifically, the genetic material delivery effect to the heart cell line were to be confirmed. To this end, negative control miRNA, miR-21 mimic, and miR-21 inhibitor were loaded onto exosomes isolated from human peripheral blood using an Exo-Fect ^TM Exosome Transfection Kit (SBI System Biosciences, USA). The miRNA (SMC-2003), miR-21 mimic (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3', SMM-002, SEQ ID NO: 2), miR-21 inhibitor (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'; SMI-002, SEQ ID NO: 1 ) Was obtained from Bioneer (Daejeon, Korea).

2-1. H9C2 심장 세포주로의 miRNA 전달2-1. MiRNA delivery to the H9C2 heart cell line

H9C2 심장 세포주를 100mm 배양 접시에 배양하고, 이로부터 1일 경과 후, 상기 세포주에 150 ㎍의 대조군, miRNA의 mimic 또는 inhibitor를 로딩한 엑소좀을 첨가하고, 24 시간 뒤 저산소 조건에서 상기 세포주를 다시 배양하였다. 이후, 역전사효소 중합효소연쇄반응과 웨스턴블로팅 분석을 이용하여, 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 H9C2 심장 세포주에 대한 miRNA 전달 효율을 확인하였다. 또한, 추가적으로, miR-21의 직접적인 타겟이 되는 Smad7 또는 PTEN의 mRNA와 단백질 수준을 분석하였다The H9C2 cardiac cell line was cultured in a 100 mm culture dish, and after 1 day thereafter, 150 μg of control, miRNA mimic or inhibitor-loaded exosomes were added to the cell line, and after 24 hours, the cell line was again regenerated under hypoxic conditions. Cultured. Subsequently, the reverse transcriptase polymerase chain reaction and Western blotting analysis were used to confirm the miRNA delivery efficiency of human peripheral blood-derived exosomes to the H9C2 heart cell line. In addition, mRNA and protein levels of Smad7 or PTEN, which are direct targets of miR-21, were analyzed.

H9C2 심장 세포주의 miR-21의 수준을 분석한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, H9C2 세포주에서 miR-21의 수준은 mimic 또는 inhibitor가 로딩된 엑소좀에 의하여 조절되어짐을 확인하였다. 즉, 저산소 조건의 H9C2 세포주에서, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 정상 산소 및 저 산소 조건의 세포와 비교하여 miR-21의 발현을 증가시켰던 반면(Exo+21-M), miR-21 억제제가 로딩된 엑소좀의 첨가는 miR-21의 발현을 감소시켰다(Exo+21-I).As a result of analyzing the level of miR-21 in the H9C2 heart cell line, as shown in FIG. 3, it was confirmed that the level of miR-21 in the H9C2 cell line is regulated by exosomes loaded with mimic or inhibitor. That is, in the H9C2 cell line under hypoxic conditions, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes increased miR-21 expression compared to cells under normal oxygen and hypoxic conditions (Exo+21-M), while miR Addition of exosomes loaded with -21 inhibitor reduced the expression of miR-21 (Exo+21-I).

또한, 도 4 및 도 5에 나타낸 바와 같이, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7과 PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 모두 하향 조절하였던 반면(Exo+21-M), miR-21 inhibitor가 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7과 PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 모두 상향 조절하였다(Exo+21-I). miRNA는 타겟 mRNA의 3'-비번역 영역(3'-UTR)에 결합하여 타겟 유전자의 발현을 억제하는 방식으로 기능을 발휘한다는 점을 고려해 볼 때, 상기 실험 결과는 miR-21의 발현 수준 분석과 일치하는 결과임을 알 수 있다. In addition, as shown in FIGS. 4 and 5, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes down-regulated both mRNA and protein levels of Smad7 and PTEN (Exo+21-M), while miR-21 inhibitor The addition of the loaded exosomes up-regulated both mRNA and protein levels of Smad7 and PTEN (Exo+21-I). Considering that miRNA exerts a function by inhibiting the expression of the target gene by binding to the 3'-untranslated region (3'-UTR) of the target mRNA, the experimental results analyze the expression level of miR-21 It can be seen that the results are consistent with.

2-2. HL-1 심장 세포주로의 miRNA 전달2-2. MiRNA delivery to HL-1 cardiac cell line

상기 실시예 2-1과 동일한 방법으로, 인간 말초 혈액 유래 엑소좀의 HL-1 심장 세포주에 대한 miRNA 전달 효율을 확인하였고, miR-21의 직접적인 타겟이 되는 Smad7 또는 PTEN의 mRNA와 단백질 수준을 분석하였다.In the same manner as in Example 2-1, the efficiency of miRNA delivery to HL-1 cardiac cell line of human peripheral blood-derived exosomes was confirmed, and mRNA and protein levels of Smad7 or PTEN, which are direct targets of miR-21, were analyzed. Did.

HL-1 심장 세포주의 miR-21의 수준을 분석한 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 저산소 조건의 HL-1 세포주에서, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 정상 산소 및 저산소 조건의 세포와 비교하여 miR-21의 발현을 증가시켰던 반면(Exo+21-M), miR-21 억제제가 로딩된 엑소좀의 첨가는 miR-21의 발현을 감소시켰다(Exo+21-I). 한편, miRNA 음성 대조군이 로딩된 엑소좀 (Exo+NC)을 첨가한 경우, 저산소 조건의 세포와 비교하여 발현 수준의 변화가 관찰되지 않았다. 또한, 도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 실험 결과와 마찬가지로, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7과 PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 모두 하향 조절하였던 반면(Exo+21-M), miR-21 inhibitor가 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7과 PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 모두 상향 조절하였다(Exo+21-I).As a result of analyzing the level of miR-21 in the HL-1 cardiac cell line, as shown in FIG. 6, in the HL-1 cell line under hypoxic conditions, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes was performed under normal oxygen and hypoxic conditions. Expression of miR-21 was increased compared to cells (Exo+21-M), while addition of exosomes loaded with miR-21 inhibitors decreased expression of miR-21 (Exo+21-I). On the other hand, when the exosome (Exo+NC) loaded with the miRNA negative control was added, a change in expression level was not observed compared to cells in hypoxic conditions. In addition, as shown in FIGS. 7 and 8, as in the above experimental results, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes down-regulated both mRNA and protein levels of Smad7 and PTEN (Exo+21-M). ), the addition of miR-21 inhibitor loaded exosomes up-regulated both mRNA and protein levels of Smad7 and PTEN (Exo+21-I).

이러한 실험결과를 종합해 보면, 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀은 심장 세포로의 유전 물질 전달에 적용할 수 있음을 알 수 있다. Summarizing the results of these experiments, it can be seen that exosomes derived from human peripheral blood according to an embodiment can be applied to genetic material delivery to heart cells.

실시예 3. 심근 경색 동물모델을 이용한 치료 효능 확인 Example 3. Confirmation of treatment efficacy using myocardial infarction animal model

본 실시예에서는 C57BL/6 마우스에 심근경색을 유도한 뒤, miR-21 mimic 또는 inhibitor가 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀이 생체 내에서 효율적으로 전달될 수 있는지를 역전사효소 중합효소연쇄반응과 웨스턴블로팅 기법을 이용하여 평가하였다. 또한, 상기 인간 말초 혈액 유래 엑소좀을 이용한 심근경색의 치료 효능을 확인하고자 하였다. 구체적으로, C57BL/6 마우스에 심근경색을 유도한 뒤, miR-21 mimic 또는 inhibitor가 로딩된 인간 말초 혈액 유래 엑소좀을 심장 내 병변 부위에 miRNA를 전달하였으며, 이후, 상기 병변 조직에 대하여 Hematoxylin & eosin (H&E)과 Masson's Trichrome (MT) 염색을 실시하여, 상기 각 엑소좀의 전달에 따른 병리학적 변화를 관찰하였다. In this embodiment, after inducing myocardial infarction in C57BL/6 mice, it was determined whether exosomes derived from human peripheral blood loaded with miR-21 mimic or inhibitor can be efficiently delivered in vivo and reverse transcriptase polymerase chain reaction and western. It was evaluated using a blotting technique. In addition, it was intended to confirm the therapeutic efficacy of myocardial infarction using exosomes derived from human peripheral blood. Specifically, after inducing myocardial infarction in C57BL/6 mice, miR-21 mimic or inhibitor loaded human peripheral blood-derived exosomes were delivered miRNA to the lesion site in the heart, and then hematoxylin & Eosin (H&E) and Masson's Trichrome (MT) staining were performed to observe pathological changes according to the delivery of each exosome.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 실시예 2의 결과와 마찬가지로, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7의 mRNA, PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 하향 조절하였던 반면(Exo+21-M), miR-21 inhibitor가 로딩된 엑소좀의 첨가는 Smad7의 mRNA, PTEN의 mRNA 및 단백질 수준을 상향 조절하였다(Exo+21-I). 한편, miRNA 음성 대조군이 로딩된 엑소좀 (Exo+NC)을 첨가한 경우, 저산소 조건의 세포와 비교하여 발현 수준의 변화가 관찰되지 않았다.As a result, as shown in FIG. 9, as in the result of Example 2, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes down-regulated mRNA of Smad7, mRNA of PTEN, and protein level (Exo+21) -M), the addition of miR-21 inhibitor-loaded exosomes up-regulated Smad7 mRNA, PTEN mRNA and protein levels (Exo+21-I). On the other hand, when the exosome (Exo+NC) loaded with the miRNA negative control was added, a change in expression level was not observed compared to cells in hypoxic conditions.

또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 마우스의 심근 장애 및 섬유화와 관련하여, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀을 처리한 군은 섬유화 병변 부위의 면적이 대조군에 비해 유의적으로 증가하였던 반면(3.758 ± 0.203 vs. 6.010 ± 0.571, p = 0.020), miR-21 inhibitor가 로딩된 엑소좀을 처리한 그룹은 섬유화 병변 부위의 면적이 유의적으로 감소하였다(3.758 ± 0.203 vs. 2.594 ± 0.288, p = 0.030). In addition, as shown in Figure 10, in relation to myocardial disorders and fibrosis in mice, the group treated with miR-21 mimic loaded exosomes had a significantly increased area of the fibrotic lesion site compared to the control group (3.758 ± 0.203 vs. 6.010 ± 0.571, p = 0.020), the group treated with miR-21 inhibitor exosomes significantly reduced the area of the fibrotic lesion site (3.758 ± 0.203 vs. 2.594 ± 0.288, p = 0.030).

이러한 실험결과는 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀은 심장 세포로의 유전 물질 전달에 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 특성은, 심근 경색을 포함하는 심장 질환의 유전 치료에 확장 적용될 수 있음을 나타내는 것이다. These experimental results indicate that human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment can be usefully used for genetic material delivery to heart cells, and these properties can be applied to genetic treatment of heart diseases including myocardial infarction. To indicate.

실시예 4. 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀의 독성 평가Example 4. Toxicity evaluation of exosomes derived from human peripheral blood

본 실시예에서는 상기 실시예 1의 엑소좀의 생체 안전성을 확인하고자 하였다. 이를 위하여, 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀을 H9C2 심장 세포주에 첨가하고, 용량 (5, 10, 20, 40μg/ml) 또는 처리 시간에 따른 세포의 생존율 변화를 확인하였고, 이와 더불어, TNF-α, HMGB1, IL-10과 같은 염증성 사이토카인의 발현 수준을 비교함으로써, 염증 반응의 유도 여부를 평가하였다.In this example, it was intended to confirm the biosafety of the exosome of Example 1. To this end, exosomes derived from human peripheral blood were added to the H9C2 cardiac cell line, and changes in the cell viability according to the dose (5, 10, 20, 40 μg/ml) or treatment time were confirmed, and, in addition, TNF-α, By comparing the expression levels of inflammatory cytokines such as HMGB1 and IL-10, whether to induce an inflammatory response was evaluated.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀에 대하여, 용량 또는 시간-의존성 세포 독성은 관찰 되지 않았으며, 도 12에 나타낸 바와 같이, 40μg/ ml의 엑소좀을 처리한 경우에도, 염증 반응의 유도가 미미한 수준임을 알 수 있었다. 또한, 상기 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀(200ug)의 투여에 따른 염증 반응 유도 여부를 실험동물을 이용하여 조직학적으로 평가한 결과, 도 13에 나타낸 바와 같이, 심장뿐만 아니라 간, 비장, 신장, 폐와 같은 다른 장기에서도 염증 반응을 야기하지 않았다. As a result, as shown in FIG. 11, for exosomes derived from human peripheral blood, no dose or time-dependent cytotoxicity was observed, and as shown in FIG. 12, when 40 μg/ml of exosomes were treated Edo, it was found that the induction of the inflammatory response was insignificant. In addition, as a result of histologically evaluating whether or not inducing an inflammatory response according to the administration of exosomes (200 ug) derived from human peripheral blood using experimental animals, as shown in FIG. 13, not only the heart but also the liver, spleen, kidney, Other organs, such as the lung, did not cause an inflammatory response.

실시예 5. 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀을 이용한 심장 세포로의 유전 물질 전달Example 5. Genetic material delivery to cardiac cells using exosomes derived from human peripheral blood

본 실시예에서는 상기 실시예 1의 엑소좀의 유전 물질 전달 효과, 구체적으로, 심장 세포주로의 유전 물질 전달 효과를 확인하고자 하였다. 인간 말초 혈액 유래의 엑소좀에 실시예 2에 언급된 유전 물질, miRNA를 로딩하였다. 이후, 상기 유전 물질이 로딩된 엑소좀을 투과 현미경으로 관찰하고, Alix, CD9, CD63, 및 CD81의 발현 변화를 웨스턴블로팅을 통해 확인하였다. 또한, 상기 유전 물질이 로딩된 엑소좀을 실시예 2와 동일한 방식으로 H9C2 심장 세포주에 첨가하고 배양하였다. 이후, 상기 PKH26으로 형광 표지된 엑소좀을 처리한 H9C2 심장 세포주를 공초점 현미경으로 관찰하였다. In this example, the effects of the genetic material delivery of the exosomes of Example 1 above, specifically, it was intended to confirm the genetic material delivery effect to the heart cell line. Exosome derived from human peripheral blood was loaded with the genetic material, miRNA mentioned in Example 2. Then, the exosome loaded with the genetic material was observed with a transmission microscope, and the expression changes of Alix, CD9, CD63, and CD81 were confirmed through Western blotting. In addition, the exosome loaded with the genetic material was added to the H9C2 cardiac cell line and cultured in the same manner as in Example 2. Subsequently, the H9C2 heart cell line treated with the PKH26 fluorescently labeled exosomes was observed with a confocal microscope.

그 결과, 도 14에 나타낸 바와 같이, miRNA 로딩 후, 엑소좀의 형태 및 마커 단백질의 유의미한 변화는 관찰되지 않았으며, 도 15에 나타낸 바와 같이, 상기 유전 물질이 로딩된 엑소좀은 심장 세포주에 효과적으로 흡수됨을 확인하였다. As a result, as shown in FIG. 14, after miRNA loading, no significant change in exosome morphology and marker protein was observed, and as shown in FIG. 15, the exosome loaded with the genetic material was effectively applied to the heart cell line. It was confirmed that it was absorbed.

또한, 정상 및 저산소 조건 하에서, 상기 유전 물질이 로딩된 엑소좀을 통한 심장 세포 내 유전자 발현 수준 조절 효과를 확인하기 위하여, miR-21 mimic (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3', SMM-002), miR-21 inhibitor (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'; SMI-002)이 로딩된 엑소좀을 실시예 2와 동일한 방식으로 심장 세포주에 첨가하고 배양한 뒤, 이에 따른 miR-21의 발현 변화를 확인하였다. In addition, under normal and hypoxic conditions, in order to confirm the effect of regulating gene expression level in cardiac cells through the exosome loaded with the genetic material, miR-21 mimic (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3', SMM-002), miR Exosome loaded with -21 inhibitor (5'-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3'; SMI-002) was added to the cardiac cell line in the same manner as in Example 2 and cultured, and accordingly, the expression change of miR-21 was confirmed.

그 결과, 도 16에 나타낸 바와 같이, H9C2 심장 세포주에서의 miR-21 발현은 miR-21 mimic 또는 inhibitor가 로딩된 엑소좀에 의하여 조절되었다. 구체적으로, miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀의 첨가는 정상 산소 및 저산소 조건의 대조군보다 높은 miR-21 발현을 보인 반면, miR-21 inhibitor가 로딩된 엑소좀의 첨가는 miR-21 발현이 감소되었다. 또한, miRNA가 로딩된 엑소좀의 흡수는 엑소좀에 대하여 용량-의존적 방식으로 H9C2 세포에서 miR-21 수준의 조절을 야기하였으며, 엑소좀의 단독처리는 miR-21 발현에 영향을 미치지 않았다. As a result, as shown in FIG. 16, miR-21 expression in the H9C2 heart cell line was regulated by exosomes loaded with miR-21 mimic or inhibitor. Specifically, the addition of miR-21 mimic loaded exosomes showed higher miR-21 expression than the control group under normal oxygen and hypoxic conditions, whereas the addition of miR-21 inhibitor loaded exosomes reduced miR-21 expression. Became. In addition, absorption of miRNA-loaded exosomes caused the regulation of miR-21 levels in H9C2 cells in a dose-dependent manner with respect to exosomes, and exosome treatment alone did not affect miR-21 expression.

아울러, miRNA가 로딩된 엑소좀의 RNase 저항률을 평가하기 위해, RNA를 분해 할 수 있는 효소인 RNase A를 엑소좀에 처리한 후, 이를 H9C2 심장 세포주 첨가하였다. 그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, RNase의 처리는 엑소좀에 로딩된 miR-21의 총량에 영향을 미치지 않았으며, 이는 엑소좀의 Rnase에 대한 저항 능력을 보여주는 것이다. In addition, to evaluate the RNase resistance of miRNA-loaded exosomes, RNase A, an enzyme capable of degrading RNA, was treated with exosomes, and H9C2 cardiac cell lines were added thereto. As a result, as shown in FIG. 17, treatment with RNase did not affect the total amount of miR-21 loaded on the exosomes, which shows the ability of the exosomes to resist Rnase.

실시예 6. 심근 경색 동물모델을 이용한 치료 효능의 재검증Example 6. Reconfirmation of Treatment Efficacy Using Myocardial Infarction Animal Model

본 실시예에서는 실시예 3과 동일한 방식으로 C57BL/6 마우스에 심근경색을 유도한 뒤, miR-21 inhibitor이 로딩된 말초 혈액 유래 엑소좀을 심장 병변 부위에 전달하였다. 이후, 심근 경색이 유도된지 1주일 후, 해당 마우스의 심장 기능을 심 초음파 검사를 통해 평가하였다. 이와 함께, 상기 동물 모델의 심장 세포의 콜라겐 Ⅰ, 콜라겐 Ⅲ의 발현 수준을 웨스턴 블로팅을 통하여 평가하였다. In this example, after inducing myocardial infarction in C57BL/6 mice in the same manner as in Example 3, peripheral blood-derived exosomes loaded with miR-21 inhibitor were delivered to the heart lesion site. Thereafter, one week after myocardial infarction was induced, the heart function of the mouse was evaluated by echocardiography. In addition, the expression levels of collagen I and collagen III in the heart cells of the animal model were evaluated through Western blotting.

그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이, miRNA 음성 대조군이 로딩된 엑소좀 (Exo+NC) 및 miR-21 mimic이 로딩된 엑소좀을 처리한 군에 비하여, miR-21 inhibitor이 로딩된 엑소좀을 처리한 군은 심장 기능성 평가 지표인 좌심실 구축률(Left ventricular ejection fraction: LVEF)이 유의적으로 증가되었다. 또한, 도 19에 나타낸 바와 같이, 상기 miR-21 inhibitor이 로딩된 엑소좀을 처리한 군은 심장 섬유화와 관련된 콜라겐의 발현이 유의적으로 감소되었다. As a result, as shown in Figure 18, compared to the group treated with exosomes loaded with miRNA negative control (Exo+NC) and miR-21 mimic, miR-21 inhibitor-loaded exosomes In the treated group, the left ventricular ejection fraction (LVEF), an index for evaluating cardiac function, was significantly increased. In addition, as shown in Fig. 19, the group treated with the miR-21 inhibitor-loaded exosomes significantly reduced the expression of collagen associated with cardiac fibrosis.

이러한 실험 결과는, 일 실시예에 따른 인간 말초 혈액 유래 엑소좀은 심장 세포로의 유전 물질, 구체적으로 miRNA-21 inhibitor의 심장 세포로의 전달에 유용하게 사용될 수 있으며, 이러한 효과에 기초하여, 상기 엑소좀은 심근 경색을 포함하는 심장 질환의 유전 치료에 확장 적용될 수 있음을 나타내는 것이다. As a result of these experiments, human peripheral blood-derived exosomes according to an embodiment can be usefully used to deliver genetic material to heart cells, specifically miRNA-21 inhibitor, to heart cells, and based on these effects, the Exosomes indicate that they can be extended to the genetic treatment of heart disease, including myocardial infarction.

실시예 7. 심장 질환의 치료 기전 확인 Example 7. Confirmation of the mechanism of treatment of heart disease

본 실시예에서는 상기 실시예 6에서 검증한 치효 효능의 기전을 확인하고 자하였다. 우선, 도 20에 나타낸 바와 같이, miRNA 표적 예측 프로그램 (www.targetscan.org)을 이용하여 miR-21이 결합할 수 있는 염기서열을 지닌 유전자를 검색한 결과, STRN의 3'-UTR 부위에 miR-21가 결합가능성이 있음을 확인하였다. In this example, the mechanism of the dentifrice efficacy verified in Example 6 was examined. First, as shown in FIG. 20, as a result of searching for a gene having a base sequence capable of binding to miR-21 using the miRNA target prediction program (www.targetscan.org), miR is located at the 3'-UTR region of STRN. It was confirmed that -21 has the possibility of binding.

이러한 결과에 기초하여, miR-21과 STRN이 실제 결합하는지를 확인하기 위하여, miR-21이 결합하는 STRN 3'-UTR 부위의 염기서열을 pmirGLO Dual-luciferase Vector (Promega, USA)에 클로닝하였다. 이후, 합성한 루시퍼라아제 벡터 시스템과 miR-21 mimic 또는 대조군으로 스크램블 miRNA를 심장 세포주에 처리할 경우, 도 21에 나타낸 바와 같이, miR-21 mimic을 처리한 군에서 루시퍼라아제 활성이 현저하게 감소된 반면, miR-21이 결합하는 STRN 3'-UTR 부위의 염기서열을 돌연변이시킨 벡터 시스템과 miR-21 mimic 또는 대조군으로 스크램블 miRNA를 세포주에 처리할 경우에는 유의한 변화가 확인되지 않았다. 이러한 결과는 miR-21이 STRN 3'-UTR 부위에 결합함으로써 STRN의 발현 수준에 영향을 미침을 나타내는 것이다. Based on these results, in order to confirm that miR-21 and STRN actually bind, the base sequence of the STRN 3'-UTR site to which miR-21 binds was cloned into pmirGLO Dual-luciferase Vector (Promega, USA). Thereafter, when the scrambled miRNA is treated with the synthesized luciferase vector system and the miR-21 mimic or control group in the cardiac cell line, as shown in FIG. 21, the luciferase activity is significantly remarkable in the group treated with miR-21 mimic. On the other hand, a significant change was not observed when a scrambled miRNA was treated with a vector system and miR-21 mimic or a control mutated base sequence of the STRN 3'-UTR site to which miR-21 binds. These results indicate that miR-21 affects the expression level of STRN by binding to the STRN 3'-UTR site.

또한, miR-21의 mimic 또는 inhibitor를 처리하여 각각 miR-21의 과발현 및 억제에 의한 H9C2 심장 세포주 내 STRN mRNA 및 단백질 발현 수준을 확인하였고, NOS3에 대한 STRN의 역할을 확인하기 위하여 STRN-특이적 siRNA를 사용하여 STRN의 발현 수준을 저해한 뒤, 이에 따른 NO3의 발현 수준 변화를 확인하였다. In addition, the mimic or inhibitor of miR-21 was treated to confirm the level of STRN mRNA and protein expression in the H9C2 cardiac cell line by overexpression and inhibition of miR-21, respectively, and STRN-specific to confirm the role of STRN for NOS3 After the expression level of STRN was inhibited using siRNA, the change in expression level of NO3 was confirmed.

그 결과, 도 22에 나타낸 바와 같이, miR-21을 과발현시킬 경우 STRN mRNA 및 단백질의 발현 수준을 크게 감소시키며, 그와 반대로 miR-21의 발현 수준을 억제할 경우, STRN mRNA 및 단백질 발현 수준을 증가시켰다. 또한, 도 23에 나타낸 바와 같이, STRN-특이적 siRNA로 형질 감염된 H9C2 심장 세포주는 STRN의 단백질 수준이 약 ~ 50 % 이상 감소되었으며, STRN 발현 수준의 감소와 함께 NOS3 단백질 발현 또한 유의하게 감소되었다. As a result, as shown in FIG. 22, when the miR-21 is overexpressed, the expression level of the STRN mRNA and protein is significantly reduced. On the contrary, when the expression level of miR-21 is suppressed, the STRN mRNA and protein expression level is reduced. Increased. In addition, as shown in FIG. 23, the H9C2 heart cell line transfected with STRN-specific siRNA reduced the protein level of STRN by more than about 50%, and the NOS3 protein expression was also significantly decreased with the decrease of the STRN expression level.

이어서, 저 산소 조건에 노출된 H9C2 심장 세포주에서 miR-21 발현 변화가 STRN 및 NOS 단백질 발현 수준에 미치는 영향을 웨스턴 블로팅을 통하여 확인하였다. 그 결과, 도 24에 나타낸 바와 같이, 저 산소 조건에 24 시간 동안 노출시킨 후, STRN 및 NOS3의 단백질 발현 수준은 저 산소 조건에 노출되지 않은 control(normoxia)에 비하여 감소되었다. 또한, 이러한 발현 수준은 miR-21 mimic을 처리할 경우 더욱 하향 조절되었으며, 그와 반대로 miR-21 inhibitor를 처리할 경우 그 변화가 역전되었다.Subsequently, the effect of miR-21 expression changes on the STRN and NOS protein expression levels in the H9C2 heart cell line exposed to low oxygen conditions was confirmed through Western blotting. As a result, as shown in FIG. 24, after 24 hours of exposure to low oxygen conditions, the protein expression levels of STRN and NOS3 were reduced compared to controls (normoxia) not exposed to low oxygen conditions. In addition, this expression level was further down-regulated when miR-21 mimic was treated, and the change was reversed when the miR-21 inhibitor was treated.

이러한 실험 결과는, 일 실시예에 따른 miR-21 inhibitor는 STRN의 발현 증가와 뒤이은 NO3의 발현 증가를 통하여 유효한 치료 효능이 발휘됨을 나타내는 것이다. These experimental results indicate that the miR-21 inhibitor according to an embodiment exerts effective therapeutic efficacy through increased expression of STRN and subsequent increased expression of NO3.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.The above description of the present invention is for illustration only, and those skilled in the art to which the present invention pertains can understand that the present invention can be easily modified into other specific forms without changing the technical spirit or essential features of the present invention. will be. Therefore, it should be understood that the embodiments described above are illustrative in all respects and not restrictive.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Gene carrier comprising exosome derived from human peripheral blood and uses thereof <130> PN131457KR <150> KR 10-2019-0011309 <151> 2019-01-29 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 inhibitor <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 mimic <400> 2 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University <120> Gene carrier comprising exosome derived from human peripheral blood and uses thereof <130> PN131457KR <150> KR 10-2019-0011309 <151> 2019-01-29 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 inhibitor <400> 1 uagcuuauca gacugauguu ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-21 mimic <400> 2 uagcuuauca gacugauguu ga 22

Claims

Exosomes derived from human peripheral blood; And
A pharmaceutical composition for the prevention or treatment of heart disease, comprising a genetic material selected from mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or cDNA encapsulated in the exosome.

In claim 1, The genetic material is to increase the expression of the STRN gene of the heart cell, pharmaceutical composition.

In claim 2, wherein the genetic material is a miRNA 21 inhibitor, pharmaceutical composition.

In claim 1, The exosomes will have a diameter of 50 to 150 nm, pharmaceutical composition.

The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the exosome expresses a protein marker selected from Alix, LAMP2, CD9, CD63, CD81, and combinations thereof.

The pharmaceutical composition of claim 1, wherein the heart disease is angina pectoris, myocardial infarction, atherosclerosis, cardiac arrhythmia, heart attack, or heart attack.

Exosomes derived from human peripheral blood; And
The exosome-enclosed mRNA, tRNA, rRNA, siRNA, miRNA, gDNA, pDNA, or a genetic material selected from cDNA, the cardiac cell gene expression regulation transporter.

The method according to claim 7, The exosomes will have a diameter of 50 to 150 nm, cardiac cell gene expression regulation transporter.

The method according to claim 7, wherein the exosome is to express a protein marker selected from Alix, LAMP2, CD9, CD63, CD81, and combinations thereof, a carrier for regulating gene expression in cardiac cells.

The method according to claim 7, wherein the delivery system is applied to the gene therapy of heart disease, the delivery system for regulating gene expression in heart cells.

The method according to claim 10, The heart disease is angina pectoris, myocardial infarction, atherosclerosis, cardiac arrhythmia, heart attack, or heart attack, cardiac cell gene expression regulation transporter.